ＨＣＶワクチン
少なくとも２つのエピトープを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチンであって、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものであり、その際、ホットスポットエピトープが、ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよびＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱよりなる群から選ばれたペプチドを含むエピトープとして定められることを特徴とするワクチンを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は相互に関連した細胞型および分子の複雑なネットワークであり、感染性微生物から多細胞生物を防禦するために進化してきたものである。免疫系は、進化的に古い生得免疫（または自然免疫）と適応免疫（または獲得免疫）とに分けることができる。生得免疫系は、病原体に通常共通し本質的なパターンを認識する。この限られた数の分子構造のため、生殖細胞にコードされたレセプターが発展してきた。対照的に、獲得免疫系の細胞であるＢリンパ球およびＴリンパ球は、とてつもなく様々な抗原構造を認識することができる。レセプター（それを発現する細胞型に従って名付けられる）であるＢ細胞レセプター（ＢＣＲ、その可溶性の態様は抗体と呼ばれる）およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ、細胞表面に結合した形態のみ）は体細胞組換えによって生成し、クローン分布（clonal distribution）を示す。それゆえ、最初は、ある特異性を有する少数の細胞しか存在しない。これら細胞は、抗原に出会うと分裂を開始して（クローン拡張）、これら抗原と対抗しうるエフェクター集団を生成する。抗原を除去した後は、この抗原を特異的に認識する細胞の特別の亜集団が免疫記憶として残る。まとめると、獲得免疫系はゆっくりであるが（生得免疫と比べて）、特異的であり、所定の病原体／抗原に繰り返し暴露されることで改良されていく。
【０００３】
Ｔ細胞は獲得免疫で中心的な役割を有している。そのレセプター（ＴＣＲ）は、細胞表面上の「主要組織適合複合体」（ＭＨＣまたはＨＬＡ）：ペプチド複合体を認識する。これらペプチドはＴ細胞エピトープと呼ばれ、抗原の分解産物を表している。Ｔ細胞には２つの主要なクラスがある：ＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はＭＨＣクラスＩに拘束されている。ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）はＭＨＣクラスIIに拘束されている。ＨＴＬは獲得免疫の多くの特性：いわゆる「プロフェッショナル抗原提示細胞」（ＡＰＣ）の活性化、免疫グロブリン（Ｉｇ）クラススイッチ、胚中心反応および親和性の成熟、ＣＴＬの活性化、免疫記憶、免疫応答の制御その他にとって必須である。
【０００４】
ＭＨＣ分子は細胞内のペプチドを回収し、それを細胞表面上でＴ細胞のＴＣＲに提示する。ＭＨＣの主要な２つのクラス、すなわち、ＣＤ８陽性のＣＴＬによって認識されるクラスＩおよびＣＤ４陽性のＨＴＬによって認識されるクラスIIがある。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ分子は、４５ｋＤａの膜結合アルファ鎖と１２ｋＤＡの非共有結合したｂ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）とからなる。Ｘ線結晶解析による３次元構造の解像（SternおよびWiley、1994）は、このアルファ鎖が溝を有し、この溝の両端が閉じられており、８〜１１アミノ酸長のペプチドを収容することを明らかにした。クラスＩ分子は遍在的に発現され、これら分子が表すペプチドは細胞質タンパク質に由来するものである。これら細胞質タンパク質はプロテアソームによって分解され、その結果生じたペプチドは小胞体（ＥＲ）に能動輸送される。小胞体で幾つかのシャペロンの助けを借りてＭＨＣ：ペプチド複合体が形成され、細胞表面に輸送される（Heemels、1995）。それゆえ、ＭＨＣクラスＩ分子は細胞の表面上で該細胞のプロテオーム（proteome）を反映し、Ｔ細胞が細胞内病原体または悪性の細胞を認識するのを可能にする。
【０００６】
ＭＨＣクラスII分子は、それぞれ３５ｋＤａおよび３０ｋＤａの２つの膜結合タンパク質（アルファ鎖およびベータ鎖）からなる。これらは一緒になって両端で開いた溝を形成し、様々な長さ、通常１２〜２５アミノ酸のペプチドを収容することができる。これら相違にもかかわらず、クラスＩおよびII分子は驚くほど構造上の類似点を有している（SternおよびWiley、1994）。クラスII分子は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞およびマクロファージ／単球を含むプロフェッショナルＡＰＣ上でのみ発現される。これら細胞は、エンドソーム経路で抗原を取り込みプロセシングするように特殊化している。クラスII分子は生合成されると直ちにいわゆるインバリアント鎖（Ｉｉ）と複合体を形成し、このインバリアント鎖はＥＲ中でのペプチドの結合を防ぐ。クラスII：Ｉｉ複合体を含む小胞が外来抗原の分解産物を含むエンドソームと融合すると、ＭＨＣ結合溝がいわゆるＣＬＩＰペプチドとのみ複合体を形成するまでＩｉは分解される。後者（ＣＬＩＰペプチド）はＨＬＡ−ＤＭなどのシャペロンの助けを借りて抗原ペプチドと交換される（Villadangos、2000）。最終的にＭＨＣ：ペプチド複合体は再びＡＰＣの表面に提示され、多くの仕方でＨＴＬと相互作用する。
【０００７】
ＭＨＣ系はポリジーン性であることおよび極めて多型性であることのため高度に複雑である。ヒトのクラスＩアルファ鎖については、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと呼ばれる３つの遺伝子座が存在する。同様に３つのクラスIIアルファ鎖遺伝子座（ＤＲＡ、ＤＱＡ、ＤＰＡ）が存在する；クラスIIベータ鎖遺伝子座については、４つの異なるＤＲベータ鎖（ＤＲＢ１、２、３、５）プラスＤＱＢおよびＤＰＢが存在するのでさらに一層複雑である。単一性のＤＲアルファ鎖ＤＲＡを例外として、各遺伝子座は集団中で多くの（数十〜数百の）異なる対立遺伝子として存在する（Klein、1986）。異なる対立遺伝子は大体、ペプチドに対する区別される結合特異性を有する。対立遺伝子は、たとえば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１またはＨＬＡ−ＤＰＡ＊０１０１／ＤＰＢ＊０４０１のように表される。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープは様々なアプローチにより同定されている（Van den Eynde、1997）。Ｔ細胞株およびクローンは、たとえば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、たとえば適当なＨＬＡ−分子でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の文脈においてスクリーニングするのに用いられている。あるいは、生化学的なアプローチも追求されている。後者は、標的細胞上のＭＨＣ分子からの天然リガンドの溶出、幾つかのクロマトグラフィー工程によるこれらペプチドの分離、エピトープ再構成アッセイでのリンパ球との反応性の分析および質量分光法によるシークエンシングを含む（Wolfelら、1994、Coxら、1994）。
【０００９】
最近、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩｓｐｏｔなどの高感度サイトカイン検出アッセイの出現が、重複する合成ペプチドのスクリーニングのためにリンパ球を直接イクスビボで使用することを可能にした（Maecker、2001、Kern、2000、Tobery、2001）。主として、Kernら（1999&2000）は、重複する９ｍｅｒのペプチドのプールのアレイを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをインビトロでマッピングした。後に、Toberyら、2001はこのアプローチを改変し、６４もの多くの２０ｍｅｒペプチドを含むプールを用いてＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔ細胞エピトープをスクリーニングできることをマウスで示した。これら両方法は、細胞内染色によるか（Kernら、2000）またはＥＬＩｓｐｏｔアッセイにて（Toberyら、2001）ＩＦＮ−ガンマ産生を測定することにより抗原特異的な応答をモニターすることに基づいていた。１５ｍｅｒの混合物を用いることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は全可溶性タンパク質を抗原として用いたときに検出されるものとほぼ等しいのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は（驚くにあたらないが）可溶性のタンパク質刺激で検出されるしばしば無視できるほどの応答よりも有意に高い。さらに、１５アミノ酸のペプチドの混合物に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、既知のＭＨＣクラスＩ最小エピトープを表すべく選択した８〜１２アミノ酸のペプチドの混合物で得られる応答と同様である。おそらく、これら状況下、細胞膜に結合したペプチダーゼがペプチドを最適な長さに「刈り込む（clipping）」のを担っている（Maeckerら、2001）。
【００１０】
興味深い代替法は、合成コンビナトリアルペプチドライブラリーを特異的なリンパ球でスクリーニングすることである。たとえば、ポジショナルスキャニングフォーマットに配置した２００の混合物からなるデカペプチドライブラリーが、Ｔ細胞のクローン特異的集団を刺激するペプチドリガンドの同定に首尾よく用いられている（Wilsonら、J. Immunol., 1999, 163: 6424-6434）。
【００１１】
多くのＴ細胞エピトープは、いわゆる「逆（reverse）免疫学的アプローチ」（Rammensee、1999）により同定されている。この場合は潜在的なＴ細胞エピトープを生じるタンパク質は知られており、その一次配列をＨＬＡ結合モチーフについてスキャニングする。典型的に数十から数百の候補ペプチドあるいは重複ペプチドの完全なセットまでをも合成し、ＨＬＡ分子への結合について試験する。通常、最良の結合体をＴ細胞との反応性についてさらに特徴付けるために選択する。このことは、たとえば、インビトロまたはＨＬＡトランスジェニックマウスの助けを借りてインビボでＴ細胞を初回免疫することにより行うことができる。
【００１２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で約１億７０００万人に慢性感染しているフラビウイルスの成員である。少なくとも６つのＨＣＶ遺伝子型があり、５０を超えるサブタイプが記載されている。アメリカ、ヨーロッパおよび日本では遺伝子型１、２および３が最も一般的である。ＨＣＶ遺伝子型の地理的分布は遺伝子型によって大きく異なっており、遺伝子型１ａは米国および西ヨーロッパの一部で優勢であり、一方、１ｂは南および中央ヨーロッパで優勢である（Bellentani、2000）。
【００１３】
ＨＣＶは非経口または皮下経路で伝達され、肝細胞で増殖する。患者の約１５％が、ウイルスのクリアランスおよび回復を伴う急性の自己限定性の肝炎を経験している。感染者の約８０％が慢性のキャリヤとなる。感染はしばしば何年もの間ゆっくりと進行しながら無症候的に持続するが、最終的にはＨＣＶは肝臓疾患の最終ステージである肝硬変および肝臓癌の主たる原因である（Liang、2000）。ＨＴＬおよびＣＴＬの両応答の強度および質が、患者が回復したのか（自然にまたは療法の結果）あるいは慢性感染を進展させているのかを決定する（Liang、2000）。
【００１４】
標準的なＨＣＶの療法は、ポリエチレングリコール処理した（pegylated）インターフェロン−アルファと抗ウイルス剤リバビリンとの組合せを含む。ウイルス学的応答は、遺伝子型に応じてＨＣＶ患者の約５０％で達成される。この療法の低い許容性および相当の副作用は、治療ワクチンを含む新規の治療的介入を必要としている（Cornberg、2002）。しかしながら、現在のところ、どのＭＨＣ組合せ中のどのエピトープが首尾よい免疫応答に導くのかについての詳細な理解を欠いている（Ward、2002）。それゆえ、全体のＨＣＶに対するＴ細胞応答の総合的な分析が治療用のエピトープベースのワクチンの開発に必要である。
【００１５】
ＨＣＶビリオンは、約３０００アミノ酸の大きな単一のポリタンパク質をコードする９.５キロベースの一本鎖のポジティブＲＮＡゲノムを含む。後者（大きな単一のポリタンパク質）は、宿主およびＨＣＶによりコードされた両タンパク質分解活性により少なくとも１０のタンパク質にプロセシングされる（Liang、2000）。重要なことには、ＨＣＶのＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼは誤りを起こしてウイルスの偽種（quasispecies）の進化を生成する傾向にあり、免疫回避変異体の生成に貢献している（Farci、2000）。
【００１６】
過去１５年の間に当該技術分野において多くの提唱がなされ、この期間に多くの有望な抗原候補が提唱されてきたが、それでも依然としてＨＣＶワクチンは市場に出回っていない（満足のいく治療法も同様；唯一利用できる治療である上記アルファインターフェロンとリバビリンとの組合せは少数の患者にのみ有効である）。ＨＣＶ配列の公表後まもなく、無数のエピトープおよび抗原がＨＣＶ疾患に対抗するための有効な手段として示唆されてきた（たとえば、Kozielら、J. Virol. 67(12), 7522-7532; Shiraiら、J. Virol. 68(5)(1994), 3334-3342; Leroux-Roelsら、Hepatology 23(1)(1996), 8-16; Hoffmannら、Hepatology 21(3)(1995), 632-638; Sarobeら、J. Clin. Invest. 102(6)(1998), 1239-1248; Battegayら、J. Virol. 69(4)(1995), 2462-2470; Wentworthら、Int. Imunol. 8(5)(1996), 651-659; Rehermannら、J. Virol. 70(10)(1996), 7092-7102; Diepolderら、J. Virol. 71(8)(1997), 6011-6019; Lamonacaら、Hepatology 30(4)(1999), 1088-1098；ＷＯ００／１１１８６、ＷＯ９５／１２７６６、ＷＯ９５／２７７３３、ＷＯ９４／２０１２７、ＷＯ９５／２５１２２、ＷＯ９５／２２３１７、ＷＯ９４／２５６０１、ＷＯ９２／０３４５８およびＷＯ９３／００３６５）。さらに、重要な原理証明（proof-of-principle）イクスビボ中和研究が、慢性ＨＣＶ感染を受けた（susceptible）チンパンジー、ホモ・サピエンス以外の他の種で行われている。実際、急性の消散した（resolved）感染か慢性の感染を有する個体およびチンパンジーで誘発した免疫応答の研究は、これまで、活動性のウイルス感染の確立後に明らかとなった潜在的な防禦免疫応答の病像を明らかにしたにすぎない。しかしながら、非経口免疫後の予防ワクチン防禦の相関は、主としてＨＣＶ暴露前の肝外のものであると予期される。ごく限られた数のワクチン有効性研究がチンパンジーで行われているにすぎず、これら研究は、（せいぜい）低用量の相同な攻撃（homologous challenge）後に７匹の動物のうち５匹を感染から防御することを示しており、その際、免疫と攻撃とで全く同じクローンが用いられているのである。さらに、ＨＣＶは高度の多様性を表し、この多様性はＨＣＶにワクチン誘起または感染誘起免疫応答からの回避能を付与する。この問題を考慮して、ＤＮＡワクチンとしての種々の大きなタンパク質断片の組合せもまた別のワクチン戦略として示唆されている（Rollierら、J. Virol. 78(1)(2004), 187-196; Dunas-Carreraら、Biotech. Appl. Biochem. Imm. Publ. (29 September 2003; BA20030112)）。
【００１７】
過去１５年間、とりわけ過去１０年間のあらゆる進歩にもかかわらず、ＨＣＶに対する新たな療法およびワクチン戦略を開発することの切迫した必要性が依然として存在する（Heileら、J. Virol. 74(15)(2000), 6885-6892）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
それゆえ、本発明の目的は、ＨＣＶに対するそのような有効な療法およびワクチン戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
それゆえ、本発明は、少なくとも２つのエピトープを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチンであって、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものであり、その際、ホットスポットエピトープは、
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
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ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ
よりなる群から選ばれたペプチドを含むエピトープとして定められることを特徴とするワクチンを提供する。
【００２０】
２００３年８月２７日に出願したＷＯ０４／０２４１８２（Ａ１３６７／２００２の２００２年９月１３日の優先権を主張）には、ワクチン接種に有用なＨＣＶペプチド、とりわけＨＣＶ Ｔ細胞エピトープを単離するための新規な方法が記載されている。この出願において「ＨＣＶホットスポットエピトープ」の概念が初めて開示された：Ｔ細胞エピトープ「ホットスポット」は、１を超えるＴ細胞エピトープを少なくとも含む短いペプチド配列として定義される。たとえば、２またはそれ以上のエピトープが互いにしばらく後に（「しばらく」とは５〜１０アミノ酸未満として定義される）位置していてよく、または直接互いの後に位置していてよく、または部分的または完全に重複していてよい。ホットスポットはクラスＩエピトープまたはクラスIIエピトープのみを含んでいてよいし、またはその組合せを含んでいてよい。ホットスポット中のエピトープは異なるＨＬＡ拘束を有していてよい。
【００２１】
導入部で言及したように、クラスＩおよびクラスII抗原プロセシングの高度に複雑かつ選択的な経路のため、Ｔ細胞エピトープはポリペプチドの配列内で容易に予測することができない。Ｔ細胞エピトープ予測のためのコンピューターアルゴリズムは、広く用いられているとはいうものの、偽陰性および偽陽性の割合が高い。
【００２２】
それゆえ、個々のＴ細胞エピトープでさえもポリペプチドの配列内で明白でないように、同じことはホットスポットの場合はより一層当てはまる。本発明に従い、エピトープ捕捉、ＨＬＡ−トランスジェニック動物およびヒト単核細胞のインビトロ刺激を含む幾つかの顕著に異なる実験アプローチをＴ細胞エピトープ同定のために組み合わせる。これら３つのアプローチはすべて、目的とする抗原にまたがる重複ペプチドに系統的に適用され、エピトープの総合的な同定を可能とする。特定のＨＬＡ対立遺伝子に限定するのではなく、むしろ集団内のターゲティングの可能性のあるすべてのエピトープを解明するそのような総合的な分析により、エピトープホットスポットが明らかとなる。ある抗原内で、もしあったとしてもごくわずかの配列がホットスポットの特性を示すにすぎない。それゆえ、ホットスポットの同定は常に驚くべき事象である。
【００２３】
Ｔ細胞エピトープのホットスポットは、重要な利点を提供する：ホットスポットは、ある被験者の異なるＴ細胞クローンを活性化することができ、異なるＴ細胞クローンによって認識されうる。ホットスポットは（異なるＨＬＡ拘束のエピトープを含むときは）、異なる非ＨＬＡマッチング個体からのＴ細胞と相互作用することができる。
【００２４】
エピトープベースのワクチンは、これまで、選択した優勢なＨＬＡ−対立遺伝子、たとえばＨＬＡ−Ａ２（カフカス人の約半分で発現される）に着目してきた。他の対立遺伝子の頻度はもっと低いため、広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンは多くの異なるエピトープを含む必要があるであろう。ワクチンの化学物質（たとえば、ペプチド）の数は、製造、製剤化および製品の安定性からの制約により限定される。
【００２５】
ホットスポットは、限られた数のペプチドによって潜在的に多数のエピトープを提供するので、そのような広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンを可能とする。実際、従来技術（従来技術で検討したエピトープおよびＨＣＶワクチンが未だ開発されていない事実に関して上記文献を参照のこと）は、その現況では、ＨＣＶワクチンの開発が問題のあるものと見られてきたこと、および幾つかの感染モデルでの体液性および細胞性免疫応答の誘発におけるＨＣＶ抗原の有効性を教示する過去１０年間に及ぶ膨大な文献にもかかわらず、ＨＣＶワクチンおよび療法の開発は一般的な失敗であったことを明らかに示している。ＨＣＶ感染の治療および予防は、錯綜と高度の予測不能性とで取り組まれている（wrought）。
【００２６】
ＨＣＶホットスポットエピトープ特徴付けに基づくＨＣＶワクチンを提供することによる本発明の概念は、今や初めて、ＨＣＶワクチン接種システムを可能にし、このシステムは適当なおよび特異的な両予防ワクチン接種およびＨＣＶ感染患者、とりわけ慢性感染患者に対する有効な治療プログラム（regimen）を可能とする。
【００２７】
本願の発明者らにより、ＨＣＶワクチンでの１または２のみの特異的なエピトープの使用がワクチン接種において満足のいく結果を得るには十分でないことを示すことができた。また、ＨＣＶタンパク質の混合物（ＤＮＡワクチンとしてのコア、Ｅ１およびＥ２；Duenas-Carreraら(2003)）またはそのようなＨＣＶタンパク質の大きな断片の混合物（ＤＮＡワクチンとしてのコア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３；Rollierら(2004)）を提供するとの概念は所望の結果をもたらさなかった。
【００２８】
本発明によるＨＣＶワクチンは、上記で列挙したホットスポットエピトープからのエピトープを含む短いポリペプチドを含む。本発明のワクチンは、ＤＮＡワクチンに関するリスクおよび不確実性（長期間にわたって持続する免疫応答の欠如；主として肝外の作用；作用様式；局在性等）に依存するものではない。さらに、本発明はまた、完全長のタンパク質または長鎖のタンパク質断片の生産に際して深刻な製造上の問題を突きつけるものでもない。
【００２９】
本明細書において開示するホットスポットエピトープは、主としてＴｈ１／Ｔｃ１タイプの反応（すなわち、インターフェロンガンマ）を読み出しとして用いた機能的なアッセイにより同定したものである。（全体または少なくとも大きな断片の）抗原は、そのようなアゴニストエピトープを含むのみならずアンタゴニストリガンドをもコードすることがよく知られている。そのような全体の抗原には潜在的に存在するがホットスポットには存在しないアンタゴニストは、ワクチンの免疫原性および有効性を妨害する。さらに、全体の抗原は殆ど確実に体液性の免疫応答を誘発するであろう。そのような抗体応答自体は細胞内にあるＨＣＶに対して殆ど影響を及ぼさないが、所望のＴ細胞応答をひどく損ないうる。本発明によるホットスポットに由来するエピトープは、その長さが限られているため、所望でない抗体応答を誘発する蓋然性が極めて低い。最後に、ＨＣＶ抗原の相対的に小さな部分のみが異なる遺伝子型間で保存されている。それゆえ、ワクチンに使用した全体の抗原は、殆どの患者にとって関連のない非保存領域またはエピトープに対する応答を誘発する。対照的に、本明細書に開示するホットスポットは、主要なＨＣＶ遺伝子型である１、２および３で＞８０％保存された領域に由来するものである。
【００３０】
ＨＬＡ−スーパータイプ（たとえば、ＷＯ０１／２１１８９に開示されているような）は、所定のＨＬＡ−クラスＩ Ｔ細胞エピトープが、ある場合には、もっぱら唯一のＨＬＡ−対立遺伝子に拘束されるのではなく他のＨＬＡ−対立遺伝子の文脈のＴ細胞によっても認識されうる（例：ペプチドはＨＬＡ−Ｂ*０７０２およびＨＬＡ−Ｂ*３５０１に結合できる）という事実を記載している。そのようなペプチドは本質的に、集団においてより広いＨＬＡ適用可能性を有し、それゆえ興味深いワクチン候補である。
【００３１】
対照的に、本発明によるＴ細胞エピトープホットスポットはそのようなＨＬＡ−スーパータイプとは有意に異なるものである、なぜなら本発明によるホットスポットは異なった隣接するまたは重複さえもする桁外れに多数のエピトープを示すタンパク質内のペプチド領域だからである。ホットスポットは相対的に短い領域内で多数のエピトープを提供し、それと同時にホットスポット内でのエピトープの適切なプロセシングが保証される。
【００３２】
実際、本発明によるホットスポットは異なるＨＣＶ種の間で顕著に低い変異しか示さず、このことが当該ホットスポットをワクチンアプローチにとって一層有利なものにする、なぜならごく小さなポリペプチドが用いられたとしても異種攻撃も可能だからである。いずれにせよ、本発明で提供されるエピトープは１００アミノ酸の長さを超えることはなく、一般に有意に短い。好ましくは、本発明によるエピトープの長さは少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸である。最大１３、１５、２０、２５、３０、４０または５０アミノ酸の長さも好ましいものと考えられる。
