麹菌アルカリプロテアーゼプロモーター
【課題】麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さとプロモーター活性の強さの関係を明らかにし、強力なプロモーターを提供すること。
【解決手段】 麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって約１．１ｋｂより長く約２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター、該プロモーターを含む遺伝子発現用ユニット、該遺伝子発現用ユニットを含む相同組換え用カセット、及び、該アルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物等。
【解決手段】 麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって約１．１ｋｂより長く約２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター、該プロモーターを含む遺伝子発現用ユニット、該遺伝子発現用ユニットを含む相同組換え用カセット、及び、該アルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌のアルカリプロテアーゼプロモーター及び該プロモーターを利用するタンパク質の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹菌でのタンパク質の発現のためのプロモーターとして、いずれも麹菌アスペルギルス・オリゼに由来するα−アミラーゼ（例えば、特許文献１参照）、グルコアミラーゼ（例えば、非特許文献１参照）、翻訳伸長因子ＴＥＦ１（例えば、非特許文献２参照）、チロシナーゼ（例えば、特許文献２参照）等の遺伝子のプロモーターが用いられ、特にα−アミラーゼプロモーターの利用例が多く報告されている。
【０００３】
麹菌アスペルギルス・ソーヤはアスペルギルス・オリゼと比べて一般的にアルカリプロテアーゼ活性が高く、アミラーゼ活性は低いことから、アスペルギルス・ソーヤにおいてはアミラーゼ系のプロモーターよりもプロテアーゼ系のプロモーターの利用が望まれる。アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子に関して、その上流１．１ｋｂの領域がプロモーターとして機能しうることが開示されている（例えば、特許文献３〜４参照）。
【０００４】
しかし、開示されている１．１ｋｂの領域がどの程度の強さのプロモーター活性を示すのかは不明である。アスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼプロモーターについても、上流１．１ｋｂの配列が開示されていて、アスペルギルス・オリゼの該当配列と非常に高い相同性を示すことが報告されている（例えば、特許文献５参照）。
【０００５】
しかし、プロモーター活性は確認されていない。このように、麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をプロモーターとして用いるに際し、領域の長さとプロモーター活性の強さとの関係については、これまでに全く検討されていない。さらに、他のプロモーターとの活性の比較も行われておらず、麹菌で用いられるプロモーターにおけるアルカリプロテアーゼプロモーターの位置付けは不明である。
【０００６】
プロモーター領域の長さとプロモーター活性の強さとの関係を調べるための従来の技術として、様々な長さの上流領域を取り出してきてこれにβ−グルクロニダーゼ等のレポーター遺伝子をつなぎ、染色体上の本来とは異なる部位に導入して、レポーターの活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とする方法が挙げられる。
【０００７】
例えば、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼプロモーターの解析では、０．６ ｋｂの領域を最長として上流側を段階的に欠損させ、０．４ｋｂでは０．６ｋｂに比べて７割の活性を示し、０．３ｋｂ以下では活性が顕著に低下したことが示されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
アスペルギルス・オリゼのα−グルコシダーゼプロモーターの解析では、１．５ｋｂを用いた最長とし、０．７ｋｂまで欠損してもプロモーター活性がほとんど変わらないことが示されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
アスペルギルス・オリゼのカタラーゼＢプロモーターの解析では、１．４ｋｂを用いた最長とし、これよりも１．０ｋｂの領域を用いた方がプロモーター活性は高く、使用する領域が長い方が必ずしも活性が高いとは限らないことが示されている（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
これらの結果は、最大限にプロモーター活性を示す領域の長さはプロモーターによって異なるため、上流領域の長さとプロモーター活性の関係についてはプロモーター毎に個別に検討する必要があることを示している。
【００１１】
しかし、この従来技術においては、取り出してきた最長の領域が最大限のプロモーター活性を示すのに必要な領域を含んでいることの確証はないという問題がある。
【特許文献１】特許第３００５６１８号明細書
【特許文献２】特開２００１−４６０７８号公報
【特許文献３】特許第２７５７９４５号明細書
【特許文献４】特許第２９０１３８７号明細書
【特許文献５】特表２００３−５１８９２１号公報
【非特許文献１】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４８， １３５ （２００２）
【非特許文献２】Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５０， ８５ （１９９８）
【非特許文献３】Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６， １８４９ （１９９２）
【非特許文献４】Ｍｉｎｅｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ３０， ４３２ （１９９６）
【非特許文献５】Ｈｉｓａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ４８ （２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さとプロモーター活性の強さの関係を明らかにし、強力なプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題について鋭意検討を重ねた結果、麹菌の染色体上のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流の一部の領域を遺伝子操作で欠損させ、遺伝子操作をしていない本来の上流領域とのプロモーター活性の比較を行うことにより、該遺伝子の翻訳開始位置より上流約２．５ｋｂに亘る領域が元の上流領域全体と同程度のプロモーター活性を示すことを明らかにし、さらに、このような上流領域をプロモーターとして用いてタンパク質発現ができることを明らかにし、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の各態様に係るものである。
[態様１]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって１．１ｋｂより長く２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様２]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ｋｂから成る、請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様３]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部が置換又は欠損している、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様４]
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１〜３のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様５]
態様１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを含む遺伝子発現用ユニット。
「態様６]
態様５記載の遺伝子発現用ユニットを含む、相同組換え用カセット。
[態様７]
態様１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物。
[態様８]
宿主微生物がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様７記載の形質転換微生物。
[態様９]
宿主微生物が非相同組換えに関与する遺伝子が破壊された株である、態様８記載の形質転換微生物。
[態様１０]
態様５記載の遺伝子発現用ユニット又は態様６記載の相同組換え用カセットを用いて宿主微生物を形質転換することを含む、態様７〜９のいずれか一項に記載の質転換微生物の作製方法。
[態様１１]
態様７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することを含む、タンパク質の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の翻訳開始位置より２．５ｋｂに亘る上流の一部の領域が元の上流領域全体と同程度の強力なプロモーター活性を示すことが明らかとなり、このような上流領域２．５ｋｂをプロモーターとして用いてタンパク質発現ができることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域（アルカリプロテアーゼプロモーター）は、有用なタンパク質等を高発現させるためのプロモーターとして用いることができる。ここで、「アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域」とは、該遺伝子の翻訳開始位置の５′側上流に隣接する領域を意味する。
【００１７】
高発現が可能なプロモーターとして用いるためには、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域約１．１ｋｂより長い領域、例えば、１．５ｋｂ以上の長さの領域を用いることが望ましい。このような麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域として、例えば、本明細書の実施例２において作製した各カセットに含まれる領域を挙げることができる。特に、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域約２．５ｋｂから成るアルカリプロテアーゼプロモーターが好ましく、そのようなプロモーターを利用することによって発現対象遺伝子を最も強く発現させることができる。アスペルギルス・ソーヤ由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域約２．５ｋｂから成るアルカリプロテアーゼプロモーターのヌクレオチド配列を配列番号１で示す。さらに、プロモーターとして機能する限りにおいて、上記プロモーターにおいてアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部、例えば、翻訳開始位置に近い側の領域の一部が置換又は欠損していても構わない。
【００１８】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をゲノムに元来含む麹菌の種類に特に制限はないが、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・カワチ、及びアスペルギルス・サイトイ等のアスペルギルス属に属する麹菌が好ましい。
【００１９】
形質転換に用いる麹菌宿主に関しても特に制限はないが、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等のアスペルギルス属に属する麹菌が好ましい。さらに、相同組み換えにより染色体の特定の部位にＤＮＡ断片を導入する場合は、非相同組換えに関与する遺伝子が破壊されて相同組み換え効率が高くなった株、例えば、ｋｕ７０遺伝子破壊株、ｋｕ８０遺伝子破壊株、ｌｉｇ４遺伝子破壊株等を用いることが望ましい。
【００２０】
上記遺伝子破壊株を用いることにより、効率良く相同組み換えを行うことができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７５， ４６０ （２００６）、Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ． ４５， ８７８（２００８）参照）。
【００２１】
麹菌ｋｕ７０遺伝子破壊株として、例えば、アスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ΔｐｙｒＧ、ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７５， ４６０（２００６）、特開２００７−２２２０５５号公報参照）を用いることができる。
【００２２】
アスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３１１が付され、その後、平成１７年１１月１７日付で、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４５３が付与されている。
【００２３】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は当業者に公知の任意の方法、例えば、ＰＣＲで取得することができる。後述の形質転換用カセット構築の過程も含め、ＰＣＲに用いる酵素は、正確性の高いものが望ましい。このような酵素として、例えば、実施例で用いたＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）が挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲの装置に特に制限はなく、例えば、実施例で用いたＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）が挙げられる。
【００２５】
