％ＣＤＴの定量方法
【課題】総トランスフェリンに対する炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）の割合（％ＣＤＴ）を簡易に直接定量するための免疫測定方法を提供する。
【解決手段】トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法である。得られた測定値は％ＣＤＴに正比例する。トランスフェリンを非特異的に選択する時にトランスフェリンが過剰量になるような条件で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【解決手段】トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法である。得られた測定値は％ＣＤＴに正比例する。トランスフェリンを非特異的に選択する時にトランスフェリンが過剰量になるような条件で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール中毒患者を同定することができる簡易な免疫測定方法を行うための総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール中毒は、アルコール中毒患者とかれらの関係者に多大の損害をもたらすばかりか、アルコール中毒に関連する生産性の損失及び莫大な年間健康管理費用をもたらす。従って、アルコール中毒への早期認識と治療とが個人及び社会にとって最善且つ費用効果的である。このような状況下において、高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからない検査方法が必要である。
【０００３】
例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、平均血球容積(mean corpuscular volume) （ＭＣＶ）、アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、α−リポタンパク質及びフェリチンのような臨床検査項目が、アルコール乱用の生化学的マーカーとして多年にわたって用いられてきたが、これらの検査の診断的感度及び特異性は満足のいくものではなかった。
【０００４】
Stibler らは、トランスフェリンの中で高い等電点を持つアイソフォームが１週間以上にわたって毎日６０ｇ以上のエタノールを摂取した者の８１％で増加し、１０日以上にわたって禁酒する場合に高い等電点を持つアイソフォームが正常レベルに戻ることを報告している(Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979) ：非特許文献１）。
【０００５】
血清トランスフェリンは、７９．５ｋＤの分子量を有し、二つのＮ−連結の多糖鎖を有する一本のポリペプチド鎖から成る糖タンパクである。これらの多糖鎖は、分岐状であり、かつ末端シアル酸残基を有している。Wongおよび Regoeczi は、Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977) （非特許文献２）において、ヒトトランスフェリンは天然ではシアル化のレベルにより種々のアイソフォームが存在すると述べている。事実、6 種のアイソフォームとしてペンタシアロ、テトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェリンが存在する。
【０００６】
正常な健康個体に比べて、アルコール中毒患者の血液中には、アシアロ、モノシアロ、ジシアロトランスフェリンが上昇したレベルで存在することが見出されている (van Eijk et al, Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983) ：非特許文献３、Stibler, Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991) ：非特許文献４、および Stibler et al, "Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum as a marker of high alcohol consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al), Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357 )：非特許文献５）。
【０００７】
アシアロ、モノシアロ及びジシアロトランスフェリンは、炭水化物（糖鎖）欠損トランスフェリン（略語：ＣＤＴ）と呼ばれており、ＣＤＴを測定する方法としては、免疫学的検査法（ＷＯ−９６／２６４４４：特許文献１、および Heil et al 、Anaesthesist, 43, 447-453,(1994)：非特許文献６等）や、高速液体クロマト法（ＷＯ９５／０４９３２：特許文献２）が用いられている。
【０００８】
前記免疫学的検査法には、アニオン性イオン交換樹脂でＣＤＴ分画を分離した後、免疫比濁法 (immunoturbidimetric assay)等によって測定する方法や、ＣＤＴ特異抗体を用いた競合ラテックス凝集法（特開２００４−０５１６３３：特許文献３）が挙げられる。前記免疫学的検査法により総トランスフェリンに対する炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）の割合（％ＣＤＴ）を定量するには、該検査法で得られたＣＤＴ濃度と、総トランスフェリン濃度から％ＣＤＴを算出している。また、前記高速液体クロマト法により％ＣＤＴを定量するには、該方法で得られたＣＤＴ濃度と、総トランスフェリン濃度から％ＣＤＴを算出している。
【特許文献１】ＷＯ−９６／２６４４４
【特許文献２】ＷＯ９５／０４９３２
【特許文献３】特開２００４−０５１６３３
【非特許文献１】Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979 ）
【非特許文献２】Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977)
【非特許文献３】Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983)
【非特許文献４】Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991)
【非特許文献５】Advances in the Biosciences, Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357
【非特許文献６】Anaesthesist, 43, 447-453, (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記従来の免疫学的検査法や、前記高速液体クロマト法による、総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（即ち、％ＣＤＴ）の定量において、何れもＣＤＴの測定に加えて総トランスフェリンの測定をそれぞれ行うことで、％ＣＤＴを算出するというプロセスが行われていた。
【００１０】
そこで本発明は、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる％ＣＤＴの定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記した課題を解決する本発明の％ＣＤＴの定量方法は、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法である。
【００１２】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、「トランスフェリンのアイソフォームに対して非特異的に反応する物質Ａ」とは、トランスフェリンの特定のアイソフォームだけに特異的に反応する物質ではない意味で用いている。
【００１３】
前記トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａには、抗トランスフェリン抗体が挙げられる。また、前記ＣＤＴに対して特異的に反応する物質ＢにはＣＤＴ特異抗体が挙げられる。
