髄膜炎菌ワクチン処方物
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（「Ｍｅｎ−Ｂ」）に対するワクチンのための二成分処方物は、（ｉ）水中油エマルションアジュバントと、（ｉｉ）凍結乾燥した形態のＭｅｎ−Ｂ免疫原性成分とを含む。凍結乾燥したＭｅｎ−Ｂ抗原は、患者に投与するために使用する時点において、液状のアジュバント化された形態に再構成することができる。この処方物により、安定性および免疫原性の両方に関して素晴らしい結果が得られることが見出された。凍結乾燥した成分はさらに、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する１種以上の複合糖も含み得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌ワクチンを処方する分野にある。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ（「Ｍｅｎ−Ｂ」）に対する様々なワクチンが現在研究されているが、それらは１つの共通する特徴を有している。
【０００３】
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社（ＭＥＮＺＢ（商標））、Ｆｉｎｌａｙ研究所（ＶＡ−ＭＥＮＧＯＣ−ＢＣ（商標））、ノルウェー国立公衆衛生院（ＭＥＮＢＶＡＣ（商標））、およびオランダワクチン研究所（ＨＥＸＡＭＥＮ（商標）およびＮＯＮＡＭＥＮ（商標））によって製造された外膜小胞（ＯＭＶ：ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）製品はすべて、水酸化アルミニウムアジュバントを含む。参考文献１（非特許文献１）においてＮｏｖａｒｔｉｓ社によって報告された「ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ（血清群Ｂ髄膜炎菌のための万能ワクチン）」も、最近、参考文献２（非特許文献２）において報告された二価のＯＭＶワクチンと同様に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｉｕｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００６）１０３（２９）：１０８３４−９
【非特許文献２】Ｂｏｕｔｒｉａｕら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００７）１４：６５〜７３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＭｅｎ−Ｂワクチンの開発において、本発明者らは、最適な免疫原性はアジュバントの存在を必要とすることを見出した。さらに彼らは、水酸化アルミニウムへの吸着が、ワクチン抗原に対して良好な保存安定性を提供することを見出した。しかしながら、アルミニウム塩の使用の必要性を避けるために、代替手段が求められている。
【０００６】
Ｍｅｎ−Ｂワクチンのための非アルミニウムアジュバントの使用は既に公知である。例えば、参考文献３では、Ｍｅｎ−Ｂ小胞のためのアジュバントとしてＭＦ５９水中油エマルションの使用が報告されており、参考文献４では、アジュバントとして免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはＭＦ５９の使用について記載されている。ＭＦ５９による免疫原性の結果は素晴らしく、継続した調査により、このアジュバントが、水酸化アルミニウムと比較してＭｅｎ−Ｂワクチンの菌株対象範囲を広げることが明らかにされたが、さらに調べると、予期せず、水中油エマルションによってアジュバント化されたＭｅｎ−Ｂ免疫原の長期安定性が乏しいことが示された。したがって、本発明の目的は、水中油エマルションアジュバントを使用した場合の、Ｍｅｎ−Ｂワクチンの保存安定性を改善する方法を提供することにある。
【０００７】
水中油エマルションによってこれまで経験してきたことは、インフルエンザワクチンの分野で起きていることである。ＦＬＵＡＤ（商標）製品は、ＭＦ５９エマルションを含み、１つの容器において予め混合された液体の形式で配布される（「１バイアルアプローチ」）。この予め混合された処方物は、Ｍｅｎ−Ｂワクチンの安定性を乏しくすることが現在わかっている処方物である。
【０００８】
水中油エマルションワクチンによる「１バイアル」処方物の代替手段として、インフルエンザ（例えば、参考文献５を参照のこと）、ＨＳＶ（例えば、参考文献６）、およびＨＩＶ（例えば、参考文献７）に対して「２バイアル」アプローチが用いられており、これらにおける当該ワクチンおよびエマルションは、使用の時点で即座に混合するために、両方とも液体の形式で一緒に配布される。
【０００９】
本発明に従って、（ｉ）水中油エマルションアジュバントと、（ｉｉ）凍結乾燥した形態のＭｅｎ−Ｂ免疫原性成分との二成分処方物を用いた、Ｍｅｎ−Ｂワクチンのための異なるアプローチが行われる。凍結乾燥したＭｅｎ−Ｂ抗原は、患者に投与するために使用する時点において、液状のアジュバント化された形態へと再構成することができる。この処方物は、安定性および免疫原性の両方に関して、素晴らしい結果が得られることが見出された。
【００１０】
本発明者らはさらに、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｍｅｎ−Ａ、Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙ）に由来する複合糖の１種以上が含まれる場合に、凍結乾燥した成分が効力を維持し得ることを見出した。単一の凍結乾燥した成分を使用した、血清群Ｂを含む多数の髄膜炎菌性血清群に対して免疫するための抗原の組み合わせは、特に有利である。
【００１１】
したがって、本発明は、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントを収容した第１の容器と、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を収容した第２の容器とを含むキットを提供する。当該凍結乾燥した抗原性組成物は、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含み得る。
【００１２】
本発明はさらに、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントと、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物とを混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製する方法も提供する。当該凍結乾燥した抗原性組成物は、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含み得る。
【００１３】
本発明はさらに、（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原と、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖とを含む、凍結乾燥された抗原性組成物を提供する。この凍結乾燥された組成物は、水中油エマルションを含むアジュバントによる再構成のために好適であり、かつ本発明のキット構成要素としての使用に好適である。
【００１４】
凍結乾燥された抗原性組成物
本発明は、Ｍｅｎ−Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を使用する。それは、必要に応じて、Ｍｅｎ−Ａ、Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、および／またはＭｅｎ−Ｙの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含んでいてもよい。
【００１５】
Ｍｅｎ−Ｂ免疫原は、Ｍｅｎ−Ｂ細菌および／またはＭｅｎ−Ｂ組み換えタンパク質および／またはＭｅｎ−Ｂリポオリゴ糖（ＬＯＳ：ｌｉｐｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）に由来する膜小胞を含み得る。
【００１６】
Ｍｅｎ−ＢのＯＭＶの凍結乾燥は、当技術分野において公知であるが［８］、これらのＯＭＶは、その後に、アルミニウムホスフェートアジュバントと一緒に投与されている。したがって、水中油エマルションアジュバントと組み合わせた場合の抗原安定性の問題は報告されていない。同様に、ＭＦ５９によるその後の再構成を含めて、髄膜炎菌性複合化抗原の凍結乾燥は公知であるが［９］、これはＭｅｎ−Ｂ抗原との組み合わせにおいてではない。
【００１７】
小胞を含むＭｅｎ−Ｂ成分
Ｍｅｎ−Ｂワクチン成分としての使用のための小胞としては、細菌外膜のタンパク質成分を含む小胞を形成するために当該外膜を破壊することによって得られる任意のプロテオリポソーム小胞が挙げられる。したがって、当該用語は、ＯＭＶ（「ブレブ」と呼ばれる場合もある）、微小胞（ＭＶ［１０］）、および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１１］）を含む。
【００１８】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌増殖の際に自然に形成されて培地に放出される、天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、ブロス培地においてＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養し、（例えば、ろ過によって、または細胞のみをペレット化してより小さな小胞はペレット化しないような低速での遠心分離によって）ブロス培地中のより小さなＭＶから全細胞を分離して、次いで、（例えば、ろ過によって、ＭＶの示差的沈降または凝集によって、ＭＶをペレット化する高速遠心分離によって）細胞枯渇培地からＭＶを収集することによって得ることができる。ＭＶの産生において使用される菌株は、一般的に、培養において産生されるＭＶの量に基づいて選択することができ、例えば、参考文献１２および１３には、高いＭＶ産生を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａについて記載されている。
【００１９】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製されるが、（例えば、デオキシコレートによる）洗浄剤処理を用いて調製してもよいし、または洗浄剤を用いない方法で調製してもよい（例えば、参考文献１４を参照のこと）。好適なＯＭＶ調製物を得るための方法は、例えば、本明細書に引用する参考文献において開示されている。ＯＭＶを形成するための技術は、洗浄剤が沈殿しないような十分に高いｐＨにおいて、胆汁酸塩洗浄剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、デオキシコール酸ナトリウム［１５および１６］が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するために好ましい）によって細菌を処理する工程を含む［１７］。他の技術は、超音波処理、ホモジナイゼーション、微細流動化、キャビテーション、浸透圧ショック、摩砕、フレンチプレス、ブレンディングなどの技術を用いて、実質的に洗浄剤の不在下において［１４］実施され得る。洗浄剤を使用しないか、または少量しか使用しない方法では、ＮｓｐＡなどの抗原の有用性を維持することができる［１４］。したがって、約０．５％のデオキシコレート、またはより少ない、例えば、約０．２％、約０．１％、＜０．０５％、またはゼロ％のデオキシコレートを有するＯＭＶ抽出緩衝液を使用する方法であってもよい。
【００２０】
ＯＭＶ調製物のための有用なプロセスは、参考文献１８に記載されており、高速遠心分離法ではなく粗ＯＭＶの限外ろ過を伴う。当該プロセスは、限外ろ過の後に超遠心分離の工程を伴っていてもよい。
【００２１】
本発明の使用のために、任意のＭｅｎ−Ｂ菌株から小胞を調製することができる。それらは、任意の血清型（例えば、１，２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型、および任意の免疫型（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３，３，７、Ｌ１０など）であってもよい。髄膜炎菌は、高侵襲性系統および高毒性系統、例えば以下の７つの高毒性系統：サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、ＥＴ−５複合物、ＥＴ−３７複合物、Ａ４クラスター、系統３など、を含む任意の好適な系統に由来し得る。これら系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｅｎｚｙｍｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により規定されているが、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ）もまた髄膜炎菌を分類するために使用されており［参考文献１９］、例えばＥＴ−３７複合物は、ＭＬＳＴによりＳＴ−１１複合物であり、ＥＴ−５複合物はＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ−４１／４４である。小胞は、以下の亜型：Ｐ１．２、Ｐ１．２，５、Ｐ１．４、Ｐ１．５、Ｐ１．５，２、Ｐ１．５，ｃ、Ｐ１．５ｃ，１０、Ｐ１．７，１６、Ｐ１．７，１６ｂ、Ｐ１．７ｈ，４、Ｐ１．９、Ｐ１．１５、Ｐ１．９，１５、Ｐ１．１２，１３、Ｐ１．１３、Ｐ１．１４、Ｐ１．２１，１６、Ｐ１．２２，１４、の内の１つを有する菌株から調製することができる。
【００２２】
本発明において使用される小胞は、野生型Ｍｅｎ−Ｂ菌株または突然変異菌株から調製され得る。例えば、参考文献２０では、修飾されたｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られる小胞の調製について開示されている。参考文献２７では、ｎｓｐＡ発現が、ｐｏｒＡおよびｃｐｓの同時ノックアウトによりアップレギュレートされるはずであることが教示されている。特許文献２７〜２９では、ＯＭＶ産生のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのさらなるノックアウト変異体について開示されている。参考文献２１では、ｆＨＢＰがアップレギュレートされる小胞について開示されている。参考文献２２では、６つの異なるＰｏｒＡ亜型を発現するように修飾された菌株に由来する小胞の構築について開示されている。さらに、ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成された低内毒素レベルを有する変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用することができる［２３、２４］。これらの変異体または他の変異体は、すべて本発明において使用することができる。
【００２３】
したがって、本発明において使用されるＭｅｎ−Ｂ菌株は、いくつかの実施形態において、２つ以上のＰｏｒＡ亜型を発現し得る。６価および９価のＰｏｒＡ菌株は、以前に構築されている。この菌株は、２、３、４、５、６、７、８、または９つのＰｏｒＡ亜型：Ｐ１．７，１６、Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．１９，１５−１、Ｐ１．５−２，１０、Ｐ１．１２−１，１３、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１．２２，１４、Ｐ１．７−１，１、および／またはＰ１．１８−１，３，６を発現し得る。他の実施形態において、菌株は、ＰｏｒＡの発現に対してダウンレギュレートされていてもよく、その場合、例えば、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルと比較して（参考文献３０に開示されるように、菌株Ｈ４４／７６と比較して）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％など）減少しているか、さらにはノックアウトされている。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｍｅｎ−Ｂ菌株は、（対応する野生型菌株と比較して）特定のタンパク質を過剰発現し得る。例えば、菌株は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［４５］、ｆＨＢＰ［２１］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２５］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［２５］などを過剰発現し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Ｍｅｎ−Ｂ菌株は、参考文献２６〜２９において開示されているノックアウトおよび／または過剰発現変異の１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトのための好ましい遺伝子としては、
【数１】
【００２６】
突然変異株が使用される場合、いくつかの実施形態において、それらは、以下の特性：（ｉ）髄膜炎菌性ＬＯＳを切端するための、ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＨｓｆ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠損ｃｐｓ遺伝子複合体、の１つ以上またはすべてを有し得る。切端されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含んでいないものであり得、例えば、ガラクトース−欠損ＬＯＳであり得る。当該ＬＯＳは、α鎖を有し得ない。
【００２７】
ＬＯＳが小胞に存在している場合、そのＬＯＳとタンパク質成分とを結合するように小胞を処理することが可能である（「ブレブ内」結合［２９］）。
【００２８】
本発明は、異なる菌株に由来する小胞の混合物を使用し得る。例えば、参考文献３０では、使用国において流行している血清亜型を有する髄膜炎菌株由来の第１の小胞および使用国において流行している血清亜型を必ずしも有さない髄膜炎菌株由来の第２の小胞を含む、多価髄膜炎菌性小胞組成物を含むワクチンについて開示されている。参考文献３１にも、異なる小胞の有用な組み合わせが開示されている。Ｌ２およびＬ３免疫型のそれぞれの菌株に由来する小胞の組み合わせが、いくつかの実施形態において使用され得る。
【００２９】
小胞ベースの抗原は、Ｍｅｎ−Ｂ以外の血清群から調製することができる（例えば、参考文献１７に、Ｍｅｎ−Ａについてのプロセスが開示されている）。したがって、本発明は、Ｍｅｎ−Ｂ以外の血清群（例えば、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ）から調製された小胞を使用してもよい。しかしながら、主な焦点は、Ｍｅｎ−Ｂにある。
【００３０】
組み換えタンパク質を含むＭｅｎ−Ｂ成分
組み換えタンパク質も、Ｍｅｎ−Ｂに対するワクチン免疫原としての使用が報告されている。例えば、様々な抗原が、参考文献３２〜４０において報告されている。そのような抗原は、単独で、または組み合わせて使用してもよい。多数の精製タンパク質を組み合わせる場合、１０種以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２種）の精製抗原の混合物を使用することが有用である。
【００３１】
抗原の特に有用な組み合わせは、参考文献１および４０において開示されており、したがって、本発明の組成物は、（１）「ＮａｄＡ」タンパク質、（２）以前には「７４１」として知られていた「ｆＨＢＰ」タンパク質、（３）「９３６」タンパク質、（４）「９５３」タンパク質、および（５）「２８７」タンパク質、の１、２、３、４、または５つを含み得る。他の可能な抗原の組み合わせは、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ）およびＨｓｆ抗原を含み得る。他の可能な精製された抗原としては、以下のアミノ酸配列：参考文献３２からの配列番号６５０、参考文献３２からの配列番号８７８、参考文献３２からの配列番号８８４、参考文献３３からの配列番号４、参考文献３４からの配列番号５９８、参考文献３４からの配列番号８１８、参考文献３４からの配列番号８６４、参考文献３４からの配列番号８６６、参考文献３４からの配列番号１１９６、参考文献３４からの配列番号１２７２、参考文献３４からの配列番号１２７４、参考文献３４からの配列番号１６４０、参考文献３４からの配列番号１７８８、参考文献３４からの配列番号２２８８、参考文献３４からの配列番号２４６６、参考文献３４からの配列番号２５５４、参考文献３４からの配列番号２５７６、参考文献３４からの配列番号２６０６、参考文献３４からの配列番号２６０８、参考文献３４からの配列番号２６１６、参考文献３４からの配列番号２６６８、参考文献３４からの配列番号２７８０、参考文献３４からの配列番号２９３２、参考文献３４からの配列番号２９５８、参考文献３４からの配列番号２９７０、参考文献３４からの配列番号２９８８のうちの１つを含むタンパク質、あるいは、（ａ）上記配列に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有し、および／または（ｂ）上記配列に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸の断片を含み、ｎが７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれ以上）であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。（ｂ）に対して好ましい断片は、関連配列に由来するエピトープを含む。これらのポリペプチドの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６つ）が含まれ得る。
【００３２】
ｆＨＢＰ抗原は、３種の異なる変異体へ分類される［３９］。本発明のＭｅｎ−Ｂ成分は、１種のｆＨＢＰ変異体を含み得るが、有用には、２種または３種全部の変異体のそれぞれに由来するｆＨＢＰを含むであろう。したがって、これは、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質、（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質、ならびに／あるいは（ｃ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む第３のタンパク質、から選択される、２種または３種の異なる精製ｆＨＢＰの組み合わせを含み得る。
【００３３】
ａの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ａ、ｂ、およびｃの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００３４】
ｘの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙ、およびｚの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００３５】
いくつかの実施形態おいて、ｆＨＢＰタンパク質（単数または複数）は、例えば、Ｎ末端システインにおいて脂質化されるだろう。他の実施形態では、それらは脂質化されないだろう。
【００３６】
精製タンパク質をベースとする有用な組成物は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、（ｉｉ）配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、の混合物を含む。参考文献１および４０を参照のこと。
【００３７】
ＬＯＳを含むＭｅｎ−Ｂ成分
リポオリゴ糖をベースとする髄膜炎菌ワクチンは、すでに報告されている。当該ＬＯＳは、単独で使用してもよいし、または担体に複合化させてもよい。複合化している場合、複合化は、ＬＯＳのリピドＡ部分を介してもよいし、他の好適な部分、例えば、そのＫＤＯ残基によってでもよい。ＬＯＳのリピドＡ部分が無い場合は、そのような代替の結合が不可欠である。
【００３８】
当該ＬＯＳは、任意の免疫型、例えば、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ７などに由来していてもよい。
【００３９】
