ＥＧＦＲ突然変異を定量的に検出するための試薬キット
本発明は、分子標的抗癌薬の治療効果に関連するＥＧＦＲ遺伝子の突然変異の検出方法及び検出するための試薬キットに関する。特に、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異のホットスポットにおいて、突然変異を検出する蛍光定量ＰＣＲ検出方法、試薬キット及びその応用に関する。本発明はＥＧＦＲ遺伝子の特定部位の突然変異に対して検出するとともに、分子標的抗腫瘍薬ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対してその治療効果を予測し、これによって、腫瘍患者の臨床個別化医療法に指導を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor, ＥＧＦＲ）は、人体の各組織細胞膜上に広く分布する多機能糖タンパク質であって、HER/ErbBファミリーの一つとして、腫瘍の増殖、血管の新生、腫瘍の転移及び抗アポトーシスに関連する。
【０００２】
大部分の腫瘍細胞は、ＥＧＦＲ及びその天然のリガンドを発現し、結合された後に自己リン酸化を引き起こし、一連の反応を経て核内にシグナルを伝達することによって、腫瘍細胞の成長及びアポトーシス、腫瘍血管の形成に影響を与え、そのことで腫瘍の発達及び進行に影響を与える。
【０００３】
ＥＧＦＲが、癌の発生及び発達の段階において重要な役割を果たすことが研究で示された。ＥＧＦＲに対する標的治療薬、例えば、アバスチン（AVASTIN）、タルセバ（エルロチニブ Erlotinib）、ゲフィチニブ（イレッサ Irressa）等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）は、腫瘍細胞ＥＧＦＲのシグナル伝達を遮断することによって、腫瘍細胞の増殖、浸潤、転移、血管の新生を抑制できると共に、腫瘍細胞のアポトーシスを促進できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
しかし、臨床実験において、８〜１８％の非小細胞肺癌患者しかイレッサなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の恩恵を受けることができない（Pazez JGら，Science, 2004年，304：1497-1500；Sequist LVら，Oncologist, 2007年，12（1）：90-8）。目下、突然変異したＥＧＦＲ遺伝子を持つ患者に対する治療効果が顕著であり、突然変異の頻度が高いグループは、イレッサに対する感受性も高く、それらは一致し、女性が男性より多く、非喫煙者が喫煙者より多く、腺癌がその他より多く、東洋人が西洋人より多い。イレッサに対する高感受性の患者の組織におけるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を分析したことによって、大部分の個体が、ＥＧＦＲ遺伝子チロシンキナーゼの領域において突然変異が起きていることを発見した。これらの突然変異は、主にエクソン１８〜２１上に集中している（Chan SKら，Eur J Cancer，2006年，42（1）：17-23）。従って、ＥＧＦＲ遺伝子１８〜２１番目のエクソンの突然変異を検出することによって、イレッサなどの分子標的薬の治療効果をうまく予測できる。本発明は、主に中国人のＥＧＦＲ遺伝子の突然変異のホットスポット（韓宇ら，中華腫瘍学雑誌，2007年，29（4）：278-282；郭健ら，中国肺癌学雑誌，2007年，10（6）：504-507）を考慮し、リアルタイム定量ＰＣＲ法によって、分子標的抗腫瘍薬の治療効果に関連する腫瘍の関係遺伝子ＥＧＦＲの１８、１９、２１番目のエクソンの５タイプの突然変異状況を検出し、本発明のＥＧＦＲ遺伝子突然変異の検出によって、イレッサなどの分子標的薬の治療効果を予測する。
【０００５】
本発明の採用した検出法は、次の幾つかのメリットを有する。
・操作が簡単で、標準化しやすい。一方で、他の方法、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション方法では、ハイブリダイゼーションの条件に対して非常に敏感で、実験の条件を厳格に制御する必要があり、制限酵素断片長多型の実験では、相当の人力を注ぎ込まなければならず、定量が不可能である。
・実験期間が短く、２時間以内に完了可能である。結果を検証するために配列を測定する必要がない。一方で、直接シークエンス法及び高解像度融解曲線分析では、４日〜２週間が必要となる。
・感度が高い。試験条件の最良化を行い、突然変異を検出する感度は１％に達しており、一方で直接シークエンス法の感度は２０〜５０％である。
・特異性が高い。一方で、免疫組織化学法では、偽陽性率及び偽陰性率が高く、かつ点突然変異の位置及び種類を確定できない。
・定量が正確である。これは本発明の実験法における最も特有なメリットであり、絶対定量法でデータを処理することによって標準曲線を描き、サンプル中の野生型及び突然変異型の遺伝子の含量を正確に測定し、それにより突然変異型遺伝子が占める比率が得られて、臨床的診断及び薬剤の使用に補助的な役割を果たす。また、本発明は、安全で無毒性である。一方で、例えばミスマッチ塩基対の化学開裂法のような他の方法は、同位体及び劇毒の化学試薬を使用する必要がある。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ＥＧＦＲ遺伝子突然変異を定量的に検出する試薬キットを提供することである。ＥＧＦＲ遺伝子の１８番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2）の2155位Ｇ塩基がＡ塩基に置換され、１９番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3）の2235〜2249位の塩基が欠失し、１９番目のエクソンの2236〜2250位の塩基が欠失し、１９番目のエクソンの2254〜2277位の塩基が欠失し、２１番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4）の2573位のＴ塩基がＧ塩基に置換される突然変異の状況を定量的に検出する。
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明は、Ｔａｑポリメラーゼ、１０×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ混合液及びＥＧＦＲ遺伝子突然変異部位の配列を特異的に増幅できるＰＣＲプライマー、野生型と突然変異型との配列を特異的に識別できるプローブを含む定量的な検出を行う試薬キット、並びに下記の検出方法を提供する。
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の１８、１９、２１番目のエクソン突然変異部位のそれぞれの付近において上流及び下流のプライマーを設計すると共に、各突然変異部位の突然変異状況に応じて特異的なプローブを設計し、該プローブは、ＥＧＦＲの特定部位の野生型の配列に又は検出される突然変異型の配列に結合することにより、該部位に検出される遺伝子の突然変異が起こったか否かを確定できる。
（２）本発明は、ＥＧＦＲ突然変異の比率を正確に定量化するための標準品を設計する。
（３）測定されるサンプル及び標準品に対して、蛍光定量ＰＣＲ検出を行う。
（４）標準品の検出結果により、定量用の標準曲線が得られ、標準曲線により、測定されるサンプルの核酸のＥＧＦＲ遺伝子突然変異が全体のＥＧＦＲ遺伝子に占める比率を算出する。
【０００８】
前記ステップ（１）の前に、更に、測定されるサンプル中の核酸に対して抽出、精製及び濃度測定を行うことを含むことができる。
【０００９】
蛍光定量ＰＣＲ検出に使用されるプローブは、適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子突然変異部位の塩基配列と特異的に結合する。前記プローブは、５'末端に蛍光リポーター基が連結され、３'末端に蛍光クエンチャー基が連結されることが好ましい。前記蛍光リポーター基は、FAM、TET、HEX、ROXから選ばれ、前記蛍光クエンチャー基は、BHQ、TAMARAから選ばれる。好ましくは、前記蛍光リポーター基はFAMであって、前記蛍光クエンチャー基はBHQである。前記プローブの配列は、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41又はSEQ ID NO：42であることが好ましい。
【００１０】
前記標準品は、プラスミド、遺伝子ゲノムＤＮＡ又は化学合成した配列の少なくとも１種を含む。好ましくは、前記標準品は、野生型プラスミド及び／又は突然変異型プラスミドを含み、そのうち、野生型プラスミドがＥＧＦＲ遺伝子型配列を含み、突然変異型プラスミドがＥＧＦＲ遺伝子突然変異配列を含む。より好ましくは、前記標準品は野生型プラスミド及び／又は突然変異型プラスミドから構成される。好ましくは、前記野生型プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列は、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48又はSEQ ID NO：52であり、前記突然変異型プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異配列は、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51又はSEQ ID NO：53である。
【００１１】
前記測定されるサンプルは、新鮮な組織、パラフィンワックスで包まれた組織、細胞株、血液、胸膜滲出液、唾液、消化液、尿液、唾液、糞便を含む。
【００１２】
前記プライマーは、上流プライマー及び下流プライマーから構成される。前記プライマーは、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15又はSEQ ID NO：16であることが好ましい。
【００１３】
前記ＥＧＦＲ遺伝子突然変異を定量検出するための試薬キットは、上述したプライマー、プローブ及び標準品から選ばれる試薬を含む。前記試薬キットは、Ｔａｑポリメラーゼ、１０×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ混合液を更に含むことが好ましい。好ましいプライマーとプローブとの比は、２：１〜１０：１であり、好ましいセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの比は、１：３〜３：１である。標準品は、指定の比で混合した上述したプラスミドを含み、野生型プラスミド及び突然変異型プラスミのそれぞれの含有量の比率は、０％〜１００％である。
【００１４】
