３次元画像形成のための標本の位置制御のための流体集束（ＦＬＵＩＤＦＯＣＵＳＩＮＧ）
光トモグラフィシステムによる画像形成のためのサンプルを充填する方法。少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積がサンプル供給管２７２内に同軸上に充填される。サンプル容積は集束セル２２２を通じてキャピラリチューブ２７４内に推進され、ここでキャピラリチューブ２７４はサンプル供給管よりも小さい断面積を有し、それによって、少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体の低減された容積がキャピラリチューブ２７４内の中心領域に拘束される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には光トモグラフィ画像形成システムに関し、より詳細には、生物細胞のような小さな対象物がたとえば、顕微鏡による画像形成のためにキャピラリチューブ内に流動的に位置決めされる光トモグラフィに関する。
【背景技術】
【０００２】
光トモグラフィを使用する生物細胞の画像形成の最近の進歩は、たとえば、２００３年２月１８日に発行された「APPARATUS AND METHOD FOR IMAGING SMALL OBJECTS IN A FLOW STREAM USING OPTICAL TOMOGRAPHY」と題する特許文献１に開示されているように、Nelsonによって開発されている。該特許文献の全開示が参照により援用される。当該技術分野におけるさらなる発展は、２００３年１１月１８日に出願され２００４年４月２２日付で米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号として公開された、「METHOD AND APPARATUS OF SHADOWGRAM FORMATION FOR OPTICAL TOMOGRAPHY」と題する、Fauver他の特許文献２に教示されている。該特許文献の全開示も参照により援用される。
【０００３】
このような光トモグラフィシステムにおける処理は、標本を調製することから開始する。通常、患者から採取された標本は病院又は診療所から受け取られ、処理されて非診断要素が除去され、固定され、次いで染色される。染色された標本は次いで光学ゲルと混合され、マイクロキャピラリチューブ内に挿入されて、標本内の、細胞のような対象物の画像が光トモグラフィシステムを使用して生成される。結果として生成される画像は、「疑似投影画像」と呼ばれる異なる複数の視野（perspective）からの拡張された被写界深度画像のセットを含む。疑似投影画像のセットを逆投影技法及びフィルタリング技法を使用して再構成して対象となる細胞の３次元断層像をもたらすことができる。
【０００４】
その後、３次元断層像は、対象となる構造、分子又は分子プローブを定量化すると共にそれらのロケーションを確定することを可能にするために、分析に利用可能に維持される。生物細胞のような対象物は、少なくとも１つの染色剤又は標識分子プローブを用いてラベル付けすることができ、このプローブの測定量及びロケーションが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌のようなさまざまな癌を含むが、これらには限定されない、細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらすことができる。
【０００５】
たとえば、特許文献２に記載されているような光トモグラフィ顕微鏡（ＯＰＴＭ）システムでは、１８０度の回転にわたって撮影される約２５０個のサンプル画像が、５０マイクロメートルのキャピラリチューブ内で流動流の中にランダムに分散している細胞核の容積を適切にサンプリングすることが必要とされる。以前の細胞導入方法における制限に起因して、多数の細胞がキャピラリチューブ壁の近くに現れ、それによってサンプリングが外半径において約０．６マイクロメートルの解像度をレンダリングする程度にしか良好でなくなる。
【０００６】
このような光トモグラフィシステムは集束しないキャピラリチューブ充填技法を使用するため、細胞及び他の対象物は、追跡エラー、並びに幾何学的歪み、及び管壁屈折によって引き起こされる収差からの解像度の損失を含む光学的欠陥に陥る傾向にある。このようなシステムはまた、媒質の振動、温度変化、封入ガスの膨張並びに／又は化学的変化及び局所的なレオロジー的変化からのゲル不安定性に起因する縦運動の影響を受ける。中心にない標本も、壁に張り付くか又は壁に沿ってゆっくりと移動する傾向にあり、それによって、壁に付着する細胞が凝集することから目詰まりが引き起こされる。現行のシステムもサンプルキャリーオーバーの問題を抱えている。
【０００７】
スループットを向上させるために、許容可能な解像度を維持しながらサンプリング要件を低減するために、より高い解像度又は改善された信号対雑音を提供する方法が必要とされている。本発明は、サンプルをセンタリングすると共にサンプル容積を低減して、サンプルキャリーオーバー問題を緩和しながらＯＰＴＭシステムにおける画像取得及びスループットを向上させる新規の斬新な技法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５２２，７７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／７１６，７４４号明細書
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、光トモグラフィシステムによる画像形成のためのサンプルを充填する方法を提供する。少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積は、サンプル供給管内に同軸上に充填される。サンプル容積は集束セルを通じてキャピラリチューブ内に推進される。ここでキャピラリチューブはサンプル供給管よりも小さい断面積を有し、それによって、少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体の低減された容積がキャピラリチューブ内の中央領域に拘束される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する５０マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分を概略的に示す。
【図１Ｂ】光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する１５マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分を概略的に示す。
【図２】本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセル（rotating high-pressure hydrodynamic focus flow cell）の断面図を概略的に示す。
【図３】本発明の一例の実施形態において回転高圧流体力学集束フローセルにおいて使用される集束セルの詳細な斜視図を概略的に示す。
【図４】充填シーケンスの開始時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解を概略的に示す。
【図５】充填シーケンスの終了時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において生物細胞に関連する特定の例に関して本発明を記載するが、これらの例は本発明の原理の説明を目的とするものであること、及び本発明はそのようには限定されないことは理解されよう。
【００１２】
概して本明細書において使用される場合、以下の用語は、光学顕微鏡法処理の文脈内で使用される場合、以下の意味を有する。
【００１３】
「キャピラリチューブ」は一般的に受け入れられている意味を有し、透明なマイクロキャピラリチューブ及び１００マイクロメートル以下の内径を有する等価な物品を含むように意図される。このようなマイクロキャピラリチューブは、アリゾナ州所在のPolymicro Technologies， LLCによって製造されている。
【００１４】
「対象物」は個々の細胞又は他の実体を意味する。１つ又は複数の対象物が１つの標本を含む場合がある。
【００１５】
「疑似投影」は、光学素子の本来の被写界深度よりも広い範囲のサンプリングされた容積を表す単一の画像を含む。
【００１６】
「標本」は、単一の試験又は手技から得られる個々の患者からの完全な産物（たとえば、分析、生検用に提出される唾液、又は鼻腔用綿棒）を意味する。標本は１つ又は複数の対象物から成る場合がある。標本診断の結果はケース診断の一部となる。
【００１７】
「サンプル」は、分析の準備が整っている完成した細胞調製品を意味し、アリコート又は標本のすべて又は一部を含む。
【００１８】