天然ＬＯＳを使用するよりもむしろ、修飾された形態を使用する方が好ましい。これらの修飾は、化学的に達成することができるが、特定の生合成付加を担う、Ｍｅｎ−Ｂにおける酵素をノックアウトする方がより簡便である。例えば、ＬＯＳは、天然のラクト−Ｎ−ネオテトラオースユニットの少なくとも末端Ｇａｌを除去するために修飾され得るが、この修飾は、１つ以上の関連する酵素をノックアウトすることによって達成することができる。天然ＬＯＳにおける２つの末端単糖（シアル酸およびガラクトース）の付加を担う酵素をノックアウトすることによって、末端Ｓｉａだけを除去することもできるし、またはＳｉａ−Ｇａｌの二糖を除去することもできる。例えば、ｌｇｔＢ遺伝子をノックアウトすると、Ｓｉａ−Ｇａｌが除去される。ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトによっても、有用な修飾ＬＯＳが得られる。リピドＡの脂肪トランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトしてもよい［４１］。
【００４０】
少なくとも１つの第一級Ｏ−結合脂肪酸を、ＬＯＳから除去してもよい［４２］。ＬＯＳ１分子あたりの第二級アシル鎖の数を減らしたＬＯＳも使用することができる［４３］。当該ＬＯＳは、α鎖を有し得ない。
【００４１】
当該ＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ２−リピドＡを含み得る［４４］。
【００４２】
混合Ｍｅｎ−Ｂ成分
本発明は、Ｍｅｎ−Ｂ抗原として、小胞、精製ポリペプチド、またはＬＯＳを使用し得る。本発明はさらに、これらの３つの抗原の組み合わせ、例えば、（ｉ）小胞＋精製ポリペプチド、（ｉｉ）小胞＋ＬＯＳ、（ｉｉｉ）精製ポリペプチド＋ＬＯＳ、または（ｉｖ）小胞＋精製ポリペプチド＋ＬＯＳ、を使用してもよい。これらの組み合わせは、個々の成分を別々に調製し、次いでそれらを混合することによって作製してもよい。例えば、参考文献４５では、より幅広い効力を組成物に提供するために、小胞に精製タンパク質を加えることが開示されている。
【００４３】
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ
血清群Ｃに対する複合化一価ワクチンは、ヒトへの使用が承認されており、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）、およびＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）が挙げられる。血清群Ａ＋Ｃに由来する複合体の混合物は公知であり［４６、４７］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来する複合体の混合物も報告されており［４８〜５１］、２００５年に水性ＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標）製品として承認されている。
【００４４】
本発明で使用される凍結乾燥された成分は、髄膜炎菌性血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの１、２、３、または４つ、例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど、に由来する莢膜糖の１つ以上の複合体を含み得る。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの４つすべてに由来する糖を含む成分が好ましい。
【００４５】
血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を有する、（α１→６）−結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ−３位でのアセチル化は、７０〜９５％であり得る。糖を精製するために使用される条件によっては、（例えば、塩基性条件下において）脱−Ｏ−アセチル化を生じ得るが、このＣ−３位にＯＡｃを保持することは有用である。いくつかの実施形態において、血清群Ａの糖におけるマンノサミン残基の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）は、Ｃ−３位においてＯ−アセチル化される。アセチル基をブロッギング基で置き換えることで、加水分解を防ぐことが可能であり［５２］、そのような修飾された糖は、依然として、本発明の意図する範囲内の血清群Ａの糖である。
【００４６】
血清群Ｃの莢膜糖は、（α２→９）−結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。糖構造は、→９）−ＮｅｕｐＮＡｃ７／８ＯＡｃ−（α２→として記述される。大部分の血清群Ｃの菌株は、シアル酸残基のＣ−７位および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を有するが、臨床単離株の約１５％は、これらのＯ−アセチル基が欠損している［５３、５４］。ＯＡｃ基の存在または欠損により特有のエピトープが生じ、糖に対する抗体結合の特異性は、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）菌株および脱−Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）菌株に対するその殺菌活性に影響を及ぼし得る［５５〜５７］。本発明で使用される血清群Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−菌株のいずれかから調製され得る。承認されているＭｅｎ−Ｃ複合体ワクチンとしては、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））糖の両方が挙げられる。いくつかの実施形態において、血清群Ｃの複合体の産生のための菌株は、例えば、血清型１６、血清亜型Ｐ１．７ａ，１などのＯＡｃ＋菌株である。したがって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１のＯＡｃ＋菌株が使用され得る。血清亜型Ｐ１．１におけるＯＡｃ＋菌株、例えば、Ｃ１１菌株なども有用である。
【００４７】
血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトース二糖ユニットのポリマーである。血清群Ｃの糖のように、それらは、種々のＯ−アセチル化を有するが、ただし、シアル酸の７位および９位においてである［５８］。当該構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→として記述される。
【００４８】
血清群Ｙの糖は、二糖繰り返しユニットがガラクトースの代わりにグルコースを含むこと以外は、血清群Ｗ１３５の糖と同じである。血清群Ｗ１３５のように、それらは、シアル酸の７位および９位に種々のＯ−アセチル化を有する［５８］。血清群Ｙの構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→として記述される。
【００４９】
本発明に従って使用される糖は、上記において説明したように（例えば、天然莢膜糖に見られるような同じＯ−アセチル化パターンで）Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、それらは、糖環の１つ以上の位置で、部分的にまたは全体的に脱−Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、それらは、天然の莢膜糖と比較して、過剰にＯ−アセチル化されていてもよい。
【００５０】
複合体の糖部分は、髄膜炎菌から調製されるような全長の糖を含んでいてもよく、および／または全長の糖の断片を含んでいてもよく、すなわち、当該糖は、細菌において見られる天然の莢膜糖より短い場合がある。したがって、当該糖は、糖の精製中あるいは精製後の、複合化の前に生じる脱重合反応により、脱重合され得る。脱重合は、糖の鎖長を減少させる。１つの脱重合方法は、過酸化水素の使用を伴う［４８］。過酸化水素を、（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度が得られるように）糖に添加し、次いで所望の鎖長の減少が達成されるまで、当該混合物を（例えば、約５５℃で）インキュベートする。別の脱重合方法は、酸加水分解を伴う［４９］。他の脱重合方法が、当技術分野において公知である。本発明による使用のための複合体を調製するために使用される糖は、これらの脱重合方法のいずれによって入手可能であり得る。脱重合は、免疫原性に対して最適な鎖長を与えるため、および／または物理的に扱いやすいように糖の鎖長を減少させるために用いることができる。いくつかの実施形態において、糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）：Ａ＝１０〜２０、Ｃ＝１２〜２２、Ｗ１３５＝１５〜２５、Ｙ＝１５〜２５、を有する。Ｄｐよりもむしろ分子量に関して、有用な範囲は、すべての血清群に対して、＜１００ｋＤａ、５ｋＤａ〜７５ｋＤａ、７ｋＤａ〜５０ｋＤａ、８ｋＤａ〜３５ｋＤａ、１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ、１５ｋＤａ〜２２ｋＤａである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、髄膜炎菌性血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する糖の平均分子量は、特にＭＡＬＬＳによって特定される場合に、５０ｋＤａ超、例えば、≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなど［５９］、および１５００ｋＤａまでさえであり得る。例えば、Ｍｅｎ−Ａの糖は、５０〜５００ｋＤａ、例えば、６０〜８０ｋＤａの範囲であり得、Ｍｅｎ−Ｃの糖は、１００〜２１０ｋＤａの範囲であり得、Ｍｅｎ−Ｗ１３５の糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば、１２０〜１４０ｋＤａの範囲であり得、および／またはＭｅｎ−Ｙの糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば、１５０〜１６０ｋＤａの範囲であり得る。
【００５２】
再構成されたワクチンにおける血清群あたりの髄膜炎菌性糖の質量は、通常、１μｇ〜２０μｇの間であり、例えば、血清群あたり２〜１０μｇの間、または約４μｇ、または約５μｇ、または約１０μｇであろう。二つ以上の血清群に由来する複合体が含まれる場合、それらは、実質的に等しい質量において存在し得、例えば、各血清群の糖の質量は、お互いの＋１０％内である。同じ比率の代わりに、２倍の質量の血清群Ａの糖を使用してもよい。したがって、ワクチンは、１０μｇのＭｅｎ−Ａの糖と、それぞれ５μｇのＭｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙの糖を含み得る。
【００５３】
好ましい担体タンパク質は、細菌毒素、例えば、ジフテリアまたは破傷風毒素など、またはトキソイド、あるいはそれらの変異体である。これらは、複合体ワクチンにおいて一般的に使用される。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は、特に好ましい［６０］。他の好適な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［６１］、合成ペプチド［６２、６３］、熱ショックタンパク質［６４、６５］、百日咳菌タンパク質［６６、６７］、サイトカイン［６８］、リンホカイン［６８］、ホルモン［６８］、成長因子［６８、］様々な病原菌誘導抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［６９］、例えばＮ１９［７０］など、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［７１〜７３］、ニューモリシン［７４］もしくはその無毒の誘導体［７５］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７６］、鉄取込タンパク質［７７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡもしくはＢ［７８］、組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｉｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［７９］、などが挙げられる。単一の担体タンパク質は、多数の異なる血清群に由来する糖を有し得るが［８０］、このアレンジメントは好ましくない。凍結乾燥された成分が、２種以上の髄膜炎菌性血清群に由来する複合体を含む場合、様々な複合体は、異なる担体タンパク質を使用し得るか（例えば、一方はＣＲＭ１９７の血清群を使用し、他方は破傷風トキソイドを使用するなど）、あるいは同じ担体タンパク質を使用し得る（例えば、２つの血清群に由来する糖を別々にＣＲＭ１９７に複合化させ、次いで組み合わせる）。
【００５４】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）〜５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する複合体は、例えば、１：２〜５：１の間の比率および１：１．２５〜１：２．５の間の比率などにおいて使用され得る。参考文献８１に記載されているように、混合物における異なる髄膜炎菌性血清群の複合体は、異なる糖：タンパク質の比率を有し得、例えば、あるものは１：２〜１：５の間の比率を有し得、別のものは５：１〜１：１．９９の間の比率を有する。
【００５５】
参考文献８２において開示されている特徴を有する糖および複合体が有用である。
【００５６】
担体分子は、直接または結合基を介して、共有結合により髄膜炎菌性糖に複合化されていてもよい。例えばアジピン酸結合基などの様々な結合基が公知であり、これは、（例えば、アミノ化によって糖に導入された）遊離−ＮＨ２基とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を用いて）カップリングさせ、次いで、結果として得られる糖−アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングさせることによって形成され得る［８３、８４］。別の好ましいタイプの結合は、カルボニル結合基であり、これは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとを反応させ［８５、８６］、次いでタンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成され得る。他の結合基としては、β−プロピオンアミド［８７］、ニトロフェニル−エチルアミン［８８］、ハロアシルハライド［８９］、グリコシド結合［９０］、６−アミノカプロン酸［９１］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ：Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）［９２］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９３］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［９４］、などが挙げられる。カルボジイミド縮合も使用することができる［９５］。
【００５７】
参考文献９６に記載されているように、混合物は、一方として糖／タンパク質の直接の結合を有する複合体と、他方として結合基を介した結合を有する複合体とを含み得る。このアレンジメントは、異なる髄膜炎菌性血清群に由来する糖複合体を使用する場合に特に適用し、例えば、Ｍｅｎ−Ａの糖とＭｅｎ−Ｃの糖を、結合基を介して結合してもよいし、あるいは、Ｍｅｎ−Ｗ１３５の糖とＭｅｎ−Ｙの糖を、担体タンパク質に直接結合してもよい。
【００５８】
組成物は、Ｍｅｎ−Ａ複合体、Ｍｅｎ−Ｃ複合体、Ｍｅｎ−Ｗ複合体、および／またはＭｅｎ−Ｙ複合体の１つ以上を含んでおり、いくつかの実施形態において、有利には、さらにＨｉｂ複合体をも含み得る（下記を参照のこと）。組成物が、２種以上の髄膜炎菌性血清群に由来する糖を含む場合、血清群あたりの糖質量は平均糖質量となる。それぞれ実質的に等しい質量の血清群が使用されている場合、平均質量は、それぞれの個々の質量と同じであろうが、等しくない質量が用いられる場合は、当該平均はそれぞれの個々の質量とは異なり、例えば、Ｍｅｎ−ＡＣＷＹ混合物において１０：５：５：５μｇが使用される場合、平均質量は、血清群あたり６．２５μｇである。Ｈｉｂ糖も含まれる場合、いくつかの実施形態において、その質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量と実質的に同じであろう。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量よりも多いであろう（例えば、少なくとも１．５倍）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量よりも少ないであろう（例えば、少なくとも１．５倍）［９７］。
【００５９】
水中油エマルションアジュバント
様々な水中油エマルションアジュバントが公知であり、それらは、通常、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤とを含み、当該油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）であり、かつ生体適合性である。エマルション中の油滴は、一般的に、直径５μｍ未満であり、サブミクロン直径さえ有し得、これらの小さいサイズは、安定したエマルションを提供するために、微細流動化装置により達成される。濾過滅菌を実施できるように、２２０ｎｍより小さいサイズの油滴が好ましい。
【００６０】
本発明は、油、例えば、動物（例えば、魚）源または植物源に由来するもの、と一緒に使用され得る。植物油の源としては、ナッツ、種子、および穀物が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能で、代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、他のシリアル穀物、例えば、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦など、の油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの、６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中には天然には存在しないが、ナッツ油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルクに由来する脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化、および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収することができる代謝可能な油を含有している。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨蝋などのクジラ油が、いくつかの代表的な魚油であり、これらは本明細書中において使用することができる。いくつかの分枝鎖油は、５−炭素イソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドと称される。サメの肝油は、スクワレンとして公知の分岐状の不飽和テルペノイドである２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンを含有するが、これは、本明細書において特に好ましい。スクワレンの飽和類似体であるスクワランも好ましい油である。スクワレンおよびスクワランなどの魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロールである。油の混合物を使用することができる。
【００６１】
組成物がトコフェロールを含んでいる場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。当該トコフェロールは、例えば、様々な塩および／または異性体などのいくつかの形態をとり得る。塩としては、有機塩、例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などが挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは、両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。
【００６２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）に応じて分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと称される）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ：ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、プロピレンオキシド（ＰＯ：ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ：ｂｕｔｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）のコポリマー、例えば、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売される直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深く；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）など；ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）など；並びにソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート、を含む界面活性剤を使用し得るが、これらに限定されるものではない。エマルション中に含まれる好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００６３】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））と、オクトキシノール、例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）との組合せも好適である。別の有用な組み合せは、ラウレス−９と、さらにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【００６４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【００６５】
本発明に有用な特定の水中油エマルションアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
・スクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルション。容量によるエマルションの組成は、約５％のスクワレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量では、これらの比率は、４．３％のスクワレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、参考文献１０１の第１０章および参考文献１０２の第１２章に、より詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として公知である［９８〜１００］。当該ＭＦ５９エマルションは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、を含み得る。
【００６７】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０のエマルション。当該エマルションは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。さらにＳｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、より安定なエマルションが得られるように、スクワレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１である。スクワレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を得るためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）の混合物と混合し、次いで微細流動化することにより作製することができる。結果として得られたエマルションは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間の平均直径、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。