【００３３】
本発明に従い、所定のワクチンのためのエピトープは上記ホットスポット領域から選択することができる。もちろん、ホットスポット領域全体をワクチンに提供することもできるし、またはその一部のみを提供することもできる（当該一部が少なくとも１のエピトープを含んでいる限り）。しかしながら、１またはそれ以上（たとえば、２、３、４、５または６）のエピトープがワクチンに提供されるのが有利であり、該エピトープはホットスポット領域全体かまたは１を超えるエピトープを含む領域を少なくとも含んでいる。本発明に従って用いるエピトープはまた、上記ホットスポット「マスター」配列中に欠失（好ましくは１、２、３、４、５、６または７アミノ酸）を有する配列変異体であってもよい。好ましくは、ホットスポット配列の内部の欠失はエピトープを変えないものである；もちろん、欠失に拘わらずホットスポット領域中に少なくとも１のエピトープが保存されている必要がある。
【００３４】
とりわけ、１のエピトープのみを有するペプチドの一方のグループと１を超えるエピトープを有するペプチドの他方のグループとの混合物を提供するのが好ましい。たとえば、１のエピトープを有する少なくとも１または少なくとも２のペプチドおよび１を超えるエピトープ（たとえば、ホットスポット全体の配列）を有する少なくとも１または少なくとも２のペプチドを含むワクチンが好ましい。
【００３５】
エピトープは修飾することなくポリペプチドとして提供することができる；ポリペプチド鎖をある種の化学的または生物学的残基で修飾することは、とりわけ可溶化または医薬製剤化の考慮の観点から適切である（たとえば、ＷＯ０１／７８７６７に記載されているように）。本発明のＨＣＶワクチンに使用するエピトープは、ホットスポット領域全体またはその隣接する（contiguous）断片（ホットスポットに含まれるエピトープの少なくとも１つを含む）を含むかまたはホットスポットの非隣接の（non-contiguous）一部（しかしながら、ホットスポットに含まれるエピトープの少なくとも１つをも含む；そのような場合、このホットスポットの非隣接の一部の間に１またはそれ以上のリンカー（たとえば、アミノ酸またはペプチドリンカー）を提供することができる）を含んでいてよい。
【００３６】
好ましい態様によれば、本発明によるＨＣＶワクチンは、それぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つのエピトープを含む。
【００３７】
さらに好ましくは、ＨＣＶワクチンはそれぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも５つのエピトープを含む。そのようなエピトープベースのワクチン中のエピトープの数が多ければ多いほど製剤化に関する問題は大きくなるが、４つ、５つまたは６つのエピトープが、とりわけ工業スケールの生産に関して広範囲の防禦能と製剤化の欠点との最適の均衡である。
【００３８】
それゆえ、ある場合には、それぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも６つのエピトープを含むＨＣＶワクチンもまた本発明の好ましい態様である。ホットスポットエピトープの最適数はまた選択したエピトープ相互の相対的な相互作用にも依存し、この点はワクチン中の短い長さのポリペプチドのある種の組合せの場合の主たる障害であることがわかっている。
【００３９】
本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、エピトープが以下の群から選ばれることを特徴とする：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＧＰＲＬＧＶＲＡＴ、ＲＬＧＶＲＡＴＲＫ；
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ；
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ、ＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ；
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ；
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ、ＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＱＹＬＡＧＬＳＴＬ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩ；
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹ、ＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＴＩＮＹＴＩＦＫ、ＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩ、ＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩ、ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲ；
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＰＡＥＴＴＶＲＬ；
ＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱ、ＲＬＬＡＰＩＴＡＹ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬ；
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＩＬＡＧＹＧＡＧＶ、ＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬ；
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ、ＳＹＴＷＴＧＡＬＩ；
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ；
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＲＳＥＬＳＰＬＬＬ、ＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ；
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ；
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＱＲＫＴＫＲＮＴＮ、ＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＫ；
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ、ＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ；
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、ＴＴＩＬＧＩＧＴＶ、ＴＩＬＧＩＧＴＶＬ；
ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ、ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ、ＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡ、ＶＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ；
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＲＬＩＶＦＰＤＬ、ＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶ、ＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ；
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ；
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡ；
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ、ＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶ。
【００４０】
一般に、良好な結果を達成するには１のエピトープのグループからは１のエピトープのみを選択すべきである。もちろん、上記で列挙したホットスポットエピトープのすべてが等しく強力であるというわけではなく、効力は異なる集団群で異なりうる。好ましくは、主としてＨＬＡ適用に基づいて個々のワクチン接種戦略を各群に適用することができる。それゆえ、本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに一層好ましくは少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【００４１】
異なる特異性のためには、本発明によるＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲおよび
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ。
【００４２】
さらに異なる特異性のためには、本発明によるＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ。
【００４３】
本明細書で列挙した正確な抗原およびエピトープの別態様として、抗原／エピトープ変異体を本発明によるワクチンに用いることができる。好ましい変異体は、ホモログ（相同ＨＣＶ株に存在する１またはそれ以上の交換を含む）またはヘテロクリティック（heteroclictic）エピトープに従ってデザインする。好ましい変異体としては、本明細書に開示した配列と保存的アミノ酸置換によって異なるものが挙げられる。そのような置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性を有する他のアミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的に認められるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間で互いに置換するもの；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換および芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間での置換である。
【００４４】
この点に関して特に好ましいのは、本明細書に開示したポリペプチドのアミノ酸配列において１、２、３、４または５のアミノ酸残基が置換、欠失または付加（いかなる組合せであってもよい）した変異体である。これらのうちで好ましいのは、本発明のポリペプチドの特性および活性を変えることのないサイレントな置換、付加および欠失である。この点で特に好ましいのは、保存的な置換である。特に好適なアミノ酸置換は、本明細書に開示した配列のホモログに含まれるものである。それゆえ、本明細書に開示する抗原またはエピトープの好適な配列変異体は、ＨＣＶの１またはそれ以上の株または血清型に存在する１またはそれ以上の変異（好ましくはそのようなホモログ変異に基づく１、２、３、４または５のアミノ酸の交換）を含む。そのような抗原は、天然に存在する配列または新たに生成した人為的な配列である配列を含む。これら好ましい抗原変異体は、そのような天然に存在する配列変異、たとえば、本発明によるポリペプチドの抗原領域の「混合配列」（mixed sequence）の形成に基づく。たとえば、本明細書に開示する所定のＨＣＶ配列は、１またはそれ以上の変異を含むことによってこの所定の（天然に存在する）抗原またはエピトープ配列の人為的な（すなわち、天然に存在しない）変異体を生成してよい。
【００４５】
エピトープのＴ細胞活性化能を改善し、保存しまたは少なくとも有意に妨害することのないアミノ酸交換によって本発明のエピトープまたはペプチドから得られるエピトープまたはペプチドもまた本発明によるエピトープまたはペプチドに包含されることが明らかである。それゆえ、本発明のエピトープまたはペプチドはまた、ＨＣＶの特定の株に由来する元々の配列を含まないが同じかまたは好ましくは改善されたＴ細胞応答を惹起するエピトープまたはペプチドをも包含する。これらエピトープは「ヘテロクリティック」と呼ばれる。これらには、元々のエピトープと同じＴ細胞を惹起することができ、好ましくはインビボまたはインビトロにおいてもＴ細胞のより強力な活性化能を有するエピトープが含まれる。また、ＨＣＶの他の株からの各相同エピトープが本発明に包含される。
【００４６】
ヘテロクリティックエピトープは、合理的デザインにより、すなわち、ＴＣＲと相互作用する可能性のある残基の体系的な交換とその結果得られる配列の元々のエピトープに対するＴ細胞を用いた試験と組み合わせて、たとえば、Ramenseeら、1999（Immunogenetics 50: 213-219）またはSturnioloら、1999（Nature Biotechnology 17: 555-562）に記載されているように、ＭＨＣ／ＨＬＡへの結合への個々の残基の貢献を考慮に入れて、得ることができる。そのようなデザインは、過度の実験を要することなく当業者が行うことが可能である。
【００４７】
他の可能性としては、元々のエピトープに対して向けられたＴ細胞を用いたペプチドライブラリーのスクリーニングが挙げられる。好ましいやり方は、合成ペプチドライブラリーのポジショナルスキャニングである。そのようなアプローチは、たとえば、Blakeら、1996（）およびHemmerら、1999（）およびその中の引用文献に詳細に記載されている。
【００４８】
コグネイトＨＣＶ由来アミノ酸配列により表されるエピトープまたはヘテロクリティックエピトープの別態様としては、これらペプチドを擬態する物質、たとえば「ペプチドミメチカ（peptidemimetica）」または「レトロ−インバーソ−ペプチド（retoro-inverso-peptides）」を適用することができる。
【００４９】
さらなる化学基、とりわけアミノ酸残基、リンカー（および担体への結合基）、輸送容易化基などを、本発明によるＨＣＶワクチン中のエピトープのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができる。ＷＯ０１／７８７６７に記載のアミノ酸結合が好ましい。
【００５０】
改善されたホットスポットエピトープのデザインの他の側面は、Ｔ細胞を刺激する能力を増大させる物質で製剤化すること（formulation）または修飾することである。これらには、Ｔヘルパー細胞エピトープ、脂質またはリポソームが含まれる（またはＷＯ０１／７８７６７に記載の好ましい修飾）。
【００５１】
エピトープのＴ細胞刺激能を増大させる他の方法は、たとえば抗体、インターロイキン２、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターロイキン１８、Ｉ型およびII型インターフェロン（ＩＦＮ）などのサイトカインもしくはケモカイン、とりわけＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ｆｌｔ３−リガンドその他の免疫刺激物質で製剤化することである。
【００５２】
さらなる側面によれば、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療または予防するためのＨＬＡ拘束ワクチンの製造のための本発明によるＨＣＶエピトープまたはＨＣＶペプチドの使用に関する。
【００５３】
本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、以下のエピトープの少なくとも２つを含む：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。好ましくは、このＨＣＶワクチンは、これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、または１２のすべてを含む。
【００５４】
本発明による他の好ましいＨＣＶワクチンは、以下のエピトープの少なくとも２つを含む：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。好ましくは、このＨＣＶワクチンは、これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ７つのすべてを含む。
【００５５】
本発明のＨＣＶワクチンは、好ましくは少なくとも１つのＡ２エピトープおよび少なくとも１つのＤＲ１エピトープを含む。
【００５６】
本発明のＨＣＶワクチンは、好ましくは少なくとも１つのＤＲ７エピトープを含む。
【００５７】
エピトープの以下の組合せが特に強力であると認められる（グループ（１）〜（５）の少なくとも３つからの少なくとも１つ）：
（１）ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＫＦＰＧＧＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
（２）ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬまたはＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡまたはＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＡＡＴ、
（３）ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰＡＬＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶ、
（４）ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴまたはＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、
（５）ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮまたはＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮまたはＱＹＬＡＧＬＳＴＬまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＨＭＷＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ；とりわけエピトープＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよびＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡを含むＨＣＶワクチンが特別に強力であることがわかった。
【００５８】
本発明のＨＣＶワクチンに特別に適した補助物質を提供するのが好ましい。それゆえ、ある種の免疫刺激物質が本発明に有利であることがわかった。
【００５９】
それゆえ、好ましいＨＣＶワクチンは、配列：Ｒ１−ＸＺＸＺＮＸＺＸ−Ｒ２（式中、Ｎは３〜７の全数、好ましくは５、Ｘは正に荷電した天然および／または非天然アミノ酸残基、ＺはＬ、Ｖ、Ｉ、Ｆおよび／またはＷよりなる群から選ばれたアミノ酸残基、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＨ、２０までのアミノ酸残基またはペプチド反応性の基を有するペプチドまたはペプチドを有するかまたは有しないペプチドリンカーから選ばれる；Ｘ−Ｒ２はまた該ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであってよい）を含むペプチド（「ペプチドＡ」）をさらに含んでいてよい。
【００６０】
ＨＣＶワクチンのさらに好ましい態様は、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１はヒポキサンチンおよびウラシルから選ばれる、
ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシイノシン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）による構造を有する免疫促進オリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）（Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮ）をさらに含む。
【００６１】
本発明によるＨＣＶワクチン組成物は、ポリカチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性ポリマー、さらに好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌ペプチドをさらに含んでいてよい。
【００６２】
本発明により使用するポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００６３】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensines）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物をポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００６４】
本発明の方法に使用するポリカチオン性物質は、カテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（ＷＯ０２／１３８５７Ａ、参照のため本明細書に引用する）、とりわけ哺乳動物カテリシジン、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２に記載）である。
【００６５】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質、とりわけマウス、ウシまたは特にヒトのカテリンおよび／またはカテリシジンである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明によるＨＣＶペプチド組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫促進性物質を用いまたは用いることなく、ワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００６６】
好ましくは、本発明のＨＣＶワクチンはＡｌ(ＯＨ)３アジュバントおよび／またはポリカチオン性ペプチドをさらに含む。
【００６７】
特に好ましい態様によれば、上記ペプチドＡはＫＬＫＬ５ＫＬＫであり、および／または上記Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮはオリゴｄ(ＩＣ)１３である。
【００６８】
ある態様において、ＨＣＶワクチンは、ＣｐＧ−モチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドをさらに含むのが好ましい。
【００６９】
好ましくは、本発明によるＨＣＶワクチンは、１５分以内に３７℃で再構成しうる形態に凍結乾燥する。ＨＣＶワクチン中の個々のエピトープに応じて、これは困難な作業である。それゆえ、本発明はまたそのようなＨＣＶワクチンを製剤化するための効率的な手段をも提供する。
【００７０】
本発明によるＨＣＶワクチンは、１０μｇ〜１０ｍｇの各エピトープ（投与量当たり）を含むのが好ましい。
【００７１】
各応用に応じて個々のペプチドの数およびとりわけ混合物中でのその濃度は異なる。本発明の好ましい態様において、患者に送達すべきＨＣＶワクチン中の個々のペプチドの濃度は、５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００７２】
本発明による凍結乾燥ＨＣＶワクチンは、本発明による凍結乾燥プロセスのために痕跡量の酢酸を含むのが好ましい。
【００７３】
他の側面によれば、本発明はまた、ＨＣＶ感染の予防および治療用医薬の製造のための本発明のＨＣＶワクチンの使用、すなわち、本発明によるＨＣＶワクチンの有効免疫投与量を個体、とりわけＨＣＶ患者またはＨＣＶ感染を獲得するリスクにある個体（たとえば、病院の職員、臨床研究の職員、献血者など）に投与することにも関する。
【００７４】
本発明によるＨＣＶワクチンなどのペプチド混合物の可溶化は困難でありうる。それゆえ、本発明によるＨＣＶペプチド混合物、すなわち２つまたはそれ以上のペプチドからなるペプチド混合物、とりわけ親水性ペプチドおよび疎水性ペプチドからなるペプチド混合物の可溶化の方法を提供することが本発明の一つの目的である。他の目的は、ペプチド混合物を含む滅菌したおよび場合により凍結乾燥した医薬製剤の製造法を利用できるようにすることである。
【００７５】
それゆえ、本発明は他の側面に従い、本発明によるＨＣＶペプチド混合物の可溶化を含む医薬製剤の製造法を提供し、該方法は、該ペプチド混合物を、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化することを特徴とする。貯蔵寿命を延ばすため、可溶化したペプチド混合物はさらに滅菌（濾過、放射線照射、熱処理、化学的滅菌その他の方法により）および凍結乾燥することができる。
【００７６】
好ましい態様において、ペプチド混合物は親水性ペプチドおよび疎水性ペプチドを含む。もちろん、本発明の方法はまた、１つのタイプのペプチドのみを含むペプチド混合物（とりわけ、たとえば２またはそれ以上の親水性ペプチドを含む混合物）に対しても用いることができる。