ここで図１Ａを参照すると、光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する、目的のセンタリングがなされていないキャピラリチューブのサンプリング増分が概略的に示されている。ここで、サンプリング増分は、第１のサンプリング角θ、第１のサンプリング距離ｄ、及びサンプリング間隔ａによって記述することができる。キャピラリチューブの直径が約５０マイクロメートルである一実施例では、θは０．７２０度になり、ｄは２５マイクロメートルになり、ａは０．３１マイクロメートルの値を有する。中心にない対象物を上記の条件下で適切にサンプリングするために、約２５０個のサンプルがキャピラリチューブの１８０度の回転にわたって必要とされる。
【００１９】
しかしながら通常、唾液のような生物サンプル中の分析される標本核及び細胞型の大部分は直径が２５マイクロメートルよりも小さい。細胞の流動流を中心流動流の半径±５マイクロメートル内に制限するために、サンプリングされる全体の半径は１５マイクロメートルとなり、すなわち中心直径は３０マイクロメートルとなる。サンプルは１０マイクロメートルの通常のサイズを有する核のみに制約されるべきであり、サンプリングされる中心容積の直径は１５マイクロメートルになる。
【００２０】
ここで図１Ｂを参照すると、光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する、１５マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分が概略的に示されている。ここで、サンプリング増分は、本発明のシステム及び方法を使用してサンプルをセンタリングすることによって可能となるように、第２のより小さいサンプリング角θ’、第２のより小さいサンプリング距離ｄ’、及び第２のサンプリング間隔ａ’によって制約される。たとえば、一貫して０．６マイクロメートルのサンプリング間隔ａ’を維持することによって、３０マイクロメートルコアのサンプル数を２５０個から１５０個に低減することができる。１５マイクロメートルの中心直径の標的を使用してサンプリングをさらに７５個のサンプルに低減することができる。システムスループットの向上は、必要とされる画像サンプリングの割合低減まで直接に引き上げられる。したがって、同じか又はより小さい回転サンプル増分で、信号対雑音比が向上したより高い解像度を達成することができるため、光トモグラフィ分析のためにキャピラリチューブ内で細胞のような標的対象物をセンタリングすることには大幅な性能優位性がある。代替的に、回転サンプル増分を低減して、十分な画質を維持しながら同じ容積に関してサンプルをより少なくすることができる。
【００２１】
ここで図２を参照すると、本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセルの断面図が概略的に示されている。回転高圧流体力学集束フローセル２００は、ケース２５０と、封止ハウジング２５２と、ベアリングレース２５４とを備える。ケース２５０は管２５１を備え、管２５１は、集束セル２２２、シリンジ針ノズル注入器２０１、及び針シール２０３を含む構成要素を収容する。集束セル２２２は、波型円錐部２３０と、第１のＯリング及び第２のＯリング３０２と、テーパ状フローセル２２４とをさらに備える。
【００２２】
シース流体注入ポート２２０が、シース流体入口チャネル２６０において波型円錐部２３０と流体連通するケース２５０内に穿孔されるか又は他の方法で作成される。封止ハウジング２５２は、テーパ状フローセル２２４を通じて挿入されるシリンジ針２７２によって供給されるサンプルを受け入れるように軸方向に位置調整される回転シール２０２を中心に保持する。テーパ状フローセル２２４は、キャピラリチューブ出口２３２において終端する。好ましい一実施形態では、シリンジ針２７２は、交換式注入器針を含む。交換式注入器針は有利には、キャリーオーバー問題を低減し、標本のキャリーオーバーが確実に最小限に抑えられるようにシステムを通じて洗浄しなければならない全体の洗浄容積も低減する。
【００２３】
ベアリングレース２５４は、シャフトハウジング２８５に対して圧力ばめされている回転ベアリング２８２を保持する。シャフト２９０がシャフトハウジング２８５内の中心に取り付けられる。シャフト２９０は、同じく軸方向に位置調整される交換式キャピラリチューブ２７４を受け入れる穿孔を有する。駆動ギア２８０はシャフトハウジング２８５と係合するようになっている。駆動ギア２８０は、交換式キャピラリチューブ２７４を受け入れると共に中心軸２７０と一致させて中心に保持するように構成される長い環状のテーパ状素子２９２を含む。ケース２５０、封止ハウジング２５２、管２５１及びシャフト２９０は中心軸２７０に沿って直線上で位置調整される。
【００２４】
ここで図３を参照すると、本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセルにおいて使用される集束セルのより詳細な透視斜視図が概略的に示されている。集束セル２２２内に挿入されると、シリンジ針ノズル注入器２０１（図２に示す）は、針ロケーション２０１ａにおいて両端のＯリングシール３０２によって波型円錐部２３０内にフィットし、テーパ状フローセル２２４の中心に位置決めされる。波型円錐部２３０は、流れの方向に沿って下流に向けてテーパ状になっており、複数のシース注入ポート２２６によって一様に波型になっている。複数のシース注入ポート２２６は、シースゲルが流体入口チャネル２６０から該複数のシース注入ポート２２６を通じてテーパ状フローセル２２４に供給されることを可能にするように位置決めされる。
【００２５】
本発明の回転高圧流体力学集束フローセルを使用して、層流条件下で２つの流れを同軸上に合流させることによって生成される中心の流動の結果、標本が中心に置かれる。層流は以下の関係によって記述することができる。
Ｒ＝レイノルズ数＜＜２０００
ここで、Ｒ＝（密度）（速度）（直径）／粘度
理想的には、流速は注入ロケーションにおいて一致するか又はほぼ一致する。流速が等しいとき、初期コア径とシース直径との比は保存される。中心流動と外側の「シース」流動流とが合流する点において、流動流は流動プロファイルが同じであると仮定する。流動が下って流体力学集束セルの円錐形流動プロファイルに移行すると、流体の速度が増加してテーパを通る一定の質量流量がサポートされる。速度が増加すると流体は押し出されて直径がより小さくなるが、流動流は流動プロファイル全体にわたって同じ相対位置を保持する。中心流動流内の微粒子は中心流動流内に留まる。
【００２６】
ここで図２及び図３を共に参照すると、動作中、高圧流体力学集束セル２００はテーパ状フローセル２２４のキャピラリチューブ出口２３２に回転シール２０２を生成する。回転シール２０２は、既知の工学的設計技法を使用して、高粘性ゲルを密にフィットしている交換式キャピラリチューブ２７４を通じて押し出すのに必要な圧力に耐えるように構成される。通常の圧力は１０００ＰＳＩを超えることができる。回転ベアリング２８２は、密にフィットしている交換式キャピラリチューブ２７４が、針２７２の周囲をＯリング２０２によって依然としてシールされたままでベルト及びモータ（図示せず）を介して回転することを可能にする。
【００２７】
シース流体（図示せず）は流体入口チャネル２６０を通じてシース流体注入ポート２２０内に、また複数のシース注入ポート２２６内に注入されて別個のシース流動流が形成される。ほぼ同時に、シリンジ針２７２が針ロケーション２０１ａにおいてシリンジ針ノズル注入器２０１を通じてサンプルを供給する。円錐部２３０の出口端３０５とシリンジ針ノズル注入器２０１の出口との間の距離３０４は、別個のシース流動流が完全に成形された合流流動プロファイルを生成することを可能にするのに十分である。シース流体及びサンプル流動流はシリンジ針ノズル注入器２０１の出口端において同軸上に合流する。駆動ギア２８０がシャフトハウジングと回転係合すると、シース流体ポートと協働するシリンジ針２７２は、同軸上に合流した層状のサンプル容積を、シリンジ針ノズル注入器２０１を通じてキャピラリチューブ出口２３２において挿入される交換式キャピラリチューブ２７４に供給することができる。
【００２８】
好ましい一実施形態では、サンプルを担持するゲル媒質は、サンプルの中心コアがシリンジ内のゲル媒質の中心領域内に注入されると、該中心コアを保持するのに適切な高粘度及びチキソトロピー性を呈するべきである。粒子はシリンジコア内に充填されると、キャピラリチューブを下る層流を介して、中心流動流内に残留する粒子によってキャピラリチューブを押し下げる。さらに、テーパ状の供給移行部分であるテーパ状フローセル２２４によって、シリンジ流動からキャピラリチューブ内径への滑らかな移行がもたらされる。
【００２９】
