ＨＬＡ結合ペプチドおよびそれらの用途
【課題】対立遺伝子特異的結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる糖タンパク質を特異的に結合し得、そしてこの対立遺伝子によって拘束されるＴ細胞におけるＴ細胞活性化を誘導し得る、免疫原性ペプチドおよび免疫原性ペプチド組成物を選択するための手段および方法を提供する。このペプチドは、所望の抗原に対して免疫応答を惹起するために有用である。本発明はまた、さらなるＭＨＣクラスＩ分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる糖タンパク質を特異的に結合し得、そしてこの対立遺伝子によって拘束されるＴ細胞におけるＴ細胞活性化を誘導し得る、免疫原性ペプチドおよび免疫原性ペプチド組成物を選択するための手段および方法を提供する。このペプチドは、所望の抗原に対して免疫応答を惹起するために有用である。本発明はまた、さらなるＭＨＣクラスＩ分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、ＵＳＳＮ０９／１７，７３５、ＵＳＳＮ０８／７５３，６２２、ＵＳＳＮ０８／５８９，１０８、ＵＳＳＮ０８／４５４，０３３、ＵＳＳＮ０８／３４９，１７７、ＵＳＳＮ０８／１５９，１８４、ＵＳＳＮ０８／０７３，２０５、ＵＳＳＮ０８／２０７，１４６、およびＵＳＳＮ０８／２０５，７１３に関連する。本出願はまた、ＵＳＳＮ０９／０１７，５２４、ＵＳＳＮ０８／８２１，７３９、ＵＳＳＮ０８／７５８，４０９、ＵＳＳＮ０８／５８９，１０７、ＵＳＳＮ０８／４５１，９１３、ならびにＵＳＳＮ０８／３４７，６１０、ＵＳＳＮ０８／１８６，２６６、ＵＳＳＮ０８／１５９，３９９、ＵＳＳＮ０８／１０３，３９６、ＵＳＳＮ０８／０２７，７４６、およびＵＳＳＮ０７／９２６，６６６に関連する。上記全ての出願は本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ウイルス疾患および癌のような多くの病理学的状態を予防、処置または診断するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、選択された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し得、そして免疫応答を誘導し得る新規なペプチドを提供する。
【０００３】
ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のいずれかとして分類される。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、免疫応答の開始および持続に関与する細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなど）上で主に発現される。クラスＩＩ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、そしてヘルパーＴリンパ球の増殖および提示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核分子上で発現され、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、これは、次いで、抗原保持細胞を破壊する。ＣＴＬは特に、腫瘍拒絶反応およびウイルス感染との闘いにおいて重要である。
【０００４】
ＣＴＬは、インタクトな外来抗原自体よりむしろＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドフラグメントの形態である抗原を認識する。この抗原は、通常、細胞によって内因的に合成されねばならず、このタンパク質抗原の一部は、細胞質中で小さいペプチドフラグメントに分解される。これらの小さいペプチドのいくつかは、プレゴルジ（ｐｒｅ−Ｇｏｌｇｉ）区画に移行し、そしてクラスＩ重鎖と相互作用して、適切な折り畳みおよびサブユニットβ２ミクログロブリンとの会合を容易にする。次いで、このペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現および特異的ＣＴＬによる潜在的認識のために細胞表面に移動する。
【０００５】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子である、ＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究は、ペプチドが結合する溝が、クラスＩ重鎖のα１およびα２ドメインの折り畳みによって作製されることを示す（非特許文献１）。しかし、この研究において、溝に結合するペプチドの正体は決定されなかった。
【０００６】
非特許文献２は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶出の方法を最初に記載した。続いて、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅおよび共同研究者（非特許文献３）は、クラスＩ分子に結合する天然でプロセシングされたペプチドを特徴付けするためのアプローチを開発した。他の研究者らは、Ｂ型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの従来の自動配列決定法（非特許文献４）およびＡ２．１型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの質量分析法（非特許文献５）によって、種々のＨＰＬＣ画分中のより大量のペプチドの直接的なアミノ酸配列決定を首尾よく達成した。ＭＨＣクラスＩの天然でプロセシングされたペプチドの特徴付けの概論は、ＲｏｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ（非特許文献６）によって示されている。
【０００７】
非特許文献７は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフを使用してＭＨＣ結合能力を予測し得ることを示した。非特許文献８は、ＭＨＣ結合が免疫原性に関連することを示した。何人かの著者（非特許文献９；非特許文献１０）は、クラスＩ結合モチーフが、動物モデルにおける潜在的な免疫原性ペプチドの同定に適用され得るという予備的証拠を提供した。所定のクラスＩアイソタイプの多くのヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、まだ記載されていない。これらの異なる対立遺伝子の合わせられた頻度が、大きな画分またはおそらく大半のヒト非近交系集団をカバーするに非常に十分に高くあるべきであることが所望される。
当該分野における発展にもかかわらず、先行技術はまだ、本研究に基づく有用なヒトペプチドベースのワクチンまたは治療剤を提供していない。本発明は、これらおよび他の利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６（１９８７）
【非特許文献２】Ｂｕｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０６５（１９８８）
【非特許文献３】Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）
【非特許文献４】Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：３２６（１９９１）
【非特許文献５】Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２）
【非特許文献６】ＲｏｅｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：４４７（１９９１）
【非特許文献７】Ｓｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３２９６（１９８９）
【非特許文献８】Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９（１９８９）
【非特許文献９】Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９６３−２９７０（１９９１）
【非特許文献１０】Ｐａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８５２−９５５（１９９１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する結合モチーフのような、対立遺伝子特異的結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。適切なＭＨＣ対立遺伝子に結合する、この免疫原性ペプチドは、好ましくは、９〜１０残基長であり、そして２位および９位のような特定の位置で保存された残基を含む。さらに、これらのペプチドは、９アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、６位および／または７位、および１０アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、４位、５位、７位、８位および／または９位のような他の位置で、本明細書中で定義されるようなネガティブな結合残基を含まない。本発明は、ＨＬＡ Ａ２．１に効率的に結合するペプチドの選択を可能にするモチーフ内の位置を定義する。
【００１０】
本発明のモチーフは、９アミノ酸のペプチドを含み、これらは、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ、ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基、ならびにＶ、Ｌ、Ｉ、Ａ、ＭおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有する。好ましい実施態様において、このペプチドは、Ｖ、Ａ，ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基；ならびにＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＡおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有する。ペプチドが１０残基有する場合、このペプチドは、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ，ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基；ならびにＶ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有し；ここで、この第１および第２の残基は、７残基離れている。
【００１１】
本発明はまた、さらなるＭＨＣクラスＩ分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。この免疫原性ペプチドは、代表的に約８〜約１１残基の間であり、そして適切なＭＨＣ対立遺伝子にコードされる結合タンパク質に関与する保存された残基を有する。多数の対立遺伝子特異的モチーフが同定されている。
【００１２】
例えば、ＨＬＡ−Ａ３．２に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、位置２でＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤの第１の保存された残基、およびＣ末端でＫ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＦまたはＡの第２の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６〜７残基離れている。
【００１３】
ＨＬＡ−Ａ１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端に対する位置２で、Ｔ、ＳまたはＭの第１の保存された残基、およびＣ末端でＹの第２の保存された残基を含む。あるいは、このペプチドは、Ｎ末端に対する３位で、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＳまたはＴの第１の保存された残基およびＣ末端でＹの保存された残基を有し得る。
【００１４】
ＨＬＡ−Ａ１１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、２位にＴ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦの第１の保存された残基、およびＣ末端でＫ、Ｒ、ＹまたはＨの第２の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６または７残基離れている。
【００１５】
ＨＬＡ−Ａ２４．１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、位置２でＹ、Ｆ、ＷまたはＭの第１の保存された残基、およびＦ、Ｉ、ＷまたはＬのＣ末端の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６〜７残基離れている。
【００１６】
多くの免疫原性標的タンパク質上のエピトープは、本発明のペプチドを使用して同定され得る。適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、カポージ肉種ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト型結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）およびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。従って、このペプチドは、インビボ治療剤およびエキソビボ治療剤の両方ならびに診断適用のための薬学的組成物に有用である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 組成物であって、ＨＬＡ対立遺伝子特異的結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含有し、該免疫原性ペプチドが、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される、組成物。
