Ｃｒｋアダプター分子の発現阻害による癌細胞の転移、浸潤阻害剤
【課題】 癌の浸潤、転移を防止する癌治療剤を提供する。
【解決手段】 GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むc-Crkの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA)を宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルスを調製する
【解決手段】 GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むc-Crkの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA)を宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルスを調製する
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｒｋアダプター分子の発現阻害による癌細胞の転移、浸潤阻害の防止に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｒｋアダプター分子ファミリーはトリ肉腫ウイルスがコードする癌遺伝子産物ｖ−Ｃｒｋにより見出された。ｖ−Ｃｒｋは１個のＳＨ２ドメインと１個のＳＨ３ドメインからなり、チロシンキナーゼ等の触媒ドメインをもたない。ｖ−Ｃｒｋは細胞内チロシンキナーゼ等の活性化、リン酸化チロシンの脱リン酸酵素からの保護、およびＣ３Ｇ、Ｓｏｓ等他の蛋白質を介したＲａｓの活性化等の機構で細胞を癌化すると考えられる。
ｖ−Ｃｒｋの細胞性対応物として、同一遺伝子から別のスプライシングにより生成される２種のｃ−Ｃｒｋ、ｃ−ＣｒｋＩとｃ−ＣｒｋＩＩが同定された（図１、非特許文献１−３）。ｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩとも過剰発現させることにより培養細胞を癌化させるトランスフォーミング活性を持ち、さらにｃ−ＣｒｋＩＩの過剰発現により培養細胞の運動能の向上が報告されている（非特許文献２、４、５）。実際にglioblastomaやlung adenocarcinoma等のヒト癌組織においてｃ−Ｃｒｋの顕著な発現上昇が報告され、ヒト癌の悪性化、すなわち転移、浸潤能に関わる分子として注目されている（非特許文献６−８）。
【非特許文献１】Mayer, B. J., Hamaguchi, M. & Hanafusa, H. (1988) Nature 332, 272-5.
【非特許文献２】Matsuda, M., Tanaka, S., Nagata, S., Kojima, A., Kurata, T., & Shibuya, M. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3482-9.
【非特許文献３】Reichman, C.T., Mayer, B.J., Keshav, S. & Hanafusa, H. (1992). Cell Growth Differ., 3, 451-60.
【非特許文献４】Iwahara, T., Akagi, T., Shishido, T. & Hanafusa, H. (2003) Oncogene 22, 5946-57.
【非特許文献５】Klemke, R. L., Leng, J., Molander, R., Brooks, P. C., Vuori, K. & Cheresh, D. A. (1998) J Cell Biol 140, 961-72.
【非特許文献６】Nishihara, H., Tanaka, S., Tsuda, M., Oikawa, S., Maeda, M., Shimizu, M., Shinomiya, H., Tanigami, A., Sawa, H. & Nagashima, K. (2002) Cancer Lett 180, 55-61.
【非特許文献７】Miller, C. T., Chen, G., Gharib, T. G., Wang, H., Thomas, D. G., Misek, D. E., Giordano, T. J., Yee, J., Orringer, M. B., Hanash, S. M. & Beer, D. G. (2003) Oncogene 22, 7950-7.
【非特許文献８】Takino, T., Nakada, M., Miyamori, H., Yamashita, J., Yamada, K. M. & Sato, H. (2003) Cancer Res 63, 2335-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は癌治療を目的とする、更に詳しくは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入することによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術を用いてｃ−Ｃｒｋの発現を阻害し、癌細胞の転移、浸潤を防止する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ｃ−ＣｒｋのｍＲＮＡ配列の内、次の配列のｄｓＲＮＡの導入により、ｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現が顕著に阻害できることを発見した（図２）。
即ち、本発明は、
GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むｃ−Ｃｒｋの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA) に関する。
【０００５】
癌細胞においてｃ−Ｃｒｋを恒常的に阻害させるためには、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入を容易にさせ、また、ｓｉＲＮＡを恒常的に発現させなければならない。組み替えレトロウイルスベクターを用いれば、上記配列番号１〜４のｓｉＲＮＡを細胞内で恒常的に発現させ得ることを確認した。
本発明は
１）５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、および
２）５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、
よりなる群から選択されるオリゴＤＮＡに関する。
スペース配列は，１〜５０個、好ましくは７〜２０個のヌクレオチドよりなる。好ましいスペース配列の例はgtgtgctgtccである。転写終結シグナルの例は、tttt、ttttt、またはttttttである