有利にはゲル媒質もキャピラリチューブの屈折率と一致するように選択される光学ゲルとすることができる。屈折率が一致する材料は市販されており（たとえば市販のソースはＮｙｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｇｅｌ（Dymx Corp、及びCargille Labs）を含む）、たとえば光界面において光反射を低減するための可変反射率の光学ゲル、油及び流体を含む。光学ゲルはより高い粘度が所望される場合に特に有用であり、油、ゲル、ポリマーエポキシ樹脂、又は周囲の屈折率と一致する他の光学的に透明な材料の媒質を含むことができる。標本は、屈折率が一致するエポキシ樹脂、包埋剤、又はプラスチックポリマー並びに屈折率が一致するゲル及び粘性流体内に保持することができる。
【００３０】
本発明の流体力学集束セルを使用することによって、再構成に必要なサンプルの数を低減することも可能になり、それによってデータ収集速度が流体力学集束がない場合よりも１．６倍〜３．３倍程度増加する。本発明の流体力学集束セルは標本のセンタリングを容易にし、該センタリングは、追跡エラー及び必要な集束追跡のダイナミックレンジを低減すると共に、幾何学的歪み及び壁屈折によって引き起こされる収差からの解像度の損失を含む管壁の光学的効果を大幅に低減する。同時に、本発明のシステムは、標本を保持するためのキャピラリチューブの全体の直径を増大させることを可能にし、それによって、ＯＰＴＭシステム全体が、ゲルの振動、温度変化、封入ガスの膨張、又は化学的変化若しくは局所的なレオロジー的変化からのゲル不安定性のような要因に起因する縦運動によって受ける影響が少なくなる。
【００３１】
本発明のシステムは、標本が壁に張り付くか又は壁に沿ってゆっくりと移動する傾向を低減し、それによって壁に付着する細胞が凝集することによる目詰まりを低減することによって信頼性を向上させる。流体力学集束は本質的に、細胞が長手方向に引き離されるようにし、それによって、目詰まりが低減されて、細胞が共に近接する確率が低下することによって顕微鏡に対する提示が改善される。直径が小さいキャピラリチューブにおけるレイノルズ数はより高い速度においても２０を下回ったままであり、それによって、標本のセンタリングを混乱させる乱流なしにスループットを高くすることが可能となる。
【００３２】
ここで図４を参照すると、充填シーケンスの開始時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解が概略的に示されている。中心コア充填メカニズム１００は、第１のシリンジバレルグリップ１２２によって基礎１１２に取り付けられるプランジャ１０３を有する第１のシリンジＡを備える。プランジャ１０５を有する第２のシリンジＢが第２のシリンジバレルグリップ１２４によって線形スライド１０８に取り付けられる。シリンジＢプランジャ１０５は第１の線形アクチュエータ１０６内の第１の線形アクチュエータシャフト１０４に結合され、第１の線形アクチュエータ１０６は線形スライド１０８上に取り付けられる。次いで、線形スライド１０８が基礎１１２に摺動可能に取り付けられる。第２の線形アクチュエータ１１０は、シャフト１２０を横方向に動かすように結合され、シャフト１２０は線形スライド１０８を横方向に動かすように取り付けられる。シリンジＢはシリンジＡ及びシリンジバレル１２６の中心内に挿入するのに適切なサイズにされる外径の小さい針１０７を有する。
【００３３】
第１のシリンジバレルグリップ１２２は有利には、基板１１２に固定してシリンジバレル１２６に対するプランジャ１０５のストロークの正確度を提供することができる。一実施例では、シリンジバレルグリップ１２２はアルミニウム等のような剛性材料、又は他の既知の材料から構成され、規格Ｕ−１００のシリンジバレルにフィットするように成形される。アダプタ又は接続金具を使用して線形アクチュエータシャフト１０４をシリンジプランジャ１０５に調整可能に接続することができる。第１の線形アクチュエータ１０６及び第２の線形アクチュエータ１１０は、たとえば、電気パルスを線形アクチュエータシャフト１０４、１２０の線形の機械的ストロークに変換する単極ステッパモータケースを備えることができる。
【００３４】
通常使用では、シリンジＡは媒質ゲルを含み、シリンジＢはサンプルを含み、サンプルは通常、光学ゲル内に保持される生物細胞を含む。シリンジＡ内にサンプルを充填する前に、シリンジＢの、外径の小さい針１０７がシリンジＡの中心内に挿入される。
【００３５】
ここで図５を参照すると、充填シーケンスの終了時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解が概略的に示されている。動作中、シリンジＢは、線形スライド１０８を押し出す制御されている第１のアクチュエータ１１０を使用してシリンジＡから後退し、一方で制御されている第２の線形アクチュエータ１０６はシリンジＢを押してシリンジＡから後退している針１０７の容積と等しい容積のサンプルを分配する。このようにして、サンプルは後に観察のために光トモグラフィキャピラリチューブ（図示せず）内に分配するためにシリンジＡの中心コア１２８内に充填される。
【００３６】
シリンジＡ及びＢ内で使用される流体の高粘度、並びに光トモグラフィサンプル供給に使用されるシリンジ及びキャピラリチューブの双方の比較的小さい寸法によってサンプル供給システム内の流動の低レイノルズ数が保証される。高粘度且つチキソトロピー性のサンプル媒質のレオロジー的特性によって、細胞の懸濁液が流動を安定及び停止させることなく、サンプルキャピラリチューブを、サンプルの角度又は長手方向（すなわち流動軸寸法）を阻害することなく回転させることを可能にすることが可能となる。サンプル供給管の中心コアに拘束されるように同軸にシリンジポンプ内に充填されるサンプルは、特にキャピラリチューブへの移行がテーパ状になっており滑らかである供給システムにおいては乱流を経験しない。この種類のシリンジ中心コア充填物は、細胞の相対半径方向位置を保持するキャピラリチューブを通じて圧送することができる。層流システムの中心において開始する細胞はその中心流動流を維持する。流動流は直径数ミリメートルから１００マイクロメートル未満に収縮するため、中心粒子は中心にあるままである。ゲル媒質のような、細胞が埋め込まれるチキソトロピー性の非ニュートン性流体のレオロジー的応答によって、ゲルが流れ始めるとずれが最大になる壁に沿って流体の流動化（thinning）を生じる。このように壁の最も近くでのずり流動化（shear thinning）の結果として、速度流動プロファイルがより平坦になるという効果があり、それによって、直径にわたる流速差によって中心粒子が阻害されない状態が維持される。
【００３７】
本発明によって意図される流体集束システムを説明してきたが、本発明の、光トモグラフィシステムによる画像形成のための低減されたサンプル容積を充填する方法の一実施例をこれより説明する。少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積を、管２５１のようなサンプル供給管内に同軸上に充填することができる。次いで、サンプル容積をテーパ状フローセル２２４のようなテーパ状の供給移行部分を通じて、キャピラリチューブ２７４内に推進させることができる。キャピラリチューブはサンプル供給管よりも小さい断面積を有し、それによって、少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体の低減された容積がキャピラリチューブ内の中心領域に拘束される。好ましくは、サンプル容積は層流条件下で同軸上に合流する２つの流れによって形成され、２つの流れのうちの一方は少なくとも１つの顕微鏡サンプルを含む。本発明の方法の一態様によれば、２つの流れは、テーパ状流管内又は流体力学集束セル内のいずれかに２つの流れを別個に注入することによって層流条件下で合流する。
【００３８】
特許法に準拠すると共に、当業者に本発明の新規の原理を適用するのに必要な情報を提供するために、またこのような例示的な構成要素及び専用の構成要素を必要に応じて構成して使用するために、本発明を本明細書においてかなり詳細に記載してきた。しかしながら、明確に異なる機器、及びデバイスによって本発明を実行することができること、並びに、機器の詳細及び動作手順の双方に関して、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな変更を達成することができることは理解されたい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には光トモグラフィ画像形成システムに関し、より詳細には、生物細胞のような小さな対象物がたとえば、顕微鏡による画像形成のためにキャピラリチューブ内に流動的に位置決めされる光トモグラフィに関する。
【背景技術】
【０００２】
光トモグラフィを使用する生物細胞の画像形成の最近の進歩は、たとえば、２００３年２月１８日に発行された「APPARATUS AND METHOD FOR IMAGING SMALL OBJECTS IN A FLOW STREAM USING OPTICAL TOMOGRAPHY」と題する特許文献１に開示されているように、Nelsonによって開発されている。該特許文献の全開示が参照により援用される。当該技術分野におけるさらなる発展は、２００３年１１月１８日に出願され２００４年４月２２日付で米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号として公開された、「METHOD AND APPARATUS OF SHADOWGRAM FORMATION FOR OPTICAL TOMOGRAPHY」と題する、Fauver他の特許文献２に教示されている。該特許文献の全開示も参照により援用される。