【００６８】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルション。当該エマルションはさらに３ｄ−ＭＰＬも含み得る。当該エマルションは、リン酸緩衝液を含有し得る。
【００６９】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。当該エマルションは、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）において、これら３つの成分を含み得、並びにこれらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分による任意の寄与を含むべきである。当該エマルションはさらにスクワレンも含み得る。当該エマルションはさらに、３ｄ−ＭＰＬも含み得る。当該水相はリン酸緩衝液を含有し得る。
【００７０】
・スクワラン、ポリソルベート８０、およびポロクサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルション。当該エマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水において、ｐＨ７．４で処方され得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドのために有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてトレオニル−ＭＤＰと共に使用される［１０３］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクワラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントのように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを含まずに使用され得る［１０４］（５％のスクワラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。なお、微細流動化が好ましい。
【００７１】
・スクワレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルション。当該エマルションは、好ましくは、熱可逆性であり、および／または少なくとも９０％（体積比）が２００ｎｍ未満のサイズである油滴を有する［１０５］。当該エマルションはさらに、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１つ以上も含み得る。そのようなエマルションは、凍結乾燥され得る。
【００７２】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン界面活性剤を有するエマルション。参考文献１０６に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの油滴サイズが有利である。
【００７３】
・代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０）のサブミクロン水中油エマルション。添加物としては、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物複合体（例えば、参考文献１０７に記載される、グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンを挙げることができる。
【００７４】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１０８］。
【００７５】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１０８］。
【００７６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が、螺旋状のミセルとして会合しているエマルション［１０９］。
【００７７】
水中油エマルションは、それ自体アジュバントとして、またはさらなる免疫賦活化合物、例えば、免疫賦活オリゴヌクレオチド、３ｄ−ＭＰＬなど、のための担体として使用することができる。
【００７８】
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとしても知られる）は、モノホスホリル脂質Ａにおける還元末端グルコサミンの３の位置が脱アシル化されているアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損変異体から調製されており、化学的に脂質Ａと同様であるが、酸不安定ホスホリル基および塩基不安定アシル基が欠損している。３ｄＭＰＬの調製は、元は参考文献１１０に記載されていた。
【００７９】
再構成およびパッケージング
本発明の凍結乾燥された抗原成分は、最終的に、患者への投与に好適な材料を得るために、液体成分により再構成される。当該再構成は、通常、使用の時点において実施される。したがって、抗原および水中油エマルションアジュバントは、パッケージングされたワクチンキットまたは配布されたワクチンキットにおいて別々に保たれ、使用の時点で最終的な処方物へと再構成される状態にあり得る。
【００８０】
２つの容器を有するキットにおいて、一方の容器は再構成のための液体を含み、第２の容器は凍結乾燥した材料を含む。第２の容器は、通常、密閉して封止されているであろう。当該液体は、通常、第１の針により第２の容器中に導入され、それにより、凍結乾燥した材料が液体形態へと再構成される。次いで、当該液体は、通常、患者への投与のために注射器へと回収されるであろう。この回収工程は、第１の針を介して行われてもよいが、多くの場合、第２の針を介して行われるであろう。回収のために使用される針は、次に患者への注射に使用される針と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００８１】
第２の容器は、通常、バイアルであるだろう。凍結乾燥した材料を再構成するための水中油エマルションも、バイアル中に収容されていてもよいが、代替手段として、注射器中に収容されていてもよい。さらなるアレンジメントは、複室型注射器における別々の室として第１および第２の容器を有することにより、作動させる時に液体材料が第１の容器から第２の容器へと導入される。次いで、当該混合され再構成された材料は、液体形態において注射器から放出され得る。しかしながら、すべての場合において、当該凍結乾燥された材料および液体材料は、混合する準備が整うまで別々に保たれる。
【００８２】
水中油エマルションは、通常、その液体形態において使用されるが、本発明のいくつかの実施形態においては、凍結乾燥した水中油エマルションアジュバントを使用することが可能である。この方法におけるエマルションアジュバントの凍結乾燥は、例えば、参考文献１０５および１１１において開示されている。これらの乾燥したエマルションは、依然として、使用時に、例えば水性担体を用いて、液体形態へと再構成されるであろう。凍結乾燥されたアジュバントおよび凍結乾燥された抗原成分は、別々のキット構成部分であり得るが、いくつかの実施形態においては、それらは凍結乾燥された形態で（凍結乾燥前または凍結乾燥後のいずれかにおいて）混合されていてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、凍結乾燥された水中油エマルションと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物との混合物を含む組成物を提供する。この混合された凍結乾燥組成物は、１つの再構成工程において水中油エマルションアジュバントを有するＭｅｎ−Ｂ組成物を得るために水性担体と混合され得る。
【００８３】
したがって、キットは、例えば、２つのバイアル、１つの充填済み注射器、および１つのバイアルなどを備えていてもよい。注射器は、一般的に、単回用量の組成物を含み、一方で、バイアルは、単回投用量または複数回用量を含み得る。したがって、複数回用量形態では、あらかじめ充填された注射器よりもバイアルの方が好ましい。
【００８４】
患者に投与する前に、さらなる液体材料および／または凍結乾燥された材料を添加してもよい。
【００８５】
凍結乾燥された成分のための容器は、キャップ（例えば、Ｌｕｅｒ ｌｏｃｋ）を有していてもよく、このキャップは、予め充填された注射器をキャップ中に差し込むことができ、当該注射器の内容物がバイアルの中に放出されてその中の凍結乾燥された材料を再構成することができ、当該バイアルの内容物が注射器に戻し入れられ得るように調整されたキャップである。バイアルから注射器を取り外した後、針を取り付けることができ、並びにワクチンを患者に投与することができる。当該キャップは、キャップを差し込む前にシールまたはカバーを除去しなければならないように、シールまたはカバーの内側に配置してもよい。
【００８６】
成分がバイアル中にパッケージされる場合、当該バイアルは、好ましくは、ガラス製またはプラスチック材料製である。当該バイアルは、好ましくは、それに材料を添加する前に滅菌される。ラテックスに敏感な患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、ラテックス不含ストッパーでシールすることができる。当該バイアルは、単回用量のワクチンを含んでいてもよく、あるいは、２回以上の用量、例えば１０回用量、を含んでいてもよい（「多用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
【００８７】
当該ワクチンが注射器中にパッケージされている場合、当該注射器は、それに取り付ける針を備えていてもよいし、または針を備えていなくもよい。組み立てて使用するために、注射器と共に別個の針を供給してもよい。針は安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が一般的である。注射器は、記録の保持を容易にするために、ロット番号と内容物の有効限日をその上に印刷することができる剥離式のラベルを備えて提供してもよい。注射器のプランジャは、好ましくは、吸引の際に偶然にプランジャが外れてしまうことを防ぐためのストッパーを備えている。
【００８８】
ガラス製の容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもむしろホウケイ酸ガラス製の容器を使用することが好ましい。
【００８９】
ワクチンは、通常、０．５ｍｌ用量において患者に投与されるため、第１の容器中の液体の量は、再構成後に、消耗量にあたる少なくとも０．５ｍｌ、例えば０．６ｍｌ、の投薬容量を得るために好適な量であろう。
【００９０】
安定性の理由から、本発明の凍結乾燥された成分は、安定化剤、例えば、ラクトース、スクロース、および／またはマンニトール、ならびにそれらの混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など、を含んでいてもよい。スクロース／マンニトール混合物を使用することによって、乾燥プロセスを迅速化することができる。凍結乾燥した成分はさらに、塩化ナトリウムも含み得る。凍結乾燥された材料における可溶性成分は、再構成後も組成物中に保有されるであろうから、したがって、最終的な液体ワクチンは、ラクトースおよび／またはスクロースを含み得る。
【００９１】
組成物は、参考文献１１２に記載されているように、温度保護剤を含んでいてもよい。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）が挙げられる。好適なＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有し得る。好ましい実施形態において、当該ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有し得る（「ＰＥＧ−３００」）。
【００９２】
医薬組成物
本発明の材料は、最終的に、患者に投与するための医薬組成物を調製するために使用されるであろう。これらは、通常、薬学的に許容される担体を含むであろう。薬学的に許容される担体についての詳細な説明は、参考文献１１３において入手可能である。
【００９３】
効果的な投薬容量は、慣習的に確立され得るが、当該組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射のために約０．５ｍｌの容量を有する。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、大腿部または上腕部への筋肉内注射により、０．５ｍｌ容量において投与されている［１１４］。ＭｅＮＺＢ（商標）は、大腿部の前外側または腕の三角筋部への筋肉内注射により、０．５ｍｌにおいて投与される。同様の用量を、他の送達経路に使用してもよく、例えば、噴霧のための鼻腔内ＯＭＶベースのワクチンは、スプレーあたり約１００μｌまたは約１３０μｌの容量を有し得るので、約０．５ｍｌの全用量を与えるために４回のスプレーが投与される。
【００９４】
再構成後の組成物のｐＨは、好ましくは６〜８の間であり、より好ましくは６．５〜７．５の間（例えば、約７）である。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンのｐＨは、７．４であり［１１５］、本発明の組成物にはｐＨ＜７．５が好ましい。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用することによってｐＨを維持し、本発明の組成物における安定したｐＨは、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液の使用により維持され得る。本発明の組成物は、一般的に、緩衝液を含むであろう。緩衝液成分は、所望するような、最終的な再構成後のアレンジメントを得るために、必要に応じて、液体成分中および／または凍結乾燥成分中に配置されるであろう。
【００９５】
当該組成物は、滅菌および／または発熱物質不含であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００９６】
患者への投与のための本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、通常は、予防的である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原（単数または複数）、並びに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単一用量または一連の用量の一部のいずれかにおいて個体に投与される量が、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個々の免疫システムの能力、所望される防御の度合い、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価、および他の関連要因に応じて変わる。この量は、日常的な試験によって特定することができる比較的広い範囲に入ることが予測される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般的に、１用量あたりのタンパク質の量を単位として表される。ＯＭＶベースの鼻腔内ワクチンの場合、１ｍｌあたりタンパク質約０．９ｍｇの用量が典型的である。
【００９７】
髄膜炎菌は、身体の様々な領域に影響を与え、そのため、本発明の組成物は、様々な液体形態において調製され得る。例えば、当該組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され得る。当該組成物は、微細スプレーを使用して、例えば吸入器による肺投与のために調製され得る。当該組成物は、鼻内、耳内、または眼内投与のために、例えば、スプレーまたは液滴として調製され得る。筋肉内投与のためには、注射可能物が典型的である。
【００９８】
本発明の組成物は、特に複数回用量方式においてパッケージングされる場合に、抗菌剤を含んでいてもよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌薬が、一般的にワクチン中に見出されるが、水銀不含の防腐剤を使用するかまたは全く防腐剤を使用しないかのいずれかが好ましい。
【００９９】
本発明の凍結乾燥した成分および／または同時パッケージされた水中油エマルションアジュバントは、実質的にアルミニウム塩を含み得ない。このアレンジメントにより、本発明の再構成された組成物がアルミニウム塩を実質的含まないことが可能となる。
【０１００】
本発明の組成物は、洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。洗浄剤は、一般的に、低濃度、例えば＜０．０１％で存在する。
【０１０１】
本発明の組成物は、ＯＭＶ調製物に由来する残留洗浄剤（例えば、デオキシコーレート）を含み得る。残留洗浄剤の量は、Ｍｅｎ−Ｂタンパク質１μｇに対して、好ましくは０．４μｇ未満（より好ましくは、０．２μｇ未満）である。
【０１０２】
本発明の組成物は、髄膜炎菌に由来するＬＯＳを含み得る。ＬＯＳの量は、タンパク質１μｇに対して、好ましくは０．１２μｇ未満（より好ましくは０．０５μｇ未満）である。
【０１０３】
本発明の組成物は、張性を与えるためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。ＮａＣｌの１０±２ｍｇ／ｍｌ濃度が典型的であり、例えば約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１０４】
処置方法
本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための方法であって、本発明の液体医薬組成物を当該哺乳動物に投与する工程を含む方法も提供する。当該免疫反応は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を伴う。当該方法は、既にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して初回免疫されている患者において、追加免疫反応を引き起こし得る。ＯＭＶに対する皮下および鼻内の初回免疫／追加免疫レジメンは、参考文献１１６に開示されている。
【０１０５】
当該哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的用途のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児または乳児）または十代の若者であり、当該ワクチンが治療用途のためのものである場合、ヒトは好ましくは成人である。小児を意図したワクチンはさらに、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与され得る。
【０１０６】
本発明はさらに、医薬品としての使用のための本発明の組成物および混合物を提供する。当該医薬品は、好ましくは、哺乳動物において免疫反応を惹起することができ（すなわち、これは、免疫原性組成物である）、並びにより好ましくはワクチンである。
【０１０７】
本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、本発明の組成物および混合物の使用も提供する。本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバント、および（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物の使用を提供する。当該使用はさらに、（ｉｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖も伴い得る。
【０１０８】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の疾患、例えば細菌性（または、より詳細には髄膜炎菌性）髄膜炎、または敗血症の予防および／または処置のためである。
【０１０９】
治療処置の効力を確認する方法の１つは、本発明の組成物の投与後のナイセリア感染症のモニタリングを伴う。予防的処置の効力を確認する方法の１つは、組成物の投与後の抗原に対する免疫反応のモニタリングを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験対象（例えば、１２〜１６ヶ月齢の小児または動物モデル［１１７］）に投与し、次いで血清細菌性抗体（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的パラメータを測定することにより、特定することができる。これらの免疫反応は、一般的に、当該組成物の投与の約４週間後に特定され、当該組成物の投与前に測定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ上昇が好ましい。１用量より多い組成物が投与される場合、１回より多くの投与後の特定が行われ得る。
【０１１０】
一般的に、本発明の組成物は、対象に投与された後、血清殺菌抗体反応を誘導することができる。これらの反応は、マウスにおいて簡便に測定されるものであり、ワクチン効力の標準的指標である。血清殺菌活性（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、補体によって媒介される細菌死滅を評価するものであり、ヒトの補体またはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイすることができる。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、９０％より多くの受容体において、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。ＭｅＮＺＢ（商標）は、第３の用量の投与の４〜６週間後に、ＳＢＡにおいて４倍の上昇を惹起する。
【０１１１】
好ましい組成物は、ヒト対象患者において、容認可能な割合の対象に対して血清防御の基準より優れた抗体力価を与え得る。その力価より上では宿主が抗原に対して血清変換されると考えられる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの組織により公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意な試料の８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、さらにより好ましくは９３％より多く、並びに最も好ましくは９６〜１００％が血清変換される。
【０１１２】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ）により、または他の好適な経路により達成され得る。本発明は、全身性免疫および／または粘膜性免疫を惹起するために使用され得る。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下組織用針）を介し得るが、代わりに無針注射を用いてもよい。典型的な筋肉内用量は０．５ｍＬである。
【０１１３】
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられ得る。初回用量スケジュールに続いて、追加免疫用量スケジュールが行われ得る。初回免疫投薬の間（例えば、４〜１６週間）、および初回免疫と追加免疫との間の好適なタイミングは、慣習的に決定され得る。ＯＭＶベースのＲＩＶＭワクチンは、０．２ヶ月、および８ヶ月あるいは０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月、および８ヶ月でのワクチン接種による３回投薬または４回投薬の初回免疫スケジュールを用いて試験した。６週間の間隔で、３回投薬としてＭｅＮＺＢ（商標）を投与する。
【０１１４】