【００７７】
他の好ましい態様において、本発明に従って水溶液により溶解したペプチドは、少なくとも６つ、好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは少なくとも１０、とりわけ少なくとも１２のアミノ酸を含む。最大数３０、４０または５０（あるいは１００アミノ酸までも、もっとも、長いエピトープは長い抗原断片が不利であることにより一層好ましくはないが）のアミノ酸を含むペプチドおよびポリペプチドを本発明に従って溶解することができる。
【００７８】
本発明のこの側面については、ペプチドはその溶解度により特徴付けられる。水溶液中に１００μｇ／ｍｌ未満しか溶解しないペプチドは疎水性であるとされる。一方、親水性ペプチドは、緩衝化水溶液中に１００μｇ／ｍｌを超える濃度で溶解する。親水性ペプチドはさらに、陽イオン性ペプチド（＞２０％塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジンを含む））、陰イオン性ペプチド（＞２０％酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸を含む））およびヒドロキシルリッチペプチド（＞３０％−ＯＨ含有アミノ酸（セリン、トレオニン、チロシンなど））に分けることができる。
【００７９】
それゆえ、他の側面に従い、本発明は、以下の工程を特徴とする本発明のＨＣＶワクチンの製造方法に関する：
−上記少なくとも２つのエピトープを化学的に合成し、
−これらエピトープを、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化し、
−該可溶化エピトープを混合し、ついで
−任意に該混合エピトープを凍結乾燥する。
【００８０】
ＨＣＶペプチド混合物は、貯蔵の理由から急速冷凍（凍結乾燥工程を行わない場合）することができる。
【００８１】
本発明によるペプチド混合物のペプチドは、標準的な化学的方法（たとえば、Merrifieldによる固相合成）により合成する。もちろん、ペプチドはまた、組換えにより製造したまたは天然から単離したタンパク質の化学的または酵素的な断片化によっても得ることができる。他の態様において、ＨＣＶペプチドは真核細胞および原核細胞から直接単離する。３つのいずれの場合においても、目的とするペプチドまたはポリペプチドを凍結乾燥および混合する前に、ある場合にはさらなる精製が必要であろう。
【００８２】
ペプチドの可溶化のために水溶液中に使用する有機酸が薬理学的に許容しうるものであることは、この特別の方法の基本的な要件である。本発明の好ましい態様において、有機酸は任意にアセトニトリルを含む酢酸および／またはギ酸である。
【００８３】
実験によれば、ペプチド混合物の組成に依存して、水溶液中の有機酸の濃度は少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％でなければならないことが明らかとなった。
【００８４】
ある場合には、水溶液に有機酸の誘導体（たとえば、アセトニトリル）を加えることが大量の疎水性ペプチドを含むペプチド混合物を可溶化する助けとなる。ＤＭＳＯやＤＭＦなどの有機溶媒もまた、疎水性ペプチドの濃度の上昇したペプチド混合物の促進された可溶化に貢献する。しかしながら、ＤＭＳＯおよび／またはＤＭＦを含む水性ペプチド混合物は凍結乾燥することはできない。
【００８５】
好ましい態様において、生成物を凍結乾燥しようとする場合には充填剤（bulking agents）をペプチド混合物に加える。とりわけ低ペプチド濃度においては、良好な凍結乾燥ケーキの生成は保証の限りでない。それゆえ、低量のペプチド充填剤を加える。好ましい充填剤は、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびその混合物である。
【００８６】
他の好ましい態様において、可溶化したペプチド混合物を濾過により滅菌する。生成物の回収を増大させ、大量のペプチド混合物の濾過を可能とするため、含有ペプチドは完全に可溶化されていることが必要であり、ゲルが形成されてはならない。
【００８７】
可溶化し任意に滅菌したペプチド混合物は、直接、またはバイアルに濾過した後、凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、上記ペプチド混合物の貯蔵寿命を延ばすための有用かつ効果的な方法である。該可溶化ペプチドを用い、最大５％の残留溶媒（水系中の水）および痕跡量の有機酸を含むペプチド混合物の凍結乾燥調製物を得ることができ、該調製物は、ＮａＣｌおよび／または１０分以内に＞９５％、好ましくは９８％、とりわけ９９％のソルビトールを含む緩衝水溶液中で再構成して濁った懸濁液または透明な溶液（ペプチド混合物の組成による）とすることができる。そのような速やかな再構成は、すぐに使用できる（ready-to-use）溶液が数分内に存在し、凍結乾燥したバイアルの全用量の殆ど完全な再溶媒和（re-solvation）が必要とされる救急患者の場合に特に必要である。
【００８８】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【００８９】
実施例：
実施例１：ＨＣＶ由来ペプチドのＨＬＡクラスII分子への結合
ＷＯ０４／０２４１８２に従い、重複する反応性のＨＣＶペプチドからの配列を導入し、システインなどの重要な残基を回避した幾つかの新規なペプチドを合成した。これらペプチドをクラスII可溶性ＨＬＡ分子に対する親和性について再試験し、結果を元のもので得られた結果と比較した（表１）。
【００９０】
表１：選択したＨＣＶ由来ペプチドおよびその１５−ｍｅｒ対応物の可溶性ＨＬＡクラスII分子への結合（「＋＋＋」強い親和性、「＋＋」中くらいの親和性、「＋」弱い親和性、「−」親和性なし、「ｎｄ」試験せず；コア結合モチーフは下線を引いてある）
【表１】
【表２】
【００９１】
ペプチド１７９８の場合にその一層短い対応物（Ｂ８４〜Ｂ９６）に比べてＤＲＢ１＊０１０１分子およびＤＲＢ１＊０４０１分子に対する親和性がなくなっているのは、おそらく結合を妨害する二次構造を取り得る長い配列（２６アミノ酸）のためである。インビボでは、タンパク質加水分解的開裂によりペプチド１７９８が２つの短いクラスIIエピトープを生成するであろうことが予期される。ペプチド１８２７および１８２９（それぞれペプチドＣ１１４および１６０４の誘導体である）で除去されたシステイン（Ｃ）残基は、ＤＲＢ１＊０４０１分子への結合に必須であるが、他の試験したＤＲサブタイプへの親和性を本質的に変えることはないと思われる。
【００９２】
実施例II：ＨＣＶ−エピトープホットスポットの同定および特徴付け
上記で概説したように、Ｔ細胞エピトープホットスポット（「ホットスポット」）は１を超えるＴ細胞エピトープを少なくとも含む短いペプチド配列として定義される。たとえば、２またはそれ以上のエピトープが互いにしばらく後に（「しばらく」とは５〜１０アミノ酸未満として定義される）位置していてよく、または直接互いの後に位置していてよく、または部分的または完全に重複していてよい。ホットスポットはクラスＩエピトープまたはクラスIIエピトープのみを含んでいてよいし、またはその組合せを含んでいてよい。ホットスポット中のエピトープは異なるＨＬＡ拘束を有していてよい。
【００９３】
クラスＩおよびクラスII抗原プロセシングの高度に複雑かつ選択的な経路のため、Ｔ細胞エピトープはポリペプチドの配列内で容易に予測することができない。Ｔ細胞エピトープ予測のためのコンピューターアルゴリズムは、広く用いられているとはいうものの、偽陰性および偽陽性の割合が高い。
【００９４】
それゆえ、個々のＴ細胞エピトープでさえもポリペプチドの配列内で明白でないように、同じことはホットスポットの場合はより一層当てはまる。本発明に従い、エピトープ捕捉、ＨＬＡ−トランスジェニック動物およびヒト単核細胞のインビトロ刺激を含む幾つかの顕著に異なる実験アプローチをＴ細胞エピトープ同定のために組み合わせる。これら３つのアプローチはすべて、目的とする抗原にまたがる重複ペプチドに系統的に適用され、エピトープの総合的な同定を可能とする。特定のＨＬＡ対立遺伝子に限定するのではなく、むしろ集団内のターゲティングの可能性のあるすべてのエピトープを解明するそのような総合的な分析により、エピトープホットスポットが明らかとなる。ある抗原内で、もしあったとしてもごくわずかの配列がホットスポットの特性を示すにすぎない。それゆえ、ホットスポットの同定は常に驚くべき事象である。
【００９５】
Ｔ細胞エピトープのホットスポットは、重要な利点を提供する：ホットスポットは、ある被験者の異なるＴ細胞クローンを活性化することができ、異なるＴ細胞クローンによって認識されうる。ホットスポットは（異なるＨＬＡ拘束のエピトープを含むときは）、異なる非ＨＬＡマッチング個体からのＴ細胞と相互作用することができる。
【００９６】
エピトープベースのワクチンは、これまで、選択した優勢なＨＬＡ−対立遺伝子、たとえばＨＬＡ−Ａ２（カフカス人の約半分で発現される）に着目してきた。他の対立遺伝子の頻度はもっと低いため、広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンは多くの異なるエピトープを含む必要があるであろう。ワクチンの化学物質（たとえば、ペプチド）の数は、製造、製剤化および製品の安定性からの制約により限定される。
【００９７】
ホットスポットは、限られた数のペプチドによって潜在的に多数のエピトープを提供するので、そのような広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンを可能とする。
【００９８】
表２：ＨＣＶの保存領域中のＴ細胞エピトープホットスポット
ホットスポット（変異体を含む）は太字で示してあり、ホットスポット内に含まれるエピトープは標準フォントで示してある。ペプチドの数および配列、並びにＨＬＡ−クラスＩおよびクラスIIの適用を示す。ソースデータはＷＯ０４／０２４１８２により提供されない場合は文献名を参照してある。
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
実施例III：ＨＣＶエピトープホットスポットＩｐｅｐ１４２６は少なくともＨＬＡ−Ａ＊０２０１および幾つかのプロミスカスクラスII Ｔ細胞エピトープを含む
この実験の主たる目的は、「ホットスポット」Ｉｐｅｐ１４２６（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープ（Ｉｐｅｐ１３３４）および２つのプロミスカスクラスIIエピトープ（Ｉｐｅｐ１００６および１４２５）を含む）の免疫原性を個々のエピトープと比較することであった。この目的のため、何人かの健常なＨＬＡ型を決定した血液ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１４２６かまたは１３３４、１００６、１４２５の混合物のいずれかでインビトロで刺激した。３回刺激を行ってオリゴクローンＴ細胞株を得た。ついで、４つのすべてのペプチドに対する応答をインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩｓｐｏｔ分析により評価した。
【０１０２】
ペプチド１４２６は、その配列に含まれる個々のエピトープと同様にＴ細胞応答を誘発する。とりわけ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束エピトープ１３３４に対して向けられたＣＤ８陽性のＴ細胞が首尾よく得られた。
【０１０３】
表３：オリゴクローンＴ細胞株のペプチド誘発ＩＦＮ−γ分泌
これら株は、ペプチド１４２６かまたはペプチド１００６＋１４２５＋１３３４の混合物のいずれかによる３回のインビトロ初回免疫により２人のＨＬＡ型決定した健常な個体から得た。これら株におけるＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔにより評価した（「＋＋＋」非常に強い、「＋＋」強い、「＋」有意、「−」ＩＦＮ−ガンマ分泌なし）。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
実施例ＩＶ：強力なＨＣＶ特異的１型細胞性応答は５つの異なるＨＣＶ由来ペプチド、抗菌ペプチドＫＬＫおよび合成オリゴデオキシヌクレオチドｏ−ｄ（ＩＣ）１３の組み合わせた注射により誘発される
マウス：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ.１）
【０１０６】
ペプチド：ペプチドｐ８３、ｐ８４、ｐ８７、ｐ８９、ｐ１４２６をワクチン接種に用いた。
ｐ８３：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）
ｐ８４：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ）
ｐ８７：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ）
ｐ８９：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）
ｐ１４２６：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ）（ｐ１２７４は関係のないペプチドとして再刺激に用いた）
（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束）
【０１０７】
ペプチドはすべて標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成により合成し、ＨＰＬＣ精製し、純度について質量分光法により分析した。
投与量：ペプチド当たり２０μｇ／マウス
【０１０８】
ＫＬＫ：ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ−ＣＯＯＨをＭＰＳ（Multiple Peptide System、米国）により合成した。投与量：１０ナノモル／マウス。
【０１０９】
オリゴ−ｄ(ＩＣ)１３（＝ＯＤＮ１ａ）ＯＤＮ ５’ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣ３’をPurimex Nucleic Acids Technology、ゲッチンゲンにより合成した。
投与量：０.４ナノモル／マウス。
製剤化：１０ｍＭトリス／１３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ〜７
【０１１０】
実験の段取り（５匹のマウス／群）
１．ＨＣＶペプチド
２．ＨＣＶペプチド ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ(ＩＣ)１３
【０１１１】
第０日目、第１４日目および第２８日目にＨＨＤ.１マウスの両後肢の皮下に上記化合物を含む全量１００μｌ／マウス（５０μｌ／肢）を注射した。第３５日目（最後のワクチン接種の７日後）にＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓細胞の単一細胞懸濁液から磁気分離（ＭＡＣＳ、Miltenyi）により単離した。Ｔ細胞を培地とともにインキュベートするか（バックグラウンド対照）またはワクチン接種に用いた異なるペプチドかまたは関連のないペプチドのいずれかの存在下でＡＰＣとしてのナイーブＨＨＤ.１マウスからの放射線照射した脾臓細胞で再刺激した。一夜インキュベートした後、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて分析した。
【０１１２】
図１は、５つのＨＣＶ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ(ＩＣ)１３とともに注射したときに、ｐ８４、ｐ８７、ｐ８９、ｐ１４２６に対するＣＤ４＋Ｔ細胞による高量のＩＦＮ−γの産生が誘発されたことを示す。さらに、ｐ８７、ｐ８９に対するＣＤ８＋Ｔ細胞による強いＩＦＮ−γの産生が検出できた。
【０１１３】
実施例Ｖ：ペプチド混合物（ＨＣＶペプチドとポリ−Ｌ−アルギニン）の可溶化
ペプチド混合物は、ペプチド８３、８４、８７、８９、１４２６およびイミュナイザーとしてのｐＲを含み（表４を参照）、ここでペプチド８３および８４は水およびＤＭＳＯに可溶であり、ペプチド８７および８９は水にはわずかしか溶解しないがＤＭＳＯには容易に溶解し、ペプチド１４２６はＤＭＳＯにのみ可溶である。懸濁調合物の製造のためには、まずペプチド８３および８４を水性緩衝液に溶解し、ペプチド８７、８９、および１４２６をＤＭＳＯに溶解する必要がある。滅菌濾過後、これら溶液を混合して最終懸濁液とすることができる。
【０１１４】
水／アセトニトリル混合物並びにＤＭＳＯおよびＤＭＦは溶媒として作用せずに懸濁液を生成したが、これは濾過妨害のため滅菌濾過することができなかった。驚くべきことには、５０％酢酸／水混合物がすべての成分を溶解することがわかった。得られた上記ペプチドを含むペプチド溶液は、濾過妨害なしに容易に滅菌濾過することができた。
【０１１５】
表４：ペプチド混合物Ｉ
【表７】
【０１１６】
以下の実施例（実施例Ｖ.１〜Ｖ.１２、表５〜１６）は、様々な長さおよびアミノ酸組成の少なくとも２つのペプチドを含むペプチド混合物が本発明により可溶化するのに適していることを説明するものである。さらに、これら表は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスII分子に対するこれらペプチドの既知の親和性を示す。
【０１１７】
実施例Ｖ.１：
表５：ペプチド混合物II
【表８】
【０１１８】
実施例Ｖ.２：
表６：ペプチド混合物III
【表９】
【０１１９】
実施例Ｖ.３：
表７：ペプチド混合物ＩＶ
【表１０】
【０１２０】
実施例Ｖ.４：
表８：ペプチド混合物Ｖ
【表１１】
【０１２１】
実施例Ｖ.５：
表９：ペプチド混合物ＶＩ
【表１２】
【０１２２】
実施例Ｖ.６：
表１０：ペプチド混合物ＶII
【表１３】
【０１２３】
実施例Ｖ.７：
表１１：ペプチド混合物ＶIII
【表１４】
【０１２４】
実施例Ｖ.８：
表１２：ペプチド混合物ＩＸ
【表１５】
【０１２５】
実施例Ｖ.９：
表１３：ペプチド混合物Ｘ
【表１６】
【０１２６】
実施例Ｖ.１０：
表１４：ペプチド混合物ＸＩ
【表１７】
【０１２７】
実施例Ｖ.１１：
表１５：ペプチド混合物ＸII
【表１８】
【０１２８】
実施例Ｖ.１２：
表１６：ペプチド混合物ＸIII
【表１９】
【０１２９】
実施例ＶＩ：本発明によりさらなるＨＣＶワクチン変異体をデザインするうえでの原理的説明
表１７：好ましい「ホットスポットＩ」の組合せ
【表２０】
【０１３０】
ホットスポットＩの好ましい組合せの特徴付け：
ペプチドの数：１２
システインによるペプチドの相互作用の可能性：３つのペプチド（１８４６、８９、１５４７）中の４つのＣｙｓ；ペプチドのホモ二量体およびへテロ二量体および潜在的にオリゴマーの形成の可能性
扱ったＨＣＶ抗原の数：５（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）
扱ったクラスＩ対立遺伝子：少なくとも８
Ａ２（８回）、Ａ３（２回）、Ａ１１（２回）、Ａ２４（１回）
Ｂ７（２回）、Ｂ３５（１回）、Ｂ６０（１回）
Ｃｗ７（１回）
扱ったＨＬＡクラスII：プロミスカスペプチドにより複数
ＤＲ１（８回）、ＤＲ４（６回）、ＤＲ７（８回）、ＤＲ１１（７回）
【０１３１】
ホットスポットＩの好ましい組合せは、５つの異なるＨＣＶ抗原の保存領域（遺伝子型１、２、３で＞８０％）からの１２のペプチドからなっている。合計で少なくとも８つの重要なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を扱い（それぞれ、１〜８回）、ヨーロッパ人で８３〜９１％、米国カフカス人で８９〜９１％および日本人で８７〜８９％の人口適用を提供する（GjertsonおよびTerasaki編、HLA 1998, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics、レネキサ、カンザス、米国におけるＨＬＡ罹患率の研究からの数字に基づいて推定）。同様に、幾つかの重要なＨＬＡクラスII対立遺伝子を、主としていわゆるプロミスカスペプチド（１を超えるＨＬＡクラスII対立遺伝子に結合する）により扱っている。個々の特に優勢な対立遺伝子（ＤＲ１、４、７、１１）は、独立に６〜８回扱っている。重要なことに、ＤＲ１１は７回扱っている。この対立遺伝子の存在は、ＨＣＶ感染からの自然回復と関連付けられている（Thurszら、1999 Lancet: 354(9196): 2119-24）。
【０１３２】
このホットスポットの組合せに含まれるエピトープの数が多いことは、広範な人口適用、それゆえワクチンの適用性を確実にするのみならず、そのような組合せで処置した個体内での広範な免疫応答をも確実にする。このことは有効性の必要条件である、というのはＨＣＶ感染からの自然回復が典型的に１０またはそれ以上のエピトープに向けられた広範な免疫応答と関連付けられているからである（Day etら、2002 J Virol.: 76(24): 12584-95）。
【０１３３】
複数のエピトープに対するＴ細胞応答はまた、ＨＣＶ−エピトープ回避変異体（免疫応答によってターゲティングされたエピトープをもはや含まないＨＣＶウイルス）の生成のリスクをも低減させる、なぜなら同時にターゲティングするエピトープが多くなれば多くなるほどウイルスがそれらを同時に変えることは困難だからである。チンパンジーでの実験は、そのようなＨＣＶ回避変異体が慢性感染を維持するための重要なメカニズムであることを確立している（Weinerら、1995 Proc Natl Acad Sci U S A.: 92(7): 2755-9）。
【０１３４】
最後に、たとえばたった一つのＨＣＶ抗原の代わりに複数のＨＣＶ抗原（コア、Ｅ２、ＮＳ３、４、５）の殆どをターゲティングすることもまた有意な利点を提供する：異なる抗原が、たとえば抗原プロセシングの差異のためにＴ細胞によって異なって認識され、または個人の特定のＨＬＡハロタイプによって異なって書き留められる（dictated）。また、異なる抗原はＨＣＶ生活環の間に異なる重要な機能を有する。
【０１３５】
組合せホットスポットＩはまた、ホットスポットからの個々のエピトープをも含む（Ｉｐｅｐ８７ＥＸからのＩｐｅｐ８７およびＩｐｅｐ８９ＥＸからのＩｐｅｐ８９）。このことは、特定のエピトープへの所望の応答の慎重な着目（focusing）の利点を有する。たとえばＩｐｅｐ８９を用いることはＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬ応答が生成することを保証し、一方、８９ＥＸを用いることはＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬ応答を導くが、これは付随するＤＲ４またはＤＲ７拘束Ｔヘルパー応答により損なわれるかもしれない。
【０１３６】
ホットスポットの組合せを用いることは、組換えタンパク質の形態かまたはＤＮＡワクチンのいずれにせよ、完全長の抗原を用いる場合に比べて多くの利点を有する。上記で詳記したように、ある場合には個々のエピトープを用いることの方がホットスポットまたは全体の抗原を用いるよりも有利である。第二に、本明細書に開示するホットスポットは主としてＴｈ１／Ｔｃ１タイプの反応（すなわち、インターフェロンガンマ）を読み取りとして用いた機能的アッセイにより同定したものである。抗原がそのようなアゴニストエピトープを含むのみならずアンタゴニストリガンドをもコードすることはよく知られている。そのような全体の抗原には潜在的に存在するがホットスポットには存在しないアンタゴニストは、ワクチンの免疫原性および有効性を妨害する。つぎに、全体の抗原は殆ど確実に体液性の免疫応答を誘発するであろう。そのような抗体応答自体は細胞内にあるＨＣＶに対して殆ど影響を及ぼさないが、所望のＴ細胞応答をひどく損ないうる。ホットスポットは、その長さが限られているため、所望でない抗体応答を誘発する蓋然性が極めて低い。最後に、ＨＣＶ抗原の相対的に小さな部分のみが、異なる遺伝子型間で保存されている。それゆえ、ワクチンに使用した全体の抗原は、殆どの患者にとって関連のない非保存領域またはエピトープに対する応答を誘発する。対照的に、本明細書に開示するホットスポットは、主要なＨＣＶ遺伝子型である１、２および３で＞８０％保存された領域に由来するものである。
【０１３７】
表１８：「ホットスポットII」の好ましい組合せ
【表２１】
【０１３８】
「ホットスポットII」の好ましい組合せの特徴付け：
ペプチドの数：７
システインによるペプチドの相互作用の可能性：１つのＣｙｓ（１８４６）；１８４６のホモ二量体の形成の可能性
扱ったＨＣＶ抗原の数：５（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）
扱ったクラスＩ対立遺伝子：少なくとも７
Ａ２（５回）、Ａ３（２回）、Ａ１１（２回）、Ａ２４（１回）
Ｂ７（２回）、Ｂ３５（１回）
Ｃｗ７（１回）
扱ったＨＬＡクラスII：プロミスカスペプチドにより複数
ＤＲ１（６回）、ＤＲ４（５回）、ＤＲ７（５回）、ＤＲ１１（５回）
【０１３９】
ホットスポットIIの好ましい組合せは、５つの異なるＨＣＶ抗原の保存領域（遺伝子型１、２、３で＞８０％）からの７つのペプチドからなっている。合計で少なくとも７つの重要なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を扱い（１〜５回）、ヨーロッパ人で８１〜９０％、米国カフカス人で８９〜９１％および日本人で８５〜８８％の人口適用を提供する（GjertsonおよびTerasaki編、HLA 1998, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics、レネキサ、カンザス、米国におけるＨＬＡ罹患率の研究からの数字に基づいて推定）。同様に、幾つかの重要なＨＬＡクラスII対立遺伝子を、主としていわゆるプロミスカスペプチド（１を超えるＨＬＡクラスII対立遺伝子に結合する）により扱っている。個々の特に優勢な対立遺伝子（ＤＲ１、４、７、１１）は、独立に５〜６回扱っている。重要なことに、ＤＲ１１は５回扱っている。この対立遺伝子の存在は、ＨＣＶ感染からの自然回復と関連付けられている（Thurszら、1999 Lancet: 354(9196): 2119-24）。