【０００３】
このような光トモグラフィシステムにおける処理は、標本を調製することから開始する。通常、患者から採取された標本は病院又は診療所から受け取られ、処理されて非診断要素が除去され、固定され、次いで染色される。染色された標本は次いで光学ゲルと混合され、マイクロキャピラリチューブ内に挿入されて、標本内の、細胞のような対象物の画像が光トモグラフィシステムを使用して生成される。結果として生成される画像は、「疑似投影画像」と呼ばれる異なる複数の視野（perspective）からの拡張された被写界深度画像のセットを含む。疑似投影画像のセットを逆投影技法及びフィルタリング技法を使用して再構成して対象となる細胞の３次元断層像をもたらすことができる。
【０００４】
その後、３次元断層像は、対象となる構造、分子又は分子プローブを定量化すると共にそれらのロケーションを確定することを可能にするために、分析に利用可能に維持される。生物細胞のような対象物は、少なくとも１つの染色剤又は標識分子プローブを用いてラベル付けすることができ、このプローブの測定量及びロケーションが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌のようなさまざまな癌を含むが、これらには限定されない、細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらすことができる。
【０００５】
たとえば、特許文献２に記載されているような光トモグラフィ顕微鏡（ＯＰＴＭ）システムでは、１８０度の回転にわたって撮影される約２５０個のサンプル画像が、５０マイクロメートルのキャピラリチューブ内で流動流の中にランダムに分散している細胞核の容積を適切にサンプリングすることが必要とされる。以前の細胞導入方法における制限に起因して、多数の細胞がキャピラリチューブ壁の近くに現れ、それによってサンプリングが外半径において約０．６マイクロメートルの解像度をレンダリングする程度にしか良好でなくなる。
【０００６】
このような光トモグラフィシステムは集束しないキャピラリチューブ充填技法を使用するため、細胞及び他の対象物は、追跡エラー、並びに幾何学的歪み、及び管壁屈折によって引き起こされる収差からの解像度の損失を含む光学的欠陥に陥る傾向にある。このようなシステムはまた、媒質の振動、温度変化、封入ガスの膨張並びに／又は化学的変化及び局所的なレオロジー的変化からのゲル不安定性に起因する縦運動の影響を受ける。中心にない標本も、壁に張り付くか又は壁に沿ってゆっくりと移動する傾向にあり、それによって、壁に付着する細胞が凝集することから目詰まりが引き起こされる。現行のシステムもサンプルキャリーオーバーの問題を抱えている。
【０００７】
スループットを向上させるために、許容可能な解像度を維持しながらサンプリング要件を低減するために、より高い解像度又は改善された信号対雑音を提供する方法が必要とされている。本発明は、サンプルをセンタリングすると共にサンプル容積を低減して、サンプルキャリーオーバー問題を緩和しながらＯＰＴＭシステムにおける画像取得及びスループットを向上させる新規の斬新な技法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５２２，７７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／７１６，７４４号明細書
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、光トモグラフィシステムによる画像形成のためのサンプルを充填する方法を提供する。少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積は、サンプル供給管内に同軸上に充填される。サンプル容積は集束セルを通じてキャピラリチューブ内に推進される。ここでキャピラリチューブはサンプル供給管よりも小さい断面積を有し、それによって、少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体の低減された容積がキャピラリチューブ内の中央領域に拘束される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する５０マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分を概略的に示す。
【図１Ｂ】光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する１５マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分を概略的に示す。
【図２】本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセル（rotating high-pressure hydrodynamic focus flow cell）の断面図を概略的に示す。
【図３】本発明の一例の実施形態において回転高圧流体力学集束フローセルにおいて使用される集束セルの詳細な斜視図を概略的に示す。
【図４】充填シーケンスの開始時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解を概略的に示す。
【図５】充填シーケンスの終了時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において生物細胞に関連する特定の例に関して本発明を記載するが、これらの例は本発明の原理の説明を目的とするものであること、及び本発明はそのようには限定されないことは理解されよう。
【００１２】
概して本明細書において使用される場合、以下の用語は、光学顕微鏡法処理の文脈内で使用される場合、以下の意味を有する。
【００１３】
「キャピラリチューブ」は一般的に受け入れられている意味を有し、透明なマイクロキャピラリチューブ及び１００マイクロメートル以下の内径を有する等価な物品を含むように意図される。このようなマイクロキャピラリチューブは、アリゾナ州所在のPolymicro Technologies， LLCによって製造されている。
【００１４】
「対象物」は個々の細胞又は他の実体を意味する。１つ又は複数の対象物が１つの標本を含む場合がある。
【００１５】
「疑似投影」は、光学素子の本来の被写界深度よりも広い範囲のサンプリングされた容積を表す単一の画像を含む。
【００１６】
「標本」は、単一の試験又は手技から得られる個々の患者からの完全な産物（たとえば、分析、生検用に提出される唾液、又は鼻腔用綿棒）を意味する。標本は１つ又は複数の対象物から成る場合がある。標本診断の結果はケース診断の一部となる。
【００１７】
「サンプル」は、分析の準備が整っている完成した細胞調製品を意味し、アリコート又は標本のすべて又は一部を含む。
【００１８】
ここで図１Ａを参照すると、光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する、目的のセンタリングがなされていないキャピラリチューブのサンプリング増分が概略的に示されている。ここで、サンプリング増分は、第１のサンプリング角θ、第１のサンプリング距離ｄ、及びサンプリング間隔ａによって記述することができる。キャピラリチューブの直径が約５０マイクロメートルである一実施例では、θは０．７２０度になり、ｄは２５マイクロメートルになり、ａは０．３１マイクロメートルの値を有する。中心にない対象物を上記の条件下で適切にサンプリングするために、約２５０個のサンプルがキャピラリチューブの１８０度の回転にわたって必要とされる。
【００１９】
しかしながら通常、唾液のような生物サンプル中の分析される標本核及び細胞型の大部分は直径が２５マイクロメートルよりも小さい。細胞の流動流を中心流動流の半径±５マイクロメートル内に制限するために、サンプリングされる全体の半径は１５マイクロメートルとなり、すなわち中心直径は３０マイクロメートルとなる。サンプルは１０マイクロメートルの通常のサイズを有する核のみに制約されるべきであり、サンプリングされる中心容積の直径は１５マイクロメートルになる。
【００２０】
