ＤＮＡクローニングベクタープラスミドのダイナミックなベクター構築のための方法
【課題】クローニングベクタープラスミドを使用することによって、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てる方法を提供する。
【解決手段】プロモーター、発現、及び３’調節ヌクレオチド配列の各々一つなど、「インサート」又は「モジュール」双方としても知られる複数のＤＮＡ断片を、各インサートを逐次的に導入するのではなく、単一工程でクローニングベクタープラスミドに組み込む方法。作られるトランスジーンは、単一の組織に用いることができ、細菌、酵母、マウス、及び他の真核生物などのさまざまな組織に対してもほとんど修飾を要さずに、或いはまったく修飾を要さずに用いることができる、前記方法。
【解決手段】プロモーター、発現、及び３’調節ヌクレオチド配列の各々一つなど、「インサート」又は「モジュール」双方としても知られる複数のＤＮＡ断片を、各インサートを逐次的に導入するのではなく、単一工程でクローニングベクタープラスミドに組み込む方法。作られるトランスジーンは、単一の組織に用いることができ、細菌、酵母、マウス、及び他の真核生物などのさまざまな組織に対してもほとんど修飾を要さずに、或いはまったく修飾を要さずに用いることができる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してクローニングベクタープラスミドの分野に関し、詳細には、クローニングベクタープラスミドを用いて、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の基礎を成すのは組換えＤＮＡ技術であり、ここでその技術は、核酸及びそれらのタンパク質産物の構造及び機能を研究するために用いられる核酸の修飾及び増幅として要約できる。
【０００３】
個々の遺伝子、遺伝子調節領域、遺伝子のサブセット、及びそれらが含まれるまさに全体の染色体はすべて、従来それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣの頭文字によって表されるアデニン、チミン、グアニン及びシトシンといった、ヌクレオチドの二本鎖の逆平行配列を含んでいる。これらのＤＮＡ配列や、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）分子に由来する二本鎖ＤＮＡコピーであるｃＤＮＡ配列は、その遺伝子産物を研究するために別個の断片に切断し、単離して、細菌プラスミドなどのベクターへ挿入することができる。プラスミドは、元は細菌に由来する染色体外ＤＮＡであり、遺伝子産物の研究又は生産を目的として操作し、宿主細菌に再導入することができるものである。プラスミドのＤＮＡは、遺伝子及び遺伝子調節領域をコードする、同じＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣヌクレオチドを含んでなるという点であらゆる染色体ＤＮＡと類似しているが、およそ３０，０００塩基対、すなわち３０キロベース（ｋｂ）未満のＤＮＡからなる比較的小さな分子である。さらに、二本鎖プラスミドのヌクレオチド塩基対は、連続的な環状分子を形成しており、染色体ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを区別することもできる。
【０００４】
プラスミドは、細菌生物間の遺伝物質の迅速な交換を増強して、温度、摂食物供給、又はその他の負荷などの、環境の変化に対する迅速な適応を可能とする。得られるプラスミドの何れも、宿主の生存に寄与する１又はそれ以上の遺伝子を発現しなければならず、さもなければ不要なプラスミドの維持は資源の浪費になるはずであるから、その生物によって破壊又は破棄されるであろう。細胞のクローン集団は、それが潜有するプラスミドも含めて、同一の遺伝物質を含むものである。ＤＮＡインサートを有するクローニングベクタープラスミドをこのような宿主細胞のクローン集団において使用すると、利用可能な目的とするＤＮＡの量は増幅する。こうしてクローニングされたＤＮＡは次いで、ＤＮＡコンストラクトを作り上げるために必要な工程におけるその後の操作のために単離し回収する。このように、ベクタープラスミドのクローニングは、大量の目的とするＤＮＡインサートを迅速に生産する能力をもたらし、遺伝子機能の研究で有用なツールであると認めることができる。
【０００５】
プラスミド中に認められるエレメントのいくつかは自然発生のものであるが、その他はＤＮＡベクターとしてのプラスミドの有用性を増強するために設計されている。これらには、特に抗生物質抵抗性又は化学物質抵抗性遺伝子及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）が含まれる。これらエレメントの各々が本発明でも従来の技術におけると同様に役割を果たす。各エレメントが果たす役割の記載により、従来の技術の限度が明らかになり本発明の有用性が示される。
【０００６】
宿主によって獲得されうる、プラスミドにより生じる特に有用な遺伝子は、抗生物質抵抗性を与えるようなものである。組換えＤＮＡ技術の日常的な実施において、抗生物質抵抗性遺伝子は、その他のプラスミドに増して所望のプラスミドの培養及び増幅を選択的に高める、ポジティブセレクション又はネガティブセレクションのエレメントとして活用される。
【０００７】
宿主細菌によって維持されるため、宿主にプラスミドを複製させるよう指向する配列の断片も、プラスミドに含まれなければならない。複製起点（ＯＲＩ）エレメントとして知られる配列は、宿主にその細胞の酵素を使用してプラスミドのコピーを作製するよう指向する。このような細菌が分裂した場合、その娘細胞は各々、かかるプラスミドの何れでも１以上のコピーを保有するはずである。大腸菌細菌の特定の株が、この複写を最大にするように誘導されており、１細菌当たり３００コピー以上を生産する。このようにして、所望のプラスミドの培養を向上させることができる。
【０００８】
何れのクローニングベクターにおいても、他の必須エレメントとして挙げられるのは、目的とする遺伝物質の挿入用の場所である。これは「野生型」プラスミドに内に設計され、かくしてクローニングベクターとしての有用性を与えている合成エレメントである。典型的な市販のクローニングベクタープラスミドは何れも、少なくとも１つこのような領域を含んでおり、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）として知られている。ＭＣＳは典型的には単一のエンドヌクレアーゼ酵素、又は一連のエンドヌクレアーゼ酵素（各々、別異の認識配列及び切断パターンを有する）によって切断されるヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ分子においてコードされる、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位のいわゆる認識配列は、二本鎖パリンドローム配列を含む。あるＲＥ酵素に対しては、認識部位を提供するのにわずか４〜６ヌクレオチドで十分であるが、ＲＥ酵素によっては８以上のヌクレオチドの配列が必要とされる。例えばＲＥ酵素ＥｃｏＲ１は、二本鎖ヘキサヌクレオチド配列：５’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ３’（配列中、５’は従来「上流」端部として知られている分子の端部を示し、３’は同様に、「下流」端部を示す）を認識する。認識配列の相補鎖は、その逆平行鎖、３’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−５’となるはずである。どのエンドヌクレアーゼ部位もヌクレオチドの二本鎖配列であるから、６ヌクレオチドの認識部位は実際に６塩基対（ｂｐ）である。従って、二本鎖認識部位はさらに大きな二本鎖分子内に現れることがありえ、その分子内で次に示すように現れる：
５’……Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ……５’
【０００９】
その他の多くのＲＥ酵素と同様、ＥｃｏＲ１は二分対称性の軸で正確に切断するのではないが、「／」によって示されるヌクレオチド間の、２つのＤＮＡ鎖で４ヌクレオチド離れた位置で切断され：
５’……Ｇ／Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ／Ｇ……５’
その結果二本鎖ＤＮＡ分子が切断されて、結果として生じるヌクレオチドの配置を新しく形成される「端部」で有することとなる：
５’……Ｇ３’ ５’Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ５’ ３’Ｇ……５’。
【００１０】
この位置のずれた切断によって、突出した５’末端を有するＤＮＡの断片が生じる。Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ対は互いに近接していると自然に形成されるので、これらのような突出した端部は、付着又は粘着末端と称される。これらの末端の何れも、同じ制限酵素で切断された他の相補性末端の何れものとも水素結合を形成することができる。特異的認識配列を含むＤＮＡの何れも、同じ配列を含んでいる何れか他のＤＮＡと同様に切断されるので、それらの切断された端部は相補的になるであろう。従って、同じＲＥ酵素で切断された何れのＤＮＡ分子の端部も、ジグソーパズルの隣接するピースが「嵌合」するように互いに「嵌合」して、酵素的につなぎ合わせることができる。組換えＤＮＡ分子の形成を可能とし、細菌プラスミド内、又は他の何れかのＤＮＡ分子内への外来ＤＮＡ断片の導入を許容するのは、この性質である。
【００１１】
組換えＤＮＡ分子を作り上げる際に考慮すべき、さらなる一般的な原則は、目的とする部位だけでなく、分子内に現れるあらゆるエンドヌクレアーゼ部位が特定のＲＥ酵素で切断されるであろうことである。ＤＮＡ分子が大きいほど、何れかのエンドヌクレアーゼ部位も再度現れる可能性が高い。何れのエンドヌクレアーゼ部位もＤＮＡ分子に沿ってランダムに分布すると仮定すると、テトラヌクレオチド部位は平均して、４４（すなわち、２５６）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れることになるはずであり、一方ヘキサヌクレオチド部位は４６（すなわち、４０９６）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れ、オクタヌクレオチド部位は４８（すなわち、１１４，６８８）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れることになるはずである。このように、短い認識配列ほど高頻度に現れ、長いものほど希にしか現れないであろうことが容易に理解できる。トランスジーン又はその他の組換えＤＮＡ分子の構築を計画する場合、このような計画では様々なサイズのＤＮＡのいくつもの断片の組立てが必要となることが多いので、これは極めて重要な問題である。これらの断片が大きいほど使用したいと思う部位がＤＮＡ成分のいくつもの断片に現れる可能性が高くなり、良くても操作が困難になってしまう。
【００１２】
高頻度に現れるエンドヌクレアーゼ酵素部位は、本願において共通部位と称し、これらの部位を切断するエンドヌクレアーゼは共通エンドヌクレアーゼ酵素と称する。６ｂｐよりも大きな同族制限部位を有する制限酵素は希少制限酵素と称し、それらの同族制限部位は希少制限部位と称する。しかしながら、統計的に予測されるよりも出現頻度の低い６ｂｐのエンドヌクレアーゼ部位もいくつかあり、これらの部位とそれらを切断するエンドヌクレアーゼも希少と称する。よって、「希少」及び「共通」の標記は、何れか特定の制限酵素の相対的な存在度又は可用性を言及するのでなく、正しくはＤＮＡ分子若しくはＤＮＡ分子の単離された断片の何れか、又は遺伝子若しくはそのＤＮＡ配列の何れかの中のその同族認識部位を構成するヌクレオチドの配列の出現頻度に言及するものである。
【００１３】
エンドヌクレアーゼ酵素の第二のクラスが最近単離されており、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）酵素と称されている。ＨＥ酵素は、大きな非パリンドローム非対称認識部位（１２〜４０塩基対）を有する。ＨＥ認識部位は極めて希少である。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩとして知られているＨＥは１８ｂｐの認識部位（５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ．．．３’）を有し、ランダム配列の７×１０１０ｂｐごとに１つずつしか現れないと予測される。この出現頻度は、２０の哺乳動物の大きさのゲノムで１箇所のみに相当する。ＨＥ認識部位の希少性により、ＨＥ認識部位がクローニングベクタープラスミド内の適切な位置に入れられた場合に、トランスジーンの完全性を崩壊させることなしに遺伝子工学者が最終のトランスジーン産物を切断できる可能性が大幅に高められる。
【００１４】
何れの原料生物由来のＤＮＡ分子でもエンドヌクレアーゼ酵素によって同じように切断されるはずなので、如何なる種に由来するＤＮＡの外来断片もエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、同じエンドヌクレアーゼ酵素で切断された細菌プラスミドベクターへ挿入して、好適な宿主細胞において増幅することができる。例えば、ＥｃｏＲ１として知られるＲＥ酵素でヒト遺伝子を２箇所で切断できれば、ＥｃｏＲ１端部を備えた所望の断片を単離し、ライゲーション混合物として一般に知られているものの中で、やはりＥｃｏＲ１で切断されたプラスミドと混合することができる。ライゲーション混合物中、適切な条件下で、単離されたヒト遺伝子断片のいくつかはプラスミド分子の端部と嵌合するはずである。これらの新しく合わされた端部は結合（ライゲーション）することができ、こうしてその新しいＤＮＡインサートを含むプラスミドが酵素的に再度環化される。ライゲーション混合物は次いで大腸菌又はその他の好適な宿主に導入されて、新しく設計されたプラスミドは細菌が分裂するにつれて増幅されることになる。このようにして、ヒト遺伝子の比較的多数のコピーを得て、細菌から収集しうる。これらの遺伝子コピーは次いで、その遺伝子産物タンパク質の研究、解析、又は生産を目的としてさらに操作することができる。
【００１５】
組換えＤＮＡ技術は、いわゆる「トランスジーン」の生成において頻繁に実施される。トランスジーンは、１以上のドナー生物に由来し、宿主生物に導入された種々の遺伝物質を含むことが多い。典型的にはトランスジーンは、計画の出発点又は「骨格」であるクローニングベクターを使用して構築され、一連の複合クローニング工程は、ベクター内に最終産物を組み立てるように計画される。ヌクレオチド配列から成るトランスジーンのエレメントとしては、１）調節プロモーター及び／又はエンハンサーエレメント、２）ｍＲＮＡ分子として発現されることになる遺伝子、３）ｍＲＮＡ情報の安定化をもたらすＤＮＡエレメント、４）哺乳動物イントロン遺伝子領域を模倣したヌクレオチド配列、及び５）天然ｍＲＮＡの端部に付加されるポリＡ尾部などのｍＲＮＡプロセッシング用のシグナルが挙げられるが、これらに限定されることはない。場合によって、実験計画で特定の細胞内部位への遺伝子産物の輸送をもたらすために局在化シグナルの付加が必要とされることがある。
【００１６】
トランスジーンのエレメントの各々は、ドナーゲノムから切り出されるさらに大きなＤＮＡ分子の断片として得ることができ、また場合によっては研究室で合成することができる。本発明では、本明細書の請求項にかかる方法にエンドヌクレアーゼを使用するが、例えば、本発明の方法において使用されるインサート又はモジュールを含む小エレメントの各々が、ｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及び／又はＰＣＲターミネーター突出クローニングによって作り出すことができることは知られている。トランスジーンの構成エレメントの合成のこのような方法の一つとして、Ｊａｒｒｅｌｌらにより米国特許第６，３５８，７１２号（引用することによりその全体を本明細書において援用する）に開示された方法が挙げられる。Ｊａｒｒｅｌｌはトランスジーンのエレメントを一体的に「結合」するための方法を開示しているが、エレメントを一旦組み立ておき、「脱離」して再度組み立てる手段を開示しているのは本発明の方法のみである。本発明の特徴の一つによれば、各々の断片は他の断片と正確な順序且つ５’−３’方向にクローニングベクタープラスミドへ組み立てられる。
【００１７】
目的とするプロモーターの刺激に必要な条件を満たしているとすれば、何れの遺伝子のプロモーターであってもＤＮＡ断片として単離し、プラスミドなどの合成分子内に配置して、所望の遺伝子の発現を指向することができる。例えば、インスリン遺伝子のプロモーター配列を単離し、レポーター遺伝子と共にクローニングベクタープラスミドに配置して、適切な細胞種の中でインスリン遺伝子の発現に必要な条件を調べるために使用することができる。あるいは、クローニングベクタープラスミド内で目的とする遺伝子のタンパク質をコードする配列にインスリン遺伝子プロモーターを合わせて使用してもよく、こうして構築したＤＮＡトランスジーン内に必要なエレメントがすべて存在するとすれば、インスリンを発現している細胞内でその目的とする遺伝子の発現が駆動される。
【００１８】
レポーター遺伝子は、ある種のトランスジーンの、特に有用な成分である。レポーター遺伝子は、トランスジーン内でそれに連結する、目的とする特定のプロモーターの主導のもとに発現されることになるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列から成り、プロモーター活性を測定可能な生化学的応答をもたらす。レポーター遺伝子は、典型的には、内在の細胞性タンパク質のバックグラウンドに対して検出又は測定が容易なものである。一般に使用されるレポーター遺伝子にはＬａｃＺ、ＧＦＰ、及びルシフェラーゼ、並びにその他のレポーター遺伝子が含まれるがこれらに限定されず、多くが当業者に良く知られている。
【００１９】
イントロンは、哺乳類遺伝子内の非コーディング領域であり、細菌ゲノム内に見出されることはないが、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ分子の適正な形成に必要とされる。従って、哺乳類系で使用されるＤＮＡコンストラクトは何れも、少なくとも１つのイントロンを有していなければならない。イントロンは、何れかの哺乳類遺伝子から単離し、哺乳類細胞にイントロンを切除させて残余のｍＲＮＡ端をつなぎ合わせる適切なスプライシングシグナルと共にＤＮＡコンストラクト内に挿入するとよい。
【００２０】
ｍＲＮＡ安定化エレメントは、いくつかのｍＲＮＡを分解から保護する結合タンパク質によって認識されるＤＮＡの配列である。ｍＲＮＡ安定化エレメントを含めることにより、いくつかの哺乳類細胞種においてそのｍＲＮＡからの遺伝子発現のレベルが増強されることが多く、そのためいくつかのＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンにおいて有用となりうる。ｍＲＮＡ安定化エレメントは、ＤＮＡコンストラクト内に包含させるために、天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡから単離するか、又は合成により生産することができる。
【００２１】
局在化シグナルは、目的とするタンパク質の細胞内での移動のためのタンパク質シグナルをコードするＤＮＡの配列である。例えば、核局在化シグナルはタンパク質を核に向かわせ、細胞膜局在化シグナルはタンパク質を細胞質膜に向かわせる、等である。よって、そのタンパク質産物の望ましい細胞内位置への転位を促進するために、局在化シグナルをＤＮＡコンストラクトに組み込むとよい。
【００２２】
タグ配列は、タンパク質産物にユニークな領域が付着するようにＤＮＡコンストラクトでコード化することができる。このユニークな領域は、その内在性の対応物から識別できるタンパク質タグとして働くものである。あるいは、当該技術分野において良く知られている多種多様な技術によって検出されうる識別子として働くことができ、かかる技術にはＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学法、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法が含まれるがこれらに限定されることはない。
【００２３】
複合トランスジーン、すなわち特に大きなＤＮＡの領域を含むものでは、ＤＮＡのこれらの断片に複数のエンドヌクレアーゼ認識部位が存在する可能性が高まる。何れのヘキサヌクレオチド部位をコードする認識配列も４０９６ｂｐ（４６）ごとに現れることを想起されたい。プロモーター配列が３０００ｂｐであり、且つ１５００ｂｐの目的の遺伝子を３０００ｂｐのクローニングベクター内に組み立てる予定であれば、使用可能な部位が断片のうちのわずか２つでしか現れないはずなので、６以下のヌクレオチドの多くの部位が有用にならない可能性が統計的に非常に高い。さらに、その部位は組み立てられる予定の適切な分子の適切な範囲内に現れなければならない。また、ほとんどのクローニングプロジェクトは、さらなるＤＮＡエレメントを付加する必要があるはずであり、これによって、成長する分子の複雑さや、何れの特定の制限部位も不都合に反復する可能性が増加してしまう。何れの制限酵素も分子内のその部位のすべてで切断するはずなので、もしもエンドヌクレアーゼ酵素制限部位が再度現れると、すべての不適当な部位はすべて、望ましい部位と共に切断されるはずであり、分子の完全性は破壊される。このように、先行エレメントを組み込むのに既に使用されているエンドヌクレアーゼ酵素で切断することによって成長する分子を破壊することのないよう、各クローニング工程は注意深く設計されなければならない。最後に、完成したトランスジーンを哺乳類生物に導入することを研究者が望む場合、完全に組み立てられたトランスジーンコンストラクトはトランスジーンの少なくとも一端にユニークな認識部位にて線状化されねばならないことが殆どであるから、コンストラクト内の他のどこにも見られないさらに別のユニークな認識部位が必要とされる。ほとんどのＤＮＡコンストラクトは単一の目的で設計されるので、今後なされる必要があるかもしれない何らかの修飾は殆ど考慮されておらず、今後の実験の変更の困難さがさらに増加することになってしまっている。
【００２４】
従来、トランスジーンの設計及び構築は以下の理由を含めたいくつかの理由によりかなりの時間と労力を費やすものである。
【００２５】
１．末端のアレイを生成する入手可能なエンドヌクレアーゼ酵素には種々多様なものがあるが、これらの殆どは相互に適合しない。ＥｃｏＲ１など多くのエンドヌクレアーゼ酵素は、突出５’付着端又は「尾部」を備えたＤＮＡ断片を生成し、その他（例えば、Ｐｓｔ１）は３’突出尾部を備えた断片を生成するが、さらに別のもの（例えば、Ｂａｌ１）は対称軸で切断して平滑断端断片を生産する。これらのうちのいくつかは他のエンドヌクレアーゼ酵素での切断により形成される末端と適合しうるであろうが、有用なものの大部分は適合しないであろう。各ＤＮＡ断片の単離で生成することのできる末端は、ＤＮＡコンストラクトを設計する上で注意深く考慮されなければならない。
【００２６】
２．ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンの組み立てに必要なＤＮＡ断片は、先ずそれらの供給用ゲノムから単離し、プラスミドクローニングベクターに入れて、有用な量を得るために増幅しなければならない。工程は、市販又は個々に改変されたクローニングベクターを幾つ使用しても実施することができる。異なる市販のクローニングベクタープラスミドの各々は、大部分が独立して開発されたものであり、このため目的とする遺伝子又は遺伝子エレメントのＤＮＡ断片を切断する異なる配列及びエンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。従って、遺伝子は、任意の一連の実験に対し、必要に応じてこれらベクターの各々に適合するように個々に調整されなければならない。同じＤＮＡ断片は、その後の実験や、又は新しいＤＮＡコンストラクト若しくはトランスジーンを作成するためのその他の組合せへのクローニングのためにさらに改変される必要のあることが多いはずである。各々のＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンは、次にどのように使用されることになるのかについて思想や知見なしに、特定の用途に対して特注で作られるので、その後の用途のために「後から改造」されなければならないことが多い。
【００２７】
３．さらに、何れの遺伝子又は遺伝子エレメントのＤＮＡ配列も様々なものであって、内部エンドヌクレアーゼ部位を含む可能性があるので、現在入手可能なベクターと適合不可能になる。これにより操作が複雑になってしまう。これは特に、いくつかのＤＮＡ断片から、単一のＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを組み立てる場合にあてはまる。
【００２８】
このように、ＤＮＡ断片の端部及び内部で認められるエンドヌクレアーゼ部位の余剰にもかかわらず、使用者が１分子の中に多くのＤＮＡ断片を迅速に組み立てることのできるようになるシステムが希求されている。そのようなシステムによって、断片の端部を、それらに他のエンドヌクレアーゼ配列が付加されるように迅速に改変するための簡単な手段も提供されうる。ＨＥ部位の単一又は対向のペアを含めることで、クローニングのためのユニークな部位を有する可能性が増大するはずである。断片の１以上を容易に置換又は除去することを可能とするようなシステムは、現在のところ使用者が利用できない水準の汎用性を付加することとなろう。従って、「モジュラー」システム、すなわち、クローニングベクター内の希少エンドヌクレアーゼ部位に隣接する「カセット」領域内に又は当該領域外に、ＤＮＡ断片若しくは「インサート」を挿入又は除去することを可能とするシステムは、組換えＤＮＡ技術の分野にとって殊に有用で歓迎されるものとなるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
従って、本発明は、クローニングベクタープラスミドを使用することによって、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てる方法を提供する。本発明はまた、プロモーター、発現、及び３’調節ヌクレオチド配列の各々一つなど、「インサート」又は「モジュール」双方としても知られる複数のＤＮＡ断片を、各インサートを逐次的に導入しなければならないのではなく、単一工程でクローニングベクタープラスミドに組み込む方法も提供する。このような方法を、本明細書では「ダイナミックなベクター構築」と称する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】一次ドッキングステーションへ挿入可能なＰＥ３ドッキングステーションへ挿入可能なＰシャトルベクターを示す、本発明のモジュール概念の線形マップを示す図である。
【図２】プロモーター、発現及び３’調節モジュールなどのシャトルベクター内の制限部位と、一次クローニングベクタープラスミド上のドッキングポイントとの間の関連性によって可能となる、骨格ベクターの組立てを示す図である。
【図３】組み立てられた図２の骨格ベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一つの実施態様において、本発明は、インサートの連鎖配列を受容することができる骨格をクローニングベクタープラスミドに備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意して、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格へ移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法を提供する。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき第一ヌクレオチド配列を第一シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき第二ヌクレオチド配列を第二シャトルベクターへ導入して、第一ヌクレオチド配列及び第二ヌクレオチド配列をシャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列を、プロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法も提供する。
【００３４】
他の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つの発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つの調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含み、１つのプロモーターモジュール、１つの発現モジュール、及び１つの調節モジュールのうち、少なくとも２つの組合せが、２つの別々の一次クローニングベクター分子へ移行されるものである、トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法を提供する。
【００３５】
さらに別の実施態様において、本発明は、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを作製するための方法であって、骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つエンドヌクレアーゼ酵素に対する少なくとも１つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを、第一のドッキングポイントの少なくとも１つの非可変性希少制限部位に対応する第一エンドヌクレアーゼ酵素で切断して、３’端を備える切断された第一のドッキングポイントを生成し；第二のドッキングポイントを、第二のドッキングポイントの少なくとも１つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位に対応する第二ヌクレアーゼ酵素で切断して、５’端を備える切断された第二のドッキングポイントを生成し；少なくとも第一及び第二インサートを用意し、各インサートは５’端、目的とするヌクレオチド配列及び３’端を含んでおり、第一インサートの５’端は切断された第一のドッキングポイントの３’端と適合可能であり、第二インサートの３’端は切断された第二のドッキングポイントの５’端と適合可能であって、第一インサートの３’端は第二インサートの５’端と適合可能で第三エンドヌクレアーゼ酵素に対する第三非可変希少エンドヌクレアーゼ部位を形成して；インサート及び切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間で第一及び第二インサートの同時ライゲーション及び自己配向を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成して、モジュラークローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む方法を提供する。
【００３６】