このオリゴＤＮＡが転写されるとセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖が対となり、それをスペース配列がつないでステム−ループ構造をとるＲＮＡが生成すると予測される（図３）。こうしたステム−ループ転写産物は細胞内でＤｉｃｅｒ（Paddison, P.J., Caudy, A.A., Bernstein, E., Hannon, G.J.& Conklin, D.S. (2002) Genes Dev., 16, 948-958）によって切断され、２本鎖構造のｓｉＲＮＡが生成する。
【０００６】
本発明者は上記オリゴＤＮＡを転写し、上記ステム−ループ構造をとるＲＮＡを恒常的に生成させるためにレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを利用した。
従って本発明は、上記オリゴＤＮＡ配列およびこれに作動可能に結合したＲＮＡ ポリメラーゼIII系のプロモーターを含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡにも関する。
【０００７】
上記オリゴＤＮＡ配列を含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に一過性に導入すると、上記ＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーター配列下流に結合したオリゴＤＮＡ配列をゲノムとして持つ組み替えレトロウイルスが産生される。この組み替えレトロウイルスを宿主細胞に感染させると、ウイルスゲノムを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。この細胞中ではＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターによりステム−ループ構造をとるＲＮＡ、したがって２本鎖構造のｓｉＲＮＡが産生される。
従って本発明はさらに、上記オリゴＤＮＡ配列を含む該レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に導入し、培養して得た組み替えレトロウイルスにも関する。
【０００８】
本発明はまた、このようにして得た組み替えレトロウイルスを有効成分として含んでなるヒト癌の転移・浸潤防止剤にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組み替えウイルスを用いれば、細胞内でｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡを恒常的に発現し、ヒトｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩの発現を阻害し、癌細胞の運動能を低下させるので癌の治療、癌の転移、浸潤の防止に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１）ｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡは２本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。先ず配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖をそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製し、またはＨＰＬＣで精製を行う。
また、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼとＴ７プロモーターを用いて鋳型ＤＮＡからアンチセンスとセンスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。そのために既製のキット（siRNA Construction Kit Ambion社）を用いることができる。
【００１１】
次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
【００１２】
２）オリゴＤＮＡの合成・アニーリング
５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、およびこれに相補的な配列を有するオリゴＤＮＡを合成してアニーリングさせる。
オリゴＤＮＡは、一般的に、保護基のついた４種類のデオキシリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＤＮＡは、４種類のデオキシヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＤＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＤＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＤＮＡを精製し、またはＨＰＬＣで精製を行う。
【００１３】
アニーリング条件は以下のようにして行う。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液２μＬとアニーリング用緩衝液（１００ｍＭ 酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，２ｍＭ 酢酸マグネシウム）４６μＬを混合した溶液を９０℃で３分間加熱し、その後、７０℃１０分間保温、さらに３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡおよびこれに相補的な配列を有するオリゴＤＮＡも同様にして合成してアニーリングさせる
【００１４】
３）レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡの調製
上記アニーリングしたオリゴＤＮＡ２本鎖をＲＮＡ ポリメラーゼIII系のプロモーターに作動可能に連結しレトロウイルスベクタープラスミドDNAに挿入する。
レトロウイルスベクタープラスミドDNAとしてはｐSUPER.retro (OligoEngine社)、pSIREN-RetroQ （BD Biosciences 社）を用いることができる。用いるプロモーターとしてはヒトＨ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター（Hannon, G.J., Chubb, A., Maroney, P.A., Hannon, G., Altman, S.& Nilsen T.W. (1991) J.Biol.Chem., 266, 22796-22799. ）（Kawasaki H.& Taira K. (2003) Nucleic Acids Res., 31, 700-707.）を用いることができる。