【０１４０】
組合せＩとは対照的に組合せIIは明らかに少ない数のペプチドを有するが（１２に対して７）、このことはそのような製品の製造可能性、製剤化および競合生産において潜在的な利点を有する。重要なことに、システイン側鎖を有するペプチドは１つしか残っていない（１８４６）。それゆえ、この組合せでは１８４６のホモ二量体のみ生成する可能性があるが、へテロ二量体もオリゴマーも生成できない。
【０１４１】
同時に組合せIIは組合せＩと同じ５つのＨＣＶ抗原および同様の数のＨＬＡクラスＩおよびIIの両対立遺伝子を扱っている。それゆえ、上記段落で検討した事項は組合せIIにも当てはまる。
【０１４２】
製剤開発の観点からは、組合せIIは組合せＩに比べて幾つかの利点を有する（１２の成分の代わりに７の成分のみ）。最も重要なことに、ただ１つのペプチド（１８４６）のみが遊離のシステイン側鎖を含んでいる。それゆえ、１８４６のホモ二量体のみが形成され、へテロ二量体もオリゴマーも形成されることはない。
【０１４３】
実施例ＶII：ＨＣＶワクチン−１０２用量最適化試験のＴ細胞免疫原性の結果
臨床試験の間に多くのペプチド／ポリアルギニン混合物をワクチンとして健常な志願者に投与した。各群はＨＬＡ−Ａ２に陽性の１２人の被験者から構成されていた。被験者は１ヶ月の間隔で４回のワクチン接種を受けた（ビジット３〜６）。免疫分析のための採血をビジット１〜６、最後のワクチン接種の１ヶ月後（ビジット７）および最後のワクチン接種の３ヶ月後（ビジット８）に行った。臨床試験をモニターするため、IntercellはＧＬＰ／ＧＣＰに準拠した免疫応答の終点を決定するための備え付きの（set-up）最新式Ｔ細胞アッセイ：インターフェロン−ガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳアッセイを有している。これらアッセイは、治療用ＨＣＶワクチンにより誘発されるエピトープ特異的なＴ細胞応答の信頼性ある測定を可能にする。ワクチン誘発Ｔ細胞免疫応答は、有効性の代理パラメーターとして作用する（Keilholzら、J Immunother. 2002 Mar-Apr;25(2): 97-138）。
【０１４４】
一次終点としてＴ細胞免疫原性をＴ細胞増殖アッセイにより決定した：
増殖アッセイは、ヒト血液のような生物学的試料中のペプチド特異的なＴ細胞の検出を可能にする。このアッセイの基礎は、Ｔ細胞がそのＴ細胞レセプターによって特異的に認識されたペプチドで刺激するとサイトカインの分泌およびその後の増殖により反応するということである。細胞の増殖は様々な手段により測定することができる；最も感度の高いアプローチとして、細胞分裂の前に合成されたＤＮＡに放射性標識したチミジンを導入することが挙げられる。この反応は９６ウエルプレートで行うことができる。各ウエルには一定数の細胞が含まれており、これを抗原／ペプチドの存在下で数日培養する。最後の１６〜２０時間にトリチウムで標識したチミジン（３Ｈ−チミジン）を加える。ついで、細胞をフィルタープレートに回収する：遊離の放射能を含む培地を洗浄して除き、一方、ＤＮＡはフィルターに固着する。導入された放射能をベータ−シンチレーションカウンターにより定量できる。通常の出力はcounts-per-minute（ｃｐｍ）で与えられる。
【０１４５】
二次終点としてＴ細胞免疫原性をインターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔにより決定した：
ＥＬＩｓｐｏｔは、ヒト血液などの生物学的試料中のペプチド特異的な機能的な（すなわち、サイトカイン分泌）Ｔ細胞の定量を可能とする。このアッセイの基礎は、Ｔ細胞がそのＴ細胞レセプターによって特異的に認識されたペプチドで刺激するとＩＦＮ−ガンマなどのサイトカインの分泌により反応するということである。この反応は９６ウエルプレートで行うことができる。このプレートのフィルター−ウエルはＩＦＮ−ガンマに特異的なＭａｂでコーティングされている。その後、ＩＦＮ−ガンマを分泌する各細胞はＩＦＮ−ガンマスポットを残し、これをその後の発色反応で可視化することができる。スポットは、自動プレート読み取り機を用いてカウントすることができる。得られた数は、試料中のペプチド特異的でＩＦＮ−ガンマ分泌性のＴ細胞の頻度の測定手段である。
【０１４６】
さらなる二次終点としてＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析を行った：
ＨＬＡ分子と抗原ペプチドとの複合体の可溶性の組換え形態であるＨＬＡクラスＩテトラマーは、Ｔ細胞認識に用いた抗原特異的なＴ細胞レセプターに結合する。蛍光テトラマーとともにフローサイトメトリーを用いることにより、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球を信頼性をもって数え上げ、特徴付けることができる。このアッセイは、Beckman Coulter Immunomicsにより製造されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１特別注文ｉＴａｇＴＭ−テトラマーをＨＣＶワクチンクラスＩエピトープと複合体を生成させて用いる。
【０１４７】
被験者は、ビジット４〜８のいずれにても有意のＴ細胞特異的な応答を示し、処置前には応答を有しないときはリスポンダーとして分類した。
【０１４８】
食塩水を与えた２５人の被験者の対照群の２５％に比べて、いずれのペプチドに対しても、ビジット４〜８のいずれにおいても、３つのＴ細胞アッセイのいずれにても９２％までの最大リスポンダー率が達成された。
【０１４９】
Ｉｐｅｐ８９、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６当たりのリスポンダー率：
ここで例示としてＴ細胞エピトープホットスポットペプチドＩｐｅｐ８９（クラスＩのＴ細胞エピトープ）、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６に対する応答を示す。これら応答は１ヶ月ごとの４回のワクチン接種のサイクルの後に得られた。グループＢについては、ワクチンはポリ−Ｌ−アルギニンのみを含んでいた。グループＣについては、ワクチンはＩｐｅｐ８９、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６を含む５つのペプチドの混合物を含んでいた。グループＧについては、ワクチンはグループＣと同じ５つのペプチドの混合物に加えて完全合成Ｔ細胞アジュバントとしてのポリ−Ｌ−アルギニンを含んでいた。
【０１５０】
表１９は、対照グループＢではＥＬＩｓｐｏｔおよびＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析においてリスポンダーがなく、合計３のみの陽性のビジットで３のリスポンダーが認められたことを示している。後者は増殖アッセイで得られた偽陽性リスポンダーの率として解釈することができる。
【０１５１】
ペプチドのみを含みポリ−Ｌ−アルギニンを含まないグループＣでは、ＥＬＩｓｐｏｔでＩｐｅｐ１４２６に対して１のリスポンダー、増殖アッセイでＩｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６に対してそれぞれ５および４のリスポンダー、ＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析でＩｐｅｐ８９に対して４のリスポンダーが認められた。最後に、グループＧ（グループＣと同じペプチドに加えてポリ−Ｌ−アルギニン）は３つのすべてのアッセイでリスポンダーを示した。重要なことに、機能的なＴ細胞の指標を与える一貫して（３つのすべてのペプチド）かつ持続した（陽性ビジットの合計数を参照）ＥＬＩｓｐｏｔ応答は合成Ｔ細胞アジュバントとしてのポリ−Ｌ−アルギニンに依存していた。
【０１５２】
表１９：グループＢ、ＣおよびＧにおけるペプチド当たりのリスポンダーおよび陽性ビジットの合計数
【表２２】
【０１５３】
個々の経過（ＥＬＩｓｐｏｔ）の例：グループＧからの被験者５：
表２０は、グループＧ（５つのペプチド＋ポリ−Ｌ−アルギニン）からの特定の被験者の連続した採血から得られたインターフェロン−ガンマＥＬＩｓｐｏｔの結果を示す。２回目のワクチン接種の１ヶ月のビジット５ですでに２つのクラスIIエピトープＩｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６が応答を示している。３回目のワクチン接種後、すべての応答でピークが達成され、クラスＩエピトープのＩｐｅｐ８９も応答を示している。さらに、Ｉｐｅｐ１４２６は最後のワクチン接種の３ヶ月後のビジット８でさえも持続した応答を示している。
【０１５４】
表２０：グループＧからの被験者５のＩｐｅｐ８９、８４、１４２６についての経時的なＥＬＩｓｐｏｔ値
（１００万のＰＢＭＣ当たりのスポット、バックグラウンドは差し引いてある；有意でない値は０とした）
【表２３】
【０１５５】
参照文献：
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＫＬＫ／Ｏ−ｄ(ＩＣ)１３がＨＣＶ−ペプチド特異的な１型細胞性免疫応答を誘発することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は相互に関連した細胞型および分子の複雑なネットワークであり、感染性微生物から多細胞生物を防禦するために進化してきたものである。免疫系は、進化的に古い生得免疫（または自然免疫）と適応免疫（または獲得免疫）とに分けることができる。生得免疫系は、病原体に通常共通し本質的なパターンを認識する。この限られた数の分子構造のため、生殖細胞にコードされたレセプターが発展してきた。対照的に、獲得免疫系の細胞であるＢリンパ球およびＴリンパ球は、とてつもなく様々な抗原構造を認識することができる。レセプター（それを発現する細胞型に従って名付けられる）であるＢ細胞レセプター（ＢＣＲ、その可溶性の態様は抗体と呼ばれる）およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ、細胞表面に結合した形態のみ）は体細胞組換えによって生成し、クローン分布（clonal distribution）を示す。それゆえ、最初は、ある特異性を有する少数の細胞しか存在しない。これら細胞は、抗原に出会うと分裂を開始して（クローン拡張）、これら抗原と対抗しうるエフェクター集団を生成する。抗原を除去した後は、この抗原を特異的に認識する細胞の特別の亜集団が免疫記憶として残る。まとめると、獲得免疫系はゆっくりであるが（生得免疫と比べて）、特異的であり、所定の病原体／抗原に繰り返し暴露されることで改良されていく。
【０００３】
Ｔ細胞は獲得免疫で中心的な役割を有している。そのレセプター（ＴＣＲ）は、細胞表面上の「主要組織適合複合体」（ＭＨＣまたはＨＬＡ）：ペプチド複合体を認識する。これらペプチドはＴ細胞エピトープと呼ばれ、抗原の分解産物を表している。Ｔ細胞には２つの主要なクラスがある：ＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はＭＨＣクラスＩに拘束されている。ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）はＭＨＣクラスIIに拘束されている。ＨＴＬは獲得免疫の多くの特性：いわゆる「プロフェッショナル抗原提示細胞」（ＡＰＣ）の活性化、免疫グロブリン（Ｉｇ）クラススイッチ、胚中心反応および親和性の成熟、ＣＴＬの活性化、免疫記憶、免疫応答の制御その他にとって必須である。
【０００４】
ＭＨＣ分子は細胞内のペプチドを回収し、それを細胞表面上でＴ細胞のＴＣＲに提示する。ＭＨＣの主要な２つのクラス、すなわち、ＣＤ８陽性のＣＴＬによって認識されるクラスＩおよびＣＤ４陽性のＨＴＬによって認識されるクラスIIがある。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ分子は、４５ｋＤａの膜結合アルファ鎖と１２ｋＤＡの非共有結合したｂ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）とからなる。Ｘ線結晶解析による３次元構造の解像（SternおよびWiley、1994）は、このアルファ鎖が溝を有し、この溝の両端が閉じられており、８〜１１アミノ酸長のペプチドを収容することを明らかにした。クラスＩ分子は遍在的に発現され、これら分子が表すペプチドは細胞質タンパク質に由来するものである。これら細胞質タンパク質はプロテアソームによって分解され、その結果生じたペプチドは小胞体（ＥＲ）に能動輸送される。小胞体で幾つかのシャペロンの助けを借りてＭＨＣ：ペプチド複合体が形成され、細胞表面に輸送される（Heemels、1995）。それゆえ、ＭＨＣクラスＩ分子は細胞の表面上で該細胞のプロテオーム（proteome）を反映し、Ｔ細胞が細胞内病原体または悪性の細胞を認識するのを可能にする。
【０００６】
ＭＨＣクラスII分子は、それぞれ３５ｋＤａおよび３０ｋＤａの２つの膜結合タンパク質（アルファ鎖およびベータ鎖）からなる。これらは一緒になって両端で開いた溝を形成し、様々な長さ、通常１２〜２５アミノ酸のペプチドを収容することができる。これら相違にもかかわらず、クラスＩおよびII分子は驚くほど構造上の類似点を有している（SternおよびWiley、1994）。クラスII分子は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞およびマクロファージ／単球を含むプロフェッショナルＡＰＣ上でのみ発現される。これら細胞は、エンドソーム経路で抗原を取り込みプロセシングするように特殊化している。クラスII分子は生合成されると直ちにいわゆるインバリアント鎖（Ｉｉ）と複合体を形成し、このインバリアント鎖はＥＲ中でのペプチドの結合を防ぐ。クラスII：Ｉｉ複合体を含む小胞が外来抗原の分解産物を含むエンドソームと融合すると、ＭＨＣ結合溝がいわゆるＣＬＩＰペプチドとのみ複合体を形成するまでＩｉは分解される。後者（ＣＬＩＰペプチド）はＨＬＡ−ＤＭなどのシャペロンの助けを借りて抗原ペプチドと交換される（Villadangos、2000）。最終的にＭＨＣ：ペプチド複合体は再びＡＰＣの表面に提示され、多くの仕方でＨＴＬと相互作用する。
【０００７】
ＭＨＣ系はポリジーン性であることおよび極めて多型性であることのため高度に複雑である。ヒトのクラスＩアルファ鎖については、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと呼ばれる３つの遺伝子座が存在する。同様に３つのクラスIIアルファ鎖遺伝子座（ＤＲＡ、ＤＱＡ、ＤＰＡ）が存在する；クラスIIベータ鎖遺伝子座については、４つの異なるＤＲベータ鎖（ＤＲＢ１、２、３、５）プラスＤＱＢおよびＤＰＢが存在するのでさらに一層複雑である。単一性のＤＲアルファ鎖ＤＲＡを例外として、各遺伝子座は集団中で多くの（数十〜数百の）異なる対立遺伝子として存在する（Klein、1986）。異なる対立遺伝子は大体、ペプチドに対する区別される結合特異性を有する。対立遺伝子は、たとえば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１またはＨＬＡ−ＤＰＡ＊０１０１／ＤＰＢ＊０４０１のように表される。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープは様々なアプローチにより同定されている（Van den Eynde、1997）。Ｔ細胞株およびクローンは、たとえば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、たとえば適当なＨＬＡ−分子でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の文脈においてスクリーニングするのに用いられている。あるいは、生化学的なアプローチも追求されている。後者は、標的細胞上のＭＨＣ分子からの天然リガンドの溶出、幾つかのクロマトグラフィー工程によるこれらペプチドの分離、エピトープ再構成アッセイでのリンパ球との反応性の分析および質量分光法によるシークエンシングを含む（Wolfelら、1994、Coxら、1994）。
【０００９】
最近、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩｓｐｏｔなどの高感度サイトカイン検出アッセイの出現が、重複する合成ペプチドのスクリーニングのためにリンパ球を直接イクスビボで使用することを可能にした（Maecker、2001、Kern、2000、Tobery、2001）。主として、Kernら（1999&2000）は、重複する９ｍｅｒのペプチドのプールのアレイを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをインビトロでマッピングした。後に、Toberyら、2001はこのアプローチを改変し、６４もの多くの２０ｍｅｒペプチドを含むプールを用いてＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔ細胞エピトープをスクリーニングできることをマウスで示した。これら両方法は、細胞内染色によるか（Kernら、2000）またはＥＬＩｓｐｏｔアッセイにて（Toberyら、2001）ＩＦＮ−ガンマ産生を測定することにより抗原特異的な応答をモニターすることに基づいていた。１５ｍｅｒの混合物を用いることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は全可溶性タンパク質を抗原として用いたときに検出されるものとほぼ等しいのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は（驚くにあたらないが）可溶性のタンパク質刺激で検出されるしばしば無視できるほどの応答よりも有意に高い。さらに、１５アミノ酸のペプチドの混合物に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、既知のＭＨＣクラスＩ最小エピトープを表すべく選択した８〜１２アミノ酸のペプチドの混合物で得られる応答と同様である。おそらく、これら状況下、細胞膜に結合したペプチダーゼがペプチドを最適な長さに「刈り込む（clipping）」のを担っている（Maeckerら、2001）。
【００１０】
興味深い代替法は、合成コンビナトリアルペプチドライブラリーを特異的なリンパ球でスクリーニングすることである。たとえば、ポジショナルスキャニングフォーマットに配置した２００の混合物からなるデカペプチドライブラリーが、Ｔ細胞のクローン特異的集団を刺激するペプチドリガンドの同定に首尾よく用いられている（Wilsonら、J. Immunol., 1999, 163: 6424-6434）。
【００１１】
多くのＴ細胞エピトープは、いわゆる「逆（reverse）免疫学的アプローチ」（Rammensee、1999）により同定されている。この場合は潜在的なＴ細胞エピトープを生じるタンパク質は知られており、その一次配列をＨＬＡ結合モチーフについてスキャニングする。典型的に数十から数百の候補ペプチドあるいは重複ペプチドの完全なセットまでをも合成し、ＨＬＡ分子への結合について試験する。通常、最良の結合体をＴ細胞との反応性についてさらに特徴付けるために選択する。このことは、たとえば、インビトロまたはＨＬＡトランスジェニックマウスの助けを借りてインビボでＴ細胞を初回免疫することにより行うことができる。
【００１２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で約１億７０００万人に慢性感染しているフラビウイルスの成員である。少なくとも６つのＨＣＶ遺伝子型があり、５０を超えるサブタイプが記載されている。アメリカ、ヨーロッパおよび日本では遺伝子型１、２および３が最も一般的である。ＨＣＶ遺伝子型の地理的分布は遺伝子型によって大きく異なっており、遺伝子型１ａは米国および西ヨーロッパの一部で優勢であり、一方、１ｂは南および中央ヨーロッパで優勢である（Bellentani、2000）。
【００１３】
ＨＣＶは非経口または皮下経路で伝達され、肝細胞で増殖する。患者の約１５％が、ウイルスのクリアランスおよび回復を伴う急性の自己限定性の肝炎を経験している。感染者の約８０％が慢性のキャリヤとなる。感染はしばしば何年もの間ゆっくりと進行しながら無症候的に持続するが、最終的にはＨＣＶは肝臓疾患の最終ステージである肝硬変および肝臓癌の主たる原因である（Liang、2000）。ＨＴＬおよびＣＴＬの両応答の強度および質が、患者が回復したのか（自然にまたは療法の結果）あるいは慢性感染を進展させているのかを決定する（Liang、2000）。
【００１４】
標準的なＨＣＶの療法は、ポリエチレングリコール処理した（pegylated）インターフェロン−アルファと抗ウイルス剤リバビリンとの組合せを含む。ウイルス学的応答は、遺伝子型に応じてＨＣＶ患者の約５０％で達成される。この療法の低い許容性および相当の副作用は、治療ワクチンを含む新規の治療的介入を必要としている（Cornberg、2002）。しかしながら、現在のところ、どのＭＨＣ組合せ中のどのエピトープが首尾よい免疫応答に導くのかについての詳細な理解を欠いている（Ward、2002）。それゆえ、全体のＨＣＶに対するＴ細胞応答の総合的な分析が治療用のエピトープベースのワクチンの開発に必要である。
【００１５】
ＨＣＶビリオンは、約３０００アミノ酸の大きな単一のポリタンパク質をコードする９.５キロベースの一本鎖のポジティブＲＮＡゲノムを含む。後者（大きな単一のポリタンパク質）は、宿主およびＨＣＶによりコードされた両タンパク質分解活性により少なくとも１０のタンパク質にプロセシングされる（Liang、2000）。重要なことには、ＨＣＶのＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼは誤りを起こしてウイルスの偽種（quasispecies）の進化を生成する傾向にあり、免疫回避変異体の生成に貢献している（Farci、2000）。
【００１６】
過去１５年の間に当該技術分野において多くの提唱がなされ、この期間に多くの有望な抗原候補が提唱されてきたが、それでも依然としてＨＣＶワクチンは市場に出回っていない（満足のいく治療法も同様；唯一利用できる治療である上記アルファインターフェロンとリバビリンとの組合せは少数の患者にのみ有効である）。ＨＣＶ配列の公表後まもなく、無数のエピトープおよび抗原がＨＣＶ疾患に対抗するための有効な手段として示唆されてきた（たとえば、Kozielら、J. Virol. 67(12), 7522-7532; Shiraiら、J. Virol. 68(5)(1994), 3334-3342; Leroux-Roelsら、Hepatology 23(1)(1996), 8-16; Hoffmannら、Hepatology 21(3)(1995), 632-638; Sarobeら、J. Clin. Invest. 102(6)(1998), 1239-1248; Battegayら、J. Virol. 69(4)(1995), 2462-2470; Wentworthら、Int. Imunol. 8(5)(1996), 651-659; Rehermannら、J. Virol. 70(10)(1996), 7092-7102; Diepolderら、J. Virol. 71(8)(1997), 6011-6019; Lamonacaら、Hepatology 30(4)(1999), 1088-1098；ＷＯ００／１１１８６、ＷＯ９５／１２７６６、ＷＯ９５／２７７３３、ＷＯ９４／２０１２７、ＷＯ９５／２５１２２、ＷＯ９５／２２３１７、ＷＯ９４／２５６０１、ＷＯ９２／０３４５８およびＷＯ９３／００３６５）。さらに、重要な原理証明（proof-of-principle）イクスビボ中和研究が、慢性ＨＣＶ感染を受けた（susceptible）チンパンジー、ホモ・サピエンス以外の他の種で行われている。実際、急性の消散した（resolved）感染か慢性の感染を有する個体およびチンパンジーで誘発した免疫応答の研究は、これまで、活動性のウイルス感染の確立後に明らかとなった潜在的な防禦免疫応答の病像を明らかにしたにすぎない。しかしながら、非経口免疫後の予防ワクチン防禦の相関は、主としてＨＣＶ暴露前の肝外のものであると予期される。ごく限られた数のワクチン有効性研究がチンパンジーで行われているにすぎず、これら研究は、（せいぜい）低用量の相同な攻撃（homologous challenge）後に７匹の動物のうち５匹を感染から防御することを示しており、その際、免疫と攻撃とで全く同じクローンが用いられているのである。さらに、ＨＣＶは高度の多様性を表し、この多様性はＨＣＶにワクチン誘起または感染誘起免疫応答からの回避能を付与する。この問題を考慮して、ＤＮＡワクチンとしての種々の大きなタンパク質断片の組合せもまた別のワクチン戦略として示唆されている（Rollierら、J. Virol. 78(1)(2004), 187-196; Dunas-Carreraら、Biotech. Appl. Biochem. Imm. Publ. (29 September 2003; BA20030112)）。
【００１７】
過去１５年間、とりわけ過去１０年間のあらゆる進歩にもかかわらず、ＨＣＶに対する新たな療法およびワクチン戦略を開発することの切迫した必要性が依然として存在する（Heileら、J. Virol. 74(15)(2000), 6885-6892）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
それゆえ、本発明の目的は、ＨＣＶに対するそのような有効な療法およびワクチン戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
それゆえ、本発明は、少なくとも２つのエピトープを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチンであって、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものであり、その際、ホットスポットエピトープは、
