ＧＶＨＤの予防及び治療
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の臓器傷害を特異的に且つ予防的又は治療的に回避する方法、そのための予防又は治療剤、及び該予防又は治療剤をスクリーニングする方法を提供するものである。フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害し、ＣＤ８ Ｔ細胞の腸管等への臓器浸潤を特異的に抑制することにより、ＧＶＨＤにおける臓器傷害を防止し、選択的なＧＶＨＤの治療及び予防が可能である。フラクタルカインとケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害には、抗フラクタルカイン抗体を用いる方法を挙げることができる。また本発明は、本発明のＣＤ８ Ｔ細胞の腸管等への臓器浸潤を特異的に抑制する機構を用いて、ＧＶＨＤの臓器傷害予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避する方法、特に、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に且つ予防的又は治療的に回避する方法、そのためのＧＶＨＤ臓器傷害特異的予防又は治療剤、及び該予防又は治療剤の有効成分として用いるＧＶＨＤの臓器傷害に特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の移植医学の進展は目覚しく、例えば、骨髄移植は慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的治療法として注目されている。この移植医学の分野においては、本来的には、生体の有害な物質や生物からの防御反応であるはずの免疫系が働いて、宿主（レシピエント）に移植された材料に対する防御反応として、移植に対する拒絶反応、或いは移植片による宿主臓器の傷害を発生するという重要な問題がある。この移植片の免疫細胞が宿主の抗原に反応し、移植拒絶反応の逆方向の免疫反応を起こすことにより発症する疾病を、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）と呼んでいる。ＧＶＨＤを発症すると、免疫反応による宿主臓器細胞の傷害により、体重減少、下痢、嘔吐、落屑性皮膚炎、肝脾腫大などの重篤な症状を呈し、ついには発育停止、宿主の死をも引き起こす。
【０００３】
このように、移植医学の分野においては、例えば、骨髄移植のように、慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的治療法として細胞の移植が有力な手段として注目されているが，致死的併発疾患であるＧＶＨＤを否めないのが現状である。
【０００４】
ヒトＧＶＨＤは、Ｍａｔｈｅらによって初めて報告された（Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｅｔｕｄ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．，１５：１１５−１６１，１９６０）。ＧＶＨＤは、本質的にはドナー細胞と宿主組織との間の免疫学的反応の臨床症状であり、この臨床的症候群は皮疹、胃腸症状、及び肝機能障害等からなり、通常は例えば同種骨髄移植から２週間以内に認められる。該免疫異常の発生には、免疫適格ドナー細胞による宿主抗原の認識、免疫抑制状態にある宿主（レシピエント）、及びドナーとレシピエントとの間に同種抗原の差があることが必要である。免疫適格ドナー細胞は、成熟Ｔ細胞であり、疾患の臨床的重症は宿主に移植されたＴ細胞の数と相関することが報告されている（ＮＥＪＭ ３２４：６６７，１９９１）。
【０００５】
臓器移植における移植免疫反応は、初回移植後の感作成立による急性拒絶（ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、いったん成立した免疫寛容の破綻による慢性拒絶（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、再移植による促進反応及び再移植直後の既存抗体による超急性拒絶（ｈｙｐｅｒａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）に分けられる。急性ＧＶＨＤではドナーＣＤ８ Ｔ細胞が組織適合抗原不一致のホスト細胞に反応，増殖し，細胞傷害性Ｔ細胞に分化した後，標的臓器である皮膚，肝臓，腸管に浸潤し，臓器傷害を引き起こすと考えられている（Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３８５−３８９，２００１；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２９：２５９−２７７，２００１）。急性ＧＶＨＤにおける臓器傷害の中でも腸管ＧＶＨＤは下痢による脱水や，傷害された腸管上皮を越えて消化管内細菌が生体内に転移する事により全身性の炎症の原因となる等，ＧＶＨＤの重症化に関与していることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：３１７−３２５，１９９９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１００４−１０１１，１９９４；Ｂｌｏｏｄ ９４：８２５−８３１，１９９９；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：１５８１−１５８９，２００１）。
【０００６】
現在の標準的ＧＶＨＤ予防プロトコールは、免疫細胞の増殖過程を標的としたメトトレキセートやシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６等による非特異的免疫抑制であり（「造血細胞移植ガイドライン−ＧＶＨＤの診断と治療に関するガイドライン」日本造血細胞移植学会ガイドライン委員会），また、コルチコステロイド、シクロホスファミド、及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のような広く作用する免疫抑制剤もＧＶＨＤの予防や治療に用いられている。しかしながら、これらの薬剤は、非特異的及び広範囲な免疫抑制効果をもつが故に、その毒性も強く、一方で免疫力低下に伴う感染症や腫瘍の再発が問題となる。したがって，現在、より選択的にＧＶＨＤを回避するのに有効な治療，予防方法及びそのための薬剤の開発が望まれている。
【０００７】
近年、ＧＶＨＤを防止又は処置するためのいくつかの方法やそのための薬剤が開示されている。例えば、特開平９−１８８６３１号公報には、Ｎ−ヒドロキシアミノカルボニル基を有する化合物からなるＦａｓリガンド可溶化抑制剤をＧＶＨＤの予防又は治療剤として用いることについて、特表平９−５１０６０７号公報には、抗Ｂ７−１抗体又は他のＢ７−１リガンドをＧＶＨＤを防止又は処置するために使用することについて、及び、特表平１１−５０８５８６号公報には、Ｃｔｘ若しくはＥｔｘ、又はＣｔｘ及びＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、或いはＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤をＧＶＨＤの予防に用いることについて開示されている。
【０００８】
また、特表２００２−５０５０９７号公報には、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球のような特定の細胞で発現される分子ＣＤ１４７が、ＣＶＨＤのような疾患に用いることができることについて、及び、特表２００３−５１２４３８号公報には、ＧＶＨＤを制御するための免疫寛容を誘導するための方法として、抗原の経粘膜投与又は該抗原をコードする核酸の投与と組み合わせて、１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素のインヒビターを用いて免疫寛容を誘導する方法が開示されている。しかしながら、これらはいずれもまだ開発段階のものであり、現在、選択的にＧＶＨＤを回避する効果的な治療及び予防法やそのための薬剤は見い出されていない。
【０００９】
一方、種々の生物学的過程、例えば免疫細胞の炎症、脈管形成、造血及び器官形成部位への動員を制御する因子、特に、免疫及び炎症中の白血球輸送の過程のレギュレーターであると考えられている因子として、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が知られている。ケモカインは、化学走性サイトカインであり、このサイトカインは広汎な種々の細胞により放出され、マクロファージ、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球及び好中級を炎症部位へと引きつける（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３：１６５−１８３，１９９１；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：８６５−８７３，１９９４；Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．，１２：５９３−６３３，１９９４）。ケモカインは、約７０〜１００個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖を有するタンパク質の大きなファミリーであり、サイトカインファミリーの５０以上のメンバーが既に知られている（ＦＡＳＥＢＪ．，３：２５６５−２５７３，１９８９；Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９，１９９４；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５０：４２５−４４０，１９９９；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３８：４３６−４４５，１９９８）。
【００１０】
既知のケモカインは、典型的にはシステインモチーフの配置に基づいて４つのサブファミリーのうちの１つに割り当てられる。アルファーケモカインＣＸＣ（α）は、４つのシステインのうちの最初の２つが介在性アミノ酸によって分離されることを特徴とし、このケモカインは好中球及びリンパ球に対して主に化学走性である。ベータケモカインＣＣ（β）は、最初の２つのシステインの間に介在性アミノ酸が存在しないことを特徴とし、このケモカインはマクロファージ、Ｔ細胞、好酸球及び好塩基球に対して化学走性である。ガンマーケモカインＣ（γ）は、単一のＣ残基を特徴とし、リンパ球に対する特異性を示す。デルターケモカインＣＸ３Ｃ（δ）は、３つの残基で分離されたシステインの対を特徴とし、リンパ球及び単球について特異性を示す。ケモカインは、Ｇタンパク質共役７回膜貫通ドメインタンパク質に属する特異的細胞表面レセプターに結合し、該ケモカインレセプターとの相互作用により生物学的役割を果たす。
【００１１】
ケモカインのレセプターは、特定のケモカインのサブファミリーに結合することができ、レセプターの名称はケモカインのサブファミリーに限定された結合特性を反映する。例えば、ＣＸＣケモカインに結合するレセプターは、ＣＸＣＲとして表示され、ＣＣケモカインに結合するレセプターはＣＣＲと表示される。サブファミリー特異的レセプターの表示の後に、該特定のレセプターの発見順序を示す数値が表示される。例えば、ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＲとして４番目に発見されたことを示している。
【００１２】
近年、ケモカインスーパーファミリーにおいて、新たなケモカインとしてフラクタルカイン（ＦＫＮ）が単離・報告された（Ｎａｔｕｒｅ，３８５（６６１７）：６４０−６４４，１９９７）。フラクタルカインは、ＣＸ３Ｃケモカインモチーフとムチン様領域を有するムチン−ケモカインハイブリッド型構造を有し、膜結合型と分泌型の二つのタイプが存在する。膜結合型のフラクタルカインは、炎症性サイトカインの刺激により血管内皮前駆細胞の細胞表面に強く発現誘導され、ＮＫ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞接着を促進する。一方、フラクタルカインタンパク質の細胞膜膜貫通領域基部に存在する切断部位でプロテアーゼによって切断されることにより分泌型となったフラクタルカインは、これらの白血球細胞の遊走を誘導する。
【００１３】
ＣＸ３ＣＲ１は、他のケモカイン受容体と同様に７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体であり、フラクタルカイン受容体として単離された（Ｃｅｌｌ，９１（４）：５２１−５３０，１９９７）。ＣＸ３ＣＲ１は、ＮＫ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞表面に発現しており、フラクタルカインの結合を介してこれらの白血球細胞の遊走と接着の両方を仲介する。