本発明の組成物は、髄膜炎菌の２種以上の高毒性系統に対する殺菌抗体反応を誘導するために使用され得る。特に、それらは、好ましくは、以下の３つの高毒性系統：（ｉ）クラスターＡ４、（ｉｉ）ＥＴ５複合体、および（ｉｉｉ）系統３、のうちの２つまたは３つに対して殺菌反応を誘導することができる。加えて、それらは、高毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、またはＥＴ−３７複合体の１つ以上に対する殺菌抗体反応、並びに他の系統、例えば高侵襲性系統、に対する殺菌抗体反応を誘導し得る。これは、当該組成物がこれら高毒性系統内のそれぞれおよびすべての髄膜炎菌の菌株に対して殺菌抗体を誘導することができることを必ずしも意味するものではなく、当該組成物によって誘導される抗体は、例えば、特定の高毒性系統のうちの４つ以上の髄膜炎菌株の任意の所定の群に対し、当該群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）に対して殺菌性である。好ましい菌株の群は、以下の国：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ、およびＣＵのうちの少なくとも４つにおいて単離された菌株を含むであろう。当該血清は、好ましくは、少なくとも１０２４の殺菌力価を有し（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、またはそれ以上、好ましくは少なくとも２１４）、例えば、当該血清は、１／１０２４に希釈された場合の特定の菌株の試験細菌の少なくとも５０％を殺傷することができる。
【０１１５】
有用な組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌の以下の菌株：（ｉ）クラスターＡ４由来の菌株９６１−５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／または菌株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来の菌株ＭＣ５８（Ｂ１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または菌株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の菌株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／または菌株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）、に対して殺菌反応を誘導することができる。より好ましい組成物は、菌株９６１−５９４５、菌株４４／７６、および菌株３９４／９８に対する殺菌反応を誘導することができる。
【０１１６】
菌株９６１−５９４５および菌株Ｇ２１３６は、両方ともＮｅｉｓｓｅｒｉａＭＬＳＴ参考株である［参考文献１１８のｉｄ６３８および１００２］。菌株ＭＣ５８は広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５）、参考文献１１９において配列決定されている。菌株４４／７６は広く用いられ、特徴解析されており（例えば、参考文献１２０）、ＮｅｉｓｓｅｒｉａＭＬＳＴ参考株の１つである［参考文献１１８のｉｄ２３７；参考文献１９の表２の３２行］。菌株３９４／９８は、元は１９９８年にニュージーランドにおいて単離されており、この菌株を使用していくつかの研究が発表されている（例えば、参考文献１２１および１２２）。菌株ＢＺ１９８は、別のＭＬＳＴ参考株である（参考文献１１８のｉｄ４０９；参考文献１９の表２の４１行）。
【０１１７】
本発明のさらなる組成物
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、ただし、当該組成物は、菌株Ｆ９１；ＪＢ１０１２４；またはＨＰ１０１２４のいずれかに由来する小胞を含まない、抗原性組成物を提供する。
【０１１８】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、当該小胞がＬ２またはＬ３免疫型の菌株に由来する、抗原性組成物を提供する。当該組成物は、Ｌ２およびＬ３菌株の両方に由来する小胞を含み得る。
【０１１９】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、当該小胞がシアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないＬＯＳを含む、抗原性組成物を提供する。
【０１２０】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が精製されたｆＨＢＰタンパク質を含む、抗原性組成物を提供する。当該組成物は、上記において説明したような、ｆＨＢＰの二つ以上の変異体を含み得る。
【０１２１】
これらの凍結乾燥された組成物は、水中油エマルションを含むアジュバントによる再構成に好適であり、したがって、それらは、本発明のキット構成要素としての使用のため、または本発明の方法における使用のため、などに好適である。エマルションアジュバントを含まずにそれらを販売または配布してもよいが、それでも、それらは本発明の独立した実施形態である。しかしながら、それらは、液体アジュバントを含む別の容器と組み合わせて、キット形態にパッケージングしてもよい。この液体アジュバントは、好ましくは水中油エマルションを含む。
【０１２２】
本発明はさらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの膜小胞とサブミクロンの水中油エマルションとを含むアジュバント化された抗原性組成物を提供する。当該エマルションは、好ましくはスクワレンおよび／またはポリソルベート８０を含む。当該エマルションの油滴の直径は、理想的には＜５００ｎｍである。当該小胞は、上記において説明したような１種以上のタンパク質を過剰発現し得、および／または上記において説明したようなノックアウト変異体の１種以上、例えば、ＬＯＳを切端するためにダウンレギュレーションまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ、アップレギュレーションされたＴｂｐＡなど、を含み得る。「ブレブ内」複合化を用いてもよい。このアジュバント化された組成物は、上記において説明したように、凍結乾燥された抗原をエマルションと混合することによって調製してもよく、あるいは対照的に、水性小胞調製物を使用して調製してもよい。
【０１２３】
さらなる抗原性成分
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する抗原に加えて、組成物は、さらなる病原菌に由来する抗原を含んでいてもよい。例えば、当該組成物は、以下のさらなる抗原：
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原、例えば、（通常、複合化された）糖など、
−Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原、例えば、表面抗原ＨＢｓＡｇなど、
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する抗原、例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ：ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する糸状性赤血球凝集素（ＦＨＡ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、必要に応じて、ペルタクチンならびに／あるいは凝集原２および凝集原３との組み合わせにおいて、
−ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイドなど、
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイドなど、
−通常、複合化された、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ（Ｈｉｂ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）に由来する糖抗原、
−不活化されたポリオウイルス抗原
の１つ以上を含み得る。
これらのさらなる抗原は、水中油エマルションと同じ容器における液体形態において、凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原と同じ容器における凍結乾燥した形態において、または第３の容器（凍結乾燥された形態、または、通常は液体形態のいずれかにおいて）に含まれ得る。
【０１２４】
ジフテリア抗原が当該組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。したがって、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０１２５】
Ｈｉｂ糖が含まれる場合（通常、複合体として）、当該糖部分は、多糖（例えば、細菌から精製されるような全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ：ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））であり得るが、オリゴ糖（例えば、ＭＷは約１〜約５ｋＤａ）を作製するために、例えば加水分解によって、精製された糖を断片化することも可能である。再構成されたワクチンにおけるＨｉｂ複合体の濃度は、通常、０．５μｇ〜５０μｇ、例えば、１〜２０μｇ、１０〜１５μｇ、１２〜１６μｇ、などの範囲であろう。当該量は、約１５ｇであり得るか、またはいくつかの実施形態では約１２．５μｇであり得る。５μｇ未満の質量が、好適であり得、例えば、１〜５μｇの範囲、２〜４μｇの範囲、または約２．５μｇであり得る［１２３］。上記において説明したように、Ｈｉｂ糖および髄膜炎菌性糖を含む組み合わせにおいて、前者の用量は、後者の用量に基づいて選択され得る（特に、多数の髄膜炎菌性血清群の場合、それらの平均質量により）。Ｈｉｂ複合体のさらなる特性は、担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などの選択を含めて、髄膜炎菌性複合体に対して上記において説明した通りである。
【０１２６】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が含まれる場合、これは、ポリペプチドまたは糖であってもよい。複合体莢膜糖は、肺炎球菌に対して免疫するために特に有用である。当該糖は、細菌からの当該糖の精製の際に生じるサイズを有する多糖であり得るか、または、そのような多糖の断片化により達成されたオリゴ糖であり得る。７価のＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品において、例えば、６つの糖は完全な多糖として存在し、残りの１つ（１８Ｃ血清型）は、オリゴ糖として存在する。組成物は、以下の肺炎球菌の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および／または３３Ｆの１つ以上に由来する莢膜糖を含み得る。組成物は、多数の血清型、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、またはそれ以上の血清型を含み得る。７価、９価、１０価、１１価、および１３価の複合体の組み合わせは、２３価の複合化されていない組み合わせと同様に、当技術分野において既に公知である。例えば、１０価の組み合わせは、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する糖を含み得る。１１価の組み合わせは、さらに、血清型３に由来する糖を含み得る。１２価の組み合わせは、１０価の混合物に、血清型６Ａおよび１９Ａ、６Ａおよび２２Ｆ、１９Ａおよび２２Ｆ、６Ａおよび１５Ｂ、１９Ａおよび１５Ｂ、ｒ２２Ｆおよび１５Ｂを加え得る。１３価の組み合わせは、１１価の混合物に、血清型１９Ａおよび２２Ｆ、８および１２Ｆ、８および１５Ｂ、８および１９Ａ、８および２２Ｆ、１２Ｆおよび１５Ｂ、１２Ｆおよび１９Ａ、１２Ｆおよび２２Ｆ、１５Ｂおよび１９Ａ、１５Ｂおよび２２Ｆ、などを加え得る。肺炎球菌複合体のさらなる特性は、担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などの選択を含めて、髄膜炎菌性複合体に対して上記において説明した通りである。組成物が２種以上の複合体を含む場合、各複合体は、同じ担体タンパク質を使用してもよいし、または異なる担体タンパク質を使用してもよい。参考文献１２４に、多価性肺炎球菌複合体ワクチンにおいて異なる担体タンパク質を使用する場合の潜在的利点が記載されている。
【０１２７】
一般論
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸから成り得るか、または何かの追加、例えば、Ｘ＋Ｙ、を含み得る。
【０１２８】
数値ｘとの関連において、用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２９】
言葉「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、言葉「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の組成物に対する、重ね合わせた２つの分析トレースを示す。当該線は、凍結乾燥前および再構成後の組成物である。本質的に、これらは非常に似ているため、１本の線だけが視認できる。
【図２】４℃で保存された組成物および３７℃で保存された組成物に対する、重ね合わせた２つの分析トレースを示す。図１とは異なり、２本の線が視認できる。
【図３】様々な処方物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１０本のレーンは、左から右へ、（１）：ＭＷマーカー、（２）〜（４）：１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および２５μｇ／ｍｌでの液体抗原、（５）：凍結乾燥前の、２％のマンニトールおよび３％のスクロースの混合物中における抗原、（６）：レーン（５）と同様であるが、ただし凍結乾燥およびｗｆｉによる再構成後、（７）：レーン（５）と同様であるが、ただし凍結乾燥およびＭＦ５９による再構成後、（８）〜（１０）：レーン（５）〜（７）と同様であるが、ただし５％スクロースにおいて、を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
Ｍｅｎ−Ｂワクチンにおけるアジュバントの含入
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＭｅｎ−Ｂワクチンの初期の前臨床評価は、最適な免疫反応は水酸化アルミニウムアジュバントの存在を必要とすることを示していた。しかしながら、このアジュバントの存在下でさえ、菌株適用範囲は不完全であった。例えば、試験したＳＴ３２およびＳＴ８菌株の１００％が、ワクチンによって惹起された血清によって死滅したが、ＳＴ１１菌株では、この値は６５％まで低下した。対照的に、アジュバントとしてＭＦ５９エマルションを使用すると、ＳＴ３２、ＳＴ８、およびＳＴ１１菌株のすべてに対して、１００％の適用範囲が得られた。さらなる実験により、ＭＦ５９の卓越性が確認された。
【０１３２】
同じ卓越性が、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する複合化莢膜糖をＭｅｎ−Ｂワクチンに加えた場合にも見られた。このＡ−Ｂ−Ｃ−Ｗ−Ｙワクチンによって達成された免疫原性は、抗細菌力価および菌株適用範囲に関して、水酸化アルミニウムを使用した場合よりＭＦ５９を使用する方がより良好であった。
【０１３３】
したがって、ＭＦ５９は、水酸化アルミニウムアジュバントと比較した場合、増強された免疫原性効力を提供する。しかしながら、これの安定性を試験したところ、４℃で保存した場合でさえ、約１２週間後に分解し始めた。より高い温度で保存した場合、分解は、早くも２週間後において明らかであり、６ヶ月後には完全に分解した。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒまたはサイズ排除クロマトグラフィーを使用した分析により、分解を確認した。対照的に、水酸化アルミニウムに吸着させた場合、当該抗原は、安定したままであった。
【０１３４】
ＭＦ５９において、非Ｂ血清群に由来する複合化された莢膜糖に対する安定性の低下も見られた。遊離シアル酸（Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙの莢膜糖における成分）のレベルは、４℃で保存したＭＦ５９−アジュバント化された処方物において、次第に上昇し、６ヶ月後には約１５％に達した。しかしながら、より高い温度では、当該遊離シアル酸のレベルは、約１０週間後に５０％に達し、６ヶ月で１００％に達した（すなわち、完全分解した）。
【０１３５】
したがって、ＭＦ５９によって達成された増強された免疫原性は、保存安定性を犠牲にしている。ＭＦ５９を使用し、および／または水酸化アルミニウムアジュバントへの吸着を必要としなくても、安定な処方物を達成することができるかどうかを見極めるために研究を実施した。
【０１３６】
Ｍｅｎ−Ｂの凍結乾燥
安定性の目的を達成する試みにおいて、Ｍｅｎ−Ｂ抗原を凍結乾燥した。再構成の後に、それらの効力が保持されていることを確認した。その上、Ｍｅｎ−Ｂ抗原と、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する複合化された莢膜糖との混合物に対しても安定性が確認された。
【０１３７】
例えば、図１は、Ｍｅｎ−Ｂタンパク質の溶出位置に一致するピークを有する、重ねられた２本の分析トレースを示す。当該トレースはほとんど同じであり、実質的な物理化学的変化がないことを明らかにしている。対照的に、図２は、４℃または３７℃のいずれかにおいて保存された同じ組成物の２本の重ねられたトレースを示しており、変化が容易に視認できる。他の解析技術により、凍結乾燥の前後にどのような検出可能な変化も存在しないことが確認された。個々のＭｅｎ−Ｂ抗原の無欠陥性が、４℃で６ヶ月の凍結乾燥保存の後でさえ保持されることが明らかとなった。
【０１３８】
当該組成物は、４．５％のマンニトールおよび１．５％のスクロースの存在下で凍結乾燥してある。
【０１３９】
したがって、アルミニウム塩への吸着を必要とせずに、髄膜炎菌性抗原の長期安定性を達成することができる。したがって、凍結乾燥により、当該抗原を、水中油エマルションとの組み合わせにおいて使用することが可能となり、それにより、これらのアジュバントに対して実証された増強された効力および菌株適用範囲が得られる一方で、関連する安定性問題を避けていることが可能となる。
【０１４０】
さらなる処方物
Ｍｅｎ−Ｂワクチンの凍結乾燥された提示のためのさらなる開発研究において、組み換えタンパク質ワクチンの２つの処方物を調製した。両方とも、凍結乾燥安定化剤としてスクロースを使用するが、一方にはさらにマンニトールも含まれている。浸透圧モル濃度は、３００ｍＯｓｍＵであり、並びにｐＨは７．０である。各バイアル瓶は、４０％過剰の１回ヒト用量に十分な材料を含み（７０μｇの各組み換えタンパク質、１５ｍｇのＰＢＳ、および１４ｍｇのマンニトールもしくは２１ｍｇのマンニトール＋３５ｍｇのスクロースのいずれか）、ＭＦ５９の７００μｌの水で（または、比較のため、ｗｆｉで）再構成される。
【０１４１】
湿気レベルは、凍結乾燥直後および低温および高温での１ヶ月後に測定した。湿気含有量は、約１．１％で一定のままであった。
【０１４２】
凍結乾燥前および再構成後のＲＰ−ＨＰＬＣトレースの比較は、両方の処方物におけるタンパク質が、凍結乾燥後、３７℃で１ヶ月でも安定に維持されることを示していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）およびウェスタンブロットも、３つのタンパク質は、４℃および３７℃の両方においてＭＦ５９またはｗｆｉのいずれかによる再構成後に、分解または凝集の兆しが無く、凍結乾燥プロセス後に安定であることが示された。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ分析からも同じ結果が得られた。サイズ排除クロマトグラフィーは、凍結乾燥により凝集の微増が生じるが、凝集の量は、その後、３７℃で３ヶ月後または４℃で６ヶ月後でさえ増加しないことを示していた。
【０１４３】
免疫原性の研究
免疫原性の研究において、マウスを使用して、ワクチン有効性についての凍結乾燥の効果を評価した。凍結乾燥した処方物をＭＦ５９で再構成し、即座にＭＦ５９と混合した（「２バイアル」アプローチとして）液体形態における同じ抗原に対して力価を比較した。当該処方物は、同様の力価を誘導した。
【０１４４】
より長期間の安定性を研究するため、２つの凍結乾燥された抗原調製物（一方をスクロースと共に凍結乾燥し、もう一方はスクロース＋マンニトールと共に凍結乾燥した）を４℃で保存し、それらの免疫原性を、３ヶ月および６ヶ月の保存の後に試験した。保存された抗原は、ＭＦ５９で再構成し（さらに抗原は４℃で保存した）、免疫化のために即座に使用した。比較のため、並行して、調製したばかりの水性抗原とＭＦ５９とを混合して試験した。
【０１４５】
２つの別々の研究によるＥＬＩＳＡの結果は、ＭＦ５９で再構成された場合、凍結乾燥した処方物は、調製されたばかりの新鮮な処方物によって惹起される場合と同様の抗体力価（ＧＭＴ）を誘導することを示していた。抗体反応をＳＢＡによって評価した場合も同様のことが確認され、例えば、スクロース−凍結乾燥抗原により、ゼロ時間において確認された３２７６８のＳＢＡ力価は、６ヶ月の保存後にも依然として確認された。したがって、Ｍｅｎ−Ｂ抗原は、凍結乾燥および保存後も活性を維持する。
【０１４６】
さらなる研究において、凍結乾燥した調製物を４℃または３７℃のいずれかで保存し、次いで免疫原性を評価した。３７℃で１ヶ月保存した後でさえ、凍結乾燥された抗体は、ＳＢＡ活性の喪失を示さなかった。
【０１４７】
凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原と混合されるエマルションのサイズ安定性
ＭＦ５９エマルションの油滴のサイズは、エマルションのみとして、または凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗体との混合物として、または対照抗原との混合物としてのいずれかにおいて、４℃および２５℃で２４時間後に測定した。液滴サイズ（ｎｍ）は、以下の通りであった。
【０１４８】
【表１】
したがって、凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原の存在下でのエマルションの粒子サイズは、４℃または２５℃で２４時間安定であり、基本的にそのままのエマルションと同じである。
【０１４９】
本発明は、例示のみの目的で記載されており、本発明の範囲および精神の内に維持しつつ改変がなされ得ることが理解されるであろう。
【０１５０】
参考文献
【０１５１】
【化１】
【０１５２】
【化２】
【０１５３】
【化３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌ワクチンを処方する分野にある。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ（「Ｍｅｎ−Ｂ」）に対する様々なワクチンが現在研究されているが、それらは１つの共通する特徴を有している。
【０００３】
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社（ＭＥＮＺＢ（商標））、Ｆｉｎｌａｙ研究所（ＶＡ−ＭＥＮＧＯＣ−ＢＣ（商標））、ノルウェー国立公衆衛生院（ＭＥＮＢＶＡＣ（商標））、およびオランダワクチン研究所（ＨＥＸＡＭＥＮ（商標）およびＮＯＮＡＭＥＮ（商標））によって製造された外膜小胞（ＯＭＶ：ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）製品はすべて、水酸化アルミニウムアジュバントを含む。参考文献１（非特許文献１）においてＮｏｖａｒｔｉｓ社によって報告された「ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ（血清群Ｂ髄膜炎菌のための万能ワクチン）」も、最近、参考文献２（非特許文献２）において報告された二価のＯＭＶワクチンと同様に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｉｕｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００６）１０３（２９）：１０８３４−９
【非特許文献２】Ｂｏｕｔｒｉａｕら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００７）１４：６５〜７３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＭｅｎ−Ｂワクチンの開発において、本発明者らは、最適な免疫原性はアジュバントの存在を必要とすることを見出した。さらに彼らは、水酸化アルミニウムへの吸着が、ワクチン抗原に対して良好な保存安定性を提供することを見出した。しかしながら、アルミニウム塩の使用の必要性を避けるために、代替手段が求められている。
