２−ヒドロキシイソ酪酸産生組み換え細胞
本発明の主題は、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明の主題は、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞である。
【０００２】
先行技術
メタクリル酸、そのエステル及びポリマーはアクリルガラス板、射出成形生成物、コーティング及び他の種々の製品の製造の際に幅広く適用される。
【０００３】
メタクリル酸の製造方法の多くが知られている。但し、この商業的な製造のうち世界最大の部分は、メタクリル酸のアミドスルファートの加水分解のための化学的方法を基礎とし、これはこの相応する２−ヒドロキシニトリルから製造され、その際約１．６ｋｇの硫酸が１ｋｇのメタクリル酸の製造のために必要とされる。
【０００４】
メタクリル酸への２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＩＢ）の化学的変換は９６％までの収率でもってUS 3,666,805及びUS 5,225,594に記載されている。
【０００５】
メタクリル酸の代替的な製造方法は、ニトリル加水分解性酵素の利用下での２−ヒドロキシニトリルから２−ヒドロキシイソ酪酸への加水分解により生じる。この場合に、前記酵素は、ニトリラーゼ又はニトリル−ヒドラターゼとアミダーゼとからの組み合わせ物である（A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60:3344及びUS 6,582,943）。この方法の重大な欠点は、効率的なニトリル加水分解性酵素活性のために必要な中性のｐＨ範囲内におけるニトリルの不安定性である。反応混合物中でのニトリルの分解はケトン及びシアニドの蓄積を招き、これらは共にニトリル加水分解性酵素活性を阻害する。
【０００６】
両者の方法、即ち、現在支配的であるアミド−スルファートをベースとする方法及び酵素によるニトリル加水分解法の一般的な欠点は、２−ヒドロキシニトリルが必要であることである。２−ヒドロキシニトリルはまず、環境に有害な出発物質、即ちケトン及びシアニドから製造されねばならない。
【０００７】
酵素による、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを分解する物質代謝経路を介した２−ヒドロキシイソ酪酸の代替的な提供方法はCA 2,510, 657から知られている。
【０００８】
更なる、酵素による２−ヒドロキシイソ酪酸の提供方法はPCT/EP2007/052830から知られている。ここでは、ムターゼ ３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ（３−ＨＢＣｏＡ）を用いて予備生成物として２−ヒドロキシ酪酸に変換される。この詳説された方法は以下の欠点を示す：この詳説された方法は不連続的であり、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）は外から出発材料として添加され、この方法条件は不活性ガスを必要とする。この変換率は２０％である。
【０００９】
したがって、この記載の欠点を克服する、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法は有利であろう。
【００１０】
したがって、本発明の課題は、メタクリル酸、そのエステル及びポリマーに更に加工されることができる、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートのための予備生成物についての要求を保証する、２−ヒドロキシイソ酪酸の形成方法を提供することであった。
【００１１】
本発明の説明
意外なことに、アセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを介して予備生成物として、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成が、前述の課題解決に寄与することが見出された。
【００１２】
概念「予備生成物」とは、本願で使用される場合には、単に１の酵素の使用により酵素による経路で所望の生成物へと反応させられることができる化学化合物を定義し、その一方で、概念「中間生成物」とは、少なくとも２の酵素の使用により酵素による経路で所望の生成物へ反応させられることができる化学化合物を定義し、その際、「化学化合物」とは、補酵素Ａ−チオエステル−官能化あり又はなしで等価に見られるべきものであり、したがってチオエステルを形成するか又は開裂する酵素は考慮されない。
【００１３】
したがって、本発明の主題は、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞である。
【００１４】
本発明の更なる一主題は、本発明による細胞の製造方法及び本発明による細胞を用いた２−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法並びにメタクリル酸の製造方法である。
【００１５】
本発明の一利点は、２−ヒドロキシイソ酪酸又はメタクリル酸を再生可能な（nachwachsend）原料から、例えば炭水化物から及び／又はグリセリンから製造できるが、しかし、化石燃料から誘導された原料、例えばメタノールからも製造でき、これにより化石原料の変動する供給性の問題を回避できることである。
【００１６】
本発明の更なる一利点は、本発明による方法ではほとんど熱負荷してない工程を用いて、かつ、一般的に少ない方法工程を用いて、メタクリル酸が得られることができることである。
【００１７】
本発明のまた更なる一利点は、様々な毒性の又は攻撃性の物質の回避であり、これは例えば２−ヒドロキシイソ酪酸の従来の化学的方法において生じる。
【００１８】
本発明は以下において例示的に記載され、この場合に本発明はこの例示的な実施態様に限定されるべきではない。
【００１９】
全ての記載されたパーセント（％）は、他のことが記載されていない場合には、質量パーセントである。
【００２０】
概念「２−ヒドロキシイソ酪酸」とは、本願で使用される場合には、常に、ｐＨ値に依存してこの相応する微生物による形成後に存在する形態にあるこの相応するＣ4−カルボン酸を記載する。したがって、この概念は、常に、純粋な酸形態（２−ヒドロキシイソ酪酸）、純粋な塩基形態（２−ヒドロキシイソブチラート）並びにこの酸のプロトン化及び脱プロトン化した形態を含む。
【００２１】
更に、概念「３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ」は根本的に、（Ｒ）−立体異性もまた同様に（Ｓ）−立体異性も含み、その際（Ｒ）−立体異性は特に好ましい。
【００２２】
「その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成できる」との表現は、この遺伝子工学的に改変された細胞の野生型が全くもって２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成できず、しかし、少なくともこれら化合物の検出可能な量を形成できず、そして、この遺伝子工学的改変により初めてこの成分の検出可能な量が形成されることができる場合も該当する。細胞の「野生型」とは、好ましくは、そのゲノムが進化により自然に発生したような状態にある細胞を指す。この概念は、この全体的な細胞にもまた同様に個々の遺伝子にも使用される。したがって、概念「野生型」とは特に、その遺伝子配列が少なくとも部分的に人的に組み換え方法を用いて改変されているような細胞又はそのような遺伝子には当てはまらない。
【００２３】
この２−ヒドロキシイソ酪酸からは引き続き、慎重な脱水反応によりメタクリル酸が得られることができる。２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの場合には、この細胞中に含まれる、このポリヒドロキシアルカノアートで満たされているグラナが単離され、引き続き、このポリマーが２−ヒドロキシイソ酪酸を取得しながら開裂されることができ、次にこれはメタクリル酸を取得しながら脱水されることができる。
【００２４】
この場合に、本発明により好ましいのは、この遺伝子工学的に改変された細胞が、これが定義された時間間隔において、好ましくは２時間の間、更に一層好ましくは８時間の間、最も好ましくは２４時間の間、この細胞の野生型に比較して少なくとも２倍、特に好ましくは１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更に一層より好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍より多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成するように遺伝子工学的に改変されていることである。この生成物形成の増加はこの場合に、例えば次のように決定されることができる：本発明による細胞及びこの野生型の細胞をそれぞれ別個に同じ条件（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）下で一定の時間間隔にわたり適した栄養培地中で培養させ、引き続き目的生成物（２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアート）に関する量を、２−ヒドロキシイソ酪酸の場合には細胞上清中で、又は、２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの場合には細胞中で決定する。本発明による細胞は原核生物又は真核生物であることができる。この場合に、これは、哺乳動物細胞（例えばヒトからの細胞）、植物細胞又は微生物、例えば酵母、菌類又は細菌であることができ、この場合に微生物が特に好ましく、細菌及び酵母が最も好ましい。
【００２５】
細菌、酵母又は菌類としては特に、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig,ドイツ国、で細菌株、酵母株又は菌株として寄託されている細菌、酵母又は菌類が適する。本発明により適した細菌は、
http : //www. dsmz . de/species/bacteria .htm
で記載の属に属し、本発明により適した酵母は、
http : //www. dsmz . de/species/yeasts .htm
で記載の属に属し、そして、本発明により適した菌類は、
http : //www. dsmz . de/species/fungi .htm
で記載のものである。
【００２６】
本発明により好ましい細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイサイス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）の属のものであり、その際、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、メチロバクテリウム・エキストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、特にラルストニア・ユートロファＨ１６（Ralstonia eutropha H16）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が特に好ましい。
【００２７】
したがって、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを中間生成物としてアセトアセチル−補酵素Ａを介して、そして、予備生成物として３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを介して形成することができる本発明の細胞は、アセトアセチル−補酵素Ａから３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの反応を触媒作用する酵素Ｅ1の活性を有する。
【００２８】
酵素Ｅ1は、好ましくは以下を含む群から選択された酵素である：
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）、
アセトアセチル−補酵素Ａレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）、
長鎖−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（（ＥＣ１．１．１．２１１）及び
３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）。
【００２９】
この酵素は好ましくはphaB、phbB、fabG、phbN1、phbB2又はからなる群から選択された遺伝子によりコードされ、その際がphaB、phbBが特に好ましいこの遺伝子のヌクレオチド配列は例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-データバンク)、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, ドイツ国又はCambridge, UK)のヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００３０】
本発明による細胞にとっては、本発明による細胞がその野生型と比較して酵素Ｅ1の上昇した活性を有することが好ましくあってよく、この酵素はアセトセチル−補酵素Ａの３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００３１】
酵素Ｅ1との関連で前述し、かつ、以下の詳細な説明において酵素Ｅ2等との関連において使用されるとおり、概念「酵素の上昇した活性」とは、好ましくは、上昇した細胞内活性が理解される。
【００３２】
細胞中での酵素活性の向上のための以下の詳細な説明は、酵素Ｅ1の活性の向上のためにもまた同様にその活性が場合により向上させられることができる以下に挙げる酵素全てについても当てはまる。
【００３３】
根本的に、酵素活性の上昇は、この酵素をコードする１の遺伝子配列又は複数の遺伝子配列のコピー数を向上させる、強力なプロモーターを使用する、この遺伝子のコドン利用を改変する、様々な手法でこのｍＲＮＡ又はこの酵素の半値時間を向上させる、この遺伝子の発現の制御を調節するか、又は、上昇した活性でもってこの相応する酵素をコードする遺伝子又はアレルを使用し、かつ、場合により、これら処置を組み合わせることにより達成される。本発明により遺伝子工学的に改変された細胞は例えば、トランスフォーメーション、形質導入、コンジュゲーション又はこれら方法の組み合わせにより、ベクターを用いて生じさせられ、これはこの所望の遺伝子、この遺伝子のアレル又はこの部分及びこの遺伝子の発現を可能にするプロモーターを含有する。この非相同発現は特にこの細胞の染色体中へのこの遺伝子又はアレルの組み込み又は染色体外で複製するベクターにより達成される。
【００３４】
ピルビン酸−カルボキシラーゼを例にとって細胞中での酵素活性の向上のための手段に関する概要DE A-100 31 999は示し、これは参照により参照文献として導入され、この開示内容は細胞中での酵素活性の向上のための手段に関して本発明の開示の一部を構成する。
【００３５】
前述の及び全ての後述の酵素又は遺伝子の発現は、１−及び２−次元のタンパク質走行分離及び引き続くタンパク質濃度の光学的同定を用いて相応する評価ソフトウェアを使用してゲル中で検出可能である。酵素活性の向上がこの相応する遺伝子の発現の向上のみを基礎とする場合には、この酵素活性の向上の定量化は容易に、野生型と遺伝子工学的に改変された細胞間の１又は２次元のタンパク質走行分離の比較により測定されることができる。コリネフォルメ細菌でのこのタンパク質ゲルの調整のための及びこのタンパク質の同定のための慣用の方法はHermann et al.(Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) により記載された方法様式である。このタンパク質濃度は同様に、検出すべきタンパク質にとって特異的な抗体を用いてウェスタン−ブロット−ハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）及び濃度測定のための相応するソフトウェアを用いて引き続く光学的評価（Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647）により分析されることができる。ＤＮＡ結合性タンパク質の活性はＤＮＡ−バンド−シフト−アッセイ（ゲルリターデーションとも呼ばれる）を用いて測定されることができる（Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155）。ＤＮＡ結合性タンパク質の他の遺伝子の発現に対する作用は様々な豊富に記載されている、リポート遺伝子−アッセイ方法により検出されることができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内酵素活性は様々な記載された方法（Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823）により測定されることができる。以下の詳説において特定の酵素の活性の測定のための具体的方法が挙げられていない場合には、この酵素活性の上昇の測定及びまたこの酵素活性の減少の測定は好ましくはHermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)及びWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)中で記載の方法を用いて行われる。
【００３６】
この酵素活性の向上が内因性遺伝子の突然変異により実施される場合には、この種の突然変異は典型的な方法により狙いを定めないで生じさせられることができ、これは例えばＵＶ照射により又は突然変異誘発性化学薬品により生じさせられることができ、又は、狙いを定めて、遺伝子工学的方法により、例えば（１又は複数の）欠失、（１又は複数の）挿入及び／又は（１又は複数の）ヌクレオオチド交換により生じさせられることができる。この突然変異により改変された細胞が得られる。
【００３７】
酵素の特に好ましい突然変異はとりわけ、フィードバック阻害可能性をもはや有しないか又は少なくとも野生型−酵素と比較して減少したフィードバック阻害可能性を有するような酵素である。
【００３８】
酵素活性の向上が酵素の合成の向上により実施される場合には、例えばこの相応する遺伝子のコピー数を向上させるか又はプロモーター−及び調節配列又はリボソーム結合部位を突然変異させ、これはこの構造遺伝子の上流に存在する。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより付加的に、この発現をそれぞれ任意の時間点で上昇させることが可能である。更に、しかし、酵素−遺伝子に調節性配列としていわゆる「エンハンサー」も配置されていることができ、これはＲＮＡ−ポリメラーゼとＤＮＡの間の改善された相互作用を介して同様に向上した遺伝子発現を引き起こす。このｍＲＮＡの寿命の延長化のための処置により同様にこの発現が改善される。
【００３９】
更に、この酵素タンパク質の分解の防止により同様にこの酵素活性が増強される。この遺伝子又は遺伝子コンストラクトはこの場合に、様々なコピー数でもってプラスミド中に存在するか、又は、染色体中に組み込まれ、増幅される。代替的に、更に、当該遺伝子の過剰発現がこの培地組成物及び培養操作の改変により達成されることができる。
【００４０】
このためのマニュアルを当業者は特にMartin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))で、Guerrero et al.(Gene 138, 35-41 (1994))で、Tsuchiya及びMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))で、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))で、EP-A-0 472 869に、US 4,601,893に、Schwarzer und Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)で、Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))で、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、WO-A-96/15246に、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)で、JP-A-10-229891に、Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))に及び遺伝学及び分子生物学の公知の教科書に見出す。前述の処置は突然変異と同様に遺伝子工学的に改変した細胞を生じる。
【００４１】
このそれぞれの遺伝子の発現の向上には例えばエピソーム性プラスミドが使用される。プラスミド又はベクターとして原則的に当業者にこの目的のために提供される実施形態の全てが考慮される。この種のプラスミド及びベクターは例えば、Novagen社、Promega、New England Biolabs、Clontech又はGibco BRLのパンフレットから取り出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは以下に見出すことができる：Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R. L.及びDenhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) , Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F.及びManiatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York。
【００４２】
増幅すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターを引き続き、コンジュゲーション又はトランスフォーメーションにより所望の株に移す。コンジュゲーションの方法は例えばSchaefer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)に記載されている。トランスフォーメーションのための方法は例えばThierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican及びShivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)及びTauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)に記載されている。「cross-over」事象を用いた相同性組み換え後にこの生じる株は当該遺伝子の少なくとも２のコピーを含有する。
【００４３】
前述及び後述の詳説で使用される表現「その野生型に比較した酵素Ｅxの上昇した活性」とは好ましくは、常に、このそれぞれの酵素Ｅxの少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更に一層好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍上昇した活性を理解すべきである。更に、「その野生型に対して酵素Ｅxの上昇した活性」を有する本発明による細胞は、特に、その野生型がこの酵素Ｅxの活性を有しないか又は少なくとも検出可能な活性を有さず、かつ、この酵素活性の向上により、例えば過剰発現により、初めてこの酵素Ｅxの検出可能な活性を示す細胞を含む。この関連において、概念「過剰発現」又は以下の詳説で使用される表現「発現の向上」は、出発細胞、例えば野生型細胞が発現を有しないか又は少なくとも検出可能な発現を有さず、かつ、組み換え方法により初めてこの酵素Ｅxの検出可能な合成が誘発される場合も含む。
