高速ＤＮＡポリメラーゼを用いた高速リアルタイムＰＣＲ
【課題】伸長性の優れたＤＮＡポリメラーゼを高速ＰＣＲに用いることにより、より短時間での遺伝子検出を可能とする。
【解決手段】１０℃／秒以上、好ましくは１５℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。特にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【解決手段】１０℃／秒以上、好ましくは１５℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。特にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。具体的には、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して有用な高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法ならびにそのための組成物に関する。さらに本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、および伸長からなるサイクルを２５〜４０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法として広く用いられている（非特許文献１）。
【０００３】
ＰＣＲの普及により、様々な周辺技術が開発されている。例えば、「ホットスタートＰＣＲ」は、高温になって初めて活性を有するようにＤＮＡポリメラーゼを修飾することにより、試薬調製時の低温での非特異反応を抑制する技術である。また、「リアルタイムＰＣＲ」は、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出する技術である。
【０００４】
中でも、リアルタイムＰＣＲは反応後に電気泳動することなく、簡便に核酸の微量検出や定量を行えることが有用な特長の一つであり、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。ＰＣＲを用いた増幅は鋳型となる核酸のコピー数が多いと短時間で一定の強度に達し、少ないと長い時間を要する。そのため、蛍光を用いて増幅の経時変化を測定できるリアルタイムＰＣＲでは、一定強度まで達する増幅回数を濃度既知の核酸と濃度未知の核酸で比較することで、鋳型核酸の定量が可能となる。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲの蛍光の検出方法には、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を使用するインターカレーター法と、遺伝子産物に特異的に結合する蛍光プローブを使用するハイブリダイゼーション法がある。
前者の一例としてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎと呼ばれる蛍光色素が広く使用されている。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素はあらゆる配列に対して利用することができるため汎用性が高いが、プライマーの二量化などの非特異的な増幅産物にも結合し、不正確な測定値を得る可能性もある。
逆に、ＴａｑＭａｎプローブ及びＦＲＥＴプローブに代表されるハイブリダイゼーション法は、遺伝子産物によって、それぞれ特異的な配列をもつ蛍光プローブを作成する必要があるが、任意の配列を特異的に定量できる利点がある。
最近では、伸長したときのみ蛍光を発するプライマーを用いた、インターカレーター法とハイブリダイゼーション法の間をとったような技術であるＬＵＸプラーマー法も開発され、安価で感度のよい検出が可能となっている。
【０００６】
現在、遺伝子診断などの多サンプルの測定を必要とする産業用途では反応時間の短縮が強く求められている。反応時間を短縮するため、様々なＰＣＲ機器が改良ならびに開発されてきている。ロシュ・ダイアグノスティックス社のライトサイクラー（登録商標）は市販されているサーマルサイクラーの中では最速であり、空気を使って温度制御をする方法をとっている。今までのブロックサイクラーに比べ、格段に温度変化にかかる時間が短くなり、通常２時間程度かかる３０〜４０サイクルのＰＣＲ時間を３０分まで短縮している。
【０００７】
このように温度変化が高速化されると、ＰＣＲの反応時間はもはや機器の温度変化ではなく、主にＰＣＲの反応自体に制約されるようになっている。現在、通常のＰＣＲを行う酵素としては、真性細菌由来のＰｏｌＩ型酵素であるＴａｑやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、アーキア（超高熱始原菌）由来のα型酵素であるＫＯＤやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどが使用され、また、これら２種類を混合した酵素もよく使用されている。しかし、高速ＰＣＲを行う際には伸長速度の差が反応時間に大きく影響するため、ＴａｑやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼよりも、伸長性に優れる酵素を使用することが必要になっている。実際、伸長性が優れるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いた高速ＰＣＲの検討がなされており、ＴａｑやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも反応時間を短縮できている（特許文献１）。
【０００８】
しかし、リアルタイムＰＣＲで使われる酵素としては、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ法など、様々な応用研究が行われているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用することが多い。
例外的に、逆転写反応を同時に行えるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲ試薬も存在するが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を使った例は少ない（特許文献２）。
リアルタイムＰＣＲでは比較的短いＤＮＡを増幅するため、ブロックサイクラーの温度変化にはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで十分、対応できていた。しかし、高速で温度変化を行えるリアルタイムＰＣＲ機器の開発も進んできており、高速リアルタイムＰＣＲに適したＰＣＲ酵素の検討も必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−０３２８７０９号
【特許文献２】米国特許第６５６９６２７号
【特許文献３】特許第３４８７３９４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２３０，ｐ１３５０−１３５４（１９８５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、リアルタイムＰＣＲは研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。多サンプルの処理が必要なこれらの産業用途では反応時間の短縮が強く望まれている。そのような中、伸長性の優れたＤＮＡポリメラーゼの高速ＰＣＲへの検討が行われている。
しかし、温度変化を高速で行うリアルタイム機器の開発が遅れたこと、また、リアルタイムＰＣＲでは増幅するＤＮＡが比較的短くブロックサイクラーの温度変化の条件ではＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで十分、機能できていたことがあり、高速ＰＣＲでの検討に比べ、高速リアルタイムＰＣＲでそれらのＤＮＡポリメラーゼを使った検討はほとんどなされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、伸長速度の高いＤＮＡポリメラーゼ、具体的には１００塩基／秒以上、好ましくは１３０塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使って、リアルタイムＰＣＲの反応時間の短縮を目指した。
