ＤＭＰ１の測定方法
【課題】既存の測定方法に比較してより簡便、かつ正確な、精度や再現性のよいＤＭＰ１の測定方法を提供する。
【解決手段】骨細胞が産生するタンパク質であるＤＭＰ１の特定部位に対する複数の特異抗体の組み合わせを用いて、血液（血清及び血漿）又は尿検体中のＤＭＰ１をサンドイッチ法により定量化し、ＤＭＰ１を指標として非侵襲的に骨質を定量化する方法、上記方法による骨・関節関連疾患の診断方法、骨・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認方法及び当該方法に使用するためのキット。
【解決手段】骨細胞が産生するタンパク質であるＤＭＰ１の特定部位に対する複数の特異抗体の組み合わせを用いて、血液（血清及び血漿）又は尿検体中のＤＭＰ１をサンドイッチ法により定量化し、ＤＭＰ１を指標として非侵襲的に骨質を定量化する方法、上記方法による骨・関節関連疾患の診断方法、骨・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認方法及び当該方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨細胞の産生するＤｅｎｔｉｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（通常
、「ＤＭＰ１」とも略記されている。）の濃度を測定する方法、及びその測定キットに関
するものである。当該測定方法及びキットは、骨質の評価、骨・関節関連疾患の診断、骨
・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認において有用である。
【背景技術】
【０００２】
骨・関節疾患の罹患により骨の強度低下が引き起こされる。骨の強度が低下すると、骨
折が発症しやすくなり、その結果、ＱＯＬの低下や寝たきりが発生し、ひいては死亡の原
因となることが社会問題となっている。
【０００３】
従来、骨の強度は骨量によって規定されることが報告されてきたが、近年ではそれ以外
の指標として骨質が骨強度に影響することが報告されている（非特許文献１）。また、当
該骨質を評価する指標としては、骨の代謝回転の程度、骨の石灰化度及び微小骨折数
があるが、それを測定・検査するための技術はいずれも、骨組織を侵襲的に採取すること
に依らざるを得ない。
【０００４】
或いは、骨関連細胞も上記骨質の評価に関連する別の指標と認識されるようになってき
ており、当該骨関連細胞のうちで骨細胞が着目されている。とりわけ、骨細胞の数と微小
骨折数との関連性が確認されているが、その確認方法も侵襲的検査によるものである（非
特許文献２）。
【０００５】
他方で、骨細胞が特異的に産生するタンパク質等を指標として骨細胞の数及び骨質を把
握する方法が先行特許に提示されており、当該タンパク質の１つとしてＤｅｎｔｉｎ Ｍ
ａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＤＭＰ１）が挙げられている（特許文献１）。ＤＭＰ
１遺伝子は公知の遺伝子であり、ヒトを含む１０種の動物からＤＭＰ１の配列が報告され
ている。ＤＭＰ１はアミノ酸数４００〜５５０個の細胞外マトリックスタンパク質であっ
て、かつ酸性タンパク質であり、そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は豊澤等による非特許
文献３乃至非特許文献５に開示されている。
【０００６】
加えて、ＤＭＰ１の非侵襲的測定方法として、ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ Ｍ１７６（抗
ＤＭＰ１ペプチド抗体、タカラバイオ社製：非特許文献６参照）抗体を用いることや、測
定手法として（１）ウェスタンブロット分析、（２）ＥＬＩＳＡ法、（３）放射免疫測定
法、（４）タンパク質に結合している糖鎖を測定する方法なども先行文献（特許文献１）
に提示されている。しかしながら、当該文献に提示されている抗体はラットＤＭＰ１に対
する抗体であるし、実際のヒトの生体材料を用いた測定の成績は報告されていなかった。
そのため、当該抗体が実際にヒトの生体材料の測定に利用可能かどうか、また、骨質の実
態や、骨・関節関連疾患の評価能及び治療薬の効果判定も可能かどうかは明らかとなって
いなかった。更に、特許文献１には、タンパク質の測定精度の点ではＥＬＩＳＡ法が望ま
しいとの記載もあるが、該文献記載の前記ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ Ｍ１７６（以下、「
Ｍ１７６抗体」ともいう。）といった唯１種類の抗体を用いたＥＬＩＳＡ法は、サンドイ
ッチ法よりも理論的に感度や特異性が低い等の理由により、測定に問題があると思われる
。
【０００７】
しかるに、ＤＭＰ１の免疫抗原性を維持したペプチドに対する抗体を用いた免疫学的測
定方法についても先行文献（特許文献２）に記載がある。その中では、ＤＭＰ１に対する
抗体を取得するための免疫原アミノ酸配列として「ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ」（
配列番号６）が特定されており、このペプチドでニュージーランドホワイトラビットを感
作して得られた精製抗ＤＭＰ１抗体を用い、且つ当該精製抗ＤＭＰ１抗体で免疫染色する
ことにより病理組織切片中のＤＭＰ１の陽性反応を確認する方法が示されている。しかし
ながら、免疫染色法では、組織断中のＤＭＰ１の存在を示すことは可能であるものの、生
体材料から非侵襲的に採取される血清、血漿、尿中等のＤＭＰ１濃度を定量することは不
可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１７８３５６号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２３２１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン２００６年版」骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン作成委員会，ライフサイエンス出版（２００６）
【非特許文献２】Ｂｏｎｅ，２００２；３０：２０１−２０６
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，１９９９；４８：１６０−１６７
【非特許文献４】Ｇｅｎｅ，１９９９；２３４：３０７−３１４
【非特許文献５】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，２０００；５０：３１−３８
【非特許文献６】ＢＩＯ ＶＩＥＷ ２００３；４３：１８−２０ (タカラバイオ株式会社発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、より正確で高い検出感度の得られるＤＭＰ１の測定方法が求められている
。すなわち、前述のとおり、特許文献１には、骨細胞が特異的に産生するタンパク質等を
指標として骨細胞の数及び骨質を把握する方法が提示されており、且つ当該タンパク質の
１つとしてＤＭＰ１が挙げられているものの、該文献中でＤＭＰ１測定用抗体として唯一
例示された抗ラットＤＭＰ１ペプチド抗体（Ｍ１７６抗体）ではヒトのＤＭＰ１の測定が
不可能であることが、後記参考例のとおりに、明らかとなった。
【００１１】
更に、特許文献２においてＤＭＰ１に対する抗体を取得するための免疫原として用いら
れたアミノ酸配列「ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ」（配列番号６）は、本願における
配列番号５のアミノ酸配列に近似するところ、後述のとおり、本発明者は配列番号５のア
ミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を作製し、当該抗体を
用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＤＭＰ１濃度の測定を試みたものの、その感度は
更なる改善の余地があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題に鑑み種々研究した結果、ヒトＤＭＰ１の特定の配列部位に対
する免疫学的特異抗体を用いると、他の抗体の組合せを用いた場合に比較して、顕著な測
定感度の向上が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、Ｄ
ＭＰ１の存在を正確且つ感度よく非侵襲的に同定することができ、及びその濃度を測定す
ることも可能になる。更に、本発明によれば優れたＤＭＰ１測定キットも提供される。当
該キットは、例えば、骨質の評価方法、骨・関節関連疾患を診断する方法、骨・関節関連
疾患の治療に対する早期からの反応性を確認する方法に利用できることも見出された。す
なわち、本発明は以下の側面を含む。
【００１３】
（１） 試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法であって、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体と、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体との組み合わせ
を用いて該試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することを特徴とする、前記方法。
（２） 前記測定方法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、上記（１）に記載の方法。
（３） 配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体を固相化した固相と、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチド
に対して免疫学的特異性を有する抗体を標識した標識化抗体とを用いることを特徴とする
、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記標識が西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、上記（３）に記載
の方法。
（５） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体の少なくとも一方がポリクローナル抗体である上記（１）乃至（４）
のいずれかに記載の方法。
（６） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である上記（１）乃至（４）
のいずれかに記載の方法。
（７） 前記試料が、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、上記（１）
乃至（６）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（８） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
（９） 上記（１）乃至（７）のいずれかに記載された測定方法に用いるための、列番
号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体及び
配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
（１０） 患者由来の試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者が
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断するために用いる、上記（
８）又は（９）に記載の測定キット。
（１１） 前記診断が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断
された患者におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定して
おき、それらの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、上記（
１０）に記載の測定キット。
（１２） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者由来の試料中のＤ
ＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者に骨形成促進剤を投与した際の前記疾
患に対する治療効果を予測するために用いる、上記（８）又は（９）に記載の測定キット
。
（１３） 前記予測が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断
された患者におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定して
おき、それらの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、上記（
１２）に記載の測定キット。
（１４） 前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である上
記（１２）又は（１３）に記載の測定キット。
（１５） 更に、配列番号３、配列番号４又は配列番号５で表されるアミノ酸配列から
成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体、或いはそのうちの二つ以上を含む、
上記（８）乃至（１４）のいずれかに記載の測定キット。
【００１５】
（１６） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者の試料に対して、
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体と、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有
する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１又はその断片、或いはそれらに対応して変化す
る指標のいずれかの測定指標を検出し、該測定指標について予め健常人や骨粗鬆症、変形
性関節症又は関節リウマチと診断された患者におけるそれぞれの平均的な検出程度を確認
し、それらの検出程度と検討対象とする患者の検出程度を比較することにより、該患者が
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断する方法。
（１７） 上記（１）乃至（７）のいずれかの測定方法を用いることを特徴とする上記
（１６）に記載の方法。
（１８） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者に骨形成促進剤を
投与した場合の該疾患に対する治療効果を予測する方法であって、該患者の試料に対して
、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体と、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１又はその断片、或いはそれらに対応して変化
する指標のいずれかを検出し、その検出程度を別途確認した健常人や当該患者における平
均的な検出程度と比較することからなる、前記方法。
(１９） 上記（１）乃至（７）のいずれかの測定方法を用いることを特徴とする上記
（１８）に記載の方法。
（２０） 前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である上