【００４４】
以下使用される表現「酵素Ｅxの減少した活性」とは、これに応じて好ましくは、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、更に好ましくは少なくとも０．０１倍、更に一層好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍減少した活性が理解される。表現「減少した活性」は検出可能な活性も含まない（ゼロの活性）。特定の酵素の活性の減少化は例えば狙いを定めた突然変異により、競合性の又は非競合性の阻害剤の添加により、又は特定の酵素の活性の減少化のために当業者に知られた他の処置により行われることができる。
【００４５】
その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロイシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として形成することができる本発明による細胞が、炭水化物、グリセリン、油及び脂肪、二酸化炭素、カルボン酸又はメタノールを炭素供給源として使用できることが好ましい。
【００４６】
更に、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロイシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として形成することができる本発明による細胞にとっては、この細胞が、場合により酵素Ｅ1の活性に付加して、酵素Ｅ2の活性、好ましくは、その野生型と比較して酵素Ｅ2の上昇した活性を有し、これが２のアセチル−補酵素Ａからアセト−アセチル補酵素Ａへの反応を触媒作用することが好ましい。
【００４７】
酵素Ｅ2とは、好ましくは、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ数 ２．３．１．９）である。この酵素は好ましくは、acat1, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erg10, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, thl, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiL1, thiL2, acaB1, acaB2, acaB3又はacaB4からなる群から選択される遺伝子によりコードされ、その際、acat1, acat2, atoB, thlA, thlB, phaA及びphbA、特に好ましくはphaA及びphbAである。
【００４８】
この遺伝子のヌクレオチド配列は例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-データバンク)、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, ドイツ国又はCambridge, UK)のヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００４９】
本発明による細胞は好ましくは酵素Ｅ3の少なくとも１の活性を、好ましくはその野生型と比較して酵素Ｅ3の上昇した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａから２−ヒドロキシイソブチリル補酵素Ａの反応を触媒作用する。酵素Ｅ3は好ましくはヒドロキシル−イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．１３）又はメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）であり、そのつど好ましくは補酵素Ｂ１２依存性ムターゼである。
【００５０】
酵素Ｅ3は好ましくは微生物アキノコラ・テルシアリカルボニス（Aquincola tertiaricarbonis）Ｌ１０８、ＤＳＭ１８０２８、ＤＳＭ１８５１２、メチリビウム・ペテロレイフィリウムＰＭ１（Methylibium petroleiphilum PM1）、メチリビウム種（Methylibium sp .）Ｒ８、キサントバクター・オートトロフィカスＰｙ２（Xanthobacter autotrophicus Py2）、ロドバクター・スフェロイダス（Rhodobacter sphaeroides）（ATCC 17029）、ノカルジオイデス種（Nocardioides sp .）ＪＳ６１４、マリノバクター・アルギコラ（Marinobacter algicola）ＤＧ８９３、シノリゾビウム・メディカエ（Sinorhizobium medicae）ＷＳＭ４１９、ロセノバリウス種（Roseovarius sp .）２１７、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＳＭ３６３８から単離される酵素、特に好ましくはＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２８３０に記載の補酵素Ｂ１２依存性ムターゼ、並びに、少なくとも１のその部分配列中にＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２８３０に記載のムターゼ（アクセッション番号DQ436457.1及びDQ436456.1）の小又は大サブユニットのアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも６０％、有利には少なくとも８０％、特に有利には少なくとも９５％、特にとりわけ好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する酵素であり、これは期待閾値（expect threshold）１０、ワードサイズ３、blosum62マトリックスでもって存在：１１及び伸長１のギャップコスト及び条件組成スコアマトリックス調節（conditional compositional score matrix adjustment）でもってblastpアルゴリズムにより測定される。
【００５１】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は野生型として酵素Ｅ4の活性を、好ましくはその野生型に比較して少なくとも１の酵素Ｅ4の低下した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからポリヒドロキシブチラートへの反応を触媒作用する。
【００５２】
酵素Ｅ4は好ましくはポリヒドロキシアルカノアート合成酵素、特に好ましくはポリヒドロキシブチラート合成酵素である。この酵素は好ましくは遺伝子phbC又はphaCによりコードされ、その際phaCが特に好ましい。
【００５３】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の更なる好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は野生型として酵素Ｅ5の活性を、特にその野生型に比較して酵素Ｅ5の低下した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからクロトニル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００５４】
酵素Ｅ5は好ましくはクロトナーゼ（ＥＣ数４．２．１．５５）又は（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ数４．２．１．１７）である。この酵素は好ましくはcrt, crt1, crt2, fadB, paaFからなる群から選択される遺伝子によりコードされ、その際crt並びにクロストリジンからのこの相応する遺伝子が好ましく、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）からのcrtが特に好ましい。
【００５５】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の更なる好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は酵素Ｅ6の活性を、好ましくはその野生型に比較して酵素Ｅ6の低下した活性を有し、これはＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素ＡからＳ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００５６】
酵素Ｅ6とは好ましくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＥＣ ５．１．２．３）である。この酵素は好ましくはfadB, fadB1, fadB2, fadJ, fabJ-1, faoA yfcXからなる群から選択された遺伝子によりコードされ、その際fadB, fadJ, yfcXが好ましく、fadB, fadJが特に好ましい。
【００５７】
更に、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞にとっては、本発明による細胞がその野生型に比較して少なくとも１の酵素Ｅ7の低下した活性を有することが好ましく、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを基質として許容する。
【００５８】
冒頭部で挙げた課題解決のためには次の方法工程：
ａ）本発明による細胞を、炭素供給源を含む栄養培地と、この炭素供給源から２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートが形成される条件下で接触させる方法工程、並びに、場合により
ｂ）２−ヒドロキシイソ酪酸をこの栄養培地から、又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをこの細胞から精製する方法工程
を含む２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法が更に寄与する。
【００５９】
炭素供給源として例えば次のものが使用されることができる：
炭水化物［例えば単糖（例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、アラビノース、キシロース）、オリゴ糖（例えばマルトース、サッカロース、ラクトース）、及び多糖（例えばデンプン、加水分解処理されたデンプン、セルロース、加水分解処理されたセルロース、ヘミセルロース、加水分解処理されたヘミセルロース）］、並びにその反応生成物、例えば
糖アルコール及びポリヒドロキシ酸；
二酸化炭素；
有機の、場合により１又は複数の、例えば１、２、３又は４個のヒドロキシル基を有するモノ−、ジ−及びトリカルボン酸、例えば酢酸、酒石酸、イタコン酸、コハク酸、プロピオン酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、２，５−フランジカルボン酸、グルタル酸、レブリン酸、グルコン酸、アコニット酸、コハク酸及び
ジアミノピメリン酸、クエン酸；
脂質；
油又は脂肪、例えばナタネ油、大豆油、パーム油、ヒマワリ油、落花生油及びヤシ油；
飽和及び不飽和脂肪酸であって好ましくは１０〜２２個のＣ原子を有するもの、例えばγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸；
炭化水素、例えばメタン；
アルコール、例えば１〜２２個のＣ原子を有するもの、例えばブタノール、メタノール、エタノール；
ジオールであって好ましくは３〜８個のＣ原子を有するもの、例えばプロパンジオール及びブタンジオール；
３以上の、例えば３、４、５又は６個のＯＨ基を有する多価（高級とも呼ばれる）アルコール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、キシリトール及びアラビニトール；
ケトンであって好ましくは３〜１０個のＣ原子及び場合により１以上のヒドロキシル基を有するもの、例えばアセトン及びアセトイン；
ラクトン、例えばγ−ブチロラクトン、シクロデキストリン、生体高分子、例えばポリヒドロキシアセタート、ポリエステル、例えばポリラクチド、多糖、ポリイソプレノイド、ポリアミド；
芳香族化合物、例えば芳香族アミン、バニリン及びインジゴ；
タンパク質、例えば酵素、例えばアミラーゼ、ペクチナーゼ、酸、ハイブリッドの又は中性のセルラーゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、パンクレアーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ及びオキシドレダクターゼ、例えばラッカーゼ、ケタラーゼ及びペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ；カロテノイド、例えばリコピン、β−カロチン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン及びカンタキサンチン；
タンパク質性及び非タンパク質性アミノ酸、例えばリシン、グルタマート、メチオニン、フェニルアラニン、アルパルギン酸、トリプトファン及びトレオニン；
プリン−及びピリミジン塩基；
ヌクレオシド及びヌクレオチド、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びアデノシン−５′−一リン酸（ＡＭＰ）；
並びに前述の化合物の前駆体及び誘導体、例えば挙げられた酸の場合にはその塩。
【００６０】
これらの物質は、単独で又は混合として使用されることができる。特に好ましくは炭水化物、特に単糖、オリゴ糖又は多糖、例えばUS 6,136,576に記載されているようなもの、Ｃ5−糖又はグリセリンの使用である。メタノールは好ましく使用すべきアルコールであり、というのもこれは多数の様々な供給源、例えばバイオガス、バイオマス、天然ガス又は石炭から製造されることができるからである。炭素供給源は、様々な形態で（純粋に又は溶液／懸濁液中で）かつ様々な組成で（精製して又は粗生成物として）、様々な加工段階（例えばサトウキビジュース、シロップ、糖蜜、粗糖、結晶糖；トウモロコシ粒（Maiskorn）、小麦粉、デンプン、デキストリン、グルコース）から、処理（蒸気爆発、酸予備処理、酵素による前処理）前又は後に使用されることができる。
【００６１】
好ましい代替的な一実施態様において、この炭素供給源はＣＯ2又はＣＯ、特に合成ガスを含む。この関連において使用される本発明による細胞は、アセトゲン（acetogen）細胞、例えば、アセトバクテリウムの属の種類、例えばＡ．ウッディ（woodii）及びクロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）である。特には、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アセトアンアエロビウム・ノテラ（Acetoanaerobium notera）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ユウバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）及びクロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）を含む群から選択されているこのアセトゲン細胞である。この関連において特に適した細胞はクロストリジウム・カルボキシディボランスであり、特に例えば「Ｐ７」及び「Ｐ１１」の株のものである。このような細胞は例えばUS 2007/0275447及びUS 2008/0057554に記載されている。更なる、この関連において特に適した細胞は、クロストリジウム・リュングダリイであり、特にクロストリジウム・リュングダリイＰＥＴＣ、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ２、クロストリジウム・リュングダリイＣ０１及びクロストリジウム・リュングダリイＯ５２を含む群から選択された株であり、かつ、WO 98/00558及びWO 00/68407に記載される。
【００６２】
本発明による、遺伝子工学的に改変された細胞は連続的に又は不連続的にバッチ法（バッチ培養）で又は流加培養法（供給法）又はrepeated-fed-batch法（繰り返した流加培養法）で２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造の目的で栄養培地と接触され、これにより培養されることができる。半連続方法も考慮でき、これは例えばGB-A-1009370に記載されている。公知の培養方法に関する概要は、Chmielによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００６３】
使用すべき培養培地は適したように、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)の教科書「Manual of Methods for General Bacteriology」に含まれている。
【００６４】
窒素供給源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用されることができる。前記窒素供給源は、単独で又は混合として使用されることができる。
【００６５】
リン供給源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用されることができる。前記培養培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなくてはならず、これらは成長に必要である。最後に、必須成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に付加的に使用することができる。培養培地にはその上適した前駆体が添加されることができる。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給されてよい。
【００６６】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸を適した方法で使用する。泡の発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用できる。プラスミドの安定性の維持のために前記溶媒に、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加できる。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を前記培養物中に導入する。この培養物の温度は、通常は２０℃〜４５℃、有利には２５℃〜４０℃である特に、グリセリンを基質として変換できる細胞の使用の際には、細胞としてUS 6,803,218に記載されるような細胞を使用することが好ましくあることができる。この場合には細胞は４０〜１００℃の範囲で培養されることができる。
【００６７】
２−ヒドロキシイソ酪酸のこの栄養溶液からの精製は好ましくは連続的に行われ、その際この関連においてこの２−ヒドロキシイソ酪酸の製造も発酵を介して連続的に実施することが更に好ましく、この結果、２−ヒドロキシイソ酪酸の製造から発酵ブイヨンからのその精製までの全プロセスが実施されることができる。この発酵ブイヨンからの２−ヒドロキシイソ酪酸の製造の連続的精製のためにはこれは連続的にこの発酵の際に使用される微生物の分離のための装置を介して、好ましくは２０〜２００ｋＤａの範囲の排除大きさを有するフィルターを介して実施され、この中では固／液分離が生じる。遠心分離、適した沈殿装置の使用又はこれら装置の組み合わせも考慮でき、その際、この微生物の少なくとも一部をまずは沈殿を介して分離し、引き続き微生物から一部除去された発酵ブイヨンを限外濾過又は遠心分離装置に供給することが特に好ましい。
【００６８】
その２−ヒドロキシイソ酪酸−含分に関して濃縮された発酵結果物はこの微生物の分離後に好ましくは多工程の分離設備に供給される。この分離設備においては複数の相前後して接続した分離段階が予定されており、ここからそのつど返送ラインにつながり（ausmuenden）、これは発酵タンクに戻されている。更にこのそのつどの分離段階から排出ラインが導出（herausfuehren）される。この個々の分離段階は電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過の原理に応じて作業されることができる。通常これは個々の分離段階中の膜−分離機である。この個々の分離段階の選択は、発酵副生成物及び基質残分の種類及び範囲から明らかである。
【００６９】
終生成物として水性２−ヒドロキシイソ酪酸−溶液がこの過程で得られる電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過を用いた２−ヒドロキシイソ酪酸の分離の他に、２−ヒドロキシイソ酪酸は抽出方法によってもこの微生物を除去した発酵溶液から分離されることができ、その際、この場合には最終的に、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸が得られることができる。抽出を介した２−ヒドロキシイソ酪酸の分離のためには発酵溶液には例えばアンモニウム化合物又はアミンが、２−ヒドロキシイソ酪酸のアンモニウム塩を形成するために、添加されることができる。このアンモニウム塩は次いでこの発酵溶液から分離されることができ、この中には有機抽出剤が添加され、かつ、このようにして得られた混合物は引き続き加熱され、これによりこのアンモニウム塩は有機相中に濃縮する。この相からは次いで２−ヒドロキシイソ酪酸が、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸を獲得しながら例えば更なる抽出工程により単離されることができる。この分離方法についてのより正確な詳細はWO-A-02/090312から取り出すことができ、この開示の内容は発酵溶液からのヒドロキシカルボン酸の分離に関して参照により参照文献として導入され、かつ、本出願の開示の一部を構成する。
【００７０】
この発酵溶液からの２−ヒドロキシイソ酪酸の分離の手法に応じて、２〜９０質量％、好ましくは７．５〜５０質量％、特に好ましくは１０〜２５質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水性２−ヒドロキシイソ酪酸−溶液、しかし又は、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸のいずれかが得られる。
【００７１】
２−ヒドロキシイソ酪酸は濃度の上昇と共に、その環式ダイマー（テトラメチルグリコライド、ＴＭＧ）を形成する傾向がある。このダイマーは本発明による方法の脱水工程において２−ヒドロキシイソ酪酸と同様に処理されることができ、したがって以下においてはこの方法工程のためには常に「２−ヒドロキシイソ酪酸」の概念に含まれる。
【００７２】
更に、本発明による方法により製造された２−ヒドロキシイソ酢酸は、この精製の前、間又は後に更に中和されることができ、その際、このためには例えば塩基、例えばアルカリ−又はアルカリ土類金属水酸化物、例えば水酸化カルシウム又は水酸化ナトリウム、又は例えばＮＨ3又はＮＨ4ＯＨも使用されることができる。
