黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質、及びこれに特異的な抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法
【課題】 本発明の課題は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質、これに特異的な抗体、及び上記抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法を提供することにある。
【解決手段】 本発明の方法によれば、容易且つ正確に黒真珠貝の繁殖量を定量化でき、これにより黒真珠貝のライフサイクル研究の重要な情報提供及び効率的な管理が可能となる。
【解決手段】 本発明の方法によれば、容易且つ正確に黒真珠貝の繁殖量を定量化でき、これにより黒真珠貝のライフサイクル研究の重要な情報提供及び効率的な管理が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質、及びこれに特異的な抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インド太平洋の珊瑚地域にわたって生息する黒真珠貝（Pinctada margaritifera）は、他の種（species）よりもサイズが非常に大きいため、より大きい真珠を生産することができる。これにより、黒真珠貝の養殖を通した黒真珠の生産は南太平洋の島嶼国家において最も重要な産業の一つとして位置付けられており、黒真珠の年平均生産量は６Ｍ／Ｔ（Metric ton,米貨175,000,000）に達する。このような黒真珠生産量の増加は黒真珠貝の母貝の需要を急激に増加させ、黒真珠貝の資源量を減少させた。
【０００３】
南太平洋のチュークラグーン（Chuuk Lagoon）での真珠養殖産業において、黒真珠生産のための母貝の安定的供給は最も急を要する事項の一つである。現在、チュークラグーンにおける黒真珠貝の養殖方法としては、天然黒真珠貝から放出された浮遊稚貝を採苗する天然採苗方式が主に用いられているが、養殖産業のために十分な量の稚貝を確保するのが難しいというのが実情である。このため、人工種苗生産を導入して黒真珠貝の稚貝を安定的に供給する必要性が高く認識されているが、黒真珠貝のライフサイクル及び繁殖生理などに関する基礎研究の不足により黒真珠貝の人工種苗生産は未だ成功されていない。また、熱帯地域に分布する二枚貝類の繁殖に関する研究実績が温帯地域の二枚貝類に比べて非常に貧弱なため、熱帯地域の二枚貝類の繁殖戦略及び生理に関する情報が絶対的に不足しているのが実情である。
【０００４】
従って、黒真珠貝の資源管理に成功するためには、優良種苗の生産のための母貝の繁殖生理学的研究が必ず先行されなければならず、これは母貝の年中生殖周期の把握及び産卵時期の予測のような定性的研究と、母貝から生産される卵と精子の定量的測定、即ち、抱卵数（reproductive effort又はfecundity）の測定などに関する研究を含む。特に、抱卵数の測定に関する研究は、測定方法上の困難さゆえに、定性的研究に比べて非常に低調であるのが実情である。これは、他の動物とは異なり、大部分の二枚貝類は卵を含む生殖巣（ovary）が物理的に分離されておらず、外套膜及び消化盲嚢に含まれており、抱卵数が数百万または数千万個に達するためである。
【０００５】
よって、本発明者等は、二枚貝類の一種である黒真珠貝（Pinctada margaritifera）の卵タンパク質に対して特異的に反応する抗体を製造し、黒真珠貝の繁殖量を定量的に測定する方法を開発することにより本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質に特異的な抗体を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、上記抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的を達成するために、本発明は、アミノ酸配列［Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｚ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ］で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供する。
【００１０】
上記アミノ酸配列において、
ＸはＰｈｅまたはＡｓｐで;
ＹはＬｙｓまたはＩｌｅで;
ＺはＧｌｕまたはＳｅｒである。
【００１１】
（上記アミノ酸配列において、Ｐｒｏはプロリン；Ｐｈｅはフェニルアラニン；Ａｒｇはアルギニン;Ｇｌｕはグルタミン酸；Ｌｙｓはリジン；Ａｓｐはアスパラギン酸；Ｉｌｅはイソロイシン；Ｓｅｒはセリン；のアミノ酸の略字である。）
上記アミノ酸配列を具体的に表示すれば、配列番号１乃至８で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供することができる。
【００１２】
本発明の他の様態としては、本発明は上記抗原タンパク質に特異的な抗体を提供する。
【００１３】
本発明のまた他の様態としては、本発明は、
（ｉ）上記抗体を利用した抗原抗体反応によって黒真珠貝の卵タンパク質量を定量する段階；及び
（ｉｉ）段階（ｉ）で定量した黒真珠貝の卵タンパク質量と実際量との標準曲線から実際の黒真珠貝の卵タンパク質量を推定する段階；を含む、黒真珠貝の繁殖量を予測する方法を提供する。
【００１４】
上記抗原抗体反応の測定には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることができるが、これに限定しない。より具体的には、本発明による黒真珠貝の繁殖量を予測する方法によれば、黒真珠貝の卵の成熟に関与する特異的な卵タンパク質を本発明の抗体を利用した酵素免疫測定法で定量分析することによって、特異的な卵タンパク質の総量を間接的に収得することができる。実際量−上記間接的に収得した特異的な卵タンパク質の総量の標準曲線から実際の卵タンパク質量を推定し、一個体が有している卵タンパク質量から卵の数（抱卵数）を予測できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による黒真珠貝の繁殖量測定方法は、抗原抗体の特異的な反応原理を利用して容易且つ正確に黒真珠貝の繁殖量を定量化できるという長所がある。また、本発明による方法は、黒真珠を生産する黒真珠貝の効率的管理及びライフサイクルの研究に重要な情報を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の全体過程図である。
【図２】本発明の望ましい実施例による血球凝集試験の結果写真である。
【図３】本発明の望ましい実施例によるウェスタンブロットの結果写真である（Ａ：交差反応除去前、Ｂ：交差反応除去後、１：卵タンパク質、２：分子量マーカー、３：体組織抽出物（somatic tissue extract）、４：消化腺抽出物（digestive gland extract）、５：精巣抽出物（male gonad extract））。