【００１４】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａにより体液中のトランスフェリンを非特異的に選択する時に、トランスフェリンが過剰量になるような条件下で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、しかも総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【００１５】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法に適用可能な方法は、不均一系測定方法であり、例えば、ＣＤＴに対して特異的に反応する物質Ｂ（即ち、ＣＤＴ特異抗体）を標識化する場合は放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法等が挙げられる。或いは、ＣＤＴ特異抗体を標識化しなくても、質量変化等により直接測定することは可能である。本発明の％ＣＤＴを定量する方法は不均一系であれば、如何なる反応形式で行われてもよい。これらの定量方法は用手法あるいは自動化されてもよい。
【００１６】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法に用いられる試薬の一つは、体液中のＣＤＴの検出または定量化を可能にするために、標識化される必要があるが、それらの標識物質については公知のものを使用してもよく、例えば、以下のものが挙げられる。
【００１７】
１）酵素：アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等
２）蛍光体：フルオレセインイソシアネート、ローダミン、テキサスレッド等
３）放射性同位体元素：Ｉ125 、Ｉ131 等
４）生物発光体：ルシフェリン、エクオリン等
５）化学発光体：イソルミノール、アクリジニウムエステル、オキサレートエステル等 所望の試薬へのこれらの標識体の結合は、公知の技術を用いて行うことができる。
【００１８】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応によりサンドイッチ複合体を形成することにより％ＣＤＴを定量することができる。
【００１９】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法を行う好ましい態様は、前記物質Ａを固相に結合させて行うことである。前記物質Ａを固相化する場合、抗体の固相化に用いる担体の材質及び形状は、測定用途によって公知のものから選択できる。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ガラス、アガロース、ニトロセルロース等が挙げられる。形状としては、マイクロタイタープレート、バイアル、ラテックスビーズ、ディップストリップ等が挙げられる。
【００２０】
測定法の％ＣＤＴを定量する好ましい方法は、（１）前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応により形成された種々のアイソフォームの複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値と、％ＣＤＴとの検量線を予め作成しておき、（２）体液中のトランスフェリンのアイソフォームに対して、前記物質Ａ及び物質Ｂを反応させることにより種々のアイソフォームの複合体を形成し、（３）形成された複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値を測定し、（４）前記工程で得たＣＤＴの量に依存して測定される値と、前記予め作成した検量線とから、％ＣＤＴを算出する方法である。
【００２１】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法により得られた、ＣＤＴの量に依存して測定される値は、％ＣＤＴに正比例する。該ＣＤＴの量に依存して測定される値は、例えば、吸光度、蛍光強度、発光強度、放射能等が挙げられる。
【００２２】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法に用いるのに適した物質Ａは、好ましくはトランスフェリンに対する抗体が挙げられる。特に好ましい抗体は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ０７６（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）から産生される抗体である。
【００２３】
本発明の免疫測定法に用いるのに適した物質Ｂは、ＣＤＴ特異抗体が挙げられ、ＣＤＴ以外のトランスフェリンアイソフォームに対してＣＤＴ分画に選択的に反応するものであればよい。特に好ましいＣＤＴ特異抗体は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４４）から産生される抗体である。
【００２４】
トランスフェリンに対する抗体やＣＤＴ特異抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、抗血清またはその精製分画、あるいは既知のイソタイプまたはサブクラスでもよい。更には、必要に応じて抗原と結合できる抗体フラグメントであってもよい。
【００２５】
本発明の免疫測定方法の対象となる体液は、血清、血漿、唾液またはその他の体液であってもよいが、血清であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のＣＤＴの定量方法によれば、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができることから、アルコール中毒患者を簡単な手法で、精度よく同定することが可能となる。
【００２７】
本発明のＣＤＴの定量方法によれば、体液中のトランスフェリンを非特異的に選択する時に、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質に対して、トランスフェリンが過剰量になるような条件下で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明を実施例及び添付した図を参照して詳述する。
【００２９】
［実施例１］ 抗体産生のハイブリドーマの作製
天然のジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンが混合された状態で含まれるＣＤＴ分画（抗原溶液 ０．５ｍｇ／ｍｌ）を調製し、免疫抗原とした。該抗原溶液５００μｌにアジュバンド５００μｌ（ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ：商品名、 ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｃｏ．）を混和して乳化させ、５週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に免疫した。追加免疫として同様に調製したものを２週おきに３回繰り返した。その間免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から１４日後に１００μｌの抗原溶液を腹腔内に投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール４０００（メルク社製）の存在下で２分間反応させることにより融合させた。融合後、ＨＡＴ選択培地に懸濁して９６ウェルの培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ2 インキュベーターで培養し、ハイブリドーマを調製した。
【００３０】
抗体産生ハイブリドーマの確認はサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗マウスＩｇＧ抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行いスクリーニング用のプレートとした。
【００３１】