他の実施態様において、本発明は、骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも１つの希少制限部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの希少制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断して、３’端を備える切断された骨格を生成し；第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断して、５’端を備える切断された骨格を生成し、目的とするプロモーター配列、第一のドッキングポイントの３’端に適合可能な５’端、及び３’端が挿入されているプロモーターインサートを用意し；目的とする発現配列、プロモーターインサートの３’端に適合して第三非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び３’末端を含む発現インサートを用意し；目的とする調節配列、発現インサートの３’に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’端、及び工程「ｃ」で切断された、切断された第二のドッキングポイントの５’端に適合可能な３’端を含む調節インサートを用意して；プロモーター、発現及び調節インサート、並びに切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成し、モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するための方法を提供する。
【００３７】
さらに別の実施態様において、本発明は、５’端、目的とするヌクレオチド配列及び３’端を有するインサートを挿入することができる骨格を含む少なくとも１つの一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格はプロモーター、発現、及び調節インサートの連鎖配列を受容して作動可能となり、且つ、少なくとも第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも１つの制限部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断し；第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断し；プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つのプロモーターインサートを用意し、その少なくとも１つのプロモーターインサートの５’端は工程「ｂ」で切断された第一のドッキングポイントの３’端に適合可能であり；発現ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つの発現インサートを用意し、その少なくとも１つの発現インサートの５’端は少なくとも１つのプロモーターインサートの３’端に適合して、第三非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し；調節ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つの調節インサートを用意し、その少なくとも１つの調節インサートの５’端は前記少なくとも１つの発現インサートの３’端に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成するものであり、前記少なくとも１つの調節インサートの３’端は工程「ｃ」で切断された第二のドッキングポイントの５’端に適合可能であり；その後、プロモーター、発現及び調節インサートうちの１つの少なくとも２つの異なる種と、残るインサートの各々の少なくとも１つと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを適切な反応混合物へ入れて、骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの各々一つの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こして、それらの骨格内でプロモーター、発現及び調節インサートの異なる組合せを有するプラスミドのアレイを創出する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトのアレイを同時に合成するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、以下の図面及び説明に鑑みてさらに完全に認められるであろう。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「クロマチン修飾ドメイン」（ＣＭＤ）の用語は、クロマチン構造の維持及び／又は改変と関係している種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「クローニング」の用語は、ＤＮＡ分子をプラスミドへライゲーションして、それを宿主の増殖の際の増幅のために適切な宿主細胞に移行させるプロセスを指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「クローニングベクター」及び「クローニングベクタープラスミド」の用語は、複製の起点、抗生物質抵抗性遺伝子などのプラスミドを内包する宿主細胞のポジティブセレクションをするための手段；及びマルチクローニングサイトを最低限含んでいる環状ＤＮＡ分子を指し、互換的に使用される。
【００４２】
本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して「共通の」の用語は、ゲノム内に比較的高頻度に現れる何れのエンドヌクレアーゼ部位も指すものである。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「適合可能な」の表現は、同じ制限酵素で切断されたか又は他の何らかの方法によって創出された、他の何れかの相補性末端と水素結合を形成することができるＤＮＡの鎖の、５’又は３’の何れかの末端又は端部をいう。制限酵素に対する特異的認識部位を含むＤＮＡは何れも、同じ配列を含む他の何れのＤＮＡと同様に切断されるので、それら切断された端部は相補的になり、よって適合可能となるであろう。従って、同じ制限酵素で切断された何れのＤＮＡ分子の端部も、ジグソーパズルの隣接するピースが「嵌合」するように、互いに「嵌合」し、酵素的につなぎ合わせることができる。適合可能な端部は、組み合わされた場合に特定の制限酵素に対する認識部位を形成することになる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ｄｅ ｎｏｖｏ合成」の用語は、所望のＤＮＡ分子全体の部分配列を表す相補性一本鎖ＤＮＡ分子の適合可能な突出を連結させることによって、如何なる長さのものでも二本鎖ＤＮＡ分子を合成するプロセスを指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡコンストラクト」の用語は、クローニングベクタープラスミド内での継続的なクローニング工程によって合成され、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞、又はｉｎ ｖｉｖｏのトランスジェニックマウスなどの何らかの適切な宿主における遺伝子発現に向けて一般に使用されるＤＮＡ分子を指す。このようなマウスを作製するのに使用されるトランスジーンは、特にトランスジーンが設計及び合成される期間にあっては、ＤＮＡコンストラクトと称することもできる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ断片」の用語は、タンパク質をコードする配列、レポーター遺伝子、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、ポリＡ尾部、マルチクローニングサイト、核局在化シグナル、若しくはｍＲＮＡ安定化シグナル、又は他の何らかの天然若しくは合成のＤＮＡ分子、又はその何れか一部分を含むＤＮＡの単離された分子をも指すものであるが、これらに限定されることはない。あるいは、ＤＮＡ断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産された完全に合成起源のものであってもよい。さらに、ＤＮＡ断片は、単離された天然及び／又は合成断片の何れの組合せをも含みうる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ドッキングプラスミド」の用語は、ＤＮＡ断片をＤＮＡコンストラクトへ組み立てるために本発明において使用される、特化されたクローニングベクタープラスミドを指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「エンドヌクレアーゼ」又は「エンドヌクレアーゼ酵素」の用語は、ＤＮＡ分子においてコードされた認識部位に結合してそのＤＮＡ分子をその配列内またはその配列近傍の正確な位置で切断する触媒分子の分類の１種または複数種のメンバーを指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「エンドヌクレアーゼ認識部位」、「認識部位」、「同族配列」又は「同族配列（複数）」の用語は、ＤＮＡ分子又は遺伝子に結合して切断する制限酵素に必要なヌクレオチドの最低限の配列を指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「エンハンサー領域」の用語は、標的遺伝子の発現には必要ないが、適切な条件下に遺伝子発現のレベルを増加させるようなヌクレオチド配列を指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子発現宿主選択遺伝子」（ＧＥＨ−Ｓ）の用語は、光学センサ、ＰＣＲ増幅、生化学的分析により、若しくは細胞／生物生存分析（適切な抗生物質又は化学物質で処理した場合の、細胞又は生物に対する抵抗性又は毒性）により選択、追跡、又は検出されうる形質を、宿主生物に与えることのできる遺伝子エレメントを指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「遺伝子プロモーター」又は「プロモーター」の用語は、遺伝子の発現に必要なヌクレオチド配列、又は全長プロモーターの何れか一部分を指す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「インサート」及び「モジュール」の用語は、原則的にほぼ同義であり、これらの区別をするとすれば、「インサート」はベクターへ挿入され、それがひとたび挿入されれば、それからはより一般的に「モジュール」と称されることのみである。モジュールはその後、ベクターから除去することができる。また、インサートの用語は、モジュラーアクセプタベクターへのインサートとして使用される、単離されたモジュールに対して一般的に使用される。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「イントロン」の用語は、２つのタンパク質コーディング領域すなわちエクソンの間に認められる、哺乳類細胞遺伝子内の非タンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「局在化シグナル」（ＬＯＣ）の用語は、目的とするタンパク質の細胞内局在に対するシグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「マルチクローニングサイト」（ＭＣＳ）の用語は、クローニングベクタープラスミドへのＤＮＡ断片のクローニングを目的とした、少なくとも１つのユニークなエンドヌクレアーゼ部位、及び、さらに典型的には、ユニークなエンドヌクレアーゼ部位の集団を含むヌクレオチド配列を指す。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ｍＲＮＡ安定化エレメント」の用語は、いくつかのｍＲＮＡを分解から保護すると考えられる結合タンパク質によって認識されるＤＮＡの配列のことである。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「複製の起点」（ＯＲＩ）の用語は、宿主細胞内でのプラスミドの複製又は複写を指向するヌクレオチド配列を指す。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ＰＣＲターミネーター突出クローニング技術」の表現は、相補性ＤＮＡ突出とのジャンクション部位として働くことのできる、保護された５’突出ヌクレオチドを備えた一本鎖ＤＮＡプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して、遺伝子モジュールを増幅するプロセスを指す。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ポリＡ尾部」の用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の端部で一般的に見出されるアデニン（Ａ）ヌクレオチドの配列を指す。ポリＡ尾部シグナルは、目的とする遺伝子の発現を促進するために、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンの３’端に組み込まれる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「プライマーサイト」の用語は、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ増幅、及び／又はＲＮＡ転写を開始することを目的として、その上に一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがアニーリングすることのできるＤＮＡ鋳型として働くヌクレオチド配列を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ｐＵＣ１９」の用語は、当業者に良く知られており、受入番号＃Ｌ０９１３７としてＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見られるプラスミドクローニングベクターを指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ランダムヌクレオチド配列」の用語は、同じ分子の成分として特定される他のエレメントをコードする配列を複写しないヌクレオチド配列の組合せを示している。ランダム配列で必要とされるヌクレオチドの数は、ランダム配列に隣接するエンドヌクレアーゼ酵素の要求性に依存する。殆どのエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合を安定化するため、最低でも２〜４のさらなるランダム配列を必要とする。ランダム配列の数は、コドンを作り上げているヌクレオチドの数に対応して、３の倍数となることが好ましい。ランダム配列の好ましい最小数は従って６であるが、もっと少ないか又はもっと多くのヌクレオチドを使用してもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して「希少」の用語は、ゲノム内で比較的低頻度でしか現れないエンドヌクレアーゼ部位を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「組換えアーム」の用語は、トランスジェニックＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の相同組換えを促進するヌクレオチド配列を指す。組換えの成功には、相同組換によって宿主ゲノムに組み込まれる予定のトランスジェニックＤＮＡの領域に隣接する、左組換えアーム（ＬＲＡ）と右組換えアーム（ＲＲＡ）の存在が必要である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「組換え」の用語は、リコンビナーゼ酵素による作用を受けることができるＤＮＡ配列と併せてランダム又は部位選択的リコンビナーゼ酵素を使用し、ある１つのＤＮＡ分子から別異のＤＮＡ分子に遺伝物質の一部を転位させるプロセスを指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」の用語は、目的とする特定のプロモーターの活性をモニターするのに有用なタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を指す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「シャトルベクター」の用語は、ＤＮＡ断片の端部を修飾することになる中間分子を作製するために本発明で使用される、特化したクローニングベクタープラスミドを指す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「タグ配列」（ＴＡＧ）の用語は、それが検出されること、又は場合によっては、何らかの内在性の対応物から識別されることを可能とするユニークなタンパク質領域をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「非翻訳領域」（ＵＴＲ）の用語は、ｍＲＮＡ分子の非タンパク質コーディング領域を包囲するヌクレオチド配列を指す。これらの非翻訳領域は、ｍＲＮＡ分子の５’端（５’ＵＴＲ）又は３’端（３’ＵＴＲ）に存在しうる。
【００７１】
本発明は、モジュールを含む新しく製造されたトランスジーンを取り上げ、選択的にモジュールの１以上を除去してそれを異なるインサートと置換する方法を提供する。このプロセスを本明細書では「第二パス」及び「重複スレッディング」と称する。本発明はさらに、単一工程で複数の異なるプロモーター、発現及び調節インサートをクローニングベクタープラスミドへ組み込むことによって、各々が異なるプロモーター、発現及び調節インサートを有している、異なるトランスジーンのアレイを創出するための方法を提供する。本発明はまた、組み合わせられたプロモーター、発現及び調節インサートが新しく導入されたクローニングベクタープラスミドを用意し、骨格ベクターとして組合せ全体を取り出して、単一のクローニングベクタープラスミドへ複数の骨格ベクターを挿入する工程を含む方法も提供する。
【００７２】
本発明はまた、その中にドッキングポイントを有する骨格を備えさせることによって、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを創出する方法も提供する。各ドッキングポイントは、好ましくは少なくとも１つの固定された非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位、より好ましくは２つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団、及び最も好ましくは３つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団がある領域を表す。各ドッキングポイントの特定の制限部位は、その同族エンドヌクレアーゼ酵素によって切断される。これによって、プロモーター、発現又は調節ヌクレオチド配列などの、選択されたヌクレオチド配列を含む、予め構築されたインサートの１つの相補性５’端又は３’端と適合可能な、所望の５’又は３’端のいずれかが創出されることになる。それぞれ、切断された目的とするドッキングポイントと適合可能な５’端及び３’端を有する少なくとも２つのインサートを、切断されたクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物に添加することができ、適切な熱力学的環境とすれば、インサートを同時に、すなわち単一工程にてクローニングベクタープラスミドへ組み込ませることができる。この一回の添加及びライゲーション反応の間にドッキングポイントが再形成されそのドッキングポイントにおいてクローニングベクタープラスミドはモジュラーとなり、２つのモジュール間の結合は適切な制限酵素で再度切断することができる。次いでそのモジュールは、後から除去することができ、新しいモジュールをその場所に入れることができる。
【００７３】
本発明の一つの実施態様は、クローニングベクタープラスミドにインサートの連鎖配列を受容することができる骨格を備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意し、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格に移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法に関する。より好ましくは、インサートは３つのインサート、具体的には少なくとも１つのプロモーター、発現、及び調節モジュールからなる。
【００７４】
本発明の別の実施態様は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法である。
【００７５】
ドッキングポイントの各々の５’及び３’端の双方、並びにインサートの各々はすべて、別のドッキングポイント又はインサートの対応する端部に適合可能であることが好ましい。例えば、もしも第一のドッキングポイントがＳｇｒＡＩなどの非可変性希少制限酵素に対する制限部位を含んでおり、且つそのドッキングポイントがその後切断されるのであれば、切断された第一のドッキングポイントの３’端で挿入されることが意図された第一インサートは適合可能な５’端を含むことになり、インサートが第一のドッキングポイントと組み合わせられるとＳｇｒＡＩに対する制限部位が創出されることになろう。プラスミド内の第二のドッキングポイントは、例えば、ＳｗａＩなどの非可変性制限酵素に対する制限部位を有しうる。何れの第二インサートもその３’端にて適合可能なヌクレオチド配列を有し、切断された第二のドッキングポイントの切断された５’端と組み合わせられてＳｗａｌに対する制限部位を創出するであろう。さらに、第一インサートの３’端及び第二インサートの５’端は、モジュラークローニングベクタープラスミドへ同時に挿入して、さらにその後同じドッキングポイントで除去もするために、ＰａｃＩ又はＳａｌＩなどの第三非可変希少制限酵素に対する第三制限部位を創出する適合可能な端部を含まなければならない。
【００７６】
本発明のモジュラー構造をコードする連鎖エレメントには、具体的には、３つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、５’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、順方向のユニークなＨＥ部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、プロモーター／イントロンモジュールに対して３’側となる部位と発現モジュールに対して５’側となる部位との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、発現モジュールに対して３’側となる部位と３’調節モジュールに対して５’側となる部位とのジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、３’調節モジュールに対して３’側となる部位を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、５’オリゴヌクレオチドプライマーサイトの３’位に配置されたものと同じＨＥ部位である逆方向のユニークなＨＥ部位、逆方向の３’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び３’挿入部位を規定する４つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれる。
【００７７】
本発明のモジュラー構造をコードする他の連鎖エレメントには、具体的には、５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位、一対のユニークなＨＥ部位の下流においてシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通の制限部位、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、順方向のユニークなＨＥ部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、一対の互いに反対方向のユニークなＢｓｔＸＩ部位（ＢｓｔＸＩ認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配置された２つの同じＨＥ認識部位の順序付けによって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドにより規定される）、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位；逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、逆方向のユニークなＨＥ部位（当該ＨＥ部位は、順方向のＨＥ部位と同じである）、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、非可変性で且つユニークな共通の制限部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び３つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれうる。
【００７８】
本発明は、必要とされることの多い操作の量を低減するために至適化されたクローニングベクターを使用することによって、ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンへ種々のＤＮＡ断片を組み立てるための方法の一群である。
【００７９】
一次ベクター（本明細書中、ドッキングプラスミドと称する）は、好ましくは３組の線状パターンに配列された希少エンドヌクレアーゼ部位を備えたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。この配列は、使用者が、先行するクローニング工程でドッキングプラスミドへ既に組み込まれたＤＮＡエレメントの完全性を破壊することなしに、複数のインサートを単一のトランスジーンコンストラクトへ組み立てることを可能とする、モジュラー構造を規定する。
【００８０】
少なくとも３つのＨＥに対する２つの認識部位が、自己アニーリングすることのできない遺伝子カセットアクセプタ部位を創出する目的で、３つのモジュラー領域に隣接するように反対方向に配置される。ＨＥ部位は非対称且つ非パリンドロームであるため、２つのＨＥ認識部位を反対方向に配置することによって非相補性突出３’付着末端を生成させることが可能である。こうして、ＨＥＩ−Ｓｃｅｌが「／」によって示されるその同族認識部位を切断する：
５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡ／ＣＡＧＧＧＴＡＡＴ．．．３’
３’．．．ＡＴＣＣＣ／ＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＡ．．．５’。
【００８１】
ＭＣＳ内に第二部位を逆に配置することで、２つの非相補性付着突出末端が生じるはずである：
５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡ ＣＣＣＴＡ．．．３’
３’．．．ＡＴＣＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＴ．．．５’
【００８２】
これは、より大きなトランスジーンをベクターへサブクローニングすることが必要な場合に特に有用である。インサートのサイズに起因して、大きなインサートを受容するよりむしろ自己アニーリングすることが、ベクターにとって熱力学的により好都合である。この制限部位の配置により生じる非相補性尾部の存在で、自己ライゲーションに対する熱力学的傾向に対向する化学力がもたらされる。
【００８３】
殆どのＨＥ突出尾部の非対称性もまた、ＢｓｔＸＩエンドヌクレアーゼ酵素部位（５’ＣＣＡＮＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ３’、配列中「Ｎ」は何れのヌクレオチドでもありうる）と組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。ＢｓｔＸＩの配列−中立ドメインは、自己アニーリングを防止しつつ２つの逆方向性ＨＥ突出尾部に対する適合可能な付着末端を生成させるために使用することができる。
【００８４】
ＢｓｔＸＩ（Ｉ−ＳｃｅＩ 順方向） Ｉ−ＳｃｅＩ 順方向 Ｉ−ＳｃｅＩ 逆方向 ＢｓｔＸＩ（Ｉ−ＳｃｅＩ 逆方向）
５’−ＣＣＡＧＡＴＡＡ
３’−ＧＧＴＣ
ＣＡＧＧＧＴＡＡＴ／／ＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴ
ＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＡ／／ＴＡＡＴＧＧＧＡＣ
ＧＴＧＧ−３’
ＡＡＴＡＣＡＣＣ−５’
【００８５】
本発明で使用されるエンドヌクレアーゼ部位は、出現の序列に従って選択した。エンドヌクレアーゼ部位出現の頻度を調べるために、１９の異なる遺伝子に対応するＤＮＡ配列情報を、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して分析した。この研究は、ＤＮＡ配列の計１１０，５３０ヌクレオチドを網羅するものであった。これらの分析の結果を、分析した１１０，５３０ヌクレオチド内に出現しているエンドヌクレアーゼ部位の事例数に従って計算した。エンドヌクレアーゼ部位は次いで、４種の分類に従って序列の上での表示を割り振り、「共通の」部位は１１０，５３０ヌクレオチド当たり２５回より多く出現し、「低頻度６ｂｐ部位」は１１０，５３０ヌクレオチド当たり６〜２４回の間で出現し、「希少」部位は１１０，５３０ヌクレオチド当たり０〜５回の間で出現する。「好適な」酵素の部分的なリストを、それらの出現の分類に従ってここに列挙する。
【００８６】
共通のエンドヌクレアーゼ酵素：
ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ
【００８７】
６ｂｐの認識部位を有するが、出現頻度が低いエンドヌクレアーゼ酵素：
ＡａｒＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｅＡＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ
【００８８】
希少エンドヌクレアーゼ酵素：
ＡｃｌＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｓｉＷＩ、ＦｓｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｌｉＩ
【００８９】
これらのリストに含まれない、同じ機能性を有する並びに本発明の精神及び意図を維持している他のエンドヌクレアーゼを使用することもできる。本発明の二次ベクターは、本明細書においてシャトルベクターとして知られており、希少エンドヌクレアーゼ部位が隣接する共通のエンドヌクレアーゼ部位と共にマルチクローニングサイトを含んでいる。シャトルベクターは、希少部位間の共通エンドヌクレアーゼ部位へＤＮＡのクローニング断片をクローニングするために設計されている。クローニングされた断片は引き続き、１又は複数の希少エンドヌクレアーゼ部位での切断によって遊離され、シャトルベクターに見出される１又は複数の同じ希少エンドヌクレアーゼ部位を用いてドッキングプラスミドへ組み込むことができる。
【００９０】
このように、従来のクローニングベクターと異なり、ＭＣＳの設計によって「カセット」すなわち、ＤＮＡ断片のモジュールをドッキングプラスミドのモジュラー領域へ挿入することが可能になる。同様に、各々を同じ希少エンドヌクレアーゼ酵素を用いて容易に除去して、目的とする他の何れかのＤＮＡ断片と置換することができる。この特徴によって、使用者がＤＮＡコンストラクト全体を再び作り上げる必要なしに実験計画の方向を迅速且つ容易に変更することが可能になる。このように、本発明のクローニングベクタープラスミドは、使用者が共通のエンドヌクレアーゼ部位を用い、カセット−受容モジュールを創出してＤＮＡ断片を中間ベクターへクローニングして、その後希少エンドヌクレアーゼ部位によって最終コンストラクトの所望のモジュラー部位にその断片を移行させることを可能にする。さらに、それによってドッキングプラスミド内の個々のモジュールを他のカセットモジュールと置換するように分子を後から改変することが可能になる。以下の説明で、従来の技術と比較した本発明の特徴を明らかにする。