【００１４】
本発明の課題は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避する方法、特に、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に且つ予防的又は治療的に回避する方法、そのためのＧＶＨＤ臓器傷害特異的予防又は治療剤、及び該予防又は治療剤の有効成分として用いるＧＶＨＤの臓器傷害に特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１５】
本発明者は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避し、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に回避する方法について鋭意研究する中で、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害し、ＣＤ８ Ｔ細胞の腸管等への臓器浸潤を特異的に抑制することにより、ＧＶＨＤにおける臓器傷害を防止し、選択的なＧＶＨＤの治療及び予防が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明者は急性ＧＶＨＤにおける臓器傷害が皮膚，肝臓，腸管に限定されていることに注目し，その機構としてＧＶＨＤ後期において細胞傷害性を獲得したドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器特異的浸潤を考え，この浸潤過程を抑制することにより，選択的なＧＶＨＤの治療，予防が可能になると考えた。そこで、今回本発明者は急性ＧＶＨＤモデル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５５：２３９６−２４０６，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６１：２８４８−２８５５，１９９８）を用い，抗フラクタルカイン抗体投与によりフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する試験を行った結果、ＧＶＨＤ後期におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤に，腸管上皮および血管内皮に発現するフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するＣＸ３ＣＲ１の相互作用が重要な役割を果たしており，この相互作用を阻害することで腸管ＧＶＨＤを軽減できることを見い出した。
【００１７】
本発明において、ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制のために、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害するには、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能を阻害することにより行うことができる。フラクタルカイン及び／又はケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能を阻害する方法としては、例えば、フラクタルカイン或いはケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の発現を遺伝子操作によって阻止する方法、或いは、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の拮抗阻害剤を用いる方法等を挙げることができる。フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害に、抗フラクタルカイン抗体を用いる方法は、特に、好ましい方法として挙げることができる。
【００１８】
本発明は、また、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することにより、移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法を包含する。該スクリーニング方法において、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことができる。
【発明の開示】
【００１９】
すなわち具体的には本発明は、（１）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制することにより移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（２）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害であることを特徴とする（１）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（３）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害であることを特徴とする（２）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（４）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、抗フラクタルカイン抗体を用いた相互作用の阻害であることを特徴とする（２）又は（３）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（５）抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（４）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（６）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、腸管への細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法からなる。
【００２０】
また本発明は、（７）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（８）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害物質であることを特徴とする（７）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（９）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする（７）又は（８）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（１０）抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（９）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤からなる。
【００２１】
さらに本発明は、（１１）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１２）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことを特徴とする（１１）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１３）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管への浸潤であることを特徴とする（１１）又は（１２）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１４）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデルマウスであることを特徴とする（１１）〜（１３）のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１５）（１１）〜（１４）のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤からなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】第１図は、本発明の実施例において、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤と腸管傷害の相関について試験した結果を示す図である。Ａは、脾臓、腸管膜リンパ節、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤、Ｂは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管組織像（ＨＥ染色）、Ｃは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管におけるアポトーシス細胞の検出について示す。
【図２】第２図は、本発明の実施例において、腸管ＧＶＨＤにおけるフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の関与について試験した結果を示す図である。Ａは、移入前及びＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターの遺伝子発現、Ｂは、移入及びＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管、肝臓におけるケモカインの遺伝子発現、Ｃは、ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管におけるフラクタルカイン発現とドナーリンパ球の浸潤について示す。
【図３】第３図は、本発明の実施例において、抗フラクタルカイン抗体投与によるドナーＣＤ８Ｔ細胞の腸管浸潤の抑制について試験した結果を示す図である。
【図４】第４図は、本発明の実施例において、抗フラクタルカイン抗体投与による腸管ＧＶＨＤの軽減について試験した結果を示す図である。Ａは、Ｔｕｎｅｌ法による腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞の検出、Ｂは、腸管陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数について示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、ケモカインのフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害すること等により、ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制し、ＧＶＨＤの発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法よりなる。
【００２４】
フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１は、既知のタンパク質であり（Ｎａｔｕｒｅ，３８５（６６１７）：６４０−６４４，１９９７；Ｃｅｌｌ，９１（４）：５２１−５３０，１９９７）、その遺伝子及びタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデーターベースでアクセッションナンバー、ＮＭ＿００１３３７及びＮＭ＿００２９９６によってアクセスすることができる。
【００２５】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害方法としては、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１のそれぞれの機能の阻害によって行うことができ、該機能の阻害には、既知の方法を利用することができる。該方法としては、フラクタルカイン或いはドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の遺伝子の発現を遺伝子操作により制御し、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１のそれぞれの機能を阻害することができる。該遺伝子の発現の制御には、アンチセンス法等、既知の遺伝子操作による発現の制御方法を用いることができる。すなわち、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の既知の配列に基づいて、該配列のアンチセンス鎖を構築し、該配列を細胞に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。
【００２６】