記１８）又は（１９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法は、非侵襲的測定であるにもかかわらず正確
な測定を可能とするから、例えば血清、血漿、尿のいずれかの試料を採取するだけで十分
であり、よって患者の負担が低下する。更に、本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法
及び測定キットを用いることによって、ヒトの骨細胞数、骨小腔数、及び骨質の正確な評
価が可能となるから、その測定結果に基づく骨・関節関連疾患の診断や治療薬の薬効の早
期からの判定等も可能になり、よって本発明の意義は極めて大きい。加えて、健常人にお
いても、ＤＭＰ１の測定値の特徴的加齢変化を解析することにより、暦年齢ではない、個
々の肉体年齢を評価することが可能になると予想されるので、これまでにない肉体年齢評
価法として、メタボリックシンドロームやロコモティブシンドロームなどを防止し、国民
の健康寿命を保つ上でも、大きな利用価値が予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＤＭＰ１の各抗原ペプチド配列を示した図である。
【図２】各ＤＭＰ１抗体を１次及び２次抗体として用いたＤＭＰ１サンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線である。
【図３】健常成人男性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を年齢別にプロットした結果を示す。
【図４】健常成人女性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を年齢別にプロットした結果を示す。
【図５】健常成人男性と関節リウマチ（ＲＡ）男性患者の血清中ＤＭＰ１濃度の平均値を示す。
【図６】健常成人女性と関節リウマチ（ＲＡ）女性患者の血清中ＤＭＰ１濃度の平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（ＤＭＰ１）
本明細書において、特段の記載がない限りＤＭＰ１はヒトＤＭＰ１を意味する。Ｄｅｎ
ｔｉｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＤＭＰ１）遺伝子は公知の遺伝子であり、
またそのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、豊澤等による「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９９
９；４８：１６０−１６７、Ｇｅｎｅ １９９９；２３４：３０７−３１４、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｅｖｏｌ．２０００；５０：３１−３８」（非特許文献３乃至５）に開示されている。
従って、例えば試験動物を免疫するための免疫原として用い得るＤＭＰ１タンパク質の任
意のペプチド断片は、上記の文献に記載された配列に基づいて、例えばペプチド合成機（
ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン製等）を使用した化学合
成法により調製することができる。
【００１９】
（ＤＭＰ１の特定の配列部位に対する免疫学的特異抗体）
本発明の好適な態様で用いられる抗体は、各配列番号のアミノ酸配列（配列番号１：ヒ
トＤＭＰ１のうち２２個；ＳＧＤＤＴＦＧＤＤＤＳＧＰＧＰＫＤＲＱＥＧＧ、配列番号２
：同じく１８個；ＬＤＮＥＤＲＶＤＳＫＰＥＧＧＤＳＴＱ及び配列番号４：同じく１９個
；ＥＮＳＮＳＲＤＴＧＬＳＱＰＲＲＤＳＫＧ）から成るペプチドに対する免疫学的特異性
を有する抗体である（以下、それぞれをＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１−２抗体、ＤＭＰ１
−４抗体と略記することがある）。
【００２０】
なお、本明細書において、「配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対
して免疫学的特異性を有する抗体」というときには、当該配列番号１で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドに含まれるいずれかのエピトープを特異的に認識することにより、
該ペプチド部分を含むタンパク質又は任意の断片と結合するが、該ペプチドを含まないそ
の他のタンパク質及びその他の断片とは実質的に結合しない抗体を意味する。従って、本
発明における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的特
異性を有する抗体には、当該、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに存
在するいずれかのエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体及び配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として接種した実験動物の体内で惹起された
特異的ポリクローナル抗体も含まれる。その他の配列番号で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体についても同様である。
【００２１】
なお、本発明の更なる好適態様では、上記のＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１−２抗体、Ｄ
ＭＰ１−４抗体３種のうちのいずれか２種の抗体を用いることが好ましい。また、別の態
様においては、次の配列番号のアミノ酸配列（配列番号３：ＦＲＫＳＲＩＳＥＥＤＤＲＳ
ＥＬ、配列番号５；ＶＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤＣ）から成るペプチドに対する免
疫学的特異性を有する抗体（それぞれＤＭＰ１−３抗体、ＤＭＰ１−５抗体と略記するこ
とがある）を同様に、或いは対比して用いることができる。
【００２２】
既知のアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を作製する方法
は公知である。具体的には、まず所望によりアジュバントを含む免疫原、例えば上記配列
番号１乃至５のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを免疫動物に皮下投与し、それを
適当な間隔（例えば１週間）で所定の回数（例えば５回）繰り返して最終免疫後に全血を
採集し、これを分離することで抗血清を得る。そのような方法は、例えば、ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２．４章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ等に記載されている。次いで、前記抗
血清からのポリクローナル抗体の精製は、動物の免疫に用いた配列番号１乃至５のいずれ
かのアミノ酸配列を有するペプチドをクロマトグラフィー用の樹脂、例えば、ＣＮＢｒ活
性化セファロースやＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ともにＡｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に共有結合で固相化し、該固相化樹脂に上記抗血清を供し
て当該抗血清中の抗体を特異的に樹脂上に吸着させ、ついで、該樹脂上に吸着した抗体を
適切な緩衝液やカオトロピックイオン等を用いて溶出させて回収することでも達成できる
が、これに限定されない。その他、ポリクローナルな抗血清を生産し加工処理する方法は
、例えばＭａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ（１９８７）：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｍ
ＥＴＨＯＤ ＳＩＮＣＥＬＬＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎｄｏｎ）においても詳述されている。なお、免疫動物を免疫す
る際に、免疫原の免疫原性を高めることが望まれる場合には、例えば上記配列番号１乃至
５のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド等を、ウシサイログロブリン又はキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよ
い。
【００２３】
また、本発明の抗体をモノクローナル抗体として得る場合は、当業者に周知の手法を用
いて、上記と同様にして調製した免疫原で免疫した実験動物、好ましくはマウス・ラット
・ハムスター等のげっ歯類動物の脾細胞とミエローマ細胞株等の細胞融合用のペアレント
セルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものを選択してクローン化し、
次いで、その融合細胞を生体外又は生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモ
ノクローナル抗体を採取する。加えて、上記のとおり永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞
融合によって調製することができるが、その他に当該永久増殖性の抗体産生細胞系はまた
、腫瘍原性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、或いはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ウイルスを用いたトランスフェクションのような他の方法によってもまた調製することが
できる。例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６０：１１５３，Ｓｃｈｒｅｉｅｒ．Ｍ．ら（１９
８０）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：１６７，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）、Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊ．，２９５：９４６，Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）
を参照されたい。
【００２４】
また、本発明の抗体には上記の抗体を酵素消化処理して得られるような当該抗体の抗原
結合性フラグメントも含まれる。当該フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａ
ｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー
又はダイマー、Ｌ鎖モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖からなるダイマー
等が含まれる。該フラグメントは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼにより完
全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元剤で処理することにより得ることがで
きる。Ｈ鎖及びＬ鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還元剤で処理した
後、精製した鎖状体を分離することにより得ることもできる。更に、ヒトの疾患の診断・
治療に使用可能なようにするためには、これらの抗体をヒト化することも可能である。
【００２５】
（試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法）
本発明の上記ＤＭＰ１の特定の配列部位に対する免疫学的特異抗体は、検査対象者から
採取した生物学的試料、好ましくは非侵襲的に採集した試料におけるＤＭＰ１又はその断
片の検出及び／又は定量において有利に利用できる。本発明における非侵襲的な採集とは
、例えば尿、血液、血清又は血漿等の、生物学的流体試料の採集を含む。
【００２６】
後述のごとく、本発明の方法及びキットを利用することにより可能となる前記試料中の
ＤＭＰ１又はその断片の検出・定量結果は、骨細胞が関与する骨質（骨の石灰化の程度、
微小骨折の程度等）の評価、骨・関節関連疾患の診断、又は骨・関節関連疾患の治療に対
する早期からの反応性確認における極めて重要な指標となり得るので、限定的ではないが
、それらの用途において有用である。
【００２７】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の検出・定量は、例えば、競合分析法、直接反応タイプ
分析法、或いはサンドイッチタイプ分析法を基本とするプロトコールに従うことができる
。これらのプロトコールは、典型的には固体支持体を用いるか、或いは免疫沈澱法を利用
することもできる。当該検出のための代表的な手法の１つであるサンドウイッチタイプ分
析法を例にとれば、まず標識化された本発明のいずれかの抗体が用意される。例えば、抗
体は、放射性物質、金コロイド等の着色粒子、蛍光又は化学発光標識、或いは酵素で標識
することができる。抗体の標識の方法としては当業者にとって周知のいかなる方法も採用
することができ、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１１、３９５〜３９９頁（１９
７９）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１４、４１〜５７頁（１９８２）、Ｉｍｍｕｎｏ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２１５〜
２２５頁（１９７８）に記載の方法を利用することができる。
【００２８】
また、サンドウイッチタイプ分析法においては、本発明のいずれかの抗体、好適には上
記の標識化抗体と異なる抗体が固体支持体に固相化される。固相化は、例えば、炭酸緩衝
液（ｐＨ８.６前後）に抗体を溶解し、該溶液をマイクロプレートのウェルに添加して所
定時間インキュベートすることで達成できる。要すれば、本発明のいずれかの抗体がウェ
ル底面等の固相支持体のコーティングに用いられてキャプチャー側抗体を提供し、本発明
のいずれかの抗体（好ましくはキャプチャー側抗体と別の抗体）が放射性物質や着色粒子
又は酵素で標識されて検出側抗体を提供する。キャプチャー側抗体を有するウェル内に検
査対象者からの生物学的試料が添加され所定時間インキュベートされた後、該試料がウェ
ルから取り除かれる。好適な緩衝液等によりウェル内を充分に洗浄後、検出側の抗体がウ
ェルに添加される。所定のインキュベーションの後、ウェル内を洗浄し、キャプチャー側
抗体−測定対象物−検出側抗体複合体の生成を検出する。
【００２９】
検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に依存し、放射性標識であれば放射線
量が、着色粒子標識であれば発色量や吸光度が、また酵素標識（ＥＬＩＳＡ法）であれば
、更に適当な基質をウェルに添加し、所定のインキュベーション後の吸光度が検出される
。なお、ＥＬＩＳＡ法の例において、用いる酵素には特に制限がなく、例えば西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリ性フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される