ＰＣＲの鋳型となる麹菌染色体ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法、例えば、以下の方法により抽出することができる。１５０ｍｌ容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地（１％ポリペプトン、２％デキストリン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮａＮＯ３、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．１％カザミノ酸、ｐＨ６．０）３０ｍｌを調製し、麹菌の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養する。培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕し、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて粉砕菌体から染色体ＤＮＡを抽出することができる。
【００２６】
具体的な染色体ＤＮＡ抽出方法は、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）のプロトコールを参照することができる。アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、実施例に示すプライマーの中から適切なものを選んで用いることができる。あるいは、本発明で開示したアスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の配列をもとに、適切なプライマーを設計して用いることができる。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の全ゲノム情報は、独立行政法人製品評価技術基盤機構のゲノム情報データベースにおいて公開されており、この配列情報をもとに、適切なプライマーを設計して用いることができる。
【００２８】
発現対象遺伝子にコードされる所望のタンパク質等は、本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いて、当業者に公知の任意の方法に従い発現させることができる。例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−ターミネーターがこの順につながって構成される、遺伝子発現用ユニット（発現ユニット）の形で用いることができる。ターミネーターとしては発現対象遺伝子の下流領域を用いることができる。この他に、当業者に公知の任意のターミネーター、例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子の下流領域やα−アミラーゼ遺伝子の下流領域をターミネーターとして用いることができる。
【００２９】
発現ユニットは麹菌染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９， １１３３ （１９９５）参照）上に発現ユニットを構築し、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００３０】
発現ユニットを麹菌染色体に導入するに当たり、導入する染色体の部位を問わない場合は、発現ユニットと適切な形質転換マーカー遺伝子とを用いて麹菌を形質転換することにより、麹菌の染色体に導入することができる。発現ユニットと形質転換マーカー遺伝子は連結されている方が望ましいが、連結されていない場合は、コトランスフォーメーションで導入することができる。
【００３１】
発現ユニットを麹菌染色体の特定の部位へ導入する場合は、相同組換えによりこれを行うことができる。このためには、発現ユニットと形質転換マーカー遺伝子を連結したものの一方の端に、導入する部位より上流側で宿主染色体と相同組換えを起こすためのＤＮＡ断片をつなぎ、もう一方の端に、導入する部位より下流側で宿主染色体と相同組換えを起こすためのＤＮＡ断片をつないでおく必要がある。このようなＤＮＡ断片から構成される相同組換え用カセットで形質転換を行い、両端に設けたそれぞれのＤＮＡ断片が染色体上の該当配列と相同組換えを起こすと、目的の部位に発現ユニットが導入された形質転換体が得られる。
【００３２】
上記の形質転換に用いるカセットにおいて発現ユニットが完全な形をとっていなくても、染色体上の配列を利用することにより最終的に完全な発現ユニットが麹菌染色体上に構築されるように、発現ユニットの一部をカセット中に構築してこれを導入する方法も用いることができる。例えば、染色体上の発現対象遺伝子のすぐ上流にアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を導入する場合は、発現対象遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子（あるいはその一部）の、４種のＤＮＡ断片から成るカセットを構築する。このカセットで麹菌を形質転換し、両端のＤＮＡ断片がそれぞれ染色体と相同組み換えを起こすと、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−発現対象遺伝子のターミネーターから成る完全な発現ユニットが染色体上に構築される。
【００３３】
ターミネーターとして、例えば、α−アミラーゼ（以下アミラーゼという）遺伝子下流領域を用いる場合、染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を利用する形で発現ユニットを構築することができる。このためのカセットとして、アミラーゼ遺伝子上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域の、５種のＤＮＡ断片がこの順につながったものを構築すればよい。このうち、アミラーゼ遺伝子上流領域とアミラーゼ遺伝子下流領域はそれぞれ相同組み換えのためのＤＮＡ断片として機能する。
【００３４】
一つながりのカセットとしての構築が困難な場合は、上流側カセットと下流側カセットに分割して構築することができる。この場合、分割部分の少なくとも０．５ｋｂ以上に亘る配列を上流側カセットと下流側カセットが互いに共通に持つように構築する必要がある。
【００３５】
例えば、上記の染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を利用する形で発現ユニットを構築するための形質転換用カセットを分割して構築する場合、アミラーゼ遺伝子上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域から成る上流側カセット、及び、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域から成る下流側カセットの、２種のカセットをそれぞれ構築する。両カセットはアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を共通領域として持つ。分割したカセットを用いて形質転換する場合は、分割したカセットが互いにほぼ等モル量になるように用いればよい。上流側カセット中の最上流のＤＮＡ断片と染色体との相同組換え、下流側カセット中の最下流のＤＮＡ断片と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きた場合に、発現ユニットが染色体上に構築された目的の株が得られる。
【００３６】
カセットを構築するためのＤＮＡ断片の取得とＤＮＡ断片の連結は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ＹｕらがＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ． ４１， ９７３ （２００４）で報告したｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ法で行うことができる。この方法では３段階のＰＣＲを行う。まず、各ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。この際に用いるプライマーのうち、ＤＮＡ断片を連結させる側のプライマーについては、プライマーの５‘末端に、連結させるＤＮＡ断片の末端の相補配列を２０〜６０ｍｅｒの長さの範囲で付加した形のものを用いる必要がある。この付加配列は、連結させるＤＮＡ断片同士の少なくともいずれか一方に設ければよい。
【００３７】
次に、得られたそれぞれのＤＮＡ断片を混合してＰＣＲを行うことにより、各ＤＮＡ断片を連結させる。最後に、得られた反応液を鋳型に、最上流のＤＮＡ断片中に設けたフォワードプライマーと最下流のＤＮＡ断片中に設けたリバースプライマーとを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、あるいはｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことにより、目的のカセットを増幅することができる。
【００３８】
カセットを構築する他の方法として、大腸菌あるいはサッカロマイセス酵母等において複製するようなベクターにＤＮＡ断片を順次、あるいは一度にクローニングすることでカセットを構築することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０， ６２ （１９９１）、Ｉｚａｓａ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４０， ７９ （２００６）参照）。麹菌の形質転換に用いる際には、構築したベクターをそのまま、あるいはベクターからカセットを含む領域を適切な制限酵素で切り出してから用いることができる。あるいは、構築したベクターを鋳型として、カセットを含む領域をＰＣＲで増幅したものを用いることができる。
【００３９】
こうして得られた遺伝子発現用ユニット又は相同組換え用カセットを用いて、当業者に公知の任意の方法で宿主微生物を形質転換し、本発明の形質転換微生物を作製することができる。さらに、こうして得られた形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することによって、所望のタンパク質を製造することができる。
【００４０】
麹菌の形質転換は、例えば、特開２００７−２２２０５５号公報に記載の方法に従い、麹菌宿主のプロトプラストを調製し、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行うことができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる麹菌宿主と形質転換マーカー遺伝子に応じて適切なものを用いる。例えば、麹菌宿主としてアスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天、１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で行うことができる。
【００４１】
適切な相同組み換え体が取得できたかどうかの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行うことができる。
【００４２】
例えば、用いたカセットより上流に位置するフォワードプライマーと、新たに導入したＤＮＡ断片（例えば、形質転換マーカー遺伝子）中に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００４３】
さらに、新たに導入したＤＮＡ断片（例えば形質転換マーカー遺伝子）中に位置するフォワードプライマーと、用いたカセットより下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００４４】
さらに、可能な場合には、用いたカセットより上流に位置するフォワードプライマーと、用いたカセットより下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
【００４５】
分割したカセットを用いて形質転換した場合は、上記の確認に加え、さらに、カセット間で適切な相同組み換えが起きていることの確認を行うことが好ましい。この確認は、上流側カセット中（ただし、下流側カセットとの共通領域は除く）に位置するフォワードプライマーと、下流側カセット中（ただし、上流側カセットとの共通領域は除く）に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認することにより行うことができる。
【００４６】
発現ユニットが導入、あるいは構築された本発明の形質転換微生物である麹菌を培養することにより、発現対象のタンパク質を発現させる場合には、アルカリプロテアーゼが十分に発現するような培地を用いることが好ましい。
【００４７】
このような培地として、例えば、ふすま培地が挙げられる。ふすま培地は、例えば、１５０ｍｌ容量の三角フラスコに小麦ふすま（精選ふすま、日清製粉社製）２．７８ｇ及び蒸留水２．２２ｍｌを入れて混合し、綿栓をしてから、１２１℃で５０分間オートクレーブ処理することで調製することができる。
【００４８】
ふすま培地での麹菌の培養は、ふすま培地に麹菌の分生子を接種し、３０℃で２４時間放置した後、三角フラスコを激しく振盪して内容物を小さい粒子に砕き、３０℃でさらに４８時間放置して菌体を生育させることにより、行うことができる。このようにして得たふすま麹から、発現対象のタンパク質の性質に応じた適切な方法で、タンパク質を抽出する。
【００４９】
発現対象のタンパク質が菌体外に分泌されるようなタンパク質である場合は、例えば、ふすま麹に蒸留水を加えて激しく撹拌し、室温で約３時間放置してからろ紙でろ過することにより、発現対象のタンパク質を抽出することができる。
【００５０】
発現対象のタンパク質が菌体内に局在するようなタンパク質である場合は、例えば、組成が２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５％グリセロールであるような緩衝液をふすま麹に加え、ポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）等の破砕装置を用いて氷冷しながら間欠運転で破砕し、得られた破砕液を遠心分離して上澄を回収することにより、発現対象のタンパク質を抽出することができる。
【００５１】
プロテアーゼ阻害剤が発現対象のタンパク質の機能に影響を及ぼさない場合は、抽出操作の際にフェニルメチルスルホニルフルオリド等のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、麹菌のプロテアーゼによる発現対象タンパク質の分解を防ぐことができる。得られた抽出液について、発現対象のタンパク質の機能に応じて酵素活性測定等の適切な方法により試験を行い、発現対象のタンパク質が発現していることを確認することができる。
【００５２】
発現対象のタンパク質は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等で精製することができる。
【００５３】