【００９１】
トランスジーンの個々の成分（プロモーターエンハンサーＰ、発現タンパク質Ｅ、及び／又は３’調節領域３）を、シャトルベクターからＰＥ３ドッキングステーションプラスミドへ移行されるモジュールとして組み立てることができる。より高次の複雑性が必要とされるのであれば、組み立てられたトランスジーン、又は他のヌクレオチド配列を、その後一次ドッキングプラスミドへ移行することができる。５つの種のクローニングベクタープラスミドの各々を各々へ組み込まれる成分の理解を図るためにさらに詳細に説明する。まず、より複雑なＰＥ３ドッキングステーションプラスミド及び一次ドッキングプラスミドから始める。
【００９２】
ＰＥ３ドッキングプラスミドは、以下のように修飾されたｐＵＣ１９骨格を含み、配列はｐＵＣ１９ Ｇｅｎｂａｎｋ配列ファイル、受入番号＃Ｌ０９１３７に従って番号付けをしている。
【００９３】
１．８０６から２６１７まで（Ａｆｌ３−Ａａｔ２）の配列のみをドッキングプラスミドに使用し、
【００９４】
２．ｐＵＣ１９の１７２９ｂｐのＢｓｐＨ１部位はＴＣＡＴＧＡからＧＣＡＴＧＡに変異させ、
【００９５】
３．ｐＵＣ１９の１４９３ｂｐのＡｃｌ１部位はＡＡＣＧＴＴからＡＡＣＧＣＴに変異させ、
【００９６】
４．ｐＵＣ１９の１１２０ｂｐのＡｃｌ１部位をＡＡＣＧＴＴからＣＡＣＧＣＴに変異させ、
【００９７】
５．ｐＵＣ１９のＡｈｄ１部位をＧＡＣＮＮＮＮＮＧＴＣからＣＡＣＮＮＮＮＮＧＴＣに変異させ、
【００９８】
６．ＢｓｐＨ１／Ｉ−Ｐｐｏ１／ＢｓｐＨ１をコードする配列を、上記リストの突然変異工程２の後に、ｐＵＣ１９の残りのＢｓｐＨ１部位のみに挿入する。
【００９９】
ＰＥ３ドッキングプラスミドのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、列記された順に以下の連鎖エレメントを含む。
【０１００】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する３つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（ＡａｔＩＩ、ＢＩｐＩ、及びＥｃｏＯ１０９Ｉと示すが、これらに限定されることはない）；
【０１０１】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１０２】
３．ユニークなＨＥ部位（例えば、Ｉ−Ｓｃｅｌ（順方向））；
【０１０３】
４．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭ Ｄ−１）として働くことができるランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩ）；
【０１０４】
５．プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）；
【０１０５】
６．プロモーター／イントロンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−Ｐ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１０６】
７．プロモーター／イントロンモジュールの３’部分と発現モジュールの５’部分との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭＩｕＩ）；
【０１０７】
８．発現アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−Ｅ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１０８】
９．発現モジュールの３’部分と３’調節モジュールの５’部分のジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｌＩ）；
【０１０９】
１０．３’調節ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−３）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１１０】
１１．３’調節モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｗａＩ、ＲｓｒＩＩ、及びＢｓｉＷＩ）；
【０１１１】
１２．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭＤ−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ）；
【０１１２】
１３．前記項目３のものと同じ、逆方向のユニークなＨＥ部位；
【０１１３】
１４．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１１４】
１５．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する４つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ、ＰｍｅＩ、ＳａｐＩ、及びＢｓｐＨＩ）。
【０１１５】
一次ドッキングプラスミドは、ＰＥ３ドッキングステーションプラスミドで最初に構築される２つの完成トランスジーン、若しくは遺伝子ターゲティングトランスジーンを構築するのに必要な２つの相同性アームを組み立てるのに、又は２つの種のポジティブ若しくはネガティブセレクションエレメントを導入するのに使用することができる。一次ドッキングプラスミド内のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、列記の順に以下の連鎖エレメントを含む。
【０１１６】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔＩｌ及びＢＩｐＩ）；
【０１１７】
２．Ｍ１３リバースプライマーサイト；
【０１１８】
３．ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＧＥＨ−Ｓ１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ；
【０１１９】
４．ＨＥの対の下流でシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１２０】
５．左組換えアームモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）；
【０１２１】
６．左組換えアームアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＬＲＡ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１２２】
７．左組換えアームアクセプタモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、ＭＩｕＩ、及びＡｓｃｌ）；
【０１２３】
８．ユニークなＨＥ部位（例えば、Ｉ−ＣｅｕＩ（順方向））；
【０１２４】
９．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭＤ−１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩ）；
【０１２５】
１０．Ｔ７プライマーサイト；
【０１２６】
１１．複合トランスジーンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＰＥ３−１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＢｓｔＸＩ部位（ＢｓｔＸＩ認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配列された２つの同じＨＥ認識部位の配列によって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドによって規定される；例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩ（順方向）及びＰＩ−ＳｃｅＩ（逆方向））；
【０１２７】
１２．複合トランスジーンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＰＥ３−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位；
【０１２８】
１３．逆方向のＴ３プライマーサイト；
【０１２９】
１４．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭ Ｄ−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ）；
【０１３０】
１５．上述した項目８のものと同一の、逆方向のユニークなＨＥ部位；
【０１３１】
１６．右組換えアームモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、及びＮｏｔＩ）；
【０１３２】
１７．右組換えアームアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＲＲＡ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１３３】
１８．右組換えアームアクセプタモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＲｓｒＩＩ、ＳｗａＩ、及びＢｓｉＷＩ）；
【０１３４】
１９．シャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１３５】
２０．ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＧＥＨ−Ｓ２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位；
【０１３６】
２１．逆方向に配置された、Ｍ１３フォワードプライマーサイト；及び、
【０１３７】
２２．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する３つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ、ＳａｐＩ、及びＢｓｐＨＩ）。
【０１３８】
本発明の３つのクローニングベクタープラスミドは、シャトルベクターとして知られている。シャトルベクターは、ＰＥ３及び一次ドッキングプラスミド同様、やはりｐＵＣ１９骨格から構築されている。まさしくＰＥ３及び一次ドッキングプラスミドと同じように、各シャトルベクターには前記１〜６のように列記したように、ｐＵＣ１９骨格に同じ修飾がなされている。個々のシャトルベクター（ＳＶ）は、シャトルベクタープロモーター／イントロン（Ｐ）、シャトルベクター発現（Ｅ）、及びシャトルベクター３’調節（３）（以下、それぞれＳＶＰ、ＳＶＥ、及びＳＶ３）として同定される。各々を、以下にさらに詳説する．
【０１３９】
シャトルベクターＰ（ＳＶＰ）：
【０１４０】
ＳＶＰは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のプロモーター及びイントロン配列を調製するのに使用することのできるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶＰプラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。
【０１４１】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔｌＩ及びＢｌｐＩ）；
【０１４２】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１４３】
３．Ｔ７プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする、非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１４４】
４．プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２のプロモーターベクターの５’端で星印により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１４５】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団を含む可変ＭＣＳ；
【０１４６】
６．プロモーターモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭＩｕＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２のプロモーターベクターの３’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１４７】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１４８】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び
【０１４９】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ及びＳａｐＩ）。
【０１５０】
シャトルベクターＥ（ＳＶＥ）：
【０１５１】
これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のトランスジーンによって発現されるべき配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶＥプラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。
【０１５２】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔｌＩ及びＢｌｐ＼Ｉ）；
【０１５３】
２．ＴＪプライマーサイト；
【０１５４】
３．Ｔ７プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、Ｅｃｏ０１０９＼Ｉ）；
【０１５５】
４．発現モジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭｌｕＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の発現ベクターの５’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１５６】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変ＭＣＳ；
【０１５７】
６．発現モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｉＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の発現ベクターの３’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１５８】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１５９】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１６０】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性且つユニークな共通の制限部位（例えば、Ｐｍｅｌ及びＳａｐｌ）。
【０１６１】
シャトルベクター３（ＳＶ３）：
【０１６２】
これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用の３’調節配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶ３プラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下のエレメントを含むことができる。
【０１６３】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔＩＩ及びＢｌｐＩ）；
【０１６４】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１６５】
３．Ｔ７プライマーの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１６６】
４．３’調節モジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｉＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の調節ベクターの５’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１６７】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変ＭＣＳ；
【０１６８】
６．３’調節モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｗａＩ、ＲｓｒＩＩ、及びＢｓｉＷＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の調節ベクターの３’端で四角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１６９】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１７０】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１７１】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ及びＳａｐＩ）。
【０１７２】
本発明は、プラスミドクローニングベクターにおいてトランスジーンを作り上げるための方法を開示するが、コスミドなどの大きな染色体外ＤＮＡ分子、又は細菌性人工染色体（ＢＡＣ）を含む人工染色体においてトランスジーンを作り上げるのに、類似の方法を使用することができる。植物で使用するには、Ｔ１ベクターも使用してよい。プラスミドクローニングベクターへ組み込むことのできる多種多様な遺伝子エレメントによっても、ほとんど又は全くさらに操作することなく、多種多様な宿主生物への最終トランスジーン産物の移行が可能となる。
【０１７３】
図２及び３は、本発明のモジュール方式の一般的な図である。図２に示すとおり、プロモーター、発現、及び３’調節シャトルベクターの各々一つが存在する。シャトルベクター内で隣接する各インサートは、ドッキングポイントを創出するのに特異的なエンドヌクレアーゼ制限部位である。さらに詳細には、図２で、プロモーターインサート（Ｐ）は５’端で星印により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第一群と、３’端で円形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群に隣接しており；発現モジュールは５’端で円形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群と、３’端で三角形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群に隣接しており；３’調節モジュール（３）は５’端で三角形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群と、３’端で四角形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第四群に隣接している。その部位に特異的なエンドヌクレアーゼによって各エンドヌクレアーゼ認識部位を切断すると、一点鎖線矢印の末端のインサートにより図２の底部に示されるように、各モジュールの５’及び３’端で粘着末端が創出される。そうすればモジュールは、エンドヌクレアーゼ制限部位（星印で示す）の第一群及びエンドヌクレアーゼ制限部位（四角形で示す）の第四群に対して特異的なエンドヌクレアーゼによって、やはりその２つの固定されたドッキングポイントで切断されているクローニングベクタープラスミドと貼合せることができる。モジュラーベクターをクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物中に入れると、各モジュラーベクターの切断された粘着末端（白抜きの星印、円形、三角形、及び四角形で示す）はプラスミド内で自己配向して、切断された星印末端の貼合せ、切断された円形末端の貼合せ、切断された三角形末端の貼合せ、及び切断された四角形末端の貼合せと、順次連結することになる。この結果、図３に示す、組み立てられた骨格ベクターが得られる。さらに、星印、円形、三角形、及び四角形で示されるエンドヌクレアーゼ部位の組み合わされた群の各々は、特定のインサートを後から除去して目的とするインサートと置換できるように、その対応する特異的エンドヌクレアーゼにより再度切断することができる。
【０１７４】
複数の骨格ベクター（例えば、ＰＥ３−１及びＰＥ３−２）は、単一のドッキングプラスミドへ挿入することができる。Ｉ−ＳｃｅＩなどのエンドヌクレアーゼの突出尾部の非対称性は、他のＨＥでの場合と同様に、ＢｓｔＸＩエンドヌクレアーゼ酵素部位（５’ＣＣＡＮＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ３’、配列中「Ｎ」は何れのヌクレオチドでもありうる）と組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。ＢｓｔＸＩの配列中立ドメインを使用して、自己アニーリングを防止しつつも、２つの逆方向性Ｉ−ＳｃｅＩ突出尾部に対して適合可能な付着末端を生成させることができる。この方法で、第一インサート、ＰＥ３−１（その末端でｌ−Ｓｃｅ−１部位を有している）は、Ｂｓｔｘｉ／Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼ部位でそのプラスミドを切断することによってクローニングベクタープラスミドに配置することができる。次いで、Ｉ−Ｓｃｅｌで再度切断して、その端部にｌ−Ｓｃｅ−１部位を有するＰＥ３−２を挿入することができる。この骨格全体は、次いでＰＩ−ＳｃｅＩによってそのドッキングプラスミドから切り出して、ＢｓｔＸｌ／ＰＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含む別のドッキングプラスミドへ挿入することができる。この第二のドッキングプラスミドもまた、ＰＩ−ＳｃｅＩに対するエンドヌクレアーゼ部位を有しており、その中に別のドッキングプラスミド用のさらに他のモジュールで、ＰＥ３−３及びＰＥ３−４を含む可能性のあるものを挿入することができる（図示せず）。このようにして、研究者はより多くの情報を一細胞に入れ込むことができ、すなわち、複数の遺伝子を単一ベクターのコンテクスト内に挿入することができるが、これは当業者によって従前に成し遂げられているものではない。このような新規のプロセスによって、当該分野での研究者の仕事のための金銭と時間の双方を節約することができる。
【実施例】
【０１７５】
実施例１：ＰＥ３ドッキングプラスミド
【０１７６】
本発明を実施する方法の例として、これらのエレメントを含むトランスジーンを構築することができる。
【０１７７】
１．界面活性タンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）に対するヒトプロモーターのヌクレオチド配列；
【０１７８】
２．マウス遺伝子顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子−レセプターβｃ（ＧＭＲβｃ）のタンパク質産物をコードする配列；
【０１７９】
３．ウサギβグロビンのイントロン配列；及び
【０１８０】
４．ＳＶ４０ポリ−Ａシグナル。
【０１８１】
ＳＰ−Ｃ配列は、内部ＢａｍＨ１部位を含んでおり、またＮｏｔ１とＥｃｏＲ１とだけでその親プラスミドから遊離させることができる。ＧＭＲβｃは、内部Ｎｏｔ１部位を有しており、その親プラスミドからＢａｍＨ１及びＸｈｏ１で切り出することができる。ウサギベータグロビンイントロン配列は、その親プラスミドからＥｃｏＲ１で切り出すことができる。ＳＶ−４０ポリＡ尾部は、Ｘｈｏ１及びＳａｃ１でその親プラスミドから切り出すことができる。エンドヌクレアーゼ部位のいくつかが多く存在するゆえに、親プラスミドのいずれも、必要な断片すべてを組み立てるのに使用することができない。
【０１８２】
ＰＥ３ドッキングプラスミド発明において所望のトランスジーンを作り上げるのに使用する工程は以下のとおりである。
【０１８３】
１．Ｎｏｔ１及びＰｓｐＯＭＩは適合可能な付着末端を生成させるので、ヒトＳＰ−Ｃプロモーター配列はＮｏｔ１及びＥｃｏＲ１で切り出して、シャトルベクターＰのＰｓｐＯＭＩ及びＥｃｏＲ１部位へクローニングする。この反応の産物は、ｐＳＶＰ−ＳＰＣと称される。
【０１８４】
２．当業者に良く知られた増殖及び回収工程の後に、ウサギβグロビンイントロン配列をｐＳＶＰ−ＳＰＣのＥｃｏＲ１部位へクローニングする。得られる中間コンストラクトでのイントロンの方向は産物を配列決定することによって確かめられ、ｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧと称される。
【０１８５】
３．ＡｓｉＳ１及びＡｓｃ１を用い、ｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧからプロモーター及びイントロンを切り出して、１つの連続断片として単離する。同時に、プロモーター／イントロンセグメントのライゲーション用の調整のため、ＡｓｉＳ１及びＡｓｄでＰＥ３ドッキングプラスミドを切り出す。プロモーター／イントロン断片をドッキングプラスミドへつなぎ、増やして回収する。
【０１８６】
４．当業者に良く知られた技術を用いてＧＭＲβｃ断片のＸｈｏ１部位を埋め、平滑３’端を創出する。それを次いでｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧのＢａｍＨ１部位と平滑断端Ｐｖｕ２部位へクローニングする。得られたプラスミド（ｐＤＰ−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧ）を増やして回収した。
【０１８７】
５．最終クローニング工程は、ＳＶ−４０ポリＡＡ尾部の付加である。レシピエントベクターｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒｂβＧと同様に、ＳＶ４０−ポリＡ断片を、Ｘｈｏ１及びＳａｃ１で切り出す。ＤＮＡの片の双方をゲルで精製して回収する。ライゲーション混合液を、ＳＶ−４０ポリＡのｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧに対するモル比１０：１にて調製する。ライゲーション産物を増やして回収する。新しいプラスミド、ｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲββｃ−ｒβＧ−ｐＡは、３’端のユニークなエンドヌクレアーゼ部位を含め、トランスジーンに必要とされる全てのエレメントを含み、これを用いてｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧ−ｐＡプラスミド全体を真核細胞へのトランスフェクション又は受精卵の前核へのマイクロインジェクション用に線状化することができる。
【０１８８】
実施例２：ダイナミックなベクター構築
【０１８９】
ダイナミックなベクター構築を、以下の実施例に示す。
【０１９０】
１．ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列を、５’及び３’部分にそれぞれＡｓｉＳＩ及びＡｓｅＩエンドヌクレアーゼを有するＰシャトルベクター（ＳＶＰ）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、プロモーターモジュールをＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９１】
２．ルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を、５’及び３’部分にそれぞれＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼを有する発現シャトルベクター（ＳＶＥ）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、発現モジュールをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９２】
３．哺乳類イントロン及びＳＶ４０ポリアデニル化サイトをコードする配列を、５’及び３’部分にそれぞれＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有する３’調節シャトルベクター（ＳＶ３）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、調節モジュールをＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９３】
４．プロモーターモジュールの５’部分及びレギュレーターモジュールの３’部分で、それぞれＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有するドッキングベクタープラスミドのエンドヌクレアーゼ認識部位を、ＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼで切り出し、単離する。
【０１９４】
５．プロモーター、発現、及び調節モジュールをライゲーション混合物においてドッキングベクタープラスミドと組み合わせる。２時間のインキュベーション後に、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドが３つのモジュラーインサート（プロモーター、発現及び調節）を含む否かを判定する。３つのモジュラーインサートを含むプラスミドは、トランスジーンｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ＳＶ４０ ｐＡとして同定される。これは、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを用いて線状化して、ＣＭＶ−ルシフェラーゼマウスを作製すべくマウス前核へ注射することができる。本実施例におけるＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ−ルシフェラーゼマウスなどの宿主生物のすべての組織でルシフェラーゼ遺伝子の発現を指向する。
【０１９５】
実施例３：ダイナミックなベクター構築の再設計
【０１９６】
もし研究者が今度は特定の組織又は細胞型のみでルシフェラーゼが発現されるように発現パターンを改良することを望めば、ＣＭＶプロモーターを、限定された発現パターンをもたらすものに迅速且つ容易に置き換えることができる。以下の実施例で、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ｐＡの迅速な再設計を円滑にするための本発明の使用を示す。