。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合は、当該酵素の基質として３,３’,５,５
’−テトラメチルベンチジン等が利用可能である。アルカリ性フォスファターゼを使用す
る場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸があげられる。
【００３０】
本発明の好適な態様をより具体的に説明すると、本発明のＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１
−２抗体又はＤＭＰ１−４抗体、或いはそれらの組合せを利用するのが有利である。例え
ば、同一のＤＭＰ１のエピトープに対する１種の抗体、異なるＤＭＰ１エピトープに対す
る複数の抗体、及びこれらの組合せが使用され得る。
【００３１】
本発明の好適な態様の１つであるＥＬＩＳＡ法では、検出及び／又は定量の結果が酵素
と抗原もしくは抗体との結合に依存し、当該検出・定量の標識として、結合した酵素の活
性を用いる。例えば、本発明の抗体を固相（マイクロプレート又はプラスチック製カップ
等）に固定し、血清等の検体の希釈物とともにインキュベートした後に該固相を洗浄し、
酵素で標識した抗体を加えてインキュベートし、再び該固相を洗浄する。標識化するため
に好適な酵素は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼである。固相に結合した当該酵素
の活性は、上記で例示した該酵素に特異的な基質を添加し、そして生成物の生成又は基質
の利用率を比色法で測定し抗原濃度に換算される。
【００３２】
上記の固相は、好適には、本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチ
ドに対して免疫学的特異性を有する抗体又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る
ペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を各プレートに固定し、固相化第１抗体（
キャプチャー側抗体）として準備する。いっぽう、標識化は、本発明の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体をＨＲＰ標識化
し、標識化第２抗体（検出側抗体）として準備する。ＤＭＰ１の存在が疑われる試料と該
固相化第１抗体とを接触させ、洗浄の後、標識化第２抗体と接触させ、試料中のＤＭＰ１
濃度を測定する。
【００３３】
（ＤＭＰ１又はその断片の測定キット）
免疫診断用に標識された試薬を有するキットは、適切な材料を適当な容器中に包装する
ことによって得られる。この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号１で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−１抗体
）が含まれ得る。又は、この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号２で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−２抗体
）が含まれ得る。或いは、この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号１で表され
るアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−１抗
体）及び本発明の配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免
疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−２抗体又はＤＭＰ１−４抗体）が組み合わせて含
まれ得る。複数の抗体が組み合わせて含まれる場合、それぞれの抗体が別の容器に入れら
れることが好ましい。また、上記の抗体（複数の抗体が含まれる場合にはそのうちの１つ
抗体）は標識化されていてもよい。
【００３４】
更に、適当な場合には、測定キットの適切な材料として、標準ＤＭＰ１、或いは配列番
号３又は５で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体（ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭＰ１−５抗体）が含まれ得る。ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭ
Ｐ１−５抗体は、例えば検出結果の比較に用いてもよい。特に好適な本発明のキットの態
様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有
する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異
性を有する抗体を組み合わせて含み得る。
【００３５】
本発明のキットは、更に所望のアッセイを実施するのに必要な残りの試薬及び材料と、
さらにアッセイの指示書の適当なセットとを含んでよい。ＥＬＩＳＡ法のためのキットで
は、必要な残りの試薬として、希釈用緩衝液、標識酵素に特異的な基質などが含まれてい
てもよい。
【００３６】
（ＤＭＰ１又はその断片の測定結果の利用）
１．骨・関節関連疾患の診断（予備的判断を含む）への利用
本発明により、試料中、特に検査対象者から採取した生物学的試料中に存在する、骨細
胞が産生したＤＭＰ１が検出及び／又は定量されて、その検出・定量結果が、例えば骨細
胞が関与する骨質（骨の石灰化の程度、微小骨折の程度等）の評価、骨・関節関連疾患の
診断、或いは骨・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認に利用することがで
きる。
【００３７】
本発明により診断される骨・関節関連疾患の非限定的な例には、骨の吸収・形成のバラ
ンスが崩れた疾患である骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、腫瘍誘導性骨軟化症及
びその他の代謝性骨・関節疾患が含まれる。
【００３８】
２．骨・関節関連疾患が疑われる患者への骨形成促進剤投与の効果予測
ＤＭＰ１は骨細胞から産生される物質であり、骨細胞にはＰＴＨ受容体が存在すること
から、ＰＴＨ投与によりＤＭＰ１の産生量が変化する可能性がある。したがって、骨・関
節関連疾患、例えば骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者に対して骨
形成促進剤を投与する際に、本発明の測定方法を用いて当該患者由来の試料中のＤＭＰ１
又はその断片を検出乃至定量し、又はそれらに対応して変化する指標（例えば骨密度や骨
代謝マーカー等）の変化量を検出して、骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチの治療
効果指標と対比することで、骨形成促進剤の治療効果の判断能を確認できる。
【００３９】
ここで、骨形成促進剤とは骨芽細胞に作用して骨形成機能を促進する物質の総称であり
、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）並びにカルシウムセンシング受容体拮抗剤、例えばＡＣＳ
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０１１；２：２３８−２４２に記載のＪＴＴ−３０
５やＢｏｎｅ，２０１０；４６：５３４−５４２に記載のＳＢ−４２３５５７などの化合
物を例示できるが、当業者において、骨芽細胞に作用して骨形成機能を促進する作用を有
することが知られている物質であれば当該例示のものに何ら限定されない。
【００４０】
なお、本発明のＰＴＨは、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学的手法で製造されたＰＴＨ、化
学的に合成されたＰＴＨを包含し、好ましくは８４個のアミノ酸から成るヒトＰＴＨ（ヒ
トＰＴＨ（１−８４））を含む。また、本発明におけるＰＴＨの用語には生物学的に活性
なその誘導体も含まれる。すなわち、当該誘導体は生理学上活性なＰＴＨフラグメントや
それらの改変体であり得、例えば前記のＰＴＨの部分ペプチドや、ＰＴＨそのもの若しく
はその部分ペプチドの構成アミノ酸を一部他のアミノ酸に置換したもの、ＰＴＨそのもの
若しくはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を欠失したもの、およびＰＴＨそのもの
若しくはその部分ペプチドに１種以上のアミノ酸を付加したペプチドなどで、天然型ＰＴ
Ｈの持つ全ての生物活性または一部の生物活性を有するペプチドであり得る。当該ＰＴＨ
誘導体のより具体的な例としては、例えばヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３
１）、ヒトＰＴＨ（１−３６）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）、
ヒトＰＴＨ（１−１４）、ウシＰＴＨ（１−３４）などが挙げられる。
【００４１】
特に、ＰＴＨ（１−３４）は、副甲状腺ホルモンのＮ末端から３４アミノ酸までの３４
個のアミノ酸から成る副甲状腺ホルモンフラグメントに対応するものであるが、天然型Ｐ
ＴＨの生物活性は、このＰＴＨ（１−３４）によって再現されることが知られており（生
化学辞典、東京化学同人、１９８４）、臨床的にも副甲状腺機能の診断薬や骨粗鬆症に対
する治療薬として使用されている。従って、本発明におけるＰＴＨの好ましい例としては
、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３７）、ヒトＰ
ＴＨ（１−３８）、ヒトＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ２などが挙げられ、さらに好ましくは
ヒトＰＴＨ（１−８４）またはヒトＰＴＨ（１−３４）が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本
発明は限定されるものではない。
【００４３】
（特異抗体の取得）
１．ＤＭＰ１の作製
ヒトＤＭＰ１は、手術により摘出された骨組織の一部からＲＮＡを抽出して、逆転写酵
素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを用いた組換細胞技術に基づき生産及び精
製した。具体的には、ヒトＤＭＰ１ｃＤＮＡの停止コドンを除きＨｉｓ ｔａｇ配列を付
加したｃＤＮＡをｐＧＥＸ−６ｐ−１（ファルマシア社）に挿入した。常法にもとづき大
腸菌にてＧＳＴ及びＨｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＭＰ１タンパクを発現させた。ＧＳＴ及び
Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＭＰ１タンパクはグルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた製造元マニュアルに準じた
方法で精製した。
【００４４】
２．抗原の調製
配列番号１、２、３、４及び５のアミノ酸配列からなるペプチドを、公知のヒトＤＭＰ
−１配列に基づきアメリカンペプチド社へ合成依頼した（但し、以下で説明するサイログ
ロブリンとの結合体を作製する際には、配列番号１、３及び４のＮ末端、並びに配列番号
２のＣ末端にシステイン残基を付加した。）。
得られたペプチドとウシサイログロブリンとの結合体を常法に従いＥＭＣＳ法によって
以下のように作製した。各ペプチドを、それぞれ１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、リン
酸緩衝液で溶解したウシサイログロブリン５ｍｇ／ｍｌとジメチルホルムアミドで溶解し
たＥＭＣＳとをそれぞれ上記モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣ
Ｓ複合体溶液を作製した。この複合体溶液を上記ペプチド溶液に上記モル相当量加えるこ
とにより、ＥＭＣＳで架橋された各ペプチドとウシサイログロブリンとの結合体を作製し
た。得られた結合体を抗原として以下の実験に用いた。
【００４５】
３．抗体の作製
調製した抗原で、ＪＷ系ウサギ各３羽を免疫した。免疫は約２週間おきにペプチド１０
０μｇ相当量の抗原を投与することにより行った。抗原は初回免疫のみフロイント完全ア
ジュバントと混合し、２回目からはフロイント不完全アジュバントと混合した。８回免疫
後、全採血を行い、血清を分離した。得られたウサギ抗血清を、前記の合成ペプチドを特
異抗原として固定化させたチオールセファロースゲルと４℃で１晩混合し、反応させた。
ゲルをカラムに充填した後、ＰＢＳで未反応の成分を洗浄し除去した。２８０ｎｍにてタ
ンパク質の溶出位置をモニターしながら、０．２Ｍクエン酸緩衝液にて抗体をカラムから
溶出した。溶離した抗体溶液に対して、トリス緩衝液を添加して中和した。得られた各抗
体ＤＭＰ１−１、ＤＭＰ１−２、ＤＭＰ１−３、ＤＭＰ１−４及びＤＭＰ１−５を精製抗
体とした。
【００４６】
４．抗体の特異性の確認
得られた各精製抗体の抗原特異性を以下の方法によって確認した。ＤＭＰ１を９６穴プ
レートに濃度１μｇ／ｍＬ（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）で４℃、一晩放置し、ブロッキング液
（ＢＳＡ）を加えたプレートとＤＭＰ１を加えずにブロッキング液のみを加えたプレート
を調製した。各プレートを洗浄し、１０μｇ／ｍｌから２倍連続希釈した精製抗体を加え
０．５時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢで洗浄した。さらにＨＲＰ
標識抗ウサギ二次抗体を各ウェルに添加し反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有
ＰＢで洗浄した。この各ウェルに基質（ＯＰＤ）を加え発色させ、４９０ｎｍで吸光度を
測定し、ＤＭＰ１吸着ウェルと非吸着ウェルの吸光度を比較した。その結果、いずれの抗
体もＤＭＰ１抗原に特異的に結合することが確認された。
【００４７】
５．サンドイッチＥＬＩＳＡ
取得された特異的抗体のうち、ＤＭＰ１−２、ＤＭＰ１−３、ＤＭＰ１−４及びＤＭＰ
１−５を０．１Ｍ炭酸緩衝液で２０μｇ／ｍｌに調製して９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート
に０．１ｍｌ分注し、４℃で一晩静置して固相化抗体を作製した。プレートをＰＢＳで２
回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを０．２ｍｌ加え４℃で１６時間静置して非特異吸
着のブロッキングを行った。再度洗浄液で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有ＰＢＳに溶解した３２０ｐＭのＤＭＰ１溶液を、１％ＢＳＡ，０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１６０ｐＭから２．５ｐＭに希釈し、０．１ｍｌを添加して
３７℃で１時間反応させた。洗浄液で７回洗浄した後、１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳに溶解した西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ＤＭＰ１−１