オリゴＤＮＡ２本鎖のレトロウイルスベクターベクタープラスミドＤＮＡへの挿入は以下のようにして行う。オリゴＤＮＡ２本鎖の５’端及び３’端には適当なＤＮＡ制限酵素の切断端が形成されるようにデザインし、これに対応する制限酵素で切断したレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡとＴ４ＤＮＡ リガーゼと反応させることによる。このライゲーションには既製のキットを用いることができる(ligation kit TaKaRa社)）
【００１５】
４）パッケージング細胞から組み替えレトロウイルスを得る方法
３）で得られたオリゴＤＮＡ２本鎖を有するレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、Ｐｌａｔ−Ｅ 細胞株（Morita, S., Kojima, T., & Kitamura, T., (2000) Gene Ther. 7, 1063-1066.）を用いることができる。パッケージング細胞へのレトロウイルスベクターの導入は、FuGENE6(Roche社)を用いて一過性に導入することができる。
得られた細胞は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM SIGMA社）に１０％牛胎仔血清（HyClone社）及び抗生物質（Antibiotic-Antimyotic GIBCO社）を添加した培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）にて培養し、１２時間以内に新しい培養液に交換し、さらに１２時間以上培養する。このようにして組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清を得る。この組み替えレトロウイルスは宿主細胞に感染させるとｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡを発現させる。レトロウイルスが感染によりそのゲノムを宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込ませた後に、その宿主のＤＮＡ上でＨ１やＵ６下流に繋いだ配列がＲＮＡとして転写されて、それがステム−ループを形成し、ダイサーによる切断をうけて始めてｓｉＲＮＡとなる。
【００１６】
５）ウイルスの癌への応用
４）で得た組み替えレトロウイルスを癌細胞に投与するとｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡによりｃ−Ｃｒｋタンパク質の発現を顕著に阻害する。また４）で得た組み替えレトロウイルスを癌細胞に投与すると癌細胞の運動能が大きく低下する。癌細胞の転移、浸潤は細胞の運動能に相関することが知られている。従って本発明のｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡ、それを宿主細胞中で発現しうる組み替えレトロウイルスは癌細胞の転移、浸潤の防止等の癌の治療に用いる事ができる。
【実施例】
【００１７】
実施例１
【００１８】
ｓｉＲＮＡの選定
ｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩに共通な遺伝子配列から、ＲＮＡｉに適当なsmall interfering RNA （siRNA）配列を選ぶため、次の４種類の２１−２３ヌクレオチドの配列
Ａ： AACUUCGACUCGGAGGAGCGG（配列番号５）
Ｂ： AAUUCUACAAAAUACACUAUU（配列番号６）
Ｃ： AAGAUCUUCCCUUUAAGAAAG（配列番号７）
Ｄ： AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
を選定した。次にそれぞれの配列及びそれぞれに相補な配列を有するRNAを既製キットを用いてin vitro合成し、相補的なＲＮＡ同士をハイブリダイズさせることによりｄｓＲＮＡを合成した（siRNA Construction Kit Ambion社）。
それぞれのｄｓＲＮＡをヒト癌細胞株であるＨｅＬａ 細胞にリポフェクタミン２０００（Invitrogen社）を用いて一過性に導入した。それぞれの細胞を溶解後、４μｇのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現量を抗Ｃｒｋ抗体用いるwestern blot法により比較した（図２）。配列番号２のｓｉＲＮＡがＣｒｋの発現を効果的に抑制することがわかる。
実施例２
【００１９】
pSUPER.retro/CrksiRNAレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡの調製
5’gatccccGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATgtgtgctgtccATTCCACCACTGCTCTTCAGGCtttttggaaa3'
のヌクレオチド配列（配列番号８）を有するオリゴＤＮＡ、および、
5’agcttttccaaaaaGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATggacagcacacATTCCACCACTGCTCTTCAGGCggg3’
のヌクレオチド配列（配列番号９）を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
このオリゴＤＮＡの合成は株式会社ジーンデザインにより行われた。
この２つのオリゴＤＮＡを次の条件でアニーリングさせた。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液２μＬとアニーリング用緩衝液（１００ｍＭ 酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，２ｍＭ 酢酸マグネシウム）４６μＬを混合した溶液を９０℃で３分間加熱し、その後、７０℃１０分間保温、さらに３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。）。得られた２本鎖オリゴＤＮＡを、宿主細胞中でヒトＨ１プロモーターによりＲＮＡを発現させるためのレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ、pSUPER.retro（OligoEngine社）のBamHI-HindIII siteにライゲーションした。このプラスミドＤＮＡベクターをpSUPER.retro/CrksiRNAと呼ぶ。