熱サイクルの時間を限界まで短くした条件において、一般にリアルタイムＰＣＲに用いられているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは鋳型ＤＮＡを短い時間で完全に伸長できず、増幅曲線がなだらかになり、ＰＣＲ効率が落ちる。しかし、短い時間で鋳型ＤＮＡを完全に増幅できる、特に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋭意検討を行った結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比べ、短い反応時間できれいな増幅曲線が得られ、かつ優れたＰＣＲ効率および定量性を示すことが確認でき、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
項１．１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。
項２．高速リアルタイムＰＣＲが、２０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とする項１に記載の遺伝子の増幅方法。
項３．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする項１または２に記載の遺伝子の増幅方法。
項４．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）いずれかであることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
項５．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
項６．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
項７．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項６に記載の遺伝子の増幅方法。
項８．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項６に記載の遺伝子の増幅方法。
項９．１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１０．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする項９に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１１．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項９または１０に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１２．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１３．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光物質が含有される反応用緩衝液を含んでなることを特徴とする項９〜１２のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、高速リアルタイムＰＣＲにおいて、反応時間をさらに短縮することを可能とした。研究分野での応用を始め、遺伝子診断などの法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等において、広く利用することができる。特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が大いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、高速リアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図２】実施例２において、高速リアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における、高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法とは、１０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とするリアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするものである。
【００１７】
上記の要件を満たしている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、現在市場にて購入できるものは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）などが挙げられる。
本発明においては、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
【００１８】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものが好ましい。また、それらのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。
該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。該変異体としては、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。
その一例としては、配列番号１の１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の１４１番目のアスパラギン酸と１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した酵素、配列番号１の３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した酵素などがあげられる。
なかでも、配列番号１における２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換されたものがより具体的な好適例として示されるが、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。また、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するもの、さらに好ましくは９０％以上のホモロジーを有するものが挙げられる。
ここでのホモロジーの計算には、ＧＥＮＥＴＹＸ、ＤＮＡｓｉｓなどのアミノ酸配列の相同性を調べる遺伝情報処理ソフトが用いられるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲとは、１０℃／秒以上、好ましくは１５℃／秒以上、更に好ましくは２０℃／秒以上の速度の温度変化で実行されるリアルタイムＰＣＲであることを特徴とする。
本発明において用いることができるＰＣＲ機器としては、ロシュ・ダイアグノスティックス社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステムズ社のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ（登録商標）、バイラッドラボラトリー社のｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ（登録商標）及び、ＴａＫａＲａ社のＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲとは、変性、アニール、及び伸長の時間を限りなく短くしたものであり、増幅反応を３０分以内、好ましくは２５分以内、更に好ましくは２０分以内で終わらせることを特徴とする。
【００２２】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲは、蛍光物質を用いて増幅産物を検出することを特徴とする。