抗体を０．１ｍｌづつ分注し、４℃で３０分間反応させた。洗浄液で９回洗浄後、ＴＭＢ
基質液（発色液）を０．１ｍｌ加え、室温暗所にて３０分間酵素反応を行った。停止液（
１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図２参照）
。
【００４８】
いずれの組み合わせにおいても吸光度とＤＭＰ１濃度の間で直線性が認められたことか
ら、両者の相関性が確認された。一方、吸光度の値から、測定感度はＤＭＰ１−１及びＤ
ＭＰ１−２抗体の組合せが最も高く、以下ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−４抗体の組合せ、
ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せの順であり、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５
抗体の組合せは最も感度が低かった。
【００４９】
６．添加回収率
次に、血清、血漿（ＥＤＴＡ処理、Ｈｅｐａｒｉｎ処理）、尿に異なる濃度のＤＭＰ１
を添加した試料を用い、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡによってＤＭＰ１濃度を測定し、
理論値との対比から回収率を算出した（表１参照）。回収率はＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１
−２抗体の組合せが最も高かった。ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５抗体の組合せは最も回
収率が悪く、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せ、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−
４抗体の組合せはその中間に位置していた。
【００５０】
以上の結果から、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５の組み合わせは他の組み合わせに比較
して血清、血漿及び尿成分の影響をより強く受け、定量性が劣ることが示唆される。
【表１】
【００５１】
次に、健常人から得られた血清、血漿（ＥＤＴＡ処理又はＨｅｐａｒｉｎ処理）、尿を
試料とし、ＤＭＰ１の組合せ別の吸光度を測定した（表２参照）。吸光度の高さから、Ｄ
ＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せが最も感度が高く、以下ＤＭＰ１−１及びＤＭ
Ｐ１−４抗体の組合せ、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せの順であり、ＤＭＰ
１−１及びＤＭＰ１−５抗体の組合せは吸光度の反応性が最も低かった。また、ＤＭＰ１
−１及びＤＭＰ１−５の組合せでは全ての採取試料において希釈倍率に応じた吸光度の変
化の直線性も認められなかった。
【表２】
【００５２】
上記の結果から、ＤＭＰ１−１抗体とＤＭＰ１−２抗体、ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭＰ
１−４抗体との組合せによりＤＭＰ１が測定され、ＤＭＰ１−１とＤＭＰ１−２抗体の組
合せにおいて特に高感度で測定し得ることが確認された。またＤＭＰ１−１抗体とＤＭＰ
１−２抗体の組合せでは、血清、血漿及び尿成分の影響を受けず、この点においても当該
抗体の組合せが、検体中のＤＭＰ１の測定に最も適した組合せと考えられた。
【００５３】
７．参考例 −抗ラットＤＭＰ１抗体による測定−
特許文献１に記載された抗ラットＤＭＰ１抗体（Ｍ１７６抗体）の同等品を作製し、ヒ
トＤＭＰ１の測定を実施した。
方法として、抗ラットＤＭＰ１並びに抗ヒトＤＭＰ１の１−２及び１−４抗体（ウサギ
ＩｇＧ １μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ）をプレートに固定し（固相プレート）、標準
品としてラット又はヒトＤＭＰ１の０．１５６〜１０ｎｇ／ｍＬを添加し、標識抗体とし
て、Ｂｉｏｔｉｎ化抗ラットＤＭＰ１−１抗体（Ｔａｋａｒａ市販Ｃｏｄｅ．Ｍ７１６同
等品、ウサギ ＩｇＧ）を用い、発色の有無を確認した。なお、実験条件は下記の通りと
した。
１）標準品を固相抗体プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加（３７℃ ３０ｍｉｎ）
２）Ｂｉｏｔｉｎ化抗体を１μｇ／ｗｅｌｌに調整し１００μｌ／ｗｅｌｌ添加（３７
℃ ３０ｍｉｎ）
３）Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ １００μｌ／ｗｅｌｌ添加 （３７℃ ３０ｍｉｎ）
４）ＴＭＢ（発色基質）１００μｌ／ｗｅｌｌ添加 遮光（室温 ３０ｍｉｎ）
５）吸光度（Ａ４５０）測定
その結果、以下の表３の通り、固相プレートに抗ラットＤＭＰ１抗体を用い、標識抗体
に抗ラットＤＭＰ１−１抗体用いると、ラットのＤＭＰ１標準品での発色は確認されたも
のの、ヒトのＤＭＰ１標準品での発色は確認されず、サンドイッチＥＬＩＳＡは成立しな
かった。また、固相プレートに抗ヒトＤＭＰ１抗体を用いても、標識抗体に抗ラットＤＭ
Ｐ１−１抗体用いると、ヒトのＤＭＰ１標準品での発色は確認されず、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡは成立しなかった。そして、前記「４．抗体の特異性の確認」の実験結果のとおり
、固相プレートが抗ヒトＤＭＰ１抗体で、標識抗体が抗ヒトＤＭＰ１−１抗体であった場
合には、ヒトＤＭＰ１標準品でのサンドイッチＥＬＩＳＡが成立することが確認されてい
るから、ラットＤＭＰ１抗体でヒトＤＭＰ１は検出できないことが確認された。
【表３】
【００５４】
８．健常人の加齢変化確認
本発明のＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法
で、健常成人男性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を測定し、年齢別にプロットした結果を図
３に示した。健常男性におけるＤＭＰ１濃度は、２０歳から４０歳に向けて低下し、その
後、低下状態が持続していた。この加齢変化はＤ．ＶａｓｈｉｓｈｔｈらのＢｏｎｅ，Ｖ
ｏｌ．２６，Ｎｏ．４，２０００：３７５−３８０、及びＳ．ＱｉｕらのＢｏｎｅ，Ｖｏ
ｌ．３１，Ｎｏ．２，２００２：３１３−３１８に示された、侵襲的に採取された骨で確
認された、骨細胞数及び骨細胞が存在する骨小腔密度の加齢変化と近似しており、ＤＭＰ
１測定によりこれらを近似的に測定しうることが確認された。
【００５５】
次に、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で
測定した、健常成人女性におけるＤＭＰ１濃度の年齢別のプロットを図４に示した。ＤＭ
Ｐ１濃度は２０歳から４０歳までは、健常成人男性と同様に低下したものの、４５歳以降
では経時的に上昇した。これは女性特有の現象である、閉経後の急速な骨吸収の増加を反
映しているものと考えられた。この加齢変化は、Ｍ．ＩｋｉらのＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓ
Ｉｎｔ．，１５，２００４：９８１−９９１における、骨の破壊（骨吸収）に伴って放出
されるマーカーの加齢変動の成績と一致しているものの、その変化率はＤＭＰ１がより大
きかった。その理由として、骨に蓄積されたＤＭＰ１が骨の吸収に伴って放出されるとと
もに、骨細胞そのものの数や質が変化することでＤＭＰ１の血中濃度がより高く上昇して
いると考えている。
【００５６】
上記で、健常成人女性で確認された、加齢に伴うＤＭＰ１の上昇状態が骨吸収の亢進に
よる骨基質タンパクの分解産物（骨の破壊（骨吸収）に伴って放出されるマーカー）の変
動に比較して大きく変動する要因として骨細胞の存在部位が影響している可能性がある。
すなわち、骨細胞の多くは海綿骨ではなく皮質骨に存在する。また全身の骨の９０％以上
は皮質骨であり、海綿骨の量的比率は小さい。閉経後に骨代謝回転が亢進した際に、海綿
骨も皮質骨も骨吸収亢進により骨基質タンパクの分解産物は血中、尿中に増加する。骨基
質タンパクの存在に海綿骨も皮質骨の差はないが、骨細胞は皮質骨に極めて密度高く存在
する。全身骨の量としては皮質骨が比率として多いことより、皮質骨の吸収に伴う多数の
骨細胞の破壊に伴う上昇を強く反映していることが影響していることが示唆される。
【００５７】
よってＤＭＰ１の測定の臨床的有用性は、従来のマーカーよりも鋭敏に骨吸収の変化を
とらえ、さらに、これまで知られていなかった加齢に伴う骨特性を反映する診断マーカー
となることが期待できる。さらに、骨を介して、暦年齢ではない、個々の肉体年齢を評価
することが可能となり、国民の健康寿命を保つ予防医学に利用できる。
【００５８】
９．骨・関節関連疾患罹患状態の確認
ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で、関節
リウマチ患者の血清中ＤＭＰ１濃度を測定し、健常男性及び健常女性の血清試料中のＤＭ
Ｐ１濃度との対比を行った結果を図５及び図６に示した。関節リウマチ患者の血清中ＤＭ
Ｐ１濃度は、健常人に比し、男性、女性とも有意に低値であった（Ｐ＜０．００１）。
【００５９】
１０．骨・関節関連疾患罹患の診断
関節リウマチ患者をケース、健常者を非ケースとして、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２
抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で得られたＤＭＰ１濃度を用い、感度・特
異度分析を行った（表４参照）。各男性、女性ともＤＭＰ１によるＡＵＣはいずれも０．
９を超えており、かつそれぞれのカットオフ値において感度・特異度とも０．８を超える
ことから、ＤＭＰ１による関節リウマチの診断能は極めて高いことが確認された。
【表４】
【００６０】
以上より、本発明の測定方法にて患者の試料を測定することにより、患者が関節リウマ
チか否かが判断できた。同様に実施すれば、骨粗鬆症や変形性関節症であるか否かの判断
ができると当業者は容易に理解できる。
【００６１】
１１．骨・関節関連疾患罹患治療剤の効果の予測
ＤＭＰ１は骨細胞から産生される物質であり、骨細胞にはＰＴＨ受容体が存在すること
から、ＰＴＨ投与によりＤＭＰ１の産生量が変化する可能性がある。骨粗鬆症、変形性関
節症または関節リウマチが疑われる患者に対し、ＰＴＨ及び／又はカルシウムセンシング
受容体拮抗剤等の骨形成促進剤を投与した場合に、配列番号１のアミノ酸配列を認識する
抗体と、配列番号２のアミノ酸配列を認識する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１及び
／またはその断片、またはそれらに対応して変化する指標の変化量検出し、骨粗鬆症、変
形性関節症または関節リウマチの治療効果指標と対比することで、骨形成促進剤の治療効
果の判断能を確認できる。
以上の実験を行うことにより、骨粗鬆症、変形性関節症または関節リウマチのそれぞれ
の患者において、骨形成促進剤を投与した場合のそれぞれの疾患に対する治療効果の程度
が予測されることが確認されると考えられる。
なお、本発明の測定方法や判断においては、ＤＭＰ１の濃度を直接に算出する方法を上
記に例示したが、ＤＭＰ１及び／又はその断片に対応する何らかの他の指標（例えば、吸
光度など）により判断しても同様に実施できることは言うまでもないことである。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法及びキットを用いることで、非侵襲的なヒト
の骨質の正確な評価が可能となることなどから、本発明は、医療機器産業分野等において
利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨細胞の産生するＤｅｎｔｉｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（通常
、「ＤＭＰ１」とも略記されている。）の濃度を測定する方法、及びその測定キットに関
するものである。当該測定方法及びキットは、骨質の評価、骨・関節関連疾患の診断、骨
・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認において有用である。
【背景技術】
【０００２】
骨・関節疾患の罹患により骨の強度低下が引き起こされる。骨の強度が低下すると、骨
折が発症しやすくなり、その結果、ＱＯＬの低下や寝たきりが発生し、ひいては死亡の原
因となることが社会問題となっている。
【０００３】
従来、骨の強度は骨量によって規定されることが報告されてきたが、近年ではそれ以外
の指標として骨質が骨強度に影響することが報告されている（非特許文献１）。また、当
該骨質を評価する指標としては、骨の代謝回転の程度、骨の石灰化度及び微小骨折数
があるが、それを測定・検査するための技術はいずれも、骨組織を侵襲的に採取すること
に依らざるを得ない。
【０００４】
或いは、骨関連細胞も上記骨質の評価に関連する別の指標と認識されるようになってき
ており、当該骨関連細胞のうちで骨細胞が着目されている。とりわけ、骨細胞の数と微小
骨折数との関連性が確認されているが、その確認方法も侵襲的検査によるものである（非
特許文献２）。
【０００５】
他方で、骨細胞が特異的に産生するタンパク質等を指標として骨細胞の数及び骨質を把
握する方法が先行特許に提示されており、当該タンパク質の１つとしてＤｅｎｔｉｎ Ｍ
ａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＤＭＰ１）が挙げられている（特許文献１）。ＤＭＰ
１遺伝子は公知の遺伝子であり、ヒトを含む１０種の動物からＤＭＰ１の配列が報告され
ている。ＤＭＰ１はアミノ酸数４００〜５５０個の細胞外マトリックスタンパク質であっ
て、かつ酸性タンパク質であり、そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は豊澤等による非特許
文献３乃至非特許文献５に開示されている。
【０００６】
加えて、ＤＭＰ１の非侵襲的測定方法として、ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ Ｍ１７６（抗
ＤＭＰ１ペプチド抗体、タカラバイオ社製：非特許文献６参照）抗体を用いることや、測
定手法として（１）ウェスタンブロット分析、（２）ＥＬＩＳＡ法、（３）放射免疫測定
法、（４）タンパク質に結合している糖鎖を測定する方法なども先行文献（特許文献１）
に提示されている。しかしながら、当該文献に提示されている抗体はラットＤＭＰ１に対
する抗体であるし、実際のヒトの生体材料を用いた測定の成績は報告されていなかった。
そのため、当該抗体が実際にヒトの生体材料の測定に利用可能かどうか、また、骨質の実
態や、骨・関節関連疾患の評価能及び治療薬の効果判定も可能かどうかは明らかとなって
いなかった。更に、特許文献１には、タンパク質の測定精度の点ではＥＬＩＳＡ法が望ま
しいとの記載もあるが、該文献記載の前記ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ Ｍ１７６（以下、「
Ｍ１７６抗体」ともいう。）といった唯１種類の抗体を用いたＥＬＩＳＡ法は、サンドイ
ッチ法よりも理論的に感度や特異性が低い等の理由により、測定に問題があると思われる
。
【０００７】
しかるに、ＤＭＰ１の免疫抗原性を維持したペプチドに対する抗体を用いた免疫学的測
定方法についても先行文献（特許文献２）に記載がある。その中では、ＤＭＰ１に対する