【図４】本発明の望ましい実施例によるウェスタンブロットの結果写真である（Ａ：非還元条件、Ｂ：還元条件、１：分子量マーカー、２：P.margaritiferaの卵抽出物、３：C.gigasの卵抽出物、４：C.ariakensisの卵抽出物、５：S.kegakiの卵抽出物、６：M.edulisの卵抽出物、７：R.pilippinarumの卵抽出物）。
【図５】本発明の望ましい実施例によるＥＬＩＳＡ分析結果グラフである（Ａ：交差反応除去前、Ｂ：交差反応除去後、各グラフ中、上方にある線：卵抽出物との反応式、下方にある線：体組織抽出物との反応式）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、実施例を通して本発明の構成要素及び技術的特徴をより詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、これによって発明の範囲が限定されることはない。
【実施例】
【００１８】
（実施例１：黒真珠貝卵抽出物の製造）
１−１：卵の分離
黒真珠貝の成熟期である４月頃にマイクロネシア連邦チューク州の延縄垂下式養殖場にて黒真珠貝３０個体を採集した。本発明で用いられた雌母貝は１２個体で、大きさの範囲は１０５．３乃至１５５．７ｍｍであった。
【００１９】
まず、黒真珠貝の貝殻を除去した後、生殖巣組織の一部を取って光学顕微鏡で雄／雌を区分した。成熟した雌の卵巣部位を切開してペトリ皿（Petri dish）にのせ、剃刀を用いて卵巣上に格子縞の細かい切り込みを入れてから、軟らかい棒で圧迫して卵を抽出した。上記分離された卵を０．０２ｍＭのアンモニア水溶液（ammonium hydroxide）及び一定量の海水（０．４５μｍ濾過及び滅菌処理されたもの）と混合し、この混合液を網目の大きさが１００μｍの篩で巨大不純物を濾した。更に、この濾した混合液を再び網目の大きさが４０μｍの篩で濾して卵以外の微細不純物を除去した後、低速で遠心分離して（１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）上澄液内の残余不純物を除去した。続いて、精製された黒真珠貝卵を−７５℃で冷凍し、凍結乾燥器を用いて凍結乾燥した。
【００２０】
１−２：黒真珠貝卵の生化学組成分析
（１）総炭水化物含量分析
総炭水化物含量分析は、フェノール硫酸法（Phenol-Sulfuric acid method,Taylor(1955)）を用いて行なった。凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化した後、遠心分離して上澄液を取った。その後、上澄液にフェノールと硫酸溶液を添加して発色させた後、分光光度計（spectrophotometer）を用いて波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。無水デキストロース（Dextrose anhydrous）を５０乃至１０００μｇ／ｍｌ濃度に希釈して標準液として用い、デキストロース標準液の炭水化物濃度と吸光度との相関式によって試料の総炭水化物含量（ｍｇ／ｇ Tissue Dry Weight,ＴＤＷ）を求めた。
【００２１】
（２）総タンパク質含量分析
総タンパク質含量分析は、凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末に０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を入れて３７℃で２時間インキュベーションし、遠心分離して上澄液を取った後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（protein assay kit,Pierce,23227）と分光光度計を用いて波長５６２ｎｍで吸光度を測定し、吸光度との相関式によってＢＳＡ（bovine serum albumin）標準液のタンパク質濃度（５０〜１０００μｇ／ｍｌ）と試料の総タンパク質含量（ｍｇ／ｇ ＴＤＷ）を求めた。
【００２２】
（３）総脂肪含量分析
総脂肪含量分析は、凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末にクロロホルム及びメタノールの混合液を入れて試料の総脂肪を抽出した。続いて、０．９％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加し、クロロホルム層とメタノール−水層との２層に分けた後、上側のメタノール−水層を捨て、脂肪が溶けているクロロホルム層を取った。脂肪を含有している上記クロロホルム層をアルミニウムディッシュに注ぎ、乾燥器で１日乾燥してクロロホルムを除去した。その後、ディッシュの重さを引いて脂肪の量（ｍｇ／ｇ ＴＤＷ）を測定した。
【００２３】
従って、黒真珠貝卵の生化学組成分分析結果は、下記表１から分かるように、総タンパク質が４０乃至５１％、総炭水化物が４乃至１０％、総脂肪が２０乃至２２％の範囲であった。
【００２４】
【表１】
（実施例２：黒真珠卵抽出物の抗原タンパク質のアミノ酸配列分析）
実施例１−１で分離された黒真珠卵抽出物を分析した図３及び図４の抗原タンパク質のうち、黒真珠卵に特異的なタンパク質のアミノ酸配列を分析した。その結果、２３ｋＤタンパク質のアミノ酸配列を確認し、下記表２に示した。但し、タンパク質のアミノ酸配列分析方法は当業界において自明なものである。
【００２５】
【表２】
分析されなかった他の大きさのタンパク質は、大部分がＮ−末端側にメチル化（methylation）、グリコシル化（glycosylation）、アルキル化（alklation）、アセチル化（acetylation）などの変形（modification）が行われているためであると判断される。
【００２６】
（実施例３：抗体の製造）
実施例１−１による凍結乾燥された黒真珠貝卵粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化し、遠心分離して上澄液を取り、黒真珠貝卵タンパク質抽出物の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。上記黒真珠貝卵タンパク質抽出物０．５ｍｌと、これと同量のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；Freund's Complete Adjuvant）とを混合して、ウサギの背の皮下に４〜５ヶ所に分けて注射した。この時、対照群としては、初回注射前にウサギの耳動脈より血液を採取して使用した。初回注射から２週間後、同一の抗原タンパク質とフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ；Freund's Incomplete Adjuvant）とを混合して総４回注射した。
【００２７】
一方、抗体の製作過程は表３の通りである。抗体が製作される間に、ウサギの耳動脈より血液を採取して血清を分離した。
