鳥類を標的とする遺伝子置換ベクター、およびその利用
【課題】 本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄内に外来タンパク質を生産させる系を実現するために、鳥類の遺伝子を置換するための遺伝子置換ベクター、および当該遺伝子置換ベクターの利用方法を提供することを目的としている。
【解決手段】 本発明の遺伝子置換ベクターは、カテプシンＤ認識領域を含むニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子が含まれており、前記カテプシンＤ認識領域に外来のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入されている。当該遺伝子置換ベクターを用いてニワトリ肝細胞（ＬＭＨ）にＥＧＦＰ遺伝子を導入したところ、Ｎ，Ｃ末端にカテプシンＤ認識領域を有するＥＧＦＰタンパク質が、ビテロゲニン融合タンパク質として生産された。
【解決手段】 本発明の遺伝子置換ベクターは、カテプシンＤ認識領域を含むニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子が含まれており、前記カテプシンＤ認識領域に外来のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入されている。当該遺伝子置換ベクターを用いてニワトリ肝細胞（ＬＭＨ）にＥＧＦＰ遺伝子を導入したところ、Ｎ，Ｃ末端にカテプシンＤ認識領域を有するＥＧＦＰタンパク質が、ビテロゲニン融合タンパク質として生産された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリを始めとする鳥類細胞において外来タンパク質をコードする遺伝子を導入するために用いられるベクター、および当該ベクターを用いて鳥類細胞において外来タンパク質を生産する方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、有用タンパク質の生産においては、その生産量が高い、生産コストが安い等の理由から、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が用いられてきた。しかし目的とするタンパク質によっては、糖鎖の付加、高次構造がその機能に重要な影響を及ぼす場合があり、かかるタンパク質を上記微生物で生産しようとしても、うまく発現しない場合や、発現したとしてもその目的とする機能が得られない場合がある。そこで、近年は、有用タンパク質の生産において、鳥類、哺乳類等の高等生物を用いることが検討され、そのタンパク質の生産系の開発が行なわれている。
【０００３】
例えば、トランスジェニックウシを用いて、その乳中にタンパク質を生産する方法が知られている（例えば、非特許文献７参照）。
【０００４】
また、近年そのヒトに極めて類似した糖鎖構造を有するタンパク質生産することから、ニワトリを始めとする鳥類がタンパク質生産系として特に注目されている。ニワトリを始めとする鳥類は、その卵中にタンパク質、抗体を蓄積することができる。例えば、特許文献１，２、および非特許文献１〜６には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクター系を利用しトランスジェニックニワトリを作製し、血中、卵（卵白）中に有用タンパク質、抗体を生産する方法について記載されている。
【０００５】
ところで、卵黄タンパク質の前躯体であるビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断されるということが知られている（例えば、非特許文献８、９参照）。
【特許文献１】特表２０００−５１２１４９号公報（公表日：平成１２（２０００）年９月１９日、国際公開日：平成９年１２月１８日）
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１０８１３２号明細書
【非特許文献１】Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris, and Robert Ivalie, 2002. nature biotechnology Vol.19, 396-399
【非特許文献２】P. E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, Ｄ. W. McCoy, and J. N. Petitte, 2003. ＤEVELOPMENTAL ＤYNAMICS 226, 439-445
【非特許文献３】Jeffrey C. Rapp, Alex J. Harvey, Gordon L. Speksnijder, Wei Hu & Robert Ivarie, 2003. Transgenic Research 12, 569-575
【非特許文献４】Mo Sun Kwon, Bon Chul Koo, Bok Ruyl Choi, Hoon Taek Lee, Young Hye Kim, Wang-Shik Ryu, Hosup Shim, Jin-Hoi Kim, Nam-Hyung Kim, and Teoan Kim, 2004, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 442-448
【非特許文献５】Micael J. McGrew, Adrian Sherman, Fiona M. Ellard, Simon G. Lillico, Hazel J. Gilhooley, Alan J. Kingsman, Kyriacos A. Mitrophanous, and Helen Sang, EMBO reports VOL 5, NO7, 2004. 728-733
【非特許文献６】Paul E. Mozdziak, Simone Pophal, Suparerk Borwornpinyo and James N. Petitte, 2003, American Society for Nutritional Science. 3076-3079
【非特許文献７】Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, L'Huillier P, Laible G. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein.Nat Biotechnol. 2003 Feb;21(2):157-62.
【非特許文献８】分子細胞生物学辞典、東京化学同人、p651
【非特許文献９】Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10;250(23):9060-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ウシ等の大型の哺乳動物を用いて有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでに長期間を要すること、広大な面積の飼育設備が必要なこと、飼育コストが高いこと等の問題を有している。
【０００７】
これに対して、ニワトリを用いて血液中や卵中に有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでの期間がウシ等の大型哺乳類に比して短期間であること、比較的小さな飼育設備で飼育可能であること、飼育コストが安い等のメリットを有している。
【０００８】
現在、ニワトリを始めとする鳥類において、外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する系として主にウイルスベクター系が用いられている。かかるウイルスベクター系は、高い効率で外来タンパク質をコードする遺伝子を導入することが可能なこと、容易にウイルスベクターを調製することができるというメリットはあるが、外来タンパク質をコードする遺伝子が染色体のどこに組み込まれるかについては全くランダムであり、その組み込み位置によっては、目的の外来タンパク質が発現しない場合や、重要な機能を有する遺伝子が破壊されてしまう場合や、細胞に不要な遺伝子が活性化されてしまう場合がある。したがって、ウイルスベクター系を用いて有用タンパク質を生産するトランスジェニック動物（ニワトリ）を作出する場合には、外来タンパク質をコードする遺伝子の組み込み位置を制御できないために、種々の問題点が生じてしまう。よって、ニワトリ等の鳥類を用いて外来タンパク質を生産させる場合においては、ジーンターゲッティングにより、目的の場所に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する系が必要となっている。
【０００９】
ところで、既述のごとく卵黄タンパク質の前躯体であるビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断されるということが知られている（非特許文献８、９参照）。
【００１０】
かかる卵黄タンパク質の合成系を利用するによって、目的の外来タンパク質を卵黄内に蓄積させることが可能となることが予想できる。すなわちビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子内に、カテプシンＤ認識配列を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができれば、ビテロゲニンタンパク質と外来タンパク質の融合タンパク質が肝細胞内で合成され、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるというものである。
【００１１】
上記のタンパク質生産系を実現するためには、外来タンパク質とビテロゲニンタンパク質との融合タンパク質を生産しなければならない。しかもビテロゲニンタンパク質から切り出されるリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンは、卵黄の大部分を構成する重要なタンパク質であるために、正常なリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンを合成する必要がある。よって、上記の条件を満たすためには、リポビテリン−１とホスビチンの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入するか、またはホスビチンとリポビテリン−２の切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入するか、またはリポビテリン−２とβ−リベチンの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入する必要がある。すなわち、鳥類のゲノムの目的の位置に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を正確に導入する必要がある。
【００１２】
そこで本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄内に目的の外来タンパク質を生産させる系を実現するために、鳥類の遺伝子を置換するための遺伝子置換ベクター、および当該遺伝子置換ベクターの利用方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記課題を解決すべく、導入した外来タンパク質（ＥＧＦＰ；Enhanced Green Fluorescence Protein、クロンテック社製）の両端に、カテプシンＤ認識配列が付加するようにデザインした遺伝子置換ベクターを用いて、ニワトリ肝細胞株（ＬＭＨ）へＥＧＦＰ遺伝子を導入したところ、内在のカテプシンＤにより外来タンパク質由来のＥＧＦＰが切り出される事を確認した。本発明は上記知見に基づき完成されたものである。
【００１４】
すなわち本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記課題を解決するために、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴としている。
【００１５】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ認識領域のうち、リポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ａとし、ホスビチンとリポビテリン−２との切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｂとし、リポビテリン−２とβ−リベチンとの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｃとすると、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部が、認識領域Ａ、または認識領域Ｂ、または認識領域Ｃのいずれかを１つ以上含む構成であってもよい。
【００１６】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子置換ベクター。
【００１７】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する構成であってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ａが、配列番号１の１１０８位から１１１４位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００１９】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ｂが、配列番号１の１３２５位から１３３１位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００２０】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ｃが、配列番号１の１５６３位から１５６９位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００２１】
上記本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる鳥類由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片内に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した後、宿主細胞に当該遺伝子置換ベクターを導入すれば、ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の相同配列を有するがゆえに、相同組み換えが起こる。よって、宿主細胞におけるビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子領域を、外来タンパク質が導入された遺伝子と置換することができるという効果を奏する。
【００２２】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、前記遺伝子断片に挿入されている構成であってもよい。
【００２３】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記選択マーカー遺伝子が、ブラストシジンＳ耐性遺伝子であってもよい。
【００２４】
上記構成によれば、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを宿主細胞に導入したときに、遺伝子が導入された細胞か否かを、ブラストシジンＳ等の薬剤に対する耐性を指標に容易に判別することができるという効果を奏する。
【００２５】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、前記遺伝子断片に連結されている構成であってもよい。
【００２６】
上記致死遺伝子発現カセットは、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子領域外に連結されているため、本発明にかかる遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、前記致死遺伝子発現カセットは宿主細胞のゲノムには組み込まれない。一方、ランダムな位置に組み換えが起これば、致死遺伝子発現カセットを含めて宿主細胞のゲノムに組み込まれる。よって、ランダムな位置に組み換えが起こった細胞は、致死遺伝子の発現により死滅する。したがって、生き残った細胞をセレクトすることにより、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選択することができるという効果を奏する。
【００２７】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記致死遺伝子が、カスパーゼ遺伝子であってもよい。
【００２８】
カスパーゼは細胞のアポトーシスを誘導する。それゆえ、上記致死遺伝子発現カセットが導入され、カスパーゼが細胞内で発現すれば、アポトーシスが起こり当該細胞は死滅する。したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに用いる致死遺伝子として好適である。
【００２９】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記いずれかの遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子領域に、外来タンパク質をコードする遺伝子が、前記外来タンパク質をコードする遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入されているものであってもよい。
【００３０】
上記構成の遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、宿主細胞においてカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。
【００３１】
かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるという効果を奏する。
【００３２】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記外来タンパク質をコードする遺伝子と、前記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されている構成であってもよい。
【００３３】
上記構成によれば、卵黄内に蓄積された目的の外来タンパク質を、精製用タグによって容易に回収・精製することができるという効果を奏する。
【００３４】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記精製用タグが、ヒスチジンタグであってもよい。
【００３５】
上記ヒスチジンタグによれば、ニッケルカラムを用いることによって、目的とする任意のタンパク質の精製を容易に行なうことができるという効果を奏する。
【００３６】
一方、本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記いずれかの遺伝子置換ベクターを用いて、鳥類由来細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
【００３７】
上記構成の遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、宿主細胞においてカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質が合成されることとなる。
【００３８】
かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるという効果を奏する。
【００３９】
また本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記鳥類由来細胞が、ニワトリ由来細胞であってもよい。
【００４０】
ニワトリは、古くから食用動物として飼育されてきており、その飼育施設、飼育方法が確立されていること、また成熟するまでの期間が短いこと、安全性が高いこと等の利点があり、目的の外来タンパク質を大量に生産する宿主として好適である。
【００４１】
また本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記鳥類由来細胞が鳥類由来肝細胞であってもよい。
【００４２】
ビテロゲニンタンパク質は、肝臓で合成されるタンパク質であるため、肝細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
【００４３】
一方、本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産キットは、上記いずれかに記載の遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴としている。
【００４４】
上記本発明にかかる鳥類由来タンパク質の生産キットによれば、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質を、宿主細胞内で合成することができる。かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができる。
それゆえ、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子置換ベクターに挿入するだけで、種々の外来タンパク質を宿主細胞内で生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００４５】