【０１９７】
１．ニューロン特異的プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を、Ｐシャトルベクター（ＳＶＰ）に挿入して、前記実施例のプロモーターモジュールとして調製する。
【０１９８】
２．ｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ｐＡを、ＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩで切断して、ＣＭＶプロモーターモジュールを除く。完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りを単離する。
【０１９９】
３．ＮＳＥプロモーターモジュールを、完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りと共にライゲーション混合物に入れる。２時間インキュベートした後、その新しいライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換する。大腸菌混合物を、前記実施例と同様にアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。コロニーを翌日に単離し、増やして、各々からプラスミドＤＮＡを単離する。エンドヌクレアーゼマッピングを使用して、所望のＮＳＥプロモーターモジュールを含むプラスミドを同定する。
【０２００】
実施例４：トランスジーンのアレイ
【０２０１】
以下の実施例は、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを各々含んでいるトランスジーンのアレイを迅速に組み立てるための、本発明の使用を例示するものである。一連の６つのシャトルベクターとＰＥ３ドッキングステーションベクターを使用し、コンビナトリアルアセンブリを用いて８つの異なるベクター産物を作製する。一連の６つのシャトルベクターは、２つのＰ−シャトル（ＳＶＰ）、２つのＥ−シャトル（ＳＶＥ）、及び２つの３−シャトル（ＳＶ３）からなる。２つの別異のＰ−シャトル（ＳＶＰ）は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はマウスＳＰＣ肺−特異的プロモーターの何れかを含み、各々は５’及び３’部分にそれぞれＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼを有している。２つの別異のＥ−シャトルは、ルシフェラーゼｃＤＮＡ又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡの何れかを含み、各々は５’及び３’部分にそれぞれＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼを有している。２つの別異の３−シャトルベクターは、ＳＶ４０ポリＡシグナル又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３’調節領域の何れかを含み、各々は、５’及び３’部分にそれぞれＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有している。
【０２０２】
プロモーターモジュールは、適切なシャトルベクターをＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのＳＶＰシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切なプロモーターモジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ＣＭＶプロモーターモジュール、又はＡｓｉＳＩ突出が５’側及び３’端にＡｓｃＩ突出が結合したＳＰＣプロモーターモジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０３】
発現モジュールは、適切なシャトルベクターをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのＳＶＥシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な発現モジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ルシフェラーゼ発現モジュール、又はＡｓｃＩ突出が５’側及び３’端にＮｏｔＩ突出が結合したＥＧＦＰ発現モジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０４】
３’調節モジュールは、適切なシャトルベクターをＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼで個々に消化することによって、それらのそれぞれのＳＶ３シャトルベクターから遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な３’調節モジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ＳＶ４０ ３’調節モジュール、又はＮｏｔＩ突出が５’側及び３’端にＢｓｉＷＩ突出が結合したｈＧＨ ３’調節モジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０５】
ＰＥ３ドッキングステーションベクターは、ＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって調製する。後からのベクターの再度のライゲーション防止に資するために、ベクター制限消化物を、３７℃で１時間、ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）に曝す。得られたＣＩＰ処理済みのベクター制限産物は、次いでゲル電気泳動に付し、線状化ＰＥ３ベクター骨格に対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。
【０２０６】
得られた、ゲルで精製した７つのＤＮＡ断片からの試料を、診断電気泳動ゲルに流すことにより、同一性、完全性、純度、及び量について分析する。精製したＰＥ３ドッキングステーションベクター及び個々のＤＮＡモジュールの相対存在度に関する定量データを使用して、コンビナトリアルライゲーション反応に必要な各成分の量を規定する。
【０２０７】
ライゲーション反応を構成する場合、好結果がもたらされることの多い戦略が２つある。第一の戦略は、インサート対ベクターの比が約３：１であるライゲーション反応混合物を構成することである。１以上のインサートが単一のベクターに同時に導入されている場合に用いる第二の戦略は、ベクターへ挿入される予定の各遺伝子モジュールを、モル当量導入することである。これは、ライゲーション反応混合物に照らしてモル当量とするために可変体積のモジュールを反応容器に加えるか、又は中性緩衝液溶液を精製されたモジュールの各々にそれらの濃度がモル比基準で等量となるように添加することのいずれかによって成し遂げることができる。本実施例では、ゲルで精製したベクター及びインサート断片はすべて、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０の緩衝液を用いてモル当量に調整している。ライゲーション反応の総体積は１５０マイクロリットルに設定する。ライゲーション反応混合物は、以下の構成成分からなる：３９マイクロリットルの超純水、１５マイクロリットルの１０×リガーゼ緩衝液、５マイクロリットルの精製したＰＥ３ベクター骨格、１５マイクロリットルの精製したＣＭＶプロモーターモジュール、１５マイクロリットルの精製したＳＰＣプロモーターモジュール、１５マイクロリットルの精製したルシフェラーゼ発現モジュール、１５マイクロリットルの精製したＥＧＦＰ発現モジュール、１５マイクロリットルの精製したＳＶ４０ ３’調節モジュール、１５マイクロリットルの精製したｈＧＨ ３’調節モジュール、及び１マイクロリットルのリガーゼ酵素。得られた反応成分を十分に混合して、その後１６℃にて終夜インキュベートする。
【０２０８】
予想されるベクターライゲーション産物は次のものを含む：
ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０
ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｈＧＨ
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ｈＧＨ
ｐＳＰＣ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０
ｐＳＰＣ−ＥＧＦＰ−ｈＧＨ
ｐＳＰＣ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０
ｐＳＰＣ−ルシフェラーゼ−ｈＧＨ
【０２０９】
次いで、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーへ取り込まれた、得られたベクターの同一性を判定する。
【０２１０】
前記実施例では、予測されたベクター産物の１つ（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０）は第一コンビナトリアルプロセスの間に生産されることがなかった。しかしながら、成功裡に生産された１つのベクター（ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０）は、所望のｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ベクターを生産するためのベクター骨格として働くことができる。この技術を、「第二パス組立て」と称することができる。
【０２１１】
実施例５：第二パス組立て
【０２１２】
所望のｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ベクターを作り上げるために、実施例４のｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０ベクター産物をＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化して、ＣＩＰ処理し、引き続きゲルで精製した。ルシフェラーゼモジュールが除去されている、この線状化したベクター断片をコンビナトリアルベクター構築の前記実施例で生産されたＥＧＦＰモジュールを含むライゲーション混合物中でインキュベートした。
【０２１３】
ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドがＥＧＦＰインサートを含むか否かを判定する。
【０２１４】
本発明の多くの利点のうち、各々、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを含むトランスジーンのアレイを迅速に非常に短時間で組み立てることができるのみならず、迅速且つ容易に新しい組立トランスジーンを変更又は再設計できることは、容易に理解されうるものである。従来は、各々、異なるプロモーター、発現、及び調節モジュールを有する、異なるトランスジーンのアレイを創出するための既知の方法を使用して、組み立てられたトランスジーンを変更することは、通常１年以上の実験時間がかかったはずである。本発明の方法を使用して、同数の所望のトランスジーンを数日又は数週間以内に作り、次いで各々の所望の試験を行い、これにより研究者は以前要した長時間を節約することができる。さらに、プロモーター、発現及び調節インサートの各々一つを同時に単一骨格へ挿入することができるダイナミックなベクター構築と、２つのＰ−シャトル、２つのＥ−シャトル、及び２つの調節シャトルをすべて組み合わせて８つの異なる型のトランスジーンを創出する前記の組合せ法の双方を、研究者が貴重な時間と金銭を節約するために使用することができる。元々ｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及びＰＣＲターミネーター突出クローニング法によって創出されたシャトルを取り上げて、これらの予製エレメントを多数のトランスジーンで迅速に組み立てる、本発明のドッキングポイント技術で用いることができる。
【０２１５】
本発明は、その実施態様の記載によって説明されており、実施態様が詳細に記載されているが、添付の請求の範囲をこのような詳細に制限又はいかようにも限定することは意図されていない。さらなる利点及び変更が、当業者に容易に明らかになることであろう。従って、本発明はその大局的な特徴において、特定の詳細、代表的な方法及び構造、並びに示され記載されたような説明された例に限定されることはない。従って、出願人の一般的発明概念の範囲又は精神から逸脱することなく、かかる詳細から逸脱してもかまわない。
【０２１６】
本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の実施態様を示して、さらに上記本発明の一般的な説明、及び以下の詳細な説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してクローニングベクタープラスミドの分野に関し、詳細には、クローニングベクタープラスミドを用いて、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の基礎を成すのは組換えＤＮＡ技術であり、ここでその技術は、核酸及びそれらのタンパク質産物の構造及び機能を研究するために用いられる核酸の修飾及び増幅として要約できる。
【０００３】
個々の遺伝子、遺伝子調節領域、遺伝子のサブセット、及びそれらが含まれるまさに全体の染色体はすべて、従来それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣの頭文字によって表されるアデニン、チミン、グアニン及びシトシンといった、ヌクレオチドの二本鎖の逆平行配列を含んでいる。これらのＤＮＡ配列や、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）分子に由来する二本鎖ＤＮＡコピーであるｃＤＮＡ配列は、その遺伝子産物を研究するために別個の断片に切断し、単離して、細菌プラスミドなどのベクターへ挿入することができる。プラスミドは、元は細菌に由来する染色体外ＤＮＡであり、遺伝子産物の研究又は生産を目的として操作し、宿主細菌に再導入することができるものである。プラスミドのＤＮＡは、遺伝子及び遺伝子調節領域をコードする、同じＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣヌクレオチドを含んでなるという点であらゆる染色体ＤＮＡと類似しているが、およそ３０，０００塩基対、すなわち３０キロベース（ｋｂ）未満のＤＮＡからなる比較的小さな分子である。さらに、二本鎖プラスミドのヌクレオチド塩基対は、連続的な環状分子を形成しており、染色体ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを区別することもできる。
【０００４】
プラスミドは、細菌生物間の遺伝物質の迅速な交換を増強して、温度、摂食物供給、又はその他の負荷などの、環境の変化に対する迅速な適応を可能とする。得られるプラスミドの何れも、宿主の生存に寄与する１又はそれ以上の遺伝子を発現しなければならず、さもなければ不要なプラスミドの維持は資源の浪費になるはずであるから、その生物によって破壊又は破棄されるであろう。細胞のクローン集団は、それが潜有するプラスミドも含めて、同一の遺伝物質を含むものである。ＤＮＡインサートを有するクローニングベクタープラスミドをこのような宿主細胞のクローン集団において使用すると、利用可能な目的とするＤＮＡの量は増幅する。こうしてクローニングされたＤＮＡは次いで、ＤＮＡコンストラクトを作り上げるために必要な工程におけるその後の操作のために単離し回収する。このように、ベクタープラスミドのクローニングは、大量の目的とするＤＮＡインサートを迅速に生産する能力をもたらし、遺伝子機能の研究で有用なツールであると認めることができる。
【０００５】
プラスミド中に認められるエレメントのいくつかは自然発生のものであるが、その他はＤＮＡベクターとしてのプラスミドの有用性を増強するために設計されている。これらには、特に抗生物質抵抗性又は化学物質抵抗性遺伝子及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）が含まれる。これらエレメントの各々が本発明でも従来の技術におけると同様に役割を果たす。各エレメントが果たす役割の記載により、従来の技術の限度が明らかになり本発明の有用性が示される。
【０００６】
宿主によって獲得されうる、プラスミドにより生じる特に有用な遺伝子は、抗生物質抵抗性を与えるようなものである。組換えＤＮＡ技術の日常的な実施において、抗生物質抵抗性遺伝子は、その他のプラスミドに増して所望のプラスミドの培養及び増幅を選択的に高める、ポジティブセレクション又はネガティブセレクションのエレメントとして活用される。
【０００７】
宿主細菌によって維持されるため、宿主にプラスミドを複製させるよう指向する配列の断片も、プラスミドに含まれなければならない。複製起点（ＯＲＩ）エレメントとして知られる配列は、宿主にその細胞の酵素を使用してプラスミドのコピーを作製するよう指向する。このような細菌が分裂した場合、その娘細胞は各々、かかるプラスミドの何れでも１以上のコピーを保有するはずである。大腸菌細菌の特定の株が、この複写を最大にするように誘導されており、１細菌当たり３００コピー以上を生産する。このようにして、所望のプラスミドの培養を向上させることができる。
【０００８】
何れのクローニングベクターにおいても、他の必須エレメントとして挙げられるのは、目的とする遺伝物質の挿入用の場所である。これは「野生型」プラスミドに内に設計され、かくしてクローニングベクターとしての有用性を与えている合成エレメントである。典型的な市販のクローニングベクタープラスミドは何れも、少なくとも１つこのような領域を含んでおり、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）として知られている。ＭＣＳは典型的には単一のエンドヌクレアーゼ酵素、又は一連のエンドヌクレアーゼ酵素（各々、別異の認識配列及び切断パターンを有する）によって切断されるヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ分子においてコードされる、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位のいわゆる認識配列は、二本鎖パリンドローム配列を含む。あるＲＥ酵素に対しては、認識部位を提供するのにわずか４〜６ヌクレオチドで十分であるが、ＲＥ酵素によっては８以上のヌクレオチドの配列が必要とされる。例えばＲＥ酵素ＥｃｏＲ１は、二本鎖ヘキサヌクレオチド配列：５’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ３’（配列中、５’は従来「上流」端部として知られている分子の端部を示し、３’は同様に、「下流」端部を示す）を認識する。認識配列の相補鎖は、その逆平行鎖、３’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−５’となるはずである。どのエンドヌクレアーゼ部位もヌクレオチドの二本鎖配列であるから、６ヌクレオチドの認識部位は実際に６塩基対（ｂｐ）である。従って、二本鎖認識部位はさらに大きな二本鎖分子内に現れることがありえ、その分子内で次に示すように現れる：
５’……Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ……５’
【０００９】
その他の多くのＲＥ酵素と同様、ＥｃｏＲ１は二分対称性の軸で正確に切断するのではないが、「／」によって示されるヌクレオチド間の、２つのＤＮＡ鎖で４ヌクレオチド離れた位置で切断され：
５’……Ｇ／Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ／Ｇ……５’
その結果二本鎖ＤＮＡ分子が切断されて、結果として生じるヌクレオチドの配置を新しく形成される「端部」で有することとなる：
５’……Ｇ３’ ５’Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ……３’
３’……Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ５’ ３’Ｇ……５’。
【００１０】
この位置のずれた切断によって、突出した５’末端を有するＤＮＡの断片が生じる。Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ対は互いに近接していると自然に形成されるので、これらのような突出した端部は、付着又は粘着末端と称される。これらの末端の何れも、同じ制限酵素で切断された他の相補性末端の何れものとも水素結合を形成することができる。特異的認識配列を含むＤＮＡの何れも、同じ配列を含んでいる何れか他のＤＮＡと同様に切断されるので、それらの切断された端部は相補的になるであろう。従って、同じＲＥ酵素で切断された何れのＤＮＡ分子の端部も、ジグソーパズルの隣接するピースが「嵌合」するように互いに「嵌合」して、酵素的につなぎ合わせることができる。組換えＤＮＡ分子の形成を可能とし、細菌プラスミド内、又は他の何れかのＤＮＡ分子内への外来ＤＮＡ断片の導入を許容するのは、この性質である。
【００１１】
組換えＤＮＡ分子を作り上げる際に考慮すべき、さらなる一般的な原則は、目的とする部位だけでなく、分子内に現れるあらゆるエンドヌクレアーゼ部位が特定のＲＥ酵素で切断されるであろうことである。ＤＮＡ分子が大きいほど、何れかのエンドヌクレアーゼ部位も再度現れる可能性が高い。何れのエンドヌクレアーゼ部位もＤＮＡ分子に沿ってランダムに分布すると仮定すると、テトラヌクレオチド部位は平均して、４４（すなわち、２５６）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れることになるはずであり、一方ヘキサヌクレオチド部位は４６（すなわち、４０９６）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れ、オクタヌクレオチド部位は４８（すなわち、１１４，６８８）ヌクレオチド又はｂｐ毎に１つ現れることになるはずである。このように、短い認識配列ほど高頻度に現れ、長いものほど希にしか現れないであろうことが容易に理解できる。トランスジーン又はその他の組換えＤＮＡ分子の構築を計画する場合、このような計画では様々なサイズのＤＮＡのいくつもの断片の組立てが必要となることが多いので、これは極めて重要な問題である。これらの断片が大きいほど使用したいと思う部位がＤＮＡ成分のいくつもの断片に現れる可能性が高くなり、良くても操作が困難になってしまう。
【００１２】
高頻度に現れるエンドヌクレアーゼ酵素部位は、本願において共通部位と称し、これらの部位を切断するエンドヌクレアーゼは共通エンドヌクレアーゼ酵素と称する。６ｂｐよりも大きな同族制限部位を有する制限酵素は希少制限酵素と称し、それらの同族制限部位は希少制限部位と称する。しかしながら、統計的に予測されるよりも出現頻度の低い６ｂｐのエンドヌクレアーゼ部位もいくつかあり、これらの部位とそれらを切断するエンドヌクレアーゼも希少と称する。よって、「希少」及び「共通」の標記は、何れか特定の制限酵素の相対的な存在度又は可用性を言及するのでなく、正しくはＤＮＡ分子若しくはＤＮＡ分子の単離された断片の何れか、又は遺伝子若しくはそのＤＮＡ配列の何れかの中のその同族認識部位を構成するヌクレオチドの配列の出現頻度に言及するものである。
【００１３】
エンドヌクレアーゼ酵素の第二のクラスが最近単離されており、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）酵素と称されている。ＨＥ酵素は、大きな非パリンドローム非対称認識部位（１２〜４０塩基対）を有する。ＨＥ認識部位は極めて希少である。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩとして知られているＨＥは１８ｂｐの認識部位（５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ．．．３’）を有し、ランダム配列の７×１０１０ｂｐごとに１つずつしか現れないと予測される。この出現頻度は、２０の哺乳動物の大きさのゲノムで１箇所のみに相当する。ＨＥ認識部位の希少性により、ＨＥ認識部位がクローニングベクタープラスミド内の適切な位置に入れられた場合に、トランスジーンの完全性を崩壊させることなしに遺伝子工学者が最終のトランスジーン産物を切断できる可能性が大幅に高められる。
【００１４】
何れの原料生物由来のＤＮＡ分子でもエンドヌクレアーゼ酵素によって同じように切断されるはずなので、如何なる種に由来するＤＮＡの外来断片もエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、同じエンドヌクレアーゼ酵素で切断された細菌プラスミドベクターへ挿入して、好適な宿主細胞において増幅することができる。例えば、ＥｃｏＲ１として知られるＲＥ酵素でヒト遺伝子を２箇所で切断できれば、ＥｃｏＲ１端部を備えた所望の断片を単離し、ライゲーション混合物として一般に知られているものの中で、やはりＥｃｏＲ１で切断されたプラスミドと混合することができる。ライゲーション混合物中、適切な条件下で、単離されたヒト遺伝子断片のいくつかはプラスミド分子の端部と嵌合するはずである。これらの新しく合わされた端部は結合（ライゲーション）することができ、こうしてその新しいＤＮＡインサートを含むプラスミドが酵素的に再度環化される。ライゲーション混合物は次いで大腸菌又はその他の好適な宿主に導入されて、新しく設計されたプラスミドは細菌が分裂するにつれて増幅されることになる。このようにして、ヒト遺伝子の比較的多数のコピーを得て、細菌から収集しうる。これらの遺伝子コピーは次いで、その遺伝子産物タンパク質の研究、解析、又は生産を目的としてさらに操作することができる。
【００１５】
組換えＤＮＡ技術は、いわゆる「トランスジーン」の生成において頻繁に実施される。トランスジーンは、１以上のドナー生物に由来し、宿主生物に導入された種々の遺伝物質を含むことが多い。典型的にはトランスジーンは、計画の出発点又は「骨格」であるクローニングベクターを使用して構築され、一連の複合クローニング工程は、ベクター内に最終産物を組み立てるように計画される。ヌクレオチド配列から成るトランスジーンのエレメントとしては、１）調節プロモーター及び／又はエンハンサーエレメント、２）ｍＲＮＡ分子として発現されることになる遺伝子、３）ｍＲＮＡ情報の安定化をもたらすＤＮＡエレメント、４）哺乳動物イントロン遺伝子領域を模倣したヌクレオチド配列、及び５）天然ｍＲＮＡの端部に付加されるポリＡ尾部などのｍＲＮＡプロセッシング用のシグナルが挙げられるが、これらに限定されることはない。場合によって、実験計画で特定の細胞内部位への遺伝子産物の輸送をもたらすために局在化シグナルの付加が必要とされることがある。
【００１６】
トランスジーンのエレメントの各々は、ドナーゲノムから切り出されるさらに大きなＤＮＡ分子の断片として得ることができ、また場合によっては研究室で合成することができる。本発明では、本明細書の請求項にかかる方法にエンドヌクレアーゼを使用するが、例えば、本発明の方法において使用されるインサート又はモジュールを含む小エレメントの各々が、ｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及び／又はＰＣＲターミネーター突出クローニングによって作り出すことができることは知られている。トランスジーンの構成エレメントの合成のこのような方法の一つとして、Ｊａｒｒｅｌｌらにより米国特許第６，３５８，７１２号（引用することによりその全体を本明細書において援用する）に開示された方法が挙げられる。Ｊａｒｒｅｌｌはトランスジーンのエレメントを一体的に「結合」するための方法を開示しているが、エレメントを一旦組み立ておき、「脱離」して再度組み立てる手段を開示しているのは本発明の方法のみである。本発明の特徴の一つによれば、各々の断片は他の断片と正確な順序且つ５’−３’方向にクローニングベクタープラスミドへ組み立てられる。
【００１７】
目的とするプロモーターの刺激に必要な条件を満たしているとすれば、何れの遺伝子のプロモーターであってもＤＮＡ断片として単離し、プラスミドなどの合成分子内に配置して、所望の遺伝子の発現を指向することができる。例えば、インスリン遺伝子のプロモーター配列を単離し、レポーター遺伝子と共にクローニングベクタープラスミドに配置して、適切な細胞種の中でインスリン遺伝子の発現に必要な条件を調べるために使用することができる。あるいは、クローニングベクタープラスミド内で目的とする遺伝子のタンパク質をコードする配列にインスリン遺伝子プロモーターを合わせて使用してもよく、こうして構築したＤＮＡトランスジーン内に必要なエレメントがすべて存在するとすれば、インスリンを発現している細胞内でその目的とする遺伝子の発現が駆動される。
【００１８】
レポーター遺伝子は、ある種のトランスジーンの、特に有用な成分である。レポーター遺伝子は、トランスジーン内でそれに連結する、目的とする特定のプロモーターの主導のもとに発現されることになるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列から成り、プロモーター活性を測定可能な生化学的応答をもたらす。レポーター遺伝子は、典型的には、内在の細胞性タンパク質のバックグラウンドに対して検出又は測定が容易なものである。一般に使用されるレポーター遺伝子にはＬａｃＺ、ＧＦＰ、及びルシフェラーゼ、並びにその他のレポーター遺伝子が含まれるがこれらに限定されず、多くが当業者に良く知られている。
【００１９】
イントロンは、哺乳類遺伝子内の非コーディング領域であり、細菌ゲノム内に見出されることはないが、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ分子の適正な形成に必要とされる。従って、哺乳類系で使用されるＤＮＡコンストラクトは何れも、少なくとも１つのイントロンを有していなければならない。イントロンは、何れかの哺乳類遺伝子から単離し、哺乳類細胞にイントロンを切除させて残余のｍＲＮＡ端をつなぎ合わせる適切なスプライシングシグナルと共にＤＮＡコンストラクト内に挿入するとよい。
【００２０】
ｍＲＮＡ安定化エレメントは、いくつかのｍＲＮＡを分解から保護する結合タンパク質によって認識されるＤＮＡの配列である。ｍＲＮＡ安定化エレメントを含めることにより、いくつかの哺乳類細胞種においてそのｍＲＮＡからの遺伝子発現のレベルが増強されることが多く、そのためいくつかのＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンにおいて有用となりうる。ｍＲＮＡ安定化エレメントは、ＤＮＡコンストラクト内に包含させるために、天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡから単離するか、又は合成により生産することができる。
【００２１】
局在化シグナルは、目的とするタンパク質の細胞内での移動のためのタンパク質シグナルをコードするＤＮＡの配列である。例えば、核局在化シグナルはタンパク質を核に向かわせ、細胞膜局在化シグナルはタンパク質を細胞質膜に向かわせる、等である。よって、そのタンパク質産物の望ましい細胞内位置への転位を促進するために、局在化シグナルをＤＮＡコンストラクトに組み込むとよい。
【００２２】