【００２８】
【表３】
（実施例４：抗体の効果検証及び精製）
４−１：血球凝集試験（Heammaglutination test）
血清内における抗体の有無及び力価を調べるために血球凝集反応実験を行なった。実験には、ヒトの血液から分離された赤血球を利用した。ＥＤＴＡまたはヘパリン（Heparin）処理されたチューブにヒトの血液を３ｍｌ程度採血し、ＰＢＳで３回洗浄してから遠心分離して赤血球（ＲＢＣ；Red blood cells）を分離させた。上記分離された赤血球が１％になるようにＰＢＳに浮遊させ、１％の赤血球にホルマリンを添加して赤血球を安定化させた後、ホルマリン処理された１％の赤血球と０．０５ｍｇ／ｍｌのタンニン酸（tannic acid）とを１：１で混ぜて赤血球をコーティングした。続いて、上記コーティングされた赤血球に抗原である黒真珠貝の卵タンパク質抽出物を同量添加し、常温で１０分間インキュベーションした後、表３に示された血清採取時期に採取された血清を１００倍希釈し、５６℃で３０分間熱処理して補体（complement）を不活性化させた。９６ウェルプレート（well plate）に血清を２倍希釈し、血清が２倍希釈された９６ウェルプレートに予めコーティング処理された赤血球を１０μｌずつ分注して３時間後凝集反応を観察した。その結果は図２の通りである。
【００２９】
図２から分かるように、上記対照群として用いられた抗原タンパク質の注射前に採取された血清、及び注射２週間後の血清には、抗原抗体凝集反応がなく赤血球が底に集まる点の形態が表れ、４週間後からは赤血球が９６ウェルプレートの底に均等に広がる抗原抗体凝集反応が起きて抗体の力価が増加するのが認められた。この時、９６ウェルプレートの底に完全に広がった形態のみを反応が起きたものと見なした。一方、８週間後には１：１６００で希釈した場合においても反応が起きる抗体力価の敏感度が表れた。
【００３０】
４−２：免疫吸着交差反応（Immunosorbent cross-reaction）除去及びＩｇＧ分離
卵以外の組織細胞との交差反応は繁殖量の測定にあたり過大評価の要因として作用するが、黒真珠貝の場合は、年中産卵する習性を持っていて卵を含まない未分化（indifferent）段階の個体を使用できないため、雄個体を用いた、雄個体抽出物が結合されたグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）免疫吸着剤によって交差反応を除去した。
【００３１】
凍結乾燥された雄個体５ｇをＰＢＳ５０ｍｌに溶かし、超音波破砕機を用いて均質化させた。この後、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を取った。このように収得された雄個体抽出物に２Ｍナトリウム−アセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）１０ｍｌを混合し、２５％のグルタルアルデヒド４ｍｌを徐々に加え、３時間反応させた。続いて、グルタルアルデヒドと結合しなかった残余タンパク質を除去するためにＰＢＳで洗浄した後、０．２Ｍグリシン緩衝溶液（Glycine buffer,ｐＨ２．８）２００ｍｌを入れて溶出させ、１ＭのＫ２ＨＰＯ４１００ｍｌでｐＨを調節し、１Ｍエタノールアミン（ethanolamine）１００ｍｌを混ぜ、一晩反応させて免疫吸着剤を準備した。準備された上記免疫吸着剤と２倍希釈された同量の血清とを常温で３時間反応させ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を取った後、ＮａＯＨを用いてｐＨ６程度に調整した。
【００３２】
続いて、上記交差反応が除去された血清から免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を分離するために、１００％飽和された硫酸アンモニウムを希釈して４０％にした硫酸アンモニウム（(ＮＨ４)２ＳＯ４）溶液と４℃で６時間反応させてＩｇＧを沈殿させ、遠心分離（４０００ｒｐｍ、３０分）してＩｇＧを収得した。ここに、交差反応除去前に取った血清量の５０％程度のＰＢＳを入れて再浮遊させた後、透析管（dialysis tubing）を用いて一日透析してＩｇＧ分離を終えた。分離されたＩｇＧは分析前まで冷凍保管した。
【００３３】
４−３：ウェスタンブロット（Western blot）
４−３−１．他の組織との交差反応性の確認
黒真珠貝の卵タンパク質が有する分子の特性を調べるためにＳＤＳ−不連続電気泳動（ＰＡＧＥ）方法を行ない、本発明による抗体が卵タンパク質のどの部分に特異的であるか、また他の組織との交差反応があるかどうかを調べるためにウェスタンブロッティング（Western blotting）を行ない、交差反応の除去前と除去後とをウェスタンブロッティングを利用して比較することにより、交差反応の除去がきちんとなされたのかを確認した。
【００３４】
黒真珠貝の卵、その他の組織（足、エラ、外套膜、筋肉）、消化盲嚢、雄生殖巣の凍結乾燥粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化した後、遠心分離してそれぞれの上澄液を取り、タンパク質濃度が２μｇ／ｍｌになるように希釈した。このように収得されたそれぞれの抽出物を１０μｌずつ分注してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、ＰＶＤＦ膜（PIERCE，88114）に移植（transfer）した。
【００３５】
以後、移植された膜を５％のスキムミルク（skim milk）で１時間ブロッキング（blocking）し、上記実施例４−２の交差反応除去後に１次抗体として開発した本発明の黒真珠貝の卵タンパク質に特異的な抗体（交差反応除去前は開発中のウサギの血清を使用）を５％のスキムミルクに１：１０００で希釈して（交差反応除去前は１：５０００で希釈）２時間反応させ、ウォッシング後、ウォッシングバッファー（washing buffer）に２次抗体（goat anti-Rabbit IgG HRP，KOMA）を１：３０００で希釈して１時間反応させた。ウォッシング後、ペルオキシダーゼ（peroxidase）及びルミナル（luminal）を１：１で混ぜて膜（membrane）に振りかけて１乃至２分程度反応させ、暗室でＥＣＬ反応を３０秒間隔で３分間撮影した。
【００３６】
一方、図３のＡ及びＢは、交差反応除去前／後の写真を示したものである。図３のＡには卵タンパク質以外のその他の組織との交差反応が示されている反面、Ｂには卵タンパク質を除いたその他の組織との交差反応が消えたことが確認された。
【００３７】
４−３−２．他種との交差反応性に対する確認
本発明による抗体が他の二枚貝（bivalve）種の卵タンパク質とも交差反応するかどうかを調べるためにウェスタンブロッティング（Western blotting）を行なった。
【００３８】