【０００６】
Ｍｅｎ−Ｂワクチンのための非アルミニウムアジュバントの使用は既に公知である。例えば、参考文献３では、Ｍｅｎ−Ｂ小胞のためのアジュバントとしてＭＦ５９水中油エマルションの使用が報告されており、参考文献４では、アジュバントとして免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはＭＦ５９の使用について記載されている。ＭＦ５９による免疫原性の結果は素晴らしく、継続した調査により、このアジュバントが、水酸化アルミニウムと比較してＭｅｎ−Ｂワクチンの菌株対象範囲を広げることが明らかにされたが、さらに調べると、予期せず、水中油エマルションによってアジュバント化されたＭｅｎ−Ｂ免疫原の長期安定性が乏しいことが示された。したがって、本発明の目的は、水中油エマルションアジュバントを使用した場合の、Ｍｅｎ−Ｂワクチンの保存安定性を改善する方法を提供することにある。
【０００７】
水中油エマルションによってこれまで経験してきたことは、インフルエンザワクチンの分野で起きていることである。ＦＬＵＡＤ（商標）製品は、ＭＦ５９エマルションを含み、１つの容器において予め混合された液体の形式で配布される（「１バイアルアプローチ」）。この予め混合された処方物は、Ｍｅｎ−Ｂワクチンの安定性を乏しくすることが現在わかっている処方物である。
【０００８】
水中油エマルションワクチンによる「１バイアル」処方物の代替手段として、インフルエンザ（例えば、参考文献５を参照のこと）、ＨＳＶ（例えば、参考文献６）、およびＨＩＶ（例えば、参考文献７）に対して「２バイアル」アプローチが用いられており、これらにおける当該ワクチンおよびエマルションは、使用の時点で即座に混合するために、両方とも液体の形式で一緒に配布される。
【０００９】
本発明に従って、（ｉ）水中油エマルションアジュバントと、（ｉｉ）凍結乾燥した形態のＭｅｎ−Ｂ免疫原性成分との二成分処方物を用いた、Ｍｅｎ−Ｂワクチンのための異なるアプローチが行われる。凍結乾燥したＭｅｎ−Ｂ抗原は、患者に投与するために使用する時点において、液状のアジュバント化された形態へと再構成することができる。この処方物は、安定性および免疫原性の両方に関して、素晴らしい結果が得られることが見出された。
【００１０】
本発明者らはさらに、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｍｅｎ−Ａ、Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙ）に由来する複合糖の１種以上が含まれる場合に、凍結乾燥した成分が効力を維持し得ることを見出した。単一の凍結乾燥した成分を使用した、血清群Ｂを含む多数の髄膜炎菌性血清群に対して免疫するための抗原の組み合わせは、特に有利である。
【００１１】
したがって、本発明は、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントを収容した第１の容器と、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を収容した第２の容器とを含むキットを提供する。当該凍結乾燥した抗原性組成物は、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含み得る。
【００１２】
本発明はさらに、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントと、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物とを混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製する方法も提供する。当該凍結乾燥した抗原性組成物は、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含み得る。
【００１３】
本発明はさらに、（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原と、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖とを含む、凍結乾燥された抗原性組成物を提供する。この凍結乾燥された組成物は、水中油エマルションを含むアジュバントによる再構成のために好適であり、かつ本発明のキット構成要素としての使用に好適である。
【００１４】
凍結乾燥された抗原性組成物
本発明は、Ｍｅｎ−Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を使用する。それは、必要に応じて、Ｍｅｎ−Ａ、Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、および／またはＭｅｎ−Ｙの１つ以上に由来する複合化莢膜糖を含んでいてもよい。
【００１５】
Ｍｅｎ−Ｂ免疫原は、Ｍｅｎ−Ｂ細菌および／またはＭｅｎ−Ｂ組み換えタンパク質および／またはＭｅｎ−Ｂリポオリゴ糖（ＬＯＳ：ｌｉｐｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）に由来する膜小胞を含み得る。
【００１６】
Ｍｅｎ−ＢのＯＭＶの凍結乾燥は、当技術分野において公知であるが［８］、これらのＯＭＶは、その後に、アルミニウムホスフェートアジュバントと一緒に投与されている。したがって、水中油エマルションアジュバントと組み合わせた場合の抗原安定性の問題は報告されていない。同様に、ＭＦ５９によるその後の再構成を含めて、髄膜炎菌性複合化抗原の凍結乾燥は公知であるが［９］、これはＭｅｎ−Ｂ抗原との組み合わせにおいてではない。
【００１７】
小胞を含むＭｅｎ−Ｂ成分
Ｍｅｎ−Ｂワクチン成分としての使用のための小胞としては、細菌外膜のタンパク質成分を含む小胞を形成するために当該外膜を破壊することによって得られる任意のプロテオリポソーム小胞が挙げられる。したがって、当該用語は、ＯＭＶ（「ブレブ」と呼ばれる場合もある）、微小胞（ＭＶ［１０］）、および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１１］）を含む。
【００１８】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌増殖の際に自然に形成されて培地に放出される、天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、ブロス培地においてＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養し、（例えば、ろ過によって、または細胞のみをペレット化してより小さな小胞はペレット化しないような低速での遠心分離によって）ブロス培地中のより小さなＭＶから全細胞を分離して、次いで、（例えば、ろ過によって、ＭＶの示差的沈降または凝集によって、ＭＶをペレット化する高速遠心分離によって）細胞枯渇培地からＭＶを収集することによって得ることができる。ＭＶの産生において使用される菌株は、一般的に、培養において産生されるＭＶの量に基づいて選択することができ、例えば、参考文献１２および１３には、高いＭＶ産生を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａについて記載されている。
【００１９】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製されるが、（例えば、デオキシコレートによる）洗浄剤処理を用いて調製してもよいし、または洗浄剤を用いない方法で調製してもよい（例えば、参考文献１４を参照のこと）。好適なＯＭＶ調製物を得るための方法は、例えば、本明細書に引用する参考文献において開示されている。ＯＭＶを形成するための技術は、洗浄剤が沈殿しないような十分に高いｐＨにおいて、胆汁酸塩洗浄剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、デオキシコール酸ナトリウム［１５および１６］が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するために好ましい）によって細菌を処理する工程を含む［１７］。他の技術は、超音波処理、ホモジナイゼーション、微細流動化、キャビテーション、浸透圧ショック、摩砕、フレンチプレス、ブレンディングなどの技術を用いて、実質的に洗浄剤の不在下において［１４］実施され得る。洗浄剤を使用しないか、または少量しか使用しない方法では、ＮｓｐＡなどの抗原の有用性を維持することができる［１４］。したがって、約０．５％のデオキシコレート、またはより少ない、例えば、約０．２％、約０．１％、＜０．０５％、またはゼロ％のデオキシコレートを有するＯＭＶ抽出緩衝液を使用する方法であってもよい。
【００２０】
ＯＭＶ調製物のための有用なプロセスは、参考文献１８に記載されており、高速遠心分離法ではなく粗ＯＭＶの限外ろ過を伴う。当該プロセスは、限外ろ過の後に超遠心分離の工程を伴っていてもよい。
【００２１】
本発明の使用のために、任意のＭｅｎ−Ｂ菌株から小胞を調製することができる。それらは、任意の血清型（例えば、１，２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型、および任意の免疫型（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３，３，７、Ｌ１０など）であってもよい。髄膜炎菌は、高侵襲性系統および高毒性系統、例えば以下の７つの高毒性系統：サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、ＥＴ−５複合物、ＥＴ−３７複合物、Ａ４クラスター、系統３など、を含む任意の好適な系統に由来し得る。これら系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｅｎｚｙｍｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により規定されているが、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ）もまた髄膜炎菌を分類するために使用されており［参考文献１９］、例えばＥＴ−３７複合物は、ＭＬＳＴによりＳＴ−１１複合物であり、ＥＴ−５複合物はＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ−４１／４４である。小胞は、以下の亜型：Ｐ１．２、Ｐ１．２，５、Ｐ１．４、Ｐ１．５、Ｐ１．５，２、Ｐ１．５，ｃ、Ｐ１．５ｃ，１０、Ｐ１．７，１６、Ｐ１．７，１６ｂ、Ｐ１．７ｈ，４、Ｐ１．９、Ｐ１．１５、Ｐ１．９，１５、Ｐ１．１２，１３、Ｐ１．１３、Ｐ１．１４、Ｐ１．２１，１６、Ｐ１．２２，１４、の内の１つを有する菌株から調製することができる。
【００２２】
本発明において使用される小胞は、野生型Ｍｅｎ−Ｂ菌株または突然変異菌株から調製され得る。例えば、参考文献２０では、修飾されたｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られる小胞の調製について開示されている。参考文献２７では、ｎｓｐＡ発現が、ｐｏｒＡおよびｃｐｓの同時ノックアウトによりアップレギュレートされるはずであることが教示されている。特許文献２７〜２９では、ＯＭＶ産生のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのさらなるノックアウト変異体について開示されている。参考文献２１では、ｆＨＢＰがアップレギュレートされる小胞について開示されている。参考文献２２では、６つの異なるＰｏｒＡ亜型を発現するように修飾された菌株に由来する小胞の構築について開示されている。さらに、ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成された低内毒素レベルを有する変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用することができる［２３、２４］。これらの変異体または他の変異体は、すべて本発明において使用することができる。
【００２３】
したがって、本発明において使用されるＭｅｎ−Ｂ菌株は、いくつかの実施形態において、２つ以上のＰｏｒＡ亜型を発現し得る。６価および９価のＰｏｒＡ菌株は、以前に構築されている。この菌株は、２、３、４、５、６、７、８、または９つのＰｏｒＡ亜型：Ｐ１．７，１６、Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．１９，１５−１、Ｐ１．５−２，１０、Ｐ１．１２−１，１３、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１．２２，１４、Ｐ１．７−１，１、および／またはＰ１．１８−１，３，６を発現し得る。他の実施形態において、菌株は、ＰｏｒＡの発現に対してダウンレギュレートされていてもよく、その場合、例えば、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルと比較して（参考文献３０に開示されるように、菌株Ｈ４４／７６と比較して）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％など）減少しているか、さらにはノックアウトされている。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｍｅｎ−Ｂ菌株は、（対応する野生型菌株と比較して）特定のタンパク質を過剰発現し得る。例えば、菌株は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［４５］、ｆＨＢＰ［２１］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２５］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［２５］などを過剰発現し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Ｍｅｎ−Ｂ菌株は、参考文献２６〜２９において開示されているノックアウトおよび／または過剰発現変異の１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトのための好ましい遺伝子としては、
【数１】
【００２６】
突然変異株が使用される場合、いくつかの実施形態において、それらは、以下の特性：（ｉ）髄膜炎菌性ＬＯＳを切端するための、ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＨｓｆ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠損ｃｐｓ遺伝子複合体、の１つ以上またはすべてを有し得る。切端されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含んでいないものであり得、例えば、ガラクトース−欠損ＬＯＳであり得る。当該ＬＯＳは、α鎖を有し得ない。
【００２７】
ＬＯＳが小胞に存在している場合、そのＬＯＳとタンパク質成分とを結合するように小胞を処理することが可能である（「ブレブ内」結合［２９］）。
【００２８】
本発明は、異なる菌株に由来する小胞の混合物を使用し得る。例えば、参考文献３０では、使用国において流行している血清亜型を有する髄膜炎菌株由来の第１の小胞および使用国において流行している血清亜型を必ずしも有さない髄膜炎菌株由来の第２の小胞を含む、多価髄膜炎菌性小胞組成物を含むワクチンについて開示されている。参考文献３１にも、異なる小胞の有用な組み合わせが開示されている。Ｌ２およびＬ３免疫型のそれぞれの菌株に由来する小胞の組み合わせが、いくつかの実施形態において使用され得る。
【００２９】
小胞ベースの抗原は、Ｍｅｎ−Ｂ以外の血清群から調製することができる（例えば、参考文献１７に、Ｍｅｎ−Ａについてのプロセスが開示されている）。したがって、本発明は、Ｍｅｎ−Ｂ以外の血清群（例えば、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ）から調製された小胞を使用してもよい。しかしながら、主な焦点は、Ｍｅｎ−Ｂにある。
【００３０】
組み換えタンパク質を含むＭｅｎ−Ｂ成分
組み換えタンパク質も、Ｍｅｎ−Ｂに対するワクチン免疫原としての使用が報告されている。例えば、様々な抗原が、参考文献３２〜４０において報告されている。そのような抗原は、単独で、または組み合わせて使用してもよい。多数の精製タンパク質を組み合わせる場合、１０種以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２種）の精製抗原の混合物を使用することが有用である。
【００３１】
抗原の特に有用な組み合わせは、参考文献１および４０において開示されており、したがって、本発明の組成物は、（１）「ＮａｄＡ」タンパク質、（２）以前には「７４１」として知られていた「ｆＨＢＰ」タンパク質、（３）「９３６」タンパク質、（４）「９５３」タンパク質、および（５）「２８７」タンパク質、の１、２、３、４、または５つを含み得る。他の可能な抗原の組み合わせは、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ）およびＨｓｆ抗原を含み得る。他の可能な精製された抗原としては、以下のアミノ酸配列：参考文献３２からの配列番号６５０、参考文献３２からの配列番号８７８、参考文献３２からの配列番号８８４、参考文献３３からの配列番号４、参考文献３４からの配列番号５９８、参考文献３４からの配列番号８１８、参考文献３４からの配列番号８６４、参考文献３４からの配列番号８６６、参考文献３４からの配列番号１１９６、参考文献３４からの配列番号１２７２、参考文献３４からの配列番号１２７４、参考文献３４からの配列番号１６４０、参考文献３４からの配列番号１７８８、参考文献３４からの配列番号２２８８、参考文献３４からの配列番号２４６６、参考文献３４からの配列番号２５５４、参考文献３４からの配列番号２５７６、参考文献３４からの配列番号２６０６、参考文献３４からの配列番号２６０８、参考文献３４からの配列番号２６１６、参考文献３４からの配列番号２６６８、参考文献３４からの配列番号２７８０、参考文献３４からの配列番号２９３２、参考文献３４からの配列番号２９５８、参考文献３４からの配列番号２９７０、参考文献３４からの配列番号２９８８のうちの１つを含むタンパク質、あるいは、（ａ）上記配列に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有し、および／または（ｂ）上記配列に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸の断片を含み、ｎが７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれ以上）であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。（ｂ）に対して好ましい断片は、関連配列に由来するエピトープを含む。これらのポリペプチドの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６つ）が含まれ得る。
【００３２】
ｆＨＢＰ抗原は、３種の異なる変異体へ分類される［３９］。本発明のＭｅｎ−Ｂ成分は、１種のｆＨＢＰ変異体を含み得るが、有用には、２種または３種全部の変異体のそれぞれに由来するｆＨＢＰを含むであろう。したがって、これは、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質、（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質、ならびに／あるいは（ｃ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む第３のタンパク質、から選択される、２種または３種の異なる精製ｆＨＢＰの組み合わせを含み得る。
【００３３】
ａの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれ以上である。ａ、ｂ、およびｃの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００３４】
ｘの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙ、およびｚの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００３５】
いくつかの実施形態おいて、ｆＨＢＰタンパク質（単数または複数）は、例えば、Ｎ末端システインにおいて脂質化されるだろう。他の実施形態では、それらは脂質化されないだろう。
【００３６】
精製タンパク質をベースとする有用な組成物は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、（ｉｉ）配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、の混合物を含む。参考文献１および４０を参照のこと。
【００３７】
ＬＯＳを含むＭｅｎ−Ｂ成分
リポオリゴ糖をベースとする髄膜炎菌ワクチンは、すでに報告されている。当該ＬＯＳは、単独で使用してもよいし、または担体に複合化させてもよい。複合化している場合、複合化は、ＬＯＳのリピドＡ部分を介してもよいし、他の好適な部分、例えば、そのＫＤＯ残基によってでもよい。ＬＯＳのリピドＡ部分が無い場合は、そのような代替の結合が不可欠である。
【００３８】
当該ＬＯＳは、任意の免疫型、例えば、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ７などに由来していてもよい。
【００３９】
天然ＬＯＳを使用するよりもむしろ、修飾された形態を使用する方が好ましい。これらの修飾は、化学的に達成することができるが、特定の生合成付加を担う、Ｍｅｎ−Ｂにおける酵素をノックアウトする方がより簡便である。例えば、ＬＯＳは、天然のラクト−Ｎ−ネオテトラオースユニットの少なくとも末端Ｇａｌを除去するために修飾され得るが、この修飾は、１つ以上の関連する酵素をノックアウトすることによって達成することができる。天然ＬＯＳにおける２つの末端単糖（シアル酸およびガラクトース）の付加を担う酵素をノックアウトすることによって、末端Ｓｉａだけを除去することもできるし、またはＳｉａ−Ｇａｌの二糖を除去することもできる。例えば、ｌｇｔＢ遺伝子をノックアウトすると、Ｓｉａ−Ｇａｌが除去される。ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトによっても、有用な修飾ＬＯＳが得られる。リピドＡの脂肪トランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトしてもよい［４１］。
【００４０】
少なくとも１つの第一級Ｏ−結合脂肪酸を、ＬＯＳから除去してもよい［４２］。ＬＯＳ１分子あたりの第二級アシル鎖の数を減らしたＬＯＳも使用することができる［４３］。当該ＬＯＳは、α鎖を有し得ない。
【００４１】
当該ＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ２−リピドＡを含み得る［４４］。
【００４２】
混合Ｍｅｎ−Ｂ成分
本発明は、Ｍｅｎ−Ｂ抗原として、小胞、精製ポリペプチド、またはＬＯＳを使用し得る。本発明はさらに、これらの３つの抗原の組み合わせ、例えば、（ｉ）小胞＋精製ポリペプチド、（ｉｉ）小胞＋ＬＯＳ、（ｉｉｉ）精製ポリペプチド＋ＬＯＳ、または（ｉｖ）小胞＋精製ポリペプチド＋ＬＯＳ、を使用してもよい。これらの組み合わせは、個々の成分を別々に調製し、次いでそれらを混合することによって作製してもよい。例えば、参考文献４５では、より幅広い効力を組成物に提供するために、小胞に精製タンパク質を加えることが開示されている。
【００４３】
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ
血清群Ｃに対する複合化一価ワクチンは、ヒトへの使用が承認されており、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）、およびＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）が挙げられる。血清群Ａ＋Ｃに由来する複合体の混合物は公知であり［４６、４７］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来する複合体の混合物も報告されており［４８〜５１］、２００５年に水性ＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標）製品として承認されている。
【００４４】