以下、図面及び実施例を参照して、本発明についてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例２において用いたプラスミド標準品の構築方法の模式図である。
【図２】本発明の実施例２における野生型プラスミドの図であって、矢印は、ベクター中に野生型ＰＣＲ産物の配列を挿入する位置を指す。
【図３】本発明の実施例２における野生型プラスミド標準品の配列を測定した結果図であり、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミドの配列決定図であり、図ＢはＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミドの配列決定図であり、図ＣはＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミドの配列決定図である。
【図４】本発明の実施例２における突然変異型プラスミド標準品の配列決定の結果図であり、矢印は、塩基の突然変異点を指す。図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミドの配列決定図である。
【図５】本発明の実施例３における標準品の増幅曲線図であり、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｆは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｇは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｈは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図６】図４に基づいて作成した標準曲線図であって、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｆは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｇは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｈは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミド標準曲線である。
【図７】本発明の実施例３において検出された組織サンプルＥＧＦＲ２１エクソン2573位の野生型（図Ａ）及びT→G置換突然変異型（図Ｂ）の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図、組織サンプルＥＧＦＲ１９エクソン野生型（図Ｃ）及び2235〜2249位欠失突然変異型（図Ｄ）の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図、全血サンプルＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異型（図Ｅ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図、全血サンプルＥＧＦＲ2254〜2277位欠失突然変異型（図Ｆ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図、細胞系サンプルＥＧＦＲ１８エクソン2155位野生型（図Ｇ）及びG→A置換突然変異型（図Ｈ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図である。
【図８】本発明における定量法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の実施例は、本分野の当業者に、本発明を如何に実施及び使用するかについて完全に開示及び記述するために提供する。これらの例は、意図する発明の範囲を限定しない。下記の実験は、実施された実験の全部又は実施可能な実験だけが示されているわけではない。実施例において、具体的な条件を明記しない実験方法は、一般に通常の条件、例えば分子クローン実験指針（第３バージョン）（Sambrook J.）に基づくか、又は製造元により提示された条件に基づく。
【００１７】
実施例1：ヒトの新鮮腫瘍組織、パラフィンワックスで包まれた組織、外周血、胸水及びヒト細胞系ゲノムＤＮＡの抽出
我々が測定したヒト癌細胞系は、非小細胞肺癌（NSCLC）（A549、H460、H838及びH1703）、乳腺癌（MCF-7、BT474及びHuL100）、悪性中皮腫（Mesothelioma）細胞系（H513、H2052、H290、MS-1及びH28）、結腸癌細胞系（SW480）、頭頚部癌細胞系（U87）、子宮頚癌（Hela）、肉腫細胞系（Mes-SA、Saos-2及びA204）を含む。
【００１８】
我々が測定したヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織は、NSCLC、中皮腫、結腸癌、悪性黒色腫、腎臓癌、食道癌、甲状腺癌、悪性腫瘍及び卵巣癌を含む。
【００１９】
ＤＮＡ標本の抽出
Qiagen社、Promega社、Roche社のＤＮＡ抽出キットを用いて、ゲノムＤＮＡサンプルを抽出することができ、Gene社のNanodrop ND1000型核酸微量測定器を用いて、抽出されたＤＮＡの濃度及び純度を測定することができる（OD260/OD280が約1.8であり、OD260/OD230が2.0より大きい）。次に、Promega社のＤＮＡ抽出キットを例として、下記でＤＮＡサンプルの抽出ステップを紹介する。
【００２０】
１．新鮮組織のＤＮＡの抽出
（１）鋏で約大豆粒の大きさの組織を切り取り、乳鉢に入れ、組織を砕き、液体窒素を添加して粉末にした。
（２）予め冷やされた６００μｌの開裂液を乳鉢に追加し、組織の粉末と開裂液とをなるべく均一にするように１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを６回繰り返してかき混ぜ、その後混合物を１．５ｍｌのＥＰチューブ（エッペンドルフチューブ）中に移し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、６５℃の水浴に２０分間保持した。
（３）３μlのＲＮＡポリメラーゼを添加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、３７℃の水浴で２０分間保持した。
（４）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を添加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）予め６００μlのイソプロパノール（室温）を入れた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、６回軽く均一に混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、６００μlの７０％エタノール（室温）を沈殿に追加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を追加し、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２１】
２．パラフィンワックスで包まれた組織ＤＮＡの抽出
（１）１ｍｇ又は１ｍｇより少ない組織を１．５ｍｌの遠心分離チューブに入れた。
（２）用意された新鮮な１００μlの保温緩衝液／ポリメラーゼＫ溶液を加えた。サンプルの種類によっては、５６℃で一晩保温した。
（３）保温されたサンプルチューブを取り出し、体積の２倍の開裂緩衝液を加えた。
（４）樹脂が完全に懸濁するまで１０分間樹脂を高速渦巻振動し、完全に懸濁した樹脂７μlを加えた。３秒間高速渦巻振動した後、室温で５分間保温した。
（５）２秒間高速渦巻振動させた後、チューブをMagneSphere（登録商標）磁気分離スタンドに置いた。直ちに磁気分離を行った。
（６）チューブの壁上についた樹脂を触らないようにして、全ての溶液を注意深く除去した。
（７）１００μlの開裂緩衝液を加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、２秒間高速渦巻振動させた。
（８）チューブを磁気分離スタンドに戻すとともに、全ての開裂液を除去した。
（９）１００μlの配合された１×洗浄液を加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、２秒間高速渦巻振動させた。
（１０）チューブを磁気分離スタンドに戻し、全ての洗浄液を除去した。
（１１）ステップ９及びステップ１０を２回繰り返し、最後の洗浄後に全ての液体を除去するようにして、合わせて３回洗浄した。
（１２）蓋を開け、チューブを磁気分離スタンドに置き、空気中で５分間乾燥させた。
（１３）２５μlの溶出液を加えた。
（１４）蓋を閉め、２秒間高速渦巻振動させた。６５℃で５分間保温した。
（１５）保温したチューブを取り出し、２秒間高速渦巻振動させた。直ちに磁気分離スタンド上に置いた。
（１６）選定された容器中にＤＮＡ溶液を注意深く移した。
【００２２】
３．全血ＤＮＡの抽出
（１）３００μlの抗凝固全血を収集して９００μlの細胞開裂液を加え、なるべく全血と細胞開裂液とが均一に混ざるように１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを６回繰り返してかき混ぜ、室温で１０分間放置し、その間に１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを３回繰り返してかき混ぜた。
（２）13,000*g、室温で２０秒間遠心分離した後、上澄みを捨て、激しく振動させ、予冷した３００μlの開裂液を加え、沈殿が完全に溶解するまで１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを繰り返してかき混ぜた。
（３）１．５μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（４）室温まで冷却し、１００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）３００μlのイソプロパノール（室温）が予め加えられた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、沈殿に１ｍｌの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２３】
４．胸水ＤＮＡの抽出
（１）５ｍｌの胸水を収集し、2000rpm、室温で１０分間遠心分離し、上澄みを取り出し、１ｍｌの細胞開裂液を加えて６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、室温で１０分間放置した。