上記本発明によれば、相同組み換えにより、ニワトリを始めとする鳥類由来宿主細胞のゲノムにおけるカテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる。上記のごとく外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された宿主細胞では、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。かかる融合タンパク質は、(1)肝細胞で合成され、(2)血流中へ分泌、(3)血流にのり卵母細胞へ到着、(4)ビテロゲニンのシグナルを卵母細胞の膜表面の受容体が認識、(5)ビテロゲニンを卵母細胞に取り込まれ、卵母細胞内に蓄積する。蓄積した融合タンパク質は、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることが可能となる。それゆえ、本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄に目的の外来タンパク質を蓄積させて、卵黄から目的の外来タンパク質を回収するというタンパク質の生産系の実現に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
（１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター）
本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴としている。
【００４８】
ここで「ビテロゲニンタンパク質」は、既述の通り、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄タンパク質の前躯体であり、カテプシンＤの作用により、最終的にリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断される。よって、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質には、３箇所のカテプシンＤ認識領域、カテプシンＤによる切断点が含まれていることとなる。ここでリポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ａ」と称し、ホスビチンとリポビテリン−２の切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ｂ」と称し、リポビテリン−２とβ−リベチンの切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ｃ」と称する。
【００４９】
ここで「カテプシンＤ認識領域」とは、カテプシンＤがポリペプチドを切断する際に認識する一定のアミノ酸配列のことを意味する。かかるカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列としては、例えば「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、「Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号８）、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１１）、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１２）、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１３）、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１５）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）が挙げられる。
【００５０】
なお、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号８）は、ウズラ、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（Gerhartz B, Auerswald EA, Mentele R, Fritz H, Machleidt W, Kolb HJ, Wittmann J. Proteolytic enzymes in yolk-sac membrane of quail egg. Purification and enzymatic characterisation. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1997 Sep;118(1):159-66.参照）。
【００５１】
Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９）、およびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１０）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（Pohl J, Baudys M, Kostka V. Chromophoric peptide substrates for activity determination of animal aspartic proteinases in the presence of their zymogens: a novel assay. Anal Biochem. 1983 Aug;133(1):104-9.参照）。
【００５２】
また、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１１）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列でり、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１２）は、ブタ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１３）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１４）は、ウシ、ヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１５）、およびＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）は、ヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（蛋白質分解酵素Ｉ、鶴 大典、船津 勝編、学会出版センター、ｐ77-87）。
【００５３】
上記カテプシンＤ認識領域のうち、ニワトリ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、かつニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質に含まれるものとしては、「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、および「Ｔｒｐ−ＡＳｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）が挙げられる。
【００５４】
図１にニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）、および各カテプシンＤ認識領域の位置を示す。なお、上記ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）は、ACCESSION Number：CAA31942に開示されている（van het Schip FD, Samallo J, Broos J, Ophuis J, Mojet M, Gruber M, AB G. Nucleotide sequence of a chicken vitellogenin gene and derived amino acid sequence of the encoded yolk precursor protein.J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):245-60参照）。
【００５５】
なお、図１中のアミノ酸は１文字表記で示している。また、上記アミノ酸配列はこれに限定されるものではない。図１中の１６位から１１１１位のアミノ酸が、リポビテリン−１のアミノ酸配列であり、１１１２位から１３２８位のアミノ酸が、ホスビチンのアミノ酸配列であり、１３２９位から１５６６位のアミノ酸が、リポボテリン−２のアミノ酸配列であり、１５６７位から１８５０位のアミノ酸がβ−リベチンのアミノ酸配列である。
【００５６】
そのうち、１１０８位から１１１４位のアミノ酸配列が、上記「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、すなわち認識領域Ａに相当し、１１１１位と１１１２位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちリポビテリン−１とホスビチンの切断点である。なお、図１中では認識領域Ａに下線（実線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５７】
また、１３２５位から１３３１位のアミノ酸配列が、上記「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、すなわち認識領域Ｂに相当し、１３２８位と１３２９位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちホスビチンとリポビテリン−２の切断点である。なお、図１中では認識領域Ｂに下線（２重線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５８】
また、１５６３位から１５６９位のアミノ酸配列が、上記「Ｔｒｐ−ＡＳｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）、すなわち認識領域Ｃに相当し、１３２８位と１３２９位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちリポビテリン−２とβ−リベチンの切断点である。なお、図１中では認識領域Ｃに下線（波線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５９】
本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、遺伝子置換を行なうためにベクターである。すなわち、鳥類の標的遺伝子（本発明においてはビテロゲニンをコードする遺伝子）の相同配列を両端に有する変異型の遺伝子断片（目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された遺伝子断片）を宿主細胞に導入し、相同組み換えを起こさせることにより宿主細胞の標的遺伝子と、変異型の遺伝子とを置換するためのベクターである。したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、標的となる鳥類のビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部または全部が含まれている必要がある。
【００６０】
したがって、鳥類のビテロゲニンをコードする遺伝子のうち、上記カテプシンＤ認識領域（認識領域Ａ、認識領域Ｂ、認識領域Ｃ）をコードする領域が含まれる遺伝子断片が、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれている必要がある。
【００６１】
例えば、ニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする全遺伝子配列を配列番号５に示した。なお、上記ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全塩基配列（配列番号５）は、ACCESSION Number：X13607に開示されている（van het Schip FD, Samallo J, Broos J, Ophuis J, Mojet M, Gruber M, AB G. Nucleotide sequence of a chicken vitellogenin gene and derived amino acid sequence of the encoded yolk precursor protein.J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):245-60参照）。
【００６２】
なお、ニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする全遺伝子配列は、これに限定されるものではない。配列番号５に示される塩基配列のうち、１１１１５位から１１１３５位が認識領域Ａをコードする塩基配列（aacactgtgctagcagagttt；配列番号１７）であり、１２２２７位から１２２５０位が認識領域Ｂをコードする塩基配列（catgagatttatcagtatcgcttt；配列番号１８）であり、１４６５５位から１４６７５位が認識領域Ｃをコードする塩基配列（tggaacgtctttgctgaagcc；配列番号１９）である。よって、ニワトリをターゲットとした本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、配列番号５に示される塩基配列のうち、１１１１５位から１１１３５位が含まれるような遺伝子断片では、認識領域Ａをコードする領域が含まれているといえ、１２２２７位から１２２５０位が含まれていれば、認識領域Ｂをコードする領域が含まれているといえ、１４６５５位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ｃをコードする領域が含まれているといえる。また１１１１５位から１２２５０位が含まれていれば、認識領域Ａおよび認識領域Ｂをコードする領域が含まれているといえ、１２２２７位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ｂおよび認識領域Ｃをコードする領域が含まれているといえ、１１１１５位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ａ、認識領域Ｂおよび認識領域Ｃをコードする領域が全て含まれているといえる。なお、上記認識領域Ａ、認識領域Ｂ、認識領域Ｃをコードする塩基配列はこれらに限定されるものではなく、コドン表に基づいて種々変更することが可能である。
【００６３】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる遺伝子断片には、上記各種認識領域をコードする領域が少なくとも含まれていればよいが、その前後に少なくとも２５００塩基以上を含まれていることが好ましく、５０００塩基以上含まれていることがさらに好ましく、８０００塩基以上含まれていることが最も好ましい。後述するとおり、相同組み換えが起こる確率は、相同部分が長く含まれているほど、換言すれば全長に近ければ近いほど、高くなるからである。
【００６４】
一般に、相同組み換えを起こさせる場合、相同領域の塩基は長ければ長いほど、より好ましい。しかし、長くなりすぎると遺伝子の導入効率が低下するため、１００ｋｂｐ以下が好ましく、８ｋｂｐ程度が好ましいといえる（Nature Genetics, volume 36, Number 8, pp867-871,2004、およびBlood First Edition Paper, prepublished online ay 1,2003;DOI10.1182/blood-2003-03-0708参照）。
【００６５】
また本発明が目的とするタンパク質の生産系は、ビテロゲニンタンパク質とカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する目的の外来タンパク質との融合タンパク質を合成し、卵母細胞に存在するカテプシンＤの作用によって、正常なリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン、および目的の外来タンパク質を卵黄内に蓄積させようとするものである。したがって、目的の外来タンパク質は、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように挿入されていることが好ましいといえる。
【００６６】
すなわち、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入させる必要がある。より具体的には、遺伝子置換ベクターには、「５’末端からビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部」−「カテプシンＤ認識領域をコードする領域」−「目的の外来タンパク質をコードする遺伝子」−「カテプシンＤ認識領域をコードする領域」−「ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部」という順で構成させる。
【００６７】
したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、少なくとも１つ以上のカテプシンＤ認識領域を含むビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片が含まれている必要がある。本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる遺伝子断片は、例えば、上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のいずれか１つを含むものであっても、上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域を含むものであっても、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域を含むものであっても、また上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域全てを含むものであってもよい。ただし、既述の通り、相同組み換えが起こりやすいという理由から、どのような組み合わせであってもいずれかを含み、全長８ｋｂｐ程度が好ましいといえる。
【００６８】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターにおいては、元来存在するカテプシンＤ認識領域をコードする領域、別のアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識領域をコードする領域ものに置き換えた態様であってもよい。例えば、認識領域Ａをコードする領域を、認識領域Ｂをコードする領域に置き換えたものであってもよい。また本来含まれていなかったカテプシンＤ認識領域をコードする領域のものと置き換えた態様であってもよい。
【００６９】
また遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入させるパターンは、特に限定されるものではない。よって目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されるカテプシンＤ認識領域をコードする領域は、上記認識領域Ａをコードする領域であっても、認識領域Ｂをコードする領域であっても、認識領域Ｃをコードする領域であってもよい。また、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のいずれか１箇所のみに挿入されている態様であってもよいが、認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のうち、いずれか２箇所に挿入されていてもよいし、また全てに挿入されていてもよい。
【００７０】
さらには、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が２つ以上、カテプシンＤ認識領域をコードする領域を介して連結されたものであってもよい。本発明においては、「目的の外来タンパク質をコードする遺伝子」とは、上記のごとく目的の外来タンパク質をコ−ドする遺伝子が複数個連結したものを含む意味である。なお、連結する目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、同じタンパク質をコードする遺伝子であっても、異なるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。かかる構成とすることで、タンパク質の生産量を向上させたり、２種類以上のタンパク質を同時に生産することができるようになる。なお、本発明において「外来タンパク質をコードする遺伝子」とは、宿主の細胞が、元来有していないタンパク質をコードする遺伝子、および元来有しているタンパク質をコードする遺伝子をも含む意味である。
【００７１】
また遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入させる手法については、特に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を用いればよい。
【００７２】