（項目２） 特異的ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現する患者において所定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、該方法が、該患者由来の細胞傷害性Ｔ細胞を、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３） 表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する、組成物。
（項目４） 患者において所定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、該方法が、該患者由来の細胞傷害性Ｔ細胞を、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（定義）
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と交換可能に用いられ
、代表的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基およびカルボニル基との間のペプ
チド結合によって互いに結合する、一連の残基（代表的に、Ｌ−アミノ酸）とい
う。本発明のオリゴペプチドは、約１５残基長未満であり、そして通常、約８〜
約１１の残基からなり、好ましくは、９または１０残基からなる。
【００１８】
「免疫原性ペプチド」は、このペプチドがＭＨＣ分子に結合し、そしてＣＴＬ
応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。本発
明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し得、そしてこの
免疫原性ペプチドが由来する抗原に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し得る。
【００１９】
免疫原性ペプチドは、本発明のアルゴリズムを使用して簡便に同定される。こ
のアルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にするスコアを生じる数学的
手順である。代表的に、「結合閾値」を有するアルゴリズムスコアを使用して、
特定の親和性で結合する高い確率を有し、そしてそれは免疫原性であろうペプチ
ドの選択を可能にする。このアルゴリズムは、ペプチドの特定の位置の特定のア
ミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果またはペプチド含有モチーフ中の特定の置換の
結合に対する効果に基づく。
【００２０】
「保存された」残基は、ペプチドの特定の位置で、ランダムな分布によって期
待されるよりも有意により高頻度で存在するアミノ酸である。代表的に、保存さ
れた残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る残基である
。少なくとも１〜３個またはそれより多い（好ましくは２個）、定義された長さ
内の保存された残基は、免疫原性ペプチドについてのモチーフを規定する。これ
らの残基は、代表的に、ペプチドが結合する溝と緊密に接触し、ここで、これら
の側鎖は、この溝自体の特定のポケットに埋まっている。代表的に、免疫原性ペ
プチドは、３つまでの保存された残基、より通常は、２つの保存された残基を含
む。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ネガティブな結合残基」は、特定の位置（例
えば、９マーの位置１、３、および／または７）に存在する場合、結合しないか
、結合の乏しいペプチドであり、次いで免疫原性にならない（すなわち、ＣＴＬ
応答を誘導しない）ペプチドを生じる。
【００２２】
用語「モチーフ」とは、定義された長さ（通常約８〜約１１アミノ酸）のペプ
チドにおける残基のパターンをいい、これは特定のＭＨＣ対立遺伝子によって認
識される。このペプチドモチーフは、通常、各ヒトＭＨＣ対立遺伝子で異なり、
そして高度に保存された残基およびネガティブな残基のパターンにおいて異なる
。
【００２３】
対立遺伝子についての結合モチーフは、正確さの程度の増加を伴い定義され得
る。１つの場合、全ての保存残基は、ペプチドの正確な位置に存在し、そして位
置１、３および／または７でネガティブな残基は存在しない。
【００２４】
句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブな形態に見
出されるようにそれに通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を
いう。従って、本発明のペプチドは、そのインサイチュの環境正常に会合する物
質（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ Ｉ分子）を含まない。タンパク質が均質
にまたは優位なバンドに単離されている場合でさえ、天然タンパク質の５〜１０
％の範囲で所望のタンパク質と共に精製された微量の混入物が存在する。本発明
の単離されたポリペプチドは、外来性の同時精製されたようなタンパク質を含ま
ない。
【００２５】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によって、オリゴペプ
チド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００２６】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、ヒトクラスＩ ＭＨＣ（時折、ＨＬＡと称される）対立遺伝子サブ
タイプについての対立遺伝子特異的ペプチドモチーフの決定に関する。次いで、
これらのモチーフは、潜在的な抗原または自己抗原標的のアミノ酸配列が公知で
ある、任意の所望の抗原（特に、ヒトウイルス疾患、癌または自己免疫疾患に関
連する抗原）由来のＴ細胞エピトープを規定するために使用される。
【００２７】
多くの潜在的な標的タンパク質上のエピトープは、この様式で同定され得る。
適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原お
よび表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイ
ルス抗原、メラノーマ抗原（例えば、ＭＡＧＨ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト
型結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）および
Ｈｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００２８】
これらの抗原由来のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば、免
疫蛍光染色およびフロー微量蛍光測定、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッ
セイ、およびペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害による、例えば、精製クラス
Ｉ分子および放射性ヨウ化ペプチド、ならびに／または空のクラスＩ分子を発現
する細胞を使用するアッセイにおいて、適切なＭＨＣ分子へ結合するそれらの能
力を試験する。クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、感染または免疫さ
れた個体に由来するＣＴＬに対する標的として機能するそれらの能力について、
ならびに潜在的な治療剤として、ウイルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反
応し得るＣＴＬ集団を生じさせ得る、初期のインビトロまたはインビボのＣＴＬ
応答を誘導するそれらの能力について、さらに評価される。
【００２９】
ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子座
によりコードされる。ＨＬＡ−Ａ抗原およびＨＬＡ−Ｂ抗原は、適切な等密度で
細胞表面に発現されるが、ＨＬＡ−Ｃの発現は、有意により低い（おそらく、１
０倍程度低い）。これらの遺伝子座の各々は、多くの対立遺伝子を有する。本発
明のペプチド結合モチーフは、各々の対立遺伝子サブタイプに比較的特異的であ
る。
【００３０】
ペプチドベースのワクチンについて、本発明のペプチドは、好ましくは、ヒト
集団において広範な分布を有するＭＨＣ Ｉ分子によって認識されるモチーフを
含む。ＭＨＣ対立遺伝子は、異なる民族群および人種内で異なる頻度で存在する
ために、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は、その標的集団に依存する。表１は、異
なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座の種々の対立遺伝子産物の頻度を示す。例えば
、大半のコーカソイド集団は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ（特に、
ＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２およびＡ２４．１）に結合するペプチドによ
ってカバーされる。同様に、大半のアジア集団は、第５の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ
１１．２へのペプチド結合を加え、包含される。
【００３１】
【表１】
ＤｕＰｏｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ，第１巻、Ｈｉｓ
ｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９より編集された表
*Ｎ−ネグロイド；Ａ＝アジア人；Ｃ＝コーカソイド。括弧内の数は、本分析
に含まれる個体の数を表す。
【００３２】
ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸
残基の左（Ｎ末端）に、そしてカルボキシル基が各アミノ酸残基の右（Ｃ末端）
に表される、従来の慣行に従う。本発明の選択された特定の実施態様を表す式に
おいて、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的に示されないが、他
で特定されない限り、生理学的ｐＨ値で想定される形態にある。アミノ酸の構造
式において、各残基は、標準的な３文字または１文字表記によって一般的に表さ
れる。アミノ酸残基のＬ型は、大文字の１文字表記または３文字記号の最初の文
字の大文字表記によって表され、そしてＤ形態を有するこれらのアミノ酸に対す
るＤ形態は、小文字の１文字表記または小文字の３文字表記によって表される。
グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単位「Ｇｌｙ」またはＧと称する。
【００３３】
本発明のペプチドを同定するために使用される手順は、一般に、Ｆａｌｋら、
Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）（本明細書中で参考として援用され
る）に記載の方法に従う。要するに、この方法は、代表的に、免疫沈降またはア
フィニティークロマトグラフィーによる、適切な細胞または細胞株からのＭＨＣ
クラスＩ分子のラージスケールでの単離を含む。当業者に等しく周知の、所望の
ＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例としては、イオン交換クロマトグラフ
ィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体
（ｌｉｇａｎｄ）クロマトグラフィー、および上記の技術の全ての組み合わせを
含む。
【００３４】
代表的な場合、免疫沈降を使用して、所望の対立遺伝子を単離する。多くのプ
ロトコルが、使用する抗体の特異性に依存して使用され得る。例えば、対立遺伝
子特異的ｍＡｂ試薬は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ１、およびＨＬＡ−Ｃ分子のア
フィニティー精製のために使用され得る。ＨＬＡ−Ａ分子の単離のためのいくつ
かのｍＡｂ試薬が、利用可能である（表２を参照のこと）。従って、標的された
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の各々について、ＨＬＡ−Ａ分子の直接的な単離のために
使用され得る試薬が利用可能である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂで
調製されるアフィニティーカラムは、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精
製するために首尾よく使用される。
【００３５】
対立遺伝子特異的ｍＡｂに加え、広範な反応性の抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＡ
ｂ（例えば、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１）、および１つの抗ＨＬＡ−Ｂ，
Ｃ ｍＡｂである、Ｂ１．２３．２は、以前の適用において記載された代替的な
アフィニティー精製プロトコルにおいて使用され得る。
【００３６】
【表２】