（２）13,000*g、室温で２０秒間を遠心分離した後、上澄みを捨て、激しく振動させ、１ｍｌの予冷した開裂液を加えた後、完全に溶解するまで均一にかき混ぜた。
（３）３μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（４）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）５ｍｌのイソプロパノール（室温）が予め加えられた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、沈殿に１ｍｌの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２４】
５．細胞系ＤＮＡの抽出
（１）少なくとも約１×１０6の細胞を収集すると共に、１．５ｍｌのＥＰチューブ中に移して、13,000*g、室温で１０秒間遠心分離した。ただし、粘着細胞である場合、細胞を収集する前に、パンクレアチンで消化する必要がある。
（２）上澄みを捨て、２００μlのＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、13,000*g、室温で１０秒間後遠心分離し、上澄みを捨て、沈殿が懸濁するように激しく振動させた。
（３）予冷した６００μlの開裂液を加えて、肉眼で見える細胞塊がなくなるまで１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを繰り返してかき混ぜた。
（４）３μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（５）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（６）６００μlのイソプロパノール（室温）を予め加えた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）上澄みを捨て、沈殿に６００μlの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（８）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（９）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２５】
実施例２：突然変異型及び野生型の検出用配列を含有するプラスミド標準品の用意
１．野生型プラスミドの構築（図１、図２）
【００２６】
１．１ ベクターの用意
ＴＡクローンベクターpMD18-Tは、TAKARA社より購入した。
【００２７】
１．２ 挿入断片の用意
ＰＣＲ法を用いて挿入断片を作成した。ＰＣＲのテンプレートは、ステップ１により抽出したゲノムＤＮＡサンプルであって、反応系及び増幅条件は下表（表１、表２、表３）の通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
ＥＧＦＲ遺伝子の１８番目のエクソン2155位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）のプライマー配列を加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）のプライマー配列を加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の２１番目のエクソン2573位野生型配列のプラスミドを作成する場合、増幅系中にE21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）のプライマー配列を加える必要がある。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
１．３ QIAgenゲル抽出キットを用いて、目的の断片を抽出した後、ＴＡクローンによってそれをpMD18-Tベクター（TAKARA社より購入した）に連結した。
【００３３】
１．４ 新しく構築したプラスミドが大腸菌DH5痾菌株において大量増幅し、抽出精製された（具体的な方法は「分子クローン試験指針」（第３バージョン）の９６〜９９ページ、１０３ページを参照）。
【００３４】
１．５ BamH1及びHind111を用いてそれを二重消化（double digestion）で同定した。
【００３５】
１．６ 消化結果が陽性である菌種を配列決定し、正確に配列決定した後、野生型配列を含有する標準品とする（図３）。
【００３６】
２．突然変異型プラスミドの構築：突然変異点における突然変異プライマーを設計し、ＤＰＮ１法によって突然変異型配列を含んだ標準品を得た。
【００３７】
２．１ 所望の突然変異配列に基づき、突然変異点における突然変異プライマーを設計した（表４）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
２．２ ５ngの野生型プラスミドをテンプレートに与え、突然変異プライマー及びPfuポリメラーゼを用いて、標的部位を突然変異させた。増幅系及び条件は表１、表４、表３の通りである。
【００４０】
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位G→A突然変異配列を含有するプラスミドを作成する過程において、増幅系中にE18-M-F（SEQ ID NO：17）及びE18-M-R（SEQ ID NO：18）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2235〜2249位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-1-F（SEQ ID NO：19）及びE19-1-R（SEQ ID NO：20）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2236〜2250位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-2-F（SEQ ID NO：21）及びE19-2-R（SEQ ID NO：22）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2254〜2277位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-3-F（SEQ ID NO：23）及びE19-3-R（SEQ ID NO：24）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の２１番目のエクソン2573位T→G突然変異配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE21-M-F（SEQ ID NO：25）及びE19-M-R（SEQ ID NO：26）のプライマーを加える必要がある。
【００４１】
２．３ ＤＰＮ１ポリメラーゼを用いて、ステップ２．２で得られた産物を処理し、３７℃で１時間保温した後に産物を回収し、大腸桿菌DH5痾菌株において大量に増幅し、抽出精製した。
【００４２】
２．４ BamH1及びHind111を用いてそれらを二重消化で同定した。
【００４３】
２．５ 消化結果が陽性である菌種を配列決定し、正しく配列決定した後、野生型配列を含有する標準品とする（図４）。
【００４４】
実施例３：肺癌及び子宮頸癌のサンプルを例としたヒト細胞系、ヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織ゲノムＤＮＡのＥＧＦＲ突然変異の検出
【００４５】
１．蛍光定量ＰＣＲ反応テンプレートは、実施例1で抽出された肺癌及び子宮頸癌のゲノムＤＮＡサンプル及び実施例２で作成されたサンプル品であって、二次蒸留水を陰性対照とする。標準曲線を作成するために、標準品を１ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlの様々な倍率で希釈した。
【００４６】
２．反応系及び反応条件（表２、表５、表６、表７）において、標識プローブ蛍光リポーター基は、FAM、TET、HEX、ROXから選ばれ、蛍光クエンチャー基は、BHQ、TAMARAから選ばれる。
【００４７】
【表５】
【００４８】
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位・→・突然変異状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）プライマー、E18W-1（SEQ ID NO：27）又はE18W-2（SEQ ID NO：28）プローブ；E18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）プライマー、E18M-1（SEQ ID NO：29）又はE18W-2（SEQ ID NO：30）プローブをそれぞれ加える。
【００４９】
１９番目のエクソン2235〜2249位欠失、2236〜2250位欠失、2254〜2277位欠失の突然変異状況を検出する場合、４つの系を配置する必要があり、即ち、E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19W-1（SEQ ID NO：31）又はE19W-2（SEQ ID NO：32）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M1-1（SEQ ID NO：33）又はE19M1-2（SEQ ID NO：34）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M2-1（SEQ ID NO：35）又はE19M2-2（SEQ ID NO：36）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M3-1（SEQ ID NO：37）又はE19M3-2（SEQ ID NO：38）プローブをそれぞれ加える。
【００５０】
２１番目のエクソン2573位・→・突然変異状況を検出する場合、2つの系を配置する必要があり、即ち、E21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）プライマー、E21W-1（SEQ ID NO：39）又はE21W-2（SEQ ID NO：40）プローブ；21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）プライマー、E21M-1（SEQ ID NO：41）又はE21M-2（SEQ ID NO：42）プローブをそれぞれ加える。
【００５１】
【表６】
【００５２】
【表７】
【００５３】
３．標準曲線の作成