ハイブリドーマの増殖が認められたウェルの培養上清５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記ＣＤＴ分画を室温で１時間反応させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、該ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＮＣＤＴ５０３）と全てのトランスフェリンアイソフォームに対する抗体活性を持つハイブリドーマ（ＮＣＤＴ０７６）を選抜した。
【００３２】
選抜した２種類のハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、各々樹立株を得た。得られたハイブリドーマＮＣＤＴ５０３及びＮＣＤＴ０７６はそれぞれ特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託された（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）。
【００３３】
［実施例２］ 抗体の調製
前記実施例１で樹立した２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６及びＮＣＤＴ５０３）は、モノクローナル抗体の大量産生のため各々マウス腹腔内にて増殖させた。各マウス腹水中から２種類のモノクローナル抗体を得、プロテインＧカラム（商品名、ＧＥ社製）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００３４】
［実施例３］ 抗体のサブクラスの決定
前記実施例２で得られた２種類の抗体のサブクラスはＩｓｏｓｔｒｉｐ（商品名、ロシュ社製）を使用して決定した。各抗体のサブクラスを下記の表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
［実施例４］ サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例２で調製した２種類の抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、トランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を次のようにして行った。
【００３７】
９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォーム５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さを比較することで抗体の特異性を確認した。選抜したハイブリドーマのトランスフェリンアイソフォームへの反応性の結果を下記の表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
［実施例５］ ウエスタンブロットを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例２で調製した２種類のモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６の産生するモノクローナル抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３の産生するモノクローナル抗体）について、ウエスタンブロットを用いて、トランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を次のようにして行った。また、比較のために、全てのトランスフェリンアイソフォームに反応する抗トランスフェリンポリクローナル抗体（株式会社シバヤギ製）を用いて同様にして確認した。
【００４０】
等電点電気泳動用ゲル（Ｎｏｖｅｘ ＩＥＦゲルｐＨ３−７：商品名、インビトロジェン社製）にＣＤＴ分画、およびＣＤＴ以外のトランスフェリンを１レーンあたり各５μｇになるように専用のサンプルバッファーで希釈後に添加し、専用の泳動バッファーで泳動後、専用のバッファーでＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜はブロックエース（商品名、大日本製薬株式会社製）でブロッキング後、前実施例２で調製した抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製したものと室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間反応させた。再び洗浄後、ＢＣＩＰ、ＮＢＴ試薬で発色させた。
【００４１】
これらの抗体の特異性を示すウエスタンブロットの展開を示す写真を図１に示す。
【００４２】
図１によれば、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６の産生するモノクローナル抗体はトランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応し、また、ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３の産生するモノクローナル抗体は、ＣＤＴ特異抗体であることがわかる。
【００４３】
［実施例６］ 固相化プレートの作製
前記実施例２で得た全てのトランスフェリンアイソフォームに抗体活性を示す抗体（ＮＣＤＴ０７６）をサンドイッチＥＬＩＳＡ用のプレートに次のように固定化した。
【００４４】
９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ１００μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。
【００４５】
［実施例７］ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体の調製
前記実施例２で得たＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体（ＮＣＤＴ５０３）に対してＡＬＰ−ｌa ｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ−ＮＨ２（商品名、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いてアルカリホスファターゼ標識を行った。
【００４６】
［実施例８］ 検体希釈率の設定
前記実施例６で作製した固相化プレートに、鉄飽和したアルコール中毒患者血清の希釈サンプル（１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、２５６０、５１２０、１０２４０、２０４８０倍希釈）を作製し、各１００μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例７で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、固相化プレートに結合されたサンドイッチ免疫複合体のアルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、検体希釈倍率の飽和領域を調べた。その結果を横軸に検体希釈倍率、縦軸に吸光度をとったグラフにして図２に示す。
【００４７】
図２のグラフに示すように検体希釈倍率１００倍以下が飽和領域であることがわかる。
【００４８】
さらに％ＣＤＴが２．５％から６．５％までの検体を用いて検体希釈倍率２５倍、５０倍、１００倍、２００倍の４種類の場合の吸光度の測定値の変動を上記と同様な方法で確認した結果を横軸に％ＣＤＴ、縦軸に吸光度をとったグラフにして図３に示す。図３のグラフに示すように％ＣＤＴに関係なく検体希釈倍率２５倍から２００倍の間の吸光度の測定値の変動は認められなかった。これにより、以下の実施例において検体希釈倍率を５０倍に設定した。
【００４９】
［実施例９］ 標識抗体希釈率の設定