例えば、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域（ここでは便宜上、認識領域Ａを用いて説明する。当然他のカテプシンＤ認識領域についても同様実施すればよい。）をコードする領域のみを切断し、かつ目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を切断しない制限酵素（例えば、ＮｈｅＩ）を用いて、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を含まない本発明にかかる遺伝子置換ベクターをまず切断する。一方、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子の両端（５’末端、３’末端）に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチドを有する融合ポリヌクレオチドを調製する。この融合ポリヌクレオチドは、両端に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチド塩基配列が付加されるようにデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲ等によって調製することが可能である。次に当該融合ポリヌクレオチドを、遺伝子置換ベクターの切断に用いた制限酵素（例えば、ＮｈｅＩ）によって切断する。このように切断を行なった遺伝子置換ベクターおよび前記融合ポリヌクレオチドをライゲーションすれば、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチド塩基配列を有するように挿入された遺伝子置換ベクターを構築することができる。
【００７３】
また、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域を制限酵素等にて切除し、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子の両端（５’末端、３’末端）に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチドを有する融合ポリヌクレオチドをフレームシフトが起こらないように挿入してもよい。
【００７４】
なお、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子と、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、ヒスチジンタグ等の精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されていてもよい。カテプシンＤによって切り出された目的の外来タンパク質を、当該精製用タグによって容易に回収・精製することができる。例えば上記ヒスチジンタグは、ニッケルカラムを用いて容易に目的の外来タンパク質を回収・精製することができる。また精製用タグは、従来公知のものを適宜選択の上、用いればよく、上記ヒスチジンタグのほか、ＧＳＴ(glutathion S transferase)タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、チオレドキシンタグ、AviｔagTM等が利用可能である（例えば、先端バイオ用語集、羊土社ｐ15-20参照）。
【００７５】
ところで、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に挿入されている態様であってもよい。上記選択マーカー遺伝子は、特に限定されるものではなく、従来公知のものを適宜選択の上、用いればよい。例えばブラストシジンＳ耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン、ピューロマシシン、ゼオシン等が挙げられる。
【００７６】
また上記選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターは、特に限定されるものではなく、宿主細胞において選択マーカー遺伝子のプロモーターと機能するものであればよい。また誘導型プロモ−ターであっても、非誘導型プロモーターであってもよい。ただし、上記薬剤耐性マーカー等の選択マーカーは陽性選択用のマーカーであり、常に発現させる必要があるため非誘導型のプロモーターの方が好ましいといえる。
【００７７】
例えば、選択マーカー用のプロモーターとしては、従来公知のプロモーターを適宜選択の上、用いればよく、誘導型のプロモーターとしては、テトラサイクリンによる誘導を行なうTet System（クロンテック社製）、ＩＰＴＧによる誘導を行なうLacプロモーター、また非誘導型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが利用可能である。
【００７８】
またこのほか、上記選択マーカー発現カセットには、ポリＡ付加シグナル、ｌｏｘＰ、ＩＲＥＳ等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。
【００７９】
上記選択マーカーを有する態様によれば、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを宿主細胞に導入したときに、目的の遺伝子が導入された細胞か否かを、ブラストシジンＳ等の薬剤に対する耐性を指標に容易に判別することができる。すなわち、目的の遺伝子が挿入された細胞は、ブラストシジンＳ等の薬剤耐性遺伝子が発現するために、上記薬剤に対する耐性が現れる。したがって上記ブラストシジンＳを含む培地で培養して生育してきた細胞をセレクトすれば、目的の遺伝子が導入された細胞をセレクトできる。
【００８０】
なお、上記選択マーカー遺伝子は、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片のイントロン部分に挿入されていることが好ましい。エクソン部分に選択マーカー遺伝子が挿入されると、リポビテリン−１、またはホスビチン、またはリポビテリン−２、またはβ−リベチンをコードする遺伝子が破壊され正常なタンパク質が得られないからである。例えば、配列番号５に示されるニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子のイントロンは、５４位〜１６８位（イントロン１）、１９０位〜２８９位（イントロン２）、４４２位〜１７６８位（イントロン３）、２０２１位〜２５３１位（イントロン４）、２６９４位〜２７９８位（イントロン５）、２９４８位〜３１１５位（イントロン６）、３２６７位〜３３８４位（イントロン７）、３５４３位〜３６２４位（イントロン８）、３７９１位〜４６９１位（イントロン９）、４８１８位〜５２２１位（イントロン１０）、５４４１位〜６０１０位（イントロン１１）、６２２９位〜６３４４位（イントロン１２）、６４４３位〜６９１９位（イントロン１３）、７０４５位〜７１６５位（イントロン１４）、７２６８位〜７９０５位（イントロン１５）、８０２６位〜８１１１位（イントロン１６）、８３０２位〜９０５４位（イントロン１７）、９１４９位〜９２８０位（イントロン１８）、９４６７位〜９９５８位（イントロン１９）、１０１０４位〜１０２２４位（イントロン２０）、１０４４８位〜１０５３７位（イントロン２１）、１０７１４位〜１１０６６位（イントロン２２）、１１７５７位〜１２２２０位（イントロン２３）、１２２７２位〜１２５２４位（イントロン２４）、１２６１５位〜１３０５３位（イントロン２５）、１３２６７位〜１３３６１位（イントロン２６）、１３５０５位〜１３８８８位（イントロン２７）、１４０２８位〜１４５６７位（イントロン２８）、１４７０４位〜１５１６０位（イントロン２９）、１５３４８位〜１５６７８位（イントロン３０）、１５７７１位〜１６８５６位（イントロン３１）、１６９５５位〜１７７０３位（イントロン３２）、１７８６４位〜１８９１８位（イントロン３３）、１９０８１位〜２０００２位（イントロン３４）であり、上記いずれかにイントロン部分に選択マーカー発現カセットを適宜挿入すればよい。なお上記イントロン情報は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で入手した（ACCESSION Number：X13607）。
【００８１】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターにはさらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に連結されている態様であってもよい。上記致死遺伝子発現カセットは、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に連結されている、すなわちビテロゲニンタンパク質の相同領域外に連結されているため、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて宿主細胞に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した際に、相同組み換えが起これば、当該致死遺伝子発現カセットは、宿主細胞のゲノムに組み込まれないこととなる。
【００８２】
一方、ランダムな位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が導入された場合は、致死遺伝子発現カセットを含めて宿主細胞のゲノムに組み込まれることとなる。したがって、ランダムな位置に目的の外来タンパク質が組み込まれた宿主細胞は、致死遺伝子が発現することによって、細胞が死滅する。よって、宿主細胞を培養して最終的に生育してきた細胞をセレクトすれば、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、目的とする相同領域に組み込まれた細胞のみをセレクトすることができる。なお、最終的に相同組み換えが起こり目的の領域に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたか否かは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、シークエンスを行なって確認することが確実性の観点から好ましい。
【００８３】
ここで「致死遺伝子」とは、その発現により宿主細胞が死滅させることができる遺伝子のことであり、その遺伝子発現産物そのものに細胞毒性があり直接的に細胞を死滅させるものであっても、アポトーシス等の細胞死の誘導を行なうシグナル伝達物質のごとく、間接的に宿主細胞を死滅させるものであってもよい。かかる致死遺伝子としては、上記宿主細胞を死滅させることができるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の致死遺伝子を適宜選択の上、採用すればよい。
【００８４】
かかる致死遺伝子としては例えば、カスパーゼ遺伝子が挙げられる。カスパーゼファミリーは、アポトーシスを誘導するプロテアーゼ群であり、基質特異性の違いからサイトカインのプロセッシングに関与するＩ群（カスパーゼ−１、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５）、細胞死の実行に関与するＩＩ群（カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−２、ＣＥＤ−３）、および細胞死のシグナル伝達に関与するＩＩＩ群（カスパーゼ−６、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９）がある。致死遺伝子としては、上記いずれのカスパーゼをコードする遺伝子は全て利用可能である。特に、カスパーゼ−３等のＩＩ群のカスパーゼをコードする遺伝子は、細胞死の実行に関与しており即効性からに特に好ましいといえる。
【００８５】
上記カスパーゼ遺伝子のほか、ジフテリア毒素遺伝子、単純ヘルペスウイルスＩ型のチミジンキナーゼをコードする遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）が利用可能である。上記ＨＳＶ−ＴＫがコードするタンパク質は、ＤＮＡ塩基のアナログであるアシクロビル、ガンシクロビル等をリン酸化し、その後宿主細胞内のキナーゼによってリン酸化されて、３リン酸化体になり細胞のＤＮＡ合成を阻害するというものである。
【００８６】
なお上記致死遺伝子は、公知の塩基配列情報から入手可能である。
【００８７】
致死遺伝子を制御するプロモーターとしては、導入される宿主細胞内で機能するものであれば、特に限定されるものではないが、誘導型のプロモーターがより好ましいといえる。細胞に対して悪影響を及ぼす致死遺伝子の発現を綿密に制御することができ安全性の面において優れていることや、前述の選択マーカーによる選抜と、致死遺伝子による選抜を別個に行なうことができ、より正確に目的とする宿主細胞を選抜することが可能となるからである。致死遺伝子用のプロモーターとしては、従来公知のプロモーターを適宜選択の上、用いればよく、例えば誘導型のプロモーターとしては、テトラサイクリンによる誘導を行なうTet System（クロンテック社製）、ＩＰＴＧによる誘導を行なうLacプロモーター、また非誘導型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが利用可能である。
【００８８】
またこのほか、上記致死遺伝子発現カセットには、ポリＡ付加シグナル、ｌｏｘＰ、ＩＲＥＳ等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。
【００８９】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターの基本骨格は、特に限定されるものではなく、従来公知のベクターを適宜選抜の上、用いればよい。またかかる従来公知のベクター由来のＤＮＡセグメント（ポリＡ付加シグナル、ヒスチジンタグ等の精製用タグ、薬剤耐性マーカー、myc epitope等の検出用タグ）が含まれていてもよい。環状であっても、リニア形状であってもよい。ただし、相同組み換えが起こりやすいという理由から、宿主細胞に導入する際には、リニア形状であることが好ましい。
【００９０】
以下に、上記本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて、相同組み換えが起こったか否かを確認する方法の一例について示す。なお確認方法はこれに限定されるものではない。(1)本発明にかかる遺伝子導入用ベクターを肝臓細胞株に導入し、薬剤等による選択をかける。(2)薬剤等による選択で生存し選択された肝臓細胞株に対して、選択マーカーである致死遺伝子の発現誘導を行なう。(3)致死遺伝子の発現誘導の結果、生存した細胞を選抜する。(4)選抜した細胞について、ビテロゲニン遺伝子座における外来タンパク質をコードする遺伝子の有無をＰＣＲ、またはサザンブロット解析によって確認し、相同遺伝子組み換えが起こったか否かを確認する。なお用いる細胞株は、特に肝臓細胞株に限らず、血球系細胞株や培養ＥＳ細胞であってもよい。また電気穿孔法で組織に遺伝子置換ベクターを導入し、導入した組織からＤＮＡを抽出して相同遺伝子組み換えの有無を調べてもよい。
【００９１】
（２．本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法）
本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法（以下、本発明にかかるタンパク質の生産方法という。）は、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示したように、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入して構築した遺伝子置換ベクターを用いて、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を鳥類由来細胞に導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
【００９２】
＜遺伝子導入工程＞
本発明にかかるベクターの導入方法は、宿主細胞と当該遺伝子置換ベクターに応じて、公知の方法を適宜採用すればよい。例えば、リポフェクション法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等があげられる。後述する実施例では、エレクトロポレーションを行なって、ニワトリ肝細胞株（ＬＭＨ）に遺伝子導入を行なっている。
【００９３】
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたか否かは、薬剤耐性マーカー等の選択マーカーによって、判定することができる。このとき、１週間程度細胞培養を行なって、一過性の発現（transient expression）を排除し、安定形質転換細胞（stable transformant）をセレクトすることが好ましい。
【００９４】
また、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示したごとく致死遺伝子発現カセットを連結して構築した遺伝子置換ベクターの場合では、致死遺伝子の発現により、相同組み換えにより目的の位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたか、ランダムな位置に組み込まれたかを判別することができる。
【００９５】
また宿主細胞は、特に限定されるものではなく、ニワトリを始めとする鳥類由来の細胞を用いればよい。ただし、増殖が早く培養がしやすいこと、扱いが容易であること等の理由により、各種培養細胞が好ましい。各種培養細胞としては、ニワトリ由来ＬＭＨ（ＨＳＲＲＢ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）より分譲）、ＯＵ−２（樹立者(岡山大・Ogura Hajime)より分与）、ＨＤ１１（樹立者(Lillehoj HS・Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture)より分与）、ＩＮ２４（樹立者(山口大・Inoue Makoto)より分与）、ＤＴ４０（ＨＳＲＲＢ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）より分譲）等が利用可能である。
【００９６】
ただし本発明の最終的な目的は、鳥類の卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることであるため、ビテロゲニンタンパク質を生産する肝細胞に挿入することが好ましいといえる。
【００９７】
＜細胞培養工程＞
本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記「遺伝子導入工程」の他、細胞培養工程を含むものであってもよい。
【００９８】
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が相同組み換えによって、目的の位置の導入された導入された細胞（肝細胞）は、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。
【００９９】
かかる融合タンパク質をカテプシンＤによる消化を行なえば（酵素消化工程）、目的の外来タンパク質、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、およびβ−リベチンが切り出されることとなる。このとき目的の外来タンパク質にヒスチジンタグ等の精製用タグが付加されていれば、容易に目的の外来タンパク質を回収することができる（回収・精製工程）。例えば、ヒスチジンタグを利用して目的の外来タンパク質を回収する方法としては、ニッケルカラムを用いて、レジンに吸着した目的の外来タンパク質を溶出して回収すればよい。
【０１００】
またこの系を用いて、トランスジェニック動物（トランスジェニックニワトリ）を作製すれば（トランスジェニック作製工程）、上記融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができる。
【０１０１】
上記の現象を実験的に確認する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。なお、以下の方法は、あくまで一例であってこれに限定されるものではない。(1)ビテロジェニン遺伝子座の上流にあるプロモーターから下流のポリＡ付加シグナル配列を含む領域をクローン化する。このとき上流のプロモーターをウイルス由来の強いプロモーターに置換したクローンを作成して実験を行なってもよい。(2)これらのＤＮＡクローンのカテプシンＤ認識領域に外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入する。(3)構築したＤＮＡ構築物を、産卵をおこなう成鶏メスの肝臓の細胞に電気穿孔法等によって導入する。(4)産卵成鶏メスの肝臓には大量のエストロゲンが存在するため、導入したＤＮＡのビテロゲニンはエストロゲンによって、内在ビテロゲニン遺伝子と同様に発現誘導を受ける。なおウイルス由来のプロモーターを用いた場合には、細胞内在性の転写因子によって発現誘導を受ける。(5)末梢血、生まれてくる卵に含まれる外来タンパク質（外来タンパク質をコードする遺伝子の発現産物を）確認することで、外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入したビテロジェニンが血流に乗り、卵黄に移行することを確認することができる。
【０１０２】
本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて、トランジェニックニワトリを作製する方法としては、例えば、ニワトリの胚盤様細胞から樹立したＥＳ様細胞にかかる遺伝子置換ベクターを導入し、目的の遺伝子座に遺伝子置換が起きた細胞のみを選択した後、ニワトリの胚へ戻す事により、遺伝子改変された体細胞と通常の体細胞を有するキメラニワトリを作製することが挙げられる。
【０１０３】
一方、ランダムな位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された株であっても、細胞培養よってカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質を生産することは可能である。この場合、上記と同様カテプシンＤによる消化を行なえば、目的の外来タンパク質が切り出されることとなる。このとき目的の外来タンパク質にヒスチジンタグ等の精製用タグが付加されていれば、容易に目的の外来タンパク質を回収することができる。
【０１０４】
なお細胞培養の方法は、各種細胞に好適な条件を適宜採用して行なえば良く、特に限定されるものではない。
【０１０５】