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いて発現対象のタンパク質を発現する麹菌は、例えば、グルテン等のタンパク質原料を麹で分解して得るような、調味液の製造に用いることができる。発現対象のタンパク質がタンパク質やペプチドの分解に携わる酵素である場合は、アルカリプロテアーゼと発現対象のタンパク質が共存することにより、原料の分解がより促進され、窒素やアミノ酸がより多い調味液を得ることができる。
【００５４】
発現対象のタンパク質がグルタミナーゼである場合は、グルタミンのグルタミン酸への変換が促進されることにより、より旨味の強い調味液を得ることができる。
【００５５】
発現対象のタンパク質がセルラーゼ等の細胞壁分解に携わる酵素である場合は、原料に含まれる細胞壁成分の分解が促進されることにより、調味液製造の際に生じる残渣を低減させることができる。
【００５６】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００５７】
なお、実施例では、形質転換の麹菌宿主として、アスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株を用いた。形質転換マーカー遺伝子として、ｐｙｒＧ遺伝子を用いた。形質転換に用いるカセットの構築はｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ法で行った。ＰＣＲの酵素として、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （東洋紡績社製）を用い、反応液の組成は添付の取扱説明書に従った。ＰＣＲの装置として、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。ＰＣＲ産物の精製には、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を添付の取扱説明書に従って用いた。
実施例でＰＣＲに用いたプライマーの一覧を表７に示した。
調製したＰＣＲ産物の一覧を表８に示した。
構築したカセットの一覧を表９に示した。
【実施例１】
【００５８】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターの強さの検討＞
・プロモーター導入株の作製
アスペルギルス・ソーヤ染色体のアルカリプロテアーゼ遺伝子のすぐ上流に、各種プロモーターを相同組換えで導入することにより、導入したプロモーターの支配下でアルカリプロテアーゼが発現する株を作製した。
【００５９】
プロモーターを導入するためのカセットは、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子から成る上流側カセットと、ｐｙｒＧ遺伝子−導入するプロモーター−アルカリプロテアーゼ遺伝子の一部、から成る下流側カセットに分割して、それぞれ構築した。両カセットはｐｙｒＧ遺伝子を共通に持つ。下流側カセットは、用いるプロモーター毎に作製した。上流側カセットと下流側カセットを混ぜて麹菌宿主を形質転換した際に、上流側カセット中のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域と染色体との相同組換え、下流側カセット中のアルカリプロテアーゼ遺伝子領域と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きると、プロモーターが導入された目的の株が得られる（図１）。
【００６０】
導入するプロモーターとして、以下のものを用いた。
【００６１】
アスペルギルス・オリゼの翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）のプロモーター（Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５０， ８５ （１９９８）参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、ＴＥＦ１プロモーターとして用いた。
【００６２】
アスペルギルス・オリゼのアミラーゼプロモーター（特許３００５６１８号、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６， １８４９ （１９９２）参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、アミラーゼプロモーターとして用いた。
【００６３】
アスペルギルス・オリゼのグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）のプロモーター（特許第２９９５７７０号明細書参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、ＧＰＤプロモーターとして用いた。
【００６４】
アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡｌｐ＿−２５１３ＦとプライマーＡｌｐ＿−１Ｒ＿Ｐを用いて、９４℃で２分、（９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、６８℃で３分）×３０サイクルでＰＣＲを行い、表８に示した産物１を得た（下流側末端には、次に調製する産物２をＰＣＲで連結するための配列が設けてある）。
【００６５】
以下同様に、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２〜６を得た。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製した。
【００６６】
産物１と産物２を混合して、９４℃で２分、（９４℃で１５秒、５６℃で５分、６８℃で５分）×１５サイクルでＰＣＲを行った後、この反応液を鋳型とし、プライマーＡｌｐ＿−１９９０ＦとプライマーＰｙｒＧ＿１４３１Ｒを用いてＰＣＲを行い、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子から成る、カセット１を得た。以下、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を同様に行い、カセット２〜カセット４を得た。
【００６７】
カセット１とカセット２を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりＴＥＦ１プロモーターがアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流に導入された形質転換体を、ＰＣＲにより選抜した。このうちの1株をＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株とした。
【００６８】
同様に、カセット１とカセット３を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流にアミラーゼプロモーターが導入された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株とした。
【００６９】
同様に、カセット１とカセット４を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流にＧＰＤプロモーターが導入された形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株とした。
【００７０】
アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域が遺伝子操作されていないコントロール株は、産物２（ｐｙｒＧ遺伝子）で麹菌宿主を形質転換することにより得た。このうちの１株をＷｈＫｕＰ３株とした。
【００７１】
・プロモーター導入株のプロテアーゼ活性
作製した各プロモーター導入株を培養してプロテアーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域が遺伝子操作されていない株についても同様に行い、アルカリプロテアーゼプロモーターの活性の指標とした。
【００７２】
各プロモーター導入株、及びコントロールのＷｈＫｕＰ３株を、１５０ｍｌ容量の三角フラスコに調製したふすま培地でそれぞれ培養し、得られたふすま麹に蒸留水を５０ｍｌ加えて激しく撹拌し、室温で３時間放置してからＮｏ.２ろ紙（アドバンテック社製）でろ過することにより、抽出液を得た。ｐＨ７．０でのミルクカゼイン基質に対する抽出液のプロテアーゼ活性を、しょうゆ試験法（財団法人日本醤油研究所編）記載の方法に従って測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を1としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表１に示す。ＴＥＦ１プロモーター導入株であるＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株はコントロールのＷｈＫｕＰ３株と同程度の活性を示し、ＧＰＤプロモーター導入株であるＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株、及びアミラーゼプロモーター導入株であるＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株の活性はこれには及ばなかった。ふすま培地での培養において、アルカリプロテアーゼプロモーターはＴＥＦ１プロモーターに匹敵する強さを持つことが判明した。
【００７３】
【表１】
【００７４】
別の培地として、１５０ ｍｌ容量の三角フラスコに２％デキストリン及び１％Ｋ２ＨＰＯ４から成る溶液を２０ ｍｌ、及び大豆粉（パフミン、キッコーマン社製）を０．３ ｇ入れてオートクレーブ滅菌したものを調製した。これに各プロモーター導入株、或いはＷｈＫｕＰ３株の分生子を２×１０７個接種した。３０℃で４日間振とう培養した後、培養液をＮｏ. ２ろ紙でろ過して通過液を得た。
【００７５】
得られた通過液のプロテアーゼ活性を測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表２に示す。
【００７６】
ＴＥＦ１プロモーター導入株であるＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株はコントロールのＷｈＫｕＰ３株よりもやや強い活性を示した。ＧＰＤプロモーター導入株であるＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株はＷｈＫｕＰ３株と同程度の活性を示した。アミラーゼプロモーター導入株であるＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株は他の株に比べて弱い活性を示した。上記組成の培地での培養において、アルカリプロテアーゼプロモーターの強さはＧＰＤプロモーターの強さに匹敵することが判明した。
【００７７】
【表２】
【実施例２】
【００７８】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターの長さの検討＞
・アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の作製
アスペルギルス・ソーヤ染色体上のアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５ｋｂの領域内を上流側から段階的に欠損した一連の株を作製した。このためのカセットは、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５〜３．５ｋｂに亘る領域−ｐｙｒＧ遺伝子−欠損させる領域の下流側の領域、の３種のＤＮＡ断片から成り、両端のＤＮＡ断片がそれぞれ宿主染色体と相同組換えを起こした場合に、ｐｙｒＧ遺伝子が導入されると共にアルカリプロテアーゼ遺伝子上流の特定の領域が欠損する（図２）。
【００７９】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、及び産物７〜産物１３を得た。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、実施例１と同様に、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を行い、カセット５〜カセット１０を得た。
【００８０】
カセット５を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５ ｋｂの位置にｐｙｒＧ遺伝子が挿入された、すなわち上流領域の長さが２．５ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株とした。
【００８１】
同様に、カセット６を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５〜２．０ｋｂに亘る領域がｐｙｒＧ遺伝子で置換された、すなわち、上流領域の長さが２．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株とした。
【００８２】
同様に、カセット７を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが１．５ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株とした。
【００８３】
同様に、カセット８を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが１．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ１．０ｋ＿７株とした。
【００８４】
同様に、カセット９を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが０．７ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ０．７ｋ＿２株とした。
【００８５】
同様に、カセット１０を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが０．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株とした。
【００８６】
・アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株のプロテアーゼ活性
作製したそれぞれのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株を培養してプロテアーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
【００８７】
作製したそれぞれのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株、及び、上流領域を遺伝子操作していないコントロールのＷｈＫｕＰ３株について、実施例１と同様にふすま麹を調製し、抽出液を調製してプロテアーゼ活性を測定した。ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の相対活性値を表３に示す。