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
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ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、
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ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
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ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
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ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ
よりなる群から選ばれたペプチドを含むエピトープとして定められることを特徴とするワクチンを提供する。
【００２０】
２００３年８月２７日に出願したＷＯ０４／０２４１８２（Ａ１３６７／２００２の２００２年９月１３日の優先権を主張）には、ワクチン接種に有用なＨＣＶペプチド、とりわけＨＣＶ Ｔ細胞エピトープを単離するための新規な方法が記載されている。この出願において「ＨＣＶホットスポットエピトープ」の概念が初めて開示された：Ｔ細胞エピトープ「ホットスポット」は、１を超えるＴ細胞エピトープを少なくとも含む短いペプチド配列として定義される。たとえば、２またはそれ以上のエピトープが互いにしばらく後に（「しばらく」とは５〜１０アミノ酸未満として定義される）位置していてよく、または直接互いの後に位置していてよく、または部分的または完全に重複していてよい。ホットスポットはクラスＩエピトープまたはクラスIIエピトープのみを含んでいてよいし、またはその組合せを含んでいてよい。ホットスポット中のエピトープは異なるＨＬＡ拘束を有していてよい。
【００２１】
導入部で言及したように、クラスＩおよびクラスII抗原プロセシングの高度に複雑かつ選択的な経路のため、Ｔ細胞エピトープはポリペプチドの配列内で容易に予測することができない。Ｔ細胞エピトープ予測のためのコンピューターアルゴリズムは、広く用いられているとはいうものの、偽陰性および偽陽性の割合が高い。
【００２２】
それゆえ、個々のＴ細胞エピトープでさえもポリペプチドの配列内で明白でないように、同じことはホットスポットの場合はより一層当てはまる。本発明に従い、エピトープ捕捉、ＨＬＡ−トランスジェニック動物およびヒト単核細胞のインビトロ刺激を含む幾つかの顕著に異なる実験アプローチをＴ細胞エピトープ同定のために組み合わせる。これら３つのアプローチはすべて、目的とする抗原にまたがる重複ペプチドに系統的に適用され、エピトープの総合的な同定を可能とする。特定のＨＬＡ対立遺伝子に限定するのではなく、むしろ集団内のターゲティングの可能性のあるすべてのエピトープを解明するそのような総合的な分析により、エピトープホットスポットが明らかとなる。ある抗原内で、もしあったとしてもごくわずかの配列がホットスポットの特性を示すにすぎない。それゆえ、ホットスポットの同定は常に驚くべき事象である。
【００２３】
Ｔ細胞エピトープのホットスポットは、重要な利点を提供する：ホットスポットは、ある被験者の異なるＴ細胞クローンを活性化することができ、異なるＴ細胞クローンによって認識されうる。ホットスポットは（異なるＨＬＡ拘束のエピトープを含むときは）、異なる非ＨＬＡマッチング個体からのＴ細胞と相互作用することができる。
【００２４】
エピトープベースのワクチンは、これまで、選択した優勢なＨＬＡ−対立遺伝子、たとえばＨＬＡ−Ａ２（カフカス人の約半分で発現される）に着目してきた。他の対立遺伝子の頻度はもっと低いため、広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンは多くの異なるエピトープを含む必要があるであろう。ワクチンの化学物質（たとえば、ペプチド）の数は、製造、製剤化および製品の安定性からの制約により限定される。
【００２５】
ホットスポットは、限られた数のペプチドによって潜在的に多数のエピトープを提供するので、そのような広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンを可能とする。実際、従来技術（従来技術で検討したエピトープおよびＨＣＶワクチンが未だ開発されていない事実に関して上記文献を参照のこと）は、その現況では、ＨＣＶワクチンの開発が問題のあるものと見られてきたこと、および幾つかの感染モデルでの体液性および細胞性免疫応答の誘発におけるＨＣＶ抗原の有効性を教示する過去１０年間に及ぶ膨大な文献にもかかわらず、ＨＣＶワクチンおよび療法の開発は一般的な失敗であったことを明らかに示している。ＨＣＶ感染の治療および予防は、錯綜と高度の予測不能性とで取り組まれている（wrought）。
【００２６】
ＨＣＶホットスポットエピトープ特徴付けに基づくＨＣＶワクチンを提供することによる本発明の概念は、今や初めて、ＨＣＶワクチン接種システムを可能にし、このシステムは適当なおよび特異的な両予防ワクチン接種およびＨＣＶ感染患者、とりわけ慢性感染患者に対する有効な治療プログラム（regimen）を可能とする。
【００２７】
本願の発明者らにより、ＨＣＶワクチンでの１または２のみの特異的なエピトープの使用がワクチン接種において満足のいく結果を得るには十分でないことを示すことができた。また、ＨＣＶタンパク質の混合物（ＤＮＡワクチンとしてのコア、Ｅ１およびＥ２；Duenas-Carreraら(2003)）またはそのようなＨＣＶタンパク質の大きな断片の混合物（ＤＮＡワクチンとしてのコア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３；Rollierら(2004)）を提供するとの概念は所望の結果をもたらさなかった。
【００２８】
本発明によるＨＣＶワクチンは、上記で列挙したホットスポットエピトープからのエピトープを含む短いポリペプチドを含む。本発明のワクチンは、ＤＮＡワクチンに関するリスクおよび不確実性（長期間にわたって持続する免疫応答の欠如；主として肝外の作用；作用様式；局在性等）に依存するものではない。さらに、本発明はまた、完全長のタンパク質または長鎖のタンパク質断片の生産に際して深刻な製造上の問題を突きつけるものでもない。
【００２９】
本明細書において開示するホットスポットエピトープは、主としてＴｈ１／Ｔｃ１タイプの反応（すなわち、インターフェロンガンマ）を読み出しとして用いた機能的なアッセイにより同定したものである。（全体または少なくとも大きな断片の）抗原は、そのようなアゴニストエピトープを含むのみならずアンタゴニストリガンドをもコードすることがよく知られている。そのような全体の抗原には潜在的に存在するがホットスポットには存在しないアンタゴニストは、ワクチンの免疫原性および有効性を妨害する。さらに、全体の抗原は殆ど確実に体液性の免疫応答を誘発するであろう。そのような抗体応答自体は細胞内にあるＨＣＶに対して殆ど影響を及ぼさないが、所望のＴ細胞応答をひどく損ないうる。本発明によるホットスポットに由来するエピトープは、その長さが限られているため、所望でない抗体応答を誘発する蓋然性が極めて低い。最後に、ＨＣＶ抗原の相対的に小さな部分のみが異なる遺伝子型間で保存されている。それゆえ、ワクチンに使用した全体の抗原は、殆どの患者にとって関連のない非保存領域またはエピトープに対する応答を誘発する。対照的に、本明細書に開示するホットスポットは、主要なＨＣＶ遺伝子型である１、２および３で＞８０％保存された領域に由来するものである。
【００３０】
ＨＬＡ−スーパータイプ（たとえば、ＷＯ０１／２１１８９に開示されているような）は、所定のＨＬＡ−クラスＩ Ｔ細胞エピトープが、ある場合には、もっぱら唯一のＨＬＡ−対立遺伝子に拘束されるのではなく他のＨＬＡ−対立遺伝子の文脈のＴ細胞によっても認識されうる（例：ペプチドはＨＬＡ−Ｂ*０７０２およびＨＬＡ−Ｂ*３５０１に結合できる）という事実を記載している。そのようなペプチドは本質的に、集団においてより広いＨＬＡ適用可能性を有し、それゆえ興味深いワクチン候補である。
【００３１】
対照的に、本発明によるＴ細胞エピトープホットスポットはそのようなＨＬＡ−スーパータイプとは有意に異なるものである、なぜなら本発明によるホットスポットは異なった隣接するまたは重複さえもする桁外れに多数のエピトープを示すタンパク質内のペプチド領域だからである。ホットスポットは相対的に短い領域内で多数のエピトープを提供し、それと同時にホットスポット内でのエピトープの適切なプロセシングが保証される。
【００３２】
実際、本発明によるホットスポットは異なるＨＣＶ種の間で顕著に低い変異しか示さず、このことが当該ホットスポットをワクチンアプローチにとって一層有利なものにする、なぜならごく小さなポリペプチドが用いられたとしても異種攻撃も可能だからである。いずれにせよ、本発明で提供されるエピトープは１００アミノ酸の長さを超えることはなく、一般に有意に短い。好ましくは、本発明によるエピトープの長さは少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸である。最大１３、１５、２０、２５、３０、４０または５０アミノ酸の長さも好ましいものと考えられる。
【００３３】
本発明に従い、所定のワクチンのためのエピトープは上記ホットスポット領域から選択することができる。もちろん、ホットスポット領域全体をワクチンに提供することもできるし、またはその一部のみを提供することもできる（当該一部が少なくとも１のエピトープを含んでいる限り）。しかしながら、１またはそれ以上（たとえば、２、３、４、５または６）のエピトープがワクチンに提供されるのが有利であり、該エピトープはホットスポット領域全体かまたは１を超えるエピトープを含む領域を少なくとも含んでいる。本発明に従って用いるエピトープはまた、上記ホットスポット「マスター」配列中に欠失（好ましくは１、２、３、４、５、６または７アミノ酸）を有する配列変異体であってもよい。好ましくは、ホットスポット配列の内部の欠失はエピトープを変えないものである；もちろん、欠失に拘わらずホットスポット領域中に少なくとも１のエピトープが保存されている必要がある。
【００３４】
とりわけ、１のエピトープのみを有するペプチドの一方のグループと１を超えるエピトープを有するペプチドの他方のグループとの混合物を提供するのが好ましい。たとえば、１のエピトープを有する少なくとも１または少なくとも２のペプチドおよび１を超えるエピトープ（たとえば、ホットスポット全体の配列）を有する少なくとも１または少なくとも２のペプチドを含むワクチンが好ましい。
【００３５】
エピトープは修飾することなくポリペプチドとして提供することができる；ポリペプチド鎖をある種の化学的または生物学的残基で修飾することは、とりわけ可溶化または医薬製剤化の考慮の観点から適切である（たとえば、ＷＯ０１／７８７６７に記載されているように）。本発明のＨＣＶワクチンに使用するエピトープは、ホットスポット領域全体またはその隣接する（contiguous）断片（ホットスポットに含まれるエピトープの少なくとも１つを含む）を含むかまたはホットスポットの非隣接の（non-contiguous）一部（しかしながら、ホットスポットに含まれるエピトープの少なくとも１つをも含む；そのような場合、このホットスポットの非隣接の一部の間に１またはそれ以上のリンカー（たとえば、アミノ酸またはペプチドリンカー）を提供することができる）を含んでいてよい。
【００３６】
好ましい態様によれば、本発明によるＨＣＶワクチンは、それぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つのエピトープを含む。
【００３７】
さらに好ましくは、ＨＣＶワクチンはそれぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも５つのエピトープを含む。そのようなエピトープベースのワクチン中のエピトープの数が多ければ多いほど製剤化に関する問題は大きくなるが、４つ、５つまたは６つのエピトープが、とりわけ工業スケールの生産に関して広範囲の防禦能と製剤化の欠点との最適の均衡である。
【００３８】
それゆえ、ある場合には、それぞれ異なるホットスポットエピトープからの少なくとも６つのエピトープを含むＨＣＶワクチンもまた本発明の好ましい態様である。ホットスポットエピトープの最適数はまた選択したエピトープ相互の相対的な相互作用にも依存し、この点はワクチン中の短い長さのポリペプチドのある種の組合せの場合の主たる障害であることがわかっている。
【００３９】
本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、エピトープが以下の群から選ばれることを特徴とする：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＧＰＲＬＧＶＲＡＴ、ＲＬＧＶＲＡＴＲＫ；
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ；
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ、ＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ；
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ；
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ、ＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＱＹＬＡＧＬＳＴＬ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩ；
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹ、ＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＴＩＮＹＴＩＦＫ、ＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩ、ＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩ、ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲ；
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＰＡＥＴＴＶＲＬ；
ＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱ、ＲＬＬＡＰＩＴＡＹ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬ；
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＩＬＡＧＹＧＡＧＶ、ＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬ；
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ、ＳＹＴＷＴＧＡＬＩ；
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ；
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＲＳＥＬＳＰＬＬＬ、ＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ；
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ；
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＱＲＫＴＫＲＮＴＮ、ＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＫ；
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ、ＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ；
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、ＴＴＩＬＧＩＧＴＶ、ＴＩＬＧＩＧＴＶＬ；
ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ、ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ、ＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡ、ＶＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ；
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＲＬＩＶＦＰＤＬ、ＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶ、ＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ；
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ；
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡ；
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ、ＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶ。
【００４０】
一般に、良好な結果を達成するには１のエピトープのグループからは１のエピトープのみを選択すべきである。もちろん、上記で列挙したホットスポットエピトープのすべてが等しく強力であるというわけではなく、効力は異なる集団群で異なりうる。好ましくは、主としてＨＬＡ適用に基づいて個々のワクチン接種戦略を各群に適用することができる。それゆえ、本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに一層好ましくは少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【００４１】
異なる特異性のためには、本発明によるＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲおよび
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ。
【００４２】
さらに異なる特異性のためには、本発明によるＨＣＶワクチンは、以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする：
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ。
【００４３】
本明細書で列挙した正確な抗原およびエピトープの別態様として、抗原／エピトープ変異体を本発明によるワクチンに用いることができる。好ましい変異体は、ホモログ（相同ＨＣＶ株に存在する１またはそれ以上の交換を含む）またはヘテロクリティック（heteroclictic）エピトープに従ってデザインする。好ましい変異体としては、本明細書に開示した配列と保存的アミノ酸置換によって異なるものが挙げられる。そのような置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性を有する他のアミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的に認められるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間で互いに置換するもの；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換および芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間での置換である。
【００４４】
この点に関して特に好ましいのは、本明細書に開示したポリペプチドのアミノ酸配列において１、２、３、４または５のアミノ酸残基が置換、欠失または付加（いかなる組合せであってもよい）した変異体である。これらのうちで好ましいのは、本発明のポリペプチドの特性および活性を変えることのないサイレントな置換、付加および欠失である。この点で特に好ましいのは、保存的な置換である。特に好適なアミノ酸置換は、本明細書に開示した配列のホモログに含まれるものである。それゆえ、本明細書に開示する抗原またはエピトープの好適な配列変異体は、ＨＣＶの１またはそれ以上の株または血清型に存在する１またはそれ以上の変異（好ましくはそのようなホモログ変異に基づく１、２、３、４または５のアミノ酸の交換）を含む。そのような抗原は、天然に存在する配列または新たに生成した人為的な配列である配列を含む。これら好ましい抗原変異体は、そのような天然に存在する配列変異、たとえば、本発明によるポリペプチドの抗原領域の「混合配列」（mixed sequence）の形成に基づく。たとえば、本明細書に開示する所定のＨＣＶ配列は、１またはそれ以上の変異を含むことによってこの所定の（天然に存在する）抗原またはエピトープ配列の人為的な（すなわち、天然に存在しない）変異体を生成してよい。
【００４５】
エピトープのＴ細胞活性化能を改善し、保存しまたは少なくとも有意に妨害することのないアミノ酸交換によって本発明のエピトープまたはペプチドから得られるエピトープまたはペプチドもまた本発明によるエピトープまたはペプチドに包含されることが明らかである。それゆえ、本発明のエピトープまたはペプチドはまた、ＨＣＶの特定の株に由来する元々の配列を含まないが同じかまたは好ましくは改善されたＴ細胞応答を惹起するエピトープまたはペプチドをも包含する。これらエピトープは「ヘテロクリティック」と呼ばれる。これらには、元々のエピトープと同じＴ細胞を惹起することができ、好ましくはインビボまたはインビトロにおいてもＴ細胞のより強力な活性化能を有するエピトープが含まれる。また、ＨＣＶの他の株からの各相同エピトープが本発明に包含される。
【００４６】
ヘテロクリティックエピトープは、合理的デザインにより、すなわち、ＴＣＲと相互作用する可能性のある残基の体系的な交換とその結果得られる配列の元々のエピトープに対するＴ細胞を用いた試験と組み合わせて、たとえば、Ramenseeら、1999（Immunogenetics 50: 213-219）またはSturnioloら、1999（Nature Biotechnology 17: 555-562）に記載されているように、ＭＨＣ／ＨＬＡへの結合への個々の残基の貢献を考慮に入れて、得ることができる。そのようなデザインは、過度の実験を要することなく当業者が行うことが可能である。
【００４７】
他の可能性としては、元々のエピトープに対して向けられたＴ細胞を用いたペプチドライブラリーのスクリーニングが挙げられる。好ましいやり方は、合成ペプチドライブラリーのポジショナルスキャニングである。そのようなアプローチは、たとえば、Blakeら、1996（）およびHemmerら、1999（）およびその中の引用文献に詳細に記載されている。
【００４８】
コグネイトＨＣＶ由来アミノ酸配列により表されるエピトープまたはヘテロクリティックエピトープの別態様としては、これらペプチドを擬態する物質、たとえば「ペプチドミメチカ（peptidemimetica）」または「レトロ−インバーソ−ペプチド（retoro-inverso-peptides）」を適用することができる。
【００４９】
さらなる化学基、とりわけアミノ酸残基、リンカー（および担体への結合基）、輸送容易化基などを、本発明によるＨＣＶワクチン中のエピトープのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができる。ＷＯ０１／７８７６７に記載のアミノ酸結合が好ましい。
【００５０】
改善されたホットスポットエピトープのデザインの他の側面は、Ｔ細胞を刺激する能力を増大させる物質で製剤化すること（formulation）または修飾することである。これらには、Ｔヘルパー細胞エピトープ、脂質またはリポソームが含まれる（またはＷＯ０１／７８７６７に記載の好ましい修飾）。
【００５１】
エピトープのＴ細胞刺激能を増大させる他の方法は、たとえば抗体、インターロイキン２、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターロイキン１８、Ｉ型およびII型インターフェロン（ＩＦＮ）などのサイトカインもしくはケモカイン、とりわけＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ｆｌｔ３−リガンドその他の免疫刺激物質で製剤化することである。
【００５２】
さらなる側面によれば、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療または予防するためのＨＬＡ拘束ワクチンの製造のための本発明によるＨＣＶエピトープまたはＨＣＶペプチドの使用に関する。
【００５３】
本発明による好ましいＨＣＶワクチンは、以下のエピトープの少なくとも２つを含む：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。好ましくは、このＨＣＶワクチンは、これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、または１２のすべてを含む。
【００５４】
本発明による他の好ましいＨＣＶワクチンは、以下のエピトープの少なくとも２つを含む：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。好ましくは、このＨＣＶワクチンは、これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ７つのすべてを含む。