タグ配列は、タンパク質産物にユニークな領域が付着するようにＤＮＡコンストラクトでコード化することができる。このユニークな領域は、その内在性の対応物から識別できるタンパク質タグとして働くものである。あるいは、当該技術分野において良く知られている多種多様な技術によって検出されうる識別子として働くことができ、かかる技術にはＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学法、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法が含まれるがこれらに限定されることはない。
【００２３】
複合トランスジーン、すなわち特に大きなＤＮＡの領域を含むものでは、ＤＮＡのこれらの断片に複数のエンドヌクレアーゼ認識部位が存在する可能性が高まる。何れのヘキサヌクレオチド部位をコードする認識配列も４０９６ｂｐ（４６）ごとに現れることを想起されたい。プロモーター配列が３０００ｂｐであり、且つ１５００ｂｐの目的の遺伝子を３０００ｂｐのクローニングベクター内に組み立てる予定であれば、使用可能な部位が断片のうちのわずか２つでしか現れないはずなので、６以下のヌクレオチドの多くの部位が有用にならない可能性が統計的に非常に高い。さらに、その部位は組み立てられる予定の適切な分子の適切な範囲内に現れなければならない。また、ほとんどのクローニングプロジェクトは、さらなるＤＮＡエレメントを付加する必要があるはずであり、これによって、成長する分子の複雑さや、何れの特定の制限部位も不都合に反復する可能性が増加してしまう。何れの制限酵素も分子内のその部位のすべてで切断するはずなので、もしもエンドヌクレアーゼ酵素制限部位が再度現れると、すべての不適当な部位はすべて、望ましい部位と共に切断されるはずであり、分子の完全性は破壊される。このように、先行エレメントを組み込むのに既に使用されているエンドヌクレアーゼ酵素で切断することによって成長する分子を破壊することのないよう、各クローニング工程は注意深く設計されなければならない。最後に、完成したトランスジーンを哺乳類生物に導入することを研究者が望む場合、完全に組み立てられたトランスジーンコンストラクトはトランスジーンの少なくとも一端にユニークな認識部位にて線状化されねばならないことが殆どであるから、コンストラクト内の他のどこにも見られないさらに別のユニークな認識部位が必要とされる。ほとんどのＤＮＡコンストラクトは単一の目的で設計されるので、今後なされる必要があるかもしれない何らかの修飾は殆ど考慮されておらず、今後の実験の変更の困難さがさらに増加することになってしまっている。
【００２４】
従来、トランスジーンの設計及び構築は以下の理由を含めたいくつかの理由によりかなりの時間と労力を費やすものである。
【００２５】
１．末端のアレイを生成する入手可能なエンドヌクレアーゼ酵素には種々多様なものがあるが、これらの殆どは相互に適合しない。ＥｃｏＲ１など多くのエンドヌクレアーゼ酵素は、突出５’付着端又は「尾部」を備えたＤＮＡ断片を生成し、その他（例えば、Ｐｓｔ１）は３’突出尾部を備えた断片を生成するが、さらに別のもの（例えば、Ｂａｌ１）は対称軸で切断して平滑断端断片を生産する。これらのうちのいくつかは他のエンドヌクレアーゼ酵素での切断により形成される末端と適合しうるであろうが、有用なものの大部分は適合しないであろう。各ＤＮＡ断片の単離で生成することのできる末端は、ＤＮＡコンストラクトを設計する上で注意深く考慮されなければならない。
【００２６】
２．ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンの組み立てに必要なＤＮＡ断片は、先ずそれらの供給用ゲノムから単離し、プラスミドクローニングベクターに入れて、有用な量を得るために増幅しなければならない。工程は、市販又は個々に改変されたクローニングベクターを幾つ使用しても実施することができる。異なる市販のクローニングベクタープラスミドの各々は、大部分が独立して開発されたものであり、このため目的とする遺伝子又は遺伝子エレメントのＤＮＡ断片を切断する異なる配列及びエンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。従って、遺伝子は、任意の一連の実験に対し、必要に応じてこれらベクターの各々に適合するように個々に調整されなければならない。同じＤＮＡ断片は、その後の実験や、又は新しいＤＮＡコンストラクト若しくはトランスジーンを作成するためのその他の組合せへのクローニングのためにさらに改変される必要のあることが多いはずである。各々のＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンは、次にどのように使用されることになるのかについて思想や知見なしに、特定の用途に対して特注で作られるので、その後の用途のために「後から改造」されなければならないことが多い。
【００２７】
３．さらに、何れの遺伝子又は遺伝子エレメントのＤＮＡ配列も様々なものであって、内部エンドヌクレアーゼ部位を含む可能性があるので、現在入手可能なベクターと適合不可能になる。これにより操作が複雑になってしまう。これは特に、いくつかのＤＮＡ断片から、単一のＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを組み立てる場合にあてはまる。
【００２８】
このように、ＤＮＡ断片の端部及び内部で認められるエンドヌクレアーゼ部位の余剰にもかかわらず、使用者が１分子の中に多くのＤＮＡ断片を迅速に組み立てることのできるようになるシステムが希求されている。そのようなシステムによって、断片の端部を、それらに他のエンドヌクレアーゼ配列が付加されるように迅速に改変するための簡単な手段も提供されうる。ＨＥ部位の単一又は対向のペアを含めることで、クローニングのためのユニークな部位を有する可能性が増大するはずである。断片の１以上を容易に置換又は除去することを可能とするようなシステムは、現在のところ使用者が利用できない水準の汎用性を付加することとなろう。従って、「モジュラー」システム、すなわち、クローニングベクター内の希少エンドヌクレアーゼ部位に隣接する「カセット」領域内に又は当該領域外に、ＤＮＡ断片若しくは「インサート」を挿入又は除去することを可能とするシステムは、組換えＤＮＡ技術の分野にとって殊に有用で歓迎されるものとなるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
従って、本発明は、クローニングベクタープラスミドを使用することによって、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てる方法を提供する。本発明はまた、プロモーター、発現、及び３’調節ヌクレオチド配列の各々一つなど、「インサート」又は「モジュール」双方としても知られる複数のＤＮＡ断片を、各インサートを逐次的に導入しなければならないのではなく、単一工程でクローニングベクタープラスミドに組み込む方法も提供する。このような方法を、本明細書では「ダイナミックなベクター構築」と称する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】一次ドッキングステーションへ挿入可能なＰＥ３ドッキングステーションへ挿入可能なＰシャトルベクターを示す、本発明のモジュール概念の線形マップを示す図である。
【図２】プロモーター、発現及び３’調節モジュールなどのシャトルベクター内の制限部位と、一次クローニングベクタープラスミド上のドッキングポイントとの間の関連性によって可能となる、骨格ベクターの組立てを示す図である。
【図３】組み立てられた図２の骨格ベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一つの実施態様において、本発明は、インサートの連鎖配列を受容することができる骨格をクローニングベクタープラスミドに備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意して、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格へ移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法を提供する。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき第一ヌクレオチド配列を第一シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき第二ヌクレオチド配列を第二シャトルベクターへ導入して、第一ヌクレオチド配列及び第二ヌクレオチド配列をシャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列を、プロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法も提供する。
【００３４】
他の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つの発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも１つの調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含み、１つのプロモーターモジュール、１つの発現モジュール、及び１つの調節モジュールのうち、少なくとも２つの組合せが、２つの別々の一次クローニングベクター分子へ移行されるものである、トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法を提供する。
【００３５】
さらに別の実施態様において、本発明は、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを作製するための方法であって、骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つエンドヌクレアーゼ酵素に対する少なくとも１つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを、第一のドッキングポイントの少なくとも１つの非可変性希少制限部位に対応する第一エンドヌクレアーゼ酵素で切断して、３’端を備える切断された第一のドッキングポイントを生成し；第二のドッキングポイントを、第二のドッキングポイントの少なくとも１つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位に対応する第二ヌクレアーゼ酵素で切断して、５’端を備える切断された第二のドッキングポイントを生成し；少なくとも第一及び第二インサートを用意し、各インサートは５’端、目的とするヌクレオチド配列及び３’端を含んでおり、第一インサートの５’端は切断された第一のドッキングポイントの３’端と適合可能であり、第二インサートの３’端は切断された第二のドッキングポイントの５’端と適合可能であって、第一インサートの３’端は第二インサートの５’端と適合可能で第三エンドヌクレアーゼ酵素に対する第三非可変希少エンドヌクレアーゼ部位を形成して；インサート及び切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間で第一及び第二インサートの同時ライゲーション及び自己配向を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成して、モジュラークローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む方法を提供する。
【００３６】
他の実施態様において、本発明は、骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも１つの希少制限部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの希少制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断して、３’端を備える切断された骨格を生成し；第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断して、５’端を備える切断された骨格を生成し、目的とするプロモーター配列、第一のドッキングポイントの３’端に適合可能な５’端、及び３’端が挿入されているプロモーターインサートを用意し；目的とする発現配列、プロモーターインサートの３’端に適合して第三非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び３’末端を含む発現インサートを用意し；目的とする調節配列、発現インサートの３’に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’端、及び工程「ｃ」で切断された、切断された第二のドッキングポイントの５’端に適合可能な３’端を含む調節インサートを用意して；プロモーター、発現及び調節インサート、並びに切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成し、モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するための方法を提供する。
【００３７】
さらに別の実施態様において、本発明は、５’端、目的とするヌクレオチド配列及び３’端を有するインサートを挿入することができる骨格を含む少なくとも１つの一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格はプロモーター、発現、及び調節インサートの連鎖配列を受容して作動可能となり、且つ、少なくとも第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも１つの制限部位を含んでおり；第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断し；第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断し；プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つのプロモーターインサートを用意し、その少なくとも１つのプロモーターインサートの５’端は工程「ｂ」で切断された第一のドッキングポイントの３’端に適合可能であり；発現ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つの発現インサートを用意し、その少なくとも１つの発現インサートの５’端は少なくとも１つのプロモーターインサートの３’端に適合して、第三非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し；調節ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも１つの調節インサートを用意し、その少なくとも１つの調節インサートの５’端は前記少なくとも１つの発現インサートの３’端に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成するものであり、前記少なくとも１つの調節インサートの３’端は工程「ｃ」で切断された第二のドッキングポイントの５’端に適合可能であり；その後、プロモーター、発現及び調節インサートうちの１つの少なくとも２つの異なる種と、残るインサートの各々の少なくとも１つと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを適切な反応混合物へ入れて、骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの各々一つの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こして、それらの骨格内でプロモーター、発現及び調節インサートの異なる組合せを有するプラスミドのアレイを創出する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトのアレイを同時に合成するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、以下の図面及び説明に鑑みてさらに完全に認められるであろう。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「クロマチン修飾ドメイン」（ＣＭＤ）の用語は、クロマチン構造の維持及び／又は改変と関係している種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「クローニング」の用語は、ＤＮＡ分子をプラスミドへライゲーションして、それを宿主の増殖の際の増幅のために適切な宿主細胞に移行させるプロセスを指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「クローニングベクター」及び「クローニングベクタープラスミド」の用語は、複製の起点、抗生物質抵抗性遺伝子などのプラスミドを内包する宿主細胞のポジティブセレクションをするための手段；及びマルチクローニングサイトを最低限含んでいる環状ＤＮＡ分子を指し、互換的に使用される。
【００４２】
本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して「共通の」の用語は、ゲノム内に比較的高頻度に現れる何れのエンドヌクレアーゼ部位も指すものである。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「適合可能な」の表現は、同じ制限酵素で切断されたか又は他の何らかの方法によって創出された、他の何れかの相補性末端と水素結合を形成することができるＤＮＡの鎖の、５’又は３’の何れかの末端又は端部をいう。制限酵素に対する特異的認識部位を含むＤＮＡは何れも、同じ配列を含む他の何れのＤＮＡと同様に切断されるので、それら切断された端部は相補的になり、よって適合可能となるであろう。従って、同じ制限酵素で切断された何れのＤＮＡ分子の端部も、ジグソーパズルの隣接するピースが「嵌合」するように、互いに「嵌合」し、酵素的につなぎ合わせることができる。適合可能な端部は、組み合わされた場合に特定の制限酵素に対する認識部位を形成することになる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ｄｅ ｎｏｖｏ合成」の用語は、所望のＤＮＡ分子全体の部分配列を表す相補性一本鎖ＤＮＡ分子の適合可能な突出を連結させることによって、如何なる長さのものでも二本鎖ＤＮＡ分子を合成するプロセスを指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡコンストラクト」の用語は、クローニングベクタープラスミド内での継続的なクローニング工程によって合成され、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞、又はｉｎ ｖｉｖｏのトランスジェニックマウスなどの何らかの適切な宿主における遺伝子発現に向けて一般に使用されるＤＮＡ分子を指す。このようなマウスを作製するのに使用されるトランスジーンは、特にトランスジーンが設計及び合成される期間にあっては、ＤＮＡコンストラクトと称することもできる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ断片」の用語は、タンパク質をコードする配列、レポーター遺伝子、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、ポリＡ尾部、マルチクローニングサイト、核局在化シグナル、若しくはｍＲＮＡ安定化シグナル、又は他の何らかの天然若しくは合成のＤＮＡ分子、又はその何れか一部分を含むＤＮＡの単離された分子をも指すものであるが、これらに限定されることはない。あるいは、ＤＮＡ断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産された完全に合成起源のものであってもよい。さらに、ＤＮＡ断片は、単離された天然及び／又は合成断片の何れの組合せをも含みうる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ドッキングプラスミド」の用語は、ＤＮＡ断片をＤＮＡコンストラクトへ組み立てるために本発明において使用される、特化されたクローニングベクタープラスミドを指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「エンドヌクレアーゼ」又は「エンドヌクレアーゼ酵素」の用語は、ＤＮＡ分子においてコードされた認識部位に結合してそのＤＮＡ分子をその配列内またはその配列近傍の正確な位置で切断する触媒分子の分類の１種または複数種のメンバーを指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「エンドヌクレアーゼ認識部位」、「認識部位」、「同族配列」又は「同族配列（複数）」の用語は、ＤＮＡ分子又は遺伝子に結合して切断する制限酵素に必要なヌクレオチドの最低限の配列を指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「エンハンサー領域」の用語は、標的遺伝子の発現には必要ないが、適切な条件下に遺伝子発現のレベルを増加させるようなヌクレオチド配列を指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子発現宿主選択遺伝子」（ＧＥＨ−Ｓ）の用語は、光学センサ、ＰＣＲ増幅、生化学的分析により、若しくは細胞／生物生存分析（適切な抗生物質又は化学物質で処理した場合の、細胞又は生物に対する抵抗性又は毒性）により選択、追跡、又は検出されうる形質を、宿主生物に与えることのできる遺伝子エレメントを指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「遺伝子プロモーター」又は「プロモーター」の用語は、遺伝子の発現に必要なヌクレオチド配列、又は全長プロモーターの何れか一部分を指す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「インサート」及び「モジュール」の用語は、原則的にほぼ同義であり、これらの区別をするとすれば、「インサート」はベクターへ挿入され、それがひとたび挿入されれば、それからはより一般的に「モジュール」と称されることのみである。モジュールはその後、ベクターから除去することができる。また、インサートの用語は、モジュラーアクセプタベクターへのインサートとして使用される、単離されたモジュールに対して一般的に使用される。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「イントロン」の用語は、２つのタンパク質コーディング領域すなわちエクソンの間に認められる、哺乳類細胞遺伝子内の非タンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「局在化シグナル」（ＬＯＣ）の用語は、目的とするタンパク質の細胞内局在に対するシグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「マルチクローニングサイト」（ＭＣＳ）の用語は、クローニングベクタープラスミドへのＤＮＡ断片のクローニングを目的とした、少なくとも１つのユニークなエンドヌクレアーゼ部位、及び、さらに典型的には、ユニークなエンドヌクレアーゼ部位の集団を含むヌクレオチド配列を指す。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ｍＲＮＡ安定化エレメント」の用語は、いくつかのｍＲＮＡを分解から保護すると考えられる結合タンパク質によって認識されるＤＮＡの配列のことである。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「複製の起点」（ＯＲＩ）の用語は、宿主細胞内でのプラスミドの複製又は複写を指向するヌクレオチド配列を指す。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ＰＣＲターミネーター突出クローニング技術」の表現は、相補性ＤＮＡ突出とのジャンクション部位として働くことのできる、保護された５’突出ヌクレオチドを備えた一本鎖ＤＮＡプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して、遺伝子モジュールを増幅するプロセスを指す。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ポリＡ尾部」の用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の端部で一般的に見出されるアデニン（Ａ）ヌクレオチドの配列を指す。ポリＡ尾部シグナルは、目的とする遺伝子の発現を促進するために、ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンの３’端に組み込まれる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「プライマーサイト」の用語は、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ増幅、及び／又はＲＮＡ転写を開始することを目的として、その上に一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがアニーリングすることのできるＤＮＡ鋳型として働くヌクレオチド配列を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ｐＵＣ１９」の用語は、当業者に良く知られており、受入番号＃Ｌ０９１３７としてＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見られるプラスミドクローニングベクターを指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ランダムヌクレオチド配列」の用語は、同じ分子の成分として特定される他のエレメントをコードする配列を複写しないヌクレオチド配列の組合せを示している。ランダム配列で必要とされるヌクレオチドの数は、ランダム配列に隣接するエンドヌクレアーゼ酵素の要求性に依存する。殆どのエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合を安定化するため、最低でも２〜４のさらなるランダム配列を必要とする。ランダム配列の数は、コドンを作り上げているヌクレオチドの数に対応して、３の倍数となることが好ましい。ランダム配列の好ましい最小数は従って６であるが、もっと少ないか又はもっと多くのヌクレオチドを使用してもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して「希少」の用語は、ゲノム内で比較的低頻度でしか現れないエンドヌクレアーゼ部位を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「組換えアーム」の用語は、トランスジェニックＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の相同組換えを促進するヌクレオチド配列を指す。組換えの成功には、相同組換によって宿主ゲノムに組み込まれる予定のトランスジェニックＤＮＡの領域に隣接する、左組換えアーム（ＬＲＡ）と右組換えアーム（ＲＲＡ）の存在が必要である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「組換え」の用語は、リコンビナーゼ酵素による作用を受けることができるＤＮＡ配列と併せてランダム又は部位選択的リコンビナーゼ酵素を使用し、ある１つのＤＮＡ分子から別異のＤＮＡ分子に遺伝物質の一部を転位させるプロセスを指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」の用語は、目的とする特定のプロモーターの活性をモニターするのに有用なタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を指す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「シャトルベクター」の用語は、ＤＮＡ断片の端部を修飾することになる中間分子を作製するために本発明で使用される、特化したクローニングベクタープラスミドを指す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「タグ配列」（ＴＡＧ）の用語は、それが検出されること、又は場合によっては、何らかの内在性の対応物から識別されることを可能とするユニークなタンパク質領域をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「非翻訳領域」（ＵＴＲ）の用語は、ｍＲＮＡ分子の非タンパク質コーディング領域を包囲するヌクレオチド配列を指す。これらの非翻訳領域は、ｍＲＮＡ分子の５’端（５’ＵＴＲ）又は３’端（３’ＵＴＲ）に存在しうる。
【００７１】
本発明は、モジュールを含む新しく製造されたトランスジーンを取り上げ、選択的にモジュールの１以上を除去してそれを異なるインサートと置換する方法を提供する。このプロセスを本明細書では「第二パス」及び「重複スレッディング」と称する。本発明はさらに、単一工程で複数の異なるプロモーター、発現及び調節インサートをクローニングベクタープラスミドへ組み込むことによって、各々が異なるプロモーター、発現及び調節インサートを有している、異なるトランスジーンのアレイを創出するための方法を提供する。本発明はまた、組み合わせられたプロモーター、発現及び調節インサートが新しく導入されたクローニングベクタープラスミドを用意し、骨格ベクターとして組合せ全体を取り出して、単一のクローニングベクタープラスミドへ複数の骨格ベクターを挿入する工程を含む方法も提供する。
【００７２】
本発明はまた、その中にドッキングポイントを有する骨格を備えさせることによって、トランスジーン又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを創出する方法も提供する。各ドッキングポイントは、好ましくは少なくとも１つの固定された非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位、より好ましくは２つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団、及び最も好ましくは３つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団がある領域を表す。各ドッキングポイントの特定の制限部位は、その同族エンドヌクレアーゼ酵素によって切断される。これによって、プロモーター、発現又は調節ヌクレオチド配列などの、選択されたヌクレオチド配列を含む、予め構築されたインサートの１つの相補性５’端又は３’端と適合可能な、所望の５’又は３’端のいずれかが創出されることになる。それぞれ、切断された目的とするドッキングポイントと適合可能な５’端及び３’端を有する少なくとも２つのインサートを、切断されたクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物に添加することができ、適切な熱力学的環境とすれば、インサートを同時に、すなわち単一工程にてクローニングベクタープラスミドへ組み込ませることができる。この一回の添加及びライゲーション反応の間にドッキングポイントが再形成されそのドッキングポイントにおいてクローニングベクタープラスミドはモジュラーとなり、２つのモジュール間の結合は適切な制限酵素で再度切断することができる。次いでそのモジュールは、後から除去することができ、新しいモジュールをその場所に入れることができる。
【００７３】