【００７３】
冒頭部で挙げた課題解決には特に、次の方法工程：
ＩＡ）２−ヒドロキシイソ酪酸を前述の方法により製造し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を精製及び／又は中和する方法工程、
ＩＢ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する方法工程
を含むメタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【００７４】
方法工程ＩＢ）によれば２−ヒドロキシイソ酪酸はメタクリル酸の形成下で脱水され、その際このためにはこの発酵溶液から単離された、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸、しかし又は、この発酵溶液の後処理の際に単離された水性２−ヒドロキシイソ酪酸溶液のいずれかが使用されることができ、その際、これは場合により更に、脱水前に例えば蒸留により、場合により適した共留剤の存在下で濃縮される。
【００７５】
この脱水は根本的には液相中で又は気相中で実施されることができる。更に、本発明により、この脱水を触媒の存在下で行うことが好ましく、この場合にはこの使用される触媒の種類は気相−又は液相反応のいずれが実施されるかに依存する。
【００７６】
脱水化触媒として酸性触媒もまた同様にアルカリ性触媒も考慮される。酸性触媒は特にオリゴマー形成のための少ない傾向のために好ましい。脱水触媒は均一系触媒としてもまた同様に不均一系触媒としても使用されることができる。脱水触媒が不均一系触媒として存在する場合には、脱水触媒が担体ｘと接触することが好ましい。担体ｘとしては当業者にとって適しているように見える全ての固形物質が考慮される。この関連において、この固形物質が適した孔体積を有することが好ましく、これは脱水触媒の良好な結合及び収容に適している。更に、DIN 66133に応じた、０．０１〜３ｍｌ／ｇの範囲内にある全孔体積が好ましく、０．１〜１．５ｍｌ／ｇの範囲内にある全孔体積が特に好ましい。その上、担体ｘとして適した固形物質が、ＤＩＮ ６６１３１に応じたＢＥＴ試験により、０．００１〜１０００ｍ2／ｇの範囲内の、好ましくは０．００５〜４５０ｍ2／ｇの範囲内の、更に好ましくは０．０１〜３００ｍ2／ｇの範囲内の表面積を有することが好ましい。脱水触媒のための担体としては、一方では、０．１〜４０ｍｍの範囲内の、好ましくは１〜１０ｍｍの範囲内の、更に好ましくは１．５〜５ｍｍの範囲内の平均粒子直径を有するばら材（Schuettgut）が使用されることができる。更に、脱水反応器の壁が担体として使用されることができる。更に、担体は自体で酸性又は塩基性であることができるか又は酸性又は塩基性の脱水触媒が不活性担体に設けられることができる。設ける技術として特に浸漬又は含浸又は担体マトリックス中への混和を挙げることができる。
【００７７】
脱水触媒特性をも有することができる担体ｘとしては特に、天然又は合成のシリカート性物質、例えば特にモルデナイト、モンモリロナイト、酸性ゼオライト；一、二又は多塩基性の無機酸、特にリン酸、又は無機酸の酸性塩でコーティングした担体物質、例えば、酸化物性又はシリカート性物質、例えばＡｌ2Ｏ3、ＴｉＯ2；酸化物及び混合酸化物、例えばγ−Ａｌ2Ｏ3及びＺｎＯ−Ａｌ2Ｏ3−混合酸化物であってヘテロポリ酸のものが適している。
【００７８】
これは、担体ｘが少なくとも部分的に酸化物性化合物からなる本発明による実施態様に当たる。この種の酸化物性化合物はＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌ、Ｐの少なくとも１の元素又はこの少なくとも２の組み合わせを有するものである。この種の担体は自体でその酸性の又は塩基性の特性により脱水触媒として作用することもできる。好ましい、ｘとしての担体としてもまた同様に脱水触媒としても作用する化合物クラスは、ケイ素／アルミニウム／リン酸化物を包含する。好ましい、塩基性の、脱水触媒としてもまた同様に担体ｘとしても機能する物質は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ランタン、ランタノイド又はこの少なくとも２の組み合わせをその酸化物の形で包含する。この種の酸性の又は塩基性の脱水触媒はEvonik Degussa GmbHでもまた同様にSuedchemie AGでも入手できる。イオン交換体は更なるクラスを示す。これも塩基性のまた同様に酸性の形に存在することができる。
【００７９】
均一系脱水触媒としては特に無機酸、好ましくはリン含有酸、更に好ましくはリン酸が考慮される。これら無機酸は担体ｘに浸漬又は含浸により固定化されることができる。
【００８０】
特に気相脱水では不均一系触媒の使用が特に信頼できる。しかし液相脱水では均一系脱水触媒もまた同様に不均一系脱水触媒も使用される。
【００８１】
その上、本発明による方法においては、＋１〜−１０の範囲内の、好ましくは＋２〜−８．２の範囲内の、更に好ましくは液相脱水の際に＋２〜−３の範囲内の、気相脱水において−３〜−８．２の範囲内のＨ０値を有する脱水触媒が使用されることが好ましい。このＨ０値は、Haemmertによる酸度関数に当たり、かつ、いわゆるアミン滴定及び指示薬の使用により又は気状塩基の吸収により算出される（"Studies in Surface Science and Catalytics", Vol. 51, 1989: "New solid Acids and Bases, their catalytic Properties", K. Tannabe et al 参照のこと）。
【００８２】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、酸性固形物質触媒として無機酸と、好ましくはリン酸と又は超酸と、例えば硫酸化（suldatisieren）又はホスファチド化した酸化ジルコニウムと接触させた孔形状の担体物質が使用され、これは好ましくは少なくとも９０質量％が、更に好ましくは少なくとも９５質量％が、最も好ましくは少なくとも９９質量％が酸化ケイ素、好ましくはＳｉＯ2を基礎とする。この孔形状の担体物質と無機酸との接触は好ましくは担体物質の酸での含浸により行われ、その際、これは好ましくは、担体物質の質量に対して１０〜７０質量％の範囲内、特に好ましくは２０〜６０質量％の範囲内、更に好ましくは３０〜５０質量％の範囲内の量でこれと接触され、引き続き乾燥される。乾燥に引き続き、この担体物質は無機酸の固定化のために加熱され、好ましくは３００〜６００℃の範囲内、更に好ましくは４００〜５００℃の範囲内の温度に加熱される。
【００８３】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、この脱水は気相中で実施される。この場合に、慣用の装備、例えば気相反応のために当業者に知られている装備、例えば管型反応器が使用されることができる。特に好ましくは、管束型熱交換器並びに熱交換器として熱プレート（Thermobleche）を包含する反応器の使用である。
【００８４】
気相脱水の一実施態様によれば、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸が前述の固体層触媒を含む反応器中に導入される。
【００８５】
他の一実施態様によれば、そのつど水溶液の全質量に対して、２〜８０質量％、特に好ましくは５〜５０質量％、更に好ましくは１０〜２５質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液の形にある２−ヒドロキシイソ酪酸が、この反応器中に導入される。この反応器の内部中の圧力−及び温度条件は、この２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液がこの反応器中への進入の際に気状の形で存在するように選択される。気相中での脱水は好ましくは温度範囲２００〜４００℃、特に好ましくは２５０〜３５０℃で行われる。この反応器の内部中の圧力は気相脱水の際に好ましくは０．１〜５０ｂａｒの範囲内、特に好ましくは０．２〜１０ｂａｒの範囲内、最も好ましくは０．５〜５ｂａｒの範囲内にある。
【００８６】
反応器中に導入される２−ヒドロキシイソ酪酸の量は気相脱水の際に好ましくは１０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内に、特に好ましくは２０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内に、最も好ましくは３０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内にある。
【００８７】
本発明による方法の別の特別な一実施態様によれば、この脱水は液相中で実施される。この液相脱水は同様に、当業者に知られている全ての装備中で実施されることができ、この中では液体が所望される反応温度に加熱されることができ、その際、この装備は、反応成分を所望の温度条件下で液状に維持するのに十分な圧力に課されることができる。
【００８８】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、液相脱水のこの方法は、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸、又は水溶液の全質量に対して５〜１００質量％、特に好ましくは２０〜１００質量％、最も好ましくは５０〜１００質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液を反応器中に導入する第１の方法工程を含む。この反応器の内部中の圧力−及び温度条件は、この２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液がこの反応器中への進入の際に液状の形で存在するように選択される。脱水が液相中で実施される本発明による特別な一実施態様によれば、２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液が脱水反応器の内部中に、この液相がこの触媒粒子の表面に沿って滴るように、触媒固体層を介して導通される。この種の実施様式は例えば細流床反応器中で実施されることができる。
【００８９】
液相中での脱水は好ましくは温度範囲２００〜３５０℃、特に好ましくは２５０〜３００℃で行われる。この反応器の内部中の圧力は液相脱水の際に好ましくは１〜５０ｂａｒの範囲内、特に好ましくは２〜２５ｂａｒの範囲内、最も好ましくは３〜１０ｂａｒの範囲内にある。
【００９０】
脱水の触媒作用は気相脱水の場合にもまた同様に液相脱水の場合にも均一系で又は不均一系で行うことができる。
【００９１】
均一系触媒作用では、次いで好ましくは無機酸、例えばリン酸又は硫酸である触媒が、まず純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含む水溶液と接触させられる。引き続き、このように得られた組成物を反応器中に導入し、所望の圧力−及び温度条件下でメタクリル酸に移行させる。無機酸を２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液とは無関係に反応器中に導入することも考慮できる。この場合にはこの反応器は少なくとも２の供給ラインを有し、１つは２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液のためであり、もう１つは触媒のためである。脱水が液相中で細流床反応器中で実施される場合には、触媒を２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液と一緒に反応器の頭部領域中に導入することが好ましい。
【００９２】
不均一系触媒作用の場合には、この触媒は、固体の基材の形で反応室中に、例えば固体層ばら物（Festbettschuettung）の形で、触媒で被覆された板、好ましくは熱プレートの形で存在し、これは反応器の内部中に配置されているか、しかし又は、触媒で被覆された反応器壁の形にある。可能性のある反応器は例えばDE-A-198 48 208、DE-A-100 19 381及びEP-A1 234 612に記載されている。不均一系触媒作用の場合には、触媒として無機酸と接触させた、好ましくは含浸させた孔形状の担体物質が好ましい。２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液を次いで、蒸気状の又は液状の形で、固体の触媒材料の表面と接触させる。
【００９３】
本発明による方法の特別に好ましい一実施態様によれば、２−ヒドロキシイソ酪酸の脱水は液相中で２００〜５００ｍｂａｒの範囲内の圧力で、１６０〜３００℃、好ましくは２００〜２４０℃の範囲内の温度で、触媒としてアルカリ金属イオンの存在下で実施される。
【００９４】
この生じたメタクリル酸は本発明による反応条件では気状で水と一緒になって留去され、引き続き水溶液として凝縮され、この結果、触媒成分を含有しないメタクリル酸水溶液が得られることができる。
【００９５】
このようにして得られるメタクリル酸溶液は本発明による方法の特別な一実施態様によれば容易に更なる後処理なしに場合によりエステル化に供給されることができる。この場合にこのメタクリル酸溶液は相応するアルコール並びに適した、当業者に知られているエステル化触媒、例えば濃縮した酸と加熱下で接触させられ、このメタクリル酸はこのようにして相応するエステルに移行する。
【００９６】
好ましいアルコールには特に、そのつど少なくとも１の炭素原子、好ましくは２〜１２、特に好ましくは４〜９個の炭素原子を有するアルコールが属する。このアルコールは線状、分枝鎖状又は環式構造を有することができる。更に、このアルコールは芳香族基又は置換基、例えばハロゲン原子を含むことができる。好ましいアルコールには特にメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、１−メチル−プロパノール、２−メチルプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、１−メチルブタノール、２−メチルブタノール、３−メチルブタノール、２，２−ジメチルプロパノール、ｎ−ヘキサノール、１−メチルペンタノール、２−メチルペンタノール、３−メチルペンタノール、４−メチルペンタノール、１，１−ジメチルブタノール、２，２−ジメチルブタノール、３，３−ジメチルブタノール、１，２−ジメチルブタノール、ｎ−ヘプタノール、１−メチルヘキサノール、２−メチルヘキサノール、３−メチルヘキサノール、４−メチルヘキサノール、１，２−ジメチルペンタノール、１，３−ジメチルペンタノール、１，１−ジメチルペンタノール、１，１，２，２，−テトラメチルプロパノール、ベンジルアルコール、ｎ−オクタノール、２−エチルヘキサノール、ｎ−ノナノ−ル、１−メチルオクタノール、２−メチルオクタノール、ｎ−デカノール、ｎ−ウンデカノール、１−メチルデカノール、２−メチルデカノール、ｎ−ドデカノール、２，４−ジエチルオクタノール、シクロペンタノール、シクロヘキサノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサノール、シクロヘプタノール、シクロドデカノール、２−（ジメチルアミノ）エタノール、３−（ジメチルアミノ）プロパノール、４−（ジメチルアミノ）ブタノール、５−（ジメチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジメチルアミノ）ヘキサノール、８−（ジメチルアミノ）オクタノール、１０−（ジメチルアミノ）デカノール、１２−（ジメチルアミノ）ドデカノール、２−（ジエチルアミノ）エタノール、３−（ジエチルアミノ）プロパノール、４−（ジエチルアミノ）ブタノール、５−（ジエチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジエチルアミノ）ヘキサノール、８−（ジエチルアミノ）オクタノール、１０−（ジエチルアミノ）デカノール、１２−（ジエチルアミノ）ドデカノール、２−（ジ（イソプロピル）−アミノ）−エタノール、３−（ジ（イソプロピル）アミノ）−プロパノール、４−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ブタノール、５−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ペンタノール、６−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ヘキサノール、８−（ジ（イソプロピル）−アミノ）オクタノール、１０−（ジ（イソプロピル）−アミノ）デカノール、１２−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ドデカノール、２−（ジブチルアミノ）−エタノール、３−（ジブチルアミノ）−プロパノール、４−（ジブチルアミノ）−ブタノール、５−（ジブチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジブチルアミノ）−ヘキサノール、８−（ジブチルアミノ）−オクタノール、１０−（ジブチルアミノ）−デカノール、１２−（ジブチルアミノ）−ドデカノール、２−（ジヘキシルアミノ）−エタノール、３−（ジヘキシルアミノ）−プロパノール、４−（ジヘキシルアミノ）−ブタノール、５−（ジヘキシルアミノ）−ペンタノール、６−（ジヘキシルアミノ）−ヘキサノール、８−（ジヘキシルアミノ）−オクタノール、１０−（ジヘキシルアミノ）−デカノール、１２−（ジヘキシルアミノ）−ドデカノール、２−（メチル−エチル−アミノ）−エチ−、２−（メチル−プロピル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−イソプロピル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−ブチル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−ヘキシル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−オクチル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−プロピル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−イソプロピル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−ブチル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−ヘキシル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−オクチル−アミノ）−エタノール、３−（メチル−エチル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−プロピル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−イソプロピル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−ブチル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−ヘキシル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−オクチル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−プロピル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−イソプロピル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−ブチル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−ヘキシル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−オクチル−アミノ）−プロパノール、４−（メチル−エチル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−プロピル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−イソプロピル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−ブチル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−ヘキシル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−オクチル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−プロピル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−イソプロピル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−ブチル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−ヘキシル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−オクチル−アミノ）−ブタノール、２−（Ｎ−ピペリジニル）−エタノール、３−（Ｎ−ピペリジニル）−プロパノール、４−（Ｎ−ピペリジニル）−ブタノール、５−（Ｎ−ピペリジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ−ピペリジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ−ピペリジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ−ピペリジニル）−デカノール、１２−（Ｎ−ピペリジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ−ピロリジニル）−エタノール、３−（Ｎ−ピロリジニル）−プロパノール、４−（Ｎ−ピロリジニル）−ブタノール、５−（Ｎ−ピロリジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ−ピロリジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ−ピロリジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ−ピロリジニル）−デカノール、１２−（Ｎ−ピロリジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタノール、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパノール、４−（Ｎ−モルホリノ）−ブタノール、５−（Ｎ−モルホリノ）−ペンタノール、６−（Ｎ−モルホリノ）−ヘキサノール、８−（Ｎ−モルホリノ）−オクタノール、１０−（Ｎ−モルホリノ）−デカノール、１２−（Ｎ−モルホリノ）−ドデカノール、２−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、３−オキサ−ブタノール、３−オキサ−ペンタノール、２，２−ジメチル−４−オキサ−ペンタノール、３，６−ジオキサ−ヘプタノール、３，６−ジオキサ−オクタノール、３，６，９−トリオキサ−デカノール、３，６，９−トリオキサ−ウンデカノール、４−オキサ−ペンタノール、４−オキサ−ヘキサノール、４−オキサ−ヘプタノール、４，８−ジオキサ−ノナノール、４，８−ジオキサ−ドデカノール、４，８−ジオキサ−ウンデカノール、５−オキサ−ヘキサノール、又は５，１０−ジオキサ−ウンデカノール。