黒真珠貝（Pinctada margaritifera）の卵抽出物と他種（C.gigas; C.ariakensis;S.kegaki;M.edulis;R.pilippinarum）の卵抽出物を１０μｌずつ分注してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、上記４−３−１と同様の方法でウェスタンブロッティングを行なった。その結果、図４に示した通り、本発明の抗体は黒真珠貝（Pinctada margaritifera）以外の他の二枚貝種の卵タンパク質とは交差反応しないことが確認された。
【００３９】
特に、実施例２でアミノ酸配列を分析した２３ｋＤの黒真珠貝卵タンパク質は、これまで研究された他の二枚貝（bivalve）種の卵タンパク質と比較分析した結果、黒真珠貝卵に特異的に存在するものと分析された（表４参照）。
【００４０】
【表４】
４−４：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Enzyme Linked Immunosorbent Assay）
黒真珠貝卵タンパク質に特異的な抗体の敏感度を確認するために、卵以外の非特定細胞との交差反応の有無を間接（indirect）ＥＬＩＳＡで確認した。抗原タンパク質としては、黒真珠貝の卵タンパク質をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）で希釈したものを用い、対照群としては、雄個体の組織抽出物を用いた。交差反応除去前は卵タンパク質１８μｇ／ｍｌ、雄個体組織抽出物２２．５μｇ／ｍｌの濃度になるように２倍希釈し、交差反応除去後は卵タンパク質２０μｇ／ｍｌ、雄個体組織抽出物２０μｇ／ｍｌの濃度になるように２倍希釈して抗原タンパク質として用いた。希釈された上記抗原タンパク質をポリスチレン製の９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（Polystyrene 96-well ELISA microplate）に１００μｇ／μｌずつ入れて４℃で一晩反応させ、マイクロプレート自動洗浄器（microplate autowasher）を用いてＰＢＳ−Ｔで洗浄した。続いて、０．１％のＢＳＡ（ｉｎ ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μｌ入れて１時間ブロッキング（blocking）し、同様の方法で洗浄した。上記実施例４−２の交差反応除去後に１次抗体として開発した本発明による黒真珠貝の卵タンパク質に特異的な６．３μｇ／ｍｌ濃度の抗体（交差反応除去前は１２．８μｇ／ｍｌ濃度の血清を使用）を１００μｌ入れて１時間反応させ、洗浄した後、１μｇ／ｍｌの２次抗体（Goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase-conjugated）を１００μｌ入れて１時間反応させた。ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ，p−nitrophenylphosphate）を発色試薬として用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ分析の結果、交差反応除去前は０．１４〜１８μｇ／ｍｌの卵タンパク質が測定可能で、陰性対照群（negative control）では２．８乃至２２．５μｇ／ｍｌと交差反応が非常に弱いことが確認された。交差反応除去後は０．０７乃至２０μｇ／ｍｌの卵タンパク質が測定可能で、陰性対照群では反応を見せないことが分かった（図５）。
【００４１】
４−５：免疫蛍光染色（Immunofluorence staining）
本発明による抗体が卵に特異的に反応するかどうかを、免疫蛍光法を用いて組織スライド上で交差反応除去前と除去後とを比較して観察した。組織スライドはキシレン（xylene）を用いてパラフィンを除去し、アルコール脱水過程を経てＰＢＳ−Ｔで置換した。５％のＢＳＡで１時間ブロッキングした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１次抗体として、上記実施例４−２の交差反応除去後の１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体（交差反応除去前は１．２ｍｇ／ｍｌ濃度の血清）を組織スライドに対して組織を覆う程度に振りかけて１時間反応させた。その後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄してから、２次抗体（fluorescein isothiocyanate-conjugated goat antibody to rabbit IgG）をブロッキング緩衝溶液に１：４０００で希釈し、組織スライドに組織を覆う程度に振りかけて１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、５０％のグリセロール（glycerol）でマウンティング（mounting）した。従って、光学顕微鏡下で写真を撮り、同写真を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００４２】
以上、本発明の望ましい実施例を参照しながら説明したが、該当技術分野における熟練した当業者は、下記特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明の多様な修正及び変更が可能であることを理解し得るであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質、及びこれに特異的な抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インド太平洋の珊瑚地域にわたって生息する黒真珠貝（Pinctada margaritifera）は、他の種（species）よりもサイズが非常に大きいため、より大きい真珠を生産することができる。これにより、黒真珠貝の養殖を通した黒真珠の生産は南太平洋の島嶼国家において最も重要な産業の一つとして位置付けられており、黒真珠の年平均生産量は６Ｍ／Ｔ（Metric ton,米貨175,000,000）に達する。このような黒真珠生産量の増加は黒真珠貝の母貝の需要を急激に増加させ、黒真珠貝の資源量を減少させた。
【０００３】
南太平洋のチュークラグーン（Chuuk Lagoon）での真珠養殖産業において、黒真珠生産のための母貝の安定的供給は最も急を要する事項の一つである。現在、チュークラグーンにおける黒真珠貝の養殖方法としては、天然黒真珠貝から放出された浮遊稚貝を採苗する天然採苗方式が主に用いられているが、養殖産業のために十分な量の稚貝を確保するのが難しいというのが実情である。このため、人工種苗生産を導入して黒真珠貝の稚貝を安定的に供給する必要性が高く認識されているが、黒真珠貝のライフサイクル及び繁殖生理などに関する基礎研究の不足により黒真珠貝の人工種苗生産は未だ成功されていない。また、熱帯地域に分布する二枚貝類の繁殖に関する研究実績が温帯地域の二枚貝類に比べて非常に貧弱なため、熱帯地域の二枚貝類の繁殖戦略及び生理に関する情報が絶対的に不足しているのが実情である。