また、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の拮抗薬（アンタゴニスト）を用いて、リガンドであるフラクタルカインのＣＸ３ＣＲ１受容体への結合を拮抗的に阻害し、フラクタルカインとケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１との相互作用を阻害することができる。フラクタルカインとケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害の特に好ましい方法として、抗フラクタルカイン抗体を用いる方法を挙げることができる。該抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いることができる。該抗体の作製は、フラクタルカインタンパク質を用いて、哺乳動物（マウス、ハムスター、ウサギ等）を感さし、それ自体既知の方法で作製することができる（特開２００２−３４５４５４号公報）。
【００２７】
更に、本発明は、本発明で見い出したＧＶＨＤにおいて臓器傷害を発症する機構を利用して、臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニングを行う方法を包含する。本発明のスクリーニング方法を行うには、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入ＧＶＨＤ発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することにより、被検物質の作用を評価して行うことができる。ＧＶＨＤ発症モデル動物に被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価するには、該モデル動物に被検物質を投与した後、組織を切開し、抗体を用いた蛍光免疫組織染色等を用いて、直接、組織学的にドナーＣＤ８ Ｔ細胞の組織への浸潤を検出・測定することにより行うことができる。
【００２８】
また、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことができる。ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価には、既知の遺伝子工学的操作による遺伝子発現の検知方法により行うことができる。例えば、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及びフラクタルカインの既知の遺伝子配列からプローブを構築し、該プローブを用いて、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の遺伝子及びフラクタルカインの遺伝子の発現を検知することができる。また、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価を、該タンパク質に対する抗体を用いて、抗原抗体法により検知・評価することができる。該抗原抗体法における望ましい例としては、蛍光抗体法を挙げることができる。
【００２９】
本発明のＧＶＨＤの臓器傷害特異的予防又は治療剤を生体に投与するには、本発明の予防又は治療剤の有効成分を、それ自体公知の薬理学的に許容される担体又は希釈剤等からなる補助成分を用いて製剤化し、経口的或いは非経口的に投与することができる。非経口的に投与する場合には、例えば静脈内、筋肉内又は皮下経路によって投与するため、製剤を注射可能な形態に形成する。また、粘膜投与可能な状態に製剤化し、粘膜を通して投与を行うことができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［材料と方法］
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６：Ｈ２ｂ）：日本クレアより購入した。
（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１マウス（ＢＤＦ１：Ｌｙ５．２、Ｈ２ｂ×ｄ）：日本クレアより購入した。ＧＦＰトランスジェニックＢ６マウス（ＧＦＰ−Ｂ６）：岡部博士（大阪大学）より分与された。Ｌｙ５．１コンジェニックＢ６マウス（Ｌｙ５．１−Ｂ６）：石川博士（慶応大学）より分与された。全ての動物実験は東京大学動物実験ガイドラインに従って行い、実験には８週齢から１２週齢の雌を用いた。
（抗体）
ｂｉｏｔｉｎ標識マウスモノクローナル抗Ｌｙ５．１抗体、ＰＥ標識ラットモノクローナル抗マウスＣＤ８抗体、精製ラットモノクローナル抗マウスＣＤ１６／３２抗体はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから、精製ヤギポリクローナル抗マウスフラクタルカイン抗体はＲ＆Ｄから、精製ウサギポリクローナル抗サイトケラチン抗体はＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃから、Ａｌｅｘａ ５４６標識抗ヤギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎはＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅから購入した。精製ハムスターモノクローナル抗フラクタルカイン抗体（５Ｈ８−４，特開２００２−３４５４５４号公報）は今井博士（（株）カン研究所）より譲渡された。
（リンパ球の調整）
脾臓リンパ球：頸椎脱臼により屠殺したマウスより脾臓を摘出後、ＰＢＳ中ですり潰し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、ペレットをＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ ｐＨ７．４，１ｍｌ／マウス）に再懸濁し、赤血球を溶血させ、除去した。ＰＢＳにより遠心洗浄後、ナイロンメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞塊を除いた物を脾臓リンパ球とした。
【００３２】
腸管膜リンパ節リンパ球：腸管膜リンパ節を摘出後、脂肪組織を除去し、ＰＢＳ中ですり潰し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、ナイロンメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞塊を除いた物を腸管膜リンパ節リンパ球とした。
【００３３】
腸管リンパ球：腸管を胃幽門部から回腸末端にかけて摘出し、腸管膜を除去後反転した。腸管をパイエル板をさけて４等分し、４５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／５％ＦＢＳ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを満たした５０ｍｌコニカルチューブに移した。３７℃、１６０ｒｐｍ、４５分間水平に振盪し、得られた上清をナイロンウールカラムを通すことにより細胞塊を除去し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、４５％（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁し、７５％Ｐｅｒｃｏｌを下層後、ＲＴ、２０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。４５％／７５％ ｐｅｒｃｏｌの中間層からリンパ球画分を回収し、これを腸管リンパ球とした。
【００３４】
肝臓リンパ球：脱血屠殺したマウスより肝臓を摘出後、ＲＰＭＩ−１６４０／５％ ＦＢＳ中ですり潰し、ステンレスメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後ペレットを３３％Ｐｅｒｃｏｌに再懸濁し、ＲＴ，２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。肝細胞を含む上清を除去した後、ペレットを１ｍｌのＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、赤血球を溶血させた。遠心洗浄後、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁しこれを肝臓リンパ球とした。
（急性ＧＶＨＤモデル）
非放射線照射ＢＤＦ１マウスに、ＧＦＰ−Ｂ６（ＦＣＭ解析時）またはＬｙ５．１−Ｂ６（組織染色時）の脾臓細胞（６×１０７）を静脈注射により移入した。ドナーリンパ球の臓器浸潤を経時的に解析するため、ドナー細胞移入後５、８、１０、１２、１４日のＢＤＦ１マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、小腸よりリンパ球を調整した。トリパンブルー染色法により生細胞数を計測後、Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）解析を行い、ＧＦＰ陽性 ＣＤ８陽性細胞の割合からドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数を算出した。
（ＦＣＭ解析）
細胞懸濁液に抗マウスＣＤ１６／３２抗体（０．０１μｇ／２×１０５ｃｅｌｌｓ）を加え、４℃、１０分間インキュベートし、ＦＣ受容体を介した非特異的結合を阻害した。次いでＰＥ標識抗マウスＣＤ８抗体（０．０５μｇ／２×１０５ｃｅｌｌｓ）を加え、４℃、２０分間インキュベートした後ＰＢＳを加え、遠心洗浄した。ＦＣＭ解析はＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）により行い、また死細胞はＰＩ染色（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）により除去した。
（腸管ＧＶＨＤの評価）
腸管組織を長軸方向に切り開き、５μｍ四方のシート状にトリミングした状態でＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｃｋ）に包埋し、液体窒素中で凍結した。クリオスタットにより厚さ６μｍの凍結切片を作成し、ＨＥ染色により腸管陰窩部の組織像を評価した。またｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。Ｔｕｎｅｌ法と抗サイトケラチン抗体および抗Ｌｙ５．１抗体を用いた蛍光免疫組織染色を組み合わせ、腸管陰窩部における上皮細胞のアポトーシスおよびドナー細胞の浸潤を検出した。さらに腸管傷害を定量するため、陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数を計数した。
（ＲＴ−ＰＣＲ）
移入前のドナーＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管または肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞（１−１０×１０４個）をセルソーターにより分取後、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。また、正常及びＧＶＨＤ誘導後１０日目のＢＤＦ１マウスより肝臓、小腸を採取しＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。得られたＲＮＡ（２００ｎｇ）をＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｐｉｔａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｃｈ）およびＲａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの一部をテンプレートとして各種プライマー及びＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＰｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、反応溶液を調整した。添付の説明書にリアルタイムＰＣＲはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。反応液の組成及びＰＣＲの条件はＰｌａｔｉｎｕｍ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＰｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧに添付の説明書に従った。ケモカインレセプター・ケモカイン遺伝子の発現はＧＡＰＤＨを内部標準とした相対値で示した。使用した各種プライマー及びＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅは表１に示した。
【００３５】
【表１】
（フラクタルカインの蛍光免疫組織染色）
ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管より厚さ６μｍの凍結切片を作成した。１次抗体にヤギ抗フラクタルカイン抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）及びｂｉｏｔｉｎ標識抗Ｌｙ５．１抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）、２次抗体にＡｌｅｘａ ５４６標識抗ヤギＩｇＧ抗体（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）およびＡｌｅｘａ ４８８標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を用いて蛍光２重染色を行った。また、抗フラクタルカイン抗体のコントロールとしてヤギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いた。共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてフラクタルカインの発現および腸管に浸潤したドナー細胞との位置関係を解析した。
（抗フラクタルカイン抗体実験）
２００μｇの抗フラクタルカイン抗体またはハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１００μｌのＰＢＳに溶解し、ＧＶＨＤ誘導後６、８、１０日目に腹腔内投与した。１４日目に小腸、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数を測定し、抗フラクタルカイン抗体投与がドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤に及ぼす影響を評価した。また、Ｔｕｎｅｌ法により小腸におけるアポトーシス細胞数を測定し、抗フラクタルカイン抗体処理が腸管傷害に及ぼす影響を評価した。
［結果と考察］
（図１）
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤と腸管傷害の相関について図１に示す。Ａは、脾臓、腸管膜リンパ節、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤、Ｂは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管組織像（ＨＥ染色）、Ｃは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管におけるアポトーシス細胞の検出について示す。
【００３６】
ＦＣＭ解析により、脾臓、腸管膜リンパ節においてドナーＣＤ８ Ｔ細胞浸潤のピークが１０日目であるのに対し、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤は１０日目から始まり、腸管ＧＶＨＤの極期である１４日目にかけて急速に進行するという異なった動態を示した（図１−Ａ）。また、ＨＥ染色およびＴｕｎｅｌ法により、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤に伴い腸管陰窩部の過形成、アポトーシス細胞の増加、陰窩部の破壊といった腸管ＧＶＨＤに特有の症状が認められた（図１−Ｂ，Ｃ）。
【００３７】
以上の結果から、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞が腸管への浸潤能を獲得するのはＧＶＨＤ後期であること、また急激なドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤が腸管ＧＶＨＤの発症と深く関連していることが明らかとなった。
（図２）
腸管ＧＶＨＤにおけるフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の関与について図２に示す。Ａは、移入前及びＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターの遺伝子発現、Ｂは、移入及びＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管、肝臓におけるケモカインの遺伝子発現、Ｃは、ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管におけるフラクタルカイン発現とドナーリンパ球の浸潤について示す。
【００３８】
ＧＶＨＤ後期におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤に関与する分子をリアルタイムＰＣＲにより検索したところ、移入後１０日目に腸管に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞においてケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の発現が特徴的に上昇しており、また腸管組織においてＣＸ３ＣＲ１のリガンドであるフラクタルカインが発現していることが明らかとなった（図２−Ａ，Ｂ）。抗フラクタルカイン抗体を用いた蛍光免疫組織染色により、腸管上皮細胞および血管内皮細胞に特異的な染色が認められ、またＬｙ５．１陽性ドナーリンパ球がフラクタルカイン陽性腸管上皮細胞の基底側に接着している像も認められた（図２−Ｃ）。
【００３９】
以上の結果から、ＧＶＨＤ後期にドナーＣＤ８ Ｔ細胞がＣＸ３ＣＲ１の発現を上昇させ、フラクタルカインを発現する腸管への浸潤能を獲得することにより、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤および腸管ＧＶＨＤが引き起こされる事が示唆された。
（図３）
抗フラクタルカイン抗体投与によるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤の抑制について、図３に表す。
【００４０】
抗フラクタルカイン抗体をＧＶＨＤ後期である６、８、１０日目に投与したところ、コントロール抗体投与群と比較し腸管に浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数が有意に減少した。一方で肝臓に浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数には有意な差は認められなかった。
【００４１】
以上の結果より、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤にフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の相互作用が重要な役割をはたしていることが明らかとなった。
（図４）
抗フラクタルカイン抗体投与による腸管ＧＶＨＤの軽減について図４に示す。Ａは、Ｔｕｎｅｌ法による腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞の検出、Ｂは、腸管陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数について示す。
【００４２】
抗フラクタルカイン抗体投与の腸管組織傷害への影響をＴｕｎｅｌ法によるアポトーシス細胞数の測定で評価したところ、抗フラクタルカイン抗体投与群において腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞が減少した。
【００４３】
以上の結果より、抗フラクタルカイン抗体投与によりＧＶＨＤにおける腸管傷害が改善されることが明らかになった。
（図１−４）
図１−図４の結果から急性ＧＶＨＤにおける腸管傷害は、ＧＶＨＤ後期に腸管へ浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞によって引き起こされること、更にドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤にはフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の相互作用が関与しており、この相互作用を阻害することによりＧＶＨＤにおける腸管傷害を軽減できることが明らかとなった。フラクタルカインを標的とする予防・治療法は免疫抑制剤を用いる従来法に比較し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤を選択的に抑制する方法であり、またＧＶＨＤにおける生死に関わる最も重篤な腸管傷害をＧＶＨＤ後期においても治療可能とするものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
骨髄移植が慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的な治療法であるように、細胞移植は医術の分野において有力な治療の手段であるが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、これらの移植による治療を行う際に重大な障害となる。現在、標準的ＧＶＨＤ予防プロトコールは、免疫細胞の増殖過程を標的とした非特異的免疫抑制剤や広く作用する免疫抑制剤が用いられているが、しかし、これらの薬剤は、非特異的及び広範囲な免疫抑制効果をもつが故に、その毒性も強く、一方で免疫力低下に伴う感染症や腫瘍の再発が問題となっている。本発明のＧＶＨＤ予防、治療剤、及びＧＶＨＤの予防、治療方法は、ＧＶＨＤにおいて臓器傷害を発症する機構を特異的に阻害して、臓器傷害を防止又は治療効果を発揮するため、より選択的にＧＶＨＤを回避することが可能となる。特に、本発明のＧＶＨＤ治療剤及びＧＶＨＤの治療方法は、フラクタルカインを標的とすることによって、ＧＶＨＤ発症後においても効果が期待でき、従来の免疫抑制剤にない特徴を有している。また、本発明においては、本発明で見い出されたＧＶＨＤにおける臓器傷害の発症機構を利用して、臓器傷害に対して特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニングを行う方法を提供でき、より選択的にＧＶＨＤを回避する予防及び治療剤の開発を可能とする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避する方法、特に、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に且つ予防的又は治療的に回避する方法、そのためのＧＶＨＤ臓器傷害特異的予防又は治療剤、及び該予防又は治療剤の有効成分として用いるＧＶＨＤの臓器傷害に特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の移植医学の進展は目覚しく、例えば、骨髄移植は慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的治療法として注目されている。この移植医学の分野においては、本来的には、生体の有害な物質や生物からの防御反応であるはずの免疫系が働いて、宿主（レシピエント）に移植された材料に対する防御反応として、移植に対する拒絶反応、或いは移植片による宿主臓器の傷害を発生するという重要な問題がある。この移植片の免疫細胞が宿主の抗原に反応し、移植拒絶反応の逆方向の免疫反応を起こすことにより発症する疾病を、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）と呼んでいる。ＧＶＨＤを発症すると、免疫反応による宿主臓器細胞の傷害により、体重減少、下痢、嘔吐、落屑性皮膚炎、肝脾腫大などの重篤な症状を呈し、ついには発育停止、宿主の死をも引き起こす。
【０００３】
このように、移植医学の分野においては、例えば、骨髄移植のように、慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的治療法として細胞の移植が有力な手段として注目されているが，致死的併発疾患であるＧＶＨＤを否めないのが現状である。
【０００４】
ヒトＧＶＨＤは、Ｍａｔｈｅらによって初めて報告された（Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｅｔｕｄ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．，１５：１１５−１６１，１９６０）。ＧＶＨＤは、本質的にはドナー細胞と宿主組織との間の免疫学的反応の臨床症状であり、この臨床的症候群は皮疹、胃腸症状、及び肝機能障害等からなり、通常は例えば同種骨髄移植から２週間以内に認められる。該免疫異常の発生には、免疫適格ドナー細胞による宿主抗原の認識、免疫抑制状態にある宿主（レシピエント）、及びドナーとレシピエントとの間に同種抗原の差があることが必要である。免疫適格ドナー細胞は、成熟Ｔ細胞であり、疾患の臨床的重症は宿主に移植されたＴ細胞の数と相関することが報告されている（ＮＥＪＭ ３２４：６６７，１９９１）。
【０００５】