【００９７】
更に、エトキシル化及び／又はプロポキシル化アルコール並びに混合エトキシル化及び／又はプロポキシル化アルコールが溶媒として使用されることができ、特にＲa−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）x−ＯＨ又はＲa−（Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2）x−ＯＨ、又は、Ｒa−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3））x−ＯＨ［式中、ＲaはＣ1〜Ｃ20−アルキル及びｘは１０〜２０の整数である］、又はエトキシル化及び／又はプロポキシル化アミノアルコール、例えばＲb2Ｎ（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）y−Ｈ又はＲb2Ｎ（−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−Ｏ）y−Ｈ又はＲb2Ｎ（−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）y−Ｈ［式中、ｙは１〜４の整数である］である。Ｒbは１〜６の炭素原子を有するアルキル基であり、その際この窒素は置換基Ｒbと一緒になって五〜六員環を形成することもできる。この環は、場合により更に１又は複数の短鎖アルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピルにより置換されていることができる。
【００９８】
しかし、メタクリル酸がエステル化前に更に精製されることが好ましくあることができ、その際、精製のためには根本的に、汚染された、プロピレンの触媒気相酸化により得られる（メタ）アクリル酸の精製に慣用の様式で適用される、当業者に知られている全ての精製方法を適用できる。
【００９９】
気相中で脱水が実施された場合には、このメタクリル酸をまず、水性メタクリル酸溶液を獲得しながら凝縮することが好ましい。この場合には根本的に、当業者に知られている全ての凝縮方法、例えば分画した凝縮を使用することができ、これは例えばWO-A-2004/035514, WO-A03/014172又はEP-A-EP 1 163 201に記載されており、又は、全体凝縮によることができ、これは例えばEP-A-O 695 736に記載されている。メタクリル酸を可能な限り完全に吸収するために、凝縮の際に付加的な溶媒、例えば水を添加することも考慮できる。
【０１００】
凝縮後に得られた水性メタクリル酸溶液、しかし又は、液相脱水の場合に得られた水性メタクリル酸溶液も、次いで更なる精製工程において水及び他の不純物から除去されることができる。この場合には先ず水が共留剤の存在下で共沸蒸留により除去されることができ、これは例えばDE-A-198 53 064に記載されているとおりである。メタクリル酸の吸収のために高沸性有機溶媒の使用も考慮でき、これは例えばEP-A-0 974 574に開示されているとおりである。この蒸留的方法の他に水除去のための膜も使用でき、これは例えばDE-A-44 01 405に提案されているとおりである。更に、結晶方法による、液相脱水の場合に獲得されたか又は凝縮により得られた水性メタクリル酸溶液の精製が考慮できる。
【０１０１】
脱水により得られたメタクリル酸は更なる方法工程において更に引き続き精製されることができる。したがって更に得られた、高沸性不純物は更なる蒸留工程により除去されることができる。しかし特に好ましくは、脱水後に得られたメタクリル酸が結晶方法により更に精製される場合であり、これは例えばDE-A-101 49 353に記載されるとおりである。
【０１０２】
このように得られた、精製されたメタクリル酸を次いで場合によりエステル化にかけることができる。
【０１０３】
冒頭部で挙げた課題の解決には更に、次の方法工程：
ＩＩＡ）前述の方法により２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを製造する方法工程、
ＩＩＢ）２−ヒドロキシイソ酪酸の形成下でこの２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを開裂し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を中和及び／又はこの２−ヒドロキシイソ酪酸を精製する方法工程、
ＩＩＣ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含むメタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【０１０４】
冒頭部で挙げた課題の解決には、次の方法工程：
ＩＩＩＡ）前述の方法によりメタクリル酸を製造する方法工程、
ＩＩＩＢ）このメタクリル酸をラジカル重合する方法工程
を含み、その際、場合により、このメタクリル酸のカルボキシル基がこのラジカル重合の前又は後に少なくとも部分的にエステル化されることができる
ポリメタクリル酸又はポリメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【０１０５】
以下に記載の実施例は、適用の幅がこの全体の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである本発明をこの実施例に挙げる実施態様に限定することなく、本発明を例示的に記載する。以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ハイブリッドプラスミド pET101/D-TOPO：：icmA-icmBを示す。
【図２】ハイブリッドプラスミド pBBR1MCS-2：：icmA-icmBを示す。
【図３】試料ＩＭ−８６中の２−ヒドロキシイソ酪酸の定量化を２−ヒドロキシイソ酪酸でのこの試料のドーピング後に行った。このメチルアセタート−ピーク（Rt. 7,16 min）をこの場合に内部標準として利用した。このドーピングされたものとこのオリジナル−試料のＧＣ−ＭＳクロマトグラムの抜粋が図示されている。
【図４】試料ＩＭ−８９への２−ヒドロキシイソ酪酸の添加（Aufstockung）を示す。このオリジナル−試料（Ａ）とドーピングされた試料（Ｂ）の試料のＮＭＲスペクトルの抜粋が図示されている。
【０１０７】
実施例
１． ゲノム性ＤＮＡの単離及び断片icmA及びicmBの増幅
アキノコラ・テルシアリカルボニス（Aquincola tertiaricarbonis）株（Ａ．テルシアリカルボニスDSMZ 18512）からキットDNeasy Blood & Tissue (Qiagen GmbH, Hilden)を用いて製造者指示に従いゲノム性ＤＮＡを単離し、ＰＣＲのための鋳型として断片icmA（１．７ｋｂｐ；ＤＱ４３６４５６）及びicmB（０．４ｋｂｐ；ＤＱ４３６４５７）の増幅のために使用した。これらは酵素Ｅ３をコードする。この場合に、オリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＡ＿ｆｗ ５′−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧ−３′(フォワードプライマー;開始コドンは下線を引いてある)及びＡｑｔ−ｉｃｍＡ−Ｈｉｎｄ＿ｒｅｖ ５′−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧ−３′(リバースプライマー;停止コドン及びHindIII切断部位は下線が引いてある)をicmAの増幅のために、そしてオリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＢ−Ｈｉｎｄ＿ｆｗ ５′−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＧＣ−３′(フォワードプライマー;開始コドン及びHindIII切断部位は下線が引いてある)及びＡｑｔ−ｉｃｍＢ＿ｒｅｖ ５′−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣ−３′(リバースプライマー;停止コドンは下線が引いてある)をicmBの増幅のために使用した。
【０１０８】
ポリメラーゼチェーン反応（PCR, SAIKI et al., 1985, Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354.による）を、Pfuポリメラーゼ（Promega, Madison, USA）で開始させた。この場合にそのつど９５℃で６０秒間、６５℃で３０秒間、及び、７２℃で４分間を有する３５サイクルを実施した。このＰＣＲの実施をサーモサイクラー（Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen）において行った。
【０１０９】
この断片をQIAquick PCR精製キット（Qiagen GmbH, Hilden）を用いて製造者指示に従い精製し、これに引き続きHindIIIで制限処理した。両方のバッチを、HindIII切断部位を介してライゲーションした。
【０１１０】
このライゲーション産物icmA-icmB（２．１ｋｂｐ）をオリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＡ＿ｆｗ ５′−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧ−３′（フォワードプライマー；開始コドンは下線を引いてある）及びＡｑｔ−ｉｃｍＢ＿ｒｅｖ ５′−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣ−３′（リバースプライマー；停止コドンは下線を引いてある）を用いたＰｆｕ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した（そのつど９５℃で６０秒間、６５℃で３０秒間、及び７２℃で４．５分間を有する３５サイクル）。この相応するサイズの得られたＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen GmbH, Hilden）を用いて製造者指示に従い精製した。
【０１１１】
２． ラルストニア・ユートロファ発現ベクターの製造
この精製したＰＣＲ断片icmA-icmB（２．１ｋｂｐ）を製造者の指示に従いベクターpET101/D-TOPOにライゲーションした(Invitrogen GmbH, Karlsruhe)。この得られたハイブリッドプラスミドpET101 /D-TOPO : : icmA-icmB(図１、配列番号１)をコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（New England Biolabs, Frankfurt）中に移し、制限処理及び配列決定により制御した。
【０１１２】
野生型として酵素Ｅ1、Ｅ2及びＥ4の活性を有する；Ｒ．ユートロファ株中での発現を達成するために、このコンストラクトは適した広宿主域ベクター中にクローニングされなくてはならなかった。利用されたベクターとは、KOVACH et al. (1995)で記載されているpBBR1MCS-2である。 Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176。
【０１１３】
このためにプラスミドpET101 /D-TOPO : : icmA-icmB及びpBBR1MCS-2を酵素Xbal及びSacIで制限処理し、この断片icmA-icmBを目的ベクターpBBR1MCS-2中にライゲーションし、コンピテント大腸菌DH5α細胞（New England Biolabs, Frankfurt）をこの生じるハイブリッドプラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmB (図２、配列番号２)でトランスフォーメーションした。
【０１１４】
このプラスミドを制限化及び配列決定により検証し、コンピテント大腸菌S17-1細胞中に移し、これを用いてプラスミドの特にラストニア・ユートロファ株中へのコンジュゲートによる移行部が可能である株である。このためにスポット接合（Spotmating）−コンジュゲーション（例えばFRIEDRICH et al.,が1981, Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus . J Bacteriol 147:198-205で記載）を大腸菌S17-1 pBBR1MCS-2 : : icmA-icmBをドナーとして、そして、Ｒ．ユートロファＨ１６（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類される、ＤＳＭＺ４２８）並びにＲ．ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類される、ＤＳＭＺ５４１）をレシピエントとして用いて実施した。プラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmBを有するトランスコンジュゲート体が得られることができた。
【０１１５】
３． 組み換えＲ．ユートロファ細胞中での２−ヒドロキシイソ酪酸の製造
実施例２で記載のプラスミドを有するＲ．ユートロファ株を５０ｍｌのVollbrecht-MSM-培地（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、２．０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、２．１ｇ；ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ；ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ、６ｍｇ；ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ；痕跡量元素−溶液（Pfennig and Lippert, 1966）、０．１ｍＬ）中での２−ヒドロキシイソ酪酸の形成の検査のために使用した。この培地を更にグルコン酸Ｎａ（１５ｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及び補酵素Ｂ１２（６０μｇ／ｍＬ）で補給した。この細胞を温度調節可能な振盪器で３０℃及び１６０ｒｐｍでインキュベーションした。３０ｈ後にグルコン酸Ｎａ（１．５％、ｗ／ｖ）及び補酵素Ｂ１２［６０μｇ／ｍＬ］を後添加した。回収を培養５２ｈ後に５０００ｒｐｍ（４℃）での遠心分離により行った。培養物上清を分析のために−２０℃で貯蔵した。
【０１１６】
２−ヒドロキシイソ酪酸の検出及び定量化を定量的1Ｈ−ＮＭＲ−分光器を用いて行った。この試料を量的に濃縮した。この残留物から１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取り出し、この含量を内部標準としてのＴＳＰ（トリシリルプロピオン酸）に対して精算した。２−ヒドロキシイソ酢酸は約１．３６ｐｐｍでのスペクトル中に一重項を示し、保護（Absicherung）のためにこの純粋な物質で添加した。（図３）。
【０１１７】
この分析した試料中で最大０．７２ｍｍｏｌ／ｋｇの２−ヒドロキシイソ酪酸の濃度が検出された。これに対して空のプラスミドを有する相応するコントロールバッチ中では２−ヒドロキシイソ酪酸は検出されなかった。このＮＭＲ測定を定量的にかつ定性的にＧＣ−ＭＳ及び純粋物質２−ヒドロキシイソ酪酸での添加を用いて確認した（図４）。このクロマトグラフィによる分離をこの場合に３０ｍのRtx-1701キャピラリーカラムで行った（Fisher Scientific, Pittsburgh, USA）。この試料を凍結乾燥後に誘導体化試薬「Methelute」（Pierce, Rockford, USA）で取り込んだ。この溶液０．５μＬを直接的にスプリット−／スプリットレス−インジェクターを介して適用した。２−ヒドロキシイソ酪酸−ピークの同定をこの測定スペクトルとデータバンクスペクトルの調整（Abgleich）により行った。２−ヒドロキシイソ酪酸の含量の見積もりのために一定量の比較物質２−ヒドロキシイソ酪酸でのこの試料のドーピングを行った。この分析した試料中には最大４４μｇ／ｍＬの濃度が検出された。空のプラスミドを有するコントロールバッチ中では２−ヒドロキシイソ酪酸は検出されなかった。同様に、Ｃ供給源（１．５％、ｗ／ｖ）としてフルクトースから出発して合成された２−ヒドロキシイソ酪酸が検出されることができた。
【０１１８】
４． ２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの脱水
実施例３に従い製造された２−ヒドロキシイソ酪酸（０．２ｇ／Ｌ）の溶液５ｍｌを撹拌しながらＮａＯＨ（０．０６ｍｇ）と混合する。この溶液を撹拌及び１８５〜１９５℃での環流冷却下で真空下（３００ｔｏｒｒ）でインキュベーションする。５ｈの期間にわたり毎時そのつど、５ｍＬ中の更なる０．５ｍｇの２−ヒドロキシイソ酪酸を添加し、これは０．４質量％のｐ−メトキシフェノールを、メタクリラートの重合を妨げるべく含有した。インキュベーション２４ｈ後にこの反応を終了する。２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの変換は９０％超に達する。この反応バッチからのメタクリル酸の分離を蒸留により行う。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明の主題は、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞である。
【０００２】
先行技術
メタクリル酸、そのエステル及びポリマーはアクリルガラス板、射出成形生成物、コーティング及び他の種々の製品の製造の際に幅広く適用される。
【０００３】
メタクリル酸の製造方法の多くが知られている。但し、この商業的な製造のうち世界最大の部分は、メタクリル酸のアミドスルファートの加水分解のための化学的方法を基礎とし、これはこの相応する２−ヒドロキシニトリルから製造され、その際約１．６ｋｇの硫酸が１ｋｇのメタクリル酸の製造のために必要とされる。
【０００４】
メタクリル酸への２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＩＢ）の化学的変換は９６％までの収率でもってUS 3,666,805及びUS 5,225,594に記載されている。
【０００５】
メタクリル酸の代替的な製造方法は、ニトリル加水分解性酵素の利用下での２−ヒドロキシニトリルから２−ヒドロキシイソ酪酸への加水分解により生じる。この場合に、前記酵素は、ニトリラーゼ又はニトリル−ヒドラターゼとアミダーゼとからの組み合わせ物である（A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60:3344及びUS 6,582,943）。この方法の重大な欠点は、効率的なニトリル加水分解性酵素活性のために必要な中性のｐＨ範囲内におけるニトリルの不安定性である。反応混合物中でのニトリルの分解はケトン及びシアニドの蓄積を招き、これらは共にニトリル加水分解性酵素活性を阻害する。
【０００６】
両者の方法、即ち、現在支配的であるアミド−スルファートをベースとする方法及び酵素によるニトリル加水分解法の一般的な欠点は、２−ヒドロキシニトリルが必要であることである。２−ヒドロキシニトリルはまず、環境に有害な出発物質、即ちケトン及びシアニドから製造されねばならない。
【０００７】
酵素による、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを分解する物質代謝経路を介した２−ヒドロキシイソ酪酸の代替的な提供方法はCA 2,510, 657から知られている。
【０００８】
更なる、酵素による２−ヒドロキシイソ酪酸の提供方法はPCT/EP2007/052830から知られている。ここでは、ムターゼ ３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ（３−ＨＢＣｏＡ）を用いて予備生成物として２−ヒドロキシ酪酸に変換される。この詳説された方法は以下の欠点を示す：この詳説された方法は不連続的であり、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）は外から出発材料として添加され、この方法条件は不活性ガスを必要とする。この変換率は２０％である。
【０００９】
したがって、この記載の欠点を克服する、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法は有利であろう。
【００１０】
したがって、本発明の課題は、メタクリル酸、そのエステル及びポリマーに更に加工されることができる、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートのための予備生成物についての要求を保証する、２−ヒドロキシイソ酪酸の形成方法を提供することであった。
【００１１】
本発明の説明
意外なことに、アセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを介して予備生成物として、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成が、前述の課題解決に寄与することが見出された。
【００１２】
概念「予備生成物」とは、本願で使用される場合には、単に１の酵素の使用により酵素による経路で所望の生成物へと反応させられることができる化学化合物を定義し、その一方で、概念「中間生成物」とは、少なくとも２の酵素の使用により酵素による経路で所望の生成物へ反応させられることができる化学化合物を定義し、その際、「化学化合物」とは、補酵素Ａ−チオエステル−官能化あり又はなしで等価に見られるべきものであり、したがってチオエステルを形成するか又は開裂する酵素は考慮されない。
【００１３】
したがって、本発明の主題は、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞である。
【００１４】
本発明の更なる一主題は、本発明による細胞の製造方法及び本発明による細胞を用いた２−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法並びにメタクリル酸の製造方法である。
【００１５】
本発明の一利点は、２−ヒドロキシイソ酪酸又はメタクリル酸を再生可能な（nachwachsend）原料から、例えば炭水化物から及び／又はグリセリンから製造できるが、しかし、化石燃料から誘導された原料、例えばメタノールからも製造でき、これにより化石原料の変動する供給性の問題を回避できることである。
【００１６】
本発明の更なる一利点は、本発明による方法ではほとんど熱負荷してない工程を用いて、かつ、一般的に少ない方法工程を用いて、メタクリル酸が得られることができることである。
【００１７】
本発明のまた更なる一利点は、様々な毒性の又は攻撃性の物質の回避であり、これは例えば２−ヒドロキシイソ酪酸の従来の化学的方法において生じる。
【００１８】
本発明は以下において例示的に記載され、この場合に本発明はこの例示的な実施態様に限定されるべきではない。
【００１９】
全ての記載されたパーセント（％）は、他のことが記載されていない場合には、質量パーセントである。
【００２０】