上流領域の長さが２．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株は、コントロールのＷｈＫｕＰ３株と比べて全く遜色の無いプロテアーゼ活性を示した。上流領域の長さが２．０ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株、１．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株は、ＷｈＫｕＰ３株と比べてそれぞれ７割弱、４割弱の活性を示した。上流領域の長さが１．０ ｋｂ以下である３種の株は、互いに同程度の低い活性を示した。
ＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株が示す活性は、今回対象としたアルカリプロテアーゼ以外の酵素に由来する活性であると考えられ、この分の活性を差し引いて比較すると、上流領域の長さが２．０ ｋｂ、１．５ ｋｂの場合は、操作していない本来の上流領域と比べて、それぞれ、６割、３割弱のプロモーター活性を有し、１．０ ｋｂの場合は本来の約１％の活性しか有していないことになる。
【００８８】
【表３】
【００８９】
１５０ ｍｌ容量の三角フラスコに１％ＫＨ２ＰＯ４溶液を２０ ｍｌ、及び小麦ふすまを０．２ ｇ入れてオートクレーブ滅菌したものを調製した。これに各アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株、或いはＷｈＫｕＰ３株の分生子を２×１０７個接種した。３０℃で４日間振とう培養した後、培養液をＮｏ. ２ろ紙でろ過して通過液を得た。得られた通過液のプロテアーゼ活性を測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表４に示す。
【００９０】
上流領域の長さが２．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株は、コントロールのＷｈＫｕＰ３株と比べて全く遜色の無いプロテアーゼ活性を示した。上流領域の長さが２．０ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株、１．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株は、ＷｈＫｕＰ３株と比べてそれぞれ４割弱、３割弱の活性を示した。上流領域の長さが１．０ ｋｂ以下である３種の株は、互いに同程度の低い活性を示した。ＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株が示す活性は、今回対象としたアルカリプロテアーゼ以外の酵素に由来する活性であると考えられ、この分の活性を差し引いて比較すると、上流領域の長さが２．０ ｋｂ、１．５ ｋｂの場合、操作していない本来の上流領域と比べて、それぞれ、２割強、１割のプロモーター活性を有し、１．０ ｋｂの場合は本来の約１％の活性しか有していないことになる。
【００９１】
【表４】
【００９２】
以上の結果から、２．５ ｋｂの長さのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、プロモーターとして、領域を限定しない本来の場合と同等の強さを発揮することが判明した。上流領域が短くなるに従ってプロモーター活性は弱くなり、１．０ ｋｂ以下の長さではプロモーターとしてほとんど機能しないことが判明した。
【実施例３】
【００９３】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターを用いたタンパク質の発現＞
・プロリダーゼ発現株の作製
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ ｋｂをプロモーターとして用い、プロリダーゼを発現する株を作製した。ターミネーターとして染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を用いた。このためのカセットはアミラーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域から成る上流側カセットと、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−プロリダーゼ遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域から成る下流側カセットに分割して、それぞれ構築した。両カセットはアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を共通に持つ。上流側カセットと下流側カセットを混ぜて麹菌宿主を形質転換した際に、上流側カセット中のアミラーゼ遺伝子上流領域と染色体との相同組換え、下流側カセット中のアミラーゼ遺伝子下流領域と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きると、発現ユニットが構築された目的の株が得られる。なお、アミラーゼ遺伝子は脱落する（図３）。
【００９４】
発現対象のプロリダーゼ遺伝子として、特開２００３−２５０５８０号公報に記載のアスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子に相当する、アスペルギルス・ソーヤの遺伝子（ｐｒｏＡとし、コードするタンパク質をプロリダーゼＡとする）を用いた。これとは異なるプロリダーゼ遺伝子として、特許４０５１２５１号に記載のアスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子に相当する、アスペルギルス・ソーヤの遺伝子（ｐｒｏＢとし、コードするタンパク質をプロリダーゼＢとする）を用いた。
【００９５】
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域として、アスペルギルス・ソーヤの配列に加え、アスペルギルス・オリゼの該当配列も用いた。以下、特に断らない限りはアスペルギルス・ソーヤの配列である。
【００９６】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、産物１４〜産物１８、及び産物２０を得た。アスペルギルス・オリゼ ＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡｏＡｌｐ＿−２５１０Ｆ＿ＰとプライマーＡｏＡｌｐ＿３Ｒを用いてＰＣＲを行い、産物１９を得た。産物１９はアスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ ｋｂを含む。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製した後、実施例１と同様に、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を行い、カセット１１〜カセット１５を得た。
【００９７】
カット１１とカセット１２を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＡ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を、ＰＣＲにより選抜した。このうちの1株をＷｈＰｒｏＡ＿１株とした。
【００９８】
同様に、カット１１とカセット１３を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＢ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰｒｏＢ＿１株とした。
【００９９】
同様に、カット１４とカセット１５を用いて麹菌宿主を形質転換し、アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＡ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰＡｏＰｒｏＡ＿２株とした。
【０１００】
・アミラーゼ遺伝子破壊株の作製
プロリダーゼ発現株ではアミラーゼ遺伝子が破壊されていることから、コントロール株として、アミラーゼ遺伝子破壊株を作製した。このためのカセットは、アミラーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域、の３種のＤＮＡ断片から成る。両端のＤＮＡ断片がそれぞれ宿主染色体と相同組換えを起こした場合に、染色体上のアミラーゼ遺伝子がｐｙｒＧ遺伝子で置き換わる（図４）。
【０１０１】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、産物１４、及び産物２１を得た。これらの産物を混合してＰＣＲを行った後、さらにプライマーＡｍｙ＿−２３４７ＦとプライマーＡｍｙ＿Ｔ１６０５Ｒを用いてＰＣＲを行い、カセット１６を得た。このカセットで麹菌宿主を形質転換し、相同組換えによりアミラーゼ遺伝子が破壊された株を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｍｙ＿１株とした。
【０１０２】
・プロリダーゼ発現株のプロリダーゼ活性
作製したそれぞれのプロリダーゼ発現株、及び、コントロールのＷｈＡｍｙ＿１株について、実施例１と同様にふすま麹を調製した。ふすま麹に２０ｍｌの破砕用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５％グリセロール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて最高回転数で３０秒×８回間欠運転することにより、ふすま麹を破砕した。この破砕懸濁液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄を回収した。この上澄をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通すことにより、ゲルろ過を行った。
【０１０３】
カラムの平衡化と試料の溶出にはＰＭＳＦを加えない破砕用緩衝液を用い、カラムの取扱説明書に従って操作した。得られた溶出液を酵素液とした。酵素液のＬｅｕ−Ｐｒｏ基質に対するプロリダーゼ活性を、特許４０５１２５１号に記載の方法に従って測定した。酵素液のタンパク質量は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて測定し、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いた。それぞれの株の酵素液について、タンパク質量当たりのプロリダーゼ活性を求め、コントロールのＷｈＡｍｙ＿１株の活性を１としたときの、各プロリダーゼ発現株の相対活性値を表５に示す。
【０１０４】
アスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いてプロリダーゼＡを発現させたＷｈＰｒｏＡ＿１株、同様にプロリダーゼＢを発現させたＷｈＰｒｏＢ＿１株はいずれもコントロールのＷｈＡｍｙ＿１株と比べて高い活性を示した。アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いてプロリダーゼＡを発現させたＷｈＰＡｏＰｒｏＡ＿２株もＷｈＡｍｙ＿１株と比べて明らかに高い活性を示した。
【０１０５】
これらの結果から、アスペルギルス・ソーヤ、及びアスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、いずれもプロモーターとしてタンパク質の発現に有効に利用できることが判明した。
【０１０６】
【表５】
【実施例４】
【０１０７】
＜プロリダーゼ発現株を用いたグルテン分解＞
プロリダーゼＢ発現株であるＷｈＰｒｏＢ＿１株、及びコントロールとしてＷｈＡｍｙ＿１株のふすま麹を、実施例１と同様にそれぞれ調製した。これにグルテン（ＶＩＴＥＮ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社製）を１８．５ ｇ、１３％食塩水を３３ ｍｌ加えて良く混合し、４０℃で７日間緩やかに振とうした。得られた懸濁液をＮｏ. ２ろ紙でろ過し、通過液の遊離アミノ酸量をアミノ酸分析計Ｌ−８８００（日立社製）で測定した結果を表６に示す。ＷｈＡｍｙ＿１株を用いた場合に比べて、ＷｈＰｒｏＢ＿１株を用いた場合には、プロリンを始め多くの種類の遊離アミノ酸が増加し、アミノ酸総量も増加した。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、強力なプロモーターとして各種タンパク質の発現に用いることができるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】プロモーター導入株の作製概要
【図２】アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の作製概要
【図３】アミラーゼ遺伝子破壊を伴った発現ユニット導入株の作製概要
【図４】アミラーゼ遺伝遺伝子破壊株の作製概要
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌のアルカリプロテアーゼプロモーター及び該プロモーターを利用するタンパク質の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹菌でのタンパク質の発現のためのプロモーターとして、いずれも麹菌アスペルギルス・オリゼに由来するα−アミラーゼ（例えば、特許文献１参照）、グルコアミラーゼ（例えば、非特許文献１参照）、翻訳伸長因子ＴＥＦ１（例えば、非特許文献２参照）、チロシナーゼ（例えば、特許文献２参照）等の遺伝子のプロモーターが用いられ、特にα−アミラーゼプロモーターの利用例が多く報告されている。
【０００３】
麹菌アスペルギルス・ソーヤはアスペルギルス・オリゼと比べて一般的にアルカリプロテアーゼ活性が高く、アミラーゼ活性は低いことから、アスペルギルス・ソーヤにおいてはアミラーゼ系のプロモーターよりもプロテアーゼ系のプロモーターの利用が望まれる。アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子に関して、その上流１．１ｋｂの領域がプロモーターとして機能しうることが開示されている（例えば、特許文献３〜４参照）。
【０００４】
しかし、開示されている１．１ｋｂの領域がどの程度の強さのプロモーター活性を示すのかは不明である。アスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼプロモーターについても、上流１．１ｋｂの配列が開示されていて、アスペルギルス・オリゼの該当配列と非常に高い相同性を示すことが報告されている（例えば、特許文献５参照）。
【０００５】