検出方法としてはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどの二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を添加するインターカレーター法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＦＲＥＴプローブ、Ｌｉｏｎプローブ、及びサイクリングプローブなどを使用するハイブリダイゼーション法、蛍光プライマーを使用するＬＵＸプライマー法などが挙げられるが、増幅産物をリアルタイムに検出できる方法であればよく、特に限定されない。
【００２３】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲ組成物とは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
ここで緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２４】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲ組成物は、さらに必要により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと反応用緩衝液を、各々別々のチューブに入れていてもよい。
本発明の高速リアルタイムＰＣＲ組成物は、さらに必要により、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２５】
反応バッファーとしては、トリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
反応バッファーを含む構成である場合、５倍から２０倍程度の濃度、好ましくは１０倍程度の濃度に濃縮されたストック液として含まれることが好ましい。
【００２６】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
本発明において、デオキシリボ核酸合成速度とは単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， ８ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ， ０．１ｍＭ ｄＮＴＰ， ０．２μＣｉ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ， ５％ フィコール、０．０５％ ブロモフェノールブルー） を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、デオキシリボ核酸合成速度を求める。
ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼは、特許第３４８７３９４号公報（特許文献３）に記載されている、３’−５’エキソヌクアーゼ活性を改変前の酵素に比べて、５％以下にまで抑えたＤＮＡポリメラーゼであり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換したものである。
【００２８】
このＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いて高速リアルタイムＰＣＲを行うことにより、従来リアルタイムＰＣＲに使用されるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの有意性を確認した。
具体的には、ｈｕｍａｎアクチンの１８８ｂｐを標的とした増幅をライトサイクラー（登録商標）２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定し、その増幅曲線およびＰＣＲ効率を比較した。
【００２９】
ＰＣＲバッファーはＫＯＤ Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のものを用い、原液 １／３００００倍希釈 ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ I、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１８８ｂｐのＤＮＡ（アクチンの一部）を増幅するべく配列番号２及び３に記載の塩基配列からなるプライマー対０．２μＭを使用した。
２０μｌの反応液中にホットスタート用の抗体（特許第３９６８６０６号公報）０．２μｇを混合したＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ０．２５Ｕを用い、鋳型にはＨｕｍａｎ ＲＮＡ １μｇをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）１００μｌで逆転写してできた産物の１〜１０４倍希釈したものを使用した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比較にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ロシュ）を使い、上記と同様のプライマー対、鋳型を用いた。ＰＣＲの反応は、以下の表１及び表２に示すような組成を用いて行った。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
温度変化を１０℃／秒以上、好ましくは２０℃／秒以上で行い、９５℃、２分の前反応後、９４℃，０秒−５５℃，０秒−７４℃，０分の反応を５５サイクル繰り返すスケジュールで、リアルタイムＰＣＲを行った。
その増幅曲線、及びＣｔ値を図１及び表３に示した。従来汎用的に用いられている、Ｔａｑポリメラーゼのなだらかに上がっていく増幅曲線に対し、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）の方では、きれいなシグモイド型の増幅曲線が確認された。鋳型量とＣｔ値との関係からも、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）を用いる方が、より高感度に精度も高い測定が可能であることが確認された。また、Ｃｔ値から算出されたｓｌｏｐｅからＫＯＤ（ｅｘｏ−）の方がＰＣＲ効率にも優れることが明らかになった。ここでＣｔ値はライトサイクラー（登録商標）２．０が自動で算出してきたＣｔ値を用いた。
【００３３】
【表３】
【実施例２】
【００３４】
ターゲットＤＮＡをさらに長くした高速リアルタイムＰＣＲにおいて、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼと、従来リアルタイムＰＣＲに使用されているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの伸長速度の差を確認した。
具体的にはｈｕｍａｎグロビンの５８２ｂｐを標的とした増幅を、ライトサイクラー（登録商標）２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定し、その増幅曲線を比較した。
【００３５】
ＰＣＲバッファーはＫＯＤ Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のものを用い、原液 １／３００００倍希釈 ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ I、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５８２ｂｐ（アクチンの一部）のターゲットＤＮＡを増幅するべく配列番号４及び５に記載の塩基配列からなるプライマー対０．２μＭを使用した。
２０μｌの反応液中にホットスタート用の抗体（特許第３９６８６０６号公報に記載）０．４μｇを混合したＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを用い、鋳型にはｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ、５ｎｇ、５００ｐｇ、および５０ｐｇをそれぞれ使用した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比較にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ロシュ）を使い、上記と同様のプライマー対、鋳型を用いた。ＰＣＲの反応は、以下の表４及び表５に示すような組成を用いて行った。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】