【０００４】
従って、黒真珠貝の資源管理に成功するためには、優良種苗の生産のための母貝の繁殖生理学的研究が必ず先行されなければならず、これは母貝の年中生殖周期の把握及び産卵時期の予測のような定性的研究と、母貝から生産される卵と精子の定量的測定、即ち、抱卵数（reproductive effort又はfecundity）の測定などに関する研究を含む。特に、抱卵数の測定に関する研究は、測定方法上の困難さゆえに、定性的研究に比べて非常に低調であるのが実情である。これは、他の動物とは異なり、大部分の二枚貝類は卵を含む生殖巣（ovary）が物理的に分離されておらず、外套膜及び消化盲嚢に含まれており、抱卵数が数百万または数千万個に達するためである。
【０００５】
よって、本発明者等は、二枚貝類の一種である黒真珠貝（Pinctada margaritifera）の卵タンパク質に対して特異的に反応する抗体を製造し、黒真珠貝の繁殖量を定量的に測定する方法を開発することにより本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質に特異的な抗体を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、上記抗体を用いて黒真珠貝の繁殖量を予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的を達成するために、本発明は、アミノ酸配列［Ｘ−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｚ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ］で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供する。
【００１０】
上記アミノ酸配列において、
ＸはＰｈｅまたはＡｓｐで;
ＹはＬｙｓまたはＩｌｅで;
ＺはＧｌｕまたはＳｅｒである。
【００１１】
（上記アミノ酸配列において、Ｐｒｏはプロリン；Ｐｈｅはフェニルアラニン；Ａｒｇはアルギニン;Ｇｌｕはグルタミン酸；Ｌｙｓはリジン；Ａｓｐはアスパラギン酸；Ｉｌｅはイソロイシン；Ｓｅｒはセリン；のアミノ酸の略字である。）
上記アミノ酸配列を具体的に表示すれば、配列番号１乃至８で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質を提供することができる。
【００１２】
本発明の他の様態としては、本発明は上記抗原タンパク質に特異的な抗体を提供する。
【００１３】
本発明のまた他の様態としては、本発明は、
（ｉ）上記抗体を利用した抗原抗体反応によって黒真珠貝の卵タンパク質量を定量する段階；及び
（ｉｉ）段階（ｉ）で定量した黒真珠貝の卵タンパク質量と実際量との標準曲線から実際の黒真珠貝の卵タンパク質量を推定する段階；を含む、黒真珠貝の繁殖量を予測する方法を提供する。
【００１４】
上記抗原抗体反応の測定には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることができるが、これに限定しない。より具体的には、本発明による黒真珠貝の繁殖量を予測する方法によれば、黒真珠貝の卵の成熟に関与する特異的な卵タンパク質を本発明の抗体を利用した酵素免疫測定法で定量分析することによって、特異的な卵タンパク質の総量を間接的に収得することができる。実際量−上記間接的に収得した特異的な卵タンパク質の総量の標準曲線から実際の卵タンパク質量を推定し、一個体が有している卵タンパク質量から卵の数（抱卵数）を予測できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による黒真珠貝の繁殖量測定方法は、抗原抗体の特異的な反応原理を利用して容易且つ正確に黒真珠貝の繁殖量を定量化できるという長所がある。また、本発明による方法は、黒真珠を生産する黒真珠貝の効率的管理及びライフサイクルの研究に重要な情報を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の全体過程図である。
【図２】本発明の望ましい実施例による血球凝集試験の結果写真である。
【図３】本発明の望ましい実施例によるウェスタンブロットの結果写真である（Ａ：交差反応除去前、Ｂ：交差反応除去後、１：卵タンパク質、２：分子量マーカー、３：体組織抽出物（somatic tissue extract）、４：消化腺抽出物（digestive gland extract）、５：精巣抽出物（male gonad extract））。
【図４】本発明の望ましい実施例によるウェスタンブロットの結果写真である（Ａ：非還元条件、Ｂ：還元条件、１：分子量マーカー、２：P.margaritiferaの卵抽出物、３：C.gigasの卵抽出物、４：C.ariakensisの卵抽出物、５：S.kegakiの卵抽出物、６：M.edulisの卵抽出物、７：R.pilippinarumの卵抽出物）。
【図５】本発明の望ましい実施例によるＥＬＩＳＡ分析結果グラフである（Ａ：交差反応除去前、Ｂ：交差反応除去後、各グラフ中、上方にある線：卵抽出物との反応式、下方にある線：体組織抽出物との反応式）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、実施例を通して本発明の構成要素及び技術的特徴をより詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、これによって発明の範囲が限定されることはない。
【実施例】
【００１８】
（実施例１：黒真珠貝卵抽出物の製造）
１−１：卵の分離
黒真珠貝の成熟期である４月頃にマイクロネシア連邦チューク州の延縄垂下式養殖場にて黒真珠貝３０個体を採集した。本発明で用いられた雌母貝は１２個体で、大きさの範囲は１０５．３乃至１５５．７ｍｍであった。
【００１９】
まず、黒真珠貝の貝殻を除去した後、生殖巣組織の一部を取って光学顕微鏡で雄／雌を区分した。成熟した雌の卵巣部位を切開してペトリ皿（Petri dish）にのせ、剃刀を用いて卵巣上に格子縞の細かい切り込みを入れてから、軟らかい棒で圧迫して卵を抽出した。上記分離された卵を０．０２ｍＭのアンモニア水溶液（ammonium hydroxide）及び一定量の海水（０．４５μｍ濾過及び滅菌処理されたもの）と混合し、この混合液を網目の大きさが１００μｍの篩で巨大不純物を濾した。更に、この濾した混合液を再び網目の大きさが４０μｍの篩で濾して卵以外の微細不純物を除去した後、低速で遠心分離して（１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）上澄液内の残余不純物を除去した。続いて、精製された黒真珠貝卵を−７５℃で冷凍し、凍結乾燥器を用いて凍結乾燥した。
【００２０】
１−２：黒真珠貝卵の生化学組成分析
（１）総炭水化物含量分析