しかし、プロモーター活性は確認されていない。このように、麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をプロモーターとして用いるに際し、領域の長さとプロモーター活性の強さとの関係については、これまでに全く検討されていない。さらに、他のプロモーターとの活性の比較も行われておらず、麹菌で用いられるプロモーターにおけるアルカリプロテアーゼプロモーターの位置付けは不明である。
【０００６】
プロモーター領域の長さとプロモーター活性の強さとの関係を調べるための従来の技術として、様々な長さの上流領域を取り出してきてこれにβ−グルクロニダーゼ等のレポーター遺伝子をつなぎ、染色体上の本来とは異なる部位に導入して、レポーターの活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とする方法が挙げられる。
【０００７】
例えば、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼプロモーターの解析では、０．６ ｋｂの領域を最長として上流側を段階的に欠損させ、０．４ｋｂでは０．６ｋｂに比べて７割の活性を示し、０．３ｋｂ以下では活性が顕著に低下したことが示されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
アスペルギルス・オリゼのα−グルコシダーゼプロモーターの解析では、１．５ｋｂを用いた最長とし、０．７ｋｂまで欠損してもプロモーター活性がほとんど変わらないことが示されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
アスペルギルス・オリゼのカタラーゼＢプロモーターの解析では、１．４ｋｂを用いた最長とし、これよりも１．０ｋｂの領域を用いた方がプロモーター活性は高く、使用する領域が長い方が必ずしも活性が高いとは限らないことが示されている（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
これらの結果は、最大限にプロモーター活性を示す領域の長さはプロモーターによって異なるため、上流領域の長さとプロモーター活性の関係についてはプロモーター毎に個別に検討する必要があることを示している。
【００１１】
しかし、この従来技術においては、取り出してきた最長の領域が最大限のプロモーター活性を示すのに必要な領域を含んでいることの確証はないという問題がある。
【特許文献１】特許第３００５６１８号明細書
【特許文献２】特開２００１−４６０７８号公報
【特許文献３】特許第２７５７９４５号明細書
【特許文献４】特許第２９０１３８７号明細書
【特許文献５】特表２００３−５１８９２１号公報
【非特許文献１】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４８， １３５ （２００２）
【非特許文献２】Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５０， ８５ （１９９８）
【非特許文献３】Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６， １８４９ （１９９２）
【非特許文献４】Ｍｉｎｅｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ３０， ４３２ （１９９６）
【非特許文献５】Ｈｉｓａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ４８ （２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さとプロモーター活性の強さの関係を明らかにし、強力なプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題について鋭意検討を重ねた結果、麹菌の染色体上のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流の一部の領域を遺伝子操作で欠損させ、遺伝子操作をしていない本来の上流領域とのプロモーター活性の比較を行うことにより、該遺伝子の翻訳開始位置より上流約２．５ｋｂに亘る領域が元の上流領域全体と同程度のプロモーター活性を示すことを明らかにし、さらに、このような上流領域をプロモーターとして用いてタンパク質発現ができることを明らかにし、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の各態様に係るものである。
[態様１]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって１．１ｋｂより長く２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様２]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ｋｂから成る、請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様３]
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部が置換又は欠損している、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様４]
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１〜３のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
[態様５]
態様１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを含む遺伝子発現用ユニット。
「態様６]
態様５記載の遺伝子発現用ユニットを含む、相同組換え用カセット。
[態様７]
態様１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物。
[態様８]
宿主微生物がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様７記載の形質転換微生物。
[態様９]
宿主微生物が非相同組換えに関与する遺伝子が破壊された株である、態様８記載の形質転換微生物。
[態様１０]
態様５記載の遺伝子発現用ユニット又は態様６記載の相同組換え用カセットを用いて宿主微生物を形質転換することを含む、態様７〜９のいずれか一項に記載の質転換微生物の作製方法。
[態様１１]
態様７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することを含む、タンパク質の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の翻訳開始位置より２．５ｋｂに亘る上流の一部の領域が元の上流領域全体と同程度の強力なプロモーター活性を示すことが明らかとなり、このような上流領域２．５ｋｂをプロモーターとして用いてタンパク質発現ができることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域（アルカリプロテアーゼプロモーター）は、有用なタンパク質等を高発現させるためのプロモーターとして用いることができる。ここで、「アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域」とは、該遺伝子の翻訳開始位置の５′側上流に隣接する領域を意味する。
【００１７】
高発現が可能なプロモーターとして用いるためには、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域約１．１ｋｂより長い領域、例えば、１．５ｋｂ以上の長さの領域を用いることが望ましい。このような麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域として、例えば、本明細書の実施例２において作製した各カセットに含まれる領域を挙げることができる。特に、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域約２．５ｋｂから成るアルカリプロテアーゼプロモーターが好ましく、そのようなプロモーターを利用することによって発現対象遺伝子を最も強く発現させることができる。アスペルギルス・ソーヤ由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域約２．５ｋｂから成るアルカリプロテアーゼプロモーターのヌクレオチド配列を配列番号１で示す。さらに、プロモーターとして機能する限りにおいて、上記プロモーターにおいてアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部、例えば、翻訳開始位置に近い側の領域の一部が置換又は欠損していても構わない。
【００１８】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をゲノムに元来含む麹菌の種類に特に制限はないが、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・カワチ、及びアスペルギルス・サイトイ等のアスペルギルス属に属する麹菌が好ましい。
【００１９】
形質転換に用いる麹菌宿主に関しても特に制限はないが、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等のアスペルギルス属に属する麹菌が好ましい。さらに、相同組み換えにより染色体の特定の部位にＤＮＡ断片を導入する場合は、非相同組換えに関与する遺伝子が破壊されて相同組み換え効率が高くなった株、例えば、ｋｕ７０遺伝子破壊株、ｋｕ８０遺伝子破壊株、ｌｉｇ４遺伝子破壊株等を用いることが望ましい。
【００２０】
上記遺伝子破壊株を用いることにより、効率良く相同組み換えを行うことができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７５， ４６０ （２００６）、Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ． ４５， ８７８（２００８）参照）。
【００２１】
麹菌ｋｕ７０遺伝子破壊株として、例えば、アスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ΔｐｙｒＧ、ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７５， ４６０（２００６）、特開２００７−２２２０５５号公報参照）を用いることができる。
【００２２】
アスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３１１が付され、その後、平成１７年１１月１７日付で、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４５３が付与されている。
【００２３】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は当業者に公知の任意の方法、例えば、ＰＣＲで取得することができる。後述の形質転換用カセット構築の過程も含め、ＰＣＲに用いる酵素は、正確性の高いものが望ましい。このような酵素として、例えば、実施例で用いたＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）が挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲの装置に特に制限はなく、例えば、実施例で用いたＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）が挙げられる。
【００２５】
ＰＣＲの鋳型となる麹菌染色体ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法、例えば、以下の方法により抽出することができる。１５０ｍｌ容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地（１％ポリペプトン、２％デキストリン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮａＮＯ３、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．１％カザミノ酸、ｐＨ６．０）３０ｍｌを調製し、麹菌の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養する。培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕し、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて粉砕菌体から染色体ＤＮＡを抽出することができる。
【００２６】
具体的な染色体ＤＮＡ抽出方法は、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）のプロトコールを参照することができる。アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域をＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、実施例に示すプライマーの中から適切なものを選んで用いることができる。あるいは、本発明で開示したアスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の配列をもとに、適切なプライマーを設計して用いることができる。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の全ゲノム情報は、独立行政法人製品評価技術基盤機構のゲノム情報データベースにおいて公開されており、この配列情報をもとに、適切なプライマーを設計して用いることができる。
【００２８】
発現対象遺伝子にコードされる所望のタンパク質等は、本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いて、当業者に公知の任意の方法に従い発現させることができる。例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−ターミネーターがこの順につながって構成される、遺伝子発現用ユニット（発現ユニット）の形で用いることができる。ターミネーターとしては発現対象遺伝子の下流領域を用いることができる。この他に、当業者に公知の任意のターミネーター、例えば、アルカリプロテアーゼ遺伝子の下流領域やα−アミラーゼ遺伝子の下流領域をターミネーターとして用いることができる。
【００２９】
発現ユニットは麹菌染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９， １１３３ （１９９５）参照）上に発現ユニットを構築し、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００３０】