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、代表的には、
酸処理を用いて溶出される。ペプチドはまた、種々の標準的な変性手段（例えば
、熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組合せ）によ
ってクラスＩ分子から解離され得る。
【００３７】
ペプチド画分は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨ
Ｃ分子からさらに分離され、そして配列決定される。ペプチドは、当業者に周知
の種々の他の標準的な手段（濾過、限外濾過、電気泳動、サイズクロマトグラフ
ィー、特異的抗体を用いる沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳
動などを含む）によって分離され得る。
【００３８】
単離されたペプチドの配列決定は、エドマン分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら
，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１，３９９（１９８３））のような標準
的な技術に従って実施され得る。配列決定のために適切な他の方法は、以前に記
載された通りの個々のペプチドの質量分析配列決定（本明細書中に参考として援
用される、Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２））を含
む。種々のクラスＩ分子由来の大量の不均質なペプチド（例えば、プールされた
ＨＰＬＣ画分）のアミノ酸配列決定は、代表的には、各クラスＩ対立遺伝子につ
いて特徴的な配列モチーフを示す。
【００３９】
種々のクラスＩ対立遺伝子について特異的なモチーフの定義は、アミノ酸配列
が公知である抗原性タンパク質由来の可能性のあるペプチドエピトープの同定を
可能にする。代表的には、可能性のあるペプチドエピトープの同定は、モチーフ
の存在について所望の抗原のアミノ酸配列を走査するためにコンピューターを用
いて最初に実施される。次いで、エピトープ配列が合成される。ＭＨＣクラス分
子への結合能が、種々の異なる方法で測定される。１つの手段は、上記の関連出
願に記載される通りのクラスＩ分子結合アッセイである。文献に記載される他の
代替手段としては、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
１：３８９３（１９９１））、インビトロアセンブリアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎ
ｄら，Ｃｅｌｌ ６２：２８５（１９９０））、および変異させた細胞（ｅｌｌ
ｓ）（例えば、ＲＭＡ−Ｓ）を用いる、ＦＡＣＳに基づくアッセイ（Ｍｅｌｉｅ
ｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３（１９９１））が挙げられ
る。
【００４０】
次いで、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイにおいてポジティブであると試験される
ペプチドが、これらのペプチドの、インビトロで特異的ＣＴＬ応答を誘導する能
力についてアッセイされる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされた抗
原提示細胞は、応答細胞集団においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセ
イされ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞
であり得る（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１８２（１９８７）
；Ｂｏｏｇ，Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２１９（１９８８））。
【００４１】
あるいは、クラスＩ分子を、内部でプロセシングされたペプチドとともに負荷
する能力を欠損する変異体哺乳動物細胞株（例えば、マウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ（
Ｋａｅｒｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：６７５（１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒ
ｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０（１９９１）
）、およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリッドＴ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２（１９９０））であって、適切なヒトクラス
Ｉ遺伝子でトランスフェクトされた変異体哺乳動物細胞株は、ペプチドをこれら
の細胞に添加する場合、このペプチドがインビトロで一次ＣＴＬ応答を誘導する
能力について試験するために便利に用いられる。用いられ得る他の真核生物細胞
株としては、蚊の幼生（ＡＴＣＣ細胞株ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１
５９１、６５８５、６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨト
ウムシ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、蛾（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）、およ
びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株（例えば、シュナイダー細胞株（Ｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７：３５３−３６５（
１９２７）を参照のこと））のような種々の昆虫細胞株が挙げられる。
【００４２】
末梢血リンパ球は、正常なドナーまたは患者の簡便な静脈穿刺または白血球搬
出の後に便利に単離され、そしてＣＴＬ前駆体の応答細胞供給源として用いられ
る。１つの実施態様では、適切な抗原提示細胞は、１０μＭ〜１００μＭのペプ
チドとともに無血清培地中で４時間、適切な培養条件下でインキュベートされる
。次いで、ペプチドを負荷した抗原提示細胞は、応答細胞集団とともにインビト
ロで７日間〜１０日間、最適化された培養条件下でインキュベートされる。ポジ
ティブなＣＴＬ活性化は、培養物を、特異的なペプチドをパルスした標的、なら
びにこのペプチド配列が誘導された内因的にプロセシングされた形態の関連のウ
イルスまたは腫瘍抗原を発現する標的細胞の両方の、放射性標識された標的細胞
を殺傷するＣＴＬの存在についてアッセイすることにより決定され得る。
【００４３】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ拘束は、適切または不適切なヒトＭＨＣクラスＩ
を発現する種々のペプチド標的細胞に対して試験することにより決定される。Ｍ
ＨＣ結合アッセイにおいてポジティブと試験され、そして特異的ＣＴＬ応答を生
じるペプチドは、本明細書中で免疫原性ペプチドと呼ばれる。
【００４４】
この免疫原性ペプチドは、合成によって、または組換えＤＮＡ技術によって、
または天然の供給源（例えば、ウイルス全体または腫瘍全体）から調製され得る
。これらのペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質お
よびそれらのフラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施態様には、こ
れらのペプチドは、合成によって、天然のフラグメントまたは粒子に対して結合
体化され得る。
【００４５】
これらのポリペプチドまたはペプチドは、種々の長さであり得、それらの中性
（非荷電）形態または塩である形態のいずれかであり得、そしてグリコシル化、
側鎖の酸化、もしくはリン酸化のような改変を含まないか、またはその改変が本
明細書中に記載される通りのポリペプチドの生物学的活性を破壊しないことを条
件として、これらの改変を含むかのいずれかであり得る。
【００４６】
望ましくは、これらのペプチドは、大きなペプチドの生物学的活性の実質的に
全てを依然として維持しながらも、できる限り小さい。可能な場合、本発明のペ
プチドを、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合している内因的にプロセシン
グされたウイルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている、
９または１０個のアミノ酸残基の長さに最適化することが所望され得る。
【００４７】
所望の活性を有するペプチドは、所望のＭＨＣ分子に結合し、そして適切なＴ
細胞を活性化する、未改変のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加させ
ながらも、または少なくとも維持しながらも、特定の所望の特性（例えば、改善
された薬理学的特徴）を提供するように必要に応じて改変され得る。例えば、こ
れらのペプチドは、種々の変更（例えば、保存的または非保存的のいずれかの置
換）に供され得、ここで、このような変更は、それらの用途における特定の利点
（例えば、改善されたＭＨＣ結合）を提供し得る。保存的置換によって、アミノ
酸残基を、生物学的および／または化学的に類似である別のアミノ酸残基で（例
えば、ある疎水性残基を別のもので、またはある極性残基を別のもので）置換す
ることが意味される。このような置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せが挙げられる。単一アミノ酸
置換の効果はまた、Ｄアミノ酸を用いてプローブされ得る。このような改変は、
本明細書中に参考として援用される、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６），ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ編（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），１−２８４頁（１９７９）
；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ
），第２版（１９８４）に記載される通りの周知のペプチド合成手順を用いて行
われ得る。
【００４８】
これらのペプチドはまた、この化合物のアミノ酸配列を、例えば、アミノ酸の
付加または欠失によって伸張または減少させることにより改変され得る。本発明
のペプチドまたはアナログは、特定の残基の順番または組成を変更することによ
り改変され得、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基（例えば、重要な接触
部位のアミノ酸残基または保存された残基）が、一般には生物学的活性に有害な
効果を与えずに変更されないかもしれないことは容易に理解される。重要でない
アミノ酸は、タンパク質中で天然に存在するアミノ酸（例えば、Ｌ−α−アミノ
酸）またはそれらのＤ異性体に制限される必要はなく、非天然のアミノ酸（例え
ば、β−γ−δ−アミノ酸）ならびにＬ−α−アミノ酸の多くの誘導体をも含み
得る。
【００４９】
代表的には、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドは、結合に対する静電
荷、疎水性などの効果を決定するために用いられる。例えば、一連の正に荷電し
たアミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負に荷電したアミノ酸（例え
ば、Ｇｌｕ）の置換は、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞レセプターに向かって異
なる感受性パターンを示すペプチドの長さに沿って行われる。さらに、小さな、
比較的中性の部分（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基）を用
いる複数の置換が用いられ得る。これらの置換物は、ホモオリゴマーまたはヘテ
ロオリゴマーであり得る。置換または付加される残基の数およびタイプは、必須
の接触点の間で必要とされる間隔、および求められる特定の機能的特性（例えば
、疎水性対親水性）に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターについての
、親ペプチドの親和性と比較して増加した結合親和性はまた、このような置換に
よって達成され得る。とにかく、このような置換は、例えば、結合を破壊し得る
立体妨害および電荷妨害を回避するように選択されたアミノ酸残基または他の分
子フラグメントを用いるべきである。
【００５０】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基の置換である。置換、欠失、挿入、また
はそれらの任意の組合せは、最終的なペプチドに到達するように組み合わされ得
る。置換改変体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる
残基がその場所に挿入されている改変体である。このような置換は、一般に、ペ
プチドの特徴を精巧に調整することが所望される場合には、以下の表３に従って
行われる。
【００５１】
【表３】
機能（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターについての親和性）におけ
る実質的変更は、表３における置換よりも保存性が低い置換を選択することによ
り、すなわち、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、シート