ステップ３における標準品で得られたＣＴ値の結果に基づき、標準曲線を作成した。図５はプラスミド標準品増幅曲線であって、図において、上昇する５つの曲線は、左から右へ順番に、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlの様々な倍率で希釈したプラスミド標準品の増幅曲線を表す。横軸はサイクル数で、縦軸は蛍光検出値である。これにより、さらに計算用の標準曲線を作成することができた（図６）。図６中において、横軸はテンプレートのコピー数の対数値で、縦軸はＣＴ値である。テンプレートコピー数＝質量／分子量×6.02×1023、プラスミド分子量?塩基数×324.5で、若しくはソフトウェアDNAMANを用いて計算してもよい。本試験中のプラスミドは、pMD18-Tベクター及び挿入断片から構成されており、挿入断片の塩基の長さが基本的に同じで、最大差でも二十個余りの塩基の長さしかなく、PMD18-Tベクター2692bpの長さに対する影響が大きくないため、野生型と突然変異型とのプラスミド標準品のコピー数の比?質量の比である。なお、本実験のプラスミドの分子量?890〜900Kdaであるため、1ngプラスミドコピー数は、約6.69×108 〜6.76×108である。
【００５４】
４．標本ＥＧＦＲ遺伝子特異的突然変異型の比率の計算
標準曲線に基づき、サンプルのＣＴ値から、反応した野生型及び突然変異型のゲノムＤＮＡのコピー数を算出したことにより、突然変異型ＥＧＦＲ ＤＮＡとＥＧＦＲ ＤＮＡ総数量（該部位における野生型と全突然変異型との合計）との比率が算出できた。図７に示すように測定されたある組織サンプルＥＧＦＲ２１エクソン野生型のＣＴ値は19.15であり、2573位T→G突然変異型のＣＴ値は20.74であることから、それぞれ対応する標準曲線の公式（図６）により各自のコピー数を算出でき、これによって突然変異型と野生型との含量の比は89：100であることが理解でき、組織中において約４７％のＥＧＦＲ遺伝子に2573位T→G突然変異が生じたと推測した。
【００５５】
５．検出の結果
本実施例では４８例の肺癌と子宮頸癌との組織、全血及び細胞系のサンプルに対してＥＧＦＲ遺伝子突然変異の検出を行った。合わせて１３例の突然変異を検出した。具体的な突然変異例の数を表８に表し、突然変異の比率、即ち、該サンプル中突然変異した遺伝子と突然変異しない遺伝子との比の値を表９に表す。
【００５６】
【表８】
【００５７】
【表９】
【００５８】
実施例４：ヒト細胞系、ヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織ゲノムｍＲＮＡ ＥＧＦＲ突然変異の検出
【００５９】
１．標本の総ＲＮＡ抽出
Invotrogen社、OMEGA社の総ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡサンプルを抽出し、Gene社のNanodrop ND1000型の核酸微量測定器を用いて抽出したＲＮＡの濃度及び純度を測定した（OD260/280は1.8〜2.0範囲内であって、OD260/230>2.0である）。
【００６０】
２．ｃＤＮＡの合成：
Ｍ-ＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写を行った。そのステップ及び反応系を表１０に示す。
【００６１】
【表１０】
【００６２】
３．標準品の作成方法、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出ステップは、実施例１と同様である。野生型プラスミド標準品の作成に使用されるプライマー及び測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲの検出時に使用されるプローブは、実施例１と同様であり、異なるのは、野生型プラスミド標準品の作成に使用されるプライマー及び測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲの検出時に使用されるプライマーである（表１１）。標準曲線の作成及び標本ＥＧＦＲ遺伝子の特異的突然変異型の含量の計算方法は、実施例１と同様である。
【００６３】
【表１１】
【００６４】
野生型プラスミド標準品の作成に使用するプライマーの選択：
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子１９番目のエクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型を含有するプラスミドを作成する場合、E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子２１番目のエクソン2573位野生型配列のプラスミドを作成する場合、E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-2プライマー（SEQ ID NO：45）を加える必要がある。
【００６５】
測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲ検出時におけるプライマー及びプローブの選択：
ＥＧＦＲ遺伝子第１８エクソン2155位・→・突然変異の状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマー、E18W-1（SEQ ID NO：27）又はE18W-2（SEQ ID NO：28）プローブ；E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマー、E18M-1（SEQ ID NO：29）又はE18W-2（SEQ ID NO：30）プローブをそれぞれ加える。
【００６６】
１９番目のエクソン2235〜2249位欠失、2236〜2250位欠失、2254〜2277位欠失の突然変異の状況を検出する場合、４つの系を配置する必要があり、即ち、E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19W-1（SEQ ID NO：31）又はE19W-2（SEQ ID NO：32）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M1-1（SEQ ID NO：33）又はE19M1-2（SEQ ID NO：34）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M2-1（SEQ ID NO：35）又はE19M2-2（SEQ ID NO：36）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M3-1（SEQ ID NO：37）又はE19M3-2（SEQ ID NO：38）プローブをそれぞれ加える。
【００６７】
２１番目のエクソン2573位・→・突然変異の状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-3（SEQ ID NO：45）プライマー、E21W-1（SEQ ID NO：39）又はE21W-2（SEQ ID NO：40）プローブ；E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-3（SEQ ID NO：45）プライマー、E21M-1（SEQ ID NO：41）又はE21M-2（SEQ ID NO：42）プローブをそれぞれ加える。
【背景技術】
【０００１】
上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor, ＥＧＦＲ）は、人体の各組織細胞膜上に広く分布する多機能糖タンパク質であって、HER/ErbBファミリーの一つとして、腫瘍の増殖、血管の新生、腫瘍の転移及び抗アポトーシスに関連する。
【０００２】
大部分の腫瘍細胞は、ＥＧＦＲ及びその天然のリガンドを発現し、結合された後に自己リン酸化を引き起こし、一連の反応を経て核内にシグナルを伝達することによって、腫瘍細胞の成長及びアポトーシス、腫瘍血管の形成に影響を与え、そのことで腫瘍の発達及び進行に影響を与える。
【０００３】
ＥＧＦＲが、癌の発生及び発達の段階において重要な役割を果たすことが研究で示された。ＥＧＦＲに対する標的治療薬、例えば、アバスチン（AVASTIN）、タルセバ（エルロチニブ Erlotinib）、ゲフィチニブ（イレッサ Irressa）等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）は、腫瘍細胞ＥＧＦＲのシグナル伝達を遮断することによって、腫瘍細胞の増殖、浸潤、転移、血管の新生を抑制できると共に、腫瘍細胞のアポトーシスを促進できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
しかし、臨床実験において、８〜１８％の非小細胞肺癌患者しかイレッサなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の恩恵を受けることができない（Pazez JGら，Science, 2004年，304：1497-1500；Sequist LVら，Oncologist, 2007年，12（1）：90-8）。目下、突然変異したＥＧＦＲ遺伝子を持つ患者に対する治療効果が顕著であり、突然変異の頻度が高いグループは、イレッサに対する感受性も高く、それらは一致し、女性が男性より多く、非喫煙者が喫煙者より多く、腺癌がその他より多く、東洋人が西洋人より多い。イレッサに対する高感受性の患者の組織におけるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を分析したことによって、大部分の個体が、ＥＧＦＲ遺伝子チロシンキナーゼの領域において突然変異が起きていることを発見した。これらの突然変異は、主にエクソン１８〜２１上に集中している（Chan SKら，Eur J Cancer，2006年，42（1）：17-23）。従って、ＥＧＦＲ遺伝子１８〜２１番目のエクソンの突然変異を検出することによって、イレッサなどの分子標的薬の治療効果をうまく予測できる。本発明は、主に中国人のＥＧＦＲ遺伝子の突然変異のホットスポット（韓宇ら，中華腫瘍学雑誌，2007年，29（4）：278-282；郭健ら，中国肺癌学雑誌，2007年，10（6）：504-507）を考慮し、リアルタイム定量ＰＣＲ法によって、分子標的抗腫瘍薬の治療効果に関連する腫瘍の関係遺伝子ＥＧＦＲの１８、１９、２１番目のエクソンの５タイプの突然変異状況を検出し、本発明のＥＧＦＲ遺伝子突然変異の検出によって、イレッサなどの分子標的薬の治療効果を予測する。
【０００５】
本発明の採用した検出法は、次の幾つかのメリットを有する。
・操作が簡単で、標準化しやすい。一方で、他の方法、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション方法では、ハイブリダイゼーションの条件に対して非常に敏感で、実験の条件を厳格に制御する必要があり、制限酵素断片長多型の実験では、相当の人力を注ぎ込まなければならず、定量が不可能である。