総炭水化物含量分析は、フェノール硫酸法（Phenol-Sulfuric acid method,Taylor(1955)）を用いて行なった。凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化した後、遠心分離して上澄液を取った。その後、上澄液にフェノールと硫酸溶液を添加して発色させた後、分光光度計（spectrophotometer）を用いて波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。無水デキストロース（Dextrose anhydrous）を５０乃至１０００μｇ／ｍｌ濃度に希釈して標準液として用い、デキストロース標準液の炭水化物濃度と吸光度との相関式によって試料の総炭水化物含量（ｍｇ／ｇ Tissue Dry Weight,ＴＤＷ）を求めた。
【００２１】
（２）総タンパク質含量分析
総タンパク質含量分析は、凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末に０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を入れて３７℃で２時間インキュベーションし、遠心分離して上澄液を取った後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（protein assay kit,Pierce,23227）と分光光度計を用いて波長５６２ｎｍで吸光度を測定し、吸光度との相関式によってＢＳＡ（bovine serum albumin）標準液のタンパク質濃度（５０〜１０００μｇ／ｍｌ）と試料の総タンパク質含量（ｍｇ／ｇ ＴＤＷ）を求めた。
【００２２】
（３）総脂肪含量分析
総脂肪含量分析は、凍結乾燥された黒真珠貝卵の粉末にクロロホルム及びメタノールの混合液を入れて試料の総脂肪を抽出した。続いて、０．９％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加し、クロロホルム層とメタノール−水層との２層に分けた後、上側のメタノール−水層を捨て、脂肪が溶けているクロロホルム層を取った。脂肪を含有している上記クロロホルム層をアルミニウムディッシュに注ぎ、乾燥器で１日乾燥してクロロホルムを除去した。その後、ディッシュの重さを引いて脂肪の量（ｍｇ／ｇ ＴＤＷ）を測定した。
【００２３】
従って、黒真珠貝卵の生化学組成分分析結果は、下記表１から分かるように、総タンパク質が４０乃至５１％、総炭水化物が４乃至１０％、総脂肪が２０乃至２２％の範囲であった。
【００２４】
【表１】
（実施例２：黒真珠卵抽出物の抗原タンパク質のアミノ酸配列分析）
実施例１−１で分離された黒真珠卵抽出物を分析した図３及び図４の抗原タンパク質のうち、黒真珠卵に特異的なタンパク質のアミノ酸配列を分析した。その結果、２３ｋＤタンパク質のアミノ酸配列を確認し、下記表２に示した。但し、タンパク質のアミノ酸配列分析方法は当業界において自明なものである。
【００２５】
【表２】
分析されなかった他の大きさのタンパク質は、大部分がＮ−末端側にメチル化（methylation）、グリコシル化（glycosylation）、アルキル化（alklation）、アセチル化（acetylation）などの変形（modification）が行われているためであると判断される。
【００２６】
（実施例３：抗体の製造）
実施例１−１による凍結乾燥された黒真珠貝卵粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化し、遠心分離して上澄液を取り、黒真珠貝卵タンパク質抽出物の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。上記黒真珠貝卵タンパク質抽出物０．５ｍｌと、これと同量のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；Freund's Complete Adjuvant）とを混合して、ウサギの背の皮下に４〜５ヶ所に分けて注射した。この時、対照群としては、初回注射前にウサギの耳動脈より血液を採取して使用した。初回注射から２週間後、同一の抗原タンパク質とフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ；Freund's Incomplete Adjuvant）とを混合して総４回注射した。
【００２７】
一方、抗体の製作過程は表３の通りである。抗体が製作される間に、ウサギの耳動脈より血液を採取して血清を分離した。
【００２８】
【表３】
（実施例４：抗体の効果検証及び精製）
４−１：血球凝集試験（Heammaglutination test）
血清内における抗体の有無及び力価を調べるために血球凝集反応実験を行なった。実験には、ヒトの血液から分離された赤血球を利用した。ＥＤＴＡまたはヘパリン（Heparin）処理されたチューブにヒトの血液を３ｍｌ程度採血し、ＰＢＳで３回洗浄してから遠心分離して赤血球（ＲＢＣ；Red blood cells）を分離させた。上記分離された赤血球が１％になるようにＰＢＳに浮遊させ、１％の赤血球にホルマリンを添加して赤血球を安定化させた後、ホルマリン処理された１％の赤血球と０．０５ｍｇ／ｍｌのタンニン酸（tannic acid）とを１：１で混ぜて赤血球をコーティングした。続いて、上記コーティングされた赤血球に抗原である黒真珠貝の卵タンパク質抽出物を同量添加し、常温で１０分間インキュベーションした後、表３に示された血清採取時期に採取された血清を１００倍希釈し、５６℃で３０分間熱処理して補体（complement）を不活性化させた。９６ウェルプレート（well plate）に血清を２倍希釈し、血清が２倍希釈された９６ウェルプレートに予めコーティング処理された赤血球を１０μｌずつ分注して３時間後凝集反応を観察した。その結果は図２の通りである。
【００２９】
図２から分かるように、上記対照群として用いられた抗原タンパク質の注射前に採取された血清、及び注射２週間後の血清には、抗原抗体凝集反応がなく赤血球が底に集まる点の形態が表れ、４週間後からは赤血球が９６ウェルプレートの底に均等に広がる抗原抗体凝集反応が起きて抗体の力価が増加するのが認められた。この時、９６ウェルプレートの底に完全に広がった形態のみを反応が起きたものと見なした。一方、８週間後には１：１６００で希釈した場合においても反応が起きる抗体力価の敏感度が表れた。
【００３０】
４−２：免疫吸着交差反応（Immunosorbent cross-reaction）除去及びＩｇＧ分離
卵以外の組織細胞との交差反応は繁殖量の測定にあたり過大評価の要因として作用するが、黒真珠貝の場合は、年中産卵する習性を持っていて卵を含まない未分化（indifferent）段階の個体を使用できないため、雄個体を用いた、雄個体抽出物が結合されたグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）免疫吸着剤によって交差反応を除去した。
【００３１】