またはヘリックス構造など）、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、ま
たは（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの効果においてより有意に
異なる残基を選択することにより行われる。ペプチド特性に最大の変化を生じる
と一般に期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリル）が疎水性残基
（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニ
ル）を置換しているもの（または疎水性残基で置換されているもの）；（ｂ）陽
性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が陰
性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）を置換しているもの（または
陰性残基によって置換されているもの）；あるいは（ｃ）嵩高い側鎖を有する残
基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）を
置換しているもの（または側鎖を有さない残基によって置換されているもの）で
ある。
【００５２】
これらのペプチドはまた、免疫原性ペプチドにおける２以上の残基の同配体を
有し得る。本明細書中に定義される場合の同配体は、第１の配列の立体的コンホ
メーションが、第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列を置
換し得る２以上の残基の配列である。この用語は、当業者に周知のペプチド骨格
改変を特異的に含む。このような改変としては、アミド窒素、α炭素、アミドカ
ルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸張、欠失、または骨格の架橋が挙
げられる。一般的に、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，１９８３）を参照の
こと。
【００５３】
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチドの改変は、インビボ
でのペプチドの安定性を増加させる際に特に有用である。安定性は、多数の方法
においてアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼおよび種々の生物学的培地（
例えば、ヒト血漿および血清）は、安定性を試験するために用いられている。例
えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）を参照のこと。本発明のペプチド
の半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて便利に決定される。こ
のプロトコルは、一般に以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、熱
不活化していない）は、使用前に遠心分離によって脱脂（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅ
）される。次いで、この血清は、ＲＰＭＩ組織培養培地を用いて２５％になるよ
うに希釈され、そしてペプチドの安定性を試験するために用いられる。所定の時
間間隔で、少量の反応溶液を取り出し、そして６％トリクロロ酢酸水溶液または
エタノールのいずれかに添加する。濁った反応サンプルを１５分間冷却（４℃）
し、次いで回転させて沈澱した血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプ
チドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いる逆相ＨＰＬＣによ
って決定する。
【００５４】
規定されたＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子を有する多数の細胞が公知で
あり、そして容易に利用可能である。例えば、ヒトＥＢＶで形質転換されたＢ細
胞株は、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子の分取単離のために優れた供給
源であることが示されている。充分に特徴付けされた細胞株は、個人的供給源お
よび商業的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，第６版（１９８８）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０／１９９１
Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（ＮＩＧＭＳ）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｃａｍｄｅｎ，
ＮＪ；およびＡＳＨＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏ
ｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，７５ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂｏｓ
ｔｏｎ，ＭＡ ０２１１５）から入手可能である。表４は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子についての供給源として用いるために適切ないくつかのＢ細胞株を列挙する。
これらの細胞株の全ては、大きなバッチで増殖させ得、それゆえ、ＭＨＣ分子の
大規模産生に有用である。当業者は、これらが単に例示的な細胞株であること、
および他の多くの細胞供給源が用いられ得ることを認識する。ＨＬＡ−Ｂについ
てホモ接合性の類似のＥＢＶ Ｂ細胞株およびＨＬＡ−Ｃについてホモ接合性の
類似のＥＢＶ Ｂ細胞株は、それぞれ、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ
対立遺伝子についての供給源として役立ち得る。
【００５５】
【表４】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらのアナログは、改善さ
れた血清半減期以外の所望の特性を提供するように改変され得る。例えば、この
ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少な
くとも１つのエピトープを含む配列を連結することにより増強され得る。特に好
ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー結合体は、スペーサー分子によって連結さ
れる。このスペーサーは、代表的に、比較的小さな、中性の分子（例えば、生理
学的条件化で実質的に非荷電のアミノ酸またはアミノ酸模倣物）から構成される
。スペーサーは、代表的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸
もしくは中性極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。この必要に
応じて存在するスペーサーは同じ残基から構成される必要性はなく、従って、ヘ
テロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場
合、このスペーサーは、通常、少なくとも１または２の残基であり、より通常は
、３〜６の残基である。あるいは、このＣＴＬペプチドは、Ｔヘルパーペプチド
にスペーサーなしで連結され得る。
【００５６】
この免疫原性ペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接的またはスペーサーを介
してのいずれかで、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれ
かで連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのア
ミノ末端は、アシル化され得る。例示的なＴヘルパーペプチドとしては、破傷風
トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアサーカム
スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）３８２〜３９８および３７
８〜３８９が挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施態様では、本発明の薬学的組成物中に、ＣＴＬのプライミング
を補助する少なくとも１つの成分を含むことが所望され得る。脂質は、インビボ
でウイルス抗原に対するＣＴＬのプライミングを補助し得る薬剤であると同定さ
れている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基残基のαアミノ基およびε
アミノ基に結合され得、次いで、例えば、１以上の連結残基（例えば、Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して免疫原性ペプチドへ
と連結され得る。次いで、この脂質化されたペプチドは、リポソーム中に取り込
まれるか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中に
乳化されて、ミセル形態で直接注射され得る。好ましい実施態様では、特に有効
な免疫原は、Ｌｙｓのαアミノ基およびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含
み、このＬｙｓは、結合（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して免疫原性ペプチド
のアミノ末端に結合している。
【００５８】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシルテイニルセリル（ｇｌｙｃｅ
ｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ）−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペ
プチドに共有結合された場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために
用いられ得る。本明細書中に参考として援用される、Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：５６１−５６４（１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドは、
例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは個体に投与されて
、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライミングし得る。さらに、中和抗
体の誘導はまた、適切なエピトープを提示するペプチドへと結合体化されたＰ３
ＣＳＳでプライミングされ得るので、この２つの組成物が合わされて、感染に対
する体液性および細胞媒介性の両方の応答をより効率的に惹起し得る。
【００５９】
さらに、さらなるアミノ酸が、ペプチドを１つのものを別のものへと連結する
ことの容易さ、キャリア支持体もしくはより大きなペプチドへと結合すること、
ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的な特性を改変すること
などを提供するために、ペプチドの末端に付加され得る。チロシン、システイン
、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸などのようなアミノ酸が、ペプ
チドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入され得る。いくつかの場
合、Ｃ末端での改変は、そのペプチドの結合の特徴を変更し得る。さらに、これ
らのペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ2アセチル化（例えば、ア
ルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化）、末端カルボキ
シルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミン）などによって改変されてい
ることによって天然の配列とは異なり得る。いくつかの例では、これらの改変は
、支持体または他の分子へと連結するための部位を提供し得る。
【００６０】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。それらが相対
的に短いサイズであるので、これらのペプチドは、従来の技術に従って溶液中で
または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販されており、そ
して公知のプロトコルに従って用いられ得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹ
ｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第
２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４）を参照のこと。
【００６１】
あるいは、組換えＤＮＡ技術が用いられ得、ここで、目的の免疫原性ペプチド
をコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞
中に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養さ
れる。これらの手順は一般に、本明細書中で参考として援用される、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般的に記載