発現ユニットを麹菌染色体に導入するに当たり、導入する染色体の部位を問わない場合は、発現ユニットと適切な形質転換マーカー遺伝子とを用いて麹菌を形質転換することにより、麹菌の染色体に導入することができる。発現ユニットと形質転換マーカー遺伝子は連結されている方が望ましいが、連結されていない場合は、コトランスフォーメーションで導入することができる。
【００３１】
発現ユニットを麹菌染色体の特定の部位へ導入する場合は、相同組換えによりこれを行うことができる。このためには、発現ユニットと形質転換マーカー遺伝子を連結したものの一方の端に、導入する部位より上流側で宿主染色体と相同組換えを起こすためのＤＮＡ断片をつなぎ、もう一方の端に、導入する部位より下流側で宿主染色体と相同組換えを起こすためのＤＮＡ断片をつないでおく必要がある。このようなＤＮＡ断片から構成される相同組換え用カセットで形質転換を行い、両端に設けたそれぞれのＤＮＡ断片が染色体上の該当配列と相同組換えを起こすと、目的の部位に発現ユニットが導入された形質転換体が得られる。
【００３２】
上記の形質転換に用いるカセットにおいて発現ユニットが完全な形をとっていなくても、染色体上の配列を利用することにより最終的に完全な発現ユニットが麹菌染色体上に構築されるように、発現ユニットの一部をカセット中に構築してこれを導入する方法も用いることができる。例えば、染色体上の発現対象遺伝子のすぐ上流にアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を導入する場合は、発現対象遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子（あるいはその一部）の、４種のＤＮＡ断片から成るカセットを構築する。このカセットで麹菌を形質転換し、両端のＤＮＡ断片がそれぞれ染色体と相同組み換えを起こすと、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−発現対象遺伝子のターミネーターから成る完全な発現ユニットが染色体上に構築される。
【００３３】
ターミネーターとして、例えば、α−アミラーゼ（以下アミラーゼという）遺伝子下流領域を用いる場合、染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を利用する形で発現ユニットを構築することができる。このためのカセットとして、アミラーゼ遺伝子上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域の、５種のＤＮＡ断片がこの順につながったものを構築すればよい。このうち、アミラーゼ遺伝子上流領域とアミラーゼ遺伝子下流領域はそれぞれ相同組み換えのためのＤＮＡ断片として機能する。
【００３４】
一つながりのカセットとしての構築が困難な場合は、上流側カセットと下流側カセットに分割して構築することができる。この場合、分割部分の少なくとも０．５ｋｂ以上に亘る配列を上流側カセットと下流側カセットが互いに共通に持つように構築する必要がある。
【００３５】
例えば、上記の染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を利用する形で発現ユニットを構築するための形質転換用カセットを分割して構築する場合、アミラーゼ遺伝子上流領域−形質転換マーカー遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域から成る上流側カセット、及び、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−発現対象遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域から成る下流側カセットの、２種のカセットをそれぞれ構築する。両カセットはアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を共通領域として持つ。分割したカセットを用いて形質転換する場合は、分割したカセットが互いにほぼ等モル量になるように用いればよい。上流側カセット中の最上流のＤＮＡ断片と染色体との相同組換え、下流側カセット中の最下流のＤＮＡ断片と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きた場合に、発現ユニットが染色体上に構築された目的の株が得られる。
【００３６】
カセットを構築するためのＤＮＡ断片の取得とＤＮＡ断片の連結は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ＹｕらがＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ． ４１， ９７３ （２００４）で報告したｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ法で行うことができる。この方法では３段階のＰＣＲを行う。まず、各ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。この際に用いるプライマーのうち、ＤＮＡ断片を連結させる側のプライマーについては、プライマーの５‘末端に、連結させるＤＮＡ断片の末端の相補配列を２０〜６０ｍｅｒの長さの範囲で付加した形のものを用いる必要がある。この付加配列は、連結させるＤＮＡ断片同士の少なくともいずれか一方に設ければよい。
【００３７】
次に、得られたそれぞれのＤＮＡ断片を混合してＰＣＲを行うことにより、各ＤＮＡ断片を連結させる。最後に、得られた反応液を鋳型に、最上流のＤＮＡ断片中に設けたフォワードプライマーと最下流のＤＮＡ断片中に設けたリバースプライマーとを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、あるいはｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことにより、目的のカセットを増幅することができる。
【００３８】
カセットを構築する他の方法として、大腸菌あるいはサッカロマイセス酵母等において複製するようなベクターにＤＮＡ断片を順次、あるいは一度にクローニングすることでカセットを構築することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０， ６２ （１９９１）、Ｉｚａｓａ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４０， ７９ （２００６）参照）。麹菌の形質転換に用いる際には、構築したベクターをそのまま、あるいはベクターからカセットを含む領域を適切な制限酵素で切り出してから用いることができる。あるいは、構築したベクターを鋳型として、カセットを含む領域をＰＣＲで増幅したものを用いることができる。
【００３９】
こうして得られた遺伝子発現用ユニット又は相同組換え用カセットを用いて、当業者に公知の任意の方法で宿主微生物を形質転換し、本発明の形質転換微生物を作製することができる。さらに、こうして得られた形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することによって、所望のタンパク質を製造することができる。
【００４０】
麹菌の形質転換は、例えば、特開２００７−２２２０５５号公報に記載の方法に従い、麹菌宿主のプロトプラストを調製し、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行うことができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる麹菌宿主と形質転換マーカー遺伝子に応じて適切なものを用いる。例えば、麹菌宿主としてアスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天、１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で行うことができる。
【００４１】
適切な相同組み換え体が取得できたかどうかの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行うことができる。
【００４２】
例えば、用いたカセットより上流に位置するフォワードプライマーと、新たに導入したＤＮＡ断片（例えば、形質転換マーカー遺伝子）中に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００４３】
さらに、新たに導入したＤＮＡ断片（例えば形質転換マーカー遺伝子）中に位置するフォワードプライマーと、用いたカセットより下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００４４】
さらに、可能な場合には、用いたカセットより上流に位置するフォワードプライマーと、用いたカセットより下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
【００４５】
分割したカセットを用いて形質転換した場合は、上記の確認に加え、さらに、カセット間で適切な相同組み換えが起きていることの確認を行うことが好ましい。この確認は、上流側カセット中（ただし、下流側カセットとの共通領域は除く）に位置するフォワードプライマーと、下流側カセット中（ただし、上流側カセットとの共通領域は除く）に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認することにより行うことができる。
【００４６】
発現ユニットが導入、あるいは構築された本発明の形質転換微生物である麹菌を培養することにより、発現対象のタンパク質を発現させる場合には、アルカリプロテアーゼが十分に発現するような培地を用いることが好ましい。
【００４７】
このような培地として、例えば、ふすま培地が挙げられる。ふすま培地は、例えば、１５０ｍｌ容量の三角フラスコに小麦ふすま（精選ふすま、日清製粉社製）２．７８ｇ及び蒸留水２．２２ｍｌを入れて混合し、綿栓をしてから、１２１℃で５０分間オートクレーブ処理することで調製することができる。
【００４８】
ふすま培地での麹菌の培養は、ふすま培地に麹菌の分生子を接種し、３０℃で２４時間放置した後、三角フラスコを激しく振盪して内容物を小さい粒子に砕き、３０℃でさらに４８時間放置して菌体を生育させることにより、行うことができる。このようにして得たふすま麹から、発現対象のタンパク質の性質に応じた適切な方法で、タンパク質を抽出する。
【００４９】
発現対象のタンパク質が菌体外に分泌されるようなタンパク質である場合は、例えば、ふすま麹に蒸留水を加えて激しく撹拌し、室温で約３時間放置してからろ紙でろ過することにより、発現対象のタンパク質を抽出することができる。
【００５０】
発現対象のタンパク質が菌体内に局在するようなタンパク質である場合は、例えば、組成が２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５％グリセロールであるような緩衝液をふすま麹に加え、ポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）等の破砕装置を用いて氷冷しながら間欠運転で破砕し、得られた破砕液を遠心分離して上澄を回収することにより、発現対象のタンパク質を抽出することができる。
【００５１】
プロテアーゼ阻害剤が発現対象のタンパク質の機能に影響を及ぼさない場合は、抽出操作の際にフェニルメチルスルホニルフルオリド等のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、麹菌のプロテアーゼによる発現対象タンパク質の分解を防ぐことができる。得られた抽出液について、発現対象のタンパク質の機能に応じて酵素活性測定等の適切な方法により試験を行い、発現対象のタンパク質が発現していることを確認することができる。
【００５２】
発現対象のタンパク質は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等で精製することができる。
【００５３】
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いて発現対象のタンパク質を発現する麹菌は、例えば、グルテン等のタンパク質原料を麹で分解して得るような、調味液の製造に用いることができる。発現対象のタンパク質がタンパク質やペプチドの分解に携わる酵素である場合は、アルカリプロテアーゼと発現対象のタンパク質が共存することにより、原料の分解がより促進され、窒素やアミノ酸がより多い調味液を得ることができる。
【００５４】
発現対象のタンパク質がグルタミナーゼである場合は、グルタミンのグルタミン酸への変換が促進されることにより、より旨味の強い調味液を得ることができる。
【００５５】
発現対象のタンパク質がセルラーゼ等の細胞壁分解に携わる酵素である場合は、原料に含まれる細胞壁成分の分解が促進されることにより、調味液製造の際に生じる残渣を低減させることができる。
【００５６】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００５７】
なお、実施例では、形質転換の麹菌宿主として、アスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株を用いた。形質転換マーカー遺伝子として、ｐｙｒＧ遺伝子を用いた。形質転換に用いるカセットの構築はｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ法で行った。ＰＣＲの酵素として、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （東洋紡績社製）を用い、反応液の組成は添付の取扱説明書に従った。ＰＣＲの装置として、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。ＰＣＲ産物の精製には、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を添付の取扱説明書に従って用いた。
実施例でＰＣＲに用いたプライマーの一覧を表７に示した。
調製したＰＣＲ産物の一覧を表８に示した。
構築したカセットの一覧を表９に示した。
【実施例１】
【００５８】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターの強さの検討＞
・プロモーター導入株の作製
アスペルギルス・ソーヤ染色体のアルカリプロテアーゼ遺伝子のすぐ上流に、各種プロモーターを相同組換えで導入することにより、導入したプロモーターの支配下でアルカリプロテアーゼが発現する株を作製した。
【００５９】