またこのほか、本発明にかかるタンパク質の生産方法では、遺伝子置換ベクターの構築工程（ベクター構築工程）を含むものであってもよい。当該ベクター構築工程の具体的な方法については、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示した方法を適宜採用すればよい。
【０１０６】
（３．本発明にかかるタンパク質の生産キット）
本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産キット（以下、本発明にかかるタンパク質生産キットという。）は、本発明にかかる遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴としている。なお本発明にかかるタンパク質生産キットに含まれる遺伝子置換ベクターは、外来タンパク質をコードする遺伝子が既に挿入されているものであっても、挿入されていないものであってもよい。
【０１０７】
外来タンパク質をコードする遺伝子が既に遺伝子置換ベクターに挿入されている場合は、当該本発明にかかるタンパク質生産キットの使用者が、既に挿入されている外来タンパク質をコードする遺伝子と、目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子とを置換して使用すればよい。
【０１０８】
また、外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていない遺伝子置換ベクターが本発明にかかるタンパク質生産キットに含まれている場合には、使用者が適宜目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入して使用すればよい。
【０１０９】
上記のほか、本発明にかかるタンパク質生産キットには、遺伝子を導入するために必要な器具・試薬類、タンパク質を回収・精製するために必要な器具・試薬類、細胞を培養するために必要な器具・試薬類等が含まれていてもよい。
【０１１０】
上記遺伝子を導入するために必要な器具・試薬類としては、例えば、エレクトロポレーター、サーマルサイクラー、チューブ、制限酵素、緩衝液等が挙げられる。また、タンパク質を回収・精製するために必要な器具・試薬類としては、電気泳動装置、アガロースゲル、ニッケルカラム等の精製用カラム、精製に用いられるレジン、緩衝液等が挙げられる。また、細胞を培養するために必要な器具・試薬類等としては、培養用容器、培養装置、培地、緩衝液、培養細胞等が挙げられる。
【実施例】
【０１１１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１１２】
〔実施例１〕
カテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質（一部）のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されるか否かを確認した。
【０１１３】
＜発現ベクターの作製＞
pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＢａｍＨＩサイトに、リポビテリンとホスビチンの切断点を含む領域をコードするビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片を挿入した。なお上記遺伝子断片は、λベクターにクローニングしたビテロゲニン遺伝子断片を鋳型として、ＰＣＲ法により取得した。当該ＰＣＲに用いたプライマーは5’-CGGGATCCACCATGGGAAACACTG-3’（配列番号２０）をフォワードプライマーとし、5’-CGGGATCCGCTGCTCCTGCTGCTGCTGCT-37’（配列番号２１）をリバースプライマーとした。なおフォワードプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列は、制限酵素ＢａｍＨＩに消化される配列をコードしている。
【０１１４】
次に外来タンパク質をコードする遺伝子としてＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)遺伝子（クロンテック社製）を、pIRES2-EGFP（クロンテック社製）を鋳型としたＰＣＲにより調製した。上記ＰＣＲに用いたプライマーは5’-CCGCTAGCAGAGTTTGGGACACACCACCACCACCACCACGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3（配列番号２２）をフォワードプライマーとし、5’-GGGCTAGCACAGTGTTTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3’（配列番号２３）をリバースプライマーとした。なおフォワードプライマーの５’端から数えて２２位〜３９位の塩基配列は、ヒスチジンタグをコードしている。また、フォワードプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列は、制限酵素ＮｈｅＩに消化される配列をコードしている。さらにフォワードプライマーの５’端から数えて４位〜１５位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて２位〜１７位の塩基配列は、カテプシンＤ認識領域（上記認識領域Ａ）の一部をコードしている。
【０１１５】
上記ＰＣＲにより増幅したＥＧＦＰを含む遺伝子断片を、pcDNA4/myc-his Bに存在するビテロゲニン領域内のＮｈｅＩ領域へ挿入すれば、外来タンパク質をコードする遺伝子（ＥＧＦＰ）の両端に、完全なカテプシン認識領域（認識領域Ａ）をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターを構築することができる。
【０１１６】
上記のようにして構築した発現ベクターの構造を図２に示す。図２（ａ）は、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）に導入した外来タンパク質をコードする遺伝子の概略を示した図であり、図２（ｂ）は構築した発現ベクターの構造を示す図である。図２（ａ）において、白抜き四角の部分は、外来タンパク質をコードする遺伝子であるＥＧＦＰ遺伝子を示し、交差線を付した四角の部分は、ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、斜線を付した四角の部分は、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子、黒塗り四角の部分はビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子を示している。
【０１１７】
また図３には、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの制御下に連結されたpVTG-eGFPの開始コドンから終止コドンまでの領域の塩基配列（配列番号６）とアミノ酸配列（配列番号７）を示した。図３において、破線を引いた部分がカテプシンＤ認識領域（コード領域）であり、実線を引いた部分がヒスチジンタグの領域であり、四角囲みの部分が外来タンパク質をコードする遺伝子であるＥＧＦＰタンパク質（遺伝子）領域であり、波線を引いた部分はビテロゲニンタンパク質（遺伝子）を示し、二重下線を引いた部分がpcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）由来のmyc epitopeとヒスチジンタグの領域を示している。
【０１１８】
図３に示す遺伝子構築物から発現する融合タンパク質は、Ｎ末端にヒスチジンタグを有するＥＧＦＰタンパク質で、さらにその両端にカテプシンＤ認識領域（配列番号２）が付加されたタンパク質である。またＣ末端には、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）由来のmyc epitopeとヒスチジンタグが付加されている。
【０１１９】
＜エレクトロポレーションによる遺伝子導入＞
Gene Pulser Xcell（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてニワトリ肝細胞株であるＬＭＨ（ＨＳＲＲＢ(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)より分譲）へ、４×１０5cells、４０μｇDNAを４００μｌ １０％仔牛血清を含むダルベッコ培地に懸濁し、０．４ｃｍ間隔キュベットを用い、２７０Ｖ、９５０μＦで遺伝子導入を行なった。ＬＭＨは１０％仔牛血清を含むイスコフ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ2にて培養した。陽性対照としてpIRES2-EGFPを遺伝子導入した。
【０１２０】
＜ＥＧＦＰの蛍光顕微鏡観察＞
（方法）
遺伝子導入２４時間後に蛍光顕微鏡IX71(OLYMPUS社製)を用い細胞を観察した。
【０１２１】
（結果）
蛍光顕微鏡観察の結果を図４（Ａ）〜（Ｌ）に示した。図４（Ａ）〜（Ｆ）は１００倍、図４（Ｇ）〜（Ｌ）は６００倍の顕微鏡写真である。図（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）、（Ｊ）は陽性対照：であるpIRES2-EGFP導入したＬＭＨの結果を示し、図４（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）、（Ｋ）は構築した発現ベクターを導入したＬＭＨの結果を示し、図４（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）、（Ｌ）は陰性対照（遺伝子非導入）のＬＭＨの結果を示している。また、図４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）はＷＩＢＡフィルターによる蛍光観察、図４（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）は明視野による観察の結果である。なお、図中のバーは１００μｍを示すスケールである。
【０１２２】
（結果）
構築した発現ベクターを導入したＬＭＨと、陽性対照のＬＭＨにおいて、ＥＧＦＰの蛍光が確認された（図４（Ｇ）、（Ｈ））。陰性対照のＬＭＨは、蛍光が確認されなかった（図４（Ｉ））。この結果は、構築した発現ベクターを導入したＬＭＨが、ＥＧＦＰを発現している事を示している。
【０１２３】
＜ウェスタンブロットによる導入タンパク質の検出＞
（方法）
遺伝子導入４８時間後の細胞集団をRIPA 緩衝液(２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．２）, １％ デオキシコール酸ナトリウム, １％ トリトンX-100, ０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム, １５０ｍＭ 塩化ナトリウム, 蛋白質分解酵素阻害剤にて可溶化し、１２．５％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なった。その後、二フッ化ポリビリニデン性の膜へ転写し、ブロッキングにスキムミルク、一次抗体に抗 ＧＦＰ抗体、二次抗体にＨＰＲＯ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（キアゲン社製）を用いて検出を行なった。またＨＲＰ標識抗myc抗体を用い同様に検出を行なった。
【０１２４】
なお、ビテロゲニンとＧＦＰとの融合タンパク質は、ＬＭＨの内在性カテプシンＤによって切り出される。ただし、遺伝子置換によって全長のビテロゲニンとＧＦＰ(外来タンパク質)との融合タンパク質が合成されれば、カテプシンＤ等の内在性プロテアーゼから隔離された経路(小胞体を通る経路)によって、肝細胞から血流にのるために、卵母細胞に到達する前にカテプシンＤによって外来タンパク質が切り出されることはない。
【０１２５】
（結果）
図５（ａ）にウェスタンブロット法によるＧＦＰタンパク質を検出した結果を示し、図５（ｂ）にウェスタンブロット法によるｍｙｃタンパク質を検出した結果を示している。またレーン１は陽性対照としてpIRES2-EGFPを導入したＬＭＨの結果を示し、レーン２、５は構築した遺伝子構築用ベクターを導入したＬＭＨの結果を示し、レーン３、６は陰性対照として遺伝子非導入のＬＭＨの結果を示す。またにおけるレーン４、７はPositope Control Protein(Invitrogen社製：５３ｋＤａ)の結果を示す。
【０１２６】
抗ＧＦＰ抗体、抗myc抗体のいずれにおいてもPositope Control Protein(Invitrogen社製)（レーン４、７、矢印Ａ）、発現する融合タンパク質全長（レーン２，５、矢印Ｂ）、及び融合タンパク質全長よりわずかに分子量の小さいバンド（レーン２、５、矢印Ｃ）を検出した。
【０１２７】
抗ＧＦＰ抗体では、カテプシンＤにより切り出されたＧＦＰタンパク質のバンド（レーン２、矢印Ｄ）、陽性対照としてpIRES2-EGFPを遺伝子導入したＬＭＨからはＥＧＦＰタンパク質のバンド（レーン１、矢印Ｅ）を検出した。
【０１２８】
（考察）
上記のウェスタンブロットの結果において、抗ＧＦＰ抗体、抗myc抗体のいずれにおいても発現した融合タンパク質全長よりわずかに分子量の小さいバンド（レーン２、５、矢印Ｃ）が検出された。これは融合タンパク質のＮ末端側のビテロゲニン領域だけが切り離された為と考える。
【０１２９】
カテプシンＤにより切り出されたＧＦＰタンパク質（レーン２、矢印Ｄ）は、陽性対照の（レーン１、矢印Ｅ）よりも分子量が大きい。これはヒスチジンタグとカテプシンＤ認識領域が付加されているためである。融合タンパク質の全長と、切り出されたＥＧＦＰタンパク質が同時に検出されている事から、カテプシンＤによる切断を受けたタンパク質は一部である事を示している。また２種類の抗体で検出したPositope Control Proteinのバンドの比較から、抗myc抗体（レーン７、矢印Ａ）は抗ＧＦＰ抗体（レーン４、矢印Ａ）よりも検出感度が低いことが示された。この為、抗myc抗体において切り出されたＣ末端側のビテロゲニンタンパク質が検出されないと考えられる。
【０１３０】
本実施例では、カテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質（一部）のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることを確認した。さらには、前記融合タンパク質からカテプシンＤの作用によって、前記融合タンパク質から目的とする外来タンパク質（ＥＧＦＰ）が切り出される事を確認した。
【０１３１】
この事により、本発明によれば本来あるビテロゲニンの機能を損なうことなく卵黄内へ外来タンパク質を蓄積させ、ニワトリの卵を用いて有用タンパク質を大量に生産することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
以上のように、本発明によれば、相同組み換えにより、ニワトリを始めとする鳥類由来宿主細胞のゲノムにおけるカテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる。上記のごとく外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された宿主細胞では、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質が合成されることとなる。かかる融合タンパク質は、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて血流に分泌された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることが可能となる。それゆえ、本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄に目的の外来タンパク質を蓄積させて、卵黄から目的の外来タンパク質を回収するというタンパク質の生産系の実現に寄与することができる。
【０１３３】
したがって、本発明は、医薬品産業、酵素産業等タンパク質の生産に関与する産業に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列、および各カテプシンＤ認識領域の位置を示す模式図である。
【図２】実施例において構築した発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図３】pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの制御下に連結されたpVTG-eGFPの開始コドンから終止コドンの領域の塩基配列（配列番号６）とアミノ酸配列（配列番号７）を示す模式図である。
【図４】実施例において、遺伝子導入後２４時間の各ＬＭＨの蛍光顕微鏡観察を行なった結果を示す写真図である。
【図５】図５（ａ）はウェスタンブロット法によるＧＦＰタンパク質を検出した結果を示す写真図であり、図５（ｂ）はウェスタンブロット法によるｍｙｃタンパク質を検出した結果を示す写真図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリを始めとする鳥類細胞において外来タンパク質をコードする遺伝子を導入するために用いられるベクター、および当該ベクターを用いて鳥類細胞において外来タンパク質を生産する方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、有用タンパク質の生産においては、その生産量が高い、生産コストが安い等の理由から、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が用いられてきた。しかし目的とするタンパク質によっては、糖鎖の付加、高次構造がその機能に重要な影響を及ぼす場合があり、かかるタンパク質を上記微生物で生産しようとしても、うまく発現しない場合や、発現したとしてもその目的とする機能が得られない場合がある。そこで、近年は、有用タンパク質の生産において、鳥類、哺乳類等の高等生物を用いることが検討され、そのタンパク質の生産系の開発が行なわれている。
【０００３】
例えば、トランスジェニックウシを用いて、その乳中にタンパク質を生産する方法が知られている（例えば、非特許文献７参照）。
【０００４】
また、近年そのヒトに極めて類似した糖鎖構造を有するタンパク質生産することから、ニワトリを始めとする鳥類がタンパク質生産系として特に注目されている。ニワトリを始めとする鳥類は、その卵中にタンパク質、抗体を蓄積することができる。例えば、特許文献１，２、および非特許文献１〜６には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクター系を利用しトランスジェニックニワトリを作製し、血中、卵（卵白）中に有用タンパク質、抗体を生産する方法について記載されている。
【０００５】
ところで、卵黄タンパク質の前躯体であるビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断されるということが知られている（例えば、非特許文献８、９参照）。
【特許文献１】特表２０００−５１２１４９号公報（公表日：平成１２（２０００）年９月１９日、国際公開日：平成９年１２月１８日）
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１０８１３２号明細書
【非特許文献１】Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris, and Robert Ivalie, 2002. nature biotechnology Vol.19, 396-399
【非特許文献２】P. E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, Ｄ. W. McCoy, and J. N. Petitte, 2003. ＤEVELOPMENTAL ＤYNAMICS 226, 439-445
【非特許文献３】Jeffrey C. Rapp, Alex J. Harvey, Gordon L. Speksnijder, Wei Hu & Robert Ivarie, 2003. Transgenic Research 12, 569-575
【非特許文献４】Mo Sun Kwon, Bon Chul Koo, Bok Ruyl Choi, Hoon Taek Lee, Young Hye Kim, Wang-Shik Ryu, Hosup Shim, Jin-Hoi Kim, Nam-Hyung Kim, and Teoan Kim, 2004, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 442-448
【非特許文献５】Micael J. McGrew, Adrian Sherman, Fiona M. Ellard, Simon G. Lillico, Hazel J. Gilhooley, Alan J. Kingsman, Kyriacos A. Mitrophanous, and Helen Sang, EMBO reports VOL 5, NO7, 2004. 728-733
【非特許文献６】Paul E. Mozdziak, Simone Pophal, Suparerk Borwornpinyo and James N. Petitte, 2003, American Society for Nutritional Science. 3076-3079
【非特許文献７】Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, L'Huillier P, Laible G. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein.Nat Biotechnol. 2003 Feb;21(2):157-62.