概念「２−ヒドロキシイソ酪酸」とは、本願で使用される場合には、常に、ｐＨ値に依存してこの相応する微生物による形成後に存在する形態にあるこの相応するＣ4−カルボン酸を記載する。したがって、この概念は、常に、純粋な酸形態（２−ヒドロキシイソ酪酸）、純粋な塩基形態（２−ヒドロキシイソブチラート）並びにこの酸のプロトン化及び脱プロトン化した形態を含む。
【００２１】
更に、概念「３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ」は根本的に、（Ｒ）−立体異性もまた同様に（Ｓ）−立体異性も含み、その際（Ｒ）−立体異性は特に好ましい。
【００２２】
「その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成できる」との表現は、この遺伝子工学的に改変された細胞の野生型が全くもって２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成できず、しかし、少なくともこれら化合物の検出可能な量を形成できず、そして、この遺伝子工学的改変により初めてこの成分の検出可能な量が形成されることができる場合も該当する。細胞の「野生型」とは、好ましくは、そのゲノムが進化により自然に発生したような状態にある細胞を指す。この概念は、この全体的な細胞にもまた同様に個々の遺伝子にも使用される。したがって、概念「野生型」とは特に、その遺伝子配列が少なくとも部分的に人的に組み換え方法を用いて改変されているような細胞又はそのような遺伝子には当てはまらない。
【００２３】
この２−ヒドロキシイソ酪酸からは引き続き、慎重な脱水反応によりメタクリル酸が得られることができる。２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの場合には、この細胞中に含まれる、このポリヒドロキシアルカノアートで満たされているグラナが単離され、引き続き、このポリマーが２−ヒドロキシイソ酪酸を取得しながら開裂されることができ、次にこれはメタクリル酸を取得しながら脱水されることができる。
【００２４】
この場合に、本発明により好ましいのは、この遺伝子工学的に改変された細胞が、これが定義された時間間隔において、好ましくは２時間の間、更に一層好ましくは８時間の間、最も好ましくは２４時間の間、この細胞の野生型に比較して少なくとも２倍、特に好ましくは１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更に一層より好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍より多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成するように遺伝子工学的に改変されていることである。この生成物形成の増加はこの場合に、例えば次のように決定されることができる：本発明による細胞及びこの野生型の細胞をそれぞれ別個に同じ条件（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）下で一定の時間間隔にわたり適した栄養培地中で培養させ、引き続き目的生成物（２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアート）に関する量を、２−ヒドロキシイソ酪酸の場合には細胞上清中で、又は、２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの場合には細胞中で決定する。本発明による細胞は原核生物又は真核生物であることができる。この場合に、これは、哺乳動物細胞（例えばヒトからの細胞）、植物細胞又は微生物、例えば酵母、菌類又は細菌であることができ、この場合に微生物が特に好ましく、細菌及び酵母が最も好ましい。
【００２５】
細菌、酵母又は菌類としては特に、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig,ドイツ国、で細菌株、酵母株又は菌株として寄託されている細菌、酵母又は菌類が適する。本発明により適した細菌は、
http : //www. dsmz . de/species/bacteria .htm
で記載の属に属し、本発明により適した酵母は、
http : //www. dsmz . de/species/yeasts .htm
で記載の属に属し、そして、本発明により適した菌類は、
http : //www. dsmz . de/species/fungi .htm
で記載のものである。
【００２６】
本発明により好ましい細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイサイス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）の属のものであり、その際、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、メチロバクテリウム・エキストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、特にラルストニア・ユートロファＨ１６（Ralstonia eutropha H16）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が特に好ましい。
【００２７】
したがって、その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを中間生成物としてアセトアセチル−補酵素Ａを介して、そして、予備生成物として３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを介して形成することができる本発明の細胞は、アセトアセチル−補酵素Ａから３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの反応を触媒作用する酵素Ｅ1の活性を有する。
【００２８】
酵素Ｅ1は、好ましくは以下を含む群から選択された酵素である：
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）、
アセトアセチル−補酵素Ａレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）、
長鎖−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（（ＥＣ１．１．１．２１１）及び
３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）。
【００２９】
この酵素は好ましくはphaB、phbB、fabG、phbN1、phbB2又はからなる群から選択された遺伝子によりコードされ、その際がphaB、phbBが特に好ましいこの遺伝子のヌクレオチド配列は例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-データバンク)、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, ドイツ国又はCambridge, UK)のヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００３０】
本発明による細胞にとっては、本発明による細胞がその野生型と比較して酵素Ｅ1の上昇した活性を有することが好ましくあってよく、この酵素はアセトセチル−補酵素Ａの３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００３１】
酵素Ｅ1との関連で前述し、かつ、以下の詳細な説明において酵素Ｅ2等との関連において使用されるとおり、概念「酵素の上昇した活性」とは、好ましくは、上昇した細胞内活性が理解される。
【００３２】
細胞中での酵素活性の向上のための以下の詳細な説明は、酵素Ｅ1の活性の向上のためにもまた同様にその活性が場合により向上させられることができる以下に挙げる酵素全てについても当てはまる。
【００３３】
根本的に、酵素活性の上昇は、この酵素をコードする１の遺伝子配列又は複数の遺伝子配列のコピー数を向上させる、強力なプロモーターを使用する、この遺伝子のコドン利用を改変する、様々な手法でこのｍＲＮＡ又はこの酵素の半値時間を向上させる、この遺伝子の発現の制御を調節するか、又は、上昇した活性でもってこの相応する酵素をコードする遺伝子又はアレルを使用し、かつ、場合により、これら処置を組み合わせることにより達成される。本発明により遺伝子工学的に改変された細胞は例えば、トランスフォーメーション、形質導入、コンジュゲーション又はこれら方法の組み合わせにより、ベクターを用いて生じさせられ、これはこの所望の遺伝子、この遺伝子のアレル又はこの部分及びこの遺伝子の発現を可能にするプロモーターを含有する。この非相同発現は特にこの細胞の染色体中へのこの遺伝子又はアレルの組み込み又は染色体外で複製するベクターにより達成される。
【００３４】
ピルビン酸−カルボキシラーゼを例にとって細胞中での酵素活性の向上のための手段に関する概要DE A-100 31 999は示し、これは参照により参照文献として導入され、この開示内容は細胞中での酵素活性の向上のための手段に関して本発明の開示の一部を構成する。
【００３５】
前述の及び全ての後述の酵素又は遺伝子の発現は、１−及び２−次元のタンパク質走行分離及び引き続くタンパク質濃度の光学的同定を用いて相応する評価ソフトウェアを使用してゲル中で検出可能である。酵素活性の向上がこの相応する遺伝子の発現の向上のみを基礎とする場合には、この酵素活性の向上の定量化は容易に、野生型と遺伝子工学的に改変された細胞間の１又は２次元のタンパク質走行分離の比較により測定されることができる。コリネフォルメ細菌でのこのタンパク質ゲルの調整のための及びこのタンパク質の同定のための慣用の方法はHermann et al.(Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) により記載された方法様式である。このタンパク質濃度は同様に、検出すべきタンパク質にとって特異的な抗体を用いてウェスタン−ブロット−ハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）及び濃度測定のための相応するソフトウェアを用いて引き続く光学的評価（Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647）により分析されることができる。ＤＮＡ結合性タンパク質の活性はＤＮＡ−バンド−シフト−アッセイ（ゲルリターデーションとも呼ばれる）を用いて測定されることができる（Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155）。ＤＮＡ結合性タンパク質の他の遺伝子の発現に対する作用は様々な豊富に記載されている、リポート遺伝子−アッセイ方法により検出されることができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内酵素活性は様々な記載された方法（Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823）により測定されることができる。以下の詳説において特定の酵素の活性の測定のための具体的方法が挙げられていない場合には、この酵素活性の上昇の測定及びまたこの酵素活性の減少の測定は好ましくはHermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)及びWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)中で記載の方法を用いて行われる。
【００３６】
この酵素活性の向上が内因性遺伝子の突然変異により実施される場合には、この種の突然変異は典型的な方法により狙いを定めないで生じさせられることができ、これは例えばＵＶ照射により又は突然変異誘発性化学薬品により生じさせられることができ、又は、狙いを定めて、遺伝子工学的方法により、例えば（１又は複数の）欠失、（１又は複数の）挿入及び／又は（１又は複数の）ヌクレオオチド交換により生じさせられることができる。この突然変異により改変された細胞が得られる。
【００３７】
酵素の特に好ましい突然変異はとりわけ、フィードバック阻害可能性をもはや有しないか又は少なくとも野生型−酵素と比較して減少したフィードバック阻害可能性を有するような酵素である。
【００３８】
酵素活性の向上が酵素の合成の向上により実施される場合には、例えばこの相応する遺伝子のコピー数を向上させるか又はプロモーター−及び調節配列又はリボソーム結合部位を突然変異させ、これはこの構造遺伝子の上流に存在する。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより付加的に、この発現をそれぞれ任意の時間点で上昇させることが可能である。更に、しかし、酵素−遺伝子に調節性配列としていわゆる「エンハンサー」も配置されていることができ、これはＲＮＡ−ポリメラーゼとＤＮＡの間の改善された相互作用を介して同様に向上した遺伝子発現を引き起こす。このｍＲＮＡの寿命の延長化のための処置により同様にこの発現が改善される。
【００３９】
更に、この酵素タンパク質の分解の防止により同様にこの酵素活性が増強される。この遺伝子又は遺伝子コンストラクトはこの場合に、様々なコピー数でもってプラスミド中に存在するか、又は、染色体中に組み込まれ、増幅される。代替的に、更に、当該遺伝子の過剰発現がこの培地組成物及び培養操作の改変により達成されることができる。
【００４０】
このためのマニュアルを当業者は特にMartin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))で、Guerrero et al.(Gene 138, 35-41 (1994))で、Tsuchiya及びMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))で、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))で、EP-A-0 472 869に、US 4,601,893に、Schwarzer und Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)で、Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))で、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、WO-A-96/15246に、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)で、JP-A-10-229891に、Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))に及び遺伝学及び分子生物学の公知の教科書に見出す。前述の処置は突然変異と同様に遺伝子工学的に改変した細胞を生じる。
【００４１】
このそれぞれの遺伝子の発現の向上には例えばエピソーム性プラスミドが使用される。プラスミド又はベクターとして原則的に当業者にこの目的のために提供される実施形態の全てが考慮される。この種のプラスミド及びベクターは例えば、Novagen社、Promega、New England Biolabs、Clontech又はGibco BRLのパンフレットから取り出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは以下に見出すことができる：Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R. L.及びDenhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) , Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F.及びManiatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York。
【００４２】
増幅すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターを引き続き、コンジュゲーション又はトランスフォーメーションにより所望の株に移す。コンジュゲーションの方法は例えばSchaefer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)に記載されている。トランスフォーメーションのための方法は例えばThierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican及びShivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)及びTauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)に記載されている。「cross-over」事象を用いた相同性組み換え後にこの生じる株は当該遺伝子の少なくとも２のコピーを含有する。
【００４３】
前述及び後述の詳説で使用される表現「その野生型に比較した酵素Ｅxの上昇した活性」とは好ましくは、常に、このそれぞれの酵素Ｅxの少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更に一層好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍上昇した活性を理解すべきである。更に、「その野生型に対して酵素Ｅxの上昇した活性」を有する本発明による細胞は、特に、その野生型がこの酵素Ｅxの活性を有しないか又は少なくとも検出可能な活性を有さず、かつ、この酵素活性の向上により、例えば過剰発現により、初めてこの酵素Ｅxの検出可能な活性を示す細胞を含む。この関連において、概念「過剰発現」又は以下の詳説で使用される表現「発現の向上」は、出発細胞、例えば野生型細胞が発現を有しないか又は少なくとも検出可能な発現を有さず、かつ、組み換え方法により初めてこの酵素Ｅxの検出可能な合成が誘発される場合も含む。
【００４４】
以下使用される表現「酵素Ｅxの減少した活性」とは、これに応じて好ましくは、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、更に好ましくは少なくとも０．０１倍、更に一層好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍減少した活性が理解される。表現「減少した活性」は検出可能な活性も含まない（ゼロの活性）。特定の酵素の活性の減少化は例えば狙いを定めた突然変異により、競合性の又は非競合性の阻害剤の添加により、又は特定の酵素の活性の減少化のために当業者に知られた他の処置により行われることができる。
【００４５】
その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロイシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として形成することができる本発明による細胞が、炭水化物、グリセリン、油及び脂肪、二酸化炭素、カルボン酸又はメタノールを炭素供給源として使用できることが好ましい。
【００４６】
更に、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロイシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として形成することができる本発明による細胞にとっては、この細胞が、場合により酵素Ｅ1の活性に付加して、酵素Ｅ2の活性、好ましくは、その野生型と比較して酵素Ｅ2の上昇した活性を有し、これが２のアセチル−補酵素Ａからアセト−アセチル補酵素Ａへの反応を触媒作用することが好ましい。
【００４７】
酵素Ｅ2とは、好ましくは、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ数 ２．３．１．９）である。この酵素は好ましくは、acat1, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erg10, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, thl, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiL1, thiL2, acaB1, acaB2, acaB3又はacaB4からなる群から選択される遺伝子によりコードされ、その際、acat1, acat2, atoB, thlA, thlB, phaA及びphbA、特に好ましくはphaA及びphbAである。
【００４８】
この遺伝子のヌクレオチド配列は例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-データバンク)、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, ドイツ国又はCambridge, UK)のヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００４９】
本発明による細胞は好ましくは酵素Ｅ3の少なくとも１の活性を、好ましくはその野生型と比較して酵素Ｅ3の上昇した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａから２−ヒドロキシイソブチリル補酵素Ａの反応を触媒作用する。酵素Ｅ3は好ましくはヒドロキシル−イソブチリル−ＣｏＡムターゼ、イソブチリル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．１３）又はメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．２）であり、そのつど好ましくは補酵素Ｂ１２依存性ムターゼである。
【００５０】
酵素Ｅ3は好ましくは微生物アキノコラ・テルシアリカルボニス（Aquincola tertiaricarbonis）Ｌ１０８、ＤＳＭ１８０２８、ＤＳＭ１８５１２、メチリビウム・ペテロレイフィリウムＰＭ１（Methylibium petroleiphilum PM1）、メチリビウム種（Methylibium sp .）Ｒ８、キサントバクター・オートトロフィカスＰｙ２（Xanthobacter autotrophicus Py2）、ロドバクター・スフェロイダス（Rhodobacter sphaeroides）（ATCC 17029）、ノカルジオイデス種（Nocardioides sp .）ＪＳ６１４、マリノバクター・アルギコラ（Marinobacter algicola）ＤＧ８９３、シノリゾビウム・メディカエ（Sinorhizobium medicae）ＷＳＭ４１９、ロセノバリウス種（Roseovarius sp .）２１７、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＳＭ３６３８から単離される酵素、特に好ましくはＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２８３０に記載の補酵素Ｂ１２依存性ムターゼ、並びに、少なくとも１のその部分配列中にＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２８３０に記載のムターゼ（アクセッション番号DQ436457.1及びDQ436456.1）の小又は大サブユニットのアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも６０％、有利には少なくとも８０％、特に有利には少なくとも９５％、特にとりわけ好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する酵素であり、これは期待閾値（expect threshold）１０、ワードサイズ３、blosum62マトリックスでもって存在：１１及び伸長１のギャップコスト及び条件組成スコアマトリックス調節（conditional compositional score matrix adjustment）でもってblastpアルゴリズムにより測定される。