配列番号８および９のオリゴＤＮＡは、配列番号１の２２−ヌクレオチドのｔａｒｇｅｔ配列：GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAUのセンス鎖とアンチセンス鎖を１１−ヌクレオチドのスペース配列ではさんだもので、pSUPER.retro/CrksiRNAによるＲＮＡ転写産物は２２−塩基対のステム−ループ構造をとると予測される。こうしたステム−ループ転写産物は細胞内で切断され、２本鎖構造のｓｉＲＮＡが生成する（図３）
実施例３
【００２０】
c-CrkII蛋白質の発現阻害
pSUPER.retro/CrksiRNAをレトロウイルスパッケージング細胞、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞株（東京大学医科学研究所 北村俊雄教授より供与をうけた）FuGENE6(Roche社)を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ 培地にて培養し、組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清を得た。上記組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清をＨｅＬａ細胞の培養ｄｉｓｈに添加し、３時間以上３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地にて培養することによりＨｅＬａ細胞にウイルスを感染させ）、ピューロマイシンによる薬剤選択を行った。
得られた細胞（HeLa-CrksiRNA）と空ベクターのみを感染させたコントロール細胞（HeLa-mock）を溶解し、４μｇのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、それぞれの細胞におけるｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現を、抗Ｃｒｋ抗体と抗ＦＡＫ（ＦＡＫは細胞の運動能に関わるチロシンキナーゼである）抗体を用いるウエスタンブロット法により比較した。HeLa-CrksiRNAにおいてｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の顕著な発現阻害が認められた（図４）。
実施例４
【００２１】
Ｈｅｌａ細胞の運動能
癌細胞の転移、浸潤は細胞の運動能に相関することが知られている。そこで、HeLa-CrksiRNAとHeLa-mockの運動能を比較した。Transwell Chamber （Costar社、ポリカーボネート膜、孔径８．０μｍ）にHela-mock(mock）、Hela-CrksiRNA)、それぞれの細胞を播き、フィブロネクチンで被覆したポリカーボネート膜の裏側に移動した細胞をクリスタルバイオレットで染色した（図５Ａ）。実験は３回行い、Hela−mock細胞の移動数を１００％とした。HeLa-CrksiRNAでは７０％の運動能低下が観察された（図５Ｂ）。以上の結果、我々の見出したｃ−Ｃｒｋ ｍＲＮＡの配列をｔａｒｇｅｔとしたＲＮＡｉは癌細胞の運動能を低下させるのに有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のＣｒｋｓｉＲＮＡ、これを宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルスは癌細胞の転移、浸潤の防止等癌の治療に用いる事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｃｒｋファミリータンパク質の構造を示す模式図である。
【図２】Ｈｅｌａ細胞にＡ〜Ｃ、配列番号１、対照（無関係な配列）のｄｓＲＮＡを一過性に導入した後、それぞれの細胞を溶解し、ＳＤＡ−ＯＰＡＧＥで分離し、抗Ｃｒｋ抗体によるウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図３】pSUPER.retro/CrksiRNA中のヒトＨ１プロモーターから転写されたＲＮＡを示す。転写されたＲＮＡは図に示すようにステム−ループ構造をとると考えられる。
【図４】Hela-mock(mock）細胞、Hela-CrksiRNA（CrksiRNA）細胞、それぞれの細胞を溶解し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、抗Ｃｒｋ抗体と抗ＦＡＫ抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図５】Hela-mock(mock）細胞、Hela-CrksiRNA（CrksiRNA）細胞のフィブロネクチン中の移動を示す図である。Ｂは移動した細胞をクリスタルバイオ レットで染色したものであり、Ａはこれをグラフで示した。実験は３回行い平均値±ＳＤで表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｒｋアダプター分子の発現阻害による癌細胞の転移、浸潤阻害の防止に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｒｋアダプター分子ファミリーはトリ肉腫ウイルスがコードする癌遺伝子産物ｖ−Ｃｒｋにより見出された。ｖ−Ｃｒｋは１個のＳＨ２ドメインと１個のＳＨ３ドメインからなり、チロシンキナーゼ等の触媒ドメインをもたない。ｖ−Ｃｒｋは細胞内チロシンキナーゼ等の活性化、リン酸化チロシンの脱リン酸酵素からの保護、およびＣ３Ｇ、Ｓｏｓ等他の蛋白質を介したＲａｓの活性化等の機構で細胞を癌化すると考えられる。
ｖ−Ｃｒｋの細胞性対応物として、同一遺伝子から別のスプライシングにより生成される２種のｃ−Ｃｒｋ、ｃ−ＣｒｋＩとｃ−ＣｒｋＩＩが同定された（図１、非特許文献１−３）。ｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩとも過剰発現させることにより培養細胞を癌化させるトランスフォーミング活性を持ち、さらにｃ−ＣｒｋＩＩの過剰発現により培養細胞の運動能の向上が報告されている（非特許文献２、４、５）。実際にglioblastomaやlung adenocarcinoma等のヒト癌組織においてｃ−Ｃｒｋの顕著な発現上昇が報告され、ヒト癌の悪性化、すなわち転移、浸潤能に関わる分子として注目されている（非特許文献６−８）。
【非特許文献１】Mayer, B. J., Hamaguchi, M. & Hanafusa, H. (1988) Nature 332, 272-5.
【非特許文献２】Matsuda, M., Tanaka, S., Nagata, S., Kojima, A., Kurata, T., & Shibuya, M. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3482-9.