ここで図１Ｂを参照すると、光トモグラフィ顕微鏡システムによる疑似投影の取得中の等価なサンプリング増分を使用する、１５マイクロメートル径のキャピラリチューブのサンプリング増分が概略的に示されている。ここで、サンプリング増分は、本発明のシステム及び方法を使用してサンプルをセンタリングすることによって可能となるように、第２のより小さいサンプリング角θ’、第２のより小さいサンプリング距離ｄ’、及び第２のサンプリング間隔ａ’によって制約される。たとえば、一貫して０．６マイクロメートルのサンプリング間隔ａ’を維持することによって、３０マイクロメートルコアのサンプル数を２５０個から１５０個に低減することができる。１５マイクロメートルの中心直径の標的を使用してサンプリングをさらに７５個のサンプルに低減することができる。システムスループットの向上は、必要とされる画像サンプリングの割合低減まで直接に引き上げられる。したがって、同じか又はより小さい回転サンプル増分で、信号対雑音比が向上したより高い解像度を達成することができるため、光トモグラフィ分析のためにキャピラリチューブ内で細胞のような標的対象物をセンタリングすることには大幅な性能優位性がある。代替的に、回転サンプル増分を低減して、十分な画質を維持しながら同じ容積に関してサンプルをより少なくすることができる。
【００２１】
ここで図２を参照すると、本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセルの断面図が概略的に示されている。回転高圧流体力学集束フローセル２００は、ケース２５０と、封止ハウジング２５２と、ベアリングレース２５４とを備える。ケース２５０は管２５１を備え、管２５１は、集束セル２２２、シリンジ針ノズル注入器２０１、及び針シール２０３を含む構成要素を収容する。集束セル２２２は、波型円錐部２３０と、第１のＯリング及び第２のＯリング３０２と、テーパ状フローセル２２４とをさらに備える。
【００２２】
シース流体注入ポート２２０が、シース流体入口チャネル２６０において波型円錐部２３０と流体連通するケース２５０内に穿孔されるか又は他の方法で作成される。封止ハウジング２５２は、テーパ状フローセル２２４を通じて挿入されるシリンジ針２７２によって供給されるサンプルを受け入れるように軸方向に位置調整される回転シール２０２を中心に保持する。テーパ状フローセル２２４は、キャピラリチューブ出口２３２において終端する。好ましい一実施形態では、シリンジ針２７２は、交換式注入器針を含む。交換式注入器針は有利には、キャリーオーバー問題を低減し、標本のキャリーオーバーが確実に最小限に抑えられるようにシステムを通じて洗浄しなければならない全体の洗浄容積も低減する。
【００２３】
ベアリングレース２５４は、シャフトハウジング２８５に対して圧力ばめされている回転ベアリング２８２を保持する。シャフト２９０がシャフトハウジング２８５内の中心に取り付けられる。シャフト２９０は、同じく軸方向に位置調整される交換式キャピラリチューブ２７４を受け入れる穿孔を有する。駆動ギア２８０はシャフトハウジング２８５と係合するようになっている。駆動ギア２８０は、交換式キャピラリチューブ２７４を受け入れると共に中心軸２７０と一致させて中心に保持するように構成される長い環状のテーパ状素子２９２を含む。ケース２５０、封止ハウジング２５２、管２５１及びシャフト２９０は中心軸２７０に沿って直線上で位置調整される。
【００２４】
ここで図３を参照すると、本発明の一例の実施形態において使用される回転高圧流体力学集束フローセルにおいて使用される集束セルのより詳細な透視斜視図が概略的に示されている。集束セル２２２内に挿入されると、シリンジ針ノズル注入器２０１（図２に示す）は、針ロケーション２０１ａにおいて両端のＯリングシール３０２によって波型円錐部２３０内にフィットし、テーパ状フローセル２２４の中心に位置決めされる。波型円錐部２３０は、流れの方向に沿って下流に向けてテーパ状になっており、複数のシース注入ポート２２６によって一様に波型になっている。複数のシース注入ポート２２６は、シースゲルが流体入口チャネル２６０から該複数のシース注入ポート２２６を通じてテーパ状フローセル２２４に供給されることを可能にするように位置決めされる。
【００２５】
本発明の回転高圧流体力学集束フローセルを使用して、層流条件下で２つの流れを同軸上に合流させることによって生成される中心の流動の結果、標本が中心に置かれる。層流は以下の関係によって記述することができる。
Ｒ＝レイノルズ数＜＜２０００
ここで、Ｒ＝（密度）（速度）（直径）／粘度
理想的には、流速は注入ロケーションにおいて一致するか又はほぼ一致する。流速が等しいとき、初期コア径とシース直径との比は保存される。中心流動と外側の「シース」流動流とが合流する点において、流動流は流動プロファイルが同じであると仮定する。流動が下って流体力学集束セルの円錐形流動プロファイルに移行すると、流体の速度が増加してテーパを通る一定の質量流量がサポートされる。速度が増加すると流体は押し出されて直径がより小さくなるが、流動流は流動プロファイル全体にわたって同じ相対位置を保持する。中心流動流内の微粒子は中心流動流内に留まる。
【００２６】
ここで図２及び図３を共に参照すると、動作中、高圧流体力学集束セル２００はテーパ状フローセル２２４のキャピラリチューブ出口２３２に回転シール２０２を生成する。回転シール２０２は、既知の工学的設計技法を使用して、高粘性ゲルを密にフィットしている交換式キャピラリチューブ２７４を通じて押し出すのに必要な圧力に耐えるように構成される。通常の圧力は１０００ＰＳＩを超えることができる。回転ベアリング２８２は、密にフィットしている交換式キャピラリチューブ２７４が、針２７２の周囲をＯリング２０２によって依然としてシールされたままでベルト及びモータ（図示せず）を介して回転することを可能にする。
【００２７】
シース流体（図示せず）は流体入口チャネル２６０を通じてシース流体注入ポート２２０内に、また複数のシース注入ポート２２６内に注入されて別個のシース流動流が形成される。ほぼ同時に、シリンジ針２７２が針ロケーション２０１ａにおいてシリンジ針ノズル注入器２０１を通じてサンプルを供給する。円錐部２３０の出口端３０５とシリンジ針ノズル注入器２０１の出口との間の距離３０４は、別個のシース流動流が完全に成形された合流流動プロファイルを生成することを可能にするのに十分である。シース流体及びサンプル流動流はシリンジ針ノズル注入器２０１の出口端において同軸上に合流する。駆動ギア２８０がシャフトハウジングと回転係合すると、シース流体ポートと協働するシリンジ針２７２は、同軸上に合流した層状のサンプル容積を、シリンジ針ノズル注入器２０１を通じてキャピラリチューブ出口２３２において挿入される交換式キャピラリチューブ２７４に供給することができる。
【００２８】
好ましい一実施形態では、サンプルを担持するゲル媒質は、サンプルの中心コアがシリンジ内のゲル媒質の中心領域内に注入されると、該中心コアを保持するのに適切な高粘度及びチキソトロピー性を呈するべきである。粒子はシリンジコア内に充填されると、キャピラリチューブを下る層流を介して、中心流動流内に残留する粒子によってキャピラリチューブを押し下げる。さらに、テーパ状の供給移行部分であるテーパ状フローセル２２４によって、シリンジ流動からキャピラリチューブ内径への滑らかな移行がもたらされる。
【００２９】
有利にはゲル媒質もキャピラリチューブの屈折率と一致するように選択される光学ゲルとすることができる。屈折率が一致する材料は市販されており（たとえば市販のソースはＮｙｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｇｅｌ（Dymx Corp、及びCargille Labs）を含む）、たとえば光界面において光反射を低減するための可変反射率の光学ゲル、油及び流体を含む。光学ゲルはより高い粘度が所望される場合に特に有用であり、油、ゲル、ポリマーエポキシ樹脂、又は周囲の屈折率と一致する他の光学的に透明な材料の媒質を含むことができる。標本は、屈折率が一致するエポキシ樹脂、包埋剤、又はプラスチックポリマー並びに屈折率が一致するゲル及び粘性流体内に保持することができる。
【００３０】
本発明の流体力学集束セルを使用することによって、再構成に必要なサンプルの数を低減することも可能になり、それによってデータ収集速度が流体力学集束がない場合よりも１．６倍〜３．３倍程度増加する。本発明の流体力学集束セルは標本のセンタリングを容易にし、該センタリングは、追跡エラー及び必要な集束追跡のダイナミックレンジを低減すると共に、幾何学的歪み及び壁屈折によって引き起こされる収差からの解像度の損失を含む管壁の光学的効果を大幅に低減する。同時に、本発明のシステムは、標本を保持するためのキャピラリチューブの全体の直径を増大させることを可能にし、それによって、ＯＰＴＭシステム全体が、ゲルの振動、温度変化、封入ガスの膨張、又は化学的変化若しくは局所的なレオロジー的変化からのゲル不安定性のような要因に起因する縦運動によって受ける影響が少なくなる。
【００３１】
本発明のシステムは、標本が壁に張り付くか又は壁に沿ってゆっくりと移動する傾向を低減し、それによって壁に付着する細胞が凝集することによる目詰まりを低減することによって信頼性を向上させる。流体力学集束は本質的に、細胞が長手方向に引き離されるようにし、それによって、目詰まりが低減されて、細胞が共に近接する確率が低下することによって顕微鏡に対する提示が改善される。直径が小さいキャピラリチューブにおけるレイノルズ数はより高い速度においても２０を下回ったままであり、それによって、標本のセンタリングを混乱させる乱流なしにスループットを高くすることが可能となる。