臓器移植における移植免疫反応は、初回移植後の感作成立による急性拒絶（ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、いったん成立した免疫寛容の破綻による慢性拒絶（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、再移植による促進反応及び再移植直後の既存抗体による超急性拒絶（ｈｙｐｅｒａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）に分けられる。急性ＧＶＨＤではドナーＣＤ８ Ｔ細胞が組織適合抗原不一致のホスト細胞に反応，増殖し，細胞傷害性Ｔ細胞に分化した後，標的臓器である皮膚，肝臓，腸管に浸潤し，臓器傷害を引き起こすと考えられている（Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３８５−３８９，２００１；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２９：２５９−２７７，２００１）。急性ＧＶＨＤにおける臓器傷害の中でも腸管ＧＶＨＤは下痢による脱水や，傷害された腸管上皮を越えて消化管内細菌が生体内に転移する事により全身性の炎症の原因となる等，ＧＶＨＤの重症化に関与していることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：３１７−３２５，１９９９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１００４−１０１１，１９９４；Ｂｌｏｏｄ ９４：８２５−８３１，１９９９；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：１５８１−１５８９，２００１）。
【０００６】
現在の標準的ＧＶＨＤ予防プロトコールは、免疫細胞の増殖過程を標的としたメトトレキセートやシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６等による非特異的免疫抑制であり（「造血細胞移植ガイドライン−ＧＶＨＤの診断と治療に関するガイドライン」日本造血細胞移植学会ガイドライン委員会），また、コルチコステロイド、シクロホスファミド、及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のような広く作用する免疫抑制剤もＧＶＨＤの予防や治療に用いられている。しかしながら、これらの薬剤は、非特異的及び広範囲な免疫抑制効果をもつが故に、その毒性も強く、一方で免疫力低下に伴う感染症や腫瘍の再発が問題となる。したがって，現在、より選択的にＧＶＨＤを回避するのに有効な治療，予防方法及びそのための薬剤の開発が望まれている。
【０００７】
近年、ＧＶＨＤを防止又は処置するためのいくつかの方法やそのための薬剤が開示されている。例えば、特開平９−１８８６３１号公報には、Ｎ−ヒドロキシアミノカルボニル基を有する化合物からなるＦａｓリガンド可溶化抑制剤をＧＶＨＤの予防又は治療剤として用いることについて、特表平９−５１０６０７号公報には、抗Ｂ７−１抗体又は他のＢ７−１リガンドをＧＶＨＤを防止又は処置するために使用することについて、及び、特表平１１−５０８５８６号公報には、Ｃｔｘ若しくはＥｔｘ、又はＣｔｘ及びＥｔｘのＢサブユニット以外の、ＧＭ−１結合活性を有する薬剤、或いはＧＭ−１結合活性を有さないが、細胞内情報伝達が媒介されるＧＭ−１に影響を及ぼす薬剤をＧＶＨＤの予防に用いることについて開示されている。
【０００８】
また、特表２００２−５０５０９７号公報には、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球のような特定の細胞で発現される分子ＣＤ１４７が、ＣＶＨＤのような疾患に用いることができることについて、及び、特表２００３−５１２４３８号公報には、ＧＶＨＤを制御するための免疫寛容を誘導するための方法として、抗原の経粘膜投与又は該抗原をコードする核酸の投与と組み合わせて、１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素のインヒビターを用いて免疫寛容を誘導する方法が開示されている。しかしながら、これらはいずれもまだ開発段階のものであり、現在、選択的にＧＶＨＤを回避する効果的な治療及び予防法やそのための薬剤は見い出されていない。
【０００９】
一方、種々の生物学的過程、例えば免疫細胞の炎症、脈管形成、造血及び器官形成部位への動員を制御する因子、特に、免疫及び炎症中の白血球輸送の過程のレギュレーターであると考えられている因子として、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が知られている。ケモカインは、化学走性サイトカインであり、このサイトカインは広汎な種々の細胞により放出され、マクロファージ、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球及び好中級を炎症部位へと引きつける（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３：１６５−１８３，１９９１；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：８６５−８７３，１９９４；Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．，１２：５９３−６３３，１９９４）。ケモカインは、約７０〜１００個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖を有するタンパク質の大きなファミリーであり、サイトカインファミリーの５０以上のメンバーが既に知られている（ＦＡＳＥＢＪ．，３：２５６５−２５７３，１９８９；Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９，１９９４；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５０：４２５−４４０，１９９９；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３８：４３６−４４５，１９９８）。
【００１０】
既知のケモカインは、典型的にはシステインモチーフの配置に基づいて４つのサブファミリーのうちの１つに割り当てられる。アルファーケモカインＣＸＣ（α）は、４つのシステインのうちの最初の２つが介在性アミノ酸によって分離されることを特徴とし、このケモカインは好中球及びリンパ球に対して主に化学走性である。ベータケモカインＣＣ（β）は、最初の２つのシステインの間に介在性アミノ酸が存在しないことを特徴とし、このケモカインはマクロファージ、Ｔ細胞、好酸球及び好塩基球に対して化学走性である。ガンマーケモカインＣ（γ）は、単一のＣ残基を特徴とし、リンパ球に対する特異性を示す。デルターケモカインＣＸ３Ｃ（δ）は、３つの残基で分離されたシステインの対を特徴とし、リンパ球及び単球について特異性を示す。ケモカインは、Ｇタンパク質共役７回膜貫通ドメインタンパク質に属する特異的細胞表面レセプターに結合し、該ケモカインレセプターとの相互作用により生物学的役割を果たす。
【００１１】
ケモカインのレセプターは、特定のケモカインのサブファミリーに結合することができ、レセプターの名称はケモカインのサブファミリーに限定された結合特性を反映する。例えば、ＣＸＣケモカインに結合するレセプターは、ＣＸＣＲとして表示され、ＣＣケモカインに結合するレセプターはＣＣＲと表示される。サブファミリー特異的レセプターの表示の後に、該特定のレセプターの発見順序を示す数値が表示される。例えば、ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＲとして４番目に発見されたことを示している。
【００１２】
近年、ケモカインスーパーファミリーにおいて、新たなケモカインとしてフラクタルカイン（ＦＫＮ）が単離・報告された（Ｎａｔｕｒｅ，３８５（６６１７）：６４０−６４４，１９９７）。フラクタルカインは、ＣＸ３Ｃケモカインモチーフとムチン様領域を有するムチン−ケモカインハイブリッド型構造を有し、膜結合型と分泌型の二つのタイプが存在する。膜結合型のフラクタルカインは、炎症性サイトカインの刺激により血管内皮前駆細胞の細胞表面に強く発現誘導され、ＮＫ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞接着を促進する。一方、フラクタルカインタンパク質の細胞膜膜貫通領域基部に存在する切断部位でプロテアーゼによって切断されることにより分泌型となったフラクタルカインは、これらの白血球細胞の遊走を誘導する。
【００１３】
ＣＸ３ＣＲ１は、他のケモカイン受容体と同様に７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体であり、フラクタルカイン受容体として単離された（Ｃｅｌｌ，９１（４）：５２１−５３０，１９９７）。ＣＸ３ＣＲ１は、ＮＫ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞表面に発現しており、フラクタルカインの結合を介してこれらの白血球細胞の遊走と接着の両方を仲介する。
【００１４】
本発明の課題は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避する方法、特に、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に且つ予防的又は治療的に回避する方法、そのためのＧＶＨＤ臓器傷害特異的予防又は治療剤、及び該予防又は治療剤の有効成分として用いるＧＶＨＤの臓器傷害に特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１５】
本発明者は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を予防的又は治療的に回避し、ＧＶＨＤの臓器傷害を特異的に回避する方法について鋭意研究する中で、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害し、ＣＤ８ Ｔ細胞の腸管等への臓器浸潤を特異的に抑制することにより、ＧＶＨＤにおける臓器傷害を防止し、選択的なＧＶＨＤの治療及び予防が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明者は急性ＧＶＨＤにおける臓器傷害が皮膚，肝臓，腸管に限定されていることに注目し，その機構としてＧＶＨＤ後期において細胞傷害性を獲得したドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器特異的浸潤を考え，この浸潤過程を抑制することにより，選択的なＧＶＨＤの治療，予防が可能になると考えた。そこで、今回本発明者は急性ＧＶＨＤモデル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５５：２３９６−２４０６，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６１：２８４８−２８５５，１９９８）を用い，抗フラクタルカイン抗体投与によりフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する試験を行った結果、ＧＶＨＤ後期におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤に，腸管上皮および血管内皮に発現するフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するＣＸ３ＣＲ１の相互作用が重要な役割を果たしており，この相互作用を阻害することで腸管ＧＶＨＤを軽減できることを見い出した。
【００１７】
本発明において、ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制のために、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害するには、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能を阻害することにより行うことができる。フラクタルカイン及び／又はケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能を阻害する方法としては、例えば、フラクタルカイン或いはケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の発現を遺伝子操作によって阻止する方法、或いは、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の拮抗阻害剤を用いる方法等を挙げることができる。フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害に、抗フラクタルカイン抗体を用いる方法は、特に、好ましい方法として挙げることができる。
【００１８】
本発明は、また、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することにより、移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法を包含する。該スクリーニング方法において、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことができる。