【００５５】
本発明のＨＣＶワクチンは、好ましくは少なくとも１つのＡ２エピトープおよび少なくとも１つのＤＲ１エピトープを含む。
【００５６】
本発明のＨＣＶワクチンは、好ましくは少なくとも１つのＤＲ７エピトープを含む。
【００５７】
エピトープの以下の組合せが特に強力であると認められる（グループ（１）〜（５）の少なくとも３つからの少なくとも１つ）：
（１）ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＬＰＲＲＧＰＲＬまたはＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＲＬＧＶＲＡＴＲＫまたはＫＦＰＧＧＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
（２）ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬまたはＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡまたはＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＰＳＶＡＡＴまたはＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＡＡＴ、
（３）ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰＡＬＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰまたはＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡまたはＤＬＭＧＹＩＰＬＶ、
（４）ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴまたはＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧまたはＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、
（５）ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮまたはＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮまたはＱＹＬＡＧＬＳＴＬまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬまたはＨＭＷＮＦＩＳＧＩＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＨＭＷＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡまたはＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ；とりわけエピトープＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよびＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡを含むＨＣＶワクチンが特別に強力であることがわかった。
【００５８】
本発明のＨＣＶワクチンに特別に適した補助物質を提供するのが好ましい。それゆえ、ある種の免疫刺激物質が本発明に有利であることがわかった。
【００５９】
それゆえ、好ましいＨＣＶワクチンは、配列：Ｒ１−ＸＺＸＺＮＸＺＸ−Ｒ２（式中、Ｎは３〜７の全数、好ましくは５、Ｘは正に荷電した天然および／または非天然アミノ酸残基、ＺはＬ、Ｖ、Ｉ、Ｆおよび／またはＷよりなる群から選ばれたアミノ酸残基、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＨ、２０までのアミノ酸残基またはペプチド反応性の基を有するペプチドまたはペプチドを有するかまたは有しないペプチドリンカーから選ばれる；Ｘ−Ｒ２はまた該ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであってよい）を含むペプチド（「ペプチドＡ」）をさらに含んでいてよい。
【００６０】
ＨＣＶワクチンのさらに好ましい態様は、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１はヒポキサンチンおよびウラシルから選ばれる、
ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシイノシン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）による構造を有する免疫促進オリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）（Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮ）をさらに含む。
【００６１】
本発明によるＨＣＶワクチン組成物は、ポリカチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性ポリマー、さらに好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌ペプチドをさらに含んでいてよい。
【００６２】
本発明により使用するポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００６３】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensines）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物をポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００６４】
本発明の方法に使用するポリカチオン性物質は、カテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（ＷＯ０２／１３８５７Ａ、参照のため本明細書に引用する）、とりわけ哺乳動物カテリシジン、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２に記載）である。
【００６５】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質、とりわけマウス、ウシまたは特にヒトのカテリンおよび／またはカテリシジンである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明によるＨＣＶペプチド組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫促進性物質を用いまたは用いることなく、ワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００６６】
好ましくは、本発明のＨＣＶワクチンはＡｌ(ＯＨ)３アジュバントおよび／またはポリカチオン性ペプチドをさらに含む。
【００６７】
特に好ましい態様によれば、上記ペプチドＡはＫＬＫＬ５ＫＬＫであり、および／または上記Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮはオリゴｄ(ＩＣ)１３である。
【００６８】
ある態様において、ＨＣＶワクチンは、ＣｐＧ−モチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドをさらに含むのが好ましい。
【００６９】
好ましくは、本発明によるＨＣＶワクチンは、１５分以内に３７℃で再構成しうる形態に凍結乾燥する。ＨＣＶワクチン中の個々のエピトープに応じて、これは困難な作業である。それゆえ、本発明はまたそのようなＨＣＶワクチンを製剤化するための効率的な手段をも提供する。
【００７０】
本発明によるＨＣＶワクチンは、１０μｇ〜１０ｍｇの各エピトープ（投与量当たり）を含むのが好ましい。
【００７１】
各応用に応じて個々のペプチドの数およびとりわけ混合物中でのその濃度は異なる。本発明の好ましい態様において、患者に送達すべきＨＣＶワクチン中の個々のペプチドの濃度は、５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００７２】
本発明による凍結乾燥ＨＣＶワクチンは、本発明による凍結乾燥プロセスのために痕跡量の酢酸を含むのが好ましい。
【００７３】
他の側面によれば、本発明はまた、ＨＣＶ感染の予防および治療用医薬の製造のための本発明のＨＣＶワクチンの使用、すなわち、本発明によるＨＣＶワクチンの有効免疫投与量を個体、とりわけＨＣＶ患者またはＨＣＶ感染を獲得するリスクにある個体（たとえば、病院の職員、臨床研究の職員、献血者など）に投与することにも関する。
【００７４】
本発明によるＨＣＶワクチンなどのペプチド混合物の可溶化は困難でありうる。それゆえ、本発明によるＨＣＶペプチド混合物、すなわち２つまたはそれ以上のペプチドからなるペプチド混合物、とりわけ親水性ペプチドおよび疎水性ペプチドからなるペプチド混合物の可溶化の方法を提供することが本発明の一つの目的である。他の目的は、ペプチド混合物を含む滅菌したおよび場合により凍結乾燥した医薬製剤の製造法を利用できるようにすることである。
【００７５】
それゆえ、本発明は他の側面に従い、本発明によるＨＣＶペプチド混合物の可溶化を含む医薬製剤の製造法を提供し、該方法は、該ペプチド混合物を、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化することを特徴とする。貯蔵寿命を延ばすため、可溶化したペプチド混合物はさらに滅菌（濾過、放射線照射、熱処理、化学的滅菌その他の方法により）および凍結乾燥することができる。
【００７６】
好ましい態様において、ペプチド混合物は親水性ペプチドおよび疎水性ペプチドを含む。もちろん、本発明の方法はまた、１つのタイプのペプチドのみを含むペプチド混合物（とりわけ、たとえば２またはそれ以上の親水性ペプチドを含む混合物）に対しても用いることができる。
【００７７】
他の好ましい態様において、本発明に従って水溶液により溶解したペプチドは、少なくとも６つ、好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは少なくとも１０、とりわけ少なくとも１２のアミノ酸を含む。最大数３０、４０または５０（あるいは１００アミノ酸までも、もっとも、長いエピトープは長い抗原断片が不利であることにより一層好ましくはないが）のアミノ酸を含むペプチドおよびポリペプチドを本発明に従って溶解することができる。
【００７８】
本発明のこの側面については、ペプチドはその溶解度により特徴付けられる。水溶液中に１００μｇ／ｍｌ未満しか溶解しないペプチドは疎水性であるとされる。一方、親水性ペプチドは、緩衝化水溶液中に１００μｇ／ｍｌを超える濃度で溶解する。親水性ペプチドはさらに、陽イオン性ペプチド（＞２０％塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジンを含む））、陰イオン性ペプチド（＞２０％酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸を含む））およびヒドロキシルリッチペプチド（＞３０％−ＯＨ含有アミノ酸（セリン、トレオニン、チロシンなど））に分けることができる。
【００７９】
それゆえ、他の側面に従い、本発明は、以下の工程を特徴とする本発明のＨＣＶワクチンの製造方法に関する：
−上記少なくとも２つのエピトープを化学的に合成し、
−これらエピトープを、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化し、
−該可溶化エピトープを混合し、ついで
−任意に該混合エピトープを凍結乾燥する。
【００８０】
ＨＣＶペプチド混合物は、貯蔵の理由から急速冷凍（凍結乾燥工程を行わない場合）することができる。
【００８１】
本発明によるペプチド混合物のペプチドは、標準的な化学的方法（たとえば、Merrifieldによる固相合成）により合成する。もちろん、ペプチドはまた、組換えにより製造したまたは天然から単離したタンパク質の化学的または酵素的な断片化によっても得ることができる。他の態様において、ＨＣＶペプチドは真核細胞および原核細胞から直接単離する。３つのいずれの場合においても、目的とするペプチドまたはポリペプチドを凍結乾燥および混合する前に、ある場合にはさらなる精製が必要であろう。
【００８２】
ペプチドの可溶化のために水溶液中に使用する有機酸が薬理学的に許容しうるものであることは、この特別の方法の基本的な要件である。本発明の好ましい態様において、有機酸は任意にアセトニトリルを含む酢酸および／またはギ酸である。
【００８３】
実験によれば、ペプチド混合物の組成に依存して、水溶液中の有機酸の濃度は少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％でなければならないことが明らかとなった。
【００８４】
ある場合には、水溶液に有機酸の誘導体（たとえば、アセトニトリル）を加えることが大量の疎水性ペプチドを含むペプチド混合物を可溶化する助けとなる。ＤＭＳＯやＤＭＦなどの有機溶媒もまた、疎水性ペプチドの濃度の上昇したペプチド混合物の促進された可溶化に貢献する。しかしながら、ＤＭＳＯおよび／またはＤＭＦを含む水性ペプチド混合物は凍結乾燥することはできない。
【００８５】
好ましい態様において、生成物を凍結乾燥しようとする場合には充填剤（bulking agents）をペプチド混合物に加える。とりわけ低ペプチド濃度においては、良好な凍結乾燥ケーキの生成は保証の限りでない。それゆえ、低量のペプチド充填剤を加える。好ましい充填剤は、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびその混合物である。
【００８６】
他の好ましい態様において、可溶化したペプチド混合物を濾過により滅菌する。生成物の回収を増大させ、大量のペプチド混合物の濾過を可能とするため、含有ペプチドは完全に可溶化されていることが必要であり、ゲルが形成されてはならない。
【００８７】
可溶化し任意に滅菌したペプチド混合物は、直接、またはバイアルに濾過した後、凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、上記ペプチド混合物の貯蔵寿命を延ばすための有用かつ効果的な方法である。該可溶化ペプチドを用い、最大５％の残留溶媒（水系中の水）および痕跡量の有機酸を含むペプチド混合物の凍結乾燥調製物を得ることができ、該調製物は、ＮａＣｌおよび／または１０分以内に＞９５％、好ましくは９８％、とりわけ９９％のソルビトールを含む緩衝水溶液中で再構成して濁った懸濁液または透明な溶液（ペプチド混合物の組成による）とすることができる。そのような速やかな再構成は、すぐに使用できる（ready-to-use）溶液が数分内に存在し、凍結乾燥したバイアルの全用量の殆ど完全な再溶媒和（re-solvation）が必要とされる救急患者の場合に特に必要である。
【００８８】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【００８９】
実施例：
実施例１：ＨＣＶ由来ペプチドのＨＬＡクラスII分子への結合
ＷＯ０４／０２４１８２に従い、重複する反応性のＨＣＶペプチドからの配列を導入し、システインなどの重要な残基を回避した幾つかの新規なペプチドを合成した。これらペプチドをクラスII可溶性ＨＬＡ分子に対する親和性について再試験し、結果を元のもので得られた結果と比較した（表１）。
【００９０】
表１：選択したＨＣＶ由来ペプチドおよびその１５−ｍｅｒ対応物の可溶性ＨＬＡクラスII分子への結合（「＋＋＋」強い親和性、「＋＋」中くらいの親和性、「＋」弱い親和性、「−」親和性なし、「ｎｄ」試験せず；コア結合モチーフは下線を引いてある）
【表１】
【表２】
【００９１】
ペプチド１７９８の場合にその一層短い対応物（Ｂ８４〜Ｂ９６）に比べてＤＲＢ１＊０１０１分子およびＤＲＢ１＊０４０１分子に対する親和性がなくなっているのは、おそらく結合を妨害する二次構造を取り得る長い配列（２６アミノ酸）のためである。インビボでは、タンパク質加水分解的開裂によりペプチド１７９８が２つの短いクラスIIエピトープを生成するであろうことが予期される。ペプチド１８２７および１８２９（それぞれペプチドＣ１１４および１６０４の誘導体である）で除去されたシステイン（Ｃ）残基は、ＤＲＢ１＊０４０１分子への結合に必須であるが、他の試験したＤＲサブタイプへの親和性を本質的に変えることはないと思われる。
【００９２】
実施例II：ＨＣＶ−エピトープホットスポットの同定および特徴付け
上記で概説したように、Ｔ細胞エピトープホットスポット（「ホットスポット」）は１を超えるＴ細胞エピトープを少なくとも含む短いペプチド配列として定義される。たとえば、２またはそれ以上のエピトープが互いにしばらく後に（「しばらく」とは５〜１０アミノ酸未満として定義される）位置していてよく、または直接互いの後に位置していてよく、または部分的または完全に重複していてよい。ホットスポットはクラスＩエピトープまたはクラスIIエピトープのみを含んでいてよいし、またはその組合せを含んでいてよい。ホットスポット中のエピトープは異なるＨＬＡ拘束を有していてよい。
【００９３】
クラスＩおよびクラスII抗原プロセシングの高度に複雑かつ選択的な経路のため、Ｔ細胞エピトープはポリペプチドの配列内で容易に予測することができない。Ｔ細胞エピトープ予測のためのコンピューターアルゴリズムは、広く用いられているとはいうものの、偽陰性および偽陽性の割合が高い。
【００９４】
それゆえ、個々のＴ細胞エピトープでさえもポリペプチドの配列内で明白でないように、同じことはホットスポットの場合はより一層当てはまる。本発明に従い、エピトープ捕捉、ＨＬＡ−トランスジェニック動物およびヒト単核細胞のインビトロ刺激を含む幾つかの顕著に異なる実験アプローチをＴ細胞エピトープ同定のために組み合わせる。これら３つのアプローチはすべて、目的とする抗原にまたがる重複ペプチドに系統的に適用され、エピトープの総合的な同定を可能とする。特定のＨＬＡ対立遺伝子に限定するのではなく、むしろ集団内のターゲティングの可能性のあるすべてのエピトープを解明するそのような総合的な分析により、エピトープホットスポットが明らかとなる。ある抗原内で、もしあったとしてもごくわずかの配列がホットスポットの特性を示すにすぎない。それゆえ、ホットスポットの同定は常に驚くべき事象である。
【００９５】
Ｔ細胞エピトープのホットスポットは、重要な利点を提供する：ホットスポットは、ある被験者の異なるＴ細胞クローンを活性化することができ、異なるＴ細胞クローンによって認識されうる。ホットスポットは（異なるＨＬＡ拘束のエピトープを含むときは）、異なる非ＨＬＡマッチング個体からのＴ細胞と相互作用することができる。
【００９６】
エピトープベースのワクチンは、これまで、選択した優勢なＨＬＡ−対立遺伝子、たとえばＨＬＡ−Ａ２（カフカス人の約半分で発現される）に着目してきた。他の対立遺伝子の頻度はもっと低いため、広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンは多くの異なるエピトープを含む必要があるであろう。ワクチンの化学物質（たとえば、ペプチド）の数は、製造、製剤化および製品の安定性からの制約により限定される。
【００９７】
ホットスポットは、限られた数のペプチドによって潜在的に多数のエピトープを提供するので、そのような広範な世界規模の人口に適用可能なエピトープベースのワクチンを可能とする。
【００９８】
表２：ＨＣＶの保存領域中のＴ細胞エピトープホットスポット
ホットスポット（変異体を含む）は太字で示してあり、ホットスポット内に含まれるエピトープは標準フォントで示してある。ペプチドの数および配列、並びにＨＬＡ−クラスＩおよびクラスIIの適用を示す。ソースデータはＷＯ０４／０２４１８２により提供されない場合は文献名を参照してある。
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
実施例III：ＨＣＶエピトープホットスポットＩｐｅｐ１４２６は少なくともＨＬＡ−Ａ＊０２０１および幾つかのプロミスカスクラスII Ｔ細胞エピトープを含む
この実験の主たる目的は、「ホットスポット」Ｉｐｅｐ１４２６（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープ（Ｉｐｅｐ１３３４）および２つのプロミスカスクラスIIエピトープ（Ｉｐｅｐ１００６および１４２５）を含む）の免疫原性を個々のエピトープと比較することであった。この目的のため、何人かの健常なＨＬＡ型を決定した血液ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１４２６かまたは１３３４、１００６、１４２５の混合物のいずれかでインビトロで刺激した。３回刺激を行ってオリゴクローンＴ細胞株を得た。ついで、４つのすべてのペプチドに対する応答をインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩｓｐｏｔ分析により評価した。
【０１０２】
ペプチド１４２６は、その配列に含まれる個々のエピトープと同様にＴ細胞応答を誘発する。とりわけ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束エピトープ１３３４に対して向けられたＣＤ８陽性のＴ細胞が首尾よく得られた。
【０１０３】
表３：オリゴクローンＴ細胞株のペプチド誘発ＩＦＮ−γ分泌
これら株は、ペプチド１４２６かまたはペプチド１００６＋１４２５＋１３３４の混合物のいずれかによる３回のインビトロ初回免疫により２人のＨＬＡ型決定した健常な個体から得た。これら株におけるＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔにより評価した（「＋＋＋」非常に強い、「＋＋」強い、「＋」有意、「−」ＩＦＮ−ガンマ分泌なし）。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
実施例ＩＶ：強力なＨＣＶ特異的１型細胞性応答は５つの異なるＨＣＶ由来ペプチド、抗菌ペプチドＫＬＫおよび合成オリゴデオキシヌクレオチドｏ−ｄ（ＩＣ）１３の組み合わせた注射により誘発される
マウス：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ.１）
【０１０６】
ペプチド：ペプチドｐ８３、ｐ８４、ｐ８７、ｐ８９、ｐ１４２６をワクチン接種に用いた。
ｐ８３：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）
ｐ８４：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ）
ｐ８７：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ）
ｐ８９：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ）
ｐ１４２６：ＨＣＶ由来ペプチド、
（ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ）（ｐ１２７４は関係のないペプチドとして再刺激に用いた）
（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束）
【０１０７】
ペプチドはすべて標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成により合成し、ＨＰＬＣ精製し、純度について質量分光法により分析した。
投与量：ペプチド当たり２０μｇ／マウス
【０１０８】
ＫＬＫ：ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ−ＣＯＯＨをＭＰＳ（Multiple Peptide System、米国）により合成した。投与量：１０ナノモル／マウス。
【０１０９】
オリゴ−ｄ(ＩＣ)１３（＝ＯＤＮ１ａ）ＯＤＮ ５’ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣ３’をPurimex Nucleic Acids Technology、ゲッチンゲンにより合成した。
投与量：０.４ナノモル／マウス。
製剤化：１０ｍＭトリス／１３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ〜７
【０１１０】
実験の段取り（５匹のマウス／群）
１．ＨＣＶペプチド
２．ＨＣＶペプチド ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ(ＩＣ)１３
【０１１１】
第０日目、第１４日目および第２８日目にＨＨＤ.１マウスの両後肢の皮下に上記化合物を含む全量１００μｌ／マウス（５０μｌ／肢）を注射した。第３５日目（最後のワクチン接種の７日後）にＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓細胞の単一細胞懸濁液から磁気分離（ＭＡＣＳ、Miltenyi）により単離した。Ｔ細胞を培地とともにインキュベートするか（バックグラウンド対照）またはワクチン接種に用いた異なるペプチドかまたは関連のないペプチドのいずれかの存在下でＡＰＣとしてのナイーブＨＨＤ.１マウスからの放射線照射した脾臓細胞で再刺激した。一夜インキュベートした後、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて分析した。
【０１１２】
図１は、５つのＨＣＶ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ(ＩＣ)１３とともに注射したときに、ｐ８４、ｐ８７、ｐ８９、ｐ１４２６に対するＣＤ４＋Ｔ細胞による高量のＩＦＮ−γの産生が誘発されたことを示す。さらに、ｐ８７、ｐ８９に対するＣＤ８＋Ｔ細胞による強いＩＦＮ−γの産生が検出できた。