【００３２】
ここで図４を参照すると、充填シーケンスの開始時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解が概略的に示されている。中心コア充填メカニズム１００は、第１のシリンジバレルグリップ１２２によって基礎１１２に取り付けられるプランジャ１０３を有する第１のシリンジＡを備える。プランジャ１０５を有する第２のシリンジＢが第２のシリンジバレルグリップ１２４によって線形スライド１０８に取り付けられる。シリンジＢプランジャ１０５は第１の線形アクチュエータ１０６内の第１の線形アクチュエータシャフト１０４に結合され、第１の線形アクチュエータ１０６は線形スライド１０８上に取り付けられる。次いで、線形スライド１０８が基礎１１２に摺動可能に取り付けられる。第２の線形アクチュエータ１１０は、シャフト１２０を横方向に動かすように結合され、シャフト１２０は線形スライド１０８を横方向に動かすように取り付けられる。シリンジＢはシリンジＡ及びシリンジバレル１２６の中心内に挿入するのに適切なサイズにされる外径の小さい針１０７を有する。
【００３３】
第１のシリンジバレルグリップ１２２は有利には、基板１１２に固定してシリンジバレル１２６に対するプランジャ１０５のストロークの正確度を提供することができる。一実施例では、シリンジバレルグリップ１２２はアルミニウム等のような剛性材料、又は他の既知の材料から構成され、規格Ｕ−１００のシリンジバレルにフィットするように成形される。アダプタ又は接続金具を使用して線形アクチュエータシャフト１０４をシリンジプランジャ１０５に調整可能に接続することができる。第１の線形アクチュエータ１０６及び第２の線形アクチュエータ１１０は、たとえば、電気パルスを線形アクチュエータシャフト１０４、１２０の線形の機械的ストロークに変換する単極ステッパモータケースを備えることができる。
【００３４】
通常使用では、シリンジＡは媒質ゲルを含み、シリンジＢはサンプルを含み、サンプルは通常、光学ゲル内に保持される生物細胞を含む。シリンジＡ内にサンプルを充填する前に、シリンジＢの、外径の小さい針１０７がシリンジＡの中心内に挿入される。
【００３５】
ここで図５を参照すると、充填シーケンスの終了時における、シリンジを充填する中心コアのための本発明の代替のメカニズムの一例の図解が概略的に示されている。動作中、シリンジＢは、線形スライド１０８を押し出す制御されている第１のアクチュエータ１１０を使用してシリンジＡから後退し、一方で制御されている第２の線形アクチュエータ１０６はシリンジＢを押してシリンジＡから後退している針１０７の容積と等しい容積のサンプルを分配する。このようにして、サンプルは後に観察のために光トモグラフィキャピラリチューブ（図示せず）内に分配するためにシリンジＡの中心コア１２８内に充填される。
【００３６】
シリンジＡ及びＢ内で使用される流体の高粘度、並びに光トモグラフィサンプル供給に使用されるシリンジ及びキャピラリチューブの双方の比較的小さい寸法によってサンプル供給システム内の流動の低レイノルズ数が保証される。高粘度且つチキソトロピー性のサンプル媒質のレオロジー的特性によって、細胞の懸濁液が流動を安定及び停止させることなく、サンプルキャピラリチューブを、サンプルの角度又は長手方向（すなわち流動軸寸法）を阻害することなく回転させることを可能にすることが可能となる。サンプル供給管の中心コアに拘束されるように同軸にシリンジポンプ内に充填されるサンプルは、特にキャピラリチューブへの移行がテーパ状になっており滑らかである供給システムにおいては乱流を経験しない。この種類のシリンジ中心コア充填物は、細胞の相対半径方向位置を保持するキャピラリチューブを通じて圧送することができる。層流システムの中心において開始する細胞はその中心流動流を維持する。流動流は直径数ミリメートルから１００マイクロメートル未満に収縮するため、中心粒子は中心にあるままである。ゲル媒質のような、細胞が埋め込まれるチキソトロピー性の非ニュートン性流体のレオロジー的応答によって、ゲルが流れ始めるとずれが最大になる壁に沿って流体の流動化（thinning）を生じる。このように壁の最も近くでのずり流動化（shear thinning）の結果として、速度流動プロファイルがより平坦になるという効果があり、それによって、直径にわたる流速差によって中心粒子が阻害されない状態が維持される。
【００３７】
本発明によって意図される流体集束システムを説明してきたが、本発明の、光トモグラフィシステムによる画像形成のための低減されたサンプル容積を充填する方法の一実施例をこれより説明する。少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積を、管２５１のようなサンプル供給管内に同軸上に充填することができる。次いで、サンプル容積をテーパ状フローセル２２４のようなテーパ状の供給移行部分を通じて、キャピラリチューブ２７４内に推進させることができる。キャピラリチューブはサンプル供給管よりも小さい断面積を有し、それによって、少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体の低減された容積がキャピラリチューブ内の中心領域に拘束される。好ましくは、サンプル容積は層流条件下で同軸上に合流する２つの流れによって形成され、２つの流れのうちの一方は少なくとも１つの顕微鏡サンプルを含む。本発明の方法の一態様によれば、２つの流れは、テーパ状流管内又は流体力学集束セル内のいずれかに２つの流れを別個に注入することによって層流条件下で合流する。
【００３８】
特許法に準拠すると共に、当業者に本発明の新規の原理を適用するのに必要な情報を提供するために、またこのような例示的な構成要素及び専用の構成要素を必要に応じて構成して使用するために、本発明を本明細書においてかなり詳細に記載してきた。しかしながら、明確に異なる機器、及びデバイスによって本発明を実行することができること、並びに、機器の詳細及び動作手順の双方に関して、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな変更を達成することができることは理解されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光トモグラフィシステムによる画像形成のためのサンプルを充填する方法であって、
少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積をサンプル供給管（２７２）内に同軸上に充填するステップと、
前記サンプル容積を流体力学集束セル（２２２）を通じてキャピラリチューブ（２７４）内に推進させるステップであって、該キャピラリチューブ（２７４）は前記サンプル供給管（２７２）よりも小さい断面積を有し、前記流体力学集束セル（２２２）は波型円錐部（２３０）及びテーパ状フローセル（２２４）を備え、それによって、前記少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び前記粘性流体の低減された容積が前記キャピラリチューブ（２７４）内の中心領域に拘束されるステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記同軸上に充填するステップは、２つの流れを層流条件下で同軸上に合流させるステップを含み、該２つの流れのうちの一方は前記少なくとも１つの顕微鏡サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つの流れを層流条件下で同軸上に合流させるステップは、前記テーパ状フローセル（２２４）内に第１の流れを注入するステップ、及び前記流体力学集束セル（２２２）内に第２の流れを注入するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粘性流体は非ニュートン性ずり流動化ゲルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記粘性流体は非ニュートン性ずり流動化ゲルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記収束セル（２２２）は波型円錐部（２３０）とテーパ状フローセル（２２４）とを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記テーパ状フローセル（２２４）はキャピラリチューブ出口（２３２）において終端し、前記波型円錐部（２３０）及び前記テーパ状フローセル（２２４）は中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整され、前記サンプル供給管（２７２）は出口端を有するシリンジ針ノズル注入器（２０１）を備え、該シリンジ針ノズル注入器（２０１）は前記テーパ状フローセル（２２４）に対してセンタリングされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