・実験期間が短く、２時間以内に完了可能である。結果を検証するために配列を測定する必要がない。一方で、直接シークエンス法及び高解像度融解曲線分析では、４日〜２週間が必要となる。
・感度が高い。試験条件の最良化を行い、突然変異を検出する感度は１％に達しており、一方で直接シークエンス法の感度は２０〜５０％である。
・特異性が高い。一方で、免疫組織化学法では、偽陽性率及び偽陰性率が高く、かつ点突然変異の位置及び種類を確定できない。
・定量が正確である。これは本発明の実験法における最も特有なメリットであり、絶対定量法でデータを処理することによって標準曲線を描き、サンプル中の野生型及び突然変異型の遺伝子の含量を正確に測定し、それにより突然変異型遺伝子が占める比率が得られて、臨床的診断及び薬剤の使用に補助的な役割を果たす。また、本発明は、安全で無毒性である。一方で、例えばミスマッチ塩基対の化学開裂法のような他の方法は、同位体及び劇毒の化学試薬を使用する必要がある。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ＥＧＦＲ遺伝子突然変異を定量的に検出する試薬キットを提供することである。ＥＧＦＲ遺伝子の１８番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2）の2155位Ｇ塩基がＡ塩基に置換され、１９番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3）の2235〜2249位の塩基が欠失し、１９番目のエクソンの2236〜2250位の塩基が欠失し、１９番目のエクソンの2254〜2277位の塩基が欠失し、２１番目のエクソン（SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4）の2573位のＴ塩基がＧ塩基に置換される突然変異の状況を定量的に検出する。
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明は、Ｔａｑポリメラーゼ、１０×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ混合液及びＥＧＦＲ遺伝子突然変異部位の配列を特異的に増幅できるＰＣＲプライマー、野生型と突然変異型との配列を特異的に識別できるプローブを含む定量的な検出を行う試薬キット、並びに下記の検出方法を提供する。
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の１８、１９、２１番目のエクソン突然変異部位のそれぞれの付近において上流及び下流のプライマーを設計すると共に、各突然変異部位の突然変異状況に応じて特異的なプローブを設計し、該プローブは、ＥＧＦＲの特定部位の野生型の配列に又は検出される突然変異型の配列に結合することにより、該部位に検出される遺伝子の突然変異が起こったか否かを確定できる。
（２）本発明は、ＥＧＦＲ突然変異の比率を正確に定量化するための標準品を設計する。
（３）測定されるサンプル及び標準品に対して、蛍光定量ＰＣＲ検出を行う。
（４）標準品の検出結果により、定量用の標準曲線が得られ、標準曲線により、測定されるサンプルの核酸のＥＧＦＲ遺伝子突然変異が全体のＥＧＦＲ遺伝子に占める比率を算出する。
【０００８】
前記ステップ（１）の前に、更に、測定されるサンプル中の核酸に対して抽出、精製及び濃度測定を行うことを含むことができる。
【０００９】
蛍光定量ＰＣＲ検出に使用されるプローブは、適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子突然変異部位の塩基配列と特異的に結合する。前記プローブは、５'末端に蛍光リポーター基が連結され、３'末端に蛍光クエンチャー基が連結されることが好ましい。前記蛍光リポーター基は、FAM、TET、HEX、ROXから選ばれ、前記蛍光クエンチャー基は、BHQ、TAMARAから選ばれる。好ましくは、前記蛍光リポーター基はFAMであって、前記蛍光クエンチャー基はBHQである。前記プローブの配列は、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41又はSEQ ID NO：42であることが好ましい。
【００１０】
前記標準品は、プラスミド、遺伝子ゲノムＤＮＡ又は化学合成した配列の少なくとも１種を含む。好ましくは、前記標準品は、野生型プラスミド及び／又は突然変異型プラスミドを含み、そのうち、野生型プラスミドがＥＧＦＲ遺伝子型配列を含み、突然変異型プラスミドがＥＧＦＲ遺伝子突然変異配列を含む。より好ましくは、前記標準品は野生型プラスミド及び／又は突然変異型プラスミドから構成される。好ましくは、前記野生型プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列は、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48又はSEQ ID NO：52であり、前記突然変異型プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異配列は、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51又はSEQ ID NO：53である。
【００１１】
前記測定されるサンプルは、新鮮な組織、パラフィンワックスで包まれた組織、細胞株、血液、胸膜滲出液、唾液、消化液、尿液、唾液、糞便を含む。
【００１２】
前記プライマーは、上流プライマー及び下流プライマーから構成される。前記プライマーは、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15又はSEQ ID NO：16であることが好ましい。
【００１３】
前記ＥＧＦＲ遺伝子突然変異を定量検出するための試薬キットは、上述したプライマー、プローブ及び標準品から選ばれる試薬を含む。前記試薬キットは、Ｔａｑポリメラーゼ、１０×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ混合液を更に含むことが好ましい。好ましいプライマーとプローブとの比は、２：１〜１０：１であり、好ましいセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの比は、１：３〜３：１である。標準品は、指定の比で混合した上述したプラスミドを含み、野生型プラスミド及び突然変異型プラスミのそれぞれの含有量の比率は、０％〜１００％である。
【００１４】
以下、図面及び実施例を参照して、本発明についてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例２において用いたプラスミド標準品の構築方法の模式図である。
【図２】本発明の実施例２における野生型プラスミドの図であって、矢印は、ベクター中に野生型ＰＣＲ産物の配列を挿入する位置を指す。
【図３】本発明の実施例２における野生型プラスミド標準品の配列を測定した結果図であり、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミドの配列決定図であり、図ＢはＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミドの配列決定図であり、図ＣはＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミドの配列決定図である。
【図４】本発明の実施例２における突然変異型プラスミド標準品の配列決定の結果図であり、矢印は、塩基の突然変異点を指す。図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミドの配列決定図であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミドの配列決定図である。
【図５】本発明の実施例３における標準品の増幅曲線図であり、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｆは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｇは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミド標準品の増幅曲線であり、図Ｈは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図６】図４に基づいて作成した標準曲線図であって、図Ａは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｂは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｃは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T野生型プラスミド標準曲線であり、図Ｄは、ＥＧＦＲ１８エクソン2155G→A突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｅは、ＥＧＦＲ１９エクソン2235〜2249位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｆは、ＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｇは、ＥＧＦＲ１９エクソン2254〜2277位欠失突然変異プラスミド標準曲線であり、図Ｈは、ＥＧＦＲ２１エクソン2573位T→G突然変異プラスミド標準曲線である。
【図７】本発明の実施例３において検出された組織サンプルＥＧＦＲ２１エクソン2573位の野生型（図Ａ）及びT→G置換突然変異型（図Ｂ）の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図、組織サンプルＥＧＦＲ１９エクソン野生型（図Ｃ）及び2235〜2249位欠失突然変異型（図Ｄ）の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図、全血サンプルＥＧＦＲ１９エクソン2236〜2250位欠失突然変異型（図Ｅ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図、全血サンプルＥＧＦＲ2254〜2277位欠失突然変異型（図Ｆ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図、細胞系サンプルＥＧＦＲ１８エクソン2155位野生型（図Ｇ）及びG→A置換突然変異型（図Ｈ）の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線図である。