凍結乾燥された雄個体５ｇをＰＢＳ５０ｍｌに溶かし、超音波破砕機を用いて均質化させた。この後、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を取った。このように収得された雄個体抽出物に２Ｍナトリウム−アセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）１０ｍｌを混合し、２５％のグルタルアルデヒド４ｍｌを徐々に加え、３時間反応させた。続いて、グルタルアルデヒドと結合しなかった残余タンパク質を除去するためにＰＢＳで洗浄した後、０．２Ｍグリシン緩衝溶液（Glycine buffer,ｐＨ２．８）２００ｍｌを入れて溶出させ、１ＭのＫ２ＨＰＯ４１００ｍｌでｐＨを調節し、１Ｍエタノールアミン（ethanolamine）１００ｍｌを混ぜ、一晩反応させて免疫吸着剤を準備した。準備された上記免疫吸着剤と２倍希釈された同量の血清とを常温で３時間反応させ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を取った後、ＮａＯＨを用いてｐＨ６程度に調整した。
【００３２】
続いて、上記交差反応が除去された血清から免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を分離するために、１００％飽和された硫酸アンモニウムを希釈して４０％にした硫酸アンモニウム（(ＮＨ４)２ＳＯ４）溶液と４℃で６時間反応させてＩｇＧを沈殿させ、遠心分離（４０００ｒｐｍ、３０分）してＩｇＧを収得した。ここに、交差反応除去前に取った血清量の５０％程度のＰＢＳを入れて再浮遊させた後、透析管（dialysis tubing）を用いて一日透析してＩｇＧ分離を終えた。分離されたＩｇＧは分析前まで冷凍保管した。
【００３３】
４−３：ウェスタンブロット（Western blot）
４−３−１．他の組織との交差反応性の確認
黒真珠貝の卵タンパク質が有する分子の特性を調べるためにＳＤＳ−不連続電気泳動（ＰＡＧＥ）方法を行ない、本発明による抗体が卵タンパク質のどの部分に特異的であるか、また他の組織との交差反応があるかどうかを調べるためにウェスタンブロッティング（Western blotting）を行ない、交差反応の除去前と除去後とをウェスタンブロッティングを利用して比較することにより、交差反応の除去がきちんとなされたのかを確認した。
【００３４】
黒真珠貝の卵、その他の組織（足、エラ、外套膜、筋肉）、消化盲嚢、雄生殖巣の凍結乾燥粉末にＰＢＳを入れて超音波破砕機で均質化した後、遠心分離してそれぞれの上澄液を取り、タンパク質濃度が２μｇ／ｍｌになるように希釈した。このように収得されたそれぞれの抽出物を１０μｌずつ分注してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、ＰＶＤＦ膜（PIERCE，88114）に移植（transfer）した。
【００３５】
以後、移植された膜を５％のスキムミルク（skim milk）で１時間ブロッキング（blocking）し、上記実施例４−２の交差反応除去後に１次抗体として開発した本発明の黒真珠貝の卵タンパク質に特異的な抗体（交差反応除去前は開発中のウサギの血清を使用）を５％のスキムミルクに１：１０００で希釈して（交差反応除去前は１：５０００で希釈）２時間反応させ、ウォッシング後、ウォッシングバッファー（washing buffer）に２次抗体（goat anti-Rabbit IgG HRP，KOMA）を１：３０００で希釈して１時間反応させた。ウォッシング後、ペルオキシダーゼ（peroxidase）及びルミナル（luminal）を１：１で混ぜて膜（membrane）に振りかけて１乃至２分程度反応させ、暗室でＥＣＬ反応を３０秒間隔で３分間撮影した。
【００３６】
一方、図３のＡ及びＢは、交差反応除去前／後の写真を示したものである。図３のＡには卵タンパク質以外のその他の組織との交差反応が示されている反面、Ｂには卵タンパク質を除いたその他の組織との交差反応が消えたことが確認された。
【００３７】
４−３−２．他種との交差反応性に対する確認
本発明による抗体が他の二枚貝（bivalve）種の卵タンパク質とも交差反応するかどうかを調べるためにウェスタンブロッティング（Western blotting）を行なった。
【００３８】
黒真珠貝（Pinctada margaritifera）の卵抽出物と他種（C.gigas; C.ariakensis;S.kegaki;M.edulis;R.pilippinarum）の卵抽出物を１０μｌずつ分注してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、上記４−３−１と同様の方法でウェスタンブロッティングを行なった。その結果、図４に示した通り、本発明の抗体は黒真珠貝（Pinctada margaritifera）以外の他の二枚貝種の卵タンパク質とは交差反応しないことが確認された。
【００３９】
特に、実施例２でアミノ酸配列を分析した２３ｋＤの黒真珠貝卵タンパク質は、これまで研究された他の二枚貝（bivalve）種の卵タンパク質と比較分析した結果、黒真珠貝卵に特異的に存在するものと分析された（表４参照）。
【００４０】
【表４】
４−４：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Enzyme Linked Immunosorbent Assay）
黒真珠貝卵タンパク質に特異的な抗体の敏感度を確認するために、卵以外の非特定細胞との交差反応の有無を間接（indirect）ＥＬＩＳＡで確認した。抗原タンパク質としては、黒真珠貝の卵タンパク質をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）で希釈したものを用い、対照群としては、雄個体の組織抽出物を用いた。交差反応除去前は卵タンパク質１８μｇ／ｍｌ、雄個体組織抽出物２２．５μｇ／ｍｌの濃度になるように２倍希釈し、交差反応除去後は卵タンパク質２０μｇ／ｍｌ、雄個体組織抽出物２０μｇ／ｍｌの濃度になるように２倍希釈して抗原タンパク質として用いた。希釈された上記抗原タンパク質をポリスチレン製の９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（Polystyrene 96-well ELISA microplate）に１００μｇ／μｌずつ入れて４℃で一晩反応させ、マイクロプレート自動洗浄器（microplate autowasher）を用いてＰＢＳ−Ｔで洗浄した。続いて、０．１％のＢＳＡ（ｉｎ ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μｌ入れて１時間ブロッキング（blocking）し、同様の方法で洗浄した。上記実施例４−２の交差反応除去後に１次抗体として開発した本発明による黒真珠貝の卵タンパク質に特異的な６．３μｇ／ｍｌ濃度の抗体（交差反応除去前は１２．８μｇ／ｍｌ濃度の血清を使用）を１００μｌ入れて１時間反応させ、洗浄した後、１μｇ／ｍｌの２次抗体（Goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase-conjugated）を１００μｌ入れて１時間反応させた。ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ，p−nitrophenylphosphate）を発色試薬として用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ分析の結果、交差反応除去前は０．１４〜１８μｇ／ｍｌの卵タンパク質が測定可能で、陰性対照群（negative control）では２．８乃至２２．５μｇ／ｍｌと交差反応が非常に弱いことが確認された。交差反応除去後は０．０７乃至２０μｇ／ｍｌの卵タンパク質が測定可能で、陰性対照群では反応を見せないことが分かった（図５）。