【０１１３】
実施例Ｖ：ペプチド混合物（ＨＣＶペプチドとポリ−Ｌ−アルギニン）の可溶化
ペプチド混合物は、ペプチド８３、８４、８７、８９、１４２６およびイミュナイザーとしてのｐＲを含み（表４を参照）、ここでペプチド８３および８４は水およびＤＭＳＯに可溶であり、ペプチド８７および８９は水にはわずかしか溶解しないがＤＭＳＯには容易に溶解し、ペプチド１４２６はＤＭＳＯにのみ可溶である。懸濁調合物の製造のためには、まずペプチド８３および８４を水性緩衝液に溶解し、ペプチド８７、８９、および１４２６をＤＭＳＯに溶解する必要がある。滅菌濾過後、これら溶液を混合して最終懸濁液とすることができる。
【０１１４】
水／アセトニトリル混合物並びにＤＭＳＯおよびＤＭＦは溶媒として作用せずに懸濁液を生成したが、これは濾過妨害のため滅菌濾過することができなかった。驚くべきことには、５０％酢酸／水混合物がすべての成分を溶解することがわかった。得られた上記ペプチドを含むペプチド溶液は、濾過妨害なしに容易に滅菌濾過することができた。
【０１１５】
表４：ペプチド混合物Ｉ
【表７】
【０１１６】
以下の実施例（実施例Ｖ.１〜Ｖ.１２、表５〜１６）は、様々な長さおよびアミノ酸組成の少なくとも２つのペプチドを含むペプチド混合物が本発明により可溶化するのに適していることを説明するものである。さらに、これら表は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスII分子に対するこれらペプチドの既知の親和性を示す。
【０１１７】
実施例Ｖ.１：
表５：ペプチド混合物II
【表８】
【０１１８】
実施例Ｖ.２：
表６：ペプチド混合物III
【表９】
【０１１９】
実施例Ｖ.３：
表７：ペプチド混合物ＩＶ
【表１０】
【０１２０】
実施例Ｖ.４：
表８：ペプチド混合物Ｖ
【表１１】
【０１２１】
実施例Ｖ.５：
表９：ペプチド混合物ＶＩ
【表１２】
【０１２２】
実施例Ｖ.６：
表１０：ペプチド混合物ＶII
【表１３】
【０１２３】
実施例Ｖ.７：
表１１：ペプチド混合物ＶIII
【表１４】
【０１２４】
実施例Ｖ.８：
表１２：ペプチド混合物ＩＸ
【表１５】
【０１２５】
実施例Ｖ.９：
表１３：ペプチド混合物Ｘ
【表１６】
【０１２６】
実施例Ｖ.１０：
表１４：ペプチド混合物ＸＩ
【表１７】
【０１２７】
実施例Ｖ.１１：
表１５：ペプチド混合物ＸII
【表１８】
【０１２８】
実施例Ｖ.１２：
表１６：ペプチド混合物ＸIII
【表１９】
【０１２９】
実施例ＶＩ：本発明によりさらなるＨＣＶワクチン変異体をデザインするうえでの原理的説明
表１７：好ましい「ホットスポットＩ」の組合せ
【表２０】
【０１３０】
ホットスポットＩの好ましい組合せの特徴付け：
ペプチドの数：１２
システインによるペプチドの相互作用の可能性：３つのペプチド（１８４６、８９、１５４７）中の４つのＣｙｓ；ペプチドのホモ二量体およびへテロ二量体および潜在的にオリゴマーの形成の可能性
扱ったＨＣＶ抗原の数：５（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）
扱ったクラスＩ対立遺伝子：少なくとも８
Ａ２（８回）、Ａ３（２回）、Ａ１１（２回）、Ａ２４（１回）
Ｂ７（２回）、Ｂ３５（１回）、Ｂ６０（１回）
Ｃｗ７（１回）
扱ったＨＬＡクラスII：プロミスカスペプチドにより複数
ＤＲ１（８回）、ＤＲ４（６回）、ＤＲ７（８回）、ＤＲ１１（７回）
【０１３１】
ホットスポットＩの好ましい組合せは、５つの異なるＨＣＶ抗原の保存領域（遺伝子型１、２、３で＞８０％）からの１２のペプチドからなっている。合計で少なくとも８つの重要なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を扱い（それぞれ、１〜８回）、ヨーロッパ人で８３〜９１％、米国カフカス人で８９〜９１％および日本人で８７〜８９％の人口適用を提供する（GjertsonおよびTerasaki編、HLA 1998, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics、レネキサ、カンザス、米国におけるＨＬＡ罹患率の研究からの数字に基づいて推定）。同様に、幾つかの重要なＨＬＡクラスII対立遺伝子を、主としていわゆるプロミスカスペプチド（１を超えるＨＬＡクラスII対立遺伝子に結合する）により扱っている。個々の特に優勢な対立遺伝子（ＤＲ１、４、７、１１）は、独立に６〜８回扱っている。重要なことに、ＤＲ１１は７回扱っている。この対立遺伝子の存在は、ＨＣＶ感染からの自然回復と関連付けられている（Thurszら、1999 Lancet: 354(9196): 2119-24）。
【０１３２】
このホットスポットの組合せに含まれるエピトープの数が多いことは、広範な人口適用、それゆえワクチンの適用性を確実にするのみならず、そのような組合せで処置した個体内での広範な免疫応答をも確実にする。このことは有効性の必要条件である、というのはＨＣＶ感染からの自然回復が典型的に１０またはそれ以上のエピトープに向けられた広範な免疫応答と関連付けられているからである（Day etら、2002 J Virol.: 76(24): 12584-95）。
【０１３３】
複数のエピトープに対するＴ細胞応答はまた、ＨＣＶ−エピトープ回避変異体（免疫応答によってターゲティングされたエピトープをもはや含まないＨＣＶウイルス）の生成のリスクをも低減させる、なぜなら同時にターゲティングするエピトープが多くなれば多くなるほどウイルスがそれらを同時に変えることは困難だからである。チンパンジーでの実験は、そのようなＨＣＶ回避変異体が慢性感染を維持するための重要なメカニズムであることを確立している（Weinerら、1995 Proc Natl Acad Sci U S A.: 92(7): 2755-9）。
【０１３４】
最後に、たとえばたった一つのＨＣＶ抗原の代わりに複数のＨＣＶ抗原（コア、Ｅ２、ＮＳ３、４、５）の殆どをターゲティングすることもまた有意な利点を提供する：異なる抗原が、たとえば抗原プロセシングの差異のためにＴ細胞によって異なって認識され、または個人の特定のＨＬＡハロタイプによって異なって書き留められる（dictated）。また、異なる抗原はＨＣＶ生活環の間に異なる重要な機能を有する。
【０１３５】
組合せホットスポットＩはまた、ホットスポットからの個々のエピトープをも含む（Ｉｐｅｐ８７ＥＸからのＩｐｅｐ８７およびＩｐｅｐ８９ＥＸからのＩｐｅｐ８９）。このことは、特定のエピトープへの所望の応答の慎重な着目（focusing）の利点を有する。たとえばＩｐｅｐ８９を用いることはＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬ応答が生成することを保証し、一方、８９ＥＸを用いることはＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬ応答を導くが、これは付随するＤＲ４またはＤＲ７拘束Ｔヘルパー応答により損なわれるかもしれない。
【０１３６】
ホットスポットの組合せを用いることは、組換えタンパク質の形態かまたはＤＮＡワクチンのいずれにせよ、完全長の抗原を用いる場合に比べて多くの利点を有する。上記で詳記したように、ある場合には個々のエピトープを用いることの方がホットスポットまたは全体の抗原を用いるよりも有利である。第二に、本明細書に開示するホットスポットは主としてＴｈ１／Ｔｃ１タイプの反応（すなわち、インターフェロンガンマ）を読み取りとして用いた機能的アッセイにより同定したものである。抗原がそのようなアゴニストエピトープを含むのみならずアンタゴニストリガンドをもコードすることはよく知られている。そのような全体の抗原には潜在的に存在するがホットスポットには存在しないアンタゴニストは、ワクチンの免疫原性および有効性を妨害する。つぎに、全体の抗原は殆ど確実に体液性の免疫応答を誘発するであろう。そのような抗体応答自体は細胞内にあるＨＣＶに対して殆ど影響を及ぼさないが、所望のＴ細胞応答をひどく損ないうる。ホットスポットは、その長さが限られているため、所望でない抗体応答を誘発する蓋然性が極めて低い。最後に、ＨＣＶ抗原の相対的に小さな部分のみが、異なる遺伝子型間で保存されている。それゆえ、ワクチンに使用した全体の抗原は、殆どの患者にとって関連のない非保存領域またはエピトープに対する応答を誘発する。対照的に、本明細書に開示するホットスポットは、主要なＨＣＶ遺伝子型である１、２および３で＞８０％保存された領域に由来するものである。
【０１３７】
表１８：「ホットスポットII」の好ましい組合せ
【表２１】
【０１３８】
「ホットスポットII」の好ましい組合せの特徴付け：
ペプチドの数：７
システインによるペプチドの相互作用の可能性：１つのＣｙｓ（１８４６）；１８４６のホモ二量体の形成の可能性
扱ったＨＣＶ抗原の数：５（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）
扱ったクラスＩ対立遺伝子：少なくとも７
Ａ２（５回）、Ａ３（２回）、Ａ１１（２回）、Ａ２４（１回）
Ｂ７（２回）、Ｂ３５（１回）
Ｃｗ７（１回）
扱ったＨＬＡクラスII：プロミスカスペプチドにより複数
ＤＲ１（６回）、ＤＲ４（５回）、ＤＲ７（５回）、ＤＲ１１（５回）
【０１３９】
ホットスポットIIの好ましい組合せは、５つの異なるＨＣＶ抗原の保存領域（遺伝子型１、２、３で＞８０％）からの７つのペプチドからなっている。合計で少なくとも７つの重要なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を扱い（１〜５回）、ヨーロッパ人で８１〜９０％、米国カフカス人で８９〜９１％および日本人で８５〜８８％の人口適用を提供する（GjertsonおよびTerasaki編、HLA 1998, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics、レネキサ、カンザス、米国におけるＨＬＡ罹患率の研究からの数字に基づいて推定）。同様に、幾つかの重要なＨＬＡクラスII対立遺伝子を、主としていわゆるプロミスカスペプチド（１を超えるＨＬＡクラスII対立遺伝子に結合する）により扱っている。個々の特に優勢な対立遺伝子（ＤＲ１、４、７、１１）は、独立に５〜６回扱っている。重要なことに、ＤＲ１１は５回扱っている。この対立遺伝子の存在は、ＨＣＶ感染からの自然回復と関連付けられている（Thurszら、1999 Lancet: 354(9196): 2119-24）。
【０１４０】
組合せＩとは対照的に組合せIIは明らかに少ない数のペプチドを有するが（１２に対して７）、このことはそのような製品の製造可能性、製剤化および競合生産において潜在的な利点を有する。重要なことに、システイン側鎖を有するペプチドは１つしか残っていない（１８４６）。それゆえ、この組合せでは１８４６のホモ二量体のみ生成する可能性があるが、へテロ二量体もオリゴマーも生成できない。
【０１４１】
同時に組合せIIは組合せＩと同じ５つのＨＣＶ抗原および同様の数のＨＬＡクラスＩおよびIIの両対立遺伝子を扱っている。それゆえ、上記段落で検討した事項は組合せIIにも当てはまる。
【０１４２】
製剤開発の観点からは、組合せIIは組合せＩに比べて幾つかの利点を有する（１２の成分の代わりに７の成分のみ）。最も重要なことに、ただ１つのペプチド（１８４６）のみが遊離のシステイン側鎖を含んでいる。それゆえ、１８４６のホモ二量体のみが形成され、へテロ二量体もオリゴマーも形成されることはない。
【０１４３】
実施例ＶII：ＨＣＶワクチン−１０２用量最適化試験のＴ細胞免疫原性の結果
臨床試験の間に多くのペプチド／ポリアルギニン混合物をワクチンとして健常な志願者に投与した。各群はＨＬＡ−Ａ２に陽性の１２人の被験者から構成されていた。被験者は１ヶ月の間隔で４回のワクチン接種を受けた（ビジット３〜６）。免疫分析のための採血をビジット１〜６、最後のワクチン接種の１ヶ月後（ビジット７）および最後のワクチン接種の３ヶ月後（ビジット８）に行った。臨床試験をモニターするため、IntercellはＧＬＰ／ＧＣＰに準拠した免疫応答の終点を決定するための備え付きの（set-up）最新式Ｔ細胞アッセイ：インターフェロン−ガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳアッセイを有している。これらアッセイは、治療用ＨＣＶワクチンにより誘発されるエピトープ特異的なＴ細胞応答の信頼性ある測定を可能にする。ワクチン誘発Ｔ細胞免疫応答は、有効性の代理パラメーターとして作用する（Keilholzら、J Immunother. 2002 Mar-Apr;25(2): 97-138）。
【０１４４】
一次終点としてＴ細胞免疫原性をＴ細胞増殖アッセイにより決定した：
増殖アッセイは、ヒト血液のような生物学的試料中のペプチド特異的なＴ細胞の検出を可能にする。このアッセイの基礎は、Ｔ細胞がそのＴ細胞レセプターによって特異的に認識されたペプチドで刺激するとサイトカインの分泌およびその後の増殖により反応するということである。細胞の増殖は様々な手段により測定することができる；最も感度の高いアプローチとして、細胞分裂の前に合成されたＤＮＡに放射性標識したチミジンを導入することが挙げられる。この反応は９６ウエルプレートで行うことができる。各ウエルには一定数の細胞が含まれており、これを抗原／ペプチドの存在下で数日培養する。最後の１６〜２０時間にトリチウムで標識したチミジン（３Ｈ−チミジン）を加える。ついで、細胞をフィルタープレートに回収する：遊離の放射能を含む培地を洗浄して除き、一方、ＤＮＡはフィルターに固着する。導入された放射能をベータ−シンチレーションカウンターにより定量できる。通常の出力はcounts-per-minute（ｃｐｍ）で与えられる。
【０１４５】
二次終点としてＴ細胞免疫原性をインターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔにより決定した：
ＥＬＩｓｐｏｔは、ヒト血液などの生物学的試料中のペプチド特異的な機能的な（すなわち、サイトカイン分泌）Ｔ細胞の定量を可能とする。このアッセイの基礎は、Ｔ細胞がそのＴ細胞レセプターによって特異的に認識されたペプチドで刺激するとＩＦＮ−ガンマなどのサイトカインの分泌により反応するということである。この反応は９６ウエルプレートで行うことができる。このプレートのフィルター−ウエルはＩＦＮ−ガンマに特異的なＭａｂでコーティングされている。その後、ＩＦＮ−ガンマを分泌する各細胞はＩＦＮ−ガンマスポットを残し、これをその後の発色反応で可視化することができる。スポットは、自動プレート読み取り機を用いてカウントすることができる。得られた数は、試料中のペプチド特異的でＩＦＮ−ガンマ分泌性のＴ細胞の頻度の測定手段である。
【０１４６】
さらなる二次終点としてＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析を行った：
ＨＬＡ分子と抗原ペプチドとの複合体の可溶性の組換え形態であるＨＬＡクラスＩテトラマーは、Ｔ細胞認識に用いた抗原特異的なＴ細胞レセプターに結合する。蛍光テトラマーとともにフローサイトメトリーを用いることにより、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球を信頼性をもって数え上げ、特徴付けることができる。このアッセイは、Beckman Coulter Immunomicsにより製造されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１特別注文ｉＴａｇＴＭ−テトラマーをＨＣＶワクチンクラスＩエピトープと複合体を生成させて用いる。
【０１４７】
被験者は、ビジット４〜８のいずれにても有意のＴ細胞特異的な応答を示し、処置前には応答を有しないときはリスポンダーとして分類した。
【０１４８】
食塩水を与えた２５人の被験者の対照群の２５％に比べて、いずれのペプチドに対しても、ビジット４〜８のいずれにおいても、３つのＴ細胞アッセイのいずれにても９２％までの最大リスポンダー率が達成された。
【０１４９】
Ｉｐｅｐ８９、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６当たりのリスポンダー率：
ここで例示としてＴ細胞エピトープホットスポットペプチドＩｐｅｐ８９（クラスＩのＴ細胞エピトープ）、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６に対する応答を示す。これら応答は１ヶ月ごとの４回のワクチン接種のサイクルの後に得られた。グループＢについては、ワクチンはポリ−Ｌ−アルギニンのみを含んでいた。グループＣについては、ワクチンはＩｐｅｐ８９、Ｉｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６を含む５つのペプチドの混合物を含んでいた。グループＧについては、ワクチンはグループＣと同じ５つのペプチドの混合物に加えて完全合成Ｔ細胞アジュバントとしてのポリ−Ｌ−アルギニンを含んでいた。
【０１５０】
表１９は、対照グループＢではＥＬＩｓｐｏｔおよびＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析においてリスポンダーがなく、合計３のみの陽性のビジットで３のリスポンダーが認められたことを示している。後者は増殖アッセイで得られた偽陽性リスポンダーの率として解釈することができる。
【０１５１】
ペプチドのみを含みポリ−Ｌ−アルギニンを含まないグループＣでは、ＥＬＩｓｐｏｔでＩｐｅｐ１４２６に対して１のリスポンダー、増殖アッセイでＩｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６に対してそれぞれ５および４のリスポンダー、ＨＬＡ−テトラマー／ＦＡＣＳ分析でＩｐｅｐ８９に対して４のリスポンダーが認められた。最後に、グループＧ（グループＣと同じペプチドに加えてポリ−Ｌ−アルギニン）は３つのすべてのアッセイでリスポンダーを示した。重要なことに、機能的なＴ細胞の指標を与える一貫して（３つのすべてのペプチド）かつ持続した（陽性ビジットの合計数を参照）ＥＬＩｓｐｏｔ応答は合成Ｔ細胞アジュバントとしてのポリ−Ｌ−アルギニンに依存していた。
【０１５２】
表１９：グループＢ、ＣおよびＧにおけるペプチド当たりのリスポンダーおよび陽性ビジットの合計数
【表２２】
【０１５３】
個々の経過（ＥＬＩｓｐｏｔ）の例：グループＧからの被験者５：
表２０は、グループＧ（５つのペプチド＋ポリ−Ｌ−アルギニン）からの特定の被験者の連続した採血から得られたインターフェロン−ガンマＥＬＩｓｐｏｔの結果を示す。２回目のワクチン接種の１ヶ月のビジット５ですでに２つのクラスIIエピトープＩｐｅｐ８４およびＩｐｅｐ１４２６が応答を示している。３回目のワクチン接種後、すべての応答でピークが達成され、クラスＩエピトープのＩｐｅｐ８９も応答を示している。さらに、Ｉｐｅｐ１４２６は最後のワクチン接種の３ヶ月後のビジット８でさえも持続した応答を示している。
【０１５４】
表２０：グループＧからの被験者５のＩｐｅｐ８９、８４、１４２６についての経時的なＥＬＩｓｐｏｔ値
（１００万のＰＢＭＣ当たりのスポット、バックグラウンドは差し引いてある；有意でない値は０とした）
【表２３】
【０１５５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＫＬＫ／Ｏ−ｄ(ＩＣ)１３がＨＣＶ−ペプチド特異的な１型細胞性免疫応答を誘発することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのエピトープを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチンであって、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものであり、その際、ホットスポットエピトープが、
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ
よりなる群から選ばれたペプチドを含むエピトープとして定められることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３】
少なくとも５つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項４】
少なくとも６つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項５】
エピトープが以下の群から選ばれる、請求項１ないし４のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＧＰＲＬＧＶＲＡＴ、ＲＬＧＶＲＡＴＲＫ；
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ；
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ、ＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ；
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ；
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ、ＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＱＹＬＡＧＬＳＴＬ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩ；
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹ、ＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＴＩＮＹＴＩＦＫ、ＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩ、ＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩ、ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲ；
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＰＡＥＴＴＶＲＬ；
ＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱ、ＲＬＬＡＰＩＴＡＹ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬ；
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＩＬＡＧＹＧＡＧＶ、ＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬ；
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ、ＳＹＴＷＴＧＡＬＩ；
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ；
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＲＳＥＬＳＰＬＬＬ、ＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ；
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ；
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＱＲＫＴＫＲＮＴＮ、ＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＫ；
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ、ＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ；
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、ＴＴＩＬＧＩＧＴＶ、ＴＩＬＧＩＧＴＶＬ；
ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ、ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ、ＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡ、ＶＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ；
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＲＬＩＶＦＰＤＬ、ＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶ、ＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ；
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ；
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡ；
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ、ＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶ。
【請求項６】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【請求項７】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし６のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲおよび
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ。