温度変化を１０℃／秒以上、好ましくは２０℃／秒以上で行い、９５℃、２分の前反応後、９４℃，０秒−５５℃，０秒−７４℃，０分の反応を５５サイクル繰り返すスケジュールで、リアルタイムＰＣＲを行った。
比較のために用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉでは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがホットスタート用に化学修飾されている。そのため、比較のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩではＰＣＲの前処理を１０分行った。測定の結果を図２、表６に示した。
従来汎用されているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いると非特異的な増幅が起こり、鋳型の濃度に依存的な増幅が見られないところ、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼでは、鋳型の濃度に依存した増幅が確認された。本発明は、長鎖のターゲット遺伝子の増幅においても十分に適用できることが確認された。
【００３９】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、リアルタイムＰＣＲを用いた、従来報告されている方法よりも短時間での検出が可能になる。この高速リアルタイムＰＣＲの実施方法は、分子生物学等における研究分野での応用を始め、遺伝子診断などの法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等において、広く利用することができる。特に、多サンプルの迅速な処理が必要な産業用途での利用が大いに期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。具体的には、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して有用な高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法ならびにそのための組成物に関する。さらに本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、および伸長からなるサイクルを２５〜４０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法として広く用いられている（非特許文献１）。
【０００３】
ＰＣＲの普及により、様々な周辺技術が開発されている。例えば、「ホットスタートＰＣＲ」は、高温になって初めて活性を有するようにＤＮＡポリメラーゼを修飾することにより、試薬調製時の低温での非特異反応を抑制する技術である。また、「リアルタイムＰＣＲ」は、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出する技術である。
【０００４】
中でも、リアルタイムＰＣＲは反応後に電気泳動することなく、簡便に核酸の微量検出や定量を行えることが有用な特長の一つであり、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。ＰＣＲを用いた増幅は鋳型となる核酸のコピー数が多いと短時間で一定の強度に達し、少ないと長い時間を要する。そのため、蛍光を用いて増幅の経時変化を測定できるリアルタイムＰＣＲでは、一定強度まで達する増幅回数を濃度既知の核酸と濃度未知の核酸で比較することで、鋳型核酸の定量が可能となる。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲの蛍光の検出方法には、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を使用するインターカレーター法と、遺伝子産物に特異的に結合する蛍光プローブを使用するハイブリダイゼーション法がある。
前者の一例としてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎと呼ばれる蛍光色素が広く使用されている。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素はあらゆる配列に対して利用することができるため汎用性が高いが、プライマーの二量化などの非特異的な増幅産物にも結合し、不正確な測定値を得る可能性もある。
逆に、ＴａｑＭａｎプローブ及びＦＲＥＴプローブに代表されるハイブリダイゼーション法は、遺伝子産物によって、それぞれ特異的な配列をもつ蛍光プローブを作成する必要があるが、任意の配列を特異的に定量できる利点がある。
最近では、伸長したときのみ蛍光を発するプライマーを用いた、インターカレーター法とハイブリダイゼーション法の間をとったような技術であるＬＵＸプラーマー法も開発され、安価で感度のよい検出が可能となっている。
【０００６】
現在、遺伝子診断などの多サンプルの測定を必要とする産業用途では反応時間の短縮が強く求められている。反応時間を短縮するため、様々なＰＣＲ機器が改良ならびに開発されてきている。ロシュ・ダイアグノスティックス社のライトサイクラー（登録商標）は市販されているサーマルサイクラーの中では最速であり、空気を使って温度制御をする方法をとっている。今までのブロックサイクラーに比べ、格段に温度変化にかかる時間が短くなり、通常２時間程度かかる３０〜４０サイクルのＰＣＲ時間を３０分まで短縮している。
【０００７】
このように温度変化が高速化されると、ＰＣＲの反応時間はもはや機器の温度変化ではなく、主にＰＣＲの反応自体に制約されるようになっている。現在、通常のＰＣＲを行う酵素としては、真性細菌由来のＰｏｌＩ型酵素であるＴａｑやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、アーキア（超高熱始原菌）由来のα型酵素であるＫＯＤやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどが使用され、また、これら２種類を混合した酵素もよく使用されている。しかし、高速ＰＣＲを行う際には伸長速度の差が反応時間に大きく影響するため、ＴａｑやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼよりも、伸長性に優れる酵素を使用することが必要になっている。実際、伸長性が優れるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いた高速ＰＣＲの検討がなされており、ＴａｑやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも反応時間を短縮できている（特許文献１）。
【０００８】
しかし、リアルタイムＰＣＲで使われる酵素としては、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ法など、様々な応用研究が行われているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用することが多い。
例外的に、逆転写反応を同時に行えるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲ試薬も存在するが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を使った例は少ない（特許文献２）。
リアルタイムＰＣＲでは比較的短いＤＮＡを増幅するため、ブロックサイクラーの温度変化にはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで十分、対応できていた。しかし、高速で温度変化を行えるリアルタイムＰＣＲ機器の開発も進んできており、高速リアルタイムＰＣＲに適したＰＣＲ酵素の検討も必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−０３２８７０９号
【特許文献２】米国特許第６５６９６２７号