【００５１】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は野生型として酵素Ｅ4の活性を、好ましくはその野生型に比較して少なくとも１の酵素Ｅ4の低下した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからポリヒドロキシブチラートへの反応を触媒作用する。
【００５２】
酵素Ｅ4は好ましくはポリヒドロキシアルカノアート合成酵素、特に好ましくはポリヒドロキシブチラート合成酵素である。この酵素は好ましくは遺伝子phbC又はphaCによりコードされ、その際phaCが特に好ましい。
【００５３】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の更なる好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は野生型として酵素Ｅ5の活性を、特にその野生型に比較して酵素Ｅ5の低下した活性を有し、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａからクロトニル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００５４】
酵素Ｅ5は好ましくはクロトナーゼ（ＥＣ数４．２．１．５５）又は（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ数４．２．１．１７）である。この酵素は好ましくはcrt, crt1, crt2, fadB, paaFからなる群から選択される遺伝子によりコードされ、その際crt並びにクロストリジンからのこの相応する遺伝子が好ましく、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）からのcrtが特に好ましい。
【００５５】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞の更なる好ましい一実施態様においては、本発明による細胞は酵素Ｅ6の活性を、好ましくはその野生型に比較して酵素Ｅ6の低下した活性を有し、これはＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素ＡからＳ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する。
【００５６】
酵素Ｅ6とは好ましくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＥＣ ５．１．２．３）である。この酵素は好ましくはfadB, fadB1, fadB2, fadJ, fabJ-1, faoA yfcXからなる群から選択された遺伝子によりコードされ、その際fadB, fadJ, yfcXが好ましく、fadB, fadJが特に好ましい。
【００５７】
更に、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、そして、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａを予備生成物として形成することができる本発明の細胞にとっては、本発明による細胞がその野生型に比較して少なくとも１の酵素Ｅ7の低下した活性を有することが好ましく、これは３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを基質として許容する。
【００５８】
冒頭部で挙げた課題解決のためには次の方法工程：
ａ）本発明による細胞を、炭素供給源を含む栄養培地と、この炭素供給源から２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートが形成される条件下で接触させる方法工程、並びに、場合により
ｂ）２−ヒドロキシイソ酪酸をこの栄養培地から、又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをこの細胞から精製する方法工程
を含む２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法が更に寄与する。
【００５９】
炭素供給源として例えば次のものが使用されることができる：
炭水化物［例えば単糖（例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、アラビノース、キシロース）、オリゴ糖（例えばマルトース、サッカロース、ラクトース）、及び多糖（例えばデンプン、加水分解処理されたデンプン、セルロース、加水分解処理されたセルロース、ヘミセルロース、加水分解処理されたヘミセルロース）］、並びにその反応生成物、例えば
糖アルコール及びポリヒドロキシ酸；
二酸化炭素；
有機の、場合により１又は複数の、例えば１、２、３又は４個のヒドロキシル基を有するモノ−、ジ−及びトリカルボン酸、例えば酢酸、酒石酸、イタコン酸、コハク酸、プロピオン酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、２，５−フランジカルボン酸、グルタル酸、レブリン酸、グルコン酸、アコニット酸、コハク酸及び
ジアミノピメリン酸、クエン酸；
脂質；
油又は脂肪、例えばナタネ油、大豆油、パーム油、ヒマワリ油、落花生油及びヤシ油；
飽和及び不飽和脂肪酸であって好ましくは１０〜２２個のＣ原子を有するもの、例えばγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸；
炭化水素、例えばメタン；
アルコール、例えば１〜２２個のＣ原子を有するもの、例えばブタノール、メタノール、エタノール；
ジオールであって好ましくは３〜８個のＣ原子を有するもの、例えばプロパンジオール及びブタンジオール；
３以上の、例えば３、４、５又は６個のＯＨ基を有する多価（高級とも呼ばれる）アルコール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、キシリトール及びアラビニトール；
ケトンであって好ましくは３〜１０個のＣ原子及び場合により１以上のヒドロキシル基を有するもの、例えばアセトン及びアセトイン；
ラクトン、例えばγ−ブチロラクトン、シクロデキストリン、生体高分子、例えばポリヒドロキシアセタート、ポリエステル、例えばポリラクチド、多糖、ポリイソプレノイド、ポリアミド；
芳香族化合物、例えば芳香族アミン、バニリン及びインジゴ；
タンパク質、例えば酵素、例えばアミラーゼ、ペクチナーゼ、酸、ハイブリッドの又は中性のセルラーゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、パンクレアーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ及びオキシドレダクターゼ、例えばラッカーゼ、ケタラーゼ及びペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ；カロテノイド、例えばリコピン、β−カロチン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン及びカンタキサンチン；
タンパク質性及び非タンパク質性アミノ酸、例えばリシン、グルタマート、メチオニン、フェニルアラニン、アルパルギン酸、トリプトファン及びトレオニン；
プリン−及びピリミジン塩基；
ヌクレオシド及びヌクレオチド、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びアデノシン−５′−一リン酸（ＡＭＰ）；
並びに前述の化合物の前駆体及び誘導体、例えば挙げられた酸の場合にはその塩。
【００６０】
これらの物質は、単独で又は混合として使用されることができる。特に好ましくは炭水化物、特に単糖、オリゴ糖又は多糖、例えばUS 6,136,576に記載されているようなもの、Ｃ5−糖又はグリセリンの使用である。メタノールは好ましく使用すべきアルコールであり、というのもこれは多数の様々な供給源、例えばバイオガス、バイオマス、天然ガス又は石炭から製造されることができるからである。炭素供給源は、様々な形態で（純粋に又は溶液／懸濁液中で）かつ様々な組成で（精製して又は粗生成物として）、様々な加工段階（例えばサトウキビジュース、シロップ、糖蜜、粗糖、結晶糖；トウモロコシ粒（Maiskorn）、小麦粉、デンプン、デキストリン、グルコース）から、処理（蒸気爆発、酸予備処理、酵素による前処理）前又は後に使用されることができる。
【００６１】
好ましい代替的な一実施態様において、この炭素供給源はＣＯ2又はＣＯ、特に合成ガスを含む。この関連において使用される本発明による細胞は、アセトゲン（acetogen）細胞、例えば、アセトバクテリウムの属の種類、例えばＡ．ウッディ（woodii）及びクロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）である。特には、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アセトアンアエロビウム・ノテラ（Acetoanaerobium notera）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ユウバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）及びクロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）を含む群から選択されているこのアセトゲン細胞である。この関連において特に適した細胞はクロストリジウム・カルボキシディボランスであり、特に例えば「Ｐ７」及び「Ｐ１１」の株のものである。このような細胞は例えばUS 2007/0275447及びUS 2008/0057554に記載されている。更なる、この関連において特に適した細胞は、クロストリジウム・リュングダリイであり、特にクロストリジウム・リュングダリイＰＥＴＣ、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ２、クロストリジウム・リュングダリイＣ０１及びクロストリジウム・リュングダリイＯ５２を含む群から選択された株であり、かつ、WO 98/00558及びWO 00/68407に記載される。
【００６２】
本発明による、遺伝子工学的に改変された細胞は連続的に又は不連続的にバッチ法（バッチ培養）で又は流加培養法（供給法）又はrepeated-fed-batch法（繰り返した流加培養法）で２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造の目的で栄養培地と接触され、これにより培養されることができる。半連続方法も考慮でき、これは例えばGB-A-1009370に記載されている。公知の培養方法に関する概要は、Chmielによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００６３】
使用すべき培養培地は適したように、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)の教科書「Manual of Methods for General Bacteriology」に含まれている。
【００６４】
窒素供給源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用されることができる。前記窒素供給源は、単独で又は混合として使用されることができる。
【００６５】
リン供給源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用されることができる。前記培養培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなくてはならず、これらは成長に必要である。最後に、必須成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に付加的に使用することができる。培養培地にはその上適した前駆体が添加されることができる。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給されてよい。
【００６６】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸を適した方法で使用する。泡の発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用できる。プラスミドの安定性の維持のために前記溶媒に、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加できる。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を前記培養物中に導入する。この培養物の温度は、通常は２０℃〜４５℃、有利には２５℃〜４０℃である特に、グリセリンを基質として変換できる細胞の使用の際には、細胞としてUS 6,803,218に記載されるような細胞を使用することが好ましくあることができる。この場合には細胞は４０〜１００℃の範囲で培養されることができる。
【００６７】
２−ヒドロキシイソ酪酸のこの栄養溶液からの精製は好ましくは連続的に行われ、その際この関連においてこの２−ヒドロキシイソ酪酸の製造も発酵を介して連続的に実施することが更に好ましく、この結果、２−ヒドロキシイソ酪酸の製造から発酵ブイヨンからのその精製までの全プロセスが実施されることができる。この発酵ブイヨンからの２−ヒドロキシイソ酪酸の製造の連続的精製のためにはこれは連続的にこの発酵の際に使用される微生物の分離のための装置を介して、好ましくは２０〜２００ｋＤａの範囲の排除大きさを有するフィルターを介して実施され、この中では固／液分離が生じる。遠心分離、適した沈殿装置の使用又はこれら装置の組み合わせも考慮でき、その際、この微生物の少なくとも一部をまずは沈殿を介して分離し、引き続き微生物から一部除去された発酵ブイヨンを限外濾過又は遠心分離装置に供給することが特に好ましい。
【００６８】
その２−ヒドロキシイソ酪酸−含分に関して濃縮された発酵結果物はこの微生物の分離後に好ましくは多工程の分離設備に供給される。この分離設備においては複数の相前後して接続した分離段階が予定されており、ここからそのつど返送ラインにつながり（ausmuenden）、これは発酵タンクに戻されている。更にこのそのつどの分離段階から排出ラインが導出（herausfuehren）される。この個々の分離段階は電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過の原理に応じて作業されることができる。通常これは個々の分離段階中の膜−分離機である。この個々の分離段階の選択は、発酵副生成物及び基質残分の種類及び範囲から明らかである。
【００６９】
終生成物として水性２−ヒドロキシイソ酪酸−溶液がこの過程で得られる電気透析、逆浸透、限外濾過又はナノ濾過を用いた２−ヒドロキシイソ酪酸の分離の他に、２−ヒドロキシイソ酪酸は抽出方法によってもこの微生物を除去した発酵溶液から分離されることができ、その際、この場合には最終的に、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸が得られることができる。抽出を介した２−ヒドロキシイソ酪酸の分離のためには発酵溶液には例えばアンモニウム化合物又はアミンが、２−ヒドロキシイソ酪酸のアンモニウム塩を形成するために、添加されることができる。このアンモニウム塩は次いでこの発酵溶液から分離されることができ、この中には有機抽出剤が添加され、かつ、このようにして得られた混合物は引き続き加熱され、これによりこのアンモニウム塩は有機相中に濃縮する。この相からは次いで２−ヒドロキシイソ酪酸が、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸を獲得しながら例えば更なる抽出工程により単離されることができる。この分離方法についてのより正確な詳細はWO-A-02/090312から取り出すことができ、この開示の内容は発酵溶液からのヒドロキシカルボン酸の分離に関して参照により参照文献として導入され、かつ、本出願の開示の一部を構成する。
【００７０】
この発酵溶液からの２−ヒドロキシイソ酪酸の分離の手法に応じて、２〜９０質量％、好ましくは７．５〜５０質量％、特に好ましくは１０〜２５質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水性２−ヒドロキシイソ酪酸−溶液、しかし又は、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸のいずれかが得られる。
【００７１】
２−ヒドロキシイソ酪酸は濃度の上昇と共に、その環式ダイマー（テトラメチルグリコライド、ＴＭＧ）を形成する傾向がある。このダイマーは本発明による方法の脱水工程において２−ヒドロキシイソ酪酸と同様に処理されることができ、したがって以下においてはこの方法工程のためには常に「２−ヒドロキシイソ酪酸」の概念に含まれる。
【００７２】
更に、本発明による方法により製造された２−ヒドロキシイソ酢酸は、この精製の前、間又は後に更に中和されることができ、その際、このためには例えば塩基、例えばアルカリ−又はアルカリ土類金属水酸化物、例えば水酸化カルシウム又は水酸化ナトリウム、又は例えばＮＨ3又はＮＨ4ＯＨも使用されることができる。
【００７３】
冒頭部で挙げた課題解決には特に、次の方法工程：
ＩＡ）２−ヒドロキシイソ酪酸を前述の方法により製造し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を精製及び／又は中和する方法工程、
ＩＢ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する方法工程
を含むメタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【００７４】
方法工程ＩＢ）によれば２−ヒドロキシイソ酪酸はメタクリル酸の形成下で脱水され、その際このためにはこの発酵溶液から単離された、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸、しかし又は、この発酵溶液の後処理の際に単離された水性２−ヒドロキシイソ酪酸溶液のいずれかが使用されることができ、その際、これは場合により更に、脱水前に例えば蒸留により、場合により適した共留剤の存在下で濃縮される。
【００７５】
この脱水は根本的には液相中で又は気相中で実施されることができる。更に、本発明により、この脱水を触媒の存在下で行うことが好ましく、この場合にはこの使用される触媒の種類は気相−又は液相反応のいずれが実施されるかに依存する。
【００７６】
脱水化触媒として酸性触媒もまた同様にアルカリ性触媒も考慮される。酸性触媒は特にオリゴマー形成のための少ない傾向のために好ましい。脱水触媒は均一系触媒としてもまた同様に不均一系触媒としても使用されることができる。脱水触媒が不均一系触媒として存在する場合には、脱水触媒が担体ｘと接触することが好ましい。担体ｘとしては当業者にとって適しているように見える全ての固形物質が考慮される。この関連において、この固形物質が適した孔体積を有することが好ましく、これは脱水触媒の良好な結合及び収容に適している。更に、DIN 66133に応じた、０．０１〜３ｍｌ／ｇの範囲内にある全孔体積が好ましく、０．１〜１．５ｍｌ／ｇの範囲内にある全孔体積が特に好ましい。その上、担体ｘとして適した固形物質が、ＤＩＮ ６６１３１に応じたＢＥＴ試験により、０．００１〜１０００ｍ2／ｇの範囲内の、好ましくは０．００５〜４５０ｍ2／ｇの範囲内の、更に好ましくは０．０１〜３００ｍ2／ｇの範囲内の表面積を有することが好ましい。脱水触媒のための担体としては、一方では、０．１〜４０ｍｍの範囲内の、好ましくは１〜１０ｍｍの範囲内の、更に好ましくは１．５〜５ｍｍの範囲内の平均粒子直径を有するばら材（Schuettgut）が使用されることができる。更に、脱水反応器の壁が担体として使用されることができる。更に、担体は自体で酸性又は塩基性であることができるか又は酸性又は塩基性の脱水触媒が不活性担体に設けられることができる。設ける技術として特に浸漬又は含浸又は担体マトリックス中への混和を挙げることができる。
【００７７】
脱水触媒特性をも有することができる担体ｘとしては特に、天然又は合成のシリカート性物質、例えば特にモルデナイト、モンモリロナイト、酸性ゼオライト；一、二又は多塩基性の無機酸、特にリン酸、又は無機酸の酸性塩でコーティングした担体物質、例えば、酸化物性又はシリカート性物質、例えばＡｌ2Ｏ3、ＴｉＯ2；酸化物及び混合酸化物、例えばγ−Ａｌ2Ｏ3及びＺｎＯ−Ａｌ2Ｏ3−混合酸化物であってヘテロポリ酸のものが適している。
【００７８】
これは、担体ｘが少なくとも部分的に酸化物性化合物からなる本発明による実施態様に当たる。この種の酸化物性化合物はＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌ、Ｐの少なくとも１の元素又はこの少なくとも２の組み合わせを有するものである。この種の担体は自体でその酸性の又は塩基性の特性により脱水触媒として作用することもできる。好ましい、ｘとしての担体としてもまた同様に脱水触媒としても作用する化合物クラスは、ケイ素／アルミニウム／リン酸化物を包含する。好ましい、塩基性の、脱水触媒としてもまた同様に担体ｘとしても機能する物質は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ランタン、ランタノイド又はこの少なくとも２の組み合わせをその酸化物の形で包含する。この種の酸性の又は塩基性の脱水触媒はEvonik Degussa GmbHでもまた同様にSuedchemie AGでも入手できる。イオン交換体は更なるクラスを示す。これも塩基性のまた同様に酸性の形に存在することができる。
【００７９】
均一系脱水触媒としては特に無機酸、好ましくはリン含有酸、更に好ましくはリン酸が考慮される。これら無機酸は担体ｘに浸漬又は含浸により固定化されることができる。
【００８０】
特に気相脱水では不均一系触媒の使用が特に信頼できる。しかし液相脱水では均一系脱水触媒もまた同様に不均一系脱水触媒も使用される。
【００８１】
その上、本発明による方法においては、＋１〜−１０の範囲内の、好ましくは＋２〜−８．２の範囲内の、更に好ましくは液相脱水の際に＋２〜−３の範囲内の、気相脱水において−３〜−８．２の範囲内のＨ０値を有する脱水触媒が使用されることが好ましい。このＨ０値は、Haemmertによる酸度関数に当たり、かつ、いわゆるアミン滴定及び指示薬の使用により又は気状塩基の吸収により算出される（"Studies in Surface Science and Catalytics", Vol. 51, 1989: "New solid Acids and Bases, their catalytic Properties", K. Tannabe et al 参照のこと）。