【請求項８】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし７のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ。
【請求項９】
以下のエピトープを含む、請求項１ないし８のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【請求項１０】
エピトープ：ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１１】
エピトープ：ＤＬＭＧＹＩＰＡＶを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１２】
エピトープ：ＣＩＮＧＶＣＷＴＶを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１３】
エピトープ：ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１４】
エピトープ：ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１５】
エピトープ：ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１６】
配列：Ｒ１−ＸＺＸＺＮＸＺＸ−Ｒ２（式中、Ｎは３〜７の全数、好ましくは５、Ｘは正に荷電した天然および／または非天然アミノ酸残基、ＺはＬ、Ｖ、Ｉ、Ｆおよび／またはＷよりなる群から選ばれたアミノ酸残基、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＨ、２０までのアミノ酸残基またはペプチド反応性の基を有するペプチドまたはペプチドを有するかまたは有しないペプチドリンカーから選ばれる；Ｘ−Ｒ２はまた該ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであってよい）を含むペプチド（「ペプチドＡ」）をさらに含む、請求項１ないし１５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１７】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１はヒポキサンチンおよびウラシルから選ばれる、
ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシイノシン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）による構造を有する免疫促進オリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）（Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮ）をさらに含む、請求項１ないし１６のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１８】
Ａｌ(ＯＨ)３アジュバントをさらに含む、請求項１ないし１７のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１９】
ポリカチオン性ペプチドをさらに含む、請求項１ないし１８のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２０】
該ペプチドＡがＫＬＫＬ５ＫＬＫである、請求項１ないし１９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２１】
該Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮがオリゴｄ(ＩＣ)１３である、請求項１ないし２０のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２２】
ＣｐＧ−モチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１ないし２１のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２３】
３７℃で１５分以内に再構成しうる形態に凍結乾燥される、請求項１ないし２３のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２４】
２０μｇ〜１０ｍｇの各エピトープを含む、請求項１ないし２３のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２５】
凍結乾燥され、痕跡量の酢酸を含む、請求項１ないし２４のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２６】
以下のエピトープの少なくとも２つを含む、請求項１ないし２５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。
【請求項２７】
これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ少なくとも６つのエピトープを含む、請求項２５に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２８】
これらエピトープの少なくとも８つ、好ましくは１２のすべてを含む、請求項２５に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２９】
以下のエピトープの少なくとも２つを含む、請求項１ないし２５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。
【請求項３０】
これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ１２のすべてのエピトープを含む、請求項２９に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３１】
これらエピトープの少なくとも１つのＡ２エピトープ、少なくとも１つのＤＲ１エピトープ、少なくとも１つのＤＲ７エピトープまたは各エピトープの少なくとも１つを含む、請求項１ないし３０のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３２】
ＨＣＶ感染の予防および治療用医薬の製造のための請求項１ないし３０のいずれかに記載のワクチンの使用。
【請求項３３】
以下の工程を特徴とする請求項１ないし３１のいずれかに記載のワクチンの製造方法：
−請求項１ないし１５および２６ないし３１に記載の少なくとも２つのエピトープを化学的に合成し、
−これらエピトープを、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化し、
−該可溶化エピトープを混合し、ついで
−任意に該混合エピトープを凍結乾燥する。
【請求項１】
少なくとも２つのエピトープを含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチンであって、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものであり、その際、ホットスポットエピトープが、
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ
よりなる群から選ばれたペプチドを含むエピトープとして定められることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３】
少なくとも５つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項４】
少なくとも６つのエピトープを含み、これらエピトープのそれぞれが異なるホットスポットエピトープからのものである、請求項１に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項５】
エピトープが以下の群から選ばれる、請求項１ないし４のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＬＰＲＲＧＰＲＬ、ＧＰＲＬＧＶＲＡＴ、ＲＬＧＶＲＡＴＲＫ；
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬ、ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ；
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ、ＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬ；
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴ、ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶ；
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ、ＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＱＹＬＡＧＬＳＴＬ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩ；
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹ、ＴＶＮＹＴＩＦＫＩ、ＴＩＮＹＴＩＦＫ、ＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＨＹＰＣＴＶＮＹＴＩ、ＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩ、ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲ；
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＰＡＥＴＴＶＲＬ；
ＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱ、ＲＬＬＡＰＩＴＡＹ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬ、ＡＹＳＱＱＴＲＧＬ；
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＩＬＡＧＹＧＡＧＶ、ＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、ＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬ；
ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ、ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ、ＳＹＴＷＴＧＡＬＩ；
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ；
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＲＳＥＬＳＰＬＬＬ、ＥＬＳＰＬＬＬＳＴ、ＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬ；
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ；
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＱＲＫＴＫＲＮＴＮ、ＲＫＴＫＲＮＴＮＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＲ、ＭＳＴＮＰＫＰＱＫ；
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩ、ＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ、ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ、ＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮ；
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、ＴＴＩＬＧＩＧＴＶ、ＴＩＬＧＩＧＴＶＬ；
ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ、ＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ、ＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡ、ＶＶＬＣＥＣＹＤＡＧＡＡＷＹＥ；
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＲＬＩＶＦＰＤＬ、ＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶ、ＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ；
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ；
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡ；
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ、ＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶ。
【請求項６】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、
ＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰ（Ａ／Ｌ）ＶＧＡＰＬ、
ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【請求項７】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし６のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（Ｖ／Ｉ）Ｎ（Ｆ／Ｙ）ＴＩＦＫ（Ｖ／Ｉ）ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬ、
ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、
ＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＶ、
ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ、
ＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶ、
ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、
ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲおよび
ＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬ。
【請求項８】
以下のホットスポットエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、とりわけ少なくとも４つからの少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１ないし７のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴ、
ＦＤＳ（Ｓ／Ｖ）ＶＬＣＥＣＹＤＡＧ（Ａ／Ｃ）ＡＷＹＥ、
ＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹ、
ＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶ、
ＧＶＬＦＧＬＡＹＦＳＭＶＧＮＷ、
ＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡおよび
ＴＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱ。
【請求項９】
以下のエピトープを含む、請求項１ないし８のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、
ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、
ＣＩＮＧＶＣＷＴＶおよび
ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ。
【請求項１０】
エピトープ：ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１１】
エピトープ：ＤＬＭＧＹＩＰＡＶを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１２】
エピトープ：ＣＩＮＧＶＣＷＴＶを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１３】
エピトープ：ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１４】
エピトープ：ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１５】
エピトープ：ＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣを含む、請求項１ないし９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１６】
配列：Ｒ１−ＸＺＸＺＮＸＺＸ−Ｒ２（式中、Ｎは３〜７の全数、好ましくは５、Ｘは正に荷電した天然および／または非天然アミノ酸残基、ＺはＬ、Ｖ、Ｉ、Ｆおよび／またはＷよりなる群から選ばれたアミノ酸残基、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＨ、２０までのアミノ酸残基またはペプチド反応性の基を有するペプチドまたはペプチドを有するかまたは有しないペプチドリンカーから選ばれる；Ｘ−Ｒ２はまた該ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであってよい）を含むペプチド（「ペプチドＡ」）をさらに含む、請求項１ないし１５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１７】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１はヒポキサンチンおよびウラシルから選ばれる、
ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシイノシン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）による構造を有する免疫促進オリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）（Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮ）をさらに含む、請求項１ないし１６のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１８】
Ａｌ(ＯＨ)３アジュバントをさらに含む、請求項１ないし１７のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項１９】
ポリカチオン性ペプチドをさらに含む、請求項１ないし１８のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２０】
該ペプチドＡがＫＬＫＬ５ＫＬＫである、請求項１ないし１９のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２１】
該Ｉ−／Ｕ−ＯＤＮがオリゴｄ(ＩＣ)１３である、請求項１ないし２０のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２２】
ＣｐＧ−モチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項１ないし２１のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２３】
３７℃で１５分以内に再構成しうる形態に凍結乾燥される、請求項１ないし２３のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２４】
２０μｇ〜１０ｍｇの各エピトープを含む、請求項１ないし２３のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２５】
凍結乾燥され、痕跡量の酢酸を含む、請求項１ないし２４のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２６】
以下のエピトープの少なくとも２つを含む、請求項１ないし２５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＬＭＧＹＩＰＡＶ、ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。
【請求項２７】
これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ少なくとも６つのエピトープを含む、請求項２５に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２８】
これらエピトープの少なくとも８つ、好ましくは１２のすべてを含む、請求項２５に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項２９】
以下のエピトープの少なくとも２つを含む、請求項１ないし２５のいずれかに記載のＨＣＶワクチン：
ＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫ、ＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶ、ＡＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴＶＲＬＲ、ＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ、ＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ、ＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫおよびＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰ。
【請求項３０】
これらエピトープの少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、とりわけ１２のすべてのエピトープを含む、請求項２９に記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３１】
これらエピトープの少なくとも１つのＡ２エピトープ、少なくとも１つのＤＲ１エピトープ、少なくとも１つのＤＲ７エピトープまたは各エピトープの少なくとも１つを含む、請求項１ないし３０のいずれかに記載のＨＣＶワクチン。
【請求項３２】
ＨＣＶ感染の予防および治療用医薬の製造のための請求項１ないし３０のいずれかに記載のワクチンの使用。
【請求項３３】
以下の工程を特徴とする請求項１ないし３１のいずれかに記載のワクチンの製造方法：
−請求項１ないし１５および２６ないし３１に記載の少なくとも２つのエピトープを化学的に合成し、
−これらエピトープを、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびそのハロゲン化形態またはヒドロキシル化形態よりなる群から選ばれた少なくとも１の有機酸を含む水溶液により可溶化し、
−該可溶化エピトープを混合し、ついで
−任意に該混合エピトープを凍結乾燥する。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５１３５４２（Ｐ２００９−５１３５４２Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１９８３７（Ｐ２００６−５１９８３７）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７５４０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００４９１０
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５０２２７０７１８）インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＣＥＬＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７５４０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００４９１０
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５０２２７０７１８）インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＣＥＬＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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