【非特許文献３】Reichman, C.T., Mayer, B.J., Keshav, S. & Hanafusa, H. (1992). Cell Growth Differ., 3, 451-60.
【非特許文献４】Iwahara, T., Akagi, T., Shishido, T. & Hanafusa, H. (2003) Oncogene 22, 5946-57.
【非特許文献５】Klemke, R. L., Leng, J., Molander, R., Brooks, P. C., Vuori, K. & Cheresh, D. A. (1998) J Cell Biol 140, 961-72.
【非特許文献６】Nishihara, H., Tanaka, S., Tsuda, M., Oikawa, S., Maeda, M., Shimizu, M., Shinomiya, H., Tanigami, A., Sawa, H. & Nagashima, K. (2002) Cancer Lett 180, 55-61.
【非特許文献７】Miller, C. T., Chen, G., Gharib, T. G., Wang, H., Thomas, D. G., Misek, D. E., Giordano, T. J., Yee, J., Orringer, M. B., Hanash, S. M. & Beer, D. G. (2003) Oncogene 22, 7950-7.
【非特許文献８】Takino, T., Nakada, M., Miyamori, H., Yamashita, J., Yamada, K. M. & Sato, H. (2003) Cancer Res 63, 2335-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は癌治療を目的とする、更に詳しくは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入することによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術を用いてｃ−Ｃｒｋの発現を阻害し、癌細胞の転移、浸潤を防止する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ｃ−ＣｒｋのｍＲＮＡ配列の内、次の配列のｄｓＲＮＡの導入により、ｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現が顕著に阻害できることを発見した（図２）。
即ち、本発明は、
GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むｃ−Ｃｒｋの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA) に関する。
【０００５】
癌細胞においてｃ−Ｃｒｋを恒常的に阻害させるためには、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入を容易にさせ、また、ｓｉＲＮＡを恒常的に発現させなければならない。組み替えレトロウイルスベクターを用いれば、上記配列番号１〜４のｓｉＲＮＡを細胞内で恒常的に発現させ得ることを確認した。
本発明は
１）５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、および
２）５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、
よりなる群から選択されるオリゴＤＮＡに関する。
スペース配列は，１〜５０個、好ましくは７〜２０個のヌクレオチドよりなる。好ましいスペース配列の例はgtgtgctgtccである。転写終結シグナルの例は、tttt、ttttt、またはttttttである
このオリゴＤＮＡが転写されるとセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖が対となり、それをスペース配列がつないでステム−ループ構造をとるＲＮＡが生成すると予測される（図３）。こうしたステム−ループ転写産物は細胞内でＤｉｃｅｒ（Paddison, P.J., Caudy, A.A., Bernstein, E., Hannon, G.J.& Conklin, D.S. (2002) Genes Dev., 16, 948-958）によって切断され、２本鎖構造のｓｉＲＮＡが生成する。
【０００６】
本発明者は上記オリゴＤＮＡを転写し、上記ステム−ループ構造をとるＲＮＡを恒常的に生成させるためにレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを利用した。
従って本発明は、上記オリゴＤＮＡ配列およびこれに作動可能に結合したＲＮＡ ポリメラーゼIII系のプロモーターを含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡにも関する。
【０００７】
上記オリゴＤＮＡ配列を含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に一過性に導入すると、上記ＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーター配列下流に結合したオリゴＤＮＡ配列をゲノムとして持つ組み替えレトロウイルスが産生される。この組み替えレトロウイルスを宿主細胞に感染させると、ウイルスゲノムを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。この細胞中ではＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターによりステム−ループ構造をとるＲＮＡ、したがって２本鎖構造のｓｉＲＮＡが産生される。
従って本発明はさらに、上記オリゴＤＮＡ配列を含む該レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に導入し、培養して得た組み替えレトロウイルスにも関する。
【０００８】
本発明はまた、このようにして得た組み替えレトロウイルスを有効成分として含んでなるヒト癌の転移・浸潤防止剤にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組み替えウイルスを用いれば、細胞内でｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡを恒常的に発現し、ヒトｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩの発現を阻害し、癌細胞の運動能を低下させるので癌の治療、癌の転移、浸潤の防止に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１）ｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡは２本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。先ず配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖をそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製し、またはＨＰＬＣで精製を行う。