【図８】本発明における定量法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の実施例は、本分野の当業者に、本発明を如何に実施及び使用するかについて完全に開示及び記述するために提供する。これらの例は、意図する発明の範囲を限定しない。下記の実験は、実施された実験の全部又は実施可能な実験だけが示されているわけではない。実施例において、具体的な条件を明記しない実験方法は、一般に通常の条件、例えば分子クローン実験指針（第３バージョン）（Sambrook J.）に基づくか、又は製造元により提示された条件に基づく。
【００１７】
実施例1：ヒトの新鮮腫瘍組織、パラフィンワックスで包まれた組織、外周血、胸水及びヒト細胞系ゲノムＤＮＡの抽出
我々が測定したヒト癌細胞系は、非小細胞肺癌（NSCLC）（A549、H460、H838及びH1703）、乳腺癌（MCF-7、BT474及びHuL100）、悪性中皮腫（Mesothelioma）細胞系（H513、H2052、H290、MS-1及びH28）、結腸癌細胞系（SW480）、頭頚部癌細胞系（U87）、子宮頚癌（Hela）、肉腫細胞系（Mes-SA、Saos-2及びA204）を含む。
【００１８】
我々が測定したヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織は、NSCLC、中皮腫、結腸癌、悪性黒色腫、腎臓癌、食道癌、甲状腺癌、悪性腫瘍及び卵巣癌を含む。
【００１９】
ＤＮＡ標本の抽出
Qiagen社、Promega社、Roche社のＤＮＡ抽出キットを用いて、ゲノムＤＮＡサンプルを抽出することができ、Gene社のNanodrop ND1000型核酸微量測定器を用いて、抽出されたＤＮＡの濃度及び純度を測定することができる（OD260/OD280が約1.8であり、OD260/OD230が2.0より大きい）。次に、Promega社のＤＮＡ抽出キットを例として、下記でＤＮＡサンプルの抽出ステップを紹介する。
【００２０】
１．新鮮組織のＤＮＡの抽出
（１）鋏で約大豆粒の大きさの組織を切り取り、乳鉢に入れ、組織を砕き、液体窒素を添加して粉末にした。
（２）予め冷やされた６００μｌの開裂液を乳鉢に追加し、組織の粉末と開裂液とをなるべく均一にするように１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを６回繰り返してかき混ぜ、その後混合物を１．５ｍｌのＥＰチューブ（エッペンドルフチューブ）中に移し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、６５℃の水浴に２０分間保持した。
（３）３μlのＲＮＡポリメラーゼを添加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、３７℃の水浴で２０分間保持した。
（４）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を添加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）予め６００μlのイソプロパノール（室温）を入れた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、６回軽く均一に混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、６００μlの７０％エタノール（室温）を沈殿に追加し、６回上下逆さまにして均一に混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を追加し、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２１】
２．パラフィンワックスで包まれた組織ＤＮＡの抽出
（１）１ｍｇ又は１ｍｇより少ない組織を１．５ｍｌの遠心分離チューブに入れた。
（２）用意された新鮮な１００μlの保温緩衝液／ポリメラーゼＫ溶液を加えた。サンプルの種類によっては、５６℃で一晩保温した。
（３）保温されたサンプルチューブを取り出し、体積の２倍の開裂緩衝液を加えた。
（４）樹脂が完全に懸濁するまで１０分間樹脂を高速渦巻振動し、完全に懸濁した樹脂７μlを加えた。３秒間高速渦巻振動した後、室温で５分間保温した。
（５）２秒間高速渦巻振動させた後、チューブをMagneSphere（登録商標）磁気分離スタンドに置いた。直ちに磁気分離を行った。
（６）チューブの壁上についた樹脂を触らないようにして、全ての溶液を注意深く除去した。
（７）１００μlの開裂緩衝液を加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、２秒間高速渦巻振動させた。
（８）チューブを磁気分離スタンドに戻すとともに、全ての開裂液を除去した。
（９）１００μlの配合された１×洗浄液を加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、２秒間高速渦巻振動させた。
（１０）チューブを磁気分離スタンドに戻し、全ての洗浄液を除去した。
（１１）ステップ９及びステップ１０を２回繰り返し、最後の洗浄後に全ての液体を除去するようにして、合わせて３回洗浄した。
（１２）蓋を開け、チューブを磁気分離スタンドに置き、空気中で５分間乾燥させた。
（１３）２５μlの溶出液を加えた。
（１４）蓋を閉め、２秒間高速渦巻振動させた。６５℃で５分間保温した。
（１５）保温したチューブを取り出し、２秒間高速渦巻振動させた。直ちに磁気分離スタンド上に置いた。
（１６）選定された容器中にＤＮＡ溶液を注意深く移した。
【００２２】
３．全血ＤＮＡの抽出
（１）３００μlの抗凝固全血を収集して９００μlの細胞開裂液を加え、なるべく全血と細胞開裂液とが均一に混ざるように１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを６回繰り返してかき混ぜ、室温で１０分間放置し、その間に１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを３回繰り返してかき混ぜた。
（２）13,000*g、室温で２０秒間遠心分離した後、上澄みを捨て、激しく振動させ、予冷した３００μlの開裂液を加え、沈殿が完全に溶解するまで１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを繰り返してかき混ぜた。
（３）１．５μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（４）室温まで冷却し、１００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）３００μlのイソプロパノール（室温）が予め加えられた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、沈殿に１ｍｌの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２３】
４．胸水ＤＮＡの抽出
（１）５ｍｌの胸水を収集し、2000rpm、室温で１０分間遠心分離し、上澄みを取り出し、１ｍｌの細胞開裂液を加えて６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、室温で１０分間放置した。
（２）13,000*g、室温で２０秒間を遠心分離した後、上澄みを捨て、激しく振動させ、１ｍｌの予冷した開裂液を加えた後、完全に溶解するまで均一にかき混ぜた。
（３）３μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（４）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（５）５ｍｌのイソプロパノール（室温）が予め加えられた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（６）上澄みを捨て、沈殿に１ｍｌの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（８）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２４】
５．細胞系ＤＮＡの抽出
（１）少なくとも約１×１０6の細胞を収集すると共に、１．５ｍｌのＥＰチューブ中に移して、13,000*g、室温で１０秒間遠心分離した。ただし、粘着細胞である場合、細胞を収集する前に、パンクレアチンで消化する必要がある。
（２）上澄みを捨て、２００μlのＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、13,000*g、室温で１０秒間後遠心分離し、上澄みを捨て、沈殿が懸濁するように激しく振動させた。
（３）予冷した６００μlの開裂液を加えて、肉眼で見える細胞塊がなくなるまで１ｍｌのマイクロピペットチップで吸い取り及び吹き戻しを繰り返してかき混ぜた。
（４）３μlのＲＮＡポリメラーゼを加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜてから、３７℃の水浴に２０分間放置した。
（５）室温まで冷却し、２００μlのタンパク質沈降剤を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜ、氷上に５分間放置した後、13,000*g、室温で４分間遠心分離した。
（６）６００μlのイソプロパノール（室温）を予め加えた新たなＥＰチューブ中に上澄みを移し、軽く６回かき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（７）上澄みを捨て、沈殿に６００μlの７０％のエタノール（室温）を加え、６回上下逆さまにして均一にかき混ぜた後、13,000*g、室温で１分間遠心分離した。
（８）エタノールを吸出し、空気で１５分間乾燥させた。
（９）沈殿に４０μlのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間、又は４℃で一晩放置した。
【００２５】
実施例２：突然変異型及び野生型の検出用配列を含有するプラスミド標準品の用意
１．野生型プラスミドの構築（図１、図２）
【００２６】
１．１ ベクターの用意
ＴＡクローンベクターpMD18-Tは、TAKARA社より購入した。
【００２７】
１．２ 挿入断片の用意
ＰＣＲ法を用いて挿入断片を作成した。ＰＣＲのテンプレートは、ステップ１により抽出したゲノムＤＮＡサンプルであって、反応系及び増幅条件は下表（表１、表２、表３）の通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