【００８２】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、酸性固形物質触媒として無機酸と、好ましくはリン酸と又は超酸と、例えば硫酸化（suldatisieren）又はホスファチド化した酸化ジルコニウムと接触させた孔形状の担体物質が使用され、これは好ましくは少なくとも９０質量％が、更に好ましくは少なくとも９５質量％が、最も好ましくは少なくとも９９質量％が酸化ケイ素、好ましくはＳｉＯ2を基礎とする。この孔形状の担体物質と無機酸との接触は好ましくは担体物質の酸での含浸により行われ、その際、これは好ましくは、担体物質の質量に対して１０〜７０質量％の範囲内、特に好ましくは２０〜６０質量％の範囲内、更に好ましくは３０〜５０質量％の範囲内の量でこれと接触され、引き続き乾燥される。乾燥に引き続き、この担体物質は無機酸の固定化のために加熱され、好ましくは３００〜６００℃の範囲内、更に好ましくは４００〜５００℃の範囲内の温度に加熱される。
【００８３】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、この脱水は気相中で実施される。この場合に、慣用の装備、例えば気相反応のために当業者に知られている装備、例えば管型反応器が使用されることができる。特に好ましくは、管束型熱交換器並びに熱交換器として熱プレート（Thermobleche）を包含する反応器の使用である。
【００８４】
気相脱水の一実施態様によれば、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸が前述の固体層触媒を含む反応器中に導入される。
【００８５】
他の一実施態様によれば、そのつど水溶液の全質量に対して、２〜８０質量％、特に好ましくは５〜５０質量％、更に好ましくは１０〜２５質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液の形にある２−ヒドロキシイソ酪酸が、この反応器中に導入される。この反応器の内部中の圧力−及び温度条件は、この２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液がこの反応器中への進入の際に気状の形で存在するように選択される。気相中での脱水は好ましくは温度範囲２００〜４００℃、特に好ましくは２５０〜３５０℃で行われる。この反応器の内部中の圧力は気相脱水の際に好ましくは０．１〜５０ｂａｒの範囲内、特に好ましくは０．２〜１０ｂａｒの範囲内、最も好ましくは０．５〜５ｂａｒの範囲内にある。
【００８６】
反応器中に導入される２−ヒドロキシイソ酪酸の量は気相脱水の際に好ましくは１０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内に、特に好ましくは２０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内に、最も好ましくは３０〜１００Ｖｏｌ．−％の範囲内にある。
【００８７】
本発明による方法の別の特別な一実施態様によれば、この脱水は液相中で実施される。この液相脱水は同様に、当業者に知られている全ての装備中で実施されることができ、この中では液体が所望される反応温度に加熱されることができ、その際、この装備は、反応成分を所望の温度条件下で液状に維持するのに十分な圧力に課されることができる。
【００８８】
本発明による方法の特別な一実施態様によれば、液相脱水のこの方法は、純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸、又は水溶液の全質量に対して５〜１００質量％、特に好ましくは２０〜１００質量％、最も好ましくは５０〜１００質量％の２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液を反応器中に導入する第１の方法工程を含む。この反応器の内部中の圧力−及び温度条件は、この２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液がこの反応器中への進入の際に液状の形で存在するように選択される。脱水が液相中で実施される本発明による特別な一実施態様によれば、２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液が脱水反応器の内部中に、この液相がこの触媒粒子の表面に沿って滴るように、触媒固体層を介して導通される。この種の実施様式は例えば細流床反応器中で実施されることができる。
【００８９】
液相中での脱水は好ましくは温度範囲２００〜３５０℃、特に好ましくは２５０〜３００℃で行われる。この反応器の内部中の圧力は液相脱水の際に好ましくは１〜５０ｂａｒの範囲内、特に好ましくは２〜２５ｂａｒの範囲内、最も好ましくは３〜１０ｂａｒの範囲内にある。
【００９０】
脱水の触媒作用は気相脱水の場合にもまた同様に液相脱水の場合にも均一系で又は不均一系で行うことができる。
【００９１】
均一系触媒作用では、次いで好ましくは無機酸、例えばリン酸又は硫酸である触媒が、まず純粋な２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含む水溶液と接触させられる。引き続き、このように得られた組成物を反応器中に導入し、所望の圧力−及び温度条件下でメタクリル酸に移行させる。無機酸を２−ヒドロキシイソ酪酸又はこの水溶液とは無関係に反応器中に導入することも考慮できる。この場合にはこの反応器は少なくとも２の供給ラインを有し、１つは２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液のためであり、もう１つは触媒のためである。脱水が液相中で細流床反応器中で実施される場合には、触媒を２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液と一緒に反応器の頭部領域中に導入することが好ましい。
【００９２】
不均一系触媒作用の場合には、この触媒は、固体の基材の形で反応室中に、例えば固体層ばら物（Festbettschuettung）の形で、触媒で被覆された板、好ましくは熱プレートの形で存在し、これは反応器の内部中に配置されているか、しかし又は、触媒で被覆された反応器壁の形にある。可能性のある反応器は例えばDE-A-198 48 208、DE-A-100 19 381及びEP-A1 234 612に記載されている。不均一系触媒作用の場合には、触媒として無機酸と接触させた、好ましくは含浸させた孔形状の担体物質が好ましい。２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸を含有する水溶液を次いで、蒸気状の又は液状の形で、固体の触媒材料の表面と接触させる。
【００９３】
本発明による方法の特別に好ましい一実施態様によれば、２−ヒドロキシイソ酪酸の脱水は液相中で２００〜５００ｍｂａｒの範囲内の圧力で、１６０〜３００℃、好ましくは２００〜２４０℃の範囲内の温度で、触媒としてアルカリ金属イオンの存在下で実施される。
【００９４】
この生じたメタクリル酸は本発明による反応条件では気状で水と一緒になって留去され、引き続き水溶液として凝縮され、この結果、触媒成分を含有しないメタクリル酸水溶液が得られることができる。
【００９５】
このようにして得られるメタクリル酸溶液は本発明による方法の特別な一実施態様によれば容易に更なる後処理なしに場合によりエステル化に供給されることができる。この場合にこのメタクリル酸溶液は相応するアルコール並びに適した、当業者に知られているエステル化触媒、例えば濃縮した酸と加熱下で接触させられ、このメタクリル酸はこのようにして相応するエステルに移行する。
【００９６】
好ましいアルコールには特に、そのつど少なくとも１の炭素原子、好ましくは２〜１２、特に好ましくは４〜９個の炭素原子を有するアルコールが属する。このアルコールは線状、分枝鎖状又は環式構造を有することができる。更に、このアルコールは芳香族基又は置換基、例えばハロゲン原子を含むことができる。好ましいアルコールには特にメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、１−メチル−プロパノール、２−メチルプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、１−メチルブタノール、２−メチルブタノール、３−メチルブタノール、２，２−ジメチルプロパノール、ｎ−ヘキサノール、１−メチルペンタノール、２−メチルペンタノール、３−メチルペンタノール、４−メチルペンタノール、１，１−ジメチルブタノール、２，２−ジメチルブタノール、３，３−ジメチルブタノール、１，２−ジメチルブタノール、ｎ−ヘプタノール、１−メチルヘキサノール、２−メチルヘキサノール、３−メチルヘキサノール、４−メチルヘキサノール、１，２−ジメチルペンタノール、１，３−ジメチルペンタノール、１，１−ジメチルペンタノール、１，１，２，２，−テトラメチルプロパノール、ベンジルアルコール、ｎ−オクタノール、２−エチルヘキサノール、ｎ−ノナノ−ル、１−メチルオクタノール、２−メチルオクタノール、ｎ−デカノール、ｎ−ウンデカノール、１−メチルデカノール、２−メチルデカノール、ｎ−ドデカノール、２，４−ジエチルオクタノール、シクロペンタノール、シクロヘキサノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサノール、シクロヘプタノール、シクロドデカノール、２−（ジメチルアミノ）エタノール、３−（ジメチルアミノ）プロパノール、４−（ジメチルアミノ）ブタノール、５−（ジメチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジメチルアミノ）ヘキサノール、８−（ジメチルアミノ）オクタノール、１０−（ジメチルアミノ）デカノール、１２−（ジメチルアミノ）ドデカノール、２−（ジエチルアミノ）エタノール、３−（ジエチルアミノ）プロパノール、４−（ジエチルアミノ）ブタノール、５−（ジエチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジエチルアミノ）ヘキサノール、８−（ジエチルアミノ）オクタノール、１０−（ジエチルアミノ）デカノール、１２−（ジエチルアミノ）ドデカノール、２−（ジ（イソプロピル）−アミノ）−エタノール、３−（ジ（イソプロピル）アミノ）−プロパノール、４−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ブタノール、５−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ペンタノール、６−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ヘキサノール、８−（ジ（イソプロピル）−アミノ）オクタノール、１０−（ジ（イソプロピル）−アミノ）デカノール、１２−（ジ（イソプロピル）−アミノ）ドデカノール、２−（ジブチルアミノ）−エタノール、３−（ジブチルアミノ）−プロパノール、４−（ジブチルアミノ）−ブタノール、５−（ジブチルアミノ）−ペンタノール、６−（ジブチルアミノ）−ヘキサノール、８−（ジブチルアミノ）−オクタノール、１０−（ジブチルアミノ）−デカノール、１２−（ジブチルアミノ）−ドデカノール、２−（ジヘキシルアミノ）−エタノール、３−（ジヘキシルアミノ）−プロパノール、４−（ジヘキシルアミノ）−ブタノール、５−（ジヘキシルアミノ）−ペンタノール、６−（ジヘキシルアミノ）−ヘキサノール、８−（ジヘキシルアミノ）−オクタノール、１０−（ジヘキシルアミノ）−デカノール、１２−（ジヘキシルアミノ）−ドデカノール、２−（メチル−エチル−アミノ）−エチ−、２−（メチル−プロピル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−イソプロピル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−ブチル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−ヘキシル−アミノ）−エタノール、２−（メチル−オクチル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−プロピル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−イソプロピル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−ブチル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−ヘキシル−アミノ）−エタノール、２−（エチル−オクチル−アミノ）−エタノール、３−（メチル−エチル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−プロピル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−イソプロピル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−ブチル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−ヘキシル−アミノ）−プロパノール、３−（メチル−オクチル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−プロピル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−イソプロピル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−ブチル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−ヘキシル−アミノ）−プロパノール、３−（エチル−オクチル−アミノ）−プロパノール、４−（メチル−エチル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−プロピル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−イソプロピル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−ブチル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−ヘキシル−アミノ）−ブタノール、４−（メチル−オクチル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−プロピル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−イソプロピル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−ブチル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−ヘキシル−アミノ）−ブタノール、４−（エチル−オクチル−アミノ）−ブタノール、２−（Ｎ−ピペリジニル）−エタノール、３−（Ｎ−ピペリジニル）−プロパノール、４−（Ｎ−ピペリジニル）−ブタノール、５−（Ｎ−ピペリジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ−ピペリジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ−ピペリジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ−ピペリジニル）−デカノール、１２−（Ｎ−ピペリジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ−ピロリジニル）−エタノール、３−（Ｎ−ピロリジニル）−プロパノール、４−（Ｎ−ピロリジニル）−ブタノール、５−（Ｎ−ピロリジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ−ピロリジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ−ピロリジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ−ピロリジニル）−デカノール、１２−（Ｎ−ピロリジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタノール、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパノール、４−（Ｎ−モルホリノ）−ブタノール、５−（Ｎ−モルホリノ）−ペンタノール、６−（Ｎ−モルホリノ）−ヘキサノール、８−（Ｎ−モルホリノ）−オクタノール、１０−（Ｎ−モルホリノ）−デカノール、１２−（Ｎ−モルホリノ）−ドデカノール、２−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−エチル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、２−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−エタノール、３−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−プロパノール、４−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ブタノール、５−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ペンタノール、６−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ヘキサノール、８−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−オクタノール、１０−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−デカノール、１２−（Ｎ′−イソプロピル−Ｎ−ピペラジニル）−ドデカノール、３−オキサ−ブタノール、３−オキサ−ペンタノール、２，２−ジメチル−４−オキサ−ペンタノール、３，６−ジオキサ−ヘプタノール、３，６−ジオキサ−オクタノール、３，６，９−トリオキサ−デカノール、３，６，９−トリオキサ−ウンデカノール、４−オキサ−ペンタノール、４−オキサ−ヘキサノール、４−オキサ−ヘプタノール、４，８−ジオキサ−ノナノール、４，８−ジオキサ−ドデカノール、４，８−ジオキサ−ウンデカノール、５−オキサ−ヘキサノール、又は５，１０−ジオキサ−ウンデカノール。
【００９７】
更に、エトキシル化及び／又はプロポキシル化アルコール並びに混合エトキシル化及び／又はプロポキシル化アルコールが溶媒として使用されることができ、特にＲa−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）x−ＯＨ又はＲa−（Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2）x−ＯＨ、又は、Ｒa−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3））x−ＯＨ［式中、ＲaはＣ1〜Ｃ20−アルキル及びｘは１０〜２０の整数である］、又はエトキシル化及び／又はプロポキシル化アミノアルコール、例えばＲb2Ｎ（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）y−Ｈ又はＲb2Ｎ（−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−Ｏ）y−Ｈ又はＲb2Ｎ（−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）y−Ｈ［式中、ｙは１〜４の整数である］である。Ｒbは１〜６の炭素原子を有するアルキル基であり、その際この窒素は置換基Ｒbと一緒になって五〜六員環を形成することもできる。この環は、場合により更に１又は複数の短鎖アルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピルにより置換されていることができる。
【００９８】
しかし、メタクリル酸がエステル化前に更に精製されることが好ましくあることができ、その際、精製のためには根本的に、汚染された、プロピレンの触媒気相酸化により得られる（メタ）アクリル酸の精製に慣用の様式で適用される、当業者に知られている全ての精製方法を適用できる。
【００９９】
気相中で脱水が実施された場合には、このメタクリル酸をまず、水性メタクリル酸溶液を獲得しながら凝縮することが好ましい。この場合には根本的に、当業者に知られている全ての凝縮方法、例えば分画した凝縮を使用することができ、これは例えばWO-A-2004/035514, WO-A03/014172又はEP-A-EP 1 163 201に記載されており、又は、全体凝縮によることができ、これは例えばEP-A-O 695 736に記載されている。メタクリル酸を可能な限り完全に吸収するために、凝縮の際に付加的な溶媒、例えば水を添加することも考慮できる。
【０１００】
凝縮後に得られた水性メタクリル酸溶液、しかし又は、液相脱水の場合に得られた水性メタクリル酸溶液も、次いで更なる精製工程において水及び他の不純物から除去されることができる。この場合には先ず水が共留剤の存在下で共沸蒸留により除去されることができ、これは例えばDE-A-198 53 064に記載されているとおりである。メタクリル酸の吸収のために高沸性有機溶媒の使用も考慮でき、これは例えばEP-A-0 974 574に開示されているとおりである。この蒸留的方法の他に水除去のための膜も使用でき、これは例えばDE-A-44 01 405に提案されているとおりである。更に、結晶方法による、液相脱水の場合に獲得されたか又は凝縮により得られた水性メタクリル酸溶液の精製が考慮できる。
【０１０１】
脱水により得られたメタクリル酸は更なる方法工程において更に引き続き精製されることができる。したがって更に得られた、高沸性不純物は更なる蒸留工程により除去されることができる。しかし特に好ましくは、脱水後に得られたメタクリル酸が結晶方法により更に精製される場合であり、これは例えばDE-A-101 49 353に記載されるとおりである。
【０１０２】
このように得られた、精製されたメタクリル酸を次いで場合によりエステル化にかけることができる。
【０１０３】
冒頭部で挙げた課題の解決には更に、次の方法工程：
ＩＩＡ）前述の方法により２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを製造する方法工程、
ＩＩＢ）２−ヒドロキシイソ酪酸の形成下でこの２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを開裂し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を中和及び／又はこの２−ヒドロキシイソ酪酸を精製する方法工程、
ＩＩＣ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含むメタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【０１０４】
冒頭部で挙げた課題の解決には、次の方法工程：
ＩＩＩＡ）前述の方法によりメタクリル酸を製造する方法工程、
ＩＩＩＢ）このメタクリル酸をラジカル重合する方法工程
を含み、その際、場合により、このメタクリル酸のカルボキシル基がこのラジカル重合の前又は後に少なくとも部分的にエステル化されることができる
ポリメタクリル酸又はポリメタクリル酸エステルの製造方法も寄与する。
【０１０５】
以下に記載の実施例は、適用の幅がこの全体の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである本発明をこの実施例に挙げる実施態様に限定することなく、本発明を例示的に記載する。以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ハイブリッドプラスミド pET101/D-TOPO：：icmA-icmBを示す。