抗体を取得するための免疫原アミノ酸配列として「ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ」（
配列番号６）が特定されており、このペプチドでニュージーランドホワイトラビットを感
作して得られた精製抗ＤＭＰ１抗体を用い、且つ当該精製抗ＤＭＰ１抗体で免疫染色する
ことにより病理組織切片中のＤＭＰ１の陽性反応を確認する方法が示されている。しかし
ながら、免疫染色法では、組織断中のＤＭＰ１の存在を示すことは可能であるものの、生
体材料から非侵襲的に採取される血清、血漿、尿中等のＤＭＰ１濃度を定量することは不
可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１７８３５６号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２３２１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン２００６年版」骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン作成委員会，ライフサイエンス出版（２００６）
【非特許文献２】Ｂｏｎｅ，２００２；３０：２０１−２０６
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，１９９９；４８：１６０−１６７
【非特許文献４】Ｇｅｎｅ，１９９９；２３４：３０７−３１４
【非特許文献５】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，２０００；５０：３１−３８
【非特許文献６】ＢＩＯ ＶＩＥＷ ２００３；４３：１８−２０ (タカラバイオ株式会社発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、より正確で高い検出感度の得られるＤＭＰ１の測定方法が求められている
。すなわち、前述のとおり、特許文献１には、骨細胞が特異的に産生するタンパク質等を
指標として骨細胞の数及び骨質を把握する方法が提示されており、且つ当該タンパク質の
１つとしてＤＭＰ１が挙げられているものの、該文献中でＤＭＰ１測定用抗体として唯一
例示された抗ラットＤＭＰ１ペプチド抗体（Ｍ１７６抗体）ではヒトのＤＭＰ１の測定が
不可能であることが、後記参考例のとおりに、明らかとなった。
【００１１】
更に、特許文献２においてＤＭＰ１に対する抗体を取得するための免疫原として用いら
れたアミノ酸配列「ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ」（配列番号６）は、本願における
配列番号５のアミノ酸配列に近似するところ、後述のとおり、本発明者は配列番号５のア
ミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を作製し、当該抗体を
用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＤＭＰ１濃度の測定を試みたものの、その感度は
更なる改善の余地があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題に鑑み種々研究した結果、ヒトＤＭＰ１の特定の配列部位に対
する免疫学的特異抗体を用いると、他の抗体の組合せを用いた場合に比較して、顕著な測
定感度の向上が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、Ｄ
ＭＰ１の存在を正確且つ感度よく非侵襲的に同定することができ、及びその濃度を測定す
ることも可能になる。更に、本発明によれば優れたＤＭＰ１測定キットも提供される。当
該キットは、例えば、骨質の評価方法、骨・関節関連疾患を診断する方法、骨・関節関連
疾患の治療に対する早期からの反応性を確認する方法に利用できることも見出された。す
なわち、本発明は以下の側面を含む。
【００１３】
（１） 試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法であって、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体と、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体との組み合わせ
を用いて該試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することを特徴とする、前記方法。
（２） 前記測定方法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、上記（１）に記載の方法。
（３） 配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体を固相化した固相と、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチド
に対して免疫学的特異性を有する抗体を標識した標識化抗体とを用いることを特徴とする
、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記標識が西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、上記（３）に記載
の方法。
（５） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体の少なくとも一方がポリクローナル抗体である上記（１）乃至（４）
のいずれかに記載の方法。
（６） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である上記（１）乃至（４）
のいずれかに記載の方法。
（７） 前記試料が、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、上記（１）
乃至（６）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（８） 配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性
を有する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的
特異性を有する抗体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
（９） 上記（１）乃至（７）のいずれかに記載された測定方法に用いるための、列番
号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体及び
配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
（１０） 患者由来の試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者が
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断するために用いる、上記（
８）又は（９）に記載の測定キット。
（１１） 前記診断が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断
された患者におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定して
おき、それらの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、上記（
１０）に記載の測定キット。
（１２） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者由来の試料中のＤ
ＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者に骨形成促進剤を投与した際の前記疾
患に対する治療効果を予測するために用いる、上記（８）又は（９）に記載の測定キット
。
（１３） 前記予測が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断
された患者におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定して
おき、それらの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、上記（
１２）に記載の測定キット。
（１４） 前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である上
記（１２）又は（１３）に記載の測定キット。
（１５） 更に、配列番号３、配列番号４又は配列番号５で表されるアミノ酸配列から
成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体、或いはそのうちの二つ以上を含む、
上記（８）乃至（１４）のいずれかに記載の測定キット。
【００１５】
（１６） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者の試料に対して、
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体と、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有
する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１又はその断片、或いはそれらに対応して変化す
る指標のいずれかの測定指標を検出し、該測定指標について予め健常人や骨粗鬆症、変形
性関節症又は関節リウマチと診断された患者におけるそれぞれの平均的な検出程度を確認
し、それらの検出程度と検討対象とする患者の検出程度を比較することにより、該患者が
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断する方法。
（１７） 上記（１）乃至（７）のいずれかの測定方法を用いることを特徴とする上記
（１６）に記載の方法。
（１８） 骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者に骨形成促進剤を
投与した場合の該疾患に対する治療効果を予測する方法であって、該患者の試料に対して
、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体と、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１又はその断片、或いはそれらに対応して変化
する指標のいずれかを検出し、その検出程度を別途確認した健常人や当該患者における平
均的な検出程度と比較することからなる、前記方法。
(１９） 上記（１）乃至（７）のいずれかの測定方法を用いることを特徴とする上記
（１８）に記載の方法。
（２０） 前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である上
記１８）又は（１９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法は、非侵襲的測定であるにもかかわらず正確
な測定を可能とするから、例えば血清、血漿、尿のいずれかの試料を採取するだけで十分
であり、よって患者の負担が低下する。更に、本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法
及び測定キットを用いることによって、ヒトの骨細胞数、骨小腔数、及び骨質の正確な評
価が可能となるから、その測定結果に基づく骨・関節関連疾患の診断や治療薬の薬効の早
期からの判定等も可能になり、よって本発明の意義は極めて大きい。加えて、健常人にお
いても、ＤＭＰ１の測定値の特徴的加齢変化を解析することにより、暦年齢ではない、個
々の肉体年齢を評価することが可能になると予想されるので、これまでにない肉体年齢評
価法として、メタボリックシンドロームやロコモティブシンドロームなどを防止し、国民
の健康寿命を保つ上でも、大きな利用価値が予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＤＭＰ１の各抗原ペプチド配列を示した図である。
【図２】各ＤＭＰ１抗体を１次及び２次抗体として用いたＤＭＰ１サンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線である。
【図３】健常成人男性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を年齢別にプロットした結果を示す。
【図４】健常成人女性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を年齢別にプロットした結果を示す。
【図５】健常成人男性と関節リウマチ（ＲＡ）男性患者の血清中ＤＭＰ１濃度の平均値を示す。
【図６】健常成人女性と関節リウマチ（ＲＡ）女性患者の血清中ＤＭＰ１濃度の平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（ＤＭＰ１）
本明細書において、特段の記載がない限りＤＭＰ１はヒトＤＭＰ１を意味する。Ｄｅｎ
ｔｉｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＤＭＰ１）遺伝子は公知の遺伝子であり、
またそのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、豊澤等による「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９９
９；４８：１６０−１６７、Ｇｅｎｅ １９９９；２３４：３０７−３１４、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｅｖｏｌ．２０００；５０：３１−３８」（非特許文献３乃至５）に開示されている。
従って、例えば試験動物を免疫するための免疫原として用い得るＤＭＰ１タンパク質の任
意のペプチド断片は、上記の文献に記載された配列に基づいて、例えばペプチド合成機（
ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン製等）を使用した化学合
成法により調製することができる。
【００１９】
（ＤＭＰ１の特定の配列部位に対する免疫学的特異抗体）
本発明の好適な態様で用いられる抗体は、各配列番号のアミノ酸配列（配列番号１：ヒ
トＤＭＰ１のうち２２個；ＳＧＤＤＴＦＧＤＤＤＳＧＰＧＰＫＤＲＱＥＧＧ、配列番号２
：同じく１８個；ＬＤＮＥＤＲＶＤＳＫＰＥＧＧＤＳＴＱ及び配列番号４：同じく１９個
；ＥＮＳＮＳＲＤＴＧＬＳＱＰＲＲＤＳＫＧ）から成るペプチドに対する免疫学的特異性
を有する抗体である（以下、それぞれをＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１−２抗体、ＤＭＰ１
−４抗体と略記することがある）。
【００２０】
なお、本明細書において、「配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対
して免疫学的特異性を有する抗体」というときには、当該配列番号１で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドに含まれるいずれかのエピトープを特異的に認識することにより、
該ペプチド部分を含むタンパク質又は任意の断片と結合するが、該ペプチドを含まないそ
の他のタンパク質及びその他の断片とは実質的に結合しない抗体を意味する。従って、本