前記実施例６で作製した固相化プレートに鉄飽和し、５０倍希釈した健常者血清とアルコール中毒患者血清を１００μｌウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体の希釈液（５００倍からの２倍希釈系列）を１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を横軸に標識抗体希釈率、縦軸に吸光度をとったグラフにして図４に示す。図４のグラフに示すように健常者血清とアルコール中毒患者血清の各測定値の差が顕著に認められる範囲、標識抗体希釈率が１００００倍以内、好ましくは、５０００倍以内、さらに好ましくは１０００倍以内、最も好ましくは５００倍以内であることから、以下の実施例で標識抗体希釈率５００倍を選択した。
【００５０】
［実施例１０］ ％ＣＤＴ標準溶液の作製と吸光度（ＯＤ）
％ＣＤＴが高い検体と低い検体を組み合わせて、人為的に％ＣＤＴが０から１２．７％まで漸増する各値を持つ８種類の標準溶液を調製した。得られた８種類の％ＣＤＴの標準溶液を前記実施例６で作製した固相化プレートに５０倍希釈で１００μｌ ウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例５の設定倍率で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、測定レンジの確認を行った。その結果を横軸に％ＣＤＴ、縦軸に吸光度をとったグラフにして図５に示す。図５のグラフに示すように％ＣＤＴの低値（０％）から高値（１２％）までは直線的に％ＣＤＴと吸光度は正比例しているので、図５のグラフは％ＣＤＴが０％−１２％の範囲で検量線として使用できることがわかる。
【００５１】
〔実施例１１］ 検体の測定
前記実施例８、９で示した設定することができる検体希釈率（５０倍）と標識抗体希釈率（５００倍）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで健常者とアルコール中毒患者の血清合計４０検体の吸光度を次のようにして測定した。
【００５２】
鉄飽和した血清４０検体を５０倍希釈した後、固相化プレートのウェルに１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例５の設定倍率（５００倍）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記実施例１０で作製した、検量線（図５）を用いて、前記工程で得られた各検体の吸光度から％ＣＤＴを算出した。
【００５３】
また、対照試験としてバイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製の試薬を用い、前記工程で得た各検体の％ＣＤＴとバイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製の試薬の％ＣＤＴを最小二乗法による回帰分析を行い、相関係数と回帰式を求めた。得られた相関図を図６のグラフに示す。
【００５４】
回帰式ｙ＝１．１４８ｘ−０．９３８ 式（１）
相関係数Ｒ＝０．９７９
なお、該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の％ＣＤＴを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後のＣＤＴの量を測定し、検体中のＣＤＴ濃度と％ＣＤＴを算出したものである。図６に示すようにサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した本発明の％ＣＤＴの測定値は、バイオラッド社製の試薬を用いた方法による％ＣＤＴの測定値と非常に強い正の相関が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法は、体液中のトランスフェリンの全てのアイソフォームに対して非特異的に選択し、さらにその中の炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）を選択性が高い抗体を用いて測定しているので、得られた測定値は％ＣＤＴに正比例する。したがって、本発明の方法により得られた％ＣＤＴは、高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからないアルコール中毒患者を同定するための検査方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２で調製した２種類のモノクローナル抗体の特異性を示すウエスタンブロットを示す写真である。
【図２】固相化プレートに結合されたサンドイッチ免疫複合体のアルカリフォスファターゼ活性を示す吸光度と、検体希釈倍率の関係を示すグラフである。
【図３】検体希釈倍率が４種類の場合の％ＣＤＴと吸光度の関係を示すグラフである。
【図４】健常者血清とアルコール中毒患者血清について、標識抗体希釈倍率と吸光度の関係を示すグラフである。
【図５】８種類の％ＣＤＴの標準溶液を用いた％ＣＤＴと吸光度の関係を示すグラフである。
【図６】健常者とアルコール中毒患者の血清合計４０検体についてサンドイッチＥＬＩＳＡの％ＣＤＴと対照試験（バイオラッド）％ＣＤＴの相関を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール中毒患者を同定することができる簡易な免疫測定方法を行うための総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール中毒は、アルコール中毒患者とかれらの関係者に多大の損害をもたらすばかりか、アルコール中毒に関連する生産性の損失及び莫大な年間健康管理費用をもたらす。従って、アルコール中毒への早期認識と治療とが個人及び社会にとって最善且つ費用効果的である。このような状況下において、高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからない検査方法が必要である。
【０００３】
例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、平均血球容積(mean corpuscular volume) （ＭＣＶ）、アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、α−リポタンパク質及びフェリチンのような臨床検査項目が、アルコール乱用の生化学的マーカーとして多年にわたって用いられてきたが、これらの検査の診断的感度及び特異性は満足のいくものではなかった。
【０００４】
Stibler らは、トランスフェリンの中で高い等電点を持つアイソフォームが１週間以上にわたって毎日６０ｇ以上のエタノールを摂取した者の８１％で増加し、１０日以上にわたって禁酒する場合に高い等電点を持つアイソフォームが正常レベルに戻ることを報告している(Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979) ：非特許文献１）。
【０００５】
血清トランスフェリンは、７９．５ｋＤの分子量を有し、二つのＮ−連結の多糖鎖を有する一本のポリペプチド鎖から成る糖タンパクである。これらの多糖鎖は、分岐状であり、かつ末端シアル酸残基を有している。Wongおよび Regoeczi は、Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977) （非特許文献２）において、ヒトトランスフェリンは天然ではシアル化のレベルにより種々のアイソフォームが存在すると述べている。事実、6 種のアイソフォームとしてペンタシアロ、テトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェリンが存在する。
【０００６】
正常な健康個体に比べて、アルコール中毒患者の血液中には、アシアロ、モノシアロ、ジシアロトランスフェリンが上昇したレベルで存在することが見出されている (van Eijk et al, Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983) ：非特許文献３、Stibler, Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991) ：非特許文献４、および Stibler et al, "Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum as a marker of high alcohol consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al), Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357 )：非特許文献５）。