【図２】ハイブリッドプラスミド pBBR1MCS-2：：icmA-icmBを示す。
【図３】試料ＩＭ−８６中の２−ヒドロキシイソ酪酸の定量化を２−ヒドロキシイソ酪酸でのこの試料のドーピング後に行った。このメチルアセタート−ピーク（Rt. 7,16 min）をこの場合に内部標準として利用した。このドーピングされたものとこのオリジナル−試料のＧＣ−ＭＳクロマトグラムの抜粋が図示されている。
【図４】試料ＩＭ−８９への２−ヒドロキシイソ酪酸の添加（Aufstockung）を示す。このオリジナル−試料（Ａ）とドーピングされた試料（Ｂ）の試料のＮＭＲスペクトルの抜粋が図示されている。
【０１０７】
実施例
１． ゲノム性ＤＮＡの単離及び断片icmA及びicmBの増幅
アキノコラ・テルシアリカルボニス（Aquincola tertiaricarbonis）株（Ａ．テルシアリカルボニスDSMZ 18512）からキットDNeasy Blood & Tissue (Qiagen GmbH, Hilden)を用いて製造者指示に従いゲノム性ＤＮＡを単離し、ＰＣＲのための鋳型として断片icmA（１．７ｋｂｐ；ＤＱ４３６４５６）及びicmB（０．４ｋｂｐ；ＤＱ４３６４５７）の増幅のために使用した。これらは酵素Ｅ３をコードする。この場合に、オリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＡ＿ｆｗ ５′−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧ−３′(フォワードプライマー;開始コドンは下線を引いてある)及びＡｑｔ−ｉｃｍＡ−Ｈｉｎｄ＿ｒｅｖ ５′−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧ−３′(リバースプライマー;停止コドン及びHindIII切断部位は下線が引いてある)をicmAの増幅のために、そしてオリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＢ−Ｈｉｎｄ＿ｆｗ ５′−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＧＣ−３′(フォワードプライマー;開始コドン及びHindIII切断部位は下線が引いてある)及びＡｑｔ−ｉｃｍＢ＿ｒｅｖ ５′−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣ−３′(リバースプライマー;停止コドンは下線が引いてある)をicmBの増幅のために使用した。
【０１０８】
ポリメラーゼチェーン反応（PCR, SAIKI et al., 1985, Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354.による）を、Pfuポリメラーゼ（Promega, Madison, USA）で開始させた。この場合にそのつど９５℃で６０秒間、６５℃で３０秒間、及び、７２℃で４分間を有する３５サイクルを実施した。このＰＣＲの実施をサーモサイクラー（Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen）において行った。
【０１０９】
この断片をQIAquick PCR精製キット（Qiagen GmbH, Hilden）を用いて製造者指示に従い精製し、これに引き続きHindIIIで制限処理した。両方のバッチを、HindIII切断部位を介してライゲーションした。
【０１１０】
このライゲーション産物icmA-icmB（２．１ｋｂｐ）をオリゴヌクレオチドＡｑｔ−ｉｃｍＡ＿ｆｗ ５′−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧ−３′（フォワードプライマー；開始コドンは下線を引いてある）及びＡｑｔ−ｉｃｍＢ＿ｒｅｖ ５′−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣ−３′（リバースプライマー；停止コドンは下線を引いてある）を用いたＰｆｕ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した（そのつど９５℃で６０秒間、６５℃で３０秒間、及び７２℃で４．５分間を有する３５サイクル）。この相応するサイズの得られたＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen GmbH, Hilden）を用いて製造者指示に従い精製した。
【０１１１】
２． ラルストニア・ユートロファ発現ベクターの製造
この精製したＰＣＲ断片icmA-icmB（２．１ｋｂｐ）を製造者の指示に従いベクターpET101/D-TOPOにライゲーションした(Invitrogen GmbH, Karlsruhe)。この得られたハイブリッドプラスミドpET101 /D-TOPO : : icmA-icmB(図１、配列番号１)をコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（New England Biolabs, Frankfurt）中に移し、制限処理及び配列決定により制御した。
【０１１２】
野生型として酵素Ｅ1、Ｅ2及びＥ4の活性を有する；Ｒ．ユートロファ株中での発現を達成するために、このコンストラクトは適した広宿主域ベクター中にクローニングされなくてはならなかった。利用されたベクターとは、KOVACH et al. (1995)で記載されているpBBR1MCS-2である。 Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176。
【０１１３】
このためにプラスミドpET101 /D-TOPO : : icmA-icmB及びpBBR1MCS-2を酵素Xbal及びSacIで制限処理し、この断片icmA-icmBを目的ベクターpBBR1MCS-2中にライゲーションし、コンピテント大腸菌DH5α細胞（New England Biolabs, Frankfurt）をこの生じるハイブリッドプラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmB (図２、配列番号２)でトランスフォーメーションした。
【０１１４】
このプラスミドを制限化及び配列決定により検証し、コンピテント大腸菌S17-1細胞中に移し、これを用いてプラスミドの特にラストニア・ユートロファ株中へのコンジュゲートによる移行部が可能である株である。このためにスポット接合（Spotmating）−コンジュゲーション（例えばFRIEDRICH et al.,が1981, Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus . J Bacteriol 147:198-205で記載）を大腸菌S17-1 pBBR1MCS-2 : : icmA-icmBをドナーとして、そして、Ｒ．ユートロファＨ１６（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類される、ＤＳＭＺ４２８）並びにＲ．ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類される、ＤＳＭＺ５４１）をレシピエントとして用いて実施した。プラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmBを有するトランスコンジュゲート体が得られることができた。
【０１１５】
３． 組み換えＲ．ユートロファ細胞中での２−ヒドロキシイソ酪酸の製造
実施例２で記載のプラスミドを有するＲ．ユートロファ株を５０ｍｌのVollbrecht-MSM-培地（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、２．０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、２．１ｇ；ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ；ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ、６ｍｇ；ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ；痕跡量元素−溶液（Pfennig and Lippert, 1966）、０．１ｍＬ）中での２−ヒドロキシイソ酪酸の形成の検査のために使用した。この培地を更にグルコン酸Ｎａ（１５ｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及び補酵素Ｂ１２（６０μｇ／ｍＬ）で補給した。この細胞を温度調節可能な振盪器で３０℃及び１６０ｒｐｍでインキュベーションした。３０ｈ後にグルコン酸Ｎａ（１．５％、ｗ／ｖ）及び補酵素Ｂ１２［６０μｇ／ｍＬ］を後添加した。回収を培養５２ｈ後に５０００ｒｐｍ（４℃）での遠心分離により行った。培養物上清を分析のために−２０℃で貯蔵した。
【０１１６】
２−ヒドロキシイソ酪酸の検出及び定量化を定量的1Ｈ−ＮＭＲ−分光器を用いて行った。この試料を量的に濃縮した。この残留物から１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取り出し、この含量を内部標準としてのＴＳＰ（トリシリルプロピオン酸）に対して精算した。２−ヒドロキシイソ酢酸は約１．３６ｐｐｍでのスペクトル中に一重項を示し、保護（Absicherung）のためにこの純粋な物質で添加した。（図３）。
【０１１７】
この分析した試料中で最大０．７２ｍｍｏｌ／ｋｇの２−ヒドロキシイソ酪酸の濃度が検出された。これに対して空のプラスミドを有する相応するコントロールバッチ中では２−ヒドロキシイソ酪酸は検出されなかった。このＮＭＲ測定を定量的にかつ定性的にＧＣ−ＭＳ及び純粋物質２−ヒドロキシイソ酪酸での添加を用いて確認した（図４）。このクロマトグラフィによる分離をこの場合に３０ｍのRtx-1701キャピラリーカラムで行った（Fisher Scientific, Pittsburgh, USA）。この試料を凍結乾燥後に誘導体化試薬「Methelute」（Pierce, Rockford, USA）で取り込んだ。この溶液０．５μＬを直接的にスプリット−／スプリットレス−インジェクターを介して適用した。２−ヒドロキシイソ酪酸−ピークの同定をこの測定スペクトルとデータバンクスペクトルの調整（Abgleich）により行った。２−ヒドロキシイソ酪酸の含量の見積もりのために一定量の比較物質２−ヒドロキシイソ酪酸でのこの試料のドーピングを行った。この分析した試料中には最大４４μｇ／ｍＬの濃度が検出された。空のプラスミドを有するコントロールバッチ中では２−ヒドロキシイソ酪酸は検出されなかった。同様に、Ｃ供給源（１．５％、ｗ／ｖ）としてフルクトースから出発して合成された２−ヒドロキシイソ酪酸が検出されることができた。
【０１１８】
４． ２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの脱水
実施例３に従い製造された２−ヒドロキシイソ酪酸（０．２ｇ／Ｌ）の溶液５ｍｌを撹拌しながらＮａＯＨ（０．０６ｍｇ）と混合する。この溶液を撹拌及び１８５〜１９５℃での環流冷却下で真空下（３００ｔｏｒｒ）でインキュベーションする。５ｈの期間にわたり毎時そのつど、５ｍＬ中の更なる０．５ｍｇの２−ヒドロキシイソ酪酸を添加し、これは０．４質量％のｐ−メトキシフェノールを、メタクリラートの重合を妨げるべく含有した。インキュベーション２４ｈ後にこの反応を終了する。２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの変換は９０％超に達する。この反応バッチからのメタクリル酸の分離を蒸留により行う。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞。
【請求項２】
細胞が、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの２−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ3の少なくとも１の活性を有する請求項１記載の細胞。
【請求項３】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ3の向上した活性を有する請求項２記載の細胞。
【請求項４】
細胞が野生型として、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａのポリヒドロキシブチラートへの反応を触媒作用する酵素Ｅ4の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ4の低められた活性を有する請求項４記載の細胞。
【請求項６】
細胞が野生型として、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａのクロトニル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ5の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ5の低められた活性を有する請求項６記載の細胞。
【請求項８】
細胞が野生型として、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素ＡのＳ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ6の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、少なくとも１の酵素Ｅ7のその野生型に比較して低められた活性少なくとも１を有し、これが３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを基質として許容する請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法であって、次の方法工程：
ａ）請求項１から９までのいずれか１項記載の細胞を、炭素供給源を含む栄養培地と、この炭素供給源から２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートが形成される条件下で接触させる方法工程、並びに、場合により
ｂ）２−ヒドロキシイソ酪酸をこの栄養培地から、又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをこの細胞から、精製する方法工程
を含む製造方法。
【請求項１１】
メタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＡ）２−ヒドロキシイソ酪酸を請求項１０記載の方法により製造し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を精製及び／又は中和する方法工程、
ＩＢ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む製造方法。
【請求項１２】
メタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＩＡ）請求項１０記載の方法により２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを製造する方法工程、
ＩＩＢ）２−ヒドロキシイソ酪酸の形成下でこの２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを開裂し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を中和及び／又はこの２−ヒドロキシイソ酪酸を精製する方法工程、
ＩＩＣ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含む製造方法。
【請求項１３】
ポリメタクリル酸又はポリメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＩＩＡ）請求項１２又は１３記載の方法によりメタクリル酸を製造する方法工程、
ＩＩＩＢ）このメタクリル酸をラジカル重合する方法工程
を含み、その際、場合により、このメタクリル酸のカルボキシル基がこのラジカル重合の前又は後に少なくとも部分的にエステル化されることができる製造方法。
【請求項１】
その野生型に比較してより多くの２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを形成することができるように遺伝子工学的に改変された細胞において、２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの形成をアセトアセチル−補酵素Ａを介して中間生成物として、及び、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを介して予備生成物として行うことを特徴とする細胞。
【請求項２】
細胞が、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの２−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ3の少なくとも１の活性を有する請求項１記載の細胞。
【請求項３】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ3の向上した活性を有する請求項２記載の細胞。
【請求項４】
細胞が野生型として、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａのポリヒドロキシブチラートへの反応を触媒作用する酵素Ｅ4の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ4の低められた活性を有する請求項４記載の細胞。
【請求項６】
細胞が野生型として、３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａのクロトニル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ5の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
細胞がその野生型に比較して酵素Ｅ5の低められた活性を有する請求項６記載の細胞。
【請求項８】
細胞が野生型として、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素ＡのＳ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの反応を触媒作用する酵素Ｅ6の活性を有する請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、少なくとも１の酵素Ｅ7のその野生型に比較して低められた活性少なくとも１を有し、これが３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを基質として許容する請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートの製造方法であって、次の方法工程：
ａ）請求項１から９までのいずれか１項記載の細胞を、炭素供給源を含む栄養培地と、この炭素供給源から２−ヒドロキシイソ酪酸又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートが形成される条件下で接触させる方法工程、並びに、場合により
ｂ）２−ヒドロキシイソ酪酸をこの栄養培地から、又は２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートをこの細胞から、精製する方法工程
を含む製造方法。
【請求項１１】
メタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＡ）２−ヒドロキシイソ酪酸を請求項１０記載の方法により製造し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を精製及び／又は中和する方法工程、
ＩＢ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む製造方法。
【請求項１２】
メタクリル酸又はメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＩＡ）請求項１０記載の方法により２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを製造する方法工程、
ＩＩＢ）２−ヒドロキシイソ酪酸の形成下でこの２−ヒドロキシイソ酪酸−モノマー単位含有ポリヒドロキシアルカノアートを開裂し、並びに、場合により、この２−ヒドロキシイソ酪酸を中和及び／又はこの２−ヒドロキシイソ酪酸を精製する方法工程、
ＩＩＣ）この２−ヒドロキシイソ酪酸をメタクリル酸の形成下で脱水し、並びに、場合により、このメタクリラート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含む製造方法。
【請求項１３】
ポリメタクリル酸又はポリメタクリル酸エステルの製造方法であって、次の方法工程：
ＩＩＩＡ）請求項１２又は１３記載の方法によりメタクリル酸を製造する方法工程、
ＩＩＩＢ）このメタクリル酸をラジカル重合する方法工程
を含み、その際、場合により、このメタクリル酸のカルボキシル基がこのラジカル重合の前又は後に少なくとも部分的にエステル化されることができる製造方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４−１】
【図４−２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４−１】
【図４−２】
【公表番号】特表２０１１−５２５３６７（Ｐ２０１１−５２５３６７Ａ）
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５２５７（Ｐ２０１１−５１５２５７）
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５６２１４
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（３９０００９１２８）エボニック レーム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (293)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｒｏｅｈｍ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｋｉｒｓｃｈｅｎａｌｌｅｅ，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５６２１４
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（３９０００９１２８）エボニック レーム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (293)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｒｏｅｈｍ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｋｉｒｓｃｈｅｎａｌｌｅｅ，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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