本発明で使用される凍結乾燥された成分は、髄膜炎菌性血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの１、２、３、または４つ、例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど、に由来する莢膜糖の１つ以上の複合体を含み得る。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの４つすべてに由来する糖を含む成分が好ましい。
【００４５】
血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を有する、（α１→６）−結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ−３位でのアセチル化は、７０〜９５％であり得る。糖を精製するために使用される条件によっては、（例えば、塩基性条件下において）脱−Ｏ−アセチル化を生じ得るが、このＣ−３位にＯＡｃを保持することは有用である。いくつかの実施形態において、血清群Ａの糖におけるマンノサミン残基の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）は、Ｃ−３位においてＯ−アセチル化される。アセチル基をブロッギング基で置き換えることで、加水分解を防ぐことが可能であり［５２］、そのような修飾された糖は、依然として、本発明の意図する範囲内の血清群Ａの糖である。
【００４６】
血清群Ｃの莢膜糖は、（α２→９）−結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。糖構造は、→９）−ＮｅｕｐＮＡｃ７／８ＯＡｃ−（α２→として記述される。大部分の血清群Ｃの菌株は、シアル酸残基のＣ−７位および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を有するが、臨床単離株の約１５％は、これらのＯ−アセチル基が欠損している［５３、５４］。ＯＡｃ基の存在または欠損により特有のエピトープが生じ、糖に対する抗体結合の特異性は、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）菌株および脱−Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）菌株に対するその殺菌活性に影響を及ぼし得る［５５〜５７］。本発明で使用される血清群Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−菌株のいずれかから調製され得る。承認されているＭｅｎ−Ｃ複合体ワクチンとしては、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））糖の両方が挙げられる。いくつかの実施形態において、血清群Ｃの複合体の産生のための菌株は、例えば、血清型１６、血清亜型Ｐ１．７ａ，１などのＯＡｃ＋菌株である。したがって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１のＯＡｃ＋菌株が使用され得る。血清亜型Ｐ１．１におけるＯＡｃ＋菌株、例えば、Ｃ１１菌株なども有用である。
【００４７】
血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトース二糖ユニットのポリマーである。血清群Ｃの糖のように、それらは、種々のＯ−アセチル化を有するが、ただし、シアル酸の７位および９位においてである［５８］。当該構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→として記述される。
【００４８】
血清群Ｙの糖は、二糖繰り返しユニットがガラクトースの代わりにグルコースを含むこと以外は、血清群Ｗ１３５の糖と同じである。血清群Ｗ１３５のように、それらは、シアル酸の７位および９位に種々のＯ−アセチル化を有する［５８］。血清群Ｙの構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→として記述される。
【００４９】
本発明に従って使用される糖は、上記において説明したように（例えば、天然莢膜糖に見られるような同じＯ−アセチル化パターンで）Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、それらは、糖環の１つ以上の位置で、部分的にまたは全体的に脱−Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、それらは、天然の莢膜糖と比較して、過剰にＯ−アセチル化されていてもよい。
【００５０】
複合体の糖部分は、髄膜炎菌から調製されるような全長の糖を含んでいてもよく、および／または全長の糖の断片を含んでいてもよく、すなわち、当該糖は、細菌において見られる天然の莢膜糖より短い場合がある。したがって、当該糖は、糖の精製中あるいは精製後の、複合化の前に生じる脱重合反応により、脱重合され得る。脱重合は、糖の鎖長を減少させる。１つの脱重合方法は、過酸化水素の使用を伴う［４８］。過酸化水素を、（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度が得られるように）糖に添加し、次いで所望の鎖長の減少が達成されるまで、当該混合物を（例えば、約５５℃で）インキュベートする。別の脱重合方法は、酸加水分解を伴う［４９］。他の脱重合方法が、当技術分野において公知である。本発明による使用のための複合体を調製するために使用される糖は、これらの脱重合方法のいずれによって入手可能であり得る。脱重合は、免疫原性に対して最適な鎖長を与えるため、および／または物理的に扱いやすいように糖の鎖長を減少させるために用いることができる。いくつかの実施形態において、糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）：Ａ＝１０〜２０、Ｃ＝１２〜２２、Ｗ１３５＝１５〜２５、Ｙ＝１５〜２５、を有する。Ｄｐよりもむしろ分子量に関して、有用な範囲は、すべての血清群に対して、＜１００ｋＤａ、５ｋＤａ〜７５ｋＤａ、７ｋＤａ〜５０ｋＤａ、８ｋＤａ〜３５ｋＤａ、１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ、１５ｋＤａ〜２２ｋＤａである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、髄膜炎菌性血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する糖の平均分子量は、特にＭＡＬＬＳによって特定される場合に、５０ｋＤａ超、例えば、≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなど［５９］、および１５００ｋＤａまでさえであり得る。例えば、Ｍｅｎ−Ａの糖は、５０〜５００ｋＤａ、例えば、６０〜８０ｋＤａの範囲であり得、Ｍｅｎ−Ｃの糖は、１００〜２１０ｋＤａの範囲であり得、Ｍｅｎ−Ｗ１３５の糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば、１２０〜１４０ｋＤａの範囲であり得、および／またはＭｅｎ−Ｙの糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば、１５０〜１６０ｋＤａの範囲であり得る。
【００５２】
再構成されたワクチンにおける血清群あたりの髄膜炎菌性糖の質量は、通常、１μｇ〜２０μｇの間であり、例えば、血清群あたり２〜１０μｇの間、または約４μｇ、または約５μｇ、または約１０μｇであろう。二つ以上の血清群に由来する複合体が含まれる場合、それらは、実質的に等しい質量において存在し得、例えば、各血清群の糖の質量は、お互いの＋１０％内である。同じ比率の代わりに、２倍の質量の血清群Ａの糖を使用してもよい。したがって、ワクチンは、１０μｇのＭｅｎ−Ａの糖と、それぞれ５μｇのＭｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙの糖を含み得る。
【００５３】
好ましい担体タンパク質は、細菌毒素、例えば、ジフテリアまたは破傷風毒素など、またはトキソイド、あるいはそれらの変異体である。これらは、複合体ワクチンにおいて一般的に使用される。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は、特に好ましい［６０］。他の好適な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［６１］、合成ペプチド［６２、６３］、熱ショックタンパク質［６４、６５］、百日咳菌タンパク質［６６、６７］、サイトカイン［６８］、リンホカイン［６８］、ホルモン［６８］、成長因子［６８、］様々な病原菌誘導抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［６９］、例えばＮ１９［７０］など、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［７１〜７３］、ニューモリシン［７４］もしくはその無毒の誘導体［７５］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７６］、鉄取込タンパク質［７７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡもしくはＢ［７８］、組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｉｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［７９］、などが挙げられる。単一の担体タンパク質は、多数の異なる血清群に由来する糖を有し得るが［８０］、このアレンジメントは好ましくない。凍結乾燥された成分が、２種以上の髄膜炎菌性血清群に由来する複合体を含む場合、様々な複合体は、異なる担体タンパク質を使用し得るか（例えば、一方はＣＲＭ１９７の血清群を使用し、他方は破傷風トキソイドを使用するなど）、あるいは同じ担体タンパク質を使用し得る（例えば、２つの血清群に由来する糖を別々にＣＲＭ１９７に複合化させ、次いで組み合わせる）。
【００５４】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）〜５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する複合体は、例えば、１：２〜５：１の間の比率および１：１．２５〜１：２．５の間の比率などにおいて使用され得る。参考文献８１に記載されているように、混合物における異なる髄膜炎菌性血清群の複合体は、異なる糖：タンパク質の比率を有し得、例えば、あるものは１：２〜１：５の間の比率を有し得、別のものは５：１〜１：１．９９の間の比率を有する。
【００５５】
参考文献８２において開示されている特徴を有する糖および複合体が有用である。
【００５６】
担体分子は、直接または結合基を介して、共有結合により髄膜炎菌性糖に複合化されていてもよい。例えばアジピン酸結合基などの様々な結合基が公知であり、これは、（例えば、アミノ化によって糖に導入された）遊離−ＮＨ２基とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を用いて）カップリングさせ、次いで、結果として得られる糖−アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングさせることによって形成され得る［８３、８４］。別の好ましいタイプの結合は、カルボニル結合基であり、これは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとを反応させ［８５、８６］、次いでタンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成され得る。他の結合基としては、β−プロピオンアミド［８７］、ニトロフェニル−エチルアミン［８８］、ハロアシルハライド［８９］、グリコシド結合［９０］、６−アミノカプロン酸［９１］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ：Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）［９２］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９３］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［９４］、などが挙げられる。カルボジイミド縮合も使用することができる［９５］。
【００５７】
参考文献９６に記載されているように、混合物は、一方として糖／タンパク質の直接の結合を有する複合体と、他方として結合基を介した結合を有する複合体とを含み得る。このアレンジメントは、異なる髄膜炎菌性血清群に由来する糖複合体を使用する場合に特に適用し、例えば、Ｍｅｎ−Ａの糖とＭｅｎ−Ｃの糖を、結合基を介して結合してもよいし、あるいは、Ｍｅｎ−Ｗ１３５の糖とＭｅｎ−Ｙの糖を、担体タンパク質に直接結合してもよい。
【００５８】
組成物は、Ｍｅｎ−Ａ複合体、Ｍｅｎ−Ｃ複合体、Ｍｅｎ−Ｗ複合体、および／またはＭｅｎ−Ｙ複合体の１つ以上を含んでおり、いくつかの実施形態において、有利には、さらにＨｉｂ複合体をも含み得る（下記を参照のこと）。組成物が、２種以上の髄膜炎菌性血清群に由来する糖を含む場合、血清群あたりの糖質量は平均糖質量となる。それぞれ実質的に等しい質量の血清群が使用されている場合、平均質量は、それぞれの個々の質量と同じであろうが、等しくない質量が用いられる場合は、当該平均はそれぞれの個々の質量とは異なり、例えば、Ｍｅｎ−ＡＣＷＹ混合物において１０：５：５：５μｇが使用される場合、平均質量は、血清群あたり６．２５μｇである。Ｈｉｂ糖も含まれる場合、いくつかの実施形態において、その質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量と実質的に同じであろう。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量よりも多いであろう（例えば、少なくとも１．５倍）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌性糖の平均質量よりも少ないであろう（例えば、少なくとも１．５倍）［９７］。
【００５９】
水中油エマルションアジュバント
様々な水中油エマルションアジュバントが公知であり、それらは、通常、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤とを含み、当該油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）であり、かつ生体適合性である。エマルション中の油滴は、一般的に、直径５μｍ未満であり、サブミクロン直径さえ有し得、これらの小さいサイズは、安定したエマルションを提供するために、微細流動化装置により達成される。濾過滅菌を実施できるように、２２０ｎｍより小さいサイズの油滴が好ましい。
【００６０】
本発明は、油、例えば、動物（例えば、魚）源または植物源に由来するもの、と一緒に使用され得る。植物油の源としては、ナッツ、種子、および穀物が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能で、代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、他のシリアル穀物、例えば、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦など、の油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの、６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中には天然には存在しないが、ナッツ油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルクに由来する脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化、および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収することができる代謝可能な油を含有している。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨蝋などのクジラ油が、いくつかの代表的な魚油であり、これらは本明細書中において使用することができる。いくつかの分枝鎖油は、５−炭素イソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドと称される。サメの肝油は、スクワレンとして公知の分岐状の不飽和テルペノイドである２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンを含有するが、これは、本明細書において特に好ましい。スクワレンの飽和類似体であるスクワランも好ましい油である。スクワレンおよびスクワランなどの魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロールである。油の混合物を使用することができる。
【００６１】
組成物がトコフェロールを含んでいる場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。当該トコフェロールは、例えば、様々な塩および／または異性体などのいくつかの形態をとり得る。塩としては、有機塩、例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などが挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは、両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。
【００６２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）に応じて分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと称される）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ：ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、プロピレンオキシド（ＰＯ：ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ：ｂｕｔｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）のコポリマー、例えば、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売される直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深く；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）など；ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）など；並びにソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート、を含む界面活性剤を使用し得るが、これらに限定されるものではない。エマルション中に含まれる好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００６３】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））と、オクトキシノール、例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）との組合せも好適である。別の有用な組み合せは、ラウレス−９と、さらにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【００６４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【００６５】
本発明に有用な特定の水中油エマルションアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
・スクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルション。容量によるエマルションの組成は、約５％のスクワレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量では、これらの比率は、４．３％のスクワレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、参考文献１０１の第１０章および参考文献１０２の第１２章に、より詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として公知である［９８〜１００］。当該ＭＦ５９エマルションは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、を含み得る。
【００６７】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０のエマルション。当該エマルションは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。さらにＳｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、より安定なエマルションが得られるように、スクワレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１である。スクワレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を得るためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）の混合物と混合し、次いで微細流動化することにより作製することができる。結果として得られたエマルションは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間の平均直径、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。
【００６８】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルション。当該エマルションはさらに３ｄ−ＭＰＬも含み得る。当該エマルションは、リン酸緩衝液を含有し得る。
【００６９】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。当該エマルションは、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）において、これら３つの成分を含み得、並びにこれらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分による任意の寄与を含むべきである。当該エマルションはさらにスクワレンも含み得る。当該エマルションはさらに、３ｄ−ＭＰＬも含み得る。当該水相はリン酸緩衝液を含有し得る。
【００７０】
・スクワラン、ポリソルベート８０、およびポロクサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルション。当該エマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水において、ｐＨ７．４で処方され得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドのために有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてトレオニル−ＭＤＰと共に使用される［１０３］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクワラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントのように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを含まずに使用され得る［１０４］（５％のスクワラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。なお、微細流動化が好ましい。
【００７１】
・スクワレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルション。当該エマルションは、好ましくは、熱可逆性であり、および／または少なくとも９０％（体積比）が２００ｎｍ未満のサイズである油滴を有する［１０５］。当該エマルションはさらに、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１つ以上も含み得る。そのようなエマルションは、凍結乾燥され得る。