【発明の開示】
【００１９】
すなわち具体的には本発明は、（１）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制することにより移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（２）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害であることを特徴とする（１）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（３）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害であることを特徴とする（２）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（４）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、抗フラクタルカイン抗体を用いた相互作用の阻害であることを特徴とする（２）又は（３）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（５）抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（４）記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法や、（６）ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、腸管への細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法からなる。
【００２０】
また本発明は、（７）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（８）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害物質であることを特徴とする（７）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（９）フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする（７）又は（８）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤や、（１０）抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（９）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤からなる。
【００２１】
さらに本発明は、（１１）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１２）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことを特徴とする（１１）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１３）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管への浸潤であることを特徴とする（１１）又は（１２）記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１４）ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデルマウスであることを特徴とする（１１）〜（１３）のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法や、（１５）（１１）〜（１４）のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤からなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】第１図は、本発明の実施例において、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤と腸管傷害の相関について試験した結果を示す図である。Ａは、脾臓、腸管膜リンパ節、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤、Ｂは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管組織像（ＨＥ染色）、Ｃは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管におけるアポトーシス細胞の検出について示す。
【図２】第２図は、本発明の実施例において、腸管ＧＶＨＤにおけるフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の関与について試験した結果を示す図である。Ａは、移入前及びＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターの遺伝子発現、Ｂは、移入及びＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管、肝臓におけるケモカインの遺伝子発現、Ｃは、ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管におけるフラクタルカイン発現とドナーリンパ球の浸潤について示す。
【図３】第３図は、本発明の実施例において、抗フラクタルカイン抗体投与によるドナーＣＤ８Ｔ細胞の腸管浸潤の抑制について試験した結果を示す図である。
【図４】第４図は、本発明の実施例において、抗フラクタルカイン抗体投与による腸管ＧＶＨＤの軽減について試験した結果を示す図である。Ａは、Ｔｕｎｅｌ法による腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞の検出、Ｂは、腸管陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数について示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、ケモカインのフラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害すること等により、ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制し、ＧＶＨＤの発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法よりなる。
【００２４】
フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１は、既知のタンパク質であり（Ｎａｔｕｒｅ，３８５（６６１７）：６４０−６４４，１９９７；Ｃｅｌｌ，９１（４）：５２１−５３０，１９９７）、その遺伝子及びタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデーターベースでアクセッションナンバー、ＮＭ＿００１３３７及びＮＭ＿００２９９６によってアクセスすることができる。
【００２５】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害方法としては、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１のそれぞれの機能の阻害によって行うことができ、該機能の阻害には、既知の方法を利用することができる。該方法としては、フラクタルカイン或いはドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の遺伝子の発現を遺伝子操作により制御し、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１のそれぞれの機能を阻害することができる。該遺伝子の発現の制御には、アンチセンス法等、既知の遺伝子操作による発現の制御方法を用いることができる。すなわち、フラクタルカイン及びケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の既知の配列に基づいて、該配列のアンチセンス鎖を構築し、該配列を細胞に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。
【００２６】
また、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の拮抗薬（アンタゴニスト）を用いて、リガンドであるフラクタルカインのＣＸ３ＣＲ１受容体への結合を拮抗的に阻害し、フラクタルカインとケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１との相互作用を阻害することができる。フラクタルカインとケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害の特に好ましい方法として、抗フラクタルカイン抗体を用いる方法を挙げることができる。該抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いることができる。該抗体の作製は、フラクタルカインタンパク質を用いて、哺乳動物（マウス、ハムスター、ウサギ等）を感さし、それ自体既知の方法で作製することができる（特開２００２−３４５４５４号公報）。
【００２７】
更に、本発明は、本発明で見い出したＧＶＨＤにおいて臓器傷害を発症する機構を利用して、臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニングを行う方法を包含する。本発明のスクリーニング方法を行うには、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入ＧＶＨＤ発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することにより、被検物質の作用を評価して行うことができる。ＧＶＨＤ発症モデル動物に被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価するには、該モデル動物に被検物質を投与した後、組織を切開し、抗体を用いた蛍光免疫組織染色等を用いて、直接、組織学的にドナーＣＤ８ Ｔ細胞の組織への浸潤を検出・測定することにより行うことができる。
【００２８】
また、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことができる。ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価には、既知の遺伝子工学的操作による遺伝子発現の検知方法により行うことができる。例えば、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及びフラクタルカインの既知の遺伝子配列からプローブを構築し、該プローブを用いて、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の遺伝子及びフラクタルカインの遺伝子の発現を検知することができる。また、ケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価を、該タンパク質に対する抗体を用いて、抗原抗体法により検知・評価することができる。該抗原抗体法における望ましい例としては、蛍光抗体法を挙げることができる。
【００２９】
本発明のＧＶＨＤの臓器傷害特異的予防又は治療剤を生体に投与するには、本発明の予防又は治療剤の有効成分を、それ自体公知の薬理学的に許容される担体又は希釈剤等からなる補助成分を用いて製剤化し、経口的或いは非経口的に投与することができる。非経口的に投与する場合には、例えば静脈内、筋肉内又は皮下経路によって投与するため、製剤を注射可能な形態に形成する。また、粘膜投与可能な状態に製剤化し、粘膜を通して投与を行うことができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［材料と方法］
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６：Ｈ２ｂ）：日本クレアより購入した。
（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１マウス（ＢＤＦ１：Ｌｙ５．２、Ｈ２ｂ×ｄ）：日本クレアより購入した。ＧＦＰトランスジェニックＢ６マウス（ＧＦＰ−Ｂ６）：岡部博士（大阪大学）より分与された。Ｌｙ５．１コンジェニックＢ６マウス（Ｌｙ５．１−Ｂ６）：石川博士（慶応大学）より分与された。全ての動物実験は東京大学動物実験ガイドラインに従って行い、実験には８週齢から１２週齢の雌を用いた。