また、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼとＴ７プロモーターを用いて鋳型ＤＮＡからアンチセンスとセンスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。そのために既製のキット（siRNA Construction Kit Ambion社）を用いることができる。
【００１１】
次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
【００１２】
２）オリゴＤＮＡの合成・アニーリング
５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、およびこれに相補的な配列を有するオリゴＤＮＡを合成してアニーリングさせる。
オリゴＤＮＡは、一般的に、保護基のついた４種類のデオキシリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＤＮＡは、４種類のデオキシヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＤＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＤＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＤＮＡを精製し、またはＨＰＬＣで精製を行う。
【００１３】
アニーリング条件は以下のようにして行う。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液２μＬとアニーリング用緩衝液（１００ｍＭ 酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，２ｍＭ 酢酸マグネシウム）４６μＬを混合した溶液を９０℃で３分間加熱し、その後、７０℃１０分間保温、さらに３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
５’側から、配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡおよびこれに相補的な配列を有するオリゴＤＮＡも同様にして合成してアニーリングさせる
【００１４】
３）レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡの調製
上記アニーリングしたオリゴＤＮＡ２本鎖をＲＮＡ ポリメラーゼIII系のプロモーターに作動可能に連結しレトロウイルスベクタープラスミドDNAに挿入する。
レトロウイルスベクタープラスミドDNAとしてはｐSUPER.retro (OligoEngine社)、pSIREN-RetroQ （BD Biosciences 社）を用いることができる。用いるプロモーターとしてはヒトＨ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター（Hannon, G.J., Chubb, A., Maroney, P.A., Hannon, G., Altman, S.& Nilsen T.W. (1991) J.Biol.Chem., 266, 22796-22799. ）（Kawasaki H.& Taira K. (2003) Nucleic Acids Res., 31, 700-707.）を用いることができる。
オリゴＤＮＡ２本鎖のレトロウイルスベクターベクタープラスミドＤＮＡへの挿入は以下のようにして行う。オリゴＤＮＡ２本鎖の５’端及び３’端には適当なＤＮＡ制限酵素の切断端が形成されるようにデザインし、これに対応する制限酵素で切断したレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡとＴ４ＤＮＡ リガーゼと反応させることによる。このライゲーションには既製のキットを用いることができる(ligation kit TaKaRa社)）
【００１５】
４）パッケージング細胞から組み替えレトロウイルスを得る方法
３）で得られたオリゴＤＮＡ２本鎖を有するレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、Ｐｌａｔ−Ｅ 細胞株（Morita, S., Kojima, T., & Kitamura, T., (2000) Gene Ther. 7, 1063-1066.）を用いることができる。パッケージング細胞へのレトロウイルスベクターの導入は、FuGENE6(Roche社)を用いて一過性に導入することができる。
得られた細胞は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM SIGMA社）に１０％牛胎仔血清（HyClone社）及び抗生物質（Antibiotic-Antimyotic GIBCO社）を添加した培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）にて培養し、１２時間以内に新しい培養液に交換し、さらに１２時間以上培養する。このようにして組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清を得る。この組み替えレトロウイルスは宿主細胞に感染させるとｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡを発現させる。レトロウイルスが感染によりそのゲノムを宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込ませた後に、その宿主のＤＮＡ上でＨ１やＵ６下流に繋いだ配列がＲＮＡとして転写されて、それがステム−ループを形成し、ダイサーによる切断をうけて始めてｓｉＲＮＡとなる。
【００１６】
５）ウイルスの癌への応用
４）で得た組み替えレトロウイルスを癌細胞に投与するとｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡによりｃ−Ｃｒｋタンパク質の発現を顕著に阻害する。また４）で得た組み替えレトロウイルスを癌細胞に投与すると癌細胞の運動能が大きく低下する。癌細胞の転移、浸潤は細胞の運動能に相関することが知られている。従って本発明のｃ−ＣｒｋのｓｉＲＮＡ、それを宿主細胞中で発現しうる組み替えレトロウイルスは癌細胞の転移、浸潤の防止等の癌の治療に用いる事ができる。
【実施例】
【００１７】
実施例１
【００１８】
ｓｉＲＮＡの選定
ｃ−ＣｒｋＩ、ｃ−ＣｒｋＩＩに共通な遺伝子配列から、ＲＮＡｉに適当なsmall interfering RNA （siRNA）配列を選ぶため、次の４種類の２１−２３ヌクレオチドの配列
Ａ： AACUUCGACUCGGAGGAGCGG（配列番号５）
Ｂ： AAUUCUACAAAAUACACUAUU（配列番号６）
Ｃ： AAGAUCUUCCCUUUAAGAAAG（配列番号７）
Ｄ： AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
を選定した。次にそれぞれの配列及びそれぞれに相補な配列を有するRNAを既製キットを用いてin vitro合成し、相補的なＲＮＡ同士をハイブリダイズさせることによりｄｓＲＮＡを合成した（siRNA Construction Kit Ambion社）。
それぞれのｄｓＲＮＡをヒト癌細胞株であるＨｅＬａ 細胞にリポフェクタミン２０００（Invitrogen社）を用いて一過性に導入した。それぞれの細胞を溶解後、４μｇのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現量を抗Ｃｒｋ抗体用いるwestern blot法により比較した（図２）。配列番号２のｓｉＲＮＡがＣｒｋの発現を効果的に抑制することがわかる。
実施例２
【００１９】