【特許文献３】特許第３４８７３９４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２３０，ｐ１３５０−１３５４（１９８５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、リアルタイムＰＣＲは研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。多サンプルの処理が必要なこれらの産業用途では反応時間の短縮が強く望まれている。そのような中、伸長性の優れたＤＮＡポリメラーゼの高速ＰＣＲへの検討が行われている。
しかし、温度変化を高速で行うリアルタイム機器の開発が遅れたこと、また、リアルタイムＰＣＲでは増幅するＤＮＡが比較的短くブロックサイクラーの温度変化の条件ではＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで十分、機能できていたことがあり、高速ＰＣＲでの検討に比べ、高速リアルタイムＰＣＲでそれらのＤＮＡポリメラーゼを使った検討はほとんどなされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、伸長速度の高いＤＮＡポリメラーゼ、具体的には１００塩基／秒以上、好ましくは１３０塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使って、リアルタイムＰＣＲの反応時間の短縮を目指した。
熱サイクルの時間を限界まで短くした条件において、一般にリアルタイムＰＣＲに用いられているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは鋳型ＤＮＡを短い時間で完全に伸長できず、増幅曲線がなだらかになり、ＰＣＲ効率が落ちる。しかし、短い時間で鋳型ＤＮＡを完全に増幅できる、特に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋭意検討を行った結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比べ、短い反応時間できれいな増幅曲線が得られ、かつ優れたＰＣＲ効率および定量性を示すことが確認でき、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
項１．１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。
項２．高速リアルタイムＰＣＲが、２０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とする項１に記載の遺伝子の増幅方法。
項３．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする項１または２に記載の遺伝子の増幅方法。
項４．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）いずれかであることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
項５．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
項６．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
項７．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項６に記載の遺伝子の増幅方法。
項８．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有することを特徴とする項６に記載の遺伝子の増幅方法。
項９．１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１０．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする項９に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１１．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項９または１０に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１２．前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項１３．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光物質が含有される反応用緩衝液を含んでなることを特徴とする項９〜１２のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、高速リアルタイムＰＣＲにおいて、反応時間をさらに短縮することを可能とした。研究分野での応用を始め、遺伝子診断などの法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等において、広く利用することができる。特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が大いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、高速リアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図２】実施例２において、高速リアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における、高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法とは、１０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とするリアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするものである。
【００１７】
上記の要件を満たしている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、現在市場にて購入できるものは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）などが挙げられる。
本発明においては、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
【００１８】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものが好ましい。また、それらのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。
該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。該変異体としては、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。
その一例としては、配列番号１の１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の１４１番目のアスパラギン酸と１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した酵素、配列番号１の２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した酵素、配列番号１の３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した酵素などがあげられる。
なかでも、配列番号１における２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換されたものがより具体的な好適例として示されるが、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。また、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するもの、さらに好ましくは９０％以上のホモロジーを有するものが挙げられる。
ここでのホモロジーの計算には、ＧＥＮＥＴＹＸ、ＤＮＡｓｉｓなどのアミノ酸配列の相同性を調べる遺伝情報処理ソフトが用いられるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲとは、１０℃／秒以上、好ましくは１５℃／秒以上、更に好ましくは２０℃／秒以上の速度の温度変化で実行されるリアルタイムＰＣＲであることを特徴とする。