【０００７】
アシアロ、モノシアロ及びジシアロトランスフェリンは、炭水化物（糖鎖）欠損トランスフェリン（略語：ＣＤＴ）と呼ばれており、ＣＤＴを測定する方法としては、免疫学的検査法（ＷＯ−９６／２６４４４：特許文献１、および Heil et al 、Anaesthesist, 43, 447-453,(1994)：非特許文献６等）や、高速液体クロマト法（ＷＯ９５／０４９３２：特許文献２）が用いられている。
【０００８】
前記免疫学的検査法には、アニオン性イオン交換樹脂でＣＤＴ分画を分離した後、免疫比濁法 (immunoturbidimetric assay)等によって測定する方法や、ＣＤＴ特異抗体を用いた競合ラテックス凝集法（特開２００４−０５１６３３：特許文献３）が挙げられる。前記免疫学的検査法により総トランスフェリンに対する炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）の割合（％ＣＤＴ）を定量するには、該検査法で得られたＣＤＴ濃度と、総トランスフェリン濃度から％ＣＤＴを算出している。また、前記高速液体クロマト法により％ＣＤＴを定量するには、該方法で得られたＣＤＴ濃度と、総トランスフェリン濃度から％ＣＤＴを算出している。
【特許文献１】ＷＯ−９６／２６４４４
【特許文献２】ＷＯ９５／０４９３２
【特許文献３】特開２００４−０５１６３３
【非特許文献１】Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979 ）
【非特許文献２】Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977)
【非特許文献３】Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983)
【非特許文献４】Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991)
【非特許文献５】Advances in the Biosciences, Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357
【非特許文献６】Anaesthesist, 43, 447-453, (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記従来の免疫学的検査法や、前記高速液体クロマト法による、総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（即ち、％ＣＤＴ）の定量において、何れもＣＤＴの測定に加えて総トランスフェリンの測定をそれぞれ行うことで、％ＣＤＴを算出するというプロセスが行われていた。
【００１０】
そこで本発明は、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる％ＣＤＴの定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記した課題を解決する本発明の％ＣＤＴの定量方法は、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法である。
【００１２】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、「トランスフェリンのアイソフォームに対して非特異的に反応する物質Ａ」とは、トランスフェリンの特定のアイソフォームだけに特異的に反応する物質ではない意味で用いている。
【００１３】
前記トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａには、抗トランスフェリン抗体が挙げられる。また、前記ＣＤＴに対して特異的に反応する物質ＢにはＣＤＴ特異抗体が挙げられる。
【００１４】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａにより体液中のトランスフェリンを非特異的に選択する時に、トランスフェリンが過剰量になるような条件下で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、しかも総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【００１５】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法に適用可能な方法は、不均一系測定方法であり、例えば、ＣＤＴに対して特異的に反応する物質Ｂ（即ち、ＣＤＴ特異抗体）を標識化する場合は放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法等が挙げられる。或いは、ＣＤＴ特異抗体を標識化しなくても、質量変化等により直接測定することは可能である。本発明の％ＣＤＴを定量する方法は不均一系であれば、如何なる反応形式で行われてもよい。これらの定量方法は用手法あるいは自動化されてもよい。
【００１６】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法に用いられる試薬の一つは、体液中のＣＤＴの検出または定量化を可能にするために、標識化される必要があるが、それらの標識物質については公知のものを使用してもよく、例えば、以下のものが挙げられる。
【００１７】
１）酵素：アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等
２）蛍光体：フルオレセインイソシアネート、ローダミン、テキサスレッド等
３）放射性同位体元素：Ｉ125 、Ｉ131 等
４）生物発光体：ルシフェリン、エクオリン等
５）化学発光体：イソルミノール、アクリジニウムエステル、オキサレートエステル等 所望の試薬へのこれらの標識体の結合は、公知の技術を用いて行うことができる。
【００１８】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法において、前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応によりサンドイッチ複合体を形成することにより％ＣＤＴを定量することができる。
【００１９】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法を行う好ましい態様は、前記物質Ａを固相に結合させて行うことである。前記物質Ａを固相化する場合、抗体の固相化に用いる担体の材質及び形状は、測定用途によって公知のものから選択できる。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ガラス、アガロース、ニトロセルロース等が挙げられる。形状としては、マイクロタイタープレート、バイアル、ラテックスビーズ、ディップストリップ等が挙げられる。
【００２０】
測定法の％ＣＤＴを定量する好ましい方法は、（１）前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応により形成された種々のアイソフォームの複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値と、％ＣＤＴとの検量線を予め作成しておき、（２）体液中のトランスフェリンのアイソフォームに対して、前記物質Ａ及び物質Ｂを反応させることにより種々のアイソフォームの複合体を形成し、（３）形成された複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値を測定し、（４）前記工程で得たＣＤＴの量に依存して測定される値と、前記予め作成した検量線とから、％ＣＤＴを算出する方法である。
【００２１】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法により得られた、ＣＤＴの量に依存して測定される値は、％ＣＤＴに正比例する。該ＣＤＴの量に依存して測定される値は、例えば、吸光度、蛍光強度、発光強度、放射能等が挙げられる。