される通りに当該分野で公知である。従って、本発明の１以上のペプチド配列を
含む融合タンパク質は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いられ得る
。
【００６２】
本明細書中で意図される長さのペプチドについてのコード配列は、化学的技術
（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１
８５（１９８１）のホスホトリエステル法）によって合成され得るので、改変は
、適切な塩基でネイティブなペプチド配列をコードする塩基を置換することによ
って簡便に行われ得る。次いで、このコード配列には、適切なリンカーが提供さ
れ得、そして当該分野で市販される発現ベクター中に連結され得、そしてこれら
のベクターを用いて適切な宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を産生し得
る。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在利用可能である。こ
の融合タンパク質の発現のために、このコード配列には、所望の細胞宿主におけ
る発現のための発現ベクターを提供するための、作動可能に連結された開始コド
ンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、ならびに通
常は複製系が提供される。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列が、所
望のコード配列の挿入のために便利な制限部位を含むプラスミド中に提供される
。得られる発現ベクターは、適切な細菌宿主中に形質転換される。もちろん、適
切なベクターおよび制御配列を用いる、酵母または哺乳動物細胞宿主もまた用い
られ得る。
【００６３】
本発明のペプチドならびにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、哺
乳動物（特にヒト）へ投与して、ウイルス感染および癌を処置および／または予
防するために有用である。本発明の免疫原性ペプチドを用いて処置または予防さ
れ得る疾患の例としては、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ感染、ＡＩＤ
Ｓ、腎臓癌、頚部癌、リンパ腫、ＣＭＶ、マラリア、および尖圭コンジローム（
ｓｏｎｄｌｙｌｏｍａ ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書中に記載されるような、免疫学的に有効な量の１以上のペプチドを含
有するワクチンは、本発明のさらなる実施態様である。適切に免疫原性のエピト
ープが一旦同定されたら、これらは、本明細書中で「ワクチン」組成物と呼ばれ
る種々の手段によって選別および送達され得る。このようなワクチン組成物とし
ては、例えば、以下が挙げられ得る：リポペプチド（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら
，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラク
チド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェア中に封入されたペプチド
組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２
８７−２９４（１９９１）；Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−
３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１（１
９９５）を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含まれるペプチ
ド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８
７５（１９９０）；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３
５−２４３（１９９８）を参照のこと）、複数抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例え
ば、Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４
０９−５４１３（１９８８）；Ｔａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１９６：１７−３２（１９９６）を参照のこと）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅ
ｒｋｕｓら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ編，３７９頁（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，
Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５（１９８６）；Ｈｕら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：
５３７（１９８６）；Ｋｉｅｎｙら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４：７９０（１９８６）；Ｔｏｐら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１
４８（１９７１）；Ｃｈａｎｄａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５（１９
９０））、ウイルス起源または合成起源の粒子（Ｋｏｆｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５（１９９６）；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｓ
ｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６（１９９３）；Ｆａｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．７：６４９（１９９５））、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎら、Ａｎｎｕ
．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９（１９８６）；Ｇｕｐｔａら，Ｖａｃｃ
ｉｎｅ １１：２９３（１９９３））、リポソーム（Ｒｅｄｄｙら，Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４８：１５８５（１９９２）；Ｒｏｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄ
ａｙ １７：１３１（１９９６））、または裸のもしくは粒子に吸収されたｃＤ
ＮＡ（Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）；Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ ｉ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７（１９９３）；Ｓｈｉｖｅｒ
ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａ
ｕｆｍａｎｎ編，４２３頁（１９９６）；ＣｅａｓｅおよびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３（１９９４）、ならびにＥ
ｌｄｒｉｄｇｅら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６（１９９３））。レセ
プター媒介標的化としても公知の、毒素標的化送達技術（例えば、Ａｖａｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓ
ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の毒素標的化送達技術）もまた用いられ得る。
【００６５】
さらに、本発明によるワクチンは、１以上の本願ペプチドの組成物を含む。ペ
プチドは、それ自体のキャリアに対して個々に連結され得る；あるいは、ペプチ
ドは、活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして存在し得る
。このようなポリマーは、増加した免疫学的反応という利点を有し、そして種々
のペプチドエピトープを用いてポリマーを作製する場合、免疫応答のために標的
化される、病原体生物の１以上のタンパク質または腫瘍関連ペプチド由来の種々
の抗原性決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を
有する。
【００６６】
本発明のワクチンと共に用いられ得る有用なキャリアが当該分野で周知であり
、そしてこれらのキャリアとしては、例えば、チログロブリン、アルブミン（例
えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリ
Ｌ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコア
タンパク質などが挙げられる。ワクチンは、水または生理食塩水（好ましくは、
リン酸緩衝化生理食塩水）のような生理学的に寛容可能な（すなわち、受容可能
な）希釈剤を含み得る。このワクチンはまた、代表的にはアジュバントを含む。
不完全フロイトアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、また
はミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の物質の例である。さら
に、本明細書中に開示されるように、ＣＴＬ応答は、脂質（例えば、トリパルミ
トイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙ
ｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ−ｓｅｒｉｎｅ：Ｐ3
ＣＳＳ）に対して本発明のペプチドを結合体化させることによってプライム（ｐ
ｒｉｍｅ）され得る。
【００６７】
本明細書中に非常に詳細に開示されるように、本発明によるペプチド組成物で
の、注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、髄腔内、または他の適
切な経路を介する免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望される抗原に特異的な大
量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答する。その結果として、この
宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性
感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性となるか、またはこの抗原が腫瘍に
関連する場合、少なくともいくらかの治療的利益を誘導する。
【００６８】
いくつかの例では、本発明のクラスＩペプチドワクチンと、目的の標的抗原へ
の（特にウイルスエンベロープ抗原への）中和抗体応答を誘導または促進するワ
クチンとを合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施態様
は、本発明によるクラスＩおよびクラスＩＩのエピトープを含有する。このよう
な組成物の別の実施態様は、本発明によるクラスＩおよび／またはクラスＩＩの
エピトープを、ＰＡＤＲＥTM（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
分子（米国特許第５，７３６，１４２号に記載される）とともに含有する。さら
に、これらの任意の実施態様は、核酸媒介様式として投与され得る。
【００６９】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチドは、ガンをすでに罹患して
いるか、または目的のウイルスに感染している個体に投与される。感染の潜伏期
または急性期にある個体は、適切に、免疫原性ペプチドを別々に用いて、または
他の処置と組み合わせて処置され得る。治療適用において、組成物は、ウイルス
または腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発するため、ならびに症状および
／または合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で、
患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」として
規定される。この用途のために有効な量は、例えば、ペプチド組成、投与の様式
、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、な
らびに処方医の判断に依存するが、一般的には、最初の免疫（これは、治療的投
与または予防的投与のためである）については、７０ｋｇの患者では約１．０μ
ｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの範囲であり、患者の血液中の特異的ＣＴＬ
活性を測定することにより、患者の応答および状態に依存して、数週間から数ヶ
月にわたる追加免疫レジメに従う、約１．０μｇ〜約１０，０００μｇのペプチ
ドの追加投薬量が続く。本発明のペプチドおよび組成物が、一般的に、重篤な疾
患状態（すなわち、生命を脅かす状況または生命を脅かす可能性のある状況）で
使用され得ることを心に留めておかなければならない。このような場合において