ＥＧＦＲ遺伝子の１８番目のエクソン2155位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）のプライマー配列を加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）のプライマー配列を加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の２１番目のエクソン2573位野生型配列のプラスミドを作成する場合、増幅系中にE21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）のプライマー配列を加える必要がある。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
１．３ QIAgenゲル抽出キットを用いて、目的の断片を抽出した後、ＴＡクローンによってそれをpMD18-Tベクター（TAKARA社より購入した）に連結した。
【００３３】
１．４ 新しく構築したプラスミドが大腸菌DH5痾菌株において大量増幅し、抽出精製された（具体的な方法は「分子クローン試験指針」（第３バージョン）の９６〜９９ページ、１０３ページを参照）。
【００３４】
１．５ BamH1及びHind111を用いてそれを二重消化（double digestion）で同定した。
【００３５】
１．６ 消化結果が陽性である菌種を配列決定し、正確に配列決定した後、野生型配列を含有する標準品とする（図３）。
【００３６】
２．突然変異型プラスミドの構築：突然変異点における突然変異プライマーを設計し、ＤＰＮ１法によって突然変異型配列を含んだ標準品を得た。
【００３７】
２．１ 所望の突然変異配列に基づき、突然変異点における突然変異プライマーを設計した（表４）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
２．２ ５ngの野生型プラスミドをテンプレートに与え、突然変異プライマー及びPfuポリメラーゼを用いて、標的部位を突然変異させた。増幅系及び条件は表１、表４、表３の通りである。
【００４０】
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位G→A突然変異配列を含有するプラスミドを作成する過程において、増幅系中にE18-M-F（SEQ ID NO：17）及びE18-M-R（SEQ ID NO：18）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2235〜2249位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-1-F（SEQ ID NO：19）及びE19-1-R（SEQ ID NO：20）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2236〜2250位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-2-F（SEQ ID NO：21）及びE19-2-R（SEQ ID NO：22）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の１９番目のエクソン2254〜2277位欠失突然変異型配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE19-3-F（SEQ ID NO：23）及びE19-3-R（SEQ ID NO：24）のプライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子の２１番目のエクソン2573位T→G突然変異配列を含有するプラスミドを作成する場合、増幅系中にE21-M-F（SEQ ID NO：25）及びE19-M-R（SEQ ID NO：26）のプライマーを加える必要がある。
【００４１】
２．３ ＤＰＮ１ポリメラーゼを用いて、ステップ２．２で得られた産物を処理し、３７℃で１時間保温した後に産物を回収し、大腸桿菌DH5痾菌株において大量に増幅し、抽出精製した。
【００４２】
２．４ BamH1及びHind111を用いてそれらを二重消化で同定した。
【００４３】
２．５ 消化結果が陽性である菌種を配列決定し、正しく配列決定した後、野生型配列を含有する標準品とする（図４）。
【００４４】
実施例３：肺癌及び子宮頸癌のサンプルを例としたヒト細胞系、ヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織ゲノムＤＮＡのＥＧＦＲ突然変異の検出
【００４５】
１．蛍光定量ＰＣＲ反応テンプレートは、実施例1で抽出された肺癌及び子宮頸癌のゲノムＤＮＡサンプル及び実施例２で作成されたサンプル品であって、二次蒸留水を陰性対照とする。標準曲線を作成するために、標準品を１ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlの様々な倍率で希釈した。
【００４６】
２．反応系及び反応条件（表２、表５、表６、表７）において、標識プローブ蛍光リポーター基は、FAM、TET、HEX、ROXから選ばれ、蛍光クエンチャー基は、BHQ、TAMARAから選ばれる。
【００４７】
【表５】
【００４８】
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位・→・突然変異状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）プライマー、E18W-1（SEQ ID NO：27）又はE18W-2（SEQ ID NO：28）プローブ；E18-F-1（SEQ ID NO：5）又はE18-F-2（SEQ ID NO：6）及びE18-R-1（SEQ ID NO：7）又はE18-R-2（SEQ ID NO：8）プライマー、E18M-1（SEQ ID NO：29）又はE18W-2（SEQ ID NO：30）プローブをそれぞれ加える。
【００４９】
１９番目のエクソン2235〜2249位欠失、2236〜2250位欠失、2254〜2277位欠失の突然変異状況を検出する場合、４つの系を配置する必要があり、即ち、E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19W-1（SEQ ID NO：31）又はE19W-2（SEQ ID NO：32）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M1-1（SEQ ID NO：33）又はE19M1-2（SEQ ID NO：34）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M2-1（SEQ ID NO：35）又はE19M2-2（SEQ ID NO：36）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）又はE19-F-2（SEQ ID NO：10）及びE19-R-1（SEQ ID NO：11）又はE19-R-2（SEQ ID NO：12）プライマー、E19M3-1（SEQ ID NO：37）又はE19M3-2（SEQ ID NO：38）プローブをそれぞれ加える。
【００５０】
２１番目のエクソン2573位・→・突然変異状況を検出する場合、2つの系を配置する必要があり、即ち、E21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）プライマー、E21W-1（SEQ ID NO：39）又はE21W-2（SEQ ID NO：40）プローブ；21-F-1（SEQ ID NO：13）又はE21-F-2（SEQ ID NO：14）及びE21-R-1（SEQ ID NO：15）又はE21-R-2（SEQ ID NO：16）プライマー、E21M-1（SEQ ID NO：41）又はE21M-2（SEQ ID NO：42）プローブをそれぞれ加える。
【００５１】
【表６】
【００５２】
【表７】
【００５３】
３．標準曲線の作成
ステップ３における標準品で得られたＣＴ値の結果に基づき、標準曲線を作成した。図５はプラスミド標準品増幅曲線であって、図において、上昇する５つの曲線は、左から右へ順番に、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlの様々な倍率で希釈したプラスミド標準品の増幅曲線を表す。横軸はサイクル数で、縦軸は蛍光検出値である。これにより、さらに計算用の標準曲線を作成することができた（図６）。図６中において、横軸はテンプレートのコピー数の対数値で、縦軸はＣＴ値である。テンプレートコピー数＝質量／分子量×6.02×1023、プラスミド分子量?塩基数×324.5で、若しくはソフトウェアDNAMANを用いて計算してもよい。本試験中のプラスミドは、pMD18-Tベクター及び挿入断片から構成されており、挿入断片の塩基の長さが基本的に同じで、最大差でも二十個余りの塩基の長さしかなく、PMD18-Tベクター2692bpの長さに対する影響が大きくないため、野生型と突然変異型とのプラスミド標準品のコピー数の比?質量の比である。なお、本実験のプラスミドの分子量?890〜900Kdaであるため、1ngプラスミドコピー数は、約6.69×108 〜6.76×108である。
【００５４】
４．標本ＥＧＦＲ遺伝子特異的突然変異型の比率の計算
標準曲線に基づき、サンプルのＣＴ値から、反応した野生型及び突然変異型のゲノムＤＮＡのコピー数を算出したことにより、突然変異型ＥＧＦＲ ＤＮＡとＥＧＦＲ ＤＮＡ総数量（該部位における野生型と全突然変異型との合計）との比率が算出できた。図７に示すように測定されたある組織サンプルＥＧＦＲ２１エクソン野生型のＣＴ値は19.15であり、2573位T→G突然変異型のＣＴ値は20.74であることから、それぞれ対応する標準曲線の公式（図６）により各自のコピー数を算出でき、これによって突然変異型と野生型との含量の比は89：100であることが理解でき、組織中において約４７％のＥＧＦＲ遺伝子に2573位T→G突然変異が生じたと推測した。
【００５５】
５．検出の結果
本実施例では４８例の肺癌と子宮頸癌との組織、全血及び細胞系のサンプルに対してＥＧＦＲ遺伝子突然変異の検出を行った。合わせて１３例の突然変異を検出した。具体的な突然変異例の数を表８に表し、突然変異の比率、即ち、該サンプル中突然変異した遺伝子と突然変異しない遺伝子との比の値を表９に表す。
【００５６】
【表８】
【００５７】
【表９】
【００５８】
実施例４：ヒト細胞系、ヒト新鮮腫瘍組織、外周血、パラフィンワックスで包まれた組織ゲノムｍＲＮＡ ＥＧＦＲ突然変異の検出
【００５９】
１．標本の総ＲＮＡ抽出
Invotrogen社、OMEGA社の総ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡサンプルを抽出し、Gene社のNanodrop ND1000型の核酸微量測定器を用いて抽出したＲＮＡの濃度及び純度を測定した（OD260/280は1.8〜2.0範囲内であって、OD260/230>2.0である）。