回転高圧流体力学集束フローセル（２００）であって、
波型円錐部及びテーパ状フローセル（２２４）を収容するケース（２５０）であって、該テーパ状フローセル（２２４）はキャピラリチューブ出口において終端し、前記波型円錐部及び前記テーパ状フローセル（２２４）は中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整されるケース（２５０）と、
出口端を有するシリンジ針ノズル注入器（２０１）であって、該シリンジ針ノズル注入器（２０１）は前記テーパ状フローセル（２２４）内でセンタリングされるシリンジ針ノズル注入器（２０１）とを備え、
前記波型円錐部は、複数のシース注入ポート（２２６）によって一様に波型になっており、該複数のシース注入ポート（２２６）は、前記テーパ状フローセル（２２４）と流体連通すると共に、前記シリンジ針ノズル注入器（２０１）の前記出口端において合流流動プロファイルを生成することが可能となるように、シースゲルが前記テーパ状フローセル（２２４）に供給されることを可能にするように位置決めされ、
前記テーパ状フローセル（２２４）内に同軸上に挿入されると、シリンジ針（２７２）によって供給されるサンプルを受け入れるように軸方向に位置調整される交換式キャピラリチューブ（２７４）を中心に保持する封止ハウジングと、
シャフトハウジング（２８５）と、
前記シャフトハウジング（２８５）内で中心に取り付けられると共に前記中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整されるシャフト（２９０）であって、該シャフト（２９０）は前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を受け入れる穿孔を有するシャフト（２９０）と、
前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を前記中心軸（２７０）を中心として回転させる、前記シャフトハウジング（２８５）と係合する駆動ギアと、
を備える、回転高圧流体力学集束フローセル。
【請求項９】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記駆動ギアは、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を受け入れると共に前記中心軸（２７０）と一致させて中心に保持するように構成される長い環状のテーパ状素子を備える、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１０】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記サンプルは光学ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１１】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記サンプルは非ニュートンずり流動化ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１２】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）は１００マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲内の断面内径を有する、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１３】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、シース流体注入ポート（２２０）が、シース流体入口チャネル（２６０）において前記管（２５１）と流体連通するように前記ケース（２５０）内に作成される、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１４】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記複数のシース注入ポート（２２６）及び前記シリンジ針ノズル注入器（２０１）は協働して、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）が回転すると該キャピラリチューブ（２７４）にシース流体内で層状になっているサンプルを充填する、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１５】
サンプルコアシリンジ充填のためのメカニズム（１００）であって、
基礎（１１２）に取り付けられる第１のシリンジ（Ａ）であって、該第１のシリンジ（Ａ）は媒質ゲルを含む第１のシリンジ（Ａ）と、
プランジャを有する第２のシリンジ（Ｂ）であって、該第２のシリンジ（Ｂ）は線形スライド（１０８）に取り付けられ、該線形スライド（１０８）は前記基礎（１１２）に摺動可能に取り付けられ、該第２のシリンジ（Ｂ）はサンプルを含み、該第２のシリンジ（Ｂ）は前記第１のシリンジ（Ａ）の中心内に挿入されるようなサイズにされる針（１０７）を有する第２のシリンジ（Ｂ）と、
前記線形スライド（１０８）上に取り付けられる第１の線形アクチュエータ（１０６）であって、前記第２のシリンジ（Ｂ）のプランジャは該第１の線形アクチュエータ（１０６）に結合される第１の線形アクチュエータ（１０６）と、
前記線形スライド（１０８）を横方向に動かすように結合される第２の線形アクチュエータ（１１０）とを備え、
前記第２のシリンジ（Ｂ）の針（１０７）が前記第１のシリンジ（Ａ）内に挿入された後に、前記第１の線形アクチュエータ（１０６）は前記第２のシリンジ（Ｂ）の前記シリンジプランジャを動かし、前記第２の線形アクチュエータ（１１０）は同時に前記線形スライド（１０８）を動かし、それによって、前記第２のシリンジ（Ｂ）が押されて、前記第１のシリンジ（Ａ）から後退する前記針（１０７）内の容積に比例するサンプルの該容積が分配され、それによって前記第１のシリンジ（Ａ）の中心コア（１２８）内に前記サンプルが充填されるメカニズム。
【請求項１６】
前記サンプルは光学ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１７】
前記サンプルは、非ニュートンずり流動化ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１８】
前記媒質ゲルは高粘度チキソトロピー性ゲルを含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１９】
前記サンプルは少なくとも１つの生物細胞を含み、該少なくとも１つの生物細胞は前記第２のシリンジ（Ｂ）内で半径方向位置を有し、該相対半径方向位置は充填時に維持される、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項２０】
前記サンプルは、１００マイクロメートル未満に収縮する流動流によって前記第１のシリンジ（Ａ）の前記中心コア（１２８）内に充填される、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１】
光トモグラフィシステムによる画像形成のためのサンプルを充填する方法であって、
少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び粘性流体を含むサンプル容積をサンプル供給管（２７２）内に同軸上に充填するステップと、
前記サンプル容積を流体力学集束セル（２２２）を通じてキャピラリチューブ（２７４）内に推進させるステップであって、該キャピラリチューブ（２７４）は前記サンプル供給管（２７２）よりも小さい断面積を有し、前記流体力学集束セル（２２２）は波型円錐部（２３０）及びテーパ状フローセル（２２４）を備え、それによって、前記少なくとも１つの顕微鏡サンプル及び前記粘性流体の低減された容積が前記キャピラリチューブ（２７４）内の中心領域に拘束されるステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記同軸上に充填するステップは、２つの流れを層流条件下で同軸上に合流させるステップを含み、該２つの流れのうちの一方は前記少なくとも１つの顕微鏡サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つの流れを層流条件下で同軸上に合流させるステップは、前記テーパ状フローセル（２２４）内に第１の流れを注入するステップ、及び前記流体力学集束セル（２２２）内に第２の流れを注入するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粘性流体は非ニュートン性ずり流動化ゲルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記粘性流体は非ニュートン性ずり流動化ゲルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記収束セル（２２２）は波型円錐部（２３０）とテーパ状フローセル（２２４）とを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記テーパ状フローセル（２２４）はキャピラリチューブ出口（２３２）において終端し、前記波型円錐部（２３０）及び前記テーパ状フローセル（２２４）は中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整され、前記サンプル供給管（２７２）は出口端を有するシリンジ針ノズル注入器（２０１）を備え、該シリンジ針ノズル注入器（２０１）は前記テーパ状フローセル（２２４）に対してセンタリングされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