【００７２】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン界面活性剤を有するエマルション。参考文献１０６に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの油滴サイズが有利である。
【００７３】
・代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０）のサブミクロン水中油エマルション。添加物としては、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物複合体（例えば、参考文献１０７に記載される、グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンを挙げることができる。
【００７４】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１０８］。
【００７５】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１０８］。
【００７６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が、螺旋状のミセルとして会合しているエマルション［１０９］。
【００７７】
水中油エマルションは、それ自体アジュバントとして、またはさらなる免疫賦活化合物、例えば、免疫賦活オリゴヌクレオチド、３ｄ−ＭＰＬなど、のための担体として使用することができる。
【００７８】
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとしても知られる）は、モノホスホリル脂質Ａにおける還元末端グルコサミンの３の位置が脱アシル化されているアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損変異体から調製されており、化学的に脂質Ａと同様であるが、酸不安定ホスホリル基および塩基不安定アシル基が欠損している。３ｄＭＰＬの調製は、元は参考文献１１０に記載されていた。
【００７９】
再構成およびパッケージング
本発明の凍結乾燥された抗原成分は、最終的に、患者への投与に好適な材料を得るために、液体成分により再構成される。当該再構成は、通常、使用の時点において実施される。したがって、抗原および水中油エマルションアジュバントは、パッケージングされたワクチンキットまたは配布されたワクチンキットにおいて別々に保たれ、使用の時点で最終的な処方物へと再構成される状態にあり得る。
【００８０】
２つの容器を有するキットにおいて、一方の容器は再構成のための液体を含み、第２の容器は凍結乾燥した材料を含む。第２の容器は、通常、密閉して封止されているであろう。当該液体は、通常、第１の針により第２の容器中に導入され、それにより、凍結乾燥した材料が液体形態へと再構成される。次いで、当該液体は、通常、患者への投与のために注射器へと回収されるであろう。この回収工程は、第１の針を介して行われてもよいが、多くの場合、第２の針を介して行われるであろう。回収のために使用される針は、次に患者への注射に使用される針と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００８１】
第２の容器は、通常、バイアルであるだろう。凍結乾燥した材料を再構成するための水中油エマルションも、バイアル中に収容されていてもよいが、代替手段として、注射器中に収容されていてもよい。さらなるアレンジメントは、複室型注射器における別々の室として第１および第２の容器を有することにより、作動させる時に液体材料が第１の容器から第２の容器へと導入される。次いで、当該混合され再構成された材料は、液体形態において注射器から放出され得る。しかしながら、すべての場合において、当該凍結乾燥された材料および液体材料は、混合する準備が整うまで別々に保たれる。
【００８２】
水中油エマルションは、通常、その液体形態において使用されるが、本発明のいくつかの実施形態においては、凍結乾燥した水中油エマルションアジュバントを使用することが可能である。この方法におけるエマルションアジュバントの凍結乾燥は、例えば、参考文献１０５および１１１において開示されている。これらの乾燥したエマルションは、依然として、使用時に、例えば水性担体を用いて、液体形態へと再構成されるであろう。凍結乾燥されたアジュバントおよび凍結乾燥された抗原成分は、別々のキット構成部分であり得るが、いくつかの実施形態においては、それらは凍結乾燥された形態で（凍結乾燥前または凍結乾燥後のいずれかにおいて）混合されていてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、凍結乾燥された水中油エマルションと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物との混合物を含む組成物を提供する。この混合された凍結乾燥組成物は、１つの再構成工程において水中油エマルションアジュバントを有するＭｅｎ−Ｂ組成物を得るために水性担体と混合され得る。
【００８３】
したがって、キットは、例えば、２つのバイアル、１つの充填済み注射器、および１つのバイアルなどを備えていてもよい。注射器は、一般的に、単回用量の組成物を含み、一方で、バイアルは、単回投用量または複数回用量を含み得る。したがって、複数回用量形態では、あらかじめ充填された注射器よりもバイアルの方が好ましい。
【００８４】
患者に投与する前に、さらなる液体材料および／または凍結乾燥された材料を添加してもよい。
【００８５】
凍結乾燥された成分のための容器は、キャップ（例えば、Ｌｕｅｒ ｌｏｃｋ）を有していてもよく、このキャップは、予め充填された注射器をキャップ中に差し込むことができ、当該注射器の内容物がバイアルの中に放出されてその中の凍結乾燥された材料を再構成することができ、当該バイアルの内容物が注射器に戻し入れられ得るように調整されたキャップである。バイアルから注射器を取り外した後、針を取り付けることができ、並びにワクチンを患者に投与することができる。当該キャップは、キャップを差し込む前にシールまたはカバーを除去しなければならないように、シールまたはカバーの内側に配置してもよい。
【００８６】
成分がバイアル中にパッケージされる場合、当該バイアルは、好ましくは、ガラス製またはプラスチック材料製である。当該バイアルは、好ましくは、それに材料を添加する前に滅菌される。ラテックスに敏感な患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、ラテックス不含ストッパーでシールすることができる。当該バイアルは、単回用量のワクチンを含んでいてもよく、あるいは、２回以上の用量、例えば１０回用量、を含んでいてもよい（「多用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
【００８７】
当該ワクチンが注射器中にパッケージされている場合、当該注射器は、それに取り付ける針を備えていてもよいし、または針を備えていなくもよい。組み立てて使用するために、注射器と共に別個の針を供給してもよい。針は安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が一般的である。注射器は、記録の保持を容易にするために、ロット番号と内容物の有効限日をその上に印刷することができる剥離式のラベルを備えて提供してもよい。注射器のプランジャは、好ましくは、吸引の際に偶然にプランジャが外れてしまうことを防ぐためのストッパーを備えている。
【００８８】
ガラス製の容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもむしろホウケイ酸ガラス製の容器を使用することが好ましい。
【００８９】
ワクチンは、通常、０．５ｍｌ用量において患者に投与されるため、第１の容器中の液体の量は、再構成後に、消耗量にあたる少なくとも０．５ｍｌ、例えば０．６ｍｌ、の投薬容量を得るために好適な量であろう。
【００９０】
安定性の理由から、本発明の凍結乾燥された成分は、安定化剤、例えば、ラクトース、スクロース、および／またはマンニトール、ならびにそれらの混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など、を含んでいてもよい。スクロース／マンニトール混合物を使用することによって、乾燥プロセスを迅速化することができる。凍結乾燥した成分はさらに、塩化ナトリウムも含み得る。凍結乾燥された材料における可溶性成分は、再構成後も組成物中に保有されるであろうから、したがって、最終的な液体ワクチンは、ラクトースおよび／またはスクロースを含み得る。
【００９１】
組成物は、参考文献１１２に記載されているように、温度保護剤を含んでいてもよい。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）が挙げられる。好適なＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有し得る。好ましい実施形態において、当該ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有し得る（「ＰＥＧ−３００」）。
【００９２】
医薬組成物
本発明の材料は、最終的に、患者に投与するための医薬組成物を調製するために使用されるであろう。これらは、通常、薬学的に許容される担体を含むであろう。薬学的に許容される担体についての詳細な説明は、参考文献１１３において入手可能である。
【００９３】
効果的な投薬容量は、慣習的に確立され得るが、当該組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射のために約０．５ｍｌの容量を有する。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、大腿部または上腕部への筋肉内注射により、０．５ｍｌ容量において投与されている［１１４］。ＭｅＮＺＢ（商標）は、大腿部の前外側または腕の三角筋部への筋肉内注射により、０．５ｍｌにおいて投与される。同様の用量を、他の送達経路に使用してもよく、例えば、噴霧のための鼻腔内ＯＭＶベースのワクチンは、スプレーあたり約１００μｌまたは約１３０μｌの容量を有し得るので、約０．５ｍｌの全用量を与えるために４回のスプレーが投与される。
【００９４】
再構成後の組成物のｐＨは、好ましくは６〜８の間であり、より好ましくは６．５〜７．５の間（例えば、約７）である。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンのｐＨは、７．４であり［１１５］、本発明の組成物にはｐＨ＜７．５が好ましい。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用することによってｐＨを維持し、本発明の組成物における安定したｐＨは、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液の使用により維持され得る。本発明の組成物は、一般的に、緩衝液を含むであろう。緩衝液成分は、所望するような、最終的な再構成後のアレンジメントを得るために、必要に応じて、液体成分中および／または凍結乾燥成分中に配置されるであろう。
【００９５】
当該組成物は、滅菌および／または発熱物質不含であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００９６】
患者への投与のための本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、通常は、予防的である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原（単数または複数）、並びに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単一用量または一連の用量の一部のいずれかにおいて個体に投与される量が、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個々の免疫システムの能力、所望される防御の度合い、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価、および他の関連要因に応じて変わる。この量は、日常的な試験によって特定することができる比較的広い範囲に入ることが予測される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般的に、１用量あたりのタンパク質の量を単位として表される。ＯＭＶベースの鼻腔内ワクチンの場合、１ｍｌあたりタンパク質約０．９ｍｇの用量が典型的である。
【００９７】
髄膜炎菌は、身体の様々な領域に影響を与え、そのため、本発明の組成物は、様々な液体形態において調製され得る。例えば、当該組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製され得る。当該組成物は、微細スプレーを使用して、例えば吸入器による肺投与のために調製され得る。当該組成物は、鼻内、耳内、または眼内投与のために、例えば、スプレーまたは液滴として調製され得る。筋肉内投与のためには、注射可能物が典型的である。
【００９８】
本発明の組成物は、特に複数回用量方式においてパッケージングされる場合に、抗菌剤を含んでいてもよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌薬が、一般的にワクチン中に見出されるが、水銀不含の防腐剤を使用するかまたは全く防腐剤を使用しないかのいずれかが好ましい。
【００９９】
本発明の凍結乾燥した成分および／または同時パッケージされた水中油エマルションアジュバントは、実質的にアルミニウム塩を含み得ない。このアレンジメントにより、本発明の再構成された組成物がアルミニウム塩を実質的含まないことが可能となる。
【０１００】
本発明の組成物は、洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。洗浄剤は、一般的に、低濃度、例えば＜０．０１％で存在する。
【０１０１】
本発明の組成物は、ＯＭＶ調製物に由来する残留洗浄剤（例えば、デオキシコーレート）を含み得る。残留洗浄剤の量は、Ｍｅｎ−Ｂタンパク質１μｇに対して、好ましくは０．４μｇ未満（より好ましくは、０．２μｇ未満）である。
【０１０２】
本発明の組成物は、髄膜炎菌に由来するＬＯＳを含み得る。ＬＯＳの量は、タンパク質１μｇに対して、好ましくは０．１２μｇ未満（より好ましくは０．０５μｇ未満）である。
【０１０３】
本発明の組成物は、張性を与えるためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。ＮａＣｌの１０±２ｍｇ／ｍｌ濃度が典型的であり、例えば約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１０４】
処置方法
本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための方法であって、本発明の液体医薬組成物を当該哺乳動物に投与する工程を含む方法も提供する。当該免疫反応は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を伴う。当該方法は、既にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して初回免疫されている患者において、追加免疫反応を引き起こし得る。ＯＭＶに対する皮下および鼻内の初回免疫／追加免疫レジメンは、参考文献１１６に開示されている。
【０１０５】
当該哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的用途のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児または乳児）または十代の若者であり、当該ワクチンが治療用途のためのものである場合、ヒトは好ましくは成人である。小児を意図したワクチンはさらに、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与され得る。
【０１０６】
本発明はさらに、医薬品としての使用のための本発明の組成物および混合物を提供する。当該医薬品は、好ましくは、哺乳動物において免疫反応を惹起することができ（すなわち、これは、免疫原性組成物である）、並びにより好ましくはワクチンである。
【０１０７】
本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、本発明の組成物および混合物の使用も提供する。本発明はさらに、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバント、および（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物の使用を提供する。当該使用はさらに、（ｉｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化莢膜糖も伴い得る。
【０１０８】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の疾患、例えば細菌性（または、より詳細には髄膜炎菌性）髄膜炎、または敗血症の予防および／または処置のためである。
【０１０９】
治療処置の効力を確認する方法の１つは、本発明の組成物の投与後のナイセリア感染症のモニタリングを伴う。予防的処置の効力を確認する方法の１つは、組成物の投与後の抗原に対する免疫反応のモニタリングを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験対象（例えば、１２〜１６ヶ月齢の小児または動物モデル［１１７］）に投与し、次いで血清細菌性抗体（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的パラメータを測定することにより、特定することができる。これらの免疫反応は、一般的に、当該組成物の投与の約４週間後に特定され、当該組成物の投与前に測定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ上昇が好ましい。１用量より多い組成物が投与される場合、１回より多くの投与後の特定が行われ得る。
【０１１０】
一般的に、本発明の組成物は、対象に投与された後、血清殺菌抗体反応を誘導することができる。これらの反応は、マウスにおいて簡便に測定されるものであり、ワクチン効力の標準的指標である。血清殺菌活性（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、補体によって媒介される細菌死滅を評価するものであり、ヒトの補体またはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイすることができる。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、９０％より多くの受容体において、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。ＭｅＮＺＢ（商標）は、第３の用量の投与の４〜６週間後に、ＳＢＡにおいて４倍の上昇を惹起する。
【０１１１】
好ましい組成物は、ヒト対象患者において、容認可能な割合の対象に対して血清防御の基準より優れた抗体力価を与え得る。その力価より上では宿主が抗原に対して血清変換されると考えられる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの組織により公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意な試料の８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、さらにより好ましくは９３％より多く、並びに最も好ましくは９６〜１００％が血清変換される。
【０１１２】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ）により、または他の好適な経路により達成され得る。本発明は、全身性免疫および／または粘膜性免疫を惹起するために使用され得る。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下組織用針）を介し得るが、代わりに無針注射を用いてもよい。典型的な筋肉内用量は０．５ｍＬである。
【０１１３】
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられ得る。初回用量スケジュールに続いて、追加免疫用量スケジュールが行われ得る。初回免疫投薬の間（例えば、４〜１６週間）、および初回免疫と追加免疫との間の好適なタイミングは、慣習的に決定され得る。ＯＭＶベースのＲＩＶＭワクチンは、０．２ヶ月、および８ヶ月あるいは０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月、および８ヶ月でのワクチン接種による３回投薬または４回投薬の初回免疫スケジュールを用いて試験した。６週間の間隔で、３回投薬としてＭｅＮＺＢ（商標）を投与する。
【０１１４】
本発明の組成物は、髄膜炎菌の２種以上の高毒性系統に対する殺菌抗体反応を誘導するために使用され得る。特に、それらは、好ましくは、以下の３つの高毒性系統：（ｉ）クラスターＡ４、（ｉｉ）ＥＴ５複合体、および（ｉｉｉ）系統３、のうちの２つまたは３つに対して殺菌反応を誘導することができる。加えて、それらは、高毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、またはＥＴ−３７複合体の１つ以上に対する殺菌抗体反応、並びに他の系統、例えば高侵襲性系統、に対する殺菌抗体反応を誘導し得る。これは、当該組成物がこれら高毒性系統内のそれぞれおよびすべての髄膜炎菌の菌株に対して殺菌抗体を誘導することができることを必ずしも意味するものではなく、当該組成物によって誘導される抗体は、例えば、特定の高毒性系統のうちの４つ以上の髄膜炎菌株の任意の所定の群に対し、当該群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）に対して殺菌性である。好ましい菌株の群は、以下の国：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ、およびＣＵのうちの少なくとも４つにおいて単離された菌株を含むであろう。当該血清は、好ましくは、少なくとも１０２４の殺菌力価を有し（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、またはそれ以上、好ましくは少なくとも２１４）、例えば、当該血清は、１／１０２４に希釈された場合の特定の菌株の試験細菌の少なくとも５０％を殺傷することができる。
【０１１５】
有用な組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌の以下の菌株：（ｉ）クラスターＡ４由来の菌株９６１−５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／または菌株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来の菌株ＭＣ５８（Ｂ１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または菌株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の菌株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／または菌株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）、に対して殺菌反応を誘導することができる。より好ましい組成物は、菌株９６１−５９４５、菌株４４／７６、および菌株３９４／９８に対する殺菌反応を誘導することができる。
【０１１６】
菌株９６１−５９４５および菌株Ｇ２１３６は、両方ともＮｅｉｓｓｅｒｉａＭＬＳＴ参考株である［参考文献１１８のｉｄ６３８および１００２］。菌株ＭＣ５８は広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５）、参考文献１１９において配列決定されている。菌株４４／７６は広く用いられ、特徴解析されており（例えば、参考文献１２０）、ＮｅｉｓｓｅｒｉａＭＬＳＴ参考株の１つである［参考文献１１８のｉｄ２３７；参考文献１９の表２の３２行］。菌株３９４／９８は、元は１９９８年にニュージーランドにおいて単離されており、この菌株を使用していくつかの研究が発表されている（例えば、参考文献１２１および１２２）。菌株ＢＺ１９８は、別のＭＬＳＴ参考株である（参考文献１１８のｉｄ４０９；参考文献１９の表２の４１行）。