、外来性物質の最小化およびペプチドの比較的無毒性の性質を考慮して、実質的
に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そしてこのこと
は処置医によって望ましいと感じられ得る。
【００７０】
治療用途のために、投与は、ウイルス感染の最初の徴候のとき、または腫瘍の
検出もしくは外科的除去のとき、または急性感染の場合は診断のすぐ後に開始す
べきである。これには、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、およびその
後の期間、追加用量が続く。慢性の感染において、負荷用量、続く追加用量が必
要とされ得る。
【００７１】
本発明の組成物での感染個体の処置は、急性感染個体において感染の消散を早
め得る。慢性の感染を発症しやすい（または、その素因を有する）個体について
、この組成物は、急性から慢性への感染の進行を妨げるための方法において特に
有用である。この発症しやすい個体が、感染の前または感染の間に、例えば、本
明細書中で記載されるように同定される場合、この組成物は、これらの個体に対
して標的化され得、より大きな集団への投与の必要性を最小にし得る。
【００７２】
ペプチド組成物はまた、慢性の感染の処置のため、および免疫系を刺激してキ
ャリアにおけるウイルス感染細胞を排除するために使用され得る。細胞傷害性Ｔ
細応答を効果的に刺激するために充分な量の免疫強化ペプチドを処方物および投
与態様において提供することが重要である。従って、慢性の感染の処置について
、代表的な用量は、１用量あたり７０ｋｇの患者について、約１．０μｇ〜約５
０，０００μｇ、好ましくは、約５μｇから１０，０００μｇの範囲である。免
疫用量、その後の例えば、１週間から４週間の確立された間隔をおいての追加免
疫用量が、おそらく、個体を効果的に免疫するために延長された期間にわたって
必要とされ得る。慢性の感染の場合、投与は、少なくとも臨床的な症状または研
究室試験が、ウイルス感染が排除されたかまたは実質的に減少したことを示すま
で、およびその後の期間継続されるべきである。
【００７３】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、または局部
的投与が意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈
内、皮下、皮内、または筋肉内に）投与される。従って、本発明は、受容可能な
キャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解されたかまたは懸濁された免疫
原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性
キャリア（例えば、水、緩衝化した水、０．９％の生理食塩水、０．３％のグリ
シン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来の、周知の
滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は
、投与の前に滅菌の溶液と合わされる凍結乾燥調製物としての使用のためにパッ
ケージングされ得るかまたは凍結乾燥され得る。この組成物は、生理学的条件に
近似するために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整お
よび緩衝化剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレ
ート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
【００７４】
薬学的処方物中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は、非常に広く変化し得
る。すなわち、約０．１重量％未満、通常は約２重量％から、または少なくとも
約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上の程度の高さまでであり、そして
選択される特定の投与態様に従って、流体容量、粘度などによって主に選択され
る。
【００７５】
本発明のペプチドはまた、特定の細胞組織（例えば、リンパ組織）に対してペ
プチドを標的化するようにリポソームを介して投与され得る。リポソームはまた
、ペプチドの半減期を増大させる際に有用である。リポソームとしては、乳濁物
、発泡体、ミセル、不溶性の単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などが挙げ
られる。これらの調製物では、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部と
して、単独で、または例えば、リンパ系細胞の中でも一般的なレセプターに結合
する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせ
て、または他の治療用もしくは免疫原性組成物とともに取り込まれる。従って、
本発明の所望のペプチドで満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位に対し
て指向され得、ここで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性ペプ
チド組成物を送達する。本発明での使用のためのリポソームは、標準的なベシク
ル形成脂質から形成され、これは、一般的に、中性の、および陰性に荷電したリ
ン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一
般的には、例えば、リポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中のリポソー
ムの安定性の考慮によって導かれる。本明細書中で参考として援用される、例え
ば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６
７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号
、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されるよ
うな種々の方法が、リポソームの調製に利用可能である。
【００７６】
免疫細胞を標的化するために、リポソーム中に取りこまれるべきリガンドとし
ては、例えば、所望の免疫系の細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその
フラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含有するリポソーム懸濁物が、静脈内
、局部的、局所的などで、とりわけ投与様式、送達されるべきペプチド、および
処置されるべき疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【００７７】
固形の組成物について、従来の無毒性の固形キャリアが使用され得る。この固
形キャリアとしては、例えば、薬学的グレードの、マンニトール、ラクトース、
デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セル
ロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。経口投与につ
いて、薬学的に受容可能な無毒性の組成物が、任意の通常使用される賦形剤（例
えば、上記に列挙されるキャリア）、および一般的に１０〜９５％（さらに好ま
しくは、２５％〜７５％の濃度で）の有効成分（すなわち、本発明の１つ以上の
ペプチド）を取り込むことによって形成される。
【００７８】
エアロゾル投与について、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤およ
びプロペラントとともに、細かく分けられた形態で供給される。ペプチドの代表
的なパーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％であり、好ましくは、１重
量％〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん、無毒性でなければならず、
そして好ましくはプロペラントに可溶性でなければならない。このような薬剤の
代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分的なエステル
（例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、カプロン酸、
オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン
酸、オレスチン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）であ
る。混合されたエステル（例えば、混合されたまたは天然のグリセリド）が使用
され得る。界面活性剤は、この組成物の０．１重量％〜２０重量％を構成し得、
好ましくは、０．２５重量％〜５重量％を構成する。組成物の残りは、通常、プ
ロペラントである。所望される場合は、キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達の
ためにはレシチンを用いるように、含まれ得る。
【００７９】
本明細書中に記載されるようなペプチド組成物での、注射、エアロゾル、経口
、経皮、または他の経路を介する免疫によって、宿主の免疫系は、所望される抗
原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、そしてこ
の宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または慢性の感染
の発症に対して耐性となる。
【００８０】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、ウイルス感染もしくはガンを
罹患しやすいか、またはそうでなければウイルス感染もしくはガンの危険性を有
する患者に、抗原に対する免疫応答を誘発し、従って患者自体の免疫応答能力を
増強するために投与される。このような量は、「免疫原的に有効な用量」として
規定される。この用途において、正確な量はさらに、患者の健康状態および体重
、投与様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者あた
り約１．０μｇから約５０，０００μｇの範囲であり、より一般的には、７０ｋ
ｇの体重あたり約１０μｇから約１０，０００μｇの範囲である。
【００８１】
いくつかの場合、本発明のペプチドワクチンを、目的のウイルス（特に、ウイ
ルスエンベロープ抗原）に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと合わせるこ
とが所望され得る。
【００８２】
治療または免疫の目的のために、１以上の本発明のペプチドをコードする核酸
はまた、患者に投与され得る。多数の方法が、核酸を患者に送達するために従来
用いられている。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。こ
のアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−
１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，
５８９，４６６号に記載される。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，
２５３号に記載されるような、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使
用して投与され得る。ＤＮＡのみから構成される粒子が投与され得る。あるいは
、ＤＮＡは、金粒子のような粒子に接着され得る。
【００８３】
核酸はまた、カチオン性化合物（例えば、カチオン性脂質）に対して複合体化
されて送達され得る。脂質によって媒介される遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ
９６／１８３７２；ＷＯ ９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌ
ｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９
１（１９８８）；Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ ９１／０
６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載される。
【００８４】
本発明のペプチドはまた、弱毒化されたウイルス宿主（例えば、ワクシニアま
たは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチには、本発明のペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使
用を含む。急性または慢性に感染した宿主への導入、または未感染の宿主への導
入によって、この組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それ
によって宿主のＣＴＬ応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用なワクシ
ニアベクターおよび方法は、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特
許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌ
ｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、本明細書
中で参考として援用されるＳｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４