（抗体）
ｂｉｏｔｉｎ標識マウスモノクローナル抗Ｌｙ５．１抗体、ＰＥ標識ラットモノクローナル抗マウスＣＤ８抗体、精製ラットモノクローナル抗マウスＣＤ１６／３２抗体はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから、精製ヤギポリクローナル抗マウスフラクタルカイン抗体はＲ＆Ｄから、精製ウサギポリクローナル抗サイトケラチン抗体はＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃから、Ａｌｅｘａ ５４６標識抗ヤギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎはＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅから購入した。精製ハムスターモノクローナル抗フラクタルカイン抗体（５Ｈ８−４，特開２００２−３４５４５４号公報）は今井博士（（株）カン研究所）より譲渡された。
（リンパ球の調整）
脾臓リンパ球：頸椎脱臼により屠殺したマウスより脾臓を摘出後、ＰＢＳ中ですり潰し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、ペレットをＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ ｐＨ７．４，１ｍｌ／マウス）に再懸濁し、赤血球を溶血させ、除去した。ＰＢＳにより遠心洗浄後、ナイロンメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞塊を除いた物を脾臓リンパ球とした。
【００３２】
腸管膜リンパ節リンパ球：腸管膜リンパ節を摘出後、脂肪組織を除去し、ＰＢＳ中ですり潰し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、ナイロンメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞塊を除いた物を腸管膜リンパ節リンパ球とした。
【００３３】
腸管リンパ球：腸管を胃幽門部から回腸末端にかけて摘出し、腸管膜を除去後反転した。腸管をパイエル板をさけて４等分し、４５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／５％ＦＢＳ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを満たした５０ｍｌコニカルチューブに移した。３７℃、１６０ｒｐｍ、４５分間水平に振盪し、得られた上清をナイロンウールカラムを通すことにより細胞塊を除去し、細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後、４５％（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁し、７５％Ｐｅｒｃｏｌを下層後、ＲＴ、２０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。４５％／７５％ ｐｅｒｃｏｌの中間層からリンパ球画分を回収し、これを腸管リンパ球とした。
【００３４】
肝臓リンパ球：脱血屠殺したマウスより肝臓を摘出後、ＲＰＭＩ−１６４０／５％ ＦＢＳ中ですり潰し、ステンレスメッシュ（孔径７０μｍ）を通して細胞浮遊液を調整した。遠心洗浄後ペレットを３３％Ｐｅｒｃｏｌに再懸濁し、ＲＴ，２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。肝細胞を含む上清を除去した後、ペレットを１ｍｌのＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、赤血球を溶血させた。遠心洗浄後、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁しこれを肝臓リンパ球とした。
（急性ＧＶＨＤモデル）
非放射線照射ＢＤＦ１マウスに、ＧＦＰ−Ｂ６（ＦＣＭ解析時）またはＬｙ５．１−Ｂ６（組織染色時）の脾臓細胞（６×１０７）を静脈注射により移入した。ドナーリンパ球の臓器浸潤を経時的に解析するため、ドナー細胞移入後５、８、１０、１２、１４日のＢＤＦ１マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、小腸よりリンパ球を調整した。トリパンブルー染色法により生細胞数を計測後、Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）解析を行い、ＧＦＰ陽性 ＣＤ８陽性細胞の割合からドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数を算出した。
（ＦＣＭ解析）
細胞懸濁液に抗マウスＣＤ１６／３２抗体（０．０１μｇ／２×１０５ｃｅｌｌｓ）を加え、４℃、１０分間インキュベートし、ＦＣ受容体を介した非特異的結合を阻害した。次いでＰＥ標識抗マウスＣＤ８抗体（０．０５μｇ／２×１０５ｃｅｌｌｓ）を加え、４℃、２０分間インキュベートした後ＰＢＳを加え、遠心洗浄した。ＦＣＭ解析はＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）により行い、また死細胞はＰＩ染色（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）により除去した。
（腸管ＧＶＨＤの評価）
腸管組織を長軸方向に切り開き、５μｍ四方のシート状にトリミングした状態でＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｃｋ）に包埋し、液体窒素中で凍結した。クリオスタットにより厚さ６μｍの凍結切片を作成し、ＨＥ染色により腸管陰窩部の組織像を評価した。またｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。Ｔｕｎｅｌ法と抗サイトケラチン抗体および抗Ｌｙ５．１抗体を用いた蛍光免疫組織染色を組み合わせ、腸管陰窩部における上皮細胞のアポトーシスおよびドナー細胞の浸潤を検出した。さらに腸管傷害を定量するため、陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数を計数した。
（ＲＴ−ＰＣＲ）
移入前のドナーＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管または肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞（１−１０×１０４個）をセルソーターにより分取後、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。また、正常及びＧＶＨＤ誘導後１０日目のＢＤＦ１マウスより肝臓、小腸を採取しＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。得られたＲＮＡ（２００ｎｇ）をＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｐｉｔａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｃｈ）およびＲａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの一部をテンプレートとして各種プライマー及びＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＰｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、反応溶液を調整した。添付の説明書にリアルタイムＰＣＲはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。反応液の組成及びＰＣＲの条件はＰｌａｔｉｎｕｍ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＰｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧに添付の説明書に従った。ケモカインレセプター・ケモカイン遺伝子の発現はＧＡＰＤＨを内部標準とした相対値で示した。使用した各種プライマー及びＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅは表１に示した。
【００３５】
【表１】
（フラクタルカインの蛍光免疫組織染色）
ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管より厚さ６μｍの凍結切片を作成した。１次抗体にヤギ抗フラクタルカイン抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）及びｂｉｏｔｉｎ標識抗Ｌｙ５．１抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）、２次抗体にＡｌｅｘａ ５４６標識抗ヤギＩｇＧ抗体（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）およびＡｌｅｘａ ４８８標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を用いて蛍光２重染色を行った。また、抗フラクタルカイン抗体のコントロールとしてヤギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いた。共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてフラクタルカインの発現および腸管に浸潤したドナー細胞との位置関係を解析した。
（抗フラクタルカイン抗体実験）
２００μｇの抗フラクタルカイン抗体またはハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１００μｌのＰＢＳに溶解し、ＧＶＨＤ誘導後６、８、１０日目に腹腔内投与した。１４日目に小腸、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数を測定し、抗フラクタルカイン抗体投与がドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤に及ぼす影響を評価した。また、Ｔｕｎｅｌ法により小腸におけるアポトーシス細胞数を測定し、抗フラクタルカイン抗体処理が腸管傷害に及ぼす影響を評価した。
［結果と考察］
（図１）
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤と腸管傷害の相関について図１に示す。Ａは、脾臓、腸管膜リンパ節、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤、Ｂは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管組織像（ＨＥ染色）、Ｃは、正常ＢＤＦ１及びＧＶＨＤ誘導後８日目、１２日目の腸管におけるアポトーシス細胞の検出について示す。
【００３６】
ＦＣＭ解析により、脾臓、腸管膜リンパ節においてドナーＣＤ８ Ｔ細胞浸潤のピークが１０日目であるのに対し、小腸におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤は１０日目から始まり、腸管ＧＶＨＤの極期である１４日目にかけて急速に進行するという異なった動態を示した（図１−Ａ）。また、ＨＥ染色およびＴｕｎｅｌ法により、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤に伴い腸管陰窩部の過形成、アポトーシス細胞の増加、陰窩部の破壊といった腸管ＧＶＨＤに特有の症状が認められた（図１−Ｂ，Ｃ）。
【００３７】
以上の結果から、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞が腸管への浸潤能を獲得するのはＧＶＨＤ後期であること、また急激なドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤が腸管ＧＶＨＤの発症と深く関連していることが明らかとなった。
（図２）
腸管ＧＶＨＤにおけるフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の関与について図２に示す。Ａは、移入前及びＧＶＨＤ誘導後１０日目に腸管、肝臓に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターの遺伝子発現、Ｂは、移入及びＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管、肝臓におけるケモカインの遺伝子発現、Ｃは、ＧＶＨＤ誘導後１０日目の腸管におけるフラクタルカイン発現とドナーリンパ球の浸潤について示す。
【００３８】