【００２２】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法に用いるのに適した物質Ａは、好ましくはトランスフェリンに対する抗体が挙げられる。特に好ましい抗体は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ０７６（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）から産生される抗体である。
【００２３】
本発明の免疫測定法に用いるのに適した物質Ｂは、ＣＤＴ特異抗体が挙げられ、ＣＤＴ以外のトランスフェリンアイソフォームに対してＣＤＴ分画に選択的に反応するものであればよい。特に好ましいＣＤＴ特異抗体は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４４）から産生される抗体である。
【００２４】
トランスフェリンに対する抗体やＣＤＴ特異抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、抗血清またはその精製分画、あるいは既知のイソタイプまたはサブクラスでもよい。更には、必要に応じて抗原と結合できる抗体フラグメントであってもよい。
【００２５】
本発明の免疫測定方法の対象となる体液は、血清、血漿、唾液またはその他の体液であってもよいが、血清であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のＣＤＴの定量方法によれば、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができることから、アルコール中毒患者を簡単な手法で、精度よく同定することが可能となる。
【００２７】
本発明のＣＤＴの定量方法によれば、体液中のトランスフェリンを非特異的に選択する時に、トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質に対して、トランスフェリンが過剰量になるような条件下で行うことで、各体液中のトランスフェリンの変動による影響を受けず、総トランスフェリンの測定を行う必要がなく、直接％ＣＤＴを測定することができる。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明を実施例及び添付した図を参照して詳述する。
【００２９】
［実施例１］ 抗体産生のハイブリドーマの作製
天然のジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンが混合された状態で含まれるＣＤＴ分画（抗原溶液 ０．５ｍｇ／ｍｌ）を調製し、免疫抗原とした。該抗原溶液５００μｌにアジュバンド５００μｌ（ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ：商品名、 ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｃｏ．）を混和して乳化させ、５週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に免疫した。追加免疫として同様に調製したものを２週おきに３回繰り返した。その間免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から１４日後に１００μｌの抗原溶液を腹腔内に投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール４０００（メルク社製）の存在下で２分間反応させることにより融合させた。融合後、ＨＡＴ選択培地に懸濁して９６ウェルの培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ2 インキュベーターで培養し、ハイブリドーマを調製した。
【００３０】
抗体産生ハイブリドーマの確認はサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗マウスＩｇＧ抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行いスクリーニング用のプレートとした。
【００３１】
ハイブリドーマの増殖が認められたウェルの培養上清５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記ＣＤＴ分画を室温で１時間反応させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、該ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＮＣＤＴ５０３）と全てのトランスフェリンアイソフォームに対する抗体活性を持つハイブリドーマ（ＮＣＤＴ０７６）を選抜した。
【００３２】
選抜した２種類のハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、各々樹立株を得た。得られたハイブリドーマＮＣＤＴ５０３及びＮＣＤＴ０７６はそれぞれ特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託された（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）。
【００３３】
［実施例２］ 抗体の調製
前記実施例１で樹立した２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６及びＮＣＤＴ５０３）は、モノクローナル抗体の大量産生のため各々マウス腹腔内にて増殖させた。各マウス腹水中から２種類のモノクローナル抗体を得、プロテインＧカラム（商品名、ＧＥ社製）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００３４】
［実施例３］ 抗体のサブクラスの決定
前記実施例２で得られた２種類の抗体のサブクラスはＩｓｏｓｔｒｉｐ（商品名、ロシュ社製）を使用して決定した。各抗体のサブクラスを下記の表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
［実施例４］ サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例２で調製した２種類の抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、トランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を次のようにして行った。
【００３７】
９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォーム５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さを比較することで抗体の特異性を確認した。選抜したハイブリドーマのトランスフェリンアイソフォームへの反応性の結果を下記の表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
［実施例５］ ウエスタンブロットを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例２で調製した２種類のモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６の産生するモノクローナル抗体及びハイブリドーマＮＣＤＴ５０３の産生するモノクローナル抗体）について、ウエスタンブロットを用いて、トランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を次のようにして行った。また、比較のために、全てのトランスフェリンアイソフォームに反応する抗トランスフェリンポリクローナル抗体（株式会社シバヤギ製）を用いて同様にして確認した。
【００４０】