本発明の一つの実施態様は、クローニングベクタープラスミドにインサートの連鎖配列を受容することができる骨格を備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意し、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格に移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法に関する。より好ましくは、インサートは３つのインサート、具体的には少なくとも１つのプロモーター、発現、及び調節モジュールからなる。
【００７４】
本発明の別の実施態様は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法である。
【００７５】
ドッキングポイントの各々の５’及び３’端の双方、並びにインサートの各々はすべて、別のドッキングポイント又はインサートの対応する端部に適合可能であることが好ましい。例えば、もしも第一のドッキングポイントがＳｇｒＡＩなどの非可変性希少制限酵素に対する制限部位を含んでおり、且つそのドッキングポイントがその後切断されるのであれば、切断された第一のドッキングポイントの３’端で挿入されることが意図された第一インサートは適合可能な５’端を含むことになり、インサートが第一のドッキングポイントと組み合わせられるとＳｇｒＡＩに対する制限部位が創出されることになろう。プラスミド内の第二のドッキングポイントは、例えば、ＳｗａＩなどの非可変性制限酵素に対する制限部位を有しうる。何れの第二インサートもその３’端にて適合可能なヌクレオチド配列を有し、切断された第二のドッキングポイントの切断された５’端と組み合わせられてＳｗａｌに対する制限部位を創出するであろう。さらに、第一インサートの３’端及び第二インサートの５’端は、モジュラークローニングベクタープラスミドへ同時に挿入して、さらにその後同じドッキングポイントで除去もするために、ＰａｃＩ又はＳａｌＩなどの第三非可変希少制限酵素に対する第三制限部位を創出する適合可能な端部を含まなければならない。
【００７６】
本発明のモジュラー構造をコードする連鎖エレメントには、具体的には、３つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、５’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、順方向のユニークなＨＥ部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、プロモーター／イントロンモジュールに対して３’側となる部位と発現モジュールに対して５’側となる部位との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、発現モジュールに対して３’側となる部位と３’調節モジュールに対して５’側となる部位とのジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、３’調節モジュールに対して３’側となる部位を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、５’オリゴヌクレオチドプライマーサイトの３’位に配置されたものと同じＨＥ部位である逆方向のユニークなＨＥ部位、逆方向の３’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び３’挿入部位を規定する４つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれる。
【００７７】
本発明のモジュラー構造をコードする他の連鎖エレメントには、具体的には、５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位、一対のユニークなＨＥ部位の下流においてシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通の制限部位、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、順方向のユニークなＨＥ部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、一対の互いに反対方向のユニークなＢｓｔＸＩ部位（ＢｓｔＸＩ認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配置された２つの同じＨＥ認識部位の順序付けによって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドにより規定される）、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位；逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、逆方向のユニークなＨＥ部位（当該ＨＥ部位は、順方向のＨＥ部位と同じである）、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、非可変性で且つユニークな共通の制限部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＨＥ部位、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び３つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれうる。
【００７８】
本発明は、必要とされることの多い操作の量を低減するために至適化されたクローニングベクターを使用することによって、ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡコンストラクト又はトランスジーンへ種々のＤＮＡ断片を組み立てるための方法の一群である。
【００７９】
一次ベクター（本明細書中、ドッキングプラスミドと称する）は、好ましくは３組の線状パターンに配列された希少エンドヌクレアーゼ部位を備えたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。この配列は、使用者が、先行するクローニング工程でドッキングプラスミドへ既に組み込まれたＤＮＡエレメントの完全性を破壊することなしに、複数のインサートを単一のトランスジーンコンストラクトへ組み立てることを可能とする、モジュラー構造を規定する。
【００８０】
少なくとも３つのＨＥに対する２つの認識部位が、自己アニーリングすることのできない遺伝子カセットアクセプタ部位を創出する目的で、３つのモジュラー領域に隣接するように反対方向に配置される。ＨＥ部位は非対称且つ非パリンドロームであるため、２つのＨＥ認識部位を反対方向に配置することによって非相補性突出３’付着末端を生成させることが可能である。こうして、ＨＥＩ−Ｓｃｅｌが「／」によって示されるその同族認識部位を切断する：
５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡ／ＣＡＧＧＧＴＡＡＴ．．．３’
３’．．．ＡＴＣＣＣ／ＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＡ．．．５’。
【００８１】
ＭＣＳ内に第二部位を逆に配置することで、２つの非相補性付着突出末端が生じるはずである：
５’．．．ＴＡＧＧＧＡＴＡＡ ＣＣＣＴＡ．．．３’
３’．．．ＡＴＣＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＴ．．．５’
【００８２】
これは、より大きなトランスジーンをベクターへサブクローニングすることが必要な場合に特に有用である。インサートのサイズに起因して、大きなインサートを受容するよりむしろ自己アニーリングすることが、ベクターにとって熱力学的により好都合である。この制限部位の配置により生じる非相補性尾部の存在で、自己ライゲーションに対する熱力学的傾向に対向する化学力がもたらされる。
【００８３】
殆どのＨＥ突出尾部の非対称性もまた、ＢｓｔＸＩエンドヌクレアーゼ酵素部位（５’ＣＣＡＮＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ３’、配列中「Ｎ」は何れのヌクレオチドでもありうる）と組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。ＢｓｔＸＩの配列−中立ドメインは、自己アニーリングを防止しつつ２つの逆方向性ＨＥ突出尾部に対する適合可能な付着末端を生成させるために使用することができる。
【００８４】
ＢｓｔＸＩ（Ｉ−ＳｃｅＩ 順方向） Ｉ−ＳｃｅＩ 順方向 Ｉ−ＳｃｅＩ 逆方向 ＢｓｔＸＩ（Ｉ−ＳｃｅＩ 逆方向）
５’−ＣＣＡＧＡＴＡＡ
３’−ＧＧＴＣ
ＣＡＧＧＧＴＡＡＴ／／ＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴ
ＴＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＡ／／ＴＡＡＴＧＧＧＡＣ
ＧＴＧＧ−３’
ＡＡＴＡＣＡＣＣ−５’
【００８５】
本発明で使用されるエンドヌクレアーゼ部位は、出現の序列に従って選択した。エンドヌクレアーゼ部位出現の頻度を調べるために、１９の異なる遺伝子に対応するＤＮＡ配列情報を、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用して分析した。この研究は、ＤＮＡ配列の計１１０，５３０ヌクレオチドを網羅するものであった。これらの分析の結果を、分析した１１０，５３０ヌクレオチド内に出現しているエンドヌクレアーゼ部位の事例数に従って計算した。エンドヌクレアーゼ部位は次いで、４種の分類に従って序列の上での表示を割り振り、「共通の」部位は１１０，５３０ヌクレオチド当たり２５回より多く出現し、「低頻度６ｂｐ部位」は１１０，５３０ヌクレオチド当たり６〜２４回の間で出現し、「希少」部位は１１０，５３０ヌクレオチド当たり０〜５回の間で出現する。「好適な」酵素の部分的なリストを、それらの出現の分類に従ってここに列挙する。
【００８６】
共通のエンドヌクレアーゼ酵素：
ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ
【００８７】
６ｂｐの認識部位を有するが、出現頻度が低いエンドヌクレアーゼ酵素：
ＡａｒＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｅＡＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ
【００８８】
希少エンドヌクレアーゼ酵素：
ＡｃｌＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｓｉＷＩ、ＦｓｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｗａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｌｉＩ
【００８９】
これらのリストに含まれない、同じ機能性を有する並びに本発明の精神及び意図を維持している他のエンドヌクレアーゼを使用することもできる。本発明の二次ベクターは、本明細書においてシャトルベクターとして知られており、希少エンドヌクレアーゼ部位が隣接する共通のエンドヌクレアーゼ部位と共にマルチクローニングサイトを含んでいる。シャトルベクターは、希少部位間の共通エンドヌクレアーゼ部位へＤＮＡのクローニング断片をクローニングするために設計されている。クローニングされた断片は引き続き、１又は複数の希少エンドヌクレアーゼ部位での切断によって遊離され、シャトルベクターに見出される１又は複数の同じ希少エンドヌクレアーゼ部位を用いてドッキングプラスミドへ組み込むことができる。
【００９０】
このように、従来のクローニングベクターと異なり、ＭＣＳの設計によって「カセット」すなわち、ＤＮＡ断片のモジュールをドッキングプラスミドのモジュラー領域へ挿入することが可能になる。同様に、各々を同じ希少エンドヌクレアーゼ酵素を用いて容易に除去して、目的とする他の何れかのＤＮＡ断片と置換することができる。この特徴によって、使用者がＤＮＡコンストラクト全体を再び作り上げる必要なしに実験計画の方向を迅速且つ容易に変更することが可能になる。このように、本発明のクローニングベクタープラスミドは、使用者が共通のエンドヌクレアーゼ部位を用い、カセット−受容モジュールを創出してＤＮＡ断片を中間ベクターへクローニングして、その後希少エンドヌクレアーゼ部位によって最終コンストラクトの所望のモジュラー部位にその断片を移行させることを可能にする。さらに、それによってドッキングプラスミド内の個々のモジュールを他のカセットモジュールと置換するように分子を後から改変することが可能になる。以下の説明で、従来の技術と比較した本発明の特徴を明らかにする。
【００９１】
トランスジーンの個々の成分（プロモーターエンハンサーＰ、発現タンパク質Ｅ、及び／又は３’調節領域３）を、シャトルベクターからＰＥ３ドッキングステーションプラスミドへ移行されるモジュールとして組み立てることができる。より高次の複雑性が必要とされるのであれば、組み立てられたトランスジーン、又は他のヌクレオチド配列を、その後一次ドッキングプラスミドへ移行することができる。５つの種のクローニングベクタープラスミドの各々を各々へ組み込まれる成分の理解を図るためにさらに詳細に説明する。まず、より複雑なＰＥ３ドッキングステーションプラスミド及び一次ドッキングプラスミドから始める。
【００９２】
ＰＥ３ドッキングプラスミドは、以下のように修飾されたｐＵＣ１９骨格を含み、配列はｐＵＣ１９ Ｇｅｎｂａｎｋ配列ファイル、受入番号＃Ｌ０９１３７に従って番号付けをしている。
【００９３】
１．８０６から２６１７まで（Ａｆｌ３−Ａａｔ２）の配列のみをドッキングプラスミドに使用し、
【００９４】
２．ｐＵＣ１９の１７２９ｂｐのＢｓｐＨ１部位はＴＣＡＴＧＡからＧＣＡＴＧＡに変異させ、
【００９５】
３．ｐＵＣ１９の１４９３ｂｐのＡｃｌ１部位はＡＡＣＧＴＴからＡＡＣＧＣＴに変異させ、
【００９６】
４．ｐＵＣ１９の１１２０ｂｐのＡｃｌ１部位をＡＡＣＧＴＴからＣＡＣＧＣＴに変異させ、
【００９７】
５．ｐＵＣ１９のＡｈｄ１部位をＧＡＣＮＮＮＮＮＧＴＣからＣＡＣＮＮＮＮＮＧＴＣに変異させ、
【００９８】
６．ＢｓｐＨ１／Ｉ−Ｐｐｏ１／ＢｓｐＨ１をコードする配列を、上記リストの突然変異工程２の後に、ｐＵＣ１９の残りのＢｓｐＨ１部位のみに挿入する。
【００９９】
ＰＥ３ドッキングプラスミドのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、列記された順に以下の連鎖エレメントを含む。
【０１００】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する３つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（ＡａｔＩＩ、ＢＩｐＩ、及びＥｃｏＯ１０９Ｉと示すが、これらに限定されることはない）；
【０１０１】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１０２】
３．ユニークなＨＥ部位（例えば、Ｉ−Ｓｃｅｌ（順方向））；
【０１０３】
４．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭ Ｄ−１）として働くことができるランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩ）；
【０１０４】
５．プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）；
【０１０５】
６．プロモーター／イントロンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−Ｐ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１０６】
７．プロモーター／イントロンモジュールの３’部分と発現モジュールの５’部分との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭＩｕＩ）；
【０１０７】
８．発現アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−Ｅ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１０８】
９．発現モジュールの３’部分と３’調節モジュールの５’部分のジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｌＩ）；
【０１０９】
１０．３’調節ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−３）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１１０】
１１．３’調節モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｗａＩ、ＲｓｒＩＩ、及びＢｓｉＷＩ）；
【０１１１】
１２．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭＤ−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ）；
【０１１２】
１３．前記項目３のものと同じ、逆方向のユニークなＨＥ部位；
【０１１３】
１４．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１１４】
１５．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する４つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ、ＰｍｅＩ、ＳａｐＩ、及びＢｓｐＨＩ）。
【０１１５】
一次ドッキングプラスミドは、ＰＥ３ドッキングステーションプラスミドで最初に構築される２つの完成トランスジーン、若しくは遺伝子ターゲティングトランスジーンを構築するのに必要な２つの相同性アームを組み立てるのに、又は２つの種のポジティブ若しくはネガティブセレクションエレメントを導入するのに使用することができる。一次ドッキングプラスミド内のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、列記の順に以下の連鎖エレメントを含む。
【０１１６】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔＩｌ及びＢＩｐＩ）；
【０１１７】
２．Ｍ１３リバースプライマーサイト；
【０１１８】
３．ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＧＥＨ−Ｓ１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ；
【０１１９】
４．ＨＥの対の下流でシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１２０】
５．左組換えアームモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）；
【０１２１】
６．左組換えアームアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＬＲＡ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１２２】
７．左組換えアームアクセプタモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、ＭＩｕＩ、及びＡｓｃｌ）；
【０１２３】
８．ユニークなＨＥ部位（例えば、Ｉ−ＣｅｕＩ（順方向））；
【０１２４】
９．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭＤ−１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩ）；
【０１２５】
１０．Ｔ７プライマーサイト；
【０１２６】
１１．複合トランスジーンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＰＥ３−１）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなＢｓｔＸＩ部位（ＢｓｔＸＩ認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配列された２つの同じＨＥ認識部位の配列によって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドによって規定される；例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩ（順方向）及びＰＩ−ＳｃｅＩ（逆方向））；
【０１２７】
１２．複合トランスジーンアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＰＥ３−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位；
【０１２８】
１３．逆方向のＴ３プライマーサイト；
【０１２９】
１４．クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＣＭ Ｄ−２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ）；
【０１３０】
１５．上述した項目８のものと同一の、逆方向のユニークなＨＥ部位；
【０１３１】
１６．右組換えアームモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、及びＮｏｔＩ）；
【０１３２】
１７．右組換えアームアクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＲＲＡ）として働くことができるランダムヌクレオチド配列；
【０１３３】
１８．右組換えアームアクセプタモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＲｓｒＩＩ、ＳｗａＩ、及びＢｓｉＷＩ）；
【０１３４】
１９．シャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１３５】
２０．ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュール（ＲＮＡＳ−ＧＥＨ−Ｓ２）として働くことができるＤＮＡのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位；
【０１３６】
２１．逆方向に配置された、Ｍ１３フォワードプライマーサイト；及び、
【０１３７】
２２．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する３つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ、ＳａｐＩ、及びＢｓｐＨＩ）。
【０１３８】
本発明の３つのクローニングベクタープラスミドは、シャトルベクターとして知られている。シャトルベクターは、ＰＥ３及び一次ドッキングプラスミド同様、やはりｐＵＣ１９骨格から構築されている。まさしくＰＥ３及び一次ドッキングプラスミドと同じように、各シャトルベクターには前記１〜６のように列記したように、ｐＵＣ１９骨格に同じ修飾がなされている。個々のシャトルベクター（ＳＶ）は、シャトルベクタープロモーター／イントロン（Ｐ）、シャトルベクター発現（Ｅ）、及びシャトルベクター３’調節（３）（以下、それぞれＳＶＰ、ＳＶＥ、及びＳＶ３）として同定される。各々を、以下にさらに詳説する．
【０１３９】
シャトルベクターＰ（ＳＶＰ）：
【０１４０】
ＳＶＰは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のプロモーター及びイントロン配列を調製するのに使用することのできるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶＰプラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。
【０１４１】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔｌＩ及びＢｌｐＩ）；
【０１４２】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１４３】
３．Ｔ７プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする、非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１４４】
４．プロモーターモジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩ、及びＳｂｆＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２のプロモーターベクターの５’端で星印により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１４５】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団を含む可変ＭＣＳ；
【０１４６】
６．プロモーターモジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭＩｕＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２のプロモーターベクターの３’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１４７】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１４８】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び
【０１４９】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ及びＳａｐＩ）。
【０１５０】
シャトルベクターＥ（ＳＶＥ）：
【０１５１】
これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のトランスジーンによって発現されるべき配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶＥプラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。
【０１５２】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔｌＩ及びＢｌｐ＼Ｉ）；
【０１５３】
２．ＴＪプライマーサイト；
【０１５４】
３．Ｔ７プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、Ｅｃｏ０１０９＼Ｉ）；
【０１５５】
４．発現モジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｇｒＡＩ、Ａｓｃｌ、及びＭｌｕＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の発現ベクターの５’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１５６】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変ＭＣＳ；
【０１５７】
６．発現モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｉＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の発現ベクターの３’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１５８】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１５９】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１６０】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性且つユニークな共通の制限部位（例えば、Ｐｍｅｌ及びＳａｐｌ）。
【０１６１】
シャトルベクター３（ＳＶ３）：
【０１６２】
これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用の３’調節配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。ＳＶ３プラスミドの例では、列記の順にＭＣＳ内に以下のエレメントを含むことができる。
【０１６３】
１．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する５’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡａｔＩＩ及びＢｌｐＩ）；
【０１６４】
２．Ｔ７プライマーサイト；
【０１６５】
３．Ｔ７プライマーの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＥｃｏＯ１０９Ｉ）；
【０１６６】
４．３’調節モジュールの５’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、及びＳａｉＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の調節ベクターの５’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１６７】
５．シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変ＭＣＳ；
【０１６８】
６．３’調節モジュールの３’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団（例えば、ＳｗａＩ、ＲｓｒＩＩ、及びＢｓｉＷＩ）。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図２の調節ベクターの３’端で四角形により示されるドッキングポイントを提供する；
【０１６９】
７．Ｔ３プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＢｓｐＥＩ）；
【０１７０】
８．逆方向のＴ３プライマーサイト；及び、
【０１７１】
９．前記の変異型ｐＵＣ１９ベクターに対する３’挿入部位を規定する２つの非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＰｍｅＩ及びＳａｐＩ）。
【０１７２】
本発明は、プラスミドクローニングベクターにおいてトランスジーンを作り上げるための方法を開示するが、コスミドなどの大きな染色体外ＤＮＡ分子、又は細菌性人工染色体（ＢＡＣ）を含む人工染色体においてトランスジーンを作り上げるのに、類似の方法を使用することができる。植物で使用するには、Ｔ１ベクターも使用してよい。プラスミドクローニングベクターへ組み込むことのできる多種多様な遺伝子エレメントによっても、ほとんど又は全くさらに操作することなく、多種多様な宿主生物への最終トランスジーン産物の移行が可能となる。
【０１７３】