回転高圧流体力学集束フローセル（２００）であって、
波型円錐部及びテーパ状フローセル（２２４）を収容するケース（２５０）であって、該テーパ状フローセル（２２４）はキャピラリチューブ出口において終端し、前記波型円錐部及び前記テーパ状フローセル（２２４）は中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整されるケース（２５０）と、
出口端を有するシリンジ針ノズル注入器（２０１）であって、該シリンジ針ノズル注入器（２０１）は前記テーパ状フローセル（２２４）内でセンタリングされるシリンジ針ノズル注入器（２０１）とを備え、
前記波型円錐部は、複数のシース注入ポート（２２６）によって一様に波型になっており、該複数のシース注入ポート（２２６）は、前記テーパ状フローセル（２２４）と流体連通すると共に、前記シリンジ針ノズル注入器（２０１）の前記出口端において合流流動プロファイルを生成することが可能となるように、シースゲルが前記テーパ状フローセル（２２４）に供給されることを可能にするように位置決めされ、
前記テーパ状フローセル（２２４）内に同軸上に挿入されると、シリンジ針（２７２）によって供給されるサンプルを受け入れるように軸方向に位置調整される交換式キャピラリチューブ（２７４）を中心に保持する封止ハウジングと、
シャフトハウジング（２８５）と、
前記シャフトハウジング（２８５）内で中心に取り付けられると共に前記中心軸（２７０）に沿って軸方向に位置調整されるシャフト（２９０）であって、該シャフト（２９０）は前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を受け入れる穿孔を有するシャフト（２９０）と、
前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を前記中心軸（２７０）を中心として回転させる、前記シャフトハウジング（２８５）と係合する駆動ギアと、
を備える、回転高圧流体力学集束フローセル。
【請求項９】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記駆動ギアは、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）を受け入れると共に前記中心軸（２７０）と一致させて中心に保持するように構成される長い環状のテーパ状素子を備える、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１０】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記サンプルは光学ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１１】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記サンプルは非ニュートンずり流動化ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１２】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）は１００マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲内の断面内径を有する、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１３】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、シース流体注入ポート（２２０）が、シース流体入口チャネル（２６０）において前記管（２５１）と流体連通するように前記ケース（２５０）内に作成される、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１４】
回転高圧流体力学集束セル（２００）であって、前記複数のシース注入ポート（２２６）及び前記シリンジ針ノズル注入器（２０１）は協働して、前記交換式キャピラリチューブ（２７４）が回転すると該キャピラリチューブ（２７４）にシース流体内で層状になっているサンプルを充填する、請求項８に記載の回転高圧流体力学集束セル。
【請求項１５】
サンプルコアシリンジ充填のためのメカニズム（１００）であって、
基礎（１１２）に取り付けられる第１のシリンジ（Ａ）であって、該第１のシリンジ（Ａ）は媒質ゲルを含む第１のシリンジ（Ａ）と、
プランジャを有する第２のシリンジ（Ｂ）であって、該第２のシリンジ（Ｂ）は線形スライド（１０８）に取り付けられ、該線形スライド（１０８）は前記基礎（１１２）に摺動可能に取り付けられ、該第２のシリンジ（Ｂ）はサンプルを含み、該第２のシリンジ（Ｂ）は前記第１のシリンジ（Ａ）の中心内に挿入されるようなサイズにされる針（１０７）を有する第２のシリンジ（Ｂ）と、
前記線形スライド（１０８）上に取り付けられる第１の線形アクチュエータ（１０６）であって、前記第２のシリンジ（Ｂ）のプランジャは該第１の線形アクチュエータ（１０６）に結合される第１の線形アクチュエータ（１０６）と、
前記線形スライド（１０８）を横方向に動かすように結合される第２の線形アクチュエータ（１１０）とを備え、
前記第２のシリンジ（Ｂ）の針（１０７）が前記第１のシリンジ（Ａ）内に挿入された後に、前記第１の線形アクチュエータ（１０６）は前記第２のシリンジ（Ｂ）の前記シリンジプランジャを動かし、前記第２の線形アクチュエータ（１１０）は同時に前記線形スライド（１０８）を動かし、それによって、前記第２のシリンジ（Ｂ）が押されて、前記第１のシリンジ（Ａ）から後退する前記針（１０７）内の容積に比例するサンプルの該容積が分配され、それによって前記第１のシリンジ（Ａ）の中心コア（１２８）内に前記サンプルが充填されるメカニズム。
【請求項１６】
前記サンプルは光学ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１７】
前記サンプルは、非ニュートンずり流動化ゲル内に担持される少なくとも１つの生物細胞を含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１８】
前記媒質ゲルは高粘度チキソトロピー性ゲルを含む、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項１９】
前記サンプルは少なくとも１つの生物細胞を含み、該少なくとも１つの生物細胞は前記第２のシリンジ（Ｂ）内で半径方向位置を有し、該相対半径方向位置は充填時に維持される、請求項１５に記載のメカニズム。
【請求項２０】
前記サンプルは、１００マイクロメートル未満に収縮する流動流によって前記第１のシリンジ（Ａ）の前記中心コア（１２８）内に充填される、請求項１５に記載のメカニズム。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５１９５４７（Ｐ２０１０−５１９５４７Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５０９７５（Ｐ２００９−５５０９７５）
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４２４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３６４０
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０３３５１９６２）ヴィジョンゲイト，インコーポレーテッド (7)
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４２４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３６４０
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０３３５１９６２）ヴィジョンゲイト，インコーポレーテッド (7)
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