本発明において用いることができるＰＣＲ機器としては、ロシュ・ダイアグノスティックス社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステムズ社のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ（登録商標）、バイラッドラボラトリー社のｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ（登録商標）及び、ＴａＫａＲａ社のＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲとは、変性、アニール、及び伸長の時間を限りなく短くしたものであり、増幅反応を３０分以内、好ましくは２５分以内、更に好ましくは２０分以内で終わらせることを特徴とする。
【００２２】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲは、蛍光物質を用いて増幅産物を検出することを特徴とする。
検出方法としてはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどの二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を添加するインターカレーター法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＦＲＥＴプローブ、Ｌｉｏｎプローブ、及びサイクリングプローブなどを使用するハイブリダイゼーション法、蛍光プライマーを使用するＬＵＸプライマー法などが挙げられるが、増幅産物をリアルタイムに検出できる方法であればよく、特に限定されない。
【００２３】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲ組成物とは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
ここで緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２４】
本発明における高速リアルタイムＰＣＲ組成物は、さらに必要により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと反応用緩衝液を、各々別々のチューブに入れていてもよい。
本発明の高速リアルタイムＰＣＲ組成物は、さらに必要により、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２５】
反応バッファーとしては、トリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
反応バッファーを含む構成である場合、５倍から２０倍程度の濃度、好ましくは１０倍程度の濃度に濃縮されたストック液として含まれることが好ましい。
【００２６】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
本発明において、デオキシリボ核酸合成速度とは単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， ８ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ， ０．１ｍＭ ｄＮＴＰ， ０．２μＣｉ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ， ５％ フィコール、０．０５％ ブロモフェノールブルー） を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、デオキシリボ核酸合成速度を求める。
ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼは、特許第３４８７３９４号公報（特許文献３）に記載されている、３’−５’エキソヌクアーゼ活性を改変前の酵素に比べて、５％以下にまで抑えたＤＮＡポリメラーゼであり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換したものである。
【００２８】
このＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いて高速リアルタイムＰＣＲを行うことにより、従来リアルタイムＰＣＲに使用されるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの有意性を確認した。
具体的には、ｈｕｍａｎアクチンの１８８ｂｐを標的とした増幅をライトサイクラー（登録商標）２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定し、その増幅曲線およびＰＣＲ効率を比較した。
【００２９】
ＰＣＲバッファーはＫＯＤ Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のものを用い、原液 １／３００００倍希釈 ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ I、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１８８ｂｐのＤＮＡ（アクチンの一部）を増幅するべく配列番号２及び３に記載の塩基配列からなるプライマー対０．２μＭを使用した。
２０μｌの反応液中にホットスタート用の抗体（特許第３９６８６０６号公報）０．２μｇを混合したＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ０．２５Ｕを用い、鋳型にはＨｕｍａｎ ＲＮＡ １μｇをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）１００μｌで逆転写してできた産物の１〜１０４倍希釈したものを使用した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比較にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ロシュ）を使い、上記と同様のプライマー対、鋳型を用いた。ＰＣＲの反応は、以下の表１及び表２に示すような組成を用いて行った。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
温度変化を１０℃／秒以上、好ましくは２０℃／秒以上で行い、９５℃、２分の前反応後、９４℃，０秒−５５℃，０秒−７４℃，０分の反応を５５サイクル繰り返すスケジュールで、リアルタイムＰＣＲを行った。
その増幅曲線、及びＣｔ値を図１及び表３に示した。従来汎用的に用いられている、Ｔａｑポリメラーゼのなだらかに上がっていく増幅曲線に対し、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）の方では、きれいなシグモイド型の増幅曲線が確認された。鋳型量とＣｔ値との関係からも、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）を用いる方が、より高感度に精度も高い測定が可能であることが確認された。また、Ｃｔ値から算出されたｓｌｏｐｅからＫＯＤ（ｅｘｏ−）の方がＰＣＲ効率にも優れることが明らかになった。ここでＣｔ値はライトサイクラー（登録商標）２．０が自動で算出してきたＣｔ値を用いた。
【００３３】
【表３】
【実施例２】
【００３４】
ターゲットＤＮＡをさらに長くした高速リアルタイムＰＣＲにおいて、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼと、従来リアルタイムＰＣＲに使用されているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの伸長速度の差を確認した。
具体的にはｈｕｍａｎグロビンの５８２ｂｐを標的とした増幅を、ライトサイクラー（登録商標）２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定し、その増幅曲線を比較した。
【００３５】