ＧＶＨＤ後期におけるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤に関与する分子をリアルタイムＰＣＲにより検索したところ、移入後１０日目に腸管に浸潤したドナーＣＤ８ Ｔ細胞においてケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の発現が特徴的に上昇しており、また腸管組織においてＣＸ３ＣＲ１のリガンドであるフラクタルカインが発現していることが明らかとなった（図２−Ａ，Ｂ）。抗フラクタルカイン抗体を用いた蛍光免疫組織染色により、腸管上皮細胞および血管内皮細胞に特異的な染色が認められ、またＬｙ５．１陽性ドナーリンパ球がフラクタルカイン陽性腸管上皮細胞の基底側に接着している像も認められた（図２−Ｃ）。
【００３９】
以上の結果から、ＧＶＨＤ後期にドナーＣＤ８ Ｔ細胞がＣＸ３ＣＲ１の発現を上昇させ、フラクタルカインを発現する腸管への浸潤能を獲得することにより、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤および腸管ＧＶＨＤが引き起こされる事が示唆された。
（図３）
抗フラクタルカイン抗体投与によるドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤の抑制について、図３に表す。
【００４０】
抗フラクタルカイン抗体をＧＶＨＤ後期である６、８、１０日目に投与したところ、コントロール抗体投与群と比較し腸管に浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数が有意に減少した。一方で肝臓に浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数には有意な差は認められなかった。
【００４１】
以上の結果より、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤にフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の相互作用が重要な役割をはたしていることが明らかとなった。
（図４）
抗フラクタルカイン抗体投与による腸管ＧＶＨＤの軽減について図４に示す。Ａは、Ｔｕｎｅｌ法による腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞の検出、Ｂは、腸管陰窩２０個あたりのアポトーシス細胞数について示す。
【００４２】
抗フラクタルカイン抗体投与の腸管組織傷害への影響をＴｕｎｅｌ法によるアポトーシス細胞数の測定で評価したところ、抗フラクタルカイン抗体投与群において腸管陰窩部におけるアポトーシス細胞が減少した。
【００４３】
以上の結果より、抗フラクタルカイン抗体投与によりＧＶＨＤにおける腸管傷害が改善されることが明らかになった。
（図１−４）
図１−図４の結果から急性ＧＶＨＤにおける腸管傷害は、ＧＶＨＤ後期に腸管へ浸潤するドナーＣＤ８ Ｔ細胞によって引き起こされること、更にドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤にはフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＲ１の相互作用が関与しており、この相互作用を阻害することによりＧＶＨＤにおける腸管傷害を軽減できることが明らかとなった。フラクタルカインを標的とする予防・治療法は免疫抑制剤を用いる従来法に比較し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管浸潤を選択的に抑制する方法であり、またＧＶＨＤにおける生死に関わる最も重篤な腸管傷害をＧＶＨＤ後期においても治療可能とするものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
骨髄移植が慢性骨髄性白血病をはじめとする多くの血球系疾患に対する代表的な治療法であるように、細胞移植は医術の分野において有力な治療の手段であるが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、これらの移植による治療を行う際に重大な障害となる。現在、標準的ＧＶＨＤ予防プロトコールは、免疫細胞の増殖過程を標的とした非特異的免疫抑制剤や広く作用する免疫抑制剤が用いられているが、しかし、これらの薬剤は、非特異的及び広範囲な免疫抑制効果をもつが故に、その毒性も強く、一方で免疫力低下に伴う感染症や腫瘍の再発が問題となっている。本発明のＧＶＨＤ予防、治療剤、及びＧＶＨＤの予防、治療方法は、ＧＶＨＤにおいて臓器傷害を発症する機構を特異的に阻害して、臓器傷害を防止又は治療効果を発揮するため、より選択的にＧＶＨＤを回避することが可能となる。特に、本発明のＧＶＨＤ治療剤及びＧＶＨＤの治療方法は、フラクタルカインを標的とすることによって、ＧＶＨＤ発症後においても効果が期待でき、従来の免疫抑制剤にない特徴を有している。また、本発明においては、本発明で見い出されたＧＶＨＤにおける臓器傷害の発症機構を利用して、臓器傷害に対して特異的な予防又は治療作用を有する物質のスクリーニングを行う方法を提供でき、より選択的にＧＶＨＤを回避する予防及び治療剤の開発を可能とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制することにより移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項２】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害であることを特徴とする請求項１記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項３】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害であることを特徴とする請求項２記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項４】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、抗フラクタルカイン抗体を用いた相互作用の阻害であることを特徴とする請求項２又は３記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項５】
抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項６】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、腸管への細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項７】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項８】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害物質であることを特徴とする請求項７記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項９】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする請求項７又は８記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項１０】
抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項１１】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことを特徴とする請求項１１記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管への浸潤であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデルマウスであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項１】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤を特異的に抑制することにより移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項２】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害であることを特徴とする請求項１記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項３】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害であることを特徴とする請求項２記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項４】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用の阻害が、抗フラクタルカイン抗体を用いた相互作用の阻害であることを特徴とする請求項２又は３記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項５】
抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項６】
ＣＤ８ Ｔ細胞の臓器浸潤の特異的抑制が、腸管への細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の移植片対宿主病の発症又は進行を予防的又は治療的に回避する方法。
【請求項７】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項８】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、フラクタルカイン及び／又はドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の機能の阻害物質であることを特徴とする請求項７記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項９】
フラクタルカインとドナーＣＤ８ Ｔ細胞に発現するケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１の相互作用を阻害する物質が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする請求項７又は８記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項１０】
抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【請求項１１】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物に、被検物質を投与し、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を検知・評価することを特徴とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤を、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞におけるケモカインレセプターＣＸ３ＣＲ１及び／又はフラクタルカインの発現の検知・評価により行うことを特徴とする請求項１１記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の臓器への浸潤が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞の腸管への浸潤であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデル動物が、ドナーＣＤ８ Ｔ細胞移入移植片対宿主病発症モデルマウスであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載の移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分とする移植片対宿主病の臓器傷害特異的予防又は治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３２５８９
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４４４０（Ｐ２００５−５１４４４０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２７７
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２７７
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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