図２及び３は、本発明のモジュール方式の一般的な図である。図２に示すとおり、プロモーター、発現、及び３’調節シャトルベクターの各々一つが存在する。シャトルベクター内で隣接する各インサートは、ドッキングポイントを創出するのに特異的なエンドヌクレアーゼ制限部位である。さらに詳細には、図２で、プロモーターインサート（Ｐ）は５’端で星印により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第一群と、３’端で円形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群に隣接しており；発現モジュールは５’端で円形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群と、３’端で三角形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群に隣接しており；３’調節モジュール（３）は５’端で三角形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群と、３’端で四角形により示される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第四群に隣接している。その部位に特異的なエンドヌクレアーゼによって各エンドヌクレアーゼ認識部位を切断すると、一点鎖線矢印の末端のインサートにより図２の底部に示されるように、各モジュールの５’及び３’端で粘着末端が創出される。そうすればモジュールは、エンドヌクレアーゼ制限部位（星印で示す）の第一群及びエンドヌクレアーゼ制限部位（四角形で示す）の第四群に対して特異的なエンドヌクレアーゼによって、やはりその２つの固定されたドッキングポイントで切断されているクローニングベクタープラスミドと貼合せることができる。モジュラーベクターをクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物中に入れると、各モジュラーベクターの切断された粘着末端（白抜きの星印、円形、三角形、及び四角形で示す）はプラスミド内で自己配向して、切断された星印末端の貼合せ、切断された円形末端の貼合せ、切断された三角形末端の貼合せ、及び切断された四角形末端の貼合せと、順次連結することになる。この結果、図３に示す、組み立てられた骨格ベクターが得られる。さらに、星印、円形、三角形、及び四角形で示されるエンドヌクレアーゼ部位の組み合わされた群の各々は、特定のインサートを後から除去して目的とするインサートと置換できるように、その対応する特異的エンドヌクレアーゼにより再度切断することができる。
【０１７４】
複数の骨格ベクター（例えば、ＰＥ３−１及びＰＥ３−２）は、単一のドッキングプラスミドへ挿入することができる。Ｉ−ＳｃｅＩなどのエンドヌクレアーゼの突出尾部の非対称性は、他のＨＥでの場合と同様に、ＢｓｔＸＩエンドヌクレアーゼ酵素部位（５’ＣＣＡＮＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ３’、配列中「Ｎ」は何れのヌクレオチドでもありうる）と組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。ＢｓｔＸＩの配列中立ドメインを使用して、自己アニーリングを防止しつつも、２つの逆方向性Ｉ−ＳｃｅＩ突出尾部に対して適合可能な付着末端を生成させることができる。この方法で、第一インサート、ＰＥ３−１（その末端でｌ−Ｓｃｅ−１部位を有している）は、Ｂｓｔｘｉ／Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼ部位でそのプラスミドを切断することによってクローニングベクタープラスミドに配置することができる。次いで、Ｉ−Ｓｃｅｌで再度切断して、その端部にｌ−Ｓｃｅ−１部位を有するＰＥ３−２を挿入することができる。この骨格全体は、次いでＰＩ−ＳｃｅＩによってそのドッキングプラスミドから切り出して、ＢｓｔＸｌ／ＰＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含む別のドッキングプラスミドへ挿入することができる。この第二のドッキングプラスミドもまた、ＰＩ−ＳｃｅＩに対するエンドヌクレアーゼ部位を有しており、その中に別のドッキングプラスミド用のさらに他のモジュールで、ＰＥ３−３及びＰＥ３−４を含む可能性のあるものを挿入することができる（図示せず）。このようにして、研究者はより多くの情報を一細胞に入れ込むことができ、すなわち、複数の遺伝子を単一ベクターのコンテクスト内に挿入することができるが、これは当業者によって従前に成し遂げられているものではない。このような新規のプロセスによって、当該分野での研究者の仕事のための金銭と時間の双方を節約することができる。
【実施例】
【０１７５】
実施例１：ＰＥ３ドッキングプラスミド
【０１７６】
本発明を実施する方法の例として、これらのエレメントを含むトランスジーンを構築することができる。
【０１７７】
１．界面活性タンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）に対するヒトプロモーターのヌクレオチド配列；
【０１７８】
２．マウス遺伝子顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子−レセプターβｃ（ＧＭＲβｃ）のタンパク質産物をコードする配列；
【０１７９】
３．ウサギβグロビンのイントロン配列；及び
【０１８０】
４．ＳＶ４０ポリ−Ａシグナル。
【０１８１】
ＳＰ−Ｃ配列は、内部ＢａｍＨ１部位を含んでおり、またＮｏｔ１とＥｃｏＲ１とだけでその親プラスミドから遊離させることができる。ＧＭＲβｃは、内部Ｎｏｔ１部位を有しており、その親プラスミドからＢａｍＨ１及びＸｈｏ１で切り出することができる。ウサギベータグロビンイントロン配列は、その親プラスミドからＥｃｏＲ１で切り出すことができる。ＳＶ−４０ポリＡ尾部は、Ｘｈｏ１及びＳａｃ１でその親プラスミドから切り出すことができる。エンドヌクレアーゼ部位のいくつかが多く存在するゆえに、親プラスミドのいずれも、必要な断片すべてを組み立てるのに使用することができない。
【０１８２】
ＰＥ３ドッキングプラスミド発明において所望のトランスジーンを作り上げるのに使用する工程は以下のとおりである。
【０１８３】
１．Ｎｏｔ１及びＰｓｐＯＭＩは適合可能な付着末端を生成させるので、ヒトＳＰ−Ｃプロモーター配列はＮｏｔ１及びＥｃｏＲ１で切り出して、シャトルベクターＰのＰｓｐＯＭＩ及びＥｃｏＲ１部位へクローニングする。この反応の産物は、ｐＳＶＰ−ＳＰＣと称される。
【０１８４】
２．当業者に良く知られた増殖及び回収工程の後に、ウサギβグロビンイントロン配列をｐＳＶＰ−ＳＰＣのＥｃｏＲ１部位へクローニングする。得られる中間コンストラクトでのイントロンの方向は産物を配列決定することによって確かめられ、ｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧと称される。
【０１８５】
３．ＡｓｉＳ１及びＡｓｃ１を用い、ｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧからプロモーター及びイントロンを切り出して、１つの連続断片として単離する。同時に、プロモーター／イントロンセグメントのライゲーション用の調整のため、ＡｓｉＳ１及びＡｓｄでＰＥ３ドッキングプラスミドを切り出す。プロモーター／イントロン断片をドッキングプラスミドへつなぎ、増やして回収する。
【０１８６】
４．当業者に良く知られた技術を用いてＧＭＲβｃ断片のＸｈｏ１部位を埋め、平滑３’端を創出する。それを次いでｐＳＶＰ−ＳＰＣ−ｒβＧのＢａｍＨ１部位と平滑断端Ｐｖｕ２部位へクローニングする。得られたプラスミド（ｐＤＰ−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧ）を増やして回収した。
【０１８７】
５．最終クローニング工程は、ＳＶ−４０ポリＡＡ尾部の付加である。レシピエントベクターｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒｂβＧと同様に、ＳＶ４０−ポリＡ断片を、Ｘｈｏ１及びＳａｃ１で切り出す。ＤＮＡの片の双方をゲルで精製して回収する。ライゲーション混合液を、ＳＶ−４０ポリＡのｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧに対するモル比１０：１にて調製する。ライゲーション産物を増やして回収する。新しいプラスミド、ｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲββｃ−ｒβＧ−ｐＡは、３’端のユニークなエンドヌクレアーゼ部位を含め、トランスジーンに必要とされる全てのエレメントを含み、これを用いてｐＤＳ１−ＳＰＣ−ＧＭＲβｃ−ｒβＧ−ｐＡプラスミド全体を真核細胞へのトランスフェクション又は受精卵の前核へのマイクロインジェクション用に線状化することができる。
【０１８８】
実施例２：ダイナミックなベクター構築
【０１８９】
ダイナミックなベクター構築を、以下の実施例に示す。
【０１９０】
１．ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列を、５’及び３’部分にそれぞれＡｓｉＳＩ及びＡｓｅＩエンドヌクレアーゼを有するＰシャトルベクター（ＳＶＰ）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、プロモーターモジュールをＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９１】
２．ルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を、５’及び３’部分にそれぞれＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼを有する発現シャトルベクター（ＳＶＥ）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、発現モジュールをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９２】
３．哺乳類イントロン及びＳＶ４０ポリアデニル化サイトをコードする配列を、５’及び３’部分にそれぞれＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有する３’調節シャトルベクター（ＳＶ３）内に挿入する。プラスミドを増幅させ、調節モジュールをＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。
【０１９３】
４．プロモーターモジュールの５’部分及びレギュレーターモジュールの３’部分で、それぞれＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有するドッキングベクタープラスミドのエンドヌクレアーゼ認識部位を、ＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼで切り出し、単離する。
【０１９４】
５．プロモーター、発現、及び調節モジュールをライゲーション混合物においてドッキングベクタープラスミドと組み合わせる。２時間のインキュベーション後に、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドが３つのモジュラーインサート（プロモーター、発現及び調節）を含む否かを判定する。３つのモジュラーインサートを含むプラスミドは、トランスジーンｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ＳＶ４０ ｐＡとして同定される。これは、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを用いて線状化して、ＣＭＶ−ルシフェラーゼマウスを作製すべくマウス前核へ注射することができる。本実施例におけるＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ−ルシフェラーゼマウスなどの宿主生物のすべての組織でルシフェラーゼ遺伝子の発現を指向する。
【０１９５】
実施例３：ダイナミックなベクター構築の再設計
【０１９６】
もし研究者が今度は特定の組織又は細胞型のみでルシフェラーゼが発現されるように発現パターンを改良することを望めば、ＣＭＶプロモーターを、限定された発現パターンをもたらすものに迅速且つ容易に置き換えることができる。以下の実施例で、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ｐＡの迅速な再設計を円滑にするための本発明の使用を示す。
【０１９７】
１．ニューロン特異的プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を、Ｐシャトルベクター（ＳＶＰ）に挿入して、前記実施例のプロモーターモジュールとして調製する。
【０１９８】
２．ｐＣＭＶ−ｌｕｃ−ｐＡを、ＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩで切断して、ＣＭＶプロモーターモジュールを除く。完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りを単離する。
【０１９９】
３．ＮＳＥプロモーターモジュールを、完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りと共にライゲーション混合物に入れる。２時間インキュベートした後、その新しいライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換する。大腸菌混合物を、前記実施例と同様にアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。コロニーを翌日に単離し、増やして、各々からプラスミドＤＮＡを単離する。エンドヌクレアーゼマッピングを使用して、所望のＮＳＥプロモーターモジュールを含むプラスミドを同定する。
【０２００】
実施例４：トランスジーンのアレイ
【０２０１】
以下の実施例は、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを各々含んでいるトランスジーンのアレイを迅速に組み立てるための、本発明の使用を例示するものである。一連の６つのシャトルベクターとＰＥ３ドッキングステーションベクターを使用し、コンビナトリアルアセンブリを用いて８つの異なるベクター産物を作製する。一連の６つのシャトルベクターは、２つのＰ−シャトル（ＳＶＰ）、２つのＥ−シャトル（ＳＶＥ）、及び２つの３−シャトル（ＳＶ３）からなる。２つの別異のＰ−シャトル（ＳＶＰ）は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はマウスＳＰＣ肺−特異的プロモーターの何れかを含み、各々は５’及び３’部分にそれぞれＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼを有している。２つの別異のＥ−シャトルは、ルシフェラーゼｃＤＮＡ又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡの何れかを含み、各々は５’及び３’部分にそれぞれＡｓｃＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼを有している。２つの別異の３−シャトルベクターは、ＳＶ４０ポリＡシグナル又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３’調節領域の何れかを含み、各々は、５’及び３’部分にそれぞれＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩエンドヌクレアーゼを有している。
【０２０２】
プロモーターモジュールは、適切なシャトルベクターをＡｓｉＳＩ及びＡｓｃＩエンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのＳＶＰシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切なプロモーターモジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ＣＭＶプロモーターモジュール、又はＡｓｉＳＩ突出が５’側及び３’端にＡｓｃＩ突出が結合したＳＰＣプロモーターモジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０３】
発現モジュールは、適切なシャトルベクターをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのＳＶＥシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な発現モジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ルシフェラーゼ発現モジュール、又はＡｓｃＩ突出が５’側及び３’端にＮｏｔＩ突出が結合したＥＧＦＰ発現モジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０４】
３’調節モジュールは、適切なシャトルベクターをＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼで個々に消化することによって、それらのそれぞれのＳＶ３シャトルベクターから遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な３’調節モジュールに対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ＳＶ４０ ３’調節モジュール、又はＮｏｔＩ突出が５’側及び３’端にＢｓｉＷＩ突出が結合したｈＧＨ ３’調節モジュールのいずれかが得られることになる。
【０２０５】
ＰＥ３ドッキングステーションベクターは、ＡｓｉＳＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって調製する。後からのベクターの再度のライゲーション防止に資するために、ベクター制限消化物を、３７℃で１時間、ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）に曝す。得られたＣＩＰ処理済みのベクター制限産物は、次いでゲル電気泳動に付し、線状化ＰＥ３ベクター骨格に対応するＤＮＡバンドをゲル精製に付す。
【０２０６】
得られた、ゲルで精製した７つのＤＮＡ断片からの試料を、診断電気泳動ゲルに流すことにより、同一性、完全性、純度、及び量について分析する。精製したＰＥ３ドッキングステーションベクター及び個々のＤＮＡモジュールの相対存在度に関する定量データを使用して、コンビナトリアルライゲーション反応に必要な各成分の量を規定する。
【０２０７】
ライゲーション反応を構成する場合、好結果がもたらされることの多い戦略が２つある。第一の戦略は、インサート対ベクターの比が約３：１であるライゲーション反応混合物を構成することである。１以上のインサートが単一のベクターに同時に導入されている場合に用いる第二の戦略は、ベクターへ挿入される予定の各遺伝子モジュールを、モル当量導入することである。これは、ライゲーション反応混合物に照らしてモル当量とするために可変体積のモジュールを反応容器に加えるか、又は中性緩衝液溶液を精製されたモジュールの各々にそれらの濃度がモル比基準で等量となるように添加することのいずれかによって成し遂げることができる。本実施例では、ゲルで精製したベクター及びインサート断片はすべて、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０の緩衝液を用いてモル当量に調整している。ライゲーション反応の総体積は１５０マイクロリットルに設定する。ライゲーション反応混合物は、以下の構成成分からなる：３９マイクロリットルの超純水、１５マイクロリットルの１０×リガーゼ緩衝液、５マイクロリットルの精製したＰＥ３ベクター骨格、１５マイクロリットルの精製したＣＭＶプロモーターモジュール、１５マイクロリットルの精製したＳＰＣプロモーターモジュール、１５マイクロリットルの精製したルシフェラーゼ発現モジュール、１５マイクロリットルの精製したＥＧＦＰ発現モジュール、１５マイクロリットルの精製したＳＶ４０ ３’調節モジュール、１５マイクロリットルの精製したｈＧＨ ３’調節モジュール、及び１マイクロリットルのリガーゼ酵素。得られた反応成分を十分に混合して、その後１６℃にて終夜インキュベートする。
【０２０８】
予想されるベクターライゲーション産物は次のものを含む：
ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０
ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｈＧＨ
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ｈＧＨ
ｐＳＰＣ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０
ｐＳＰＣ−ＥＧＦＰ−ｈＧＨ
ｐＳＰＣ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０
ｐＳＰＣ−ルシフェラーゼ−ｈＧＨ
【０２０９】
次いで、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーへ取り込まれた、得られたベクターの同一性を判定する。
【０２１０】
前記実施例では、予測されたベクター産物の１つ（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０）は第一コンビナトリアルプロセスの間に生産されることがなかった。しかしながら、成功裡に生産された１つのベクター（ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０）は、所望のｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ベクターを生産するためのベクター骨格として働くことができる。この技術を、「第二パス組立て」と称することができる。
【０２１１】
実施例５：第二パス組立て
【０２１２】
所望のｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ベクターを作り上げるために、実施例４のｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＳＶ４０ベクター産物をＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで消化して、ＣＩＰ処理し、引き続きゲルで精製した。ルシフェラーゼモジュールが除去されている、この線状化したベクター断片をコンビナトリアルベクター構築の前記実施例で生産されたＥＧＦＰモジュールを含むライゲーション混合物中でインキュベートした。
【０２１３】
ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに播種する。プレートを３７℃で終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体ＬＢブロス培養液で増殖させる。プラスミドＤＮＡを各ＬＢブロス培養から単離する。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドがＥＧＦＰインサートを含むか否かを判定する。
【０２１４】
本発明の多くの利点のうち、各々、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを含むトランスジーンのアレイを迅速に非常に短時間で組み立てることができるのみならず、迅速且つ容易に新しい組立トランスジーンを変更又は再設計できることは、容易に理解されうるものである。従来は、各々、異なるプロモーター、発現、及び調節モジュールを有する、異なるトランスジーンのアレイを創出するための既知の方法を使用して、組み立てられたトランスジーンを変更することは、通常１年以上の実験時間がかかったはずである。本発明の方法を使用して、同数の所望のトランスジーンを数日又は数週間以内に作り、次いで各々の所望の試験を行い、これにより研究者は以前要した長時間を節約することができる。さらに、プロモーター、発現及び調節インサートの各々一つを同時に単一骨格へ挿入することができるダイナミックなベクター構築と、２つのＰ−シャトル、２つのＥ−シャトル、及び２つの調節シャトルをすべて組み合わせて８つの異なる型のトランスジーンを創出する前記の組合せ法の双方を、研究者が貴重な時間と金銭を節約するために使用することができる。元々ｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及びＰＣＲターミネーター突出クローニング法によって創出されたシャトルを取り上げて、これらの予製エレメントを多数のトランスジーンで迅速に組み立てる、本発明のドッキングポイント技術で用いることができる。
【０２１５】
本発明は、その実施態様の記載によって説明されており、実施態様が詳細に記載されているが、添付の請求の範囲をこのような詳細に制限又はいかようにも限定することは意図されていない。さらなる利点及び変更が、当業者に容易に明らかになることであろう。従って、本発明はその大局的な特徴において、特定の詳細、代表的な方法及び構造、並びに示され記載されたような説明された例に限定されることはない。従って、出願人の一般的発明概念の範囲又は精神から逸脱することなく、かかる詳細から逸脱してもかまわない。
【０２１６】
本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の実施態様を示して、さらに上記本発明の一般的な説明、及び以下の詳細な説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジーンを構築するための方法であって、
ａ）連続したインサートの配列を受容可能な骨格を有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、少なくとも第一のインサート及び第二のインサートを用意する工程；及び、
ｃ）単一の反応により、前記第一のインサート及び前記第二のインサートを前記骨格に移行させる工程を含む方法。
【請求項２】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、第一のヌクレオチド配列を第一のシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、第二のヌクレオチド配列を第二のシャトルベクターに導入する工程；及び、
ｄ）前記第一のヌクレオチド配列と前記第二のヌクレオチド配列を、同時に、前記シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項３】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、プロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターに導入する工程；及び、
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、調節シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項４】
トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有する一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、少なくとも一のプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターに導入する工程；
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、及び調節シャトルベクターから、前記クローニングプラスミドの前記第一及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程；及び、
ｆ）一のプロモーターモジュール、一の発現モジュール、及び一の調節モジュールのうち少なくとも二つが、それぞれの一次クローニングベクター分子に移行する方法。
【請求項５】
トランスジーン、又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するためのモジュラークローニングベクターを作成するための方法であって、
ａ）骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は第一、及び第二のドッキングポイントを含み、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定されていて、エンドヌクレアーゼに対する少なくとも一の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含む工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを、前記第一のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第一のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、３’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを、前記第二のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第二のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、５’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｄ）第一、及び第二のインサートを用意する工程であって、それぞれのインサートは５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有し、前記第一のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第二のインサートの３’末端は、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能であって、前記第一のインサートの３’末端と前記第二のインサートの５’は適合可能であって、第三のエンドヌクレアーゼ酵素に対する第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を形成する工程；及び、
ｅ）インサートと切断したクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一、及び第二のインサートの、骨格内の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での自己配向、前記第一、及び第二のドッキングポイントの再形成、及び、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項６】
修飾したクローニングベクタープラスミド分子を提供する請求項５に記載の方法であって、更に、
ｆ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第一、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第一のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第一のインサートを除去し、切断された第一のドッキングポイントにおける３’末端と、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における５’末端を生成する工程；