【非特許文献８】分子細胞生物学辞典、東京化学同人、p651
【非特許文献９】Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10;250(23):9060-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ウシ等の大型の哺乳動物を用いて有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでに長期間を要すること、広大な面積の飼育設備が必要なこと、飼育コストが高いこと等の問題を有している。
【０００７】
これに対して、ニワトリを用いて血液中や卵中に有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでの期間がウシ等の大型哺乳類に比して短期間であること、比較的小さな飼育設備で飼育可能であること、飼育コストが安い等のメリットを有している。
【０００８】
現在、ニワトリを始めとする鳥類において、外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する系として主にウイルスベクター系が用いられている。かかるウイルスベクター系は、高い効率で外来タンパク質をコードする遺伝子を導入することが可能なこと、容易にウイルスベクターを調製することができるというメリットはあるが、外来タンパク質をコードする遺伝子が染色体のどこに組み込まれるかについては全くランダムであり、その組み込み位置によっては、目的の外来タンパク質が発現しない場合や、重要な機能を有する遺伝子が破壊されてしまう場合や、細胞に不要な遺伝子が活性化されてしまう場合がある。したがって、ウイルスベクター系を用いて有用タンパク質を生産するトランスジェニック動物（ニワトリ）を作出する場合には、外来タンパク質をコードする遺伝子の組み込み位置を制御できないために、種々の問題点が生じてしまう。よって、ニワトリ等の鳥類を用いて外来タンパク質を生産させる場合においては、ジーンターゲッティングにより、目的の場所に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する系が必要となっている。
【０００９】
ところで、既述のごとく卵黄タンパク質の前躯体であるビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断されるということが知られている（非特許文献８、９参照）。
【００１０】
かかる卵黄タンパク質の合成系を利用するによって、目的の外来タンパク質を卵黄内に蓄積させることが可能となることが予想できる。すなわちビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子内に、カテプシンＤ認識配列を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができれば、ビテロゲニンタンパク質と外来タンパク質の融合タンパク質が肝細胞内で合成され、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるというものである。
【００１１】
上記のタンパク質生産系を実現するためには、外来タンパク質とビテロゲニンタンパク質との融合タンパク質を生産しなければならない。しかもビテロゲニンタンパク質から切り出されるリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンは、卵黄の大部分を構成する重要なタンパク質であるために、正常なリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンを合成する必要がある。よって、上記の条件を満たすためには、リポビテリン−１とホスビチンの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入するか、またはホスビチンとリポビテリン−２の切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入するか、またはリポビテリン−２とβ−リベチンの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入する必要がある。すなわち、鳥類のゲノムの目的の位置に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を正確に導入する必要がある。
【００１２】
そこで本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄内に目的の外来タンパク質を生産させる系を実現するために、鳥類の遺伝子を置換するための遺伝子置換ベクター、および当該遺伝子置換ベクターの利用方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記課題を解決すべく、導入した外来タンパク質（ＥＧＦＰ；Enhanced Green Fluorescence Protein、クロンテック社製）の両端に、カテプシンＤ認識配列が付加するようにデザインした遺伝子置換ベクターを用いて、ニワトリ肝細胞株（ＬＭＨ）へＥＧＦＰ遺伝子を導入したところ、内在のカテプシンＤにより外来タンパク質由来のＥＧＦＰが切り出される事を確認した。本発明は上記知見に基づき完成されたものである。
【００１４】
すなわち本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記課題を解決するために、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴としている。
【００１５】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ認識領域のうち、リポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ａとし、ホスビチンとリポビテリン−２との切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｂとし、リポビテリン−２とβ−リベチンとの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｃとすると、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部が、認識領域Ａ、または認識領域Ｂ、または認識領域Ｃのいずれかを１つ以上含む構成であってもよい。
【００１６】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子置換ベクター。
【００１７】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する構成であってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ａが、配列番号１の１１０８位から１１１４位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００１９】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ｂが、配列番号１の１３２５位から１３３１位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００２０】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記認識領域Ｃが、配列番号１の１５６３位から１５６９位に示されるアミノ酸配列である構成であってもよい。
【００２１】
上記本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる鳥類由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片内に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した後、宿主細胞に当該遺伝子置換ベクターを導入すれば、ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の相同配列を有するがゆえに、相同組み換えが起こる。よって、宿主細胞におけるビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子領域を、外来タンパク質が導入された遺伝子と置換することができるという効果を奏する。
【００２２】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、前記遺伝子断片に挿入されている構成であってもよい。
【００２３】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記選択マーカー遺伝子が、ブラストシジンＳ耐性遺伝子であってもよい。
【００２４】
上記構成によれば、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを宿主細胞に導入したときに、遺伝子が導入された細胞か否かを、ブラストシジンＳ等の薬剤に対する耐性を指標に容易に判別することができるという効果を奏する。
【００２５】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、前記遺伝子断片に連結されている構成であってもよい。
【００２６】
上記致死遺伝子発現カセットは、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子領域外に連結されているため、本発明にかかる遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、前記致死遺伝子発現カセットは宿主細胞のゲノムには組み込まれない。一方、ランダムな位置に組み換えが起これば、致死遺伝子発現カセットを含めて宿主細胞のゲノムに組み込まれる。よって、ランダムな位置に組み換えが起こった細胞は、致死遺伝子の発現により死滅する。したがって、生き残った細胞をセレクトすることにより、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選択することができるという効果を奏する。
【００２７】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記致死遺伝子が、カスパーゼ遺伝子であってもよい。
【００２８】
カスパーゼは細胞のアポトーシスを誘導する。それゆえ、上記致死遺伝子発現カセットが導入され、カスパーゼが細胞内で発現すれば、アポトーシスが起こり当該細胞は死滅する。したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに用いる致死遺伝子として好適である。
【００２９】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記いずれかの遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子領域に、外来タンパク質をコードする遺伝子が、前記外来タンパク質をコードする遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入されているものであってもよい。
【００３０】
上記構成の遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、宿主細胞においてカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。
【００３１】
かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるという効果を奏する。
【００３２】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記外来タンパク質をコードする遺伝子と、前記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されている構成であってもよい。
【００３３】
上記構成によれば、卵黄内に蓄積された目的の外来タンパク質を、精製用タグによって容易に回収・精製することができるという効果を奏する。
【００３４】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、上記精製用タグが、ヒスチジンタグであってもよい。
【００３５】
上記ヒスチジンタグによれば、ニッケルカラムを用いることによって、目的とする任意のタンパク質の精製を容易に行なうことができるという効果を奏する。
【００３６】
一方、本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記いずれかの遺伝子置換ベクターを用いて、鳥類由来細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
【００３７】
上記構成の遺伝子置換ベクターによって、相同組み換えが起これば、宿主細胞においてカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質が合成されることとなる。
【００３８】
かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができるという効果を奏する。
【００３９】
また本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記鳥類由来細胞が、ニワトリ由来細胞であってもよい。
【００４０】
ニワトリは、古くから食用動物として飼育されてきており、その飼育施設、飼育方法が確立されていること、また成熟するまでの期間が短いこと、安全性が高いこと等の利点があり、目的の外来タンパク質を大量に生産する宿主として好適である。
【００４１】
また本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法は、上記鳥類由来細胞が鳥類由来肝細胞であってもよい。
【００４２】
ビテロゲニンタンパク質は、肝臓で合成されるタンパク質であるため、肝細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
【００４３】
一方、本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産キットは、上記いずれかに記載の遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴としている。
【００４４】
上記本発明にかかる鳥類由来タンパク質の生産キットによれば、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質を、宿主細胞内で合成することができる。かかる融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質（リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン）が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができる。
それゆえ、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子置換ベクターに挿入するだけで、種々の外来タンパク質を宿主細胞内で生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００４５】
上記本発明によれば、相同組み換えにより、ニワトリを始めとする鳥類由来宿主細胞のゲノムにおけるカテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる。上記のごとく外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された宿主細胞では、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。かかる融合タンパク質は、(1)肝細胞で合成され、(2)血流中へ分泌、(3)血流にのり卵母細胞へ到着、(4)ビテロゲニンのシグナルを卵母細胞の膜表面の受容体が認識、(5)ビテロゲニンを卵母細胞に取り込まれ、卵母細胞内に蓄積する。蓄積した融合タンパク質は、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることが可能となる。それゆえ、本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄に目的の外来タンパク質を蓄積させて、卵黄から目的の外来タンパク質を回収するというタンパク質の生産系の実現に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
（１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター）
本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴としている。
【００４８】
ここで「ビテロゲニンタンパク質」は、既述の通り、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄タンパク質の前躯体であり、カテプシンＤの作用により、最終的にリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断される。よって、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質には、３箇所のカテプシンＤ認識領域、カテプシンＤによる切断点が含まれていることとなる。ここでリポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ａ」と称し、ホスビチンとリポビテリン−２の切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ｂ」と称し、リポビテリン−２とβ−リベチンの切断点を含むカテプシンＤの認識領域を便宜上、「認識領域Ｃ」と称する。
【００４９】
ここで「カテプシンＤ認識領域」とは、カテプシンＤがポリペプチドを切断する際に認識する一定のアミノ酸配列のことを意味する。かかるカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列としては、例えば「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、「Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号８）、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１１）、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１２）、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１３）、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１５）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）が挙げられる。
【００５０】
なお、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号８）は、ウズラ、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（Gerhartz B, Auerswald EA, Mentele R, Fritz H, Machleidt W, Kolb HJ, Wittmann J. Proteolytic enzymes in yolk-sac membrane of quail egg. Purification and enzymatic characterisation. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1997 Sep;118(1):159-66.参照）。
【００５１】
Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９）、およびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１０）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（Pohl J, Baudys M, Kostka V. Chromophoric peptide substrates for activity determination of animal aspartic proteinases in the presence of their zymogens: a novel assay. Anal Biochem. 1983 Aug;133(1):104-9.参照）。
【００５２】