ＰＣＲバッファーはＫＯＤ Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のものを用い、原液 １／３００００倍希釈 ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ I、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５８２ｂｐ（アクチンの一部）のターゲットＤＮＡを増幅するべく配列番号４及び５に記載の塩基配列からなるプライマー対０．２μＭを使用した。
２０μｌの反応液中にホットスタート用の抗体（特許第３９６８６０６号公報に記載）０．４μｇを混合したＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを用い、鋳型にはｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ、５ｎｇ、５００ｐｇ、および５０ｐｇをそれぞれ使用した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比較にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ロシュ）を使い、上記と同様のプライマー対、鋳型を用いた。ＰＣＲの反応は、以下の表４及び表５に示すような組成を用いて行った。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】
温度変化を１０℃／秒以上、好ましくは２０℃／秒以上で行い、９５℃、２分の前反応後、９４℃，０秒−５５℃，０秒−７４℃，０分の反応を５５サイクル繰り返すスケジュールで、リアルタイムＰＣＲを行った。
比較のために用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉでは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがホットスタート用に化学修飾されている。そのため、比較のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩではＰＣＲの前処理を１０分行った。測定の結果を図２、表６に示した。
従来汎用されているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いると非特異的な増幅が起こり、鋳型の濃度に依存的な増幅が見られないところ、ＫＯＤ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼでは、鋳型の濃度に依存した増幅が確認された。本発明は、長鎖のターゲット遺伝子の増幅においても十分に適用できることが確認された。
【００３９】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、リアルタイムＰＣＲを用いた、従来報告されている方法よりも短時間での検出が可能になる。この高速リアルタイムＰＣＲの実施方法は、分子生物学等における研究分野での応用を始め、遺伝子診断などの法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等において、広く利用することができる。特に、多サンプルの迅速な処理が必要な産業用途での利用が大いに期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。
【請求項２】
高速リアルタイムＰＣＲが、２０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項３】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項４】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）いずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項６】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項７】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項８】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項９】
１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１０】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする請求項９に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１１】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項９または１０に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１２】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１３】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光物質が含有される反応用緩衝液を含んでなることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１】
１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速リアルタイムＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅方法。
【請求項２】
高速リアルタイムＰＣＲが、２０℃／秒以上の温度変化で実行されることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項３】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項４】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）いずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列における１４１、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項６】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項７】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項８】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子の増幅方法。
【請求項９】
１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１０】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するものであることを特徴とする請求項９に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１１】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項９または１０に記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１２】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項１３】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光物質が含有される反応用緩衝液を含んでなることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の高速リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２３９８８０（Ｐ２０１０−２３９８８０Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９００６７（Ｐ２００９−９００６７）
【出願日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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