等電点電気泳動用ゲル（Ｎｏｖｅｘ ＩＥＦゲルｐＨ３−７：商品名、インビトロジェン社製）にＣＤＴ分画、およびＣＤＴ以外のトランスフェリンを１レーンあたり各５μｇになるように専用のサンプルバッファーで希釈後に添加し、専用の泳動バッファーで泳動後、専用のバッファーでＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜はブロックエース（商品名、大日本製薬株式会社製）でブロッキング後、前実施例２で調製した抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製したものと室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間反応させた。再び洗浄後、ＢＣＩＰ、ＮＢＴ試薬で発色させた。
【００４１】
これらの抗体の特異性を示すウエスタンブロットの展開を示す写真を図１に示す。
【００４２】
図１によれば、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６の産生するモノクローナル抗体はトランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応し、また、ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３の産生するモノクローナル抗体は、ＣＤＴ特異抗体であることがわかる。
【００４３】
［実施例６］ 固相化プレートの作製
前記実施例２で得た全てのトランスフェリンアイソフォームに抗体活性を示す抗体（ＮＣＤＴ０７６）をサンドイッチＥＬＩＳＡ用のプレートに次のように固定化した。
【００４４】
９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ１００μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。
【００４５】
［実施例７］ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体の調製
前記実施例２で得たＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体（ＮＣＤＴ５０３）に対してＡＬＰ−ｌa ｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ−ＮＨ２（商品名、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いてアルカリホスファターゼ標識を行った。
【００４６】
［実施例８］ 検体希釈率の設定
前記実施例６で作製した固相化プレートに、鉄飽和したアルコール中毒患者血清の希釈サンプル（１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、２５６０、５１２０、１０２４０、２０４８０倍希釈）を作製し、各１００μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例７で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、固相化プレートに結合されたサンドイッチ免疫複合体のアルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、検体希釈倍率の飽和領域を調べた。その結果を横軸に検体希釈倍率、縦軸に吸光度をとったグラフにして図２に示す。
【００４７】
図２のグラフに示すように検体希釈倍率１００倍以下が飽和領域であることがわかる。
【００４８】
さらに％ＣＤＴが２．５％から６．５％までの検体を用いて検体希釈倍率２５倍、５０倍、１００倍、２００倍の４種類の場合の吸光度の測定値の変動を上記と同様な方法で確認した結果を横軸に％ＣＤＴ、縦軸に吸光度をとったグラフにして図３に示す。図３のグラフに示すように％ＣＤＴに関係なく検体希釈倍率２５倍から２００倍の間の吸光度の測定値の変動は認められなかった。これにより、以下の実施例において検体希釈倍率を５０倍に設定した。
【００４９】
［実施例９］ 標識抗体希釈率の設定
前記実施例６で作製した固相化プレートに鉄飽和し、５０倍希釈した健常者血清とアルコール中毒患者血清を１００μｌウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体の希釈液（５００倍からの２倍希釈系列）を１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を横軸に標識抗体希釈率、縦軸に吸光度をとったグラフにして図４に示す。図４のグラフに示すように健常者血清とアルコール中毒患者血清の各測定値の差が顕著に認められる範囲、標識抗体希釈率が１００００倍以内、好ましくは、５０００倍以内、さらに好ましくは１０００倍以内、最も好ましくは５００倍以内であることから、以下の実施例で標識抗体希釈率５００倍を選択した。
【００５０】
［実施例１０］ ％ＣＤＴ標準溶液の作製と吸光度（ＯＤ）
％ＣＤＴが高い検体と低い検体を組み合わせて、人為的に％ＣＤＴが０から１２．７％まで漸増する各値を持つ８種類の標準溶液を調製した。得られた８種類の％ＣＤＴの標準溶液を前記実施例６で作製した固相化プレートに５０倍希釈で１００μｌ ウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例５の設定倍率で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、測定レンジの確認を行った。その結果を横軸に％ＣＤＴ、縦軸に吸光度をとったグラフにして図５に示す。図５のグラフに示すように％ＣＤＴの低値（０％）から高値（１２％）までは直線的に％ＣＤＴと吸光度は正比例しているので、図５のグラフは％ＣＤＴが０％−１２％の範囲で検量線として使用できることがわかる。
【００５１】
〔実施例１１］ 検体の測定
前記実施例８、９で示した設定することができる検体希釈率（５０倍）と標識抗体希釈率（５００倍）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで健常者とアルコール中毒患者の血清合計４０検体の吸光度を次のようにして測定した。
【００５２】
鉄飽和した血清４０検体を５０倍希釈した後、固相化プレートのウェルに１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例５の設定倍率（５００倍）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ＣＤＴ抗体１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記実施例１０で作製した、検量線（図５）を用いて、前記工程で得られた各検体の吸光度から％ＣＤＴを算出した。
【００５３】
また、対照試験としてバイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製の試薬を用い、前記工程で得た各検体の％ＣＤＴとバイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製の試薬の％ＣＤＴを最小二乗法による回帰分析を行い、相関係数と回帰式を求めた。得られた相関図を図６のグラフに示す。
【００５４】
回帰式ｙ＝１．１４８ｘ−０．９３８ 式（１）
相関係数Ｒ＝０．９７９
なお、該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の％ＣＤＴを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後のＣＤＴの量を測定し、検体中のＣＤＴ濃度と％ＣＤＴを算出したものである。図６に示すようにサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した本発明の％ＣＤＴの測定値は、バイオラッド社製の試薬を用いた方法による％ＣＤＴの測定値と非常に強い正の相関が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の％ＣＤＴを定量する方法は、体液中のトランスフェリンの全てのアイソフォームに対して非特異的に選択し、さらにその中の炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）を選択性が高い抗体を用いて測定しているので、得られた測定値は％ＣＤＴに正比例する。したがって、本発明の方法により得られた％ＣＤＴは、高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからないアルコール中毒患者を同定するための検査方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２で調製した２種類のモノクローナル抗体の特異性を示すウエスタンブロットを示す写真である。