【００４１】
４−５：免疫蛍光染色（Immunofluorence staining）
本発明による抗体が卵に特異的に反応するかどうかを、免疫蛍光法を用いて組織スライド上で交差反応除去前と除去後とを比較して観察した。組織スライドはキシレン（xylene）を用いてパラフィンを除去し、アルコール脱水過程を経てＰＢＳ−Ｔで置換した。５％のＢＳＡで１時間ブロッキングした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１次抗体として、上記実施例４−２の交差反応除去後の１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体（交差反応除去前は１．２ｍｇ／ｍｌ濃度の血清）を組織スライドに対して組織を覆う程度に振りかけて１時間反応させた。その後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄してから、２次抗体（fluorescein isothiocyanate-conjugated goat antibody to rabbit IgG）をブロッキング緩衝溶液に１：４０００で希釈し、組織スライドに組織を覆う程度に振りかけて１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、５０％のグリセロール（glycerol）でマウンティング（mounting）した。従って、光学顕微鏡下で写真を撮り、同写真を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００４２】
以上、本発明の望ましい実施例を参照しながら説明したが、該当技術分野における熟練した当業者は、下記特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明の多様な修正及び変更が可能であることを理解し得るであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項２】
配列番号２で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項３】
配列番号３で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項４】
配列番号４で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項５】
配列番号５で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項６】
配列番号６で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項７】
配列番号７で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項８】
配列番号８で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項９】
請求項１乃至８のうちの何れか一項における抗原タンパク質に特異的な抗体。
【請求項１０】
（ｉ）請求項９の抗体を利用した抗原抗体反応によって黒真珠貝の卵タンパク質量を定量する段階；及び
（ｉｉ）段階（ｉ）で定量した黒真珠貝の卵タンパク質量と実際量との標準曲線から実際の黒真珠貝の卵タンパク質量を推定する段階；を含む、黒真珠貝の繁殖量を予測する方法。
【請求項１１】
上記抗原抗体反応の測定には酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることを特徴とする、請求項１０に記載の黒真珠貝の繁殖量を予測する方法。
【請求項１】
配列番号１で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項２】
配列番号２で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項３】
配列番号３で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項４】
配列番号４で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項５】
配列番号５で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項６】
配列番号６で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項７】
配列番号７で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項８】
配列番号８で表示される黒真珠貝卵抽出物の抗原タンパク質。
【請求項９】
請求項１乃至８のうちの何れか一項における抗原タンパク質に特異的な抗体。
【請求項１０】
（ｉ）請求項９の抗体を利用した抗原抗体反応によって黒真珠貝の卵タンパク質量を定量する段階；及び
（ｉｉ）段階（ｉ）で定量した黒真珠貝の卵タンパク質量と実際量との標準曲線から実際の黒真珠貝の卵タンパク質量を推定する段階；を含む、黒真珠貝の繁殖量を予測する方法。
【請求項１１】
上記抗原抗体反応の測定には酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることを特徴とする、請求項１０に記載の黒真珠貝の繁殖量を予測する方法。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２４８１９０（Ｐ２０１０−２４８１９０Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９２１２９（Ｐ２０１０−９２１２９）
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【出願人】（５０９１９０６４６）コリア オーシャン リサーチ アンド ディベロプメント インスティチュート (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【出願人】（５０９１９０６４６）コリア オーシャン リサーチ アンド ディベロプメント インスティチュート (2)
【Ｆターム（参考）】
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