プロモーターを導入するためのカセットは、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子から成る上流側カセットと、ｐｙｒＧ遺伝子−導入するプロモーター−アルカリプロテアーゼ遺伝子の一部、から成る下流側カセットに分割して、それぞれ構築した。両カセットはｐｙｒＧ遺伝子を共通に持つ。下流側カセットは、用いるプロモーター毎に作製した。上流側カセットと下流側カセットを混ぜて麹菌宿主を形質転換した際に、上流側カセット中のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域と染色体との相同組換え、下流側カセット中のアルカリプロテアーゼ遺伝子領域と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きると、プロモーターが導入された目的の株が得られる（図１）。
【００６０】
導入するプロモーターとして、以下のものを用いた。
【００６１】
アスペルギルス・オリゼの翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）のプロモーター（Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５０， ８５ （１９９８）参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、ＴＥＦ１プロモーターとして用いた。
【００６２】
アスペルギルス・オリゼのアミラーゼプロモーター（特許３００５６１８号、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６， １８４９ （１９９２）参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、アミラーゼプロモーターとして用いた。
【００６３】
アスペルギルス・オリゼのグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）のプロモーター（特許第２９９５７７０号明細書参照）に相当するアスペルギルス・ソーヤの配列を、ＧＰＤプロモーターとして用いた。
【００６４】
アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡｌｐ＿−２５１３ＦとプライマーＡｌｐ＿−１Ｒ＿Ｐを用いて、９４℃で２分、（９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、６８℃で３分）×３０サイクルでＰＣＲを行い、表８に示した産物１を得た（下流側末端には、次に調製する産物２をＰＣＲで連結するための配列が設けてある）。
【００６５】
以下同様に、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２〜６を得た。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製した。
【００６６】
産物１と産物２を混合して、９４℃で２分、（９４℃で１５秒、５６℃で５分、６８℃で５分）×１５サイクルでＰＣＲを行った後、この反応液を鋳型とし、プライマーＡｌｐ＿−１９９０ＦとプライマーＰｙｒＧ＿１４３１Ｒを用いてＰＣＲを行い、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子から成る、カセット１を得た。以下、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を同様に行い、カセット２〜カセット４を得た。
【００６７】
カセット１とカセット２を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりＴＥＦ１プロモーターがアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流に導入された形質転換体を、ＰＣＲにより選抜した。このうちの1株をＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株とした。
【００６８】
同様に、カセット１とカセット３を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流にアミラーゼプロモーターが導入された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株とした。
【００６９】
同様に、カセット１とカセット４を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流にＧＰＤプロモーターが導入された形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株とした。
【００７０】
アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域が遺伝子操作されていないコントロール株は、産物２（ｐｙｒＧ遺伝子）で麹菌宿主を形質転換することにより得た。このうちの１株をＷｈＫｕＰ３株とした。
【００７１】
・プロモーター導入株のプロテアーゼ活性
作製した各プロモーター導入株を培養してプロテアーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流領域が遺伝子操作されていない株についても同様に行い、アルカリプロテアーゼプロモーターの活性の指標とした。
【００７２】
各プロモーター導入株、及びコントロールのＷｈＫｕＰ３株を、１５０ｍｌ容量の三角フラスコに調製したふすま培地でそれぞれ培養し、得られたふすま麹に蒸留水を５０ｍｌ加えて激しく撹拌し、室温で３時間放置してからＮｏ.２ろ紙（アドバンテック社製）でろ過することにより、抽出液を得た。ｐＨ７．０でのミルクカゼイン基質に対する抽出液のプロテアーゼ活性を、しょうゆ試験法（財団法人日本醤油研究所編）記載の方法に従って測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を1としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表１に示す。ＴＥＦ１プロモーター導入株であるＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株はコントロールのＷｈＫｕＰ３株と同程度の活性を示し、ＧＰＤプロモーター導入株であるＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株、及びアミラーゼプロモーター導入株であるＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株の活性はこれには及ばなかった。ふすま培地での培養において、アルカリプロテアーゼプロモーターはＴＥＦ１プロモーターに匹敵する強さを持つことが判明した。
【００７３】
【表１】
【００７４】
別の培地として、１５０ ｍｌ容量の三角フラスコに２％デキストリン及び１％Ｋ２ＨＰＯ４から成る溶液を２０ ｍｌ、及び大豆粉（パフミン、キッコーマン社製）を０．３ ｇ入れてオートクレーブ滅菌したものを調製した。これに各プロモーター導入株、或いはＷｈＫｕＰ３株の分生子を２×１０７個接種した。３０℃で４日間振とう培養した後、培養液をＮｏ. ２ろ紙でろ過して通過液を得た。
【００７５】
得られた通過液のプロテアーゼ活性を測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表２に示す。
【００７６】
ＴＥＦ１プロモーター導入株であるＷｈＰｔｅｆＡｌｐ＿４株はコントロールのＷｈＫｕＰ３株よりもやや強い活性を示した。ＧＰＤプロモーター導入株であるＷｈＰｇｐｄＡｌｐ＿６株はＷｈＫｕＰ３株と同程度の活性を示した。アミラーゼプロモーター導入株であるＷｈＰａｍｙＡｌｐ＿３株は他の株に比べて弱い活性を示した。上記組成の培地での培養において、アルカリプロテアーゼプロモーターの強さはＧＰＤプロモーターの強さに匹敵することが判明した。
【００７７】
【表２】
【実施例２】
【００７８】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターの長さの検討＞
・アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の作製
アスペルギルス・ソーヤ染色体上のアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５ｋｂの領域内を上流側から段階的に欠損した一連の株を作製した。このためのカセットは、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５〜３．５ｋｂに亘る領域−ｐｙｒＧ遺伝子−欠損させる領域の下流側の領域、の３種のＤＮＡ断片から成り、両端のＤＮＡ断片がそれぞれ宿主染色体と相同組換えを起こした場合に、ｐｙｒＧ遺伝子が導入されると共にアルカリプロテアーゼ遺伝子上流の特定の領域が欠損する（図２）。
【００７９】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、及び産物７〜産物１３を得た。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、実施例１と同様に、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を行い、カセット５〜カセット１０を得た。
【００８０】
カセット５を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりアルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５ ｋｂの位置にｐｙｒＧ遺伝子が挿入された、すなわち上流領域の長さが２．５ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株とした。
【００８１】
同様に、カセット６を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子の上流２．５〜２．０ｋｂに亘る領域がｐｙｒＧ遺伝子で置換された、すなわち、上流領域の長さが２．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株とした。
【００８２】
同様に、カセット７を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが１．５ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株とした。
【００８３】
同様に、カセット８を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが１．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ１．０ｋ＿７株とした。
【００８４】
同様に、カセット９を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが０．７ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ０．７ｋ＿２株とした。
【００８５】
同様に、カセット１０を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域の長さが０．０ｋｂである形質転換体を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株とした。
【００８６】
・アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株のプロテアーゼ活性
作製したそれぞれのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株を培養してプロテアーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
【００８７】
作製したそれぞれのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株、及び、上流領域を遺伝子操作していないコントロールのＷｈＫｕＰ３株について、実施例１と同様にふすま麹を調製し、抽出液を調製してプロテアーゼ活性を測定した。ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の相対活性値を表３に示す。
上流領域の長さが２．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株は、コントロールのＷｈＫｕＰ３株と比べて全く遜色の無いプロテアーゼ活性を示した。上流領域の長さが２．０ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株、１．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株は、ＷｈＫｕＰ３株と比べてそれぞれ７割弱、４割弱の活性を示した。上流領域の長さが１．０ ｋｂ以下である３種の株は、互いに同程度の低い活性を示した。
ＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株が示す活性は、今回対象としたアルカリプロテアーゼ以外の酵素に由来する活性であると考えられ、この分の活性を差し引いて比較すると、上流領域の長さが２．０ ｋｂ、１．５ ｋｂの場合は、操作していない本来の上流領域と比べて、それぞれ、６割、３割弱のプロモーター活性を有し、１．０ ｋｂの場合は本来の約１％の活性しか有していないことになる。
【００８８】
【表３】
【００８９】
１５０ ｍｌ容量の三角フラスコに１％ＫＨ２ＰＯ４溶液を２０ ｍｌ、及び小麦ふすまを０．２ ｇ入れてオートクレーブ滅菌したものを調製した。これに各アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株、或いはＷｈＫｕＰ３株の分生子を２×１０７個接種した。３０℃で４日間振とう培養した後、培養液をＮｏ. ２ろ紙でろ過して通過液を得た。得られた通過液のプロテアーゼ活性を測定し、ＷｈＫｕＰ３株のプロテアーゼ活性を１としたときの各プロモーター導入株の相対活性値を表４に示す。
【００９０】
上流領域の長さが２．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．５ｋ＿１株は、コントロールのＷｈＫｕＰ３株と比べて全く遜色の無いプロテアーゼ活性を示した。上流領域の長さが２．０ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ２．０ｋ＿１株、１．５ ｋｂであるＷｈＡｌｐＵ１．５ｋ＿１株は、ＷｈＫｕＰ３株と比べてそれぞれ４割弱、３割弱の活性を示した。上流領域の長さが１．０ ｋｂ以下である３種の株は、互いに同程度の低い活性を示した。ＷｈＡｌｐＵ０．０ｋ＿１株が示す活性は、今回対象としたアルカリプロテアーゼ以外の酵素に由来する活性であると考えられ、この分の活性を差し引いて比較すると、上流領域の長さが２．０ ｋｂ、１．５ ｋｂの場合、操作していない本来の上流領域と比べて、それぞれ、２割強、１割のプロモーター活性を有し、１．０ ｋｂの場合は本来の約１％の活性しか有していないことになる。