また、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１１）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列でり、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１２）は、ブタ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１３）は、ウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１４）は、ウシ、ヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１５）、およびＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）は、ヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（蛋白質分解酵素Ｉ、鶴 大典、船津 勝編、学会出版センター、ｐ77-87）。
【００５３】
上記カテプシンＤ認識領域のうち、ニワトリ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、かつニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質に含まれるものとしては、「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、および「Ｔｒｐ−ＡＳｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）が挙げられる。
【００５４】
図１にニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）、および各カテプシンＤ認識領域の位置を示す。なお、上記ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）は、ACCESSION Number：CAA31942に開示されている（van het Schip FD, Samallo J, Broos J, Ophuis J, Mojet M, Gruber M, AB G. Nucleotide sequence of a chicken vitellogenin gene and derived amino acid sequence of the encoded yolk precursor protein.J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):245-60参照）。
【００５５】
なお、図１中のアミノ酸は１文字表記で示している。また、上記アミノ酸配列はこれに限定されるものではない。図１中の１６位から１１１１位のアミノ酸が、リポビテリン−１のアミノ酸配列であり、１１１２位から１３２８位のアミノ酸が、ホスビチンのアミノ酸配列であり、１３２９位から１５６６位のアミノ酸が、リポボテリン−２のアミノ酸配列であり、１５６７位から１８５０位のアミノ酸がβ−リベチンのアミノ酸配列である。
【００５６】
そのうち、１１０８位から１１１４位のアミノ酸配列が、上記「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号２）、すなわち認識領域Ａに相当し、１１１１位と１１１２位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちリポビテリン−１とホスビチンの切断点である。なお、図１中では認識領域Ａに下線（実線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５７】
また、１３２５位から１３３１位のアミノ酸配列が、上記「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号３）、すなわち認識領域Ｂに相当し、１３２８位と１３２９位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちホスビチンとリポビテリン−２の切断点である。なお、図１中では認識領域Ｂに下線（２重線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５８】
また、１５６３位から１５６９位のアミノ酸配列が、上記「Ｔｒｐ−ＡＳｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号４）、すなわち認識領域Ｃに相当し、１３２８位と１３２９位との間がカテプシンＤによる切断点、すなわちリポビテリン−２とβ−リベチンの切断点である。なお、図１中では認識領域Ｃに下線（波線）を引いてその位置を示している。また切断点には矢印を付している。
【００５９】
本発明にかかる遺伝子置換ベクターは、遺伝子置換を行なうためにベクターである。すなわち、鳥類の標的遺伝子（本発明においてはビテロゲニンをコードする遺伝子）の相同配列を両端に有する変異型の遺伝子断片（目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された遺伝子断片）を宿主細胞に導入し、相同組み換えを起こさせることにより宿主細胞の標的遺伝子と、変異型の遺伝子とを置換するためのベクターである。したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、標的となる鳥類のビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部または全部が含まれている必要がある。
【００６０】
したがって、鳥類のビテロゲニンをコードする遺伝子のうち、上記カテプシンＤ認識領域（認識領域Ａ、認識領域Ｂ、認識領域Ｃ）をコードする領域が含まれる遺伝子断片が、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれている必要がある。
【００６１】
例えば、ニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする全遺伝子配列を配列番号５に示した。なお、上記ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全塩基配列（配列番号５）は、ACCESSION Number：X13607に開示されている（van het Schip FD, Samallo J, Broos J, Ophuis J, Mojet M, Gruber M, AB G. Nucleotide sequence of a chicken vitellogenin gene and derived amino acid sequence of the encoded yolk precursor protein.J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):245-60参照）。
【００６２】
なお、ニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする全遺伝子配列は、これに限定されるものではない。配列番号５に示される塩基配列のうち、１１１１５位から１１１３５位が認識領域Ａをコードする塩基配列（aacactgtgctagcagagttt；配列番号１７）であり、１２２２７位から１２２５０位が認識領域Ｂをコードする塩基配列（catgagatttatcagtatcgcttt；配列番号１８）であり、１４６５５位から１４６７５位が認識領域Ｃをコードする塩基配列（tggaacgtctttgctgaagcc；配列番号１９）である。よって、ニワトリをターゲットとした本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、配列番号５に示される塩基配列のうち、１１１１５位から１１１３５位が含まれるような遺伝子断片では、認識領域Ａをコードする領域が含まれているといえ、１２２２７位から１２２５０位が含まれていれば、認識領域Ｂをコードする領域が含まれているといえ、１４６５５位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ｃをコードする領域が含まれているといえる。また１１１１５位から１２２５０位が含まれていれば、認識領域Ａおよび認識領域Ｂをコードする領域が含まれているといえ、１２２２７位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ｂおよび認識領域Ｃをコードする領域が含まれているといえ、１１１１５位から１４６７５位が含まれていれば、認識領域Ａ、認識領域Ｂおよび認識領域Ｃをコードする領域が全て含まれているといえる。なお、上記認識領域Ａ、認識領域Ｂ、認識領域Ｃをコードする塩基配列はこれらに限定されるものではなく、コドン表に基づいて種々変更することが可能である。
【００６３】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる遺伝子断片には、上記各種認識領域をコードする領域が少なくとも含まれていればよいが、その前後に少なくとも２５００塩基以上を含まれていることが好ましく、５０００塩基以上含まれていることがさらに好ましく、８０００塩基以上含まれていることが最も好ましい。後述するとおり、相同組み換えが起こる確率は、相同部分が長く含まれているほど、換言すれば全長に近ければ近いほど、高くなるからである。
【００６４】
一般に、相同組み換えを起こさせる場合、相同領域の塩基は長ければ長いほど、より好ましい。しかし、長くなりすぎると遺伝子の導入効率が低下するため、１００ｋｂｐ以下が好ましく、８ｋｂｐ程度が好ましいといえる（Nature Genetics, volume 36, Number 8, pp867-871,2004、およびBlood First Edition Paper, prepublished online ay 1,2003;DOI10.1182/blood-2003-03-0708参照）。
【００６５】
また本発明が目的とするタンパク質の生産系は、ビテロゲニンタンパク質とカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する目的の外来タンパク質との融合タンパク質を合成し、卵母細胞に存在するカテプシンＤの作用によって、正常なリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチン、および目的の外来タンパク質を卵黄内に蓄積させようとするものである。したがって、目的の外来タンパク質は、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤの切断点にカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有するように挿入されていることが好ましいといえる。
【００６６】
すなわち、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入させる必要がある。より具体的には、遺伝子置換ベクターには、「５’末端からビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部」−「カテプシンＤ認識領域をコードする領域」−「目的の外来タンパク質をコードする遺伝子」−「カテプシンＤ認識領域をコードする領域」−「ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の一部」という順で構成させる。
【００６７】
したがって、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、少なくとも１つ以上のカテプシンＤ認識領域を含むビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片が含まれている必要がある。本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれる遺伝子断片は、例えば、上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のいずれか１つを含むものであっても、上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域を含むものであっても、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域を含むものであっても、また上記認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域全てを含むものであってもよい。ただし、既述の通り、相同組み換えが起こりやすいという理由から、どのような組み合わせであってもいずれかを含み、全長８ｋｂｐ程度が好ましいといえる。
【００６８】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターにおいては、元来存在するカテプシンＤ認識領域をコードする領域、別のアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識領域をコードする領域ものに置き換えた態様であってもよい。例えば、認識領域Ａをコードする領域を、認識領域Ｂをコードする領域に置き換えたものであってもよい。また本来含まれていなかったカテプシンＤ認識領域をコードする領域のものと置き換えた態様であってもよい。
【００６９】
また遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入させるパターンは、特に限定されるものではない。よって目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されるカテプシンＤ認識領域をコードする領域は、上記認識領域Ａをコードする領域であっても、認識領域Ｂをコードする領域であっても、認識領域Ｃをコードする領域であってもよい。また、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のいずれか１箇所のみに挿入されている態様であってもよいが、認識領域Ａをコードする領域、認識領域Ｂをコードする領域、認識領域Ｃをコードする領域のうち、いずれか２箇所に挿入されていてもよいし、また全てに挿入されていてもよい。
【００７０】
さらには、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が２つ以上、カテプシンＤ認識領域をコードする領域を介して連結されたものであってもよい。本発明においては、「目的の外来タンパク質をコードする遺伝子」とは、上記のごとく目的の外来タンパク質をコ−ドする遺伝子が複数個連結したものを含む意味である。なお、連結する目的の外来タンパク質をコードする遺伝子は、同じタンパク質をコードする遺伝子であっても、異なるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。かかる構成とすることで、タンパク質の生産量を向上させたり、２種類以上のタンパク質を同時に生産することができるようになる。なお、本発明において「外来タンパク質をコードする遺伝子」とは、宿主の細胞が、元来有していないタンパク質をコードする遺伝子、および元来有しているタンパク質をコードする遺伝子をも含む意味である。
【００７１】
また遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入させる手法については、特に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を用いればよい。
【００７２】
例えば、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域（ここでは便宜上、認識領域Ａを用いて説明する。当然他のカテプシンＤ認識領域についても同様実施すればよい。）をコードする領域のみを切断し、かつ目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を切断しない制限酵素（例えば、ＮｈｅＩ）を用いて、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を含まない本発明にかかる遺伝子置換ベクターをまず切断する。一方、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子の両端（５’末端、３’末端）に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチドを有する融合ポリヌクレオチドを調製する。この融合ポリヌクレオチドは、両端に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチド塩基配列が付加されるようにデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲ等によって調製することが可能である。次に当該融合ポリヌクレオチドを、遺伝子置換ベクターの切断に用いた制限酵素（例えば、ＮｈｅＩ）によって切断する。このように切断を行なった遺伝子置換ベクターおよび前記融合ポリヌクレオチドをライゲーションすれば、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチド塩基配列を有するように挿入された遺伝子置換ベクターを構築することができる。
【００７３】
また、遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域を制限酵素等にて切除し、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子の両端（５’末端、３’末端）に認識領域Ａをコードするポリヌクレオチドを有する融合ポリヌクレオチドをフレームシフトが起こらないように挿入してもよい。
【００７４】
なお、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子と、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、ヒスチジンタグ等の精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されていてもよい。カテプシンＤによって切り出された目的の外来タンパク質を、当該精製用タグによって容易に回収・精製することができる。例えば上記ヒスチジンタグは、ニッケルカラムを用いて容易に目的の外来タンパク質を回収・精製することができる。また精製用タグは、従来公知のものを適宜選択の上、用いればよく、上記ヒスチジンタグのほか、ＧＳＴ(glutathion S transferase)タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、チオレドキシンタグ、AviｔagTM等が利用可能である（例えば、先端バイオ用語集、羊土社ｐ15-20参照）。
【００７５】
ところで、本発明にかかる遺伝子置換ベクターには、さらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に挿入されている態様であってもよい。上記選択マーカー遺伝子は、特に限定されるものではなく、従来公知のものを適宜選択の上、用いればよい。例えばブラストシジンＳ耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン、ピューロマシシン、ゼオシン等が挙げられる。
【００７６】
また上記選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターは、特に限定されるものではなく、宿主細胞において選択マーカー遺伝子のプロモーターと機能するものであればよい。また誘導型プロモ−ターであっても、非誘導型プロモーターであってもよい。ただし、上記薬剤耐性マーカー等の選択マーカーは陽性選択用のマーカーであり、常に発現させる必要があるため非誘導型のプロモーターの方が好ましいといえる。
【００７７】
例えば、選択マーカー用のプロモーターとしては、従来公知のプロモーターを適宜選択の上、用いればよく、誘導型のプロモーターとしては、テトラサイクリンによる誘導を行なうTet System（クロンテック社製）、ＩＰＴＧによる誘導を行なうLacプロモーター、また非誘導型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが利用可能である。
【００７８】
またこのほか、上記選択マーカー発現カセットには、ポリＡ付加シグナル、ｌｏｘＰ、ＩＲＥＳ等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。
【００７９】
上記選択マーカーを有する態様によれば、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを宿主細胞に導入したときに、目的の遺伝子が導入された細胞か否かを、ブラストシジンＳ等の薬剤に対する耐性を指標に容易に判別することができる。すなわち、目的の遺伝子が挿入された細胞は、ブラストシジンＳ等の薬剤耐性遺伝子が発現するために、上記薬剤に対する耐性が現れる。したがって上記ブラストシジンＳを含む培地で培養して生育してきた細胞をセレクトすれば、目的の遺伝子が導入された細胞をセレクトできる。
【００８０】