ｇ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第三のインサートを用意する工程であって、前記第三のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第三のインサートの３’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｈ）前記第三のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼ部位との間における前記第三のインサートの自己配向、及び、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼサイトの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項７】
修飾したモジュラークローニングベクタープラスミドを提供する請求項５に記載の方法であって、更に、
ｉ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第二、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第二のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第二のインサートを除去し、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における３’末端と、切断された第二のドッキングポイントにおける５’末端を生成する工程；
ｊ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第四のインサートを用意する工程であって、前記第四のインサートの５’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位と適合可能であって、前記第四のインサートの３’末端は切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｋ）前記第四のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第三のエンドヌクレアーゼ部位と前記第二のドッキングポイントとの間における前記第四のインサートの自己配向、及び前記第三のエンドヌクレアーゼ部位、及び前記第二のドッキングポイントの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項８】
インサートがｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及びＰＣＲターミネーター突出クローニングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するための方法であって、
ａ）骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを有し、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定され、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の希少制限部位を有する工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを前記第一のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第一の非可変性希少制限酵素で切断し、３’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを前記第二のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第二の非可変性希少制限酵素で切断し、５’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｄ）目的とするプロモーター配列、前記第一のドッキングポイントの３’末端に適合可能な５’末端、及び３’末端を有するプロモーターインサートを用意する工程；
ｅ）目的とする発現配列、プロモーターインサートの３’末端と適合可能で、第三の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び３’末端を有する発現インサートを用意する工程；
ｆ）目的とする調節配列、発現インサートの３’末端と適合可能で、第四の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び、工程「ｃ」で切断された、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能な３’末端を有する調節インサートを用意する工程；
ｇ）前記プロモーター、発現、及び調節インサートと切断されたクローニングプラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間におけるプロモーター、発現、及び調節インサートの自己配向と、連鎖配置と、を引き起こし、第一、及び第二のドッキングポイントを再形成し、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項１０】
修飾したモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項９に記載の方法であって、更に、
ｈ）モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを一対の希少制限酵素を用いて、プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも一が有する一対の希少制限部位で切断し、３’末端と５’末端を有する切断されたベクタープラスミドを生成する工程；
ｉ）プロモーターインサート、発現インサート、調節インサートから選択される一の第五のインサートを用意する工程であって、前記第五のインサートは切断されたベクタープラスミドの３’末端に適合可能な５’末端、及び切断されたベクタープラスミドの５’末端に適合可能な３’末端を有する工程；及び
ｊ）前記第五のインサートと切断されたベクタープラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、同じ配列で、前記モジュラー一次クローニングベクタープラスミドでの前記第五のインサートの自己配向と、及び一対の制限部位の再形成とを行う工程を含む方法。
【請求項１１】
更に、工程ｈ、ｉ、及びｊをプロモーターインサート、発現インサート、及び調節インサートから選ばれる、一又はそれ以上の追加のインサートを用いて、繰り返す工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトのアレイを同時に合成する方法であって、
ａ）５’末端、目的のヌクレオチド配列、及び３’末端を含むインサート挿入することができる骨格を含む少なくとも一の一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は、連続した配置のプロモーター、発現、及び調節インサートを受容可能であって、第一、及び第二のドッキングポイントを含み、各ドッキングポイントは骨格内に固定されており、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の制限部位を有している工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第一のドッキングポイントを切断する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第二のドッキングポイントを切断する工程；
ｄ）プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一のプロモーターインサートを用意する工程であって、少なくとも一のプロモーターインサートの５’末端は、工程「ｂ」で切断された、前記第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能である工程；
ｅ）発現ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の発現インサートを用意する工程であって、少なくとも一の発現インサートの５’末端は、少なくとも一のプロモーターインサートの３’末端と適合可能であり、第三の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成する工程；
ｆ）調節ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の調節インサートを用意する工程であって、少なくとも一の調節インサートの５’末端は、少なくとも一の発現インサートの３’末端と適合可能であり、第四の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し、少なくとも一の調節インサートの３’末端は、工程「ｃ」で切断された、前記第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｇ）その後、少なくとも一の前記プロモーター、発現、及び調節インサートとの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する工程を含む方法。
【請求項１３】
工程「ｇ」において、少なくとも二つの前記プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程「ｇ」において、前記プロモーター、発現、及び調節インサートのそれぞれの少なくとも異なる二種と、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
修飾されたモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項１２、１３、又は１４に記載の方法であって、更に、
ｈ）ハイスループットスクリーニングにより工程「ｇ」の生成物を検査する工程；
ｉ）一次クローニングベクタープラスミドである、工程「ｇ」の特定の生成物を単離する工程；
ｊ）工程「ｉ」の一次クローニングベクタープラスミドの骨格を、前記プロモーター、発現、調節インサートの一つの５’端と３’端において、これに対応する一対の希少制限酵素により切断する工程；
ｋ）第六のインサートを用意する工程であって、前記第六のインサートの５’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の３’末端と適合可能であって、前記第六のインサートの３’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｌ）その後、前記第六のインサートと工程「ｊ」で切断された骨格とを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第六のインサートの前記骨格への自己配向を行う工程を含む方法。
【請求項１６】
前記骨格において、連続的に一つのインサートをもう一つのインサートに置き換えるため、更に、任意の数のインサートについて、工程ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、及びｌを繰り返し行う工程を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
インサートがｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、ＰＣＲターミネーター突出クローニング技術、及び制限エンドヌクレアーゼマッピングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項５、９、又は１２のいずれかに記載の方法であって、前記骨格が更に、前記第一のドッキングポイントの５’末端の上流に位置する順方向のユニークなＨＥ部位、及び前記第二のドッキングポイントの３’末端の下流に位置する逆方向のユニークなＨＥ部位を有し、前記方法は、更に、
ｍ）前記骨格をユニークなＨＥ制限酵素を用いて、それぞれのユニークなＨＥ部位で切断する工程；
ｎ）インサートを含む切断片を精製する工程；及び、
ｏ）前記切断片を目的のゲノム宿主に挿入する工程を含む方法。
【請求項１】
トランスジーンを構築するための方法であって、
ａ）連続したインサートの配列を受容可能な骨格を有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、少なくとも第一のインサート及び第二のインサートを用意する工程；及び、
ｃ）単一の反応により、前記第一のインサート及び前記第二のインサートを前記骨格に移行させる工程を含む方法。
【請求項２】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、第一のヌクレオチド配列を第一のシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、第二のヌクレオチド配列を第二のシャトルベクターに導入する工程；及び、
ｄ）前記第一のヌクレオチド配列と前記第二のヌクレオチド配列を、同時に、前記シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項３】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、プロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターに導入する工程；及び、
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、調節シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項４】
トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有する一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、少なくとも一のプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターに導入する工程；
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、及び調節シャトルベクターから、前記クローニングプラスミドの前記第一及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程；及び、
ｆ）一のプロモーターモジュール、一の発現モジュール、及び一の調節モジュールのうち少なくとも二つが、それぞれの一次クローニングベクター分子に移行する方法。
【請求項５】
トランスジーン、又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するためのモジュラークローニングベクターを作成するための方法であって、
ａ）骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は第一、及び第二のドッキングポイントを含み、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定されていて、エンドヌクレアーゼに対する少なくとも一の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含む工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを、前記第一のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第一のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、３’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを、前記第二のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第二のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、５’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｄ）第一、及び第二のインサートを用意する工程であって、それぞれのインサートは５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有し、前記第一のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第二のインサートの３’末端は、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能であって、前記第一のインサートの３’末端と前記第二のインサートの５’は適合可能であって、第三のエンドヌクレアーゼ酵素に対する第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を形成する工程；及び、
ｅ）インサートと切断したクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一、及び第二のインサートの、骨格内の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での自己配向、前記第一、及び第二のドッキングポイントの再形成、及び、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項６】
修飾したクローニングベクタープラスミド分子を提供する請求項５に記載の方法であって、更に、
ｆ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第一、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第一のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第一のインサートを除去し、切断された第一のドッキングポイントにおける３’末端と、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における５’末端を生成する工程；
ｇ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第三のインサートを用意する工程であって、前記第三のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第三のインサートの３’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｈ）前記第三のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼ部位との間における前記第三のインサートの自己配向、及び、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼサイトの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項７】
修飾したモジュラークローニングベクタープラスミドを提供する請求項５に記載の方法であって、更に、
ｉ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第二、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第二のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第二のインサートを除去し、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における３’末端と、切断された第二のドッキングポイントにおける５’末端を生成する工程；
ｊ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第四のインサートを用意する工程であって、前記第四のインサートの５’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位と適合可能であって、前記第四のインサートの３’末端は切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｋ）前記第四のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第三のエンドヌクレアーゼ部位と前記第二のドッキングポイントとの間における前記第四のインサートの自己配向、及び前記第三のエンドヌクレアーゼ部位、及び前記第二のドッキングポイントの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項８】
インサートがｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、及びＰＣＲターミネーター突出クローニングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するための方法であって、
ａ）骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを有し、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定され、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の希少制限部位を有する工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを前記第一のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第一の非可変性希少制限酵素で切断し、３’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを前記第二のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第二の非可変性希少制限酵素で切断し、５’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｄ）目的とするプロモーター配列、前記第一のドッキングポイントの３’末端に適合可能な５’末端、及び３’末端を有するプロモーターインサートを用意する工程；
ｅ）目的とする発現配列、プロモーターインサートの３’末端と適合可能で、第三の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び３’末端を有する発現インサートを用意する工程；
ｆ）目的とする調節配列、発現インサートの３’末端と適合可能で、第四の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び、工程「ｃ」で切断された、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能な３’末端を有する調節インサートを用意する工程；
ｇ）前記プロモーター、発現、及び調節インサートと切断されたクローニングプラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間におけるプロモーター、発現、及び調節インサートの自己配向と、連鎖配置と、を引き起こし、第一、及び第二のドッキングポイントを再形成し、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項１０】
修飾したモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項９に記載の方法であって、更に、
ｈ）モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを一対の希少制限酵素を用いて、プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも一が有する一対の希少制限部位で切断し、３’末端と５’末端を有する切断されたベクタープラスミドを生成する工程；
ｉ）プロモーターインサート、発現インサート、調節インサートから選択される一の第五のインサートを用意する工程であって、前記第五のインサートは切断されたベクタープラスミドの３’末端に適合可能な５’末端、及び切断されたベクタープラスミドの５’末端に適合可能な３’末端を有する工程；及び
ｊ）前記第五のインサートと切断されたベクタープラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、同じ配列で、前記モジュラー一次クローニングベクタープラスミドでの前記第五のインサートの自己配向と、及び一対の制限部位の再形成とを行う工程を含む方法。
【請求項１１】
更に、工程ｈ、ｉ、及びｊをプロモーターインサート、発現インサート、及び調節インサートから選ばれる、一又はそれ以上の追加のインサートを用いて、繰り返す工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトのアレイを同時に合成する方法であって、
ａ）５’末端、目的のヌクレオチド配列、及び３’末端を含むインサート挿入することができる骨格を含む少なくとも一の一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は、連続した配置のプロモーター、発現、及び調節インサートを受容可能であって、第一、及び第二のドッキングポイントを含み、各ドッキングポイントは骨格内に固定されており、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の制限部位を有している工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第一のドッキングポイントを切断する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第二のドッキングポイントを切断する工程；
ｄ）プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一のプロモーターインサートを用意する工程であって、少なくとも一のプロモーターインサートの５’末端は、工程「ｂ」で切断された、前記第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能である工程；
ｅ）発現ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の発現インサートを用意する工程であって、少なくとも一の発現インサートの５’末端は、少なくとも一のプロモーターインサートの３’末端と適合可能であり、第三の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成する工程；
ｆ）調節ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の調節インサートを用意する工程であって、少なくとも一の調節インサートの５’末端は、少なくとも一の発現インサートの３’末端と適合可能であり、第四の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し、少なくとも一の調節インサートの３’末端は、工程「ｃ」で切断された、前記第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｇ）その後、少なくとも一の前記プロモーター、発現、及び調節インサートとの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する工程を含む方法。
【請求項１３】
工程「ｇ」において、少なくとも二つの前記プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程「ｇ」において、前記プロモーター、発現、及び調節インサートのそれぞれの少なくとも異なる二種と、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
修飾されたモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項１２、１３、又は１４に記載の方法であって、更に、
ｈ）ハイスループットスクリーニングにより工程「ｇ」の生成物を検査する工程；
ｉ）一次クローニングベクタープラスミドである、工程「ｇ」の特定の生成物を単離する工程；
ｊ）工程「ｉ」の一次クローニングベクタープラスミドの骨格を、前記プロモーター、発現、調節インサートの一つの５’端と３’端において、これに対応する一対の希少制限酵素により切断する工程；
ｋ）第六のインサートを用意する工程であって、前記第六のインサートの５’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の３’末端と適合可能であって、前記第六のインサートの３’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｌ）その後、前記第六のインサートと工程「ｊ」で切断された骨格とを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第六のインサートの前記骨格への自己配向を行う工程を含む方法。
【請求項１６】
前記骨格において、連続的に一つのインサートをもう一つのインサートに置き換えるため、更に、任意の数のインサートについて、工程ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、及びｌを繰り返し行う工程を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
インサートがｄｅ ｎｏｖｏ合成、組換え、ＰＣＲターミネーター突出クローニング技術、及び制限エンドヌクレアーゼマッピングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項５、９、又は１２のいずれかに記載の方法であって、前記骨格が更に、前記第一のドッキングポイントの５’末端の上流に位置する順方向のユニークなＨＥ部位、及び前記第二のドッキングポイントの３’末端の下流に位置する逆方向のユニークなＨＥ部位を有し、前記方法は、更に、
ｍ）前記骨格をユニークなＨＥ制限酵素を用いて、それぞれのユニークなＨＥ部位で切断する工程；
ｎ）インサートを含む切断片を精製する工程；及び、
ｏ）前記切断片を目的のゲノム宿主に挿入する工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２４０９９（Ｐ２０１２−２４０９９Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２０４８９６（Ｐ２０１１−２０４８９６）
【出願日】平成２３年９月２０日（２０１１．９．２０）
【分割の表示】特願２００７−５２７３８０（Ｐ２００７−５２７３８０）の分割
【原出願日】平成１７年５月１８日（２００５．５．１８）
【出願人】（５０６３８７００７）イントレクソン コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０４８９６（Ｐ２０１１−２０４８９６）
【出願日】平成２３年９月２０日（２０１１．９．２０）
【分割の表示】特願２００７−５２７３８０（Ｐ２００７−５２７３８０）の分割
【原出願日】平成１７年５月１８日（２００５．５．１８）
【出願人】（５０６３８７００７）イントレクソン コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
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