pSUPER.retro/CrksiRNAレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡの調製
5’gatccccGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATgtgtgctgtccATTCCACCACTGCTCTTCAGGCtttttggaaa3'
のヌクレオチド配列（配列番号８）を有するオリゴＤＮＡ、および、
5’agcttttccaaaaaGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATggacagcacacATTCCACCACTGCTCTTCAGGCggg3’
のヌクレオチド配列（配列番号９）を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
このオリゴＤＮＡの合成は株式会社ジーンデザインにより行われた。
この２つのオリゴＤＮＡを次の条件でアニーリングさせた。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液２μＬとアニーリング用緩衝液（１００ｍＭ 酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，２ｍＭ 酢酸マグネシウム）４６μＬを混合した溶液を９０℃で３分間加熱し、その後、７０℃１０分間保温、さらに３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。）。得られた２本鎖オリゴＤＮＡを、宿主細胞中でヒトＨ１プロモーターによりＲＮＡを発現させるためのレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ、pSUPER.retro（OligoEngine社）のBamHI-HindIII siteにライゲーションした。このプラスミドＤＮＡベクターをpSUPER.retro/CrksiRNAと呼ぶ。
配列番号８および９のオリゴＤＮＡは、配列番号１の２２−ヌクレオチドのｔａｒｇｅｔ配列：GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAUのセンス鎖とアンチセンス鎖を１１−ヌクレオチドのスペース配列ではさんだもので、pSUPER.retro/CrksiRNAによるＲＮＡ転写産物は２２−塩基対のステム−ループ構造をとると予測される。こうしたステム−ループ転写産物は細胞内で切断され、２本鎖構造のｓｉＲＮＡが生成する（図３）
実施例３
【００２０】
c-CrkII蛋白質の発現阻害
pSUPER.retro/CrksiRNAをレトロウイルスパッケージング細胞、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞株（東京大学医科学研究所 北村俊雄教授より供与をうけた）FuGENE6(Roche社)を用いて一過性に導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ 培地にて培養し、組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清を得た。上記組み替えレトロウイルスを含んだ培養上清をＨｅＬａ細胞の培養ｄｉｓｈに添加し、３時間以上３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地にて培養することによりＨｅＬａ細胞にウイルスを感染させ）、ピューロマイシンによる薬剤選択を行った。
得られた細胞（HeLa-CrksiRNA）と空ベクターのみを感染させたコントロール細胞（HeLa-mock）を溶解し、４μｇのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、それぞれの細胞におけるｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の発現を、抗Ｃｒｋ抗体と抗ＦＡＫ（ＦＡＫは細胞の運動能に関わるチロシンキナーゼである）抗体を用いるウエスタンブロット法により比較した。HeLa-CrksiRNAにおいてｃ−ＣｒｋＩＩ蛋白質の顕著な発現阻害が認められた（図４）。
実施例４
【００２１】
Ｈｅｌａ細胞の運動能
癌細胞の転移、浸潤は細胞の運動能に相関することが知られている。そこで、HeLa-CrksiRNAとHeLa-mockの運動能を比較した。Transwell Chamber （Costar社、ポリカーボネート膜、孔径８．０μｍ）にHela-mock(mock）、Hela-CrksiRNA)、それぞれの細胞を播き、フィブロネクチンで被覆したポリカーボネート膜の裏側に移動した細胞をクリスタルバイオレットで染色した（図５Ａ）。実験は３回行い、Hela−mock細胞の移動数を１００％とした。HeLa-CrksiRNAでは７０％の運動能低下が観察された（図５Ｂ）。以上の結果、我々の見出したｃ−Ｃｒｋ ｍＲＮＡの配列をｔａｒｇｅｔとしたＲＮＡｉは癌細胞の運動能を低下させるのに有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のＣｒｋｓｉＲＮＡ、これを宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルスは癌細胞の転移、浸潤の防止等癌の治療に用いる事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｃｒｋファミリータンパク質の構造を示す模式図である。
【図２】Ｈｅｌａ細胞にＡ〜Ｃ、配列番号１、対照（無関係な配列）のｄｓＲＮＡを一過性に導入した後、それぞれの細胞を溶解し、ＳＤＡ−ＯＰＡＧＥで分離し、抗Ｃｒｋ抗体によるウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図３】pSUPER.retro/CrksiRNA中のヒトＨ１プロモーターから転写されたＲＮＡを示す。転写されたＲＮＡは図に示すようにステム−ループ構造をとると考えられる。
【図４】Hela-mock(mock）細胞、Hela-CrksiRNA（CrksiRNA）細胞、それぞれの細胞を溶解し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、抗Ｃｒｋ抗体と抗ＦＡＫ抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図５】Hela-mock(mock）細胞、Hela-CrksiRNA（CrksiRNA）細胞のフィブロネクチン中の移動を示す図である。Ｂは移動した細胞をクリスタルバイオ レットで染色したものであり、Ａはこれをグラフで示した。実験は３回行い平均値±ＳＤで表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むc-Crkの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA)。
【請求項２】
１）５’側から、請求項１に記載のヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、および
２）５’側から、請求項１に記載のヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、
よりなる群から選択されるオリゴＤＮＡであって、スペース配列はヌクレオチドの数が１〜５０個であるオリゴＤＮＡ。
【請求項３】
スペース配列が７〜２０個のヌクレオチドよりなる請求項２に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項４】