なお、上記選択マーカー遺伝子は、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片のイントロン部分に挿入されていることが好ましい。エクソン部分に選択マーカー遺伝子が挿入されると、リポビテリン−１、またはホスビチン、またはリポビテリン−２、またはβ−リベチンをコードする遺伝子が破壊され正常なタンパク質が得られないからである。例えば、配列番号５に示されるニワトリのビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子のイントロンは、５４位〜１６８位（イントロン１）、１９０位〜２８９位（イントロン２）、４４２位〜１７６８位（イントロン３）、２０２１位〜２５３１位（イントロン４）、２６９４位〜２７９８位（イントロン５）、２９４８位〜３１１５位（イントロン６）、３２６７位〜３３８４位（イントロン７）、３５４３位〜３６２４位（イントロン８）、３７９１位〜４６９１位（イントロン９）、４８１８位〜５２２１位（イントロン１０）、５４４１位〜６０１０位（イントロン１１）、６２２９位〜６３４４位（イントロン１２）、６４４３位〜６９１９位（イントロン１３）、７０４５位〜７１６５位（イントロン１４）、７２６８位〜７９０５位（イントロン１５）、８０２６位〜８１１１位（イントロン１６）、８３０２位〜９０５４位（イントロン１７）、９１４９位〜９２８０位（イントロン１８）、９４６７位〜９９５８位（イントロン１９）、１０１０４位〜１０２２４位（イントロン２０）、１０４４８位〜１０５３７位（イントロン２１）、１０７１４位〜１１０６６位（イントロン２２）、１１７５７位〜１２２２０位（イントロン２３）、１２２７２位〜１２５２４位（イントロン２４）、１２６１５位〜１３０５３位（イントロン２５）、１３２６７位〜１３３６１位（イントロン２６）、１３５０５位〜１３８８８位（イントロン２７）、１４０２８位〜１４５６７位（イントロン２８）、１４７０４位〜１５１６０位（イントロン２９）、１５３４８位〜１５６７８位（イントロン３０）、１５７７１位〜１６８５６位（イントロン３１）、１６９５５位〜１７７０３位（イントロン３２）、１７８６４位〜１８９１８位（イントロン３３）、１９０８１位〜２０００２位（イントロン３４）であり、上記いずれかにイントロン部分に選択マーカー発現カセットを適宜挿入すればよい。なお上記イントロン情報は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で入手した（ACCESSION Number：X13607）。
【００８１】
また本発明にかかる遺伝子置換ベクターにはさらに、プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に連結されている態様であってもよい。上記致死遺伝子発現カセットは、カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片に連結されている、すなわちビテロゲニンタンパク質の相同領域外に連結されているため、本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて宿主細胞に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した際に、相同組み換えが起これば、当該致死遺伝子発現カセットは、宿主細胞のゲノムに組み込まれないこととなる。
【００８２】
一方、ランダムな位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が導入された場合は、致死遺伝子発現カセットを含めて宿主細胞のゲノムに組み込まれることとなる。したがって、ランダムな位置に目的の外来タンパク質が組み込まれた宿主細胞は、致死遺伝子が発現することによって、細胞が死滅する。よって、宿主細胞を培養して最終的に生育してきた細胞をセレクトすれば、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、目的とする相同領域に組み込まれた細胞のみをセレクトすることができる。なお、最終的に相同組み換えが起こり目的の領域に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたか否かは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、シークエンスを行なって確認することが確実性の観点から好ましい。
【００８３】
ここで「致死遺伝子」とは、その発現により宿主細胞が死滅させることができる遺伝子のことであり、その遺伝子発現産物そのものに細胞毒性があり直接的に細胞を死滅させるものであっても、アポトーシス等の細胞死の誘導を行なうシグナル伝達物質のごとく、間接的に宿主細胞を死滅させるものであってもよい。かかる致死遺伝子としては、上記宿主細胞を死滅させることができるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の致死遺伝子を適宜選択の上、採用すればよい。
【００８４】
かかる致死遺伝子としては例えば、カスパーゼ遺伝子が挙げられる。カスパーゼファミリーは、アポトーシスを誘導するプロテアーゼ群であり、基質特異性の違いからサイトカインのプロセッシングに関与するＩ群（カスパーゼ−１、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５）、細胞死の実行に関与するＩＩ群（カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−２、ＣＥＤ−３）、および細胞死のシグナル伝達に関与するＩＩＩ群（カスパーゼ−６、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９）がある。致死遺伝子としては、上記いずれのカスパーゼをコードする遺伝子は全て利用可能である。特に、カスパーゼ−３等のＩＩ群のカスパーゼをコードする遺伝子は、細胞死の実行に関与しており即効性からに特に好ましいといえる。
【００８５】
上記カスパーゼ遺伝子のほか、ジフテリア毒素遺伝子、単純ヘルペスウイルスＩ型のチミジンキナーゼをコードする遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）が利用可能である。上記ＨＳＶ−ＴＫがコードするタンパク質は、ＤＮＡ塩基のアナログであるアシクロビル、ガンシクロビル等をリン酸化し、その後宿主細胞内のキナーゼによってリン酸化されて、３リン酸化体になり細胞のＤＮＡ合成を阻害するというものである。
【００８６】
なお上記致死遺伝子は、公知の塩基配列情報から入手可能である。
【００８７】
致死遺伝子を制御するプロモーターとしては、導入される宿主細胞内で機能するものであれば、特に限定されるものではないが、誘導型のプロモーターがより好ましいといえる。細胞に対して悪影響を及ぼす致死遺伝子の発現を綿密に制御することができ安全性の面において優れていることや、前述の選択マーカーによる選抜と、致死遺伝子による選抜を別個に行なうことができ、より正確に目的とする宿主細胞を選抜することが可能となるからである。致死遺伝子用のプロモーターとしては、従来公知のプロモーターを適宜選択の上、用いればよく、例えば誘導型のプロモーターとしては、テトラサイクリンによる誘導を行なうTet System（クロンテック社製）、ＩＰＴＧによる誘導を行なうLacプロモーター、また非誘導型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが利用可能である。
【００８８】
またこのほか、上記致死遺伝子発現カセットには、ポリＡ付加シグナル、ｌｏｘＰ、ＩＲＥＳ等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。
【００８９】
なお、本発明にかかる遺伝子置換ベクターの基本骨格は、特に限定されるものではなく、従来公知のベクターを適宜選抜の上、用いればよい。またかかる従来公知のベクター由来のＤＮＡセグメント（ポリＡ付加シグナル、ヒスチジンタグ等の精製用タグ、薬剤耐性マーカー、myc epitope等の検出用タグ）が含まれていてもよい。環状であっても、リニア形状であってもよい。ただし、相同組み換えが起こりやすいという理由から、宿主細胞に導入する際には、リニア形状であることが好ましい。
【００９０】
以下に、上記本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて、相同組み換えが起こったか否かを確認する方法の一例について示す。なお確認方法はこれに限定されるものではない。(1)本発明にかかる遺伝子導入用ベクターを肝臓細胞株に導入し、薬剤等による選択をかける。(2)薬剤等による選択で生存し選択された肝臓細胞株に対して、選択マーカーである致死遺伝子の発現誘導を行なう。(3)致死遺伝子の発現誘導の結果、生存した細胞を選抜する。(4)選抜した細胞について、ビテロゲニン遺伝子座における外来タンパク質をコードする遺伝子の有無をＰＣＲ、またはサザンブロット解析によって確認し、相同遺伝子組み換えが起こったか否かを確認する。なお用いる細胞株は、特に肝臓細胞株に限らず、血球系細胞株や培養ＥＳ細胞であってもよい。また電気穿孔法で組織に遺伝子置換ベクターを導入し、導入した組織からＤＮＡを抽出して相同遺伝子組み換えの有無を調べてもよい。
【００９１】
（２．本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法）
本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法（以下、本発明にかかるタンパク質の生産方法という。）は、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示したように、本発明にかかる遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする領域に、外来の目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が、当該遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードする塩基配列を有するように挿入して構築した遺伝子置換ベクターを用いて、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を鳥類由来細胞に導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
【００９２】
＜遺伝子導入工程＞
本発明にかかるベクターの導入方法は、宿主細胞と当該遺伝子置換ベクターに応じて、公知の方法を適宜採用すればよい。例えば、リポフェクション法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等があげられる。後述する実施例では、エレクトロポレーションを行なって、ニワトリ肝細胞株（ＬＭＨ）に遺伝子導入を行なっている。
【００９３】
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたか否かは、薬剤耐性マーカー等の選択マーカーによって、判定することができる。このとき、１週間程度細胞培養を行なって、一過性の発現（transient expression）を排除し、安定形質転換細胞（stable transformant）をセレクトすることが好ましい。
【００９４】
また、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示したごとく致死遺伝子発現カセットを連結して構築した遺伝子置換ベクターの場合では、致死遺伝子の発現により、相同組み換えにより目的の位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたか、ランダムな位置に組み込まれたかを判別することができる。
【００９５】
また宿主細胞は、特に限定されるものではなく、ニワトリを始めとする鳥類由来の細胞を用いればよい。ただし、増殖が早く培養がしやすいこと、扱いが容易であること等の理由により、各種培養細胞が好ましい。各種培養細胞としては、ニワトリ由来ＬＭＨ（ＨＳＲＲＢ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）より分譲）、ＯＵ−２（樹立者(岡山大・Ogura Hajime)より分与）、ＨＤ１１（樹立者(Lillehoj HS・Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture)より分与）、ＩＮ２４（樹立者(山口大・Inoue Makoto)より分与）、ＤＴ４０（ＨＳＲＲＢ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）より分譲）等が利用可能である。
【００９６】
ただし本発明の最終的な目的は、鳥類の卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることであるため、ビテロゲニンタンパク質を生産する肝細胞に挿入することが好ましいといえる。
【００９７】
＜細胞培養工程＞
本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記「遺伝子導入工程」の他、細胞培養工程を含むものであってもよい。
【００９８】
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が相同組み換えによって、目的の位置の導入された導入された細胞（肝細胞）は、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることとなる。
【００９９】
かかる融合タンパク質をカテプシンＤによる消化を行なえば（酵素消化工程）、目的の外来タンパク質、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、およびβ−リベチンが切り出されることとなる。このとき目的の外来タンパク質にヒスチジンタグ等の精製用タグが付加されていれば、容易に目的の外来タンパク質を回収することができる（回収・精製工程）。例えば、ヒスチジンタグを利用して目的の外来タンパク質を回収する方法としては、ニッケルカラムを用いて、レジンに吸着した目的の外来タンパク質を溶出して回収すればよい。
【０１００】
またこの系を用いて、トランスジェニック動物（トランスジェニックニワトリ）を作製すれば（トランスジェニック作製工程）、上記融合タンパク質は、血流に分泌された後、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることができる。
【０１０１】
上記の現象を実験的に確認する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。なお、以下の方法は、あくまで一例であってこれに限定されるものではない。(1)ビテロジェニン遺伝子座の上流にあるプロモーターから下流のポリＡ付加シグナル配列を含む領域をクローン化する。このとき上流のプロモーターをウイルス由来の強いプロモーターに置換したクローンを作成して実験を行なってもよい。(2)これらのＤＮＡクローンのカテプシンＤ認識領域に外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入する。(3)構築したＤＮＡ構築物を、産卵をおこなう成鶏メスの肝臓の細胞に電気穿孔法等によって導入する。(4)産卵成鶏メスの肝臓には大量のエストロゲンが存在するため、導入したＤＮＡのビテロゲニンはエストロゲンによって、内在ビテロゲニン遺伝子と同様に発現誘導を受ける。なおウイルス由来のプロモーターを用いた場合には、細胞内在性の転写因子によって発現誘導を受ける。(5)末梢血、生まれてくる卵に含まれる外来タンパク質（外来タンパク質をコードする遺伝子の発現産物を）確認することで、外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入したビテロジェニンが血流に乗り、卵黄に移行することを確認することができる。
【０１０２】
本発明にかかる遺伝子置換ベクターを用いて、トランジェニックニワトリを作製する方法としては、例えば、ニワトリの胚盤様細胞から樹立したＥＳ様細胞にかかる遺伝子置換ベクターを導入し、目的の遺伝子座に遺伝子置換が起きた細胞のみを選択した後、ニワトリの胚へ戻す事により、遺伝子改変された体細胞と通常の体細胞を有するキメラニワトリを作製することが挙げられる。
【０１０３】
一方、ランダムな位置に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された株であっても、細胞培養よってカテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質を生産することは可能である。この場合、上記と同様カテプシンＤによる消化を行なえば、目的の外来タンパク質が切り出されることとなる。このとき目的の外来タンパク質にヒスチジンタグ等の精製用タグが付加されていれば、容易に目的の外来タンパク質を回収することができる。
【０１０４】
なお細胞培養の方法は、各種細胞に好適な条件を適宜採用して行なえば良く、特に限定されるものではない。
【０１０５】
またこのほか、本発明にかかるタンパク質の生産方法では、遺伝子置換ベクターの構築工程（ベクター構築工程）を含むものであってもよい。当該ベクター構築工程の具体的な方法については、上記「１．本発明にかかる遺伝子置換ベクター」の項で説示した方法を適宜採用すればよい。
【０１０６】
（３．本発明にかかるタンパク質の生産キット）
本発明にかかる鳥類細胞におけるタンパク質の生産キット（以下、本発明にかかるタンパク質生産キットという。）は、本発明にかかる遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴としている。なお本発明にかかるタンパク質生産キットに含まれる遺伝子置換ベクターは、外来タンパク質をコードする遺伝子が既に挿入されているものであっても、挿入されていないものであってもよい。
【０１０７】
外来タンパク質をコードする遺伝子が既に遺伝子置換ベクターに挿入されている場合は、当該本発明にかかるタンパク質生産キットの使用者が、既に挿入されている外来タンパク質をコードする遺伝子と、目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子とを置換して使用すればよい。
【０１０８】
また、外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていない遺伝子置換ベクターが本発明にかかるタンパク質生産キットに含まれている場合には、使用者が適宜目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入して使用すればよい。
【０１０９】
上記のほか、本発明にかかるタンパク質生産キットには、遺伝子を導入するために必要な器具・試薬類、タンパク質を回収・精製するために必要な器具・試薬類、細胞を培養するために必要な器具・試薬類等が含まれていてもよい。
【０１１０】
上記遺伝子を導入するために必要な器具・試薬類としては、例えば、エレクトロポレーター、サーマルサイクラー、チューブ、制限酵素、緩衝液等が挙げられる。また、タンパク質を回収・精製するために必要な器具・試薬類としては、電気泳動装置、アガロースゲル、ニッケルカラム等の精製用カラム、精製に用いられるレジン、緩衝液等が挙げられる。また、細胞を培養するために必要な器具・試薬類等としては、培養用容器、培養装置、培地、緩衝液、培養細胞等が挙げられる。
【実施例】
【０１１１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１１２】
〔実施例１〕
カテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質（一部）のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されるか否かを確認した。
【０１１３】
＜発現ベクターの作製＞
pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＢａｍＨＩサイトに、リポビテリンとホスビチンの切断点を含む領域をコードするビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子断片を挿入した。なお上記遺伝子断片は、λベクターにクローニングしたビテロゲニン遺伝子断片を鋳型として、ＰＣＲ法により取得した。当該ＰＣＲに用いたプライマーは5’-CGGGATCCACCATGGGAAACACTG-3’（配列番号２０）をフォワードプライマーとし、5’-CGGGATCCGCTGCTCCTGCTGCTGCTGCT-37’（配列番号２１）をリバースプライマーとした。なおフォワードプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列は、制限酵素ＢａｍＨＩに消化される配列をコードしている。
【０１１４】
次に外来タンパク質をコードする遺伝子としてＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)遺伝子（クロンテック社製）を、pIRES2-EGFP（クロンテック社製）を鋳型としたＰＣＲにより調製した。上記ＰＣＲに用いたプライマーは5’-CCGCTAGCAGAGTTTGGGACACACCACCACCACCACCACGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3（配列番号２２）をフォワードプライマーとし、5’-GGGCTAGCACAGTGTTTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3’（配列番号２３）をリバースプライマーとした。なおフォワードプライマーの５’端から数えて２２位〜３９位の塩基配列は、ヒスチジンタグをコードしている。また、フォワードプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて３位〜８位の塩基配列は、制限酵素ＮｈｅＩに消化される配列をコードしている。さらにフォワードプライマーの５’端から数えて４位〜１５位の塩基配列、およびリバースプライマーの５’端から数えて２位〜１７位の塩基配列は、カテプシンＤ認識領域（上記認識領域Ａ）の一部をコードしている。