発明における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的特
異性を有する抗体には、当該、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに存
在するいずれかのエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体及び配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として接種した実験動物の体内で惹起された
特異的ポリクローナル抗体も含まれる。その他の配列番号で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体についても同様である。
【００２１】
なお、本発明の更なる好適態様では、上記のＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１−２抗体、Ｄ
ＭＰ１−４抗体３種のうちのいずれか２種の抗体を用いることが好ましい。また、別の態
様においては、次の配列番号のアミノ酸配列（配列番号３：ＦＲＫＳＲＩＳＥＥＤＤＲＳ
ＥＬ、配列番号５；ＶＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤＣ）から成るペプチドに対する免
疫学的特異性を有する抗体（それぞれＤＭＰ１−３抗体、ＤＭＰ１−５抗体と略記するこ
とがある）を同様に、或いは対比して用いることができる。
【００２２】
既知のアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を作製する方法
は公知である。具体的には、まず所望によりアジュバントを含む免疫原、例えば上記配列
番号１乃至５のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを免疫動物に皮下投与し、それを
適当な間隔（例えば１週間）で所定の回数（例えば５回）繰り返して最終免疫後に全血を
採集し、これを分離することで抗血清を得る。そのような方法は、例えば、ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２．４章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ等に記載されている。次いで、前記抗
血清からのポリクローナル抗体の精製は、動物の免疫に用いた配列番号１乃至５のいずれ
かのアミノ酸配列を有するペプチドをクロマトグラフィー用の樹脂、例えば、ＣＮＢｒ活
性化セファロースやＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ともにＡｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に共有結合で固相化し、該固相化樹脂に上記抗血清を供し
て当該抗血清中の抗体を特異的に樹脂上に吸着させ、ついで、該樹脂上に吸着した抗体を
適切な緩衝液やカオトロピックイオン等を用いて溶出させて回収することでも達成できる
が、これに限定されない。その他、ポリクローナルな抗血清を生産し加工処理する方法は
、例えばＭａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ（１９８７）：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｍ
ＥＴＨＯＤ ＳＩＮＣＥＬＬＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｌｏｎｄｏｎ）においても詳述されている。なお、免疫動物を免疫す
る際に、免疫原の免疫原性を高めることが望まれる場合には、例えば上記配列番号１乃至
５のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド等を、ウシサイログロブリン又はキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよ
い。
【００２３】
また、本発明の抗体をモノクローナル抗体として得る場合は、当業者に周知の手法を用
いて、上記と同様にして調製した免疫原で免疫した実験動物、好ましくはマウス・ラット
・ハムスター等のげっ歯類動物の脾細胞とミエローマ細胞株等の細胞融合用のペアレント
セルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものを選択してクローン化し、
次いで、その融合細胞を生体外又は生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモ
ノクローナル抗体を採取する。加えて、上記のとおり永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞
融合によって調製することができるが、その他に当該永久増殖性の抗体産生細胞系はまた
、腫瘍原性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、或いはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ウイルスを用いたトランスフェクションのような他の方法によってもまた調製することが
できる。例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６０：１１５３，Ｓｃｈｒｅｉｅｒ．Ｍ．ら（１９
８０）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：１６７，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）、Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊ．，２９５：９４６，Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）
を参照されたい。
【００２４】
また、本発明の抗体には上記の抗体を酵素消化処理して得られるような当該抗体の抗原
結合性フラグメントも含まれる。当該フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａ
ｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー
又はダイマー、Ｌ鎖モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖からなるダイマー
等が含まれる。該フラグメントは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼにより完
全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元剤で処理することにより得ることがで
きる。Ｈ鎖及びＬ鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還元剤で処理した
後、精製した鎖状体を分離することにより得ることもできる。更に、ヒトの疾患の診断・
治療に使用可能なようにするためには、これらの抗体をヒト化することも可能である。
【００２５】
（試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法）
本発明の上記ＤＭＰ１の特定の配列部位に対する免疫学的特異抗体は、検査対象者から
採取した生物学的試料、好ましくは非侵襲的に採集した試料におけるＤＭＰ１又はその断
片の検出及び／又は定量において有利に利用できる。本発明における非侵襲的な採集とは
、例えば尿、血液、血清又は血漿等の、生物学的流体試料の採集を含む。
【００２６】
後述のごとく、本発明の方法及びキットを利用することにより可能となる前記試料中の
ＤＭＰ１又はその断片の検出・定量結果は、骨細胞が関与する骨質（骨の石灰化の程度、
微小骨折の程度等）の評価、骨・関節関連疾患の診断、又は骨・関節関連疾患の治療に対
する早期からの反応性確認における極めて重要な指標となり得るので、限定的ではないが
、それらの用途において有用である。
【００２７】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の検出・定量は、例えば、競合分析法、直接反応タイプ
分析法、或いはサンドイッチタイプ分析法を基本とするプロトコールに従うことができる
。これらのプロトコールは、典型的には固体支持体を用いるか、或いは免疫沈澱法を利用
することもできる。当該検出のための代表的な手法の１つであるサンドウイッチタイプ分
析法を例にとれば、まず標識化された本発明のいずれかの抗体が用意される。例えば、抗
体は、放射性物質、金コロイド等の着色粒子、蛍光又は化学発光標識、或いは酵素で標識
することができる。抗体の標識の方法としては当業者にとって周知のいかなる方法も採用
することができ、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１１、３９５〜３９９頁（１９
７９）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１４、４１〜５７頁（１９８２）、Ｉｍｍｕｎｏ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２１５〜
２２５頁（１９７８）に記載の方法を利用することができる。
【００２８】
また、サンドウイッチタイプ分析法においては、本発明のいずれかの抗体、好適には上
記の標識化抗体と異なる抗体が固体支持体に固相化される。固相化は、例えば、炭酸緩衝
液（ｐＨ８.６前後）に抗体を溶解し、該溶液をマイクロプレートのウェルに添加して所
定時間インキュベートすることで達成できる。要すれば、本発明のいずれかの抗体がウェ
ル底面等の固相支持体のコーティングに用いられてキャプチャー側抗体を提供し、本発明
のいずれかの抗体（好ましくはキャプチャー側抗体と別の抗体）が放射性物質や着色粒子
又は酵素で標識されて検出側抗体を提供する。キャプチャー側抗体を有するウェル内に検
査対象者からの生物学的試料が添加され所定時間インキュベートされた後、該試料がウェ
ルから取り除かれる。好適な緩衝液等によりウェル内を充分に洗浄後、検出側の抗体がウ
ェルに添加される。所定のインキュベーションの後、ウェル内を洗浄し、キャプチャー側
抗体−測定対象物−検出側抗体複合体の生成を検出する。
【００２９】
検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に依存し、放射性標識であれば放射線
量が、着色粒子標識であれば発色量や吸光度が、また酵素標識（ＥＬＩＳＡ法）であれば
、更に適当な基質をウェルに添加し、所定のインキュベーション後の吸光度が検出される
。なお、ＥＬＩＳＡ法の例において、用いる酵素には特に制限がなく、例えば西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリ性フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される
。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合は、当該酵素の基質として３,３’,５,５
’−テトラメチルベンチジン等が利用可能である。アルカリ性フォスファターゼを使用す
る場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸があげられる。
【００３０】
本発明の好適な態様をより具体的に説明すると、本発明のＤＭＰ１−１抗体、ＤＭＰ１
−２抗体又はＤＭＰ１−４抗体、或いはそれらの組合せを利用するのが有利である。例え
ば、同一のＤＭＰ１のエピトープに対する１種の抗体、異なるＤＭＰ１エピトープに対す
る複数の抗体、及びこれらの組合せが使用され得る。
【００３１】
本発明の好適な態様の１つであるＥＬＩＳＡ法では、検出及び／又は定量の結果が酵素
と抗原もしくは抗体との結合に依存し、当該検出・定量の標識として、結合した酵素の活
性を用いる。例えば、本発明の抗体を固相（マイクロプレート又はプラスチック製カップ
等）に固定し、血清等の検体の希釈物とともにインキュベートした後に該固相を洗浄し、
酵素で標識した抗体を加えてインキュベートし、再び該固相を洗浄する。標識化するため
に好適な酵素は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼである。固相に結合した当該酵素
の活性は、上記で例示した該酵素に特異的な基質を添加し、そして生成物の生成又は基質
の利用率を比色法で測定し抗原濃度に換算される。
【００３２】
上記の固相は、好適には、本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチ
ドに対して免疫学的特異性を有する抗体又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る
ペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を各プレートに固定し、固相化第１抗体（
キャプチャー側抗体）として準備する。いっぽう、標識化は、本発明の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体をＨＲＰ標識化
し、標識化第２抗体（検出側抗体）として準備する。ＤＭＰ１の存在が疑われる試料と該
固相化第１抗体とを接触させ、洗浄の後、標識化第２抗体と接触させ、試料中のＤＭＰ１
濃度を測定する。
【００３３】
（ＤＭＰ１又はその断片の測定キット）
免疫診断用に標識された試薬を有するキットは、適切な材料を適当な容器中に包装する
ことによって得られる。この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号１で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−１抗体
）が含まれ得る。又は、この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号２で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−２抗体
）が含まれ得る。或いは、この適切な材料には、少なくとも本発明の配列番号１で表され
るアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−１抗
体）及び本発明の配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免
疫学的特異性を有する抗体（ＤＭＰ１−２抗体又はＤＭＰ１−４抗体）が組み合わせて含
まれ得る。複数の抗体が組み合わせて含まれる場合、それぞれの抗体が別の容器に入れら
れることが好ましい。また、上記の抗体（複数の抗体が含まれる場合にはそのうちの１つ
抗体）は標識化されていてもよい。
【００３４】
更に、適当な場合には、測定キットの適切な材料として、標準ＤＭＰ１、或いは配列番
号３又は５で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗
体（ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭＰ１−５抗体）が含まれ得る。ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭ
Ｐ１−５抗体は、例えば検出結果の比較に用いてもよい。特に好適な本発明のキットの態
様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有
する抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異
性を有する抗体を組み合わせて含み得る。
【００３５】
本発明のキットは、更に所望のアッセイを実施するのに必要な残りの試薬及び材料と、
さらにアッセイの指示書の適当なセットとを含んでよい。ＥＬＩＳＡ法のためのキットで
は、必要な残りの試薬として、希釈用緩衝液、標識酵素に特異的な基質などが含まれてい
てもよい。
【００３６】
（ＤＭＰ１又はその断片の測定結果の利用）
１．骨・関節関連疾患の診断（予備的判断を含む）への利用
本発明により、試料中、特に検査対象者から採取した生物学的試料中に存在する、骨細
胞が産生したＤＭＰ１が検出及び／又は定量されて、その検出・定量結果が、例えば骨細
胞が関与する骨質（骨の石灰化の程度、微小骨折の程度等）の評価、骨・関節関連疾患の
診断、或いは骨・関節関連疾患の治療に対する早期からの反応性確認に利用することがで
きる。
【００３７】
本発明により診断される骨・関節関連疾患の非限定的な例には、骨の吸収・形成のバラ
ンスが崩れた疾患である骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、腫瘍誘導性骨軟化症及
びその他の代謝性骨・関節疾患が含まれる。
【００３８】
２．骨・関節関連疾患が疑われる患者への骨形成促進剤投与の効果予測
ＤＭＰ１は骨細胞から産生される物質であり、骨細胞にはＰＴＨ受容体が存在すること
から、ＰＴＨ投与によりＤＭＰ１の産生量が変化する可能性がある。したがって、骨・関
節関連疾患、例えば骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者に対して骨
形成促進剤を投与する際に、本発明の測定方法を用いて当該患者由来の試料中のＤＭＰ１
又はその断片を検出乃至定量し、又はそれらに対応して変化する指標（例えば骨密度や骨
代謝マーカー等）の変化量を検出して、骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチの治療
効果指標と対比することで、骨形成促進剤の治療効果の判断能を確認できる。
【００３９】
ここで、骨形成促進剤とは骨芽細胞に作用して骨形成機能を促進する物質の総称であり
、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）並びにカルシウムセンシング受容体拮抗剤、例えばＡＣＳ
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０１１；２：２３８−２４２に記載のＪＴＴ−３０
５やＢｏｎｅ，２０１０；４６：５３４−５４２に記載のＳＢ−４２３５５７などの化合
物を例示できるが、当業者において、骨芽細胞に作用して骨形成機能を促進する作用を有
することが知られている物質であれば当該例示のものに何ら限定されない。
【００４０】
なお、本発明のＰＴＨは、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学的手法で製造されたＰＴＨ、化
学的に合成されたＰＴＨを包含し、好ましくは８４個のアミノ酸から成るヒトＰＴＨ（ヒ
トＰＴＨ（１−８４））を含む。また、本発明におけるＰＴＨの用語には生物学的に活性
なその誘導体も含まれる。すなわち、当該誘導体は生理学上活性なＰＴＨフラグメントや
それらの改変体であり得、例えば前記のＰＴＨの部分ペプチドや、ＰＴＨそのもの若しく
はその部分ペプチドの構成アミノ酸を一部他のアミノ酸に置換したもの、ＰＴＨそのもの
若しくはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を欠失したもの、およびＰＴＨそのもの
若しくはその部分ペプチドに１種以上のアミノ酸を付加したペプチドなどで、天然型ＰＴ
Ｈの持つ全ての生物活性または一部の生物活性を有するペプチドであり得る。当該ＰＴＨ
誘導体のより具体的な例としては、例えばヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３
１）、ヒトＰＴＨ（１−３６）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）、
ヒトＰＴＨ（１−１４）、ウシＰＴＨ（１−３４）などが挙げられる。
【００４１】
特に、ＰＴＨ（１−３４）は、副甲状腺ホルモンのＮ末端から３４アミノ酸までの３４
個のアミノ酸から成る副甲状腺ホルモンフラグメントに対応するものであるが、天然型Ｐ
ＴＨの生物活性は、このＰＴＨ（１−３４）によって再現されることが知られており（生
化学辞典、東京化学同人、１９８４）、臨床的にも副甲状腺機能の診断薬や骨粗鬆症に対
する治療薬として使用されている。従って、本発明におけるＰＴＨの好ましい例としては
、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３７）、ヒトＰ
ＴＨ（１−３８）、ヒトＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ２などが挙げられ、さらに好ましくは
ヒトＰＴＨ（１−８４）またはヒトＰＴＨ（１−３４）が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本
発明は限定されるものではない。
【００４３】
（特異抗体の取得）
１．ＤＭＰ１の作製
ヒトＤＭＰ１は、手術により摘出された骨組織の一部からＲＮＡを抽出して、逆転写酵
素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを用いた組換細胞技術に基づき生産及び精
製した。具体的には、ヒトＤＭＰ１ｃＤＮＡの停止コドンを除きＨｉｓ ｔａｇ配列を付
加したｃＤＮＡをｐＧＥＸ−６ｐ−１（ファルマシア社）に挿入した。常法にもとづき大
腸菌にてＧＳＴ及びＨｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＭＰ１タンパクを発現させた。ＧＳＴ及び
Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＭＰ１タンパクはグルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた製造元マニュアルに準じた
方法で精製した。
【００４４】
２．抗原の調製
配列番号１、２、３、４及び５のアミノ酸配列からなるペプチドを、公知のヒトＤＭＰ
−１配列に基づきアメリカンペプチド社へ合成依頼した（但し、以下で説明するサイログ
ロブリンとの結合体を作製する際には、配列番号１、３及び４のＮ末端、並びに配列番号
２のＣ末端にシステイン残基を付加した。）。
得られたペプチドとウシサイログロブリンとの結合体を常法に従いＥＭＣＳ法によって
以下のように作製した。各ペプチドを、それぞれ１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、リン
酸緩衝液で溶解したウシサイログロブリン５ｍｇ／ｍｌとジメチルホルムアミドで溶解し
たＥＭＣＳとをそれぞれ上記モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣ
Ｓ複合体溶液を作製した。この複合体溶液を上記ペプチド溶液に上記モル相当量加えるこ
とにより、ＥＭＣＳで架橋された各ペプチドとウシサイログロブリンとの結合体を作製し
た。得られた結合体を抗原として以下の実験に用いた。
【００４５】
３．抗体の作製
調製した抗原で、ＪＷ系ウサギ各３羽を免疫した。免疫は約２週間おきにペプチド１０
０μｇ相当量の抗原を投与することにより行った。抗原は初回免疫のみフロイント完全ア
ジュバントと混合し、２回目からはフロイント不完全アジュバントと混合した。８回免疫
後、全採血を行い、血清を分離した。得られたウサギ抗血清を、前記の合成ペプチドを特
異抗原として固定化させたチオールセファロースゲルと４℃で１晩混合し、反応させた。
ゲルをカラムに充填した後、ＰＢＳで未反応の成分を洗浄し除去した。２８０ｎｍにてタ
ンパク質の溶出位置をモニターしながら、０．２Ｍクエン酸緩衝液にて抗体をカラムから
溶出した。溶離した抗体溶液に対して、トリス緩衝液を添加して中和した。得られた各抗
体ＤＭＰ１−１、ＤＭＰ１−２、ＤＭＰ１−３、ＤＭＰ１−４及びＤＭＰ１−５を精製抗
体とした。
【００４６】
４．抗体の特異性の確認
得られた各精製抗体の抗原特異性を以下の方法によって確認した。ＤＭＰ１を９６穴プ
レートに濃度１μｇ／ｍＬ（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）で４℃、一晩放置し、ブロッキング液
（ＢＳＡ）を加えたプレートとＤＭＰ１を加えずにブロッキング液のみを加えたプレート
を調製した。各プレートを洗浄し、１０μｇ／ｍｌから２倍連続希釈した精製抗体を加え
０．５時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢで洗浄した。さらにＨＲＰ
標識抗ウサギ二次抗体を各ウェルに添加し反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有
ＰＢで洗浄した。この各ウェルに基質（ＯＰＤ）を加え発色させ、４９０ｎｍで吸光度を
測定し、ＤＭＰ１吸着ウェルと非吸着ウェルの吸光度を比較した。その結果、いずれの抗
体もＤＭＰ１抗原に特異的に結合することが確認された。
【００４７】
５．サンドイッチＥＬＩＳＡ
取得された特異的抗体のうち、ＤＭＰ１−２、ＤＭＰ１−３、ＤＭＰ１−４及びＤＭＰ
１−５を０．１Ｍ炭酸緩衝液で２０μｇ／ｍｌに調製して９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート
に０．１ｍｌ分注し、４℃で一晩静置して固相化抗体を作製した。プレートをＰＢＳで２
回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを０．２ｍｌ加え４℃で１６時間静置して非特異吸
着のブロッキングを行った。再度洗浄液で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有ＰＢＳに溶解した３２０ｐＭのＤＭＰ１溶液を、１％ＢＳＡ，０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１６０ｐＭから２．５ｐＭに希釈し、０．１ｍｌを添加して
３７℃で１時間反応させた。洗浄液で７回洗浄した後、１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳに溶解した西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ＤＭＰ１−１
抗体を０．１ｍｌづつ分注し、４℃で３０分間反応させた。洗浄液で９回洗浄後、ＴＭＢ
基質液（発色液）を０．１ｍｌ加え、室温暗所にて３０分間酵素反応を行った。停止液（
１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図２参照）
。
【００４８】
いずれの組み合わせにおいても吸光度とＤＭＰ１濃度の間で直線性が認められたことか
ら、両者の相関性が確認された。一方、吸光度の値から、測定感度はＤＭＰ１−１及びＤ
ＭＰ１−２抗体の組合せが最も高く、以下ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−４抗体の組合せ、
ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せの順であり、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５
抗体の組合せは最も感度が低かった。
【００４９】
６．添加回収率
次に、血清、血漿（ＥＤＴＡ処理、Ｈｅｐａｒｉｎ処理）、尿に異なる濃度のＤＭＰ１
を添加した試料を用い、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡによってＤＭＰ１濃度を測定し、
理論値との対比から回収率を算出した（表１参照）。回収率はＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１
−２抗体の組合せが最も高かった。ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５抗体の組合せは最も回
収率が悪く、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せ、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−
４抗体の組合せはその中間に位置していた。
【００５０】
以上の結果から、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−５の組み合わせは他の組み合わせに比較
して血清、血漿及び尿成分の影響をより強く受け、定量性が劣ることが示唆される。
【表１】
【００５１】
次に、健常人から得られた血清、血漿（ＥＤＴＡ処理又はＨｅｐａｒｉｎ処理）、尿を
試料とし、ＤＭＰ１の組合せ別の吸光度を測定した（表２参照）。吸光度の高さから、Ｄ
ＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せが最も感度が高く、以下ＤＭＰ１−１及びＤＭ
Ｐ１−４抗体の組合せ、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−３抗体の組合せの順であり、ＤＭＰ
１−１及びＤＭＰ１−５抗体の組合せは吸光度の反応性が最も低かった。また、ＤＭＰ１
−１及びＤＭＰ１−５の組合せでは全ての採取試料において希釈倍率に応じた吸光度の変
化の直線性も認められなかった。
【表２】
【００５２】
上記の結果から、ＤＭＰ１−１抗体とＤＭＰ１−２抗体、ＤＭＰ１−３抗体又はＤＭＰ
１−４抗体との組合せによりＤＭＰ１が測定され、ＤＭＰ１−１とＤＭＰ１−２抗体の組
合せにおいて特に高感度で測定し得ることが確認された。またＤＭＰ１−１抗体とＤＭＰ
１−２抗体の組合せでは、血清、血漿及び尿成分の影響を受けず、この点においても当該
抗体の組合せが、検体中のＤＭＰ１の測定に最も適した組合せと考えられた。
【００５３】
７．参考例 −抗ラットＤＭＰ１抗体による測定−
特許文献１に記載された抗ラットＤＭＰ１抗体（Ｍ１７６抗体）の同等品を作製し、ヒ
トＤＭＰ１の測定を実施した。
方法として、抗ラットＤＭＰ１並びに抗ヒトＤＭＰ１の１−２及び１−４抗体（ウサギ
ＩｇＧ １μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ）をプレートに固定し（固相プレート）、標準
品としてラット又はヒトＤＭＰ１の０．１５６〜１０ｎｇ／ｍＬを添加し、標識抗体とし
て、Ｂｉｏｔｉｎ化抗ラットＤＭＰ１−１抗体（Ｔａｋａｒａ市販Ｃｏｄｅ．Ｍ７１６同
等品、ウサギ ＩｇＧ）を用い、発色の有無を確認した。なお、実験条件は下記の通りと
した。
１）標準品を固相抗体プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加（３７℃ ３０ｍｉｎ）
２）Ｂｉｏｔｉｎ化抗体を１μｇ／ｗｅｌｌに調整し１００μｌ／ｗｅｌｌ添加（３７
℃ ３０ｍｉｎ）
３）Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ １００μｌ／ｗｅｌｌ添加 （３７℃ ３０ｍｉｎ）
４）ＴＭＢ（発色基質）１００μｌ／ｗｅｌｌ添加 遮光（室温 ３０ｍｉｎ）
５）吸光度（Ａ４５０）測定
その結果、以下の表３の通り、固相プレートに抗ラットＤＭＰ１抗体を用い、標識抗体