【０１１７】
本発明のさらなる組成物
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、ただし、当該組成物は、菌株Ｆ９１；ＪＢ１０１２４；またはＨＰ１０１２４のいずれかに由来する小胞を含まない、抗原性組成物を提供する。
【０１１８】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、当該小胞がＬ２またはＬ３免疫型の菌株に由来する、抗原性組成物を提供する。当該組成物は、Ｌ２およびＬ３菌株の両方に由来する小胞を含み得る。
【０１１９】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が上記において説明したようなＭｅｎ−Ｂ外膜小胞を含み、当該小胞がシアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないＬＯＳを含む、抗原性組成物を提供する。
【０１２０】
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対して免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥した抗原性組成物であって、当該免疫原が精製されたｆＨＢＰタンパク質を含む、抗原性組成物を提供する。当該組成物は、上記において説明したような、ｆＨＢＰの二つ以上の変異体を含み得る。
【０１２１】
これらの凍結乾燥された組成物は、水中油エマルションを含むアジュバントによる再構成に好適であり、したがって、それらは、本発明のキット構成要素としての使用のため、または本発明の方法における使用のため、などに好適である。エマルションアジュバントを含まずにそれらを販売または配布してもよいが、それでも、それらは本発明の独立した実施形態である。しかしながら、それらは、液体アジュバントを含む別の容器と組み合わせて、キット形態にパッケージングしてもよい。この液体アジュバントは、好ましくは水中油エマルションを含む。
【０１２２】
本発明はさらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの膜小胞とサブミクロンの水中油エマルションとを含むアジュバント化された抗原性組成物を提供する。当該エマルションは、好ましくはスクワレンおよび／またはポリソルベート８０を含む。当該エマルションの油滴の直径は、理想的には＜５００ｎｍである。当該小胞は、上記において説明したような１種以上のタンパク質を過剰発現し得、および／または上記において説明したようなノックアウト変異体の１種以上、例えば、ＬＯＳを切端するためにダウンレギュレーションまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ、アップレギュレーションされたＴｂｐＡなど、を含み得る。「ブレブ内」複合化を用いてもよい。このアジュバント化された組成物は、上記において説明したように、凍結乾燥された抗原をエマルションと混合することによって調製してもよく、あるいは対照的に、水性小胞調製物を使用して調製してもよい。
【０１２３】
さらなる抗原性成分
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する抗原に加えて、組成物は、さらなる病原菌に由来する抗原を含んでいてもよい。例えば、当該組成物は、以下のさらなる抗原：
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原、例えば、（通常、複合化された）糖など、
−Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原、例えば、表面抗原ＨＢｓＡｇなど、
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する抗原、例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ：ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する糸状性赤血球凝集素（ＦＨＡ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、必要に応じて、ペルタクチンならびに／あるいは凝集原２および凝集原３との組み合わせにおいて、
−ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイドなど、
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイドなど、
−通常、複合化された、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ（Ｈｉｂ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）に由来する糖抗原、
−不活化されたポリオウイルス抗原
の１つ以上を含み得る。
これらのさらなる抗原は、水中油エマルションと同じ容器における液体形態において、凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原と同じ容器における凍結乾燥した形態において、または第３の容器（凍結乾燥された形態、または、通常は液体形態のいずれかにおいて）に含まれ得る。
【０１２４】
ジフテリア抗原が当該組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。したがって、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０１２５】
Ｈｉｂ糖が含まれる場合（通常、複合体として）、当該糖部分は、多糖（例えば、細菌から精製されるような全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ：ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））であり得るが、オリゴ糖（例えば、ＭＷは約１〜約５ｋＤａ）を作製するために、例えば加水分解によって、精製された糖を断片化することも可能である。再構成されたワクチンにおけるＨｉｂ複合体の濃度は、通常、０．５μｇ〜５０μｇ、例えば、１〜２０μｇ、１０〜１５μｇ、１２〜１６μｇ、などの範囲であろう。当該量は、約１５ｇであり得るか、またはいくつかの実施形態では約１２．５μｇであり得る。５μｇ未満の質量が、好適であり得、例えば、１〜５μｇの範囲、２〜４μｇの範囲、または約２．５μｇであり得る［１２３］。上記において説明したように、Ｈｉｂ糖および髄膜炎菌性糖を含む組み合わせにおいて、前者の用量は、後者の用量に基づいて選択され得る（特に、多数の髄膜炎菌性血清群の場合、それらの平均質量により）。Ｈｉｂ複合体のさらなる特性は、担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などの選択を含めて、髄膜炎菌性複合体に対して上記において説明した通りである。
【０１２６】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が含まれる場合、これは、ポリペプチドまたは糖であってもよい。複合体莢膜糖は、肺炎球菌に対して免疫するために特に有用である。当該糖は、細菌からの当該糖の精製の際に生じるサイズを有する多糖であり得るか、または、そのような多糖の断片化により達成されたオリゴ糖であり得る。７価のＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品において、例えば、６つの糖は完全な多糖として存在し、残りの１つ（１８Ｃ血清型）は、オリゴ糖として存在する。組成物は、以下の肺炎球菌の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および／または３３Ｆの１つ以上に由来する莢膜糖を含み得る。組成物は、多数の血清型、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、またはそれ以上の血清型を含み得る。７価、９価、１０価、１１価、および１３価の複合体の組み合わせは、２３価の複合化されていない組み合わせと同様に、当技術分野において既に公知である。例えば、１０価の組み合わせは、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する糖を含み得る。１１価の組み合わせは、さらに、血清型３に由来する糖を含み得る。１２価の組み合わせは、１０価の混合物に、血清型６Ａおよび１９Ａ、６Ａおよび２２Ｆ、１９Ａおよび２２Ｆ、６Ａおよび１５Ｂ、１９Ａおよび１５Ｂ、ｒ２２Ｆおよび１５Ｂを加え得る。１３価の組み合わせは、１１価の混合物に、血清型１９Ａおよび２２Ｆ、８および１２Ｆ、８および１５Ｂ、８および１９Ａ、８および２２Ｆ、１２Ｆおよび１５Ｂ、１２Ｆおよび１９Ａ、１２Ｆおよび２２Ｆ、１５Ｂおよび１９Ａ、１５Ｂおよび２２Ｆ、などを加え得る。肺炎球菌複合体のさらなる特性は、担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などの選択を含めて、髄膜炎菌性複合体に対して上記において説明した通りである。組成物が２種以上の複合体を含む場合、各複合体は、同じ担体タンパク質を使用してもよいし、または異なる担体タンパク質を使用してもよい。参考文献１２４に、多価性肺炎球菌複合体ワクチンにおいて異なる担体タンパク質を使用する場合の潜在的利点が記載されている。
【０１２７】
一般論
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸから成り得るか、または何かの追加、例えば、Ｘ＋Ｙ、を含み得る。
【０１２８】
数値ｘとの関連において、用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２９】
言葉「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、言葉「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の組成物に対する、重ね合わせた２つの分析トレースを示す。当該線は、凍結乾燥前および再構成後の組成物である。本質的に、これらは非常に似ているため、１本の線だけが視認できる。
【図２】４℃で保存された組成物および３７℃で保存された組成物に対する、重ね合わせた２つの分析トレースを示す。図１とは異なり、２本の線が視認できる。
【図３】様々な処方物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１０本のレーンは、左から右へ、（１）：ＭＷマーカー、（２）〜（４）：１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および２５μｇ／ｍｌでの液体抗原、（５）：凍結乾燥前の、２％のマンニトールおよび３％のスクロースの混合物中における抗原、（６）：レーン（５）と同様であるが、ただし凍結乾燥およびｗｆｉによる再構成後、（７）：レーン（５）と同様であるが、ただし凍結乾燥およびＭＦ５９による再構成後、（８）〜（１０）：レーン（５）〜（７）と同様であるが、ただし５％スクロースにおいて、を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
Ｍｅｎ−Ｂワクチンにおけるアジュバントの含入
Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＭｅｎ−Ｂワクチンの初期の前臨床評価は、最適な免疫反応は水酸化アルミニウムアジュバントの存在を必要とすることを示していた。しかしながら、このアジュバントの存在下でさえ、菌株適用範囲は不完全であった。例えば、試験したＳＴ３２およびＳＴ８菌株の１００％が、ワクチンによって惹起された血清によって死滅したが、ＳＴ１１菌株では、この値は６５％まで低下した。対照的に、アジュバントとしてＭＦ５９エマルションを使用すると、ＳＴ３２、ＳＴ８、およびＳＴ１１菌株のすべてに対して、１００％の適用範囲が得られた。さらなる実験により、ＭＦ５９の卓越性が確認された。
【０１３２】
同じ卓越性が、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する複合化莢膜糖をＭｅｎ−Ｂワクチンに加えた場合にも見られた。このＡ−Ｂ−Ｃ−Ｗ−Ｙワクチンによって達成された免疫原性は、抗細菌力価および菌株適用範囲に関して、水酸化アルミニウムを使用した場合よりＭＦ５９を使用する方がより良好であった。
【０１３３】
したがって、ＭＦ５９は、水酸化アルミニウムアジュバントと比較した場合、増強された免疫原性効力を提供する。しかしながら、これの安定性を試験したところ、４℃で保存した場合でさえ、約１２週間後に分解し始めた。より高い温度で保存した場合、分解は、早くも２週間後において明らかであり、６ヶ月後には完全に分解した。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒまたはサイズ排除クロマトグラフィーを使用した分析により、分解を確認した。対照的に、水酸化アルミニウムに吸着させた場合、当該抗原は、安定したままであった。
【０１３４】
ＭＦ５９において、非Ｂ血清群に由来する複合化された莢膜糖に対する安定性の低下も見られた。遊離シアル酸（Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ１３５、およびＭｅｎ−Ｙの莢膜糖における成分）のレベルは、４℃で保存したＭＦ５９−アジュバント化された処方物において、次第に上昇し、６ヶ月後には約１５％に達した。しかしながら、より高い温度では、当該遊離シアル酸のレベルは、約１０週間後に５０％に達し、６ヶ月で１００％に達した（すなわち、完全分解した）。
【０１３５】
したがって、ＭＦ５９によって達成された増強された免疫原性は、保存安定性を犠牲にしている。ＭＦ５９を使用し、および／または水酸化アルミニウムアジュバントへの吸着を必要としなくても、安定な処方物を達成することができるかどうかを見極めるために研究を実施した。
【０１３６】
Ｍｅｎ−Ｂの凍結乾燥
安定性の目的を達成する試みにおいて、Ｍｅｎ−Ｂ抗原を凍結乾燥した。再構成の後に、それらの効力が保持されていることを確認した。その上、Ｍｅｎ−Ｂ抗原と、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する複合化された莢膜糖との混合物に対しても安定性が確認された。
【０１３７】
例えば、図１は、Ｍｅｎ−Ｂタンパク質の溶出位置に一致するピークを有する、重ねられた２本の分析トレースを示す。当該トレースはほとんど同じであり、実質的な物理化学的変化がないことを明らかにしている。対照的に、図２は、４℃または３７℃のいずれかにおいて保存された同じ組成物の２本の重ねられたトレースを示しており、変化が容易に視認できる。他の解析技術により、凍結乾燥の前後にどのような検出可能な変化も存在しないことが確認された。個々のＭｅｎ−Ｂ抗原の無欠陥性が、４℃で６ヶ月の凍結乾燥保存の後でさえ保持されることが明らかとなった。
【０１３８】
当該組成物は、４．５％のマンニトールおよび１．５％のスクロースの存在下で凍結乾燥してある。
【０１３９】
したがって、アルミニウム塩への吸着を必要とせずに、髄膜炎菌性抗原の長期安定性を達成することができる。したがって、凍結乾燥により、当該抗原を、水中油エマルションとの組み合わせにおいて使用することが可能となり、それにより、これらのアジュバントに対して実証された増強された効力および菌株適用範囲が得られる一方で、関連する安定性問題を避けていることが可能となる。
【０１４０】
さらなる処方物
Ｍｅｎ−Ｂワクチンの凍結乾燥された提示のためのさらなる開発研究において、組み換えタンパク質ワクチンの２つの処方物を調製した。両方とも、凍結乾燥安定化剤としてスクロースを使用するが、一方にはさらにマンニトールも含まれている。浸透圧モル濃度は、３００ｍＯｓｍＵであり、並びにｐＨは７．０である。各バイアル瓶は、４０％過剰の１回ヒト用量に十分な材料を含み（７０μｇの各組み換えタンパク質、１５ｍｇのＰＢＳ、および１４ｍｇのマンニトールもしくは２１ｍｇのマンニトール＋３５ｍｇのスクロースのいずれか）、ＭＦ５９の７００μｌの水で（または、比較のため、ｗｆｉで）再構成される。
【０１４１】
湿気レベルは、凍結乾燥直後および低温および高温での１ヶ月後に測定した。湿気含有量は、約１．１％で一定のままであった。
【０１４２】
凍結乾燥前および再構成後のＲＰ−ＨＰＬＣトレースの比較は、両方の処方物におけるタンパク質が、凍結乾燥後、３７℃で１ヶ月でも安定に維持されることを示していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）およびウェスタンブロットも、３つのタンパク質は、４℃および３７℃の両方においてＭＦ５９またはｗｆｉのいずれかによる再構成後に、分解または凝集の兆しが無く、凍結乾燥プロセス後に安定であることが示された。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ分析からも同じ結果が得られた。サイズ排除クロマトグラフィーは、凍結乾燥により凝集の微増が生じるが、凝集の量は、その後、３７℃で３ヶ月後または４℃で６ヶ月後でさえ増加しないことを示していた。
【０１４３】
免疫原性の研究
免疫原性の研究において、マウスを使用して、ワクチン有効性についての凍結乾燥の効果を評価した。凍結乾燥した処方物をＭＦ５９で再構成し、即座にＭＦ５９と混合した（「２バイアル」アプローチとして）液体形態における同じ抗原に対して力価を比較した。当該処方物は、同様の力価を誘導した。
【０１４４】
より長期間の安定性を研究するため、２つの凍結乾燥された抗原調製物（一方をスクロースと共に凍結乾燥し、もう一方はスクロース＋マンニトールと共に凍結乾燥した）を４℃で保存し、それらの免疫原性を、３ヶ月および６ヶ月の保存の後に試験した。保存された抗原は、ＭＦ５９で再構成し（さらに抗原は４℃で保存した）、免疫化のために即座に使用した。比較のため、並行して、調製したばかりの水性抗原とＭＦ５９とを混合して試験した。
【０１４５】
２つの別々の研究によるＥＬＩＳＡの結果は、ＭＦ５９で再構成された場合、凍結乾燥した処方物は、調製されたばかりの新鮮な処方物によって惹起される場合と同様の抗体力価（ＧＭＴ）を誘導することを示していた。抗体反応をＳＢＡによって評価した場合も同様のことが確認され、例えば、スクロース−凍結乾燥抗原により、ゼロ時間において確認された３２７６８のＳＢＡ力価は、６ヶ月の保存後にも依然として確認された。したがって、Ｍｅｎ−Ｂ抗原は、凍結乾燥および保存後も活性を維持する。
【０１４６】
さらなる研究において、凍結乾燥した調製物を４℃または３７℃のいずれかで保存し、次いで免疫原性を評価した。３７℃で１ヶ月保存した後でさえ、凍結乾燥された抗体は、ＳＢＡ活性の喪失を示さなかった。
【０１４７】
凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原と混合されるエマルションのサイズ安定性
ＭＦ５９エマルションの油滴のサイズは、エマルションのみとして、または凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗体との混合物として、または対照抗原との混合物としてのいずれかにおいて、４℃および２５℃で２４時間後に測定した。液滴サイズ（ｎｍ）は、以下の通りであった。
【０１４８】
【表１】
したがって、凍結乾燥されたＭｅｎ−Ｂ抗原の存在下でのエマルションの粒子サイズは、４℃または２５℃で２４時間安定であり、基本的にそのままのエマルションと同じである。
【０１４９】
本発明は、例示のみの目的で記載されており、本発明の範囲および精神の内に維持しつつ改変がなされ得ることが理解されるであろう。
【０１５０】
参考文献
【０１５１】
【化１】
【０１５２】
【化２】
【０１５３】
【化３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントを収容した第１の容器と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を収容した第２の容器とを含むキット。
【請求項２】
前記第２の容器における前記凍結乾燥された抗原性組成物が、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖とを含む、凍結乾燥された抗原性組成物。
【請求項４】
（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントと、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物とを混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製するための方法。
【請求項５】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、請求項３に記載されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株に由来する膜小胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項８】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株の組み換えタンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項９】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株に由来するリポオリゴ糖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１】
（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントを収容した第１の容器と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物を収容した第２の容器とを含むキット。
【請求項２】
前記第２の容器における前記凍結乾燥された抗原性組成物が、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖とを含む、凍結乾燥された抗原性組成物。
【請求項４】
（ｉ）水中油エマルションを含むアジュバントと、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対する免疫反応を惹起するための免疫原を含む凍結乾燥された抗原性組成物とを混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製するための方法。
【請求項５】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの１つ以上に由来する複合化された莢膜糖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、請求項３に記載されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株に由来する膜小胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項８】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株の組み換えタンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項９】
前記凍結乾燥された抗原性組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ菌株に由来するリポオリゴ糖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット、組成物、または方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５００６６２（Ｐ２０１１−５００６６２Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９４７２（Ｐ２０１０−５２９４７２）
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３２８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５０５８６
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３２８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５０５８６
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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