【０１１５】
上記ＰＣＲにより増幅したＥＧＦＰを含む遺伝子断片を、pcDNA4/myc-his Bに存在するビテロゲニン領域内のＮｈｅＩ領域へ挿入すれば、外来タンパク質をコードする遺伝子（ＥＧＦＰ）の両端に、完全なカテプシン認識領域（認識領域Ａ）をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターを構築することができる。
【０１１６】
上記のようにして構築した発現ベクターの構造を図２に示す。図２（ａ）は、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）に導入した外来タンパク質をコードする遺伝子の概略を示した図であり、図２（ｂ）は構築した発現ベクターの構造を示す図である。図２（ａ）において、白抜き四角の部分は、外来タンパク質をコードする遺伝子であるＥＧＦＰ遺伝子を示し、交差線を付した四角の部分は、ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、斜線を付した四角の部分は、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子、黒塗り四角の部分はビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子を示している。
【０１１７】
また図３には、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの制御下に連結されたpVTG-eGFPの開始コドンから終止コドンまでの領域の塩基配列（配列番号６）とアミノ酸配列（配列番号７）を示した。図３において、破線を引いた部分がカテプシンＤ認識領域（コード領域）であり、実線を引いた部分がヒスチジンタグの領域であり、四角囲みの部分が外来タンパク質をコードする遺伝子であるＥＧＦＰタンパク質（遺伝子）領域であり、波線を引いた部分はビテロゲニンタンパク質（遺伝子）を示し、二重下線を引いた部分がpcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）由来のmyc epitopeとヒスチジンタグの領域を示している。
【０１１８】
図３に示す遺伝子構築物から発現する融合タンパク質は、Ｎ末端にヒスチジンタグを有するＥＧＦＰタンパク質で、さらにその両端にカテプシンＤ認識領域（配列番号２）が付加されたタンパク質である。またＣ末端には、pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）由来のmyc epitopeとヒスチジンタグが付加されている。
【０１１９】
＜エレクトロポレーションによる遺伝子導入＞
Gene Pulser Xcell（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてニワトリ肝細胞株であるＬＭＨ（ＨＳＲＲＢ(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)より分譲）へ、４×１０5cells、４０μｇDNAを４００μｌ １０％仔牛血清を含むダルベッコ培地に懸濁し、０．４ｃｍ間隔キュベットを用い、２７０Ｖ、９５０μＦで遺伝子導入を行なった。ＬＭＨは１０％仔牛血清を含むイスコフ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ2にて培養した。陽性対照としてpIRES2-EGFPを遺伝子導入した。
【０１２０】
＜ＥＧＦＰの蛍光顕微鏡観察＞
（方法）
遺伝子導入２４時間後に蛍光顕微鏡IX71(OLYMPUS社製)を用い細胞を観察した。
【０１２１】
（結果）
蛍光顕微鏡観察の結果を図４（Ａ）〜（Ｌ）に示した。図４（Ａ）〜（Ｆ）は１００倍、図４（Ｇ）〜（Ｌ）は６００倍の顕微鏡写真である。図（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）、（Ｊ）は陽性対照：であるpIRES2-EGFP導入したＬＭＨの結果を示し、図４（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）、（Ｋ）は構築した発現ベクターを導入したＬＭＨの結果を示し、図４（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）、（Ｌ）は陰性対照（遺伝子非導入）のＬＭＨの結果を示している。また、図４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）はＷＩＢＡフィルターによる蛍光観察、図４（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）は明視野による観察の結果である。なお、図中のバーは１００μｍを示すスケールである。
【０１２２】
（結果）
構築した発現ベクターを導入したＬＭＨと、陽性対照のＬＭＨにおいて、ＥＧＦＰの蛍光が確認された（図４（Ｇ）、（Ｈ））。陰性対照のＬＭＨは、蛍光が確認されなかった（図４（Ｉ））。この結果は、構築した発現ベクターを導入したＬＭＨが、ＥＧＦＰを発現している事を示している。
【０１２３】
＜ウェスタンブロットによる導入タンパク質の検出＞
（方法）
遺伝子導入４８時間後の細胞集団をRIPA 緩衝液(２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．２）, １％ デオキシコール酸ナトリウム, １％ トリトンX-100, ０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム, １５０ｍＭ 塩化ナトリウム, 蛋白質分解酵素阻害剤にて可溶化し、１２．５％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なった。その後、二フッ化ポリビリニデン性の膜へ転写し、ブロッキングにスキムミルク、一次抗体に抗 ＧＦＰ抗体、二次抗体にＨＰＲＯ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（キアゲン社製）を用いて検出を行なった。またＨＲＰ標識抗myc抗体を用い同様に検出を行なった。
【０１２４】
なお、ビテロゲニンとＧＦＰとの融合タンパク質は、ＬＭＨの内在性カテプシンＤによって切り出される。ただし、遺伝子置換によって全長のビテロゲニンとＧＦＰ(外来タンパク質)との融合タンパク質が合成されれば、カテプシンＤ等の内在性プロテアーゼから隔離された経路(小胞体を通る経路)によって、肝細胞から血流にのるために、卵母細胞に到達する前にカテプシンＤによって外来タンパク質が切り出されることはない。
【０１２５】
（結果）
図５（ａ）にウェスタンブロット法によるＧＦＰタンパク質を検出した結果を示し、図５（ｂ）にウェスタンブロット法によるｍｙｃタンパク質を検出した結果を示している。またレーン１は陽性対照としてpIRES2-EGFPを導入したＬＭＨの結果を示し、レーン２、５は構築した遺伝子構築用ベクターを導入したＬＭＨの結果を示し、レーン３、６は陰性対照として遺伝子非導入のＬＭＨの結果を示す。またにおけるレーン４、７はPositope Control Protein(Invitrogen社製：５３ｋＤａ)の結果を示す。
【０１２６】
抗ＧＦＰ抗体、抗myc抗体のいずれにおいてもPositope Control Protein(Invitrogen社製)（レーン４、７、矢印Ａ）、発現する融合タンパク質全長（レーン２，５、矢印Ｂ）、及び融合タンパク質全長よりわずかに分子量の小さいバンド（レーン２、５、矢印Ｃ）を検出した。
【０１２７】
抗ＧＦＰ抗体では、カテプシンＤにより切り出されたＧＦＰタンパク質のバンド（レーン２、矢印Ｄ）、陽性対照としてpIRES2-EGFPを遺伝子導入したＬＭＨからはＥＧＦＰタンパク質のバンド（レーン１、矢印Ｅ）を検出した。
【０１２８】
（考察）
上記のウェスタンブロットの結果において、抗ＧＦＰ抗体、抗myc抗体のいずれにおいても発現した融合タンパク質全長よりわずかに分子量の小さいバンド（レーン２、５、矢印Ｃ）が検出された。これは融合タンパク質のＮ末端側のビテロゲニン領域だけが切り離された為と考える。
【０１２９】
カテプシンＤにより切り出されたＧＦＰタンパク質（レーン２、矢印Ｄ）は、陽性対照の（レーン１、矢印Ｅ）よりも分子量が大きい。これはヒスチジンタグとカテプシンＤ認識領域が付加されているためである。融合タンパク質の全長と、切り出されたＥＧＦＰタンパク質が同時に検出されている事から、カテプシンＤによる切断を受けたタンパク質は一部である事を示している。また２種類の抗体で検出したPositope Control Proteinのバンドの比較から、抗myc抗体（レーン７、矢印Ａ）は抗ＧＦＰ抗体（レーン４、矢印Ａ）よりも検出感度が低いことが示された。この為、抗myc抗体において切り出されたＣ末端側のビテロゲニンタンパク質が検出されないと考えられる。
【０１３０】
本実施例では、カテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入することで、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質（一部）のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質として合成されることを確認した。さらには、前記融合タンパク質からカテプシンＤの作用によって、前記融合タンパク質から目的とする外来タンパク質（ＥＧＦＰ）が切り出される事を確認した。
【０１３１】
この事により、本発明によれば本来あるビテロゲニンの機能を損なうことなく卵黄内へ外来タンパク質を蓄積させ、ニワトリの卵を用いて有用タンパク質を大量に生産することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
以上のように、本発明によれば、相同組み換えにより、ニワトリを始めとする鳥類由来宿主細胞のゲノムにおけるカテプシンＤの切断点をコードする領域に、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる。上記のごとく外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された宿主細胞では、カテプシンＤ認識領域を両端（Ｎ末端、Ｃ末端）に有する外来タンパク質が、ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ切断点に挿入された融合タンパク質が合成されることとなる。かかる融合タンパク質は、ビテロゲニンタンパク質のシグナルを用いて血流に分泌された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的の外来タンパク質および卵黄タンパク質が切り出され、卵黄内に目的の外来タンパク質を蓄積させることが可能となる。それゆえ、本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄に目的の外来タンパク質を蓄積させて、卵黄から目的の外来タンパク質を回収するというタンパク質の生産系の実現に寄与することができる。
【０１３３】
したがって、本発明は、医薬品産業、酵素産業等タンパク質の生産に関与する産業に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列、および各カテプシンＤ認識領域の位置を示す模式図である。
【図２】実施例において構築した発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図３】pcDNA4/myc-his B（Invitrogen社製）のＣＭＶプロモーターの制御下に連結されたpVTG-eGFPの開始コドンから終止コドンの領域の塩基配列（配列番号６）とアミノ酸配列（配列番号７）を示す模式図である。
【図４】実施例において、遺伝子導入後２４時間の各ＬＭＨの蛍光顕微鏡観察を行なった結果を示す写真図である。
【図５】図５（ａ）はウェスタンブロット法によるＧＦＰタンパク質を検出した結果を示す写真図であり、図５（ｂ）はウェスタンブロット法によるｍｙｃタンパク質を検出した結果を示す写真図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴とする遺伝子置換ベクター。
【請求項２】
鳥類由来ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ認識領域のうち、リポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ａとし、ホスビチンとリポビテリン−２との切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｂとし、リポビテリン−２とβ−リベチンとの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｃとすると、
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部が、認識領域Ａ、または認識領域Ｂ、または認識領域Ｃのいずれかを１つ以上含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項３】
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項４】
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項５】
上記認識領域Ａが、配列番号１の１１０８位から１１１４位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項６】
上記認識領域Ｂが、配列番号１の１３２５位から１３３１位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項７】
上記認識領域Ｃが、配列番号１の１５６３位から１５６９位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項８】
さらに、
プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、
前記遺伝子断片に挿入されていることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項９】
上記選択マーカー遺伝子が、ブラストシジンＳ耐性遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１０】
さらに、
プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、
前記遺伝子断片に連結されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１１】
上記致死遺伝子が、カスパーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子領域に、
外来タンパク質をコードする遺伝子が、前記外来タンパク質をコードする遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入されていることを特徴とする遺伝子置換ベクター。
【請求項１３】
上記外来タンパク質をコードする遺伝子と、前記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１４】
上記精製用タグが、ヒスチジンタグであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１５】
請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターを用いて、鳥類由来細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
上記鳥類由来細胞が、ニワトリ由来細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１７】
上記鳥類由来細胞が、鳥類由来肝細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴とする鳥類細胞におけるタンパク質の生産キット。
【請求項１】
カテプシンＤ認識領域を含む鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子断片を含むことを特徴とする遺伝子置換ベクター。
【請求項２】
鳥類由来ビテロゲニンタンパク質のカテプシンＤ認識領域のうち、リポビテリン−１とホスビチンの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ａとし、ホスビチンとリポビテリン−２との切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｂとし、リポビテリン−２とβ−リベチンとの切断点を含むカテプシンＤ認識領域を認識領域Ｃとすると、
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の一部が、認識領域Ａ、または認識領域Ｂ、または認識領域Ｃのいずれかを１つ以上含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項３】
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項４】
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項５】
上記認識領域Ａが、配列番号１の１１０８位から１１１４位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項６】
上記認識領域Ｂが、配列番号１の１３２５位から１３３１位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項７】
上記認識領域Ｃが、配列番号１の１５６３位から１５６９位に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項８】
さらに、
プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された選択マーカー遺伝子を含んでなる選択マーカー発現カセットが、
前記遺伝子断片に挿入されていることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項９】
上記選択マーカー遺伝子が、ブラストシジンＳ耐性遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１０】
さらに、
プロモーターと当該プロモーターに制御可能に連結された致死遺伝子を含んでなる致死遺伝子発現カセットが、
前記遺伝子断片に連結されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１１】
上記致死遺伝子が、カスパーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子領域に、
外来タンパク質をコードする遺伝子が、前記外来タンパク質をコードする遺伝子の３’末端および５’末端にカテプシンＤ認識領域をコードするポリヌクレオチドを有するように挿入されていることを特徴とする遺伝子置換ベクター。
【請求項１３】
上記外来タンパク質をコードする遺伝子と、前記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子との間に、精製用タグをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１４】
上記精製用タグが、ヒスチジンタグであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子置換ベクター。
【請求項１５】
請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターを用いて、鳥類由来細胞に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
上記鳥類由来細胞が、ニワトリ由来細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１７】
上記鳥類由来細胞が、鳥類由来肝細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の鳥類細胞におけるタンパク質の生産方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の遺伝子置換ベクターが含まれていることを特徴とする鳥類細胞におけるタンパク質の生産キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１１５７６１（Ｐ２００６−１１５７６１Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０６９９１（Ｐ２００４−３０６９９１）
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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