に抗ラットＤＭＰ１−１抗体用いると、ラットのＤＭＰ１標準品での発色は確認されたも
のの、ヒトのＤＭＰ１標準品での発色は確認されず、サンドイッチＥＬＩＳＡは成立しな
かった。また、固相プレートに抗ヒトＤＭＰ１抗体を用いても、標識抗体に抗ラットＤＭ
Ｐ１−１抗体用いると、ヒトのＤＭＰ１標準品での発色は確認されず、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡは成立しなかった。そして、前記「４．抗体の特異性の確認」の実験結果のとおり
、固相プレートが抗ヒトＤＭＰ１抗体で、標識抗体が抗ヒトＤＭＰ１−１抗体であった場
合には、ヒトＤＭＰ１標準品でのサンドイッチＥＬＩＳＡが成立することが確認されてい
るから、ラットＤＭＰ１抗体でヒトＤＭＰ１は検出できないことが確認された。
【表３】
【００５４】
８．健常人の加齢変化確認
本発明のＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法
で、健常成人男性の血清試料中のＤＭＰ１濃度を測定し、年齢別にプロットした結果を図
３に示した。健常男性におけるＤＭＰ１濃度は、２０歳から４０歳に向けて低下し、その
後、低下状態が持続していた。この加齢変化はＤ．ＶａｓｈｉｓｈｔｈらのＢｏｎｅ，Ｖ
ｏｌ．２６，Ｎｏ．４，２０００：３７５−３８０、及びＳ．ＱｉｕらのＢｏｎｅ，Ｖｏ
ｌ．３１，Ｎｏ．２，２００２：３１３−３１８に示された、侵襲的に採取された骨で確
認された、骨細胞数及び骨細胞が存在する骨小腔密度の加齢変化と近似しており、ＤＭＰ
１測定によりこれらを近似的に測定しうることが確認された。
【００５５】
次に、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で
測定した、健常成人女性におけるＤＭＰ１濃度の年齢別のプロットを図４に示した。ＤＭ
Ｐ１濃度は２０歳から４０歳までは、健常成人男性と同様に低下したものの、４５歳以降
では経時的に上昇した。これは女性特有の現象である、閉経後の急速な骨吸収の増加を反
映しているものと考えられた。この加齢変化は、Ｍ．ＩｋｉらのＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓ
Ｉｎｔ．，１５，２００４：９８１−９９１における、骨の破壊（骨吸収）に伴って放出
されるマーカーの加齢変動の成績と一致しているものの、その変化率はＤＭＰ１がより大
きかった。その理由として、骨に蓄積されたＤＭＰ１が骨の吸収に伴って放出されるとと
もに、骨細胞そのものの数や質が変化することでＤＭＰ１の血中濃度がより高く上昇して
いると考えている。
【００５６】
上記で、健常成人女性で確認された、加齢に伴うＤＭＰ１の上昇状態が骨吸収の亢進に
よる骨基質タンパクの分解産物（骨の破壊（骨吸収）に伴って放出されるマーカー）の変
動に比較して大きく変動する要因として骨細胞の存在部位が影響している可能性がある。
すなわち、骨細胞の多くは海綿骨ではなく皮質骨に存在する。また全身の骨の９０％以上
は皮質骨であり、海綿骨の量的比率は小さい。閉経後に骨代謝回転が亢進した際に、海綿
骨も皮質骨も骨吸収亢進により骨基質タンパクの分解産物は血中、尿中に増加する。骨基
質タンパクの存在に海綿骨も皮質骨の差はないが、骨細胞は皮質骨に極めて密度高く存在
する。全身骨の量としては皮質骨が比率として多いことより、皮質骨の吸収に伴う多数の
骨細胞の破壊に伴う上昇を強く反映していることが影響していることが示唆される。
【００５７】
よってＤＭＰ１の測定の臨床的有用性は、従来のマーカーよりも鋭敏に骨吸収の変化を
とらえ、さらに、これまで知られていなかった加齢に伴う骨特性を反映する診断マーカー
となることが期待できる。さらに、骨を介して、暦年齢ではない、個々の肉体年齢を評価
することが可能となり、国民の健康寿命を保つ予防医学に利用できる。
【００５８】
９．骨・関節関連疾患罹患状態の確認
ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で、関節
リウマチ患者の血清中ＤＭＰ１濃度を測定し、健常男性及び健常女性の血清試料中のＤＭ
Ｐ１濃度との対比を行った結果を図５及び図６に示した。関節リウマチ患者の血清中ＤＭ
Ｐ１濃度は、健常人に比し、男性、女性とも有意に低値であった（Ｐ＜０．００１）。
【００５９】
１０．骨・関節関連疾患罹患の診断
関節リウマチ患者をケース、健常者を非ケースとして、ＤＭＰ１−１及びＤＭＰ１−２
抗体の組合せによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で得られたＤＭＰ１濃度を用い、感度・特
異度分析を行った（表４参照）。各男性、女性ともＤＭＰ１によるＡＵＣはいずれも０．
９を超えており、かつそれぞれのカットオフ値において感度・特異度とも０．８を超える
ことから、ＤＭＰ１による関節リウマチの診断能は極めて高いことが確認された。
【表４】
【００６０】
以上より、本発明の測定方法にて患者の試料を測定することにより、患者が関節リウマ
チか否かが判断できた。同様に実施すれば、骨粗鬆症や変形性関節症であるか否かの判断
ができると当業者は容易に理解できる。
【００６１】
１１．骨・関節関連疾患罹患治療剤の効果の予測
ＤＭＰ１は骨細胞から産生される物質であり、骨細胞にはＰＴＨ受容体が存在すること
から、ＰＴＨ投与によりＤＭＰ１の産生量が変化する可能性がある。骨粗鬆症、変形性関
節症または関節リウマチが疑われる患者に対し、ＰＴＨ及び／又はカルシウムセンシング
受容体拮抗剤等の骨形成促進剤を投与した場合に、配列番号１のアミノ酸配列を認識する
抗体と、配列番号２のアミノ酸配列を認識する抗体とを用いて、該試料中のＤＭＰ１及び
／またはその断片、またはそれらに対応して変化する指標の変化量検出し、骨粗鬆症、変
形性関節症または関節リウマチの治療効果指標と対比することで、骨形成促進剤の治療効
果の判断能を確認できる。
以上の実験を行うことにより、骨粗鬆症、変形性関節症または関節リウマチのそれぞれ
の患者において、骨形成促進剤を投与した場合のそれぞれの疾患に対する治療効果の程度
が予測されることが確認されると考えられる。
なお、本発明の測定方法や判断においては、ＤＭＰ１の濃度を直接に算出する方法を上
記に例示したが、ＤＭＰ１及び／又はその断片に対応する何らかの他の指標（例えば、吸
光度など）により判断しても同様に実施できることは言うまでもないことである。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のＤＭＰ１又はその断片の測定方法及びキットを用いることで、非侵襲的なヒト
の骨質の正確な評価が可能となることなどから、本発明は、医療機器産業分野等において
利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法であって、配列番号１で表されるアミノ酸配
列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体と、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体との組み合わせを用いて
該試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記測定方法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体を固相化した固相と、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して
免疫学的特異性を有する抗体を標識した標識化抗体とを用いることを特徴とする、請求項
１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が西洋ワサビパーオキシダーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体の少なくとも一方がポリクローナル抗体である請求項１乃至４のいずれかに記
載の方法。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である請求項１乃至４のいずれかに記
載の方法。
【請求項７】
前記試料が、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、請求項１乃至６のい
ずれかに記載の方法。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれかに記載された測定方法に用いるための、列番号１で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体及び／又は配列番号
２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を含む
、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
【請求項１０】
患者由来の試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者が骨粗鬆症、
変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断するために用いる、請求項８又は９に
記載の測定キット。
【請求項１１】
前記診断が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断された患者
におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定しておき、それ
らの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、請求項１０に記載
の測定キット。
【請求項１２】
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者由来の試料中のＤＭＰ１又は
その断片を測定することにより、該患者に骨形成促進剤を投与した際の前記疾患に対する
治療効果を予測するために用いる、請求項８又は９に記載の測定キット。
【請求項１３】
前記予測が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断された患者
におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定しておき、それ
らの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、請求項１２に記載
の測定キット。
【請求項１４】
前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である請求項１２又
は１３に記載の測定キット。
【請求項１５】
更に、配列番号３、配列番号４又は配列番号５で表されるアミノ酸配列から成るペプチ
ドに対して免疫学的特異性を有する抗体、或いはそのうちの二つ以上を含む、請求項８乃
至１４のいずれかに記載の測定キット。
【請求項１】
試料中のＤＭＰ１又はその断片の測定方法であって、配列番号１で表されるアミノ酸配
列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体と、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体との組み合わせを用いて
該試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記測定方法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体を固相化した固相と、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して
免疫学的特異性を有する抗体を標識した標識化抗体とを用いることを特徴とする、請求項
１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が西洋ワサビパーオキシダーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体の少なくとも一方がポリクローナル抗体である請求項１乃至４のいずれかに記
載の方法。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である請求項１乃至４のいずれかに記
載の方法。
【請求項７】
前記試料が、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、請求項１乃至６のい
ずれかに記載の方法。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する
抗体及び配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を
有する抗体を含む、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれかに記載された測定方法に用いるための、列番号１で表される
アミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体及び／又は配列番号
２で表されるアミノ酸配列から成るペプチドに対して免疫学的特異性を有する抗体を含む
、ＤＭＰ１又はその断片の測定キット。
【請求項１０】
患者由来の試料中のＤＭＰ１又はその断片を測定することにより、該患者が骨粗鬆症、
変形性関節症又は関節リウマチであるか否かを診断するために用いる、請求項８又は９に
記載の測定キット。
【請求項１１】
前記診断が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断された患者
におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定しておき、それ
らの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、請求項１０に記載
の測定キット。
【請求項１２】
骨粗鬆症、変形性関節症又は関節リウマチが疑われる患者由来の試料中のＤＭＰ１又は
その断片を測定することにより、該患者に骨形成促進剤を投与した際の前記疾患に対する
治療効果を予測するために用いる、請求項８又は９に記載の測定キット。
【請求項１３】
前記予測が、健常人並びに骨粗鬆症、変形性関節症及び関節リウマチと診断された患者
におけるそれぞれの平均的なＤＭＰ１又はその断片の検出程度を予め測定しておき、それ
らの検出程度と対象とする患者の当該検出程度を比較することを含む、請求項１２に記載
の測定キット。
【請求項１４】
前記骨形成促進剤がＰＴＨ又はカルシウムセンシング受容体拮抗剤である請求項１２又
は１３に記載の測定キット。
【請求項１５】
更に、配列番号３、配列番号４又は配列番号５で表されるアミノ酸配列から成るペプチ
ドに対して免疫学的特異性を有する抗体、或いはそのうちの二つ以上を含む、請求項８乃
至１４のいずれかに記載の測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−３０６６（Ｐ２０１３−３０６６Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３６８８５（Ｐ２０１１−１３６８８５）
【出願日】平成２３年６月２１日（２０１１．６．２１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２１日（２０１１．６．２１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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