【００６０】
２．ｃＤＮＡの合成：
Ｍ-ＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写を行った。そのステップ及び反応系を表１０に示す。
【００６１】
【表１０】
【００６２】
３．標準品の作成方法、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲの検出ステップは、実施例１と同様である。野生型プラスミド標準品の作成に使用されるプライマー及び測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲの検出時に使用されるプローブは、実施例１と同様であり、異なるのは、野生型プラスミド標準品の作成に使用されるプライマー及び測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲの検出時に使用されるプライマーである（表１１）。標準曲線の作成及び標本ＥＧＦＲ遺伝子の特異的突然変異型の含量の計算方法は、実施例１と同様である。
【００６３】
【表１１】
【００６４】
野生型プラスミド標準品の作成に使用するプライマーの選択：
ＥＧＦＲ遺伝子１８番目のエクソン2155位野生型配列を含有するプラスミドを作成する場合、E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子１９番目のエクソン2235〜2249位、2236〜2250位、2254〜2277位野生型を含有するプラスミドを作成する場合、E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマーを加える必要がある。ＥＧＦＲ遺伝子２１番目のエクソン2573位野生型配列のプラスミドを作成する場合、E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-2プライマー（SEQ ID NO：45）を加える必要がある。
【００６５】
測定されるサンプルの蛍光定量ＰＣＲ検出時におけるプライマー及びプローブの選択：
ＥＧＦＲ遺伝子第１８エクソン2155位・→・突然変異の状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマー、E18W-1（SEQ ID NO：27）又はE18W-2（SEQ ID NO：28）プローブ；E18-F-1（SEQ ID NO：5）及びE18-R-3（SEQ ID NO：43）プライマー、E18M-1（SEQ ID NO：29）又はE18W-2（SEQ ID NO：30）プローブをそれぞれ加える。
【００６６】
１９番目のエクソン2235〜2249位欠失、2236〜2250位欠失、2254〜2277位欠失の突然変異の状況を検出する場合、４つの系を配置する必要があり、即ち、E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19W-1（SEQ ID NO：31）又はE19W-2（SEQ ID NO：32）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M1-1（SEQ ID NO：33）又はE19M1-2（SEQ ID NO：34）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M2-1（SEQ ID NO：35）又はE19M2-2（SEQ ID NO：36）プローブ；E19-F-1（SEQ ID NO：9）及びE19-R-3（SEQ ID NO：44）プライマー、E19M3-1（SEQ ID NO：37）又はE19M3-2（SEQ ID NO：38）プローブをそれぞれ加える。
【００６７】
２１番目のエクソン2573位・→・突然変異の状況を検出する場合、２つの系を配置する必要があり、即ち、E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-3（SEQ ID NO：45）プライマー、E21W-1（SEQ ID NO：39）又はE21W-2（SEQ ID NO：40）プローブ；E21-F-1（SEQ ID NO：13）及びE21-R-3（SEQ ID NO：45）プライマー、E21M-1（SEQ ID NO：41）又はE21M-2（SEQ ID NO：42）プローブをそれぞれ加える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異部位の上流及び下流における２００個以内のヌクレオチドに結合する、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー。
【請求項２】
前記プライマーは上流プライマー及び下流プライマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異部位の塩基配列と特異的に結合する、蛍光定量ＰＣＲのプローブ。
【請求項４】
前記プローブの５'末端に蛍光リポーター基が連結され、３'末端に蛍光クエンチャー基が連結されることを特徴とする、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
検出されるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列を含む、プラスミド。
【請求項６】
前記プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列は、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、又はSEQ ID NO：52であることを特徴とする、請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
検出される突然変異型ＥＧＦＲ遺伝子配列を含む、プラスミド。
【請求項８】
前記プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異配列は、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、又はSEQ ID NO：53であることを特徴とする、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を定量的に検出するための試薬キットであって、請求項１又は請求項２に記載のプライマー、請求項３又は請求項４に記載のプローブ、及び請求項５及び／又は請求項７に記載のプラスミドから選ばれる試薬を含むことを特徴とする、試薬キット。
【請求項１０】
プライマー対プローブの比は２：１〜１０：１であり、センスプライマー対アンチセンスプライマーの比は１：３〜３：１であることを特徴とする、請求項９に記載の試薬キット。
【請求項１】
適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異部位の上流及び下流における２００個以内のヌクレオチドに結合する、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー。
【請求項２】
前記プライマーは上流プライマー及び下流プライマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異部位の塩基配列と特異的に結合する、蛍光定量ＰＣＲのプローブ。
【請求項４】
前記プローブの５'末端に蛍光リポーター基が連結され、３'末端に蛍光クエンチャー基が連結されることを特徴とする、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
検出されるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列を含む、プラスミド。
【請求項６】
前記プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の野生型配列は、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、又はSEQ ID NO：52であることを特徴とする、請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
検出される突然変異型ＥＧＦＲ遺伝子配列を含む、プラスミド。
【請求項８】
前記プラスミドに含まれるＥＧＦＲ遺伝子の突然変異配列は、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、又はSEQ ID NO：53であることを特徴とする、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を定量的に検出するための試薬キットであって、請求項１又は請求項２に記載のプライマー、請求項３又は請求項４に記載のプローブ、及び請求項５及び／又は請求項７に記載のプラスミドから選ばれる試薬を含むことを特徴とする、試薬キット。
【請求項１０】
プライマー対プローブの比は２：１〜１０：１であり、センスプライマー対アンチセンスプライマーの比は１：３〜３：１であることを特徴とする、請求項９に記載の試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５０５００５（Ｐ２０１３−５０５００５Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９０９４（Ｐ２０１２−５２９０９４）
【出願日】平成２２年９月２０日（２０１０．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００１４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３５５３８
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０９１３５３８２）北京雅康博生物科技有限公司 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２０日（２０１０．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００１４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３５５３８
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０９１３５３８２）北京雅康博生物科技有限公司 (2)
【Ｆターム（参考）】
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