６０（１９９１））に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫に
有用な広範な種々の他のベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ベクターなど）は、本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【００８５】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の複数
のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞中での発現の
ための選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作
製するために、このエピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使
用表が、各アミノ酸のコドン選択を導くために使用される。これらのエピトープ
をコードするＤＮＡ配列は、直接的に付加されて、連続するポリペプチド配列を
作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメン
トが、ミニ遺伝子の設計に取り込まれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配
列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴリン
パ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体残留シグナル。さら
に、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、合成の（例えば、ポリアラニン）または
天然に存在する隣接配列をＣＴＬエピトープに隣接して含むことによって改善さ
れ得る。
【００８６】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリ
ゴヌクレオチドをアセンブリすることによって、ＤＮＡに転換される。重複して
いるオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知の技術を使用して適切
な条件下で合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオ
チドの末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結される。次いで、ＣＴＬエ
ピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクター
にクローニングされ得る。
【００８７】
当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞中での発現を確実にするために
ベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが必要とされる：ミニ遺伝
子の挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写
の終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃ
ｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多
数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモータ
ー）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について
は、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照の
こと。
【００８８】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するため
に所望され得る。いくつかの場合、イントロンが、効率的な遺伝子発現のために
必要とされ、そして１つ以上の合成のまたは天然に存在するイントロンが、ミニ
遺伝子の転写領域に取りこまれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列を含むこともまた、ミ
ニ遺伝子の発現を増大させるために考慮され得る。免疫刺激配列（ＩＳＳまたは
ＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすことが、近年提唱さ
れている。これらの配列は、免疫原性を増強することが見出される場合、ミニ遺
伝子のコード配列の外側に、ベクター中に含まれ得る。
【００８９】
いくつかの実施態様において、ミニ遺伝子にコードされるエピトープ、および
免疫原性を増強するかまたは減少させるために含まれる第２のタンパク質の産生
を可能にする二シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用さ
れ得る。同時発現される場合に免疫応答を有益に増強し得るタンパク質またはポ
リペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、サイトカイン誘導性分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または同時刺激性分子
が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに連結
され得、そしてＣＴＬエピトープとは別に発現され得る。このことは、ＣＴＬエ
ピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向を可能にする。必要と
される場合、このことは、ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効
率的な進入を促進し得、それによって、ＣＴＬ誘導を改良する。ＣＴＬ誘導とは
対照的に、免疫抑制性分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答
を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【００９０】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポ
リリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ
株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ
遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる全ての他のエレ
メントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確な
プラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンク（ｂａｎｋ）および作業細
胞バンクとして保存され得る。
【００９１】
治療的な量のプラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発酵、その後の精製
によって産生される。作業細胞バンクに由来するアリコートは、発酵培地（例え
ば、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）を接種するために使用され、そして周知の
技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクターにおいて飽和するまで増殖
される。プラスミドＤＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎより提供される固相アニオン交換
樹脂のような、標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要とされる場
合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の技術を使用して、開環状
および直鎖状の形態から単離され得る。
【００９２】
精製されたプラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製さ
れ得る。これらのうち最も単純なものは、無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中での凍結乾燥したＤＮＡの再構成である。種々の方法が記載されており、
そして新規の技術が利用可能となり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂
質とともに好都合に処方される。さらに、糖脂質、フソジェニック（ｆｕｓｏｇ
ｅｎｉｃ）リポソーム、防御的、相互作用的、非縮合（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓ
ｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）として総称的に呼ばれるペプチドおよび化合物がまた、安
定性、筋肉内分散、特異的な器官もしくは細胞型へのトラフィッキングのような
変量に影響を与えるために、精製されたプラスミドＤＮＡに対して複合体化され
得る。
【００９３】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープの発現
およびＭＨＣクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。プラス
ミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切であ
る、哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最
終的な処方物に依存する。エレクトロポレーションは、カチオン性脂質が直接的
なインビトロでのトランスフェクションを可能にするにもかかわらず、「裸の」
ＤＮＡについて使用され得る。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプ
ラスミドが、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用するトランスフェクトされ
た細胞の富化を可能にするために、同時トランスフェクトされ得る。次いで、こ
れらの細胞は、クロム−５１で標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株の標
的細胞として使用される。５１Ｃｒの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ
遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の産生を示す。
【００９４】
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能的試験のための第２
のアプローチである。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウ
スは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（
例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについてはＩＰ
）。免疫の２１日後、脾細胞を回収し、そして試験される各エピトープをコード
するペプチドの存在下で１週間再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ
）は、ペプチドを負荷したクロム−５１標識化標的細胞の細胞溶解について、標
準的な技術を使用してアッセイされる。ミニ遺伝子によってコードされるエピト
ープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作された標的細胞の溶解は、Ｃ
ＴＬのインビボ誘導のためのＤＮＡワクチン機能を実証する。
【００９５】
抗原性ペプチドは、ＣＴＬをエキソビボで誘発するために同様に用いられ得る
。得られるＣＴＬは、他の従来の形態の治療に応答しないか、またはペプチドワ
クチンアプローチの治療に応答しない、患者における慢性の感染（ウイルス性ま
たは細菌性）または腫瘍を処置するために用いられ得る。特定の病原体（感染性
因子または腫瘍抗原）に対するエキソビボでのＣＴＬ応答は、組織培養において
、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源およ
び適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることにより誘導される。
適切なインキュベーション時間（代表的には１〜４週間）（このとき、これらの
ＣＴＬｐが活性化され、そして成熟し、そして増殖してエフェクターＣＴＬにな
る）の後、これらの細胞は、患者に注入し戻され、ここでこれらはそれらの特異
的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊する。特異的細胞傷害性Ｔ細
胞の生成のためのインビトロでの条件を最適化するために、刺激細胞の培養物は
、適切な無血清培地中で維持される。
【００９６】
刺激細胞と、活性化されるべき細胞（例えば、前駆体ＣＤ8+細胞）とのインキ
ュベーションの前に、刺激細胞の表面上に発現されるべきヒトクラスＩ分子に負
荷されるのに充分な量の抗原性ペプチドが刺激細胞培養物に添加される。本発明
では、ペプチドの充分な量は、約２００、そして好ましくは２００以上のヒトク
ラスＩ ＭＨＣ分子が、各刺激細胞の表面上に発現されるべきペプチドととに負
荷されることを可能にする量である。好ましくは、刺激細胞は、２０μｇ／ｍｌ
を超えるペプチドとともにインキュベートされる。
【００９７】