【００９１】
【表４】
【００９２】
以上の結果から、２．５ ｋｂの長さのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、プロモーターとして、領域を限定しない本来の場合と同等の強さを発揮することが判明した。上流領域が短くなるに従ってプロモーター活性は弱くなり、１．０ ｋｂ以下の長さではプロモーターとしてほとんど機能しないことが判明した。
【実施例３】
【００９３】
＜アルカリプロテアーゼプロモーターを用いたタンパク質の発現＞
・プロリダーゼ発現株の作製
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ ｋｂをプロモーターとして用い、プロリダーゼを発現する株を作製した。ターミネーターとして染色体上のアミラーゼ遺伝子下流領域を用いた。このためのカセットはアミラーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子−アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域から成る上流側カセットと、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−プロリダーゼ遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域から成る下流側カセットに分割して、それぞれ構築した。両カセットはアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を共通に持つ。上流側カセットと下流側カセットを混ぜて麹菌宿主を形質転換した際に、上流側カセット中のアミラーゼ遺伝子上流領域と染色体との相同組換え、下流側カセット中のアミラーゼ遺伝子下流領域と染色体との相同組換え、両カセット間での共通領域を介した相同組換えの、計３か所での相同組換えが起きると、発現ユニットが構築された目的の株が得られる。なお、アミラーゼ遺伝子は脱落する（図３）。
【００９４】
発現対象のプロリダーゼ遺伝子として、特開２００３−２５０５８０号公報に記載のアスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子に相当する、アスペルギルス・ソーヤの遺伝子（ｐｒｏＡとし、コードするタンパク質をプロリダーゼＡとする）を用いた。これとは異なるプロリダーゼ遺伝子として、特許４０５１２５１号に記載のアスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子に相当する、アスペルギルス・ソーヤの遺伝子（ｐｒｏＢとし、コードするタンパク質をプロリダーゼＢとする）を用いた。
【００９５】
アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域として、アスペルギルス・ソーヤの配列に加え、アスペルギルス・オリゼの該当配列も用いた。以下、特に断らない限りはアスペルギルス・ソーヤの配列である。
【００９６】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、産物１４〜産物１８、及び産物２０を得た。アスペルギルス・オリゼ ＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡｏＡｌｐ＿−２５１０Ｆ＿ＰとプライマーＡｏＡｌｐ＿３Ｒを用いてＰＣＲを行い、産物１９を得た。産物１９はアスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ ｋｂを含む。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製した後、実施例１と同様に、表９に示した産物の組み合わせ、及びプライマーの組み合わせでカセットの作製を行い、カセット１１〜カセット１５を得た。
【００９７】
カット１１とカセット１２を用いて麹菌宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中から、相同組み換えによりアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＡ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を、ＰＣＲにより選抜した。このうちの1株をＷｈＰｒｏＡ＿１株とした。
【００９８】
同様に、カット１１とカセット１３を用いて麹菌宿主を形質転換し、アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＢ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰｒｏＢ＿１株とした。
【００９９】
同様に、カット１４とカセット１５を用いて麹菌宿主を形質転換し、アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域−ｐｒｏＡ遺伝子−アミラーゼターミネーターから成る発現ユニットが構築された形質転換体を選抜した。このうちの1株をＷｈＰＡｏＰｒｏＡ＿２株とした。
【０１００】
・アミラーゼ遺伝子破壊株の作製
プロリダーゼ発現株ではアミラーゼ遺伝子が破壊されていることから、コントロール株として、アミラーゼ遺伝子破壊株を作製した。このためのカセットは、アミラーゼ遺伝子上流領域−ｐｙｒＧ遺伝子−アミラーゼ遺伝子下流領域、の３種のＤＮＡ断片から成る。両端のＤＮＡ断片がそれぞれ宿主染色体と相同組換えを起こした場合に、染色体上のアミラーゼ遺伝子がｐｙｒＧ遺伝子で置き換わる（図４）。
【０１０１】
実施例１と同様に、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、表８に示した産物２、産物１４、及び産物２１を得た。これらの産物を混合してＰＣＲを行った後、さらにプライマーＡｍｙ＿−２３４７ＦとプライマーＡｍｙ＿Ｔ１６０５Ｒを用いてＰＣＲを行い、カセット１６を得た。このカセットで麹菌宿主を形質転換し、相同組換えによりアミラーゼ遺伝子が破壊された株を選抜した。このうちの１株をＷｈＡｍｙ＿１株とした。
【０１０２】
・プロリダーゼ発現株のプロリダーゼ活性
作製したそれぞれのプロリダーゼ発現株、及び、コントロールのＷｈＡｍｙ＿１株について、実施例１と同様にふすま麹を調製した。ふすま麹に２０ｍｌの破砕用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５％グリセロール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて最高回転数で３０秒×８回間欠運転することにより、ふすま麹を破砕した。この破砕懸濁液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄を回収した。この上澄をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通すことにより、ゲルろ過を行った。
【０１０３】
カラムの平衡化と試料の溶出にはＰＭＳＦを加えない破砕用緩衝液を用い、カラムの取扱説明書に従って操作した。得られた溶出液を酵素液とした。酵素液のＬｅｕ−Ｐｒｏ基質に対するプロリダーゼ活性を、特許４０５１２５１号に記載の方法に従って測定した。酵素液のタンパク質量は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて測定し、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いた。それぞれの株の酵素液について、タンパク質量当たりのプロリダーゼ活性を求め、コントロールのＷｈＡｍｙ＿１株の活性を１としたときの、各プロリダーゼ発現株の相対活性値を表５に示す。
【０１０４】
アスペルギルス・ソーヤのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いてプロリダーゼＡを発現させたＷｈＰｒｏＡ＿１株、同様にプロリダーゼＢを発現させたＷｈＰｒｏＢ＿１株はいずれもコントロールのＷｈＡｍｙ＿１株と比べて高い活性を示した。アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域を用いてプロリダーゼＡを発現させたＷｈＰＡｏＰｒｏＡ＿２株もＷｈＡｍｙ＿１株と比べて明らかに高い活性を示した。
【０１０５】
これらの結果から、アスペルギルス・ソーヤ、及びアスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、いずれもプロモーターとしてタンパク質の発現に有効に利用できることが判明した。
【０１０６】
【表５】
【実施例４】
【０１０７】
＜プロリダーゼ発現株を用いたグルテン分解＞
プロリダーゼＢ発現株であるＷｈＰｒｏＢ＿１株、及びコントロールとしてＷｈＡｍｙ＿１株のふすま麹を、実施例１と同様にそれぞれ調製した。これにグルテン（ＶＩＴＥＮ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社製）を１８．５ ｇ、１３％食塩水を３３ ｍｌ加えて良く混合し、４０℃で７日間緩やかに振とうした。得られた懸濁液をＮｏ. ２ろ紙でろ過し、通過液の遊離アミノ酸量をアミノ酸分析計Ｌ−８８００（日立社製）で測定した結果を表６に示す。ＷｈＡｍｙ＿１株を用いた場合に比べて、ＷｈＰｒｏＢ＿１株を用いた場合には、プロリンを始め多くの種類の遊離アミノ酸が増加し、アミノ酸総量も増加した。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域は、強力なプロモーターとして各種タンパク質の発現に用いることができるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】プロモーター導入株の作製概要
【図２】アルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域欠損株の作製概要
【図３】アミラーゼ遺伝子破壊を伴った発現ユニット導入株の作製概要
【図４】アミラーゼ遺伝遺伝子破壊株の作製概要
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって１．１ｋｂより長く２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項２】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ｋｂから成る、請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項３】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部が置換又は欠損している、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項４】
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを含む遺伝子発現用ユニット。
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子発現用ユニットを含む、相同組換え用カセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物。
【請求項８】
宿主微生物がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項７記載の形質転換微生物。
【請求項９】
宿主微生物が非相同組換えに関与する遺伝子が破壊された株である、請求項８記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
請求項５記載の遺伝子発現用ユニット又は請求項６記載の相同組換え用カセットを用いて宿主微生物を形質転換することを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の質転換微生物の作製方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域であって１．１ｋｂより長く２．５ｋｂ以下の長さを有するアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項２】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子上流領域２．５ｋｂから成る、請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項３】
麹菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子の一部が置換又は欠損している、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項４】
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを含む遺伝子発現用ユニット。
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子発現用ユニットを含む、相同組換え用カセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルカリプロテアーゼプロモーターを宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入して成る形質転換微生物。
【請求項８】
宿主微生物がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項７記載の形質転換微生物。
【請求項９】
宿主微生物が非相同組換えに関与する遺伝子が破壊された株である、請求項８記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
請求項５記載の遺伝子発現用ユニット又は請求項６記載の相同組換え用カセットを用いて宿主微生物を形質転換することを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の質転換微生物の作製方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培地に培養し、組み込まれた発現対象遺伝子を発現させ、発現したタンパク質を培養物より採取することを含む、タンパク質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−２３９６８１（Ｐ２０１１−２３９６８１Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４０１１６（Ｐ２００８−２４０１１６）
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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