転写終結シグナルがtttt、ttttt、またはttttttである請求項２又は３に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項５】
5’GCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATgtgtgctgtccATTCCACCACTGCTCTTCAGGCttttt3'
のヌクレオチド配列（配列番号１０）を含む請求項２〜４のいずれかに記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項６】
5'ATTCCACCACTGCTCTTCAGGgtgtgctgtccGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAAT ttttt3'
のヌクレオチド配列（配列番号１１）を含む請求項２に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２〜６に記載のオリゴＤＮＡおよびこれに作動可能に結合したＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターを含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項８】
レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡが、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ、またはpSIREN-RetroQである請求項７に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項９】
レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡのＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターが、ヒトＨ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーターよりなる群から選択される請求項７に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項７〜９に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞に導入し、培養して得た、Ｃｒｋの２本鎖ｓｉＲＮＡを宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルス。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組み替えレトロウイルスを有効成分として含んでなるヒト癌の転移・浸潤防止剤。
【請求項１】
GCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号１）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGG（配列番号２）
GCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号３）
AAGCCUGAAGAGCAGUGGUGGAAG（配列番号４）
よりなる群から選択されるヌクレオチド鎖およびこれに相補的なヌクレオチド鎖を含むc-Crkの２本鎖ｓｉＲＮＡ(small interference RNA)。
【請求項２】
１）５’側から、請求項１に記載のヌクレオチド鎖のセンス鎖、スペース配列、アンチセンス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、および
２）５’側から、請求項１に記載のヌクレオチド鎖のアンチセンス鎖、スペース配列、センス鎖および転写終結シグナルが結合したオリゴＤＮＡ、
よりなる群から選択されるオリゴＤＮＡであって、スペース配列はヌクレオチドの数が１〜５０個であるオリゴＤＮＡ。
【請求項３】
スペース配列が７〜２０個のヌクレオチドよりなる請求項２に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項４】
転写終結シグナルがtttt、ttttt、またはttttttである請求項２又は３に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項５】
5’GCCTGAAGAGCAGTGGTGGAATgtgtgctgtccATTCCACCACTGCTCTTCAGGCttttt3'
のヌクレオチド配列（配列番号１０）を含む請求項２〜４のいずれかに記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項６】
5'ATTCCACCACTGCTCTTCAGGgtgtgctgtccGCCTGAAGAGCAGTGGTGGAAT ttttt3'
のヌクレオチド配列（配列番号１１）を含む請求項２に記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２〜６に記載のオリゴＤＮＡおよびこれに作動可能に結合したＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターを含むレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項８】
レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡが、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ、またはpSIREN-RetroQである請求項７に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項９】
レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡのＲＮＡ ポリメラーゼIIIプロモーターが、ヒトＨ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーターよりなる群から選択される請求項７に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項７〜９に記載のレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞に導入し、培養して得た、Ｃｒｋの２本鎖ｓｉＲＮＡを宿主細胞中で発現させる組み替えレトロウイルス。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組み替えレトロウイルスを有効成分として含んでなるヒト癌の転移・浸潤防止剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１６６７２７（Ｐ２００６−１６６７２７Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６０１１１（Ｐ２００４−３６０１１１）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（３９００００７４５）財団法人大阪バイオサイエンス研究所 (32)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（３９００００７４５）財団法人大阪バイオサイエンス研究所 (32)
【Ｆターム（参考）】
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