【図２】固相化プレートに結合されたサンドイッチ免疫複合体のアルカリフォスファターゼ活性を示す吸光度と、検体希釈倍率の関係を示すグラフである。
【図３】検体希釈倍率が４種類の場合の％ＣＤＴと吸光度の関係を示すグラフである。
【図４】健常者血清とアルコール中毒患者血清について、標識抗体希釈倍率と吸光度の関係を示すグラフである。
【図５】８種類の％ＣＤＴの標準溶液を用いた％ＣＤＴと吸光度の関係を示すグラフである。
【図６】健常者とアルコール中毒患者の血清合計４０検体についてサンドイッチＥＬＩＳＡの％ＣＤＴと対照試験（バイオラッド）％ＣＤＴの相関を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、
該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法。
【請求項２】
前記物質Ａの量に対して、体液中のトランスフェリンのアイソフォームを過剰量になる条件下で行う、請求項１記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項３】
前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応によりサンドイッチ複合体を形成する、請求項１又は２記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項４】
前記物質Ｂは標識化されている請求項１−３の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項５】
前記物質Ａを固相に結合させて行う、請求項１−４の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項６】
（１）前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応により形成された種々のアイソフォームの複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値と、％ＣＤＴとの検量線を予め作成しておき、
（２）体液中のトランスフェリンのアイソフォームに対して、前記物質Ａ及び物質Ｂを反応させることにより種々のアイソフォームの複合体を形成し、
（３）形成された複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値を測定し、
（４）前記工程で得たＣＤＴの量に依存して測定される値と、前記予め作成した検量線とから、％ＣＤＴを算出する請求項１−５の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項７】
前記ＣＤＴの量に依存して測定される値は、吸光度である請求項１−６の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項８】
前記トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質が抗トランスフェリン抗体である請求項１−７の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項９】
前記ＣＤＴに対して特異的に反応する物質がＣＤＴ特異抗体である請求項１−７の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項１０】
前記抗トランスフェリン抗体が、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）の産生するモノクローナル抗体である請求項８に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項１】
トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質Ａと、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に特異的に反応する物質Ｂとを用い、
該物質Ａにより体液中のトランスフェリンのアイソフォームを非特異的に選択し、且つ、該物質ＢによりＣＤＴを特異的に選択することにより、体液中の総トランスフェリンの量を測定することなく総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合（％ＣＤＴ）を定量する方法。
【請求項２】
前記物質Ａの量に対して、体液中のトランスフェリンのアイソフォームを過剰量になる条件下で行う、請求項１記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項３】
前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応によりサンドイッチ複合体を形成する、請求項１又は２記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項４】
前記物質Ｂは標識化されている請求項１−３の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項５】
前記物質Ａを固相に結合させて行う、請求項１−４の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項６】
（１）前記物質Ａと、トランスフェリンのアイソフォームと、物質Ｂの反応により形成された種々のアイソフォームの複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値と、％ＣＤＴとの検量線を予め作成しておき、
（２）体液中のトランスフェリンのアイソフォームに対して、前記物質Ａ及び物質Ｂを反応させることにより種々のアイソフォームの複合体を形成し、
（３）形成された複合体におけるＣＤＴの量に依存して測定される値を測定し、
（４）前記工程で得たＣＤＴの量に依存して測定される値と、前記予め作成した検量線とから、％ＣＤＴを算出する請求項１−５の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項７】
前記ＣＤＴの量に依存して測定される値は、吸光度である請求項１−６の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項８】
前記トランスフェリンのアイソフォームに非特異的に反応する物質が抗トランスフェリン抗体である請求項１−７の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項９】
前記ＣＤＴに対して特異的に反応する物質がＣＤＴ特異抗体である請求項１−７の何れか１項に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【請求項１０】
前記抗トランスフェリン抗体が、ハイブリドーマＮＣＤＴ０７６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８４２）の産生するモノクローナル抗体である請求項８に記載の％ＣＤＴを定量する方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【公開番号】特開２００７−２５６２１６（Ｐ２００７−２５６２１６Ａ）
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８４３０５（Ｐ２００６−８４３０５）
【出願日】平成１８年３月２５日（２００６．３．２５）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２５日（２００６．３．２５）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
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