次いで、休止ＣＤ８＋細胞または前駆ＣＤ８＋細胞は、適切な刺激細胞を有す
る培養において、ＣＤ８＋細胞を活性化するために充分な時間の間インキュベー
トされる。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は、抗原特異的溶液で活性化される。休止
ＣＤ８＋細胞または前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の、刺激細胞に対する比
は、個体毎に変動し得、そして個体のリンパ球の培養条件に対する順応性、なら
びに記載された処置様式が用いられる疾患状態または他の状態の性質および重篤
度のような変量にさらに依存し得る。しかし、好ましくは、リンパ球：刺激細胞
の比は、約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激培養物は、
治療的に有用なまたは効果的な数のＣＤ８＋細胞を刺激するために必要な期間の
間維持され得る。
【００９８】
インビトロでのＣＴＬの誘導は、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的ＭＨＣクラスＩ
分子に結合しているペプチドの特異的認識を必要とする。ＡＰＣあたりの特異的
ＭＨＣ／ペプチド複合体の数は、ＣＴＬの刺激のために、特に一次免疫応答のた
めに重大である。細胞あたり少量のペプチド／ＭＨＣ複合体が、細胞をＣＴＬに
よる溶解に感受性にするために充分であるか、または二次ＣＴＬ応答を刺激する
ために充分であるが、一次応答の間のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の好首尾の活性
化は、有意に多い数のＭＨＣ／ペプチド複合体を必要とする。細胞上での空の主
要組織適合遺伝子複合体分子のペプチド負荷は、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答
の誘導を可能にする。細胞上での空の主要組織適合遺伝子複合体分子のペプチド
負荷は、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を可能にする。
【００９９】
変異体細胞株は、全てのヒトＭＨＣ対立遺伝子に存在するわけではないので、
内因性ＭＨＣ結合ペプチドをＡＰＣの表面から除去する技術を用い、その後、得
られる空のＭＨＣ分子に目的の免疫原性ペプチドを負荷することが有利である。
患者の非形質転換（非腫瘍形成性）非感染細胞、および好ましくは自己細胞の、
ＡＰＣとしての使用は、エキスビボＣＴＬ治療の開発に向けてのＣＴＬ誘導プロ
トコルの設計のために所望される。本願は、内因性ＭＨＣ結合ペプチドをＡＰＣ
の表面から剥がし、その後、所望のペプチドをロードするための方法を開示する
。
【０１００】
安定なＭＨＣクラスＩ分子は、以下のエレメントから形成される三量体複合体
である：１）通常、８〜１０残基のペプチド、２）α１ドメインおよびα２ドメ
イン中にペプチド結合部位を保有する膜貫通重鎖多型性タンパク質鎖、ならびに
３）非共有結合的に結合した非多型軽鎖である、β２ミクロブロブリン。複合体
から、結合したペプチドを除去することおよび／またはβ２ミクログロブリンを
解離することは、ＭＨＣクラスＩ分子を非機能的および不安定にし、迅速な分解
を生じる。ＰＢＭＣから単離された全てのＭＨＣクラスＩ分子は、その分子に結
合している内因性ペプチドを有する。それゆえ、第１段階は、ＡＰＣ上のＭＨＣ
クラスＩ分子に結合している全ての内因性ペプチドを、外因性ペプチドがそれに
添加され得る前にそれらの分解を生じることなく除去することである。
【０１０１】
結合したペプチドのＭＨＣクラスＩ分子を遊離させるための２つの可能な方法
は、培養温度を３７℃から２６℃へと、一晩の間低下させてβ２ミクログロブリ
ンを不安定化する工程、および穏やかな酸処理を用いて細胞から内因性ペプチド
を剥がす工程を含む。この方法は、前に結合していたペプチドを細胞外環境へと
遊離させ、新たな外因性ペプチドが空のクラスＩ分子に結合することを可能にす
る。低温インキュベーション方法は、外因性ペプチドがＭＨＣ複合体に効率的に
結合することを可能にするが、２６℃での一晩の培養（これは、細胞の代謝速度
を遅くし得る）を必要とする。ＭＨＣ分子を活性には合成しない細胞（例えば、
休止ＰＢＭＣ）が、低温手順によっては多量の空の表面ＭＨＣ分子を生じないこ
ともまたあるようである。
【０１０２】
厳しい酸ストリッピングは、トリフルオロ酢酸（ｐＨ２）でのペプチドの抽出
、または免疫アフィニティー精製したクラスＩペプチド複合体の酸変性を含む。
これらの方法は、ＣＴＬ誘導が可能ではない。なぜなら、抗原提示のために重要
であるＡＰＣの生存度および最適な代謝状態を保ちながら、内因性ペプチドを除
去することが重要であるからである。ｐＨ３の穏やかな酸性溶液（例えば、グリ
シンまたはクエン酸−リン酸緩衝液）は、内因性ペプチドを同定するために、お
よび腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを同定するために用いられている。ＭＨＣクラス
Ｉ分子のみが不安定化され（そして結合したペプチドが放出される）、一方、他
の表面抗原（ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む）は、インタクトなままであるという
点で、この処理は特に有効である。最も重要なことには、穏やかな酸性溶液での
細胞の処理は、細胞の生存度にも代謝状態にも影響を与えない。穏やかな酸処理
は、迅速である。なぜなら、内因性ペプチドのストリッピングは、４℃にて２分
間で生じ、そしてＡＰＣは、適切なペプチドが負荷された後にその機能を果たす
準備ができているからである。この技術は、一次抗原特異的ＣＴＬを生じるため
のペプチド特異的ＡＰＣを作製するために本明細書中で利用される。得られるＡ
ＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬを誘導する際に効率的である。
【０１０３】
活性化ＣＤ８＋細胞は、種々の公知の方法のうちの１つを用いて刺激細胞から
効果的に分離され得る。例えば、刺激細胞に、刺激細胞に負荷されるペプチドに
、またはＣＤ８＋細胞（またはそれらのセグメント）に特異的なモノクローナル
抗体は、それらの適切な相補的リガンドを結合するために利用され得る。次いで
、抗体タグ化分子は、刺激細胞／エフェクター細胞混合物から、適切な手段（例
えば、周知の免疫沈降またはイムノアッセイ方法）によって抽出され得る。
【０１０４】
有効な、細胞傷害性量の活性化ＣＤ８＋細胞は、インビトロでの用途とインビ
ボでの用途との間で変動し得、そしてそれらのキラー細胞の最終的な標的である
細胞の量および型によって変動し得る。この量はまた、患者の状態に依存して変
動し得、そして開業医によって全ての適切な因子を考慮して決定されるべきであ
る。しかし、マウスにおいて用いられる約５×１０6〜５×１０7細胞と比較して
、好ましくは約１×１０6〜約１×１０12、より好ましくは約１×１０8〜約１×
１０11、そしてさらにより好ましくは約１×１０9〜約１×１０10個の活性化Ｃ
Ｄ８＋細胞が、成人ヒトのために利用される。
【０１０５】
好ましくは、上記のように、活性化ＣＤ８＋細胞は、処置されるべき個体への
ＣＤ８＋細胞の投与の前に、細胞培養物から収集される。しかし、他の現行の処
置様式および提唱される処置様式とは異なり、本発明の方法は、腫瘍形成性では
ない細胞培養系を用いることに留意することが重要である。それゆえ、刺激細胞
と活性化ＣＤ８＋細胞との完全な分離が達成されないならば、少数の刺激細胞の
投与に関連することが公知の固有の危険性は存在せず、一方、哺乳動物腫瘍促進
細胞の投与は、極めて危険であり得る。
【０１０６】
細胞成分を再度導入する方法は、当該分野で公知であり、そしてこの方法とし
ては、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅ
ｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号に例示される手順のような
手順が挙げられる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋細胞の投与は適切
である。
【０１０７】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するために用い
られ得る。このような抗体は、潜在的な診断剤または治療剤として有用であり得
る。
【０１０８】
これらのペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発
明のペプチドは、ペプチドもしくは関連ペプチドを用いる処置レジメに対する特
定の個体の感受性を決定するために用いられ得、従って、既存の処置プロトコル
を改変する際に、または罹患個体についての予後を決定する際に有用であり得る
。さらに、これらのペプチドはまた、どの個体が、慢性の感染を発症するかなり
の危険性にあるかを予測するために用いられ得る。
【０１０９】
本明細書中に引用した全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の各刊行
物または特許出願が、参考として援用されると具体的かつ個別に示されたかのよ
うに、本明細書中で参考として援用される。
【０１１０】
前述の発明は、理解の明確化の目的のための実例および例としていくぶん詳細
に記載したが、本発明の教示を考慮して、特定の変更および改変が、添付の特許
請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく本発明に行われ得ることが当
業者には容易に明らかである。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、そして限定のために提供される
わけではない。当業者は、変更または改変され得る種々の重要でないパラメータ
ーが、本質的に類似の結果を生じることを容易に理解する。
【０１１２】
（実施例１）
クラスＩ抗原の単離を、上記の関連出願に記載されるとおりに実施した。次い
で、天然でプロセシングされたペプチドを、上記の関連出願に記載されるとおり
に単離および配列決定した。対立遺伝子特異的モチーフおよびアルゴリズムを決
定し、そして定量的結合アッセイを実施した。
【０１１３】
ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子について上記で同定されたモチーフを用いて、多
数の抗原由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。表５
は、これらの検索の結果を提供する。
【０１１４】
【表５】
本発明のペプチドを同定するために、クラスＩ抗原単離、ならびに天然でプロ
セシングされたペプチドの単離および配列決定を、関連出願に記載されるとおり
に実施した。次いで、これらのペプチドを用いて、以下の各々の対立遺伝子につ
いての特異的結合モチーフを規定した：Ａ３．２、Ａ１、Ａ１１およびＡ２４．
１。これらのモチーフを、上記に記載する。以下の表６〜表９に記載されるこれ
らのモチーフは、関連出願において記載されるように、天然でプロセシングされ
たペプチドの配列決定データプールから規定される。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
【表９】
（実施例２）
種々のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子について上記で同定されたモチーフを用いて
、種々の病原体および腫瘍関連タンパク質由来のアミノ酸配列を、これらのモチ
ーフの存在について分析した。関連出願において記載したスクリーニングを実施
した。表１０は、これらの抗原の検索結果を提供する。
【０１１９】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、ＵＳＳＮ０９／１７，７３５、ＵＳＳＮ０８／７５３，６２２、ＵＳＳＮ０８／５８９，１０８、ＵＳＳＮ０８／４５４，０３３、ＵＳＳＮ０８／３４９，１７７、ＵＳＳＮ０８／１５９，１８４、ＵＳＳＮ０８／０７３，２０５、ＵＳＳＮ０８／２０７，１４６、およびＵＳＳＮ０８／２０５，７１３に関連する。本出願はまた、ＵＳＳＮ０９／０１７，５２４、ＵＳＳＮ０８／８２１，７３９、ＵＳＳＮ０８／７５８，４０９、ＵＳＳＮ０８／５８９，１０７、ＵＳＳＮ０８／４５１，９１３、ならびにＵＳＳＮ０８／３４７，６１０、ＵＳＳＮ０８／１８６，２６６、ＵＳＳＮ０８／１５９，３９９、ＵＳＳＮ０８／１０３，３９６、ＵＳＳＮ０８／０２７，７４６、およびＵＳＳＮ０７／９２６，６６６に関連する。上記全ての出願は本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ウイルス疾患および癌のような多くの病理学的状態を予防、処置または診断するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、選択された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し得、そして免疫応答を誘導し得る新規なペプチドを提供する。
【０００３】
ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のいずれかとして分類される。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、免疫応答の開始および持続に関与する細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなど）上で主に発現される。クラスＩＩ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、そしてヘルパーＴリンパ球の増殖および提示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核分子上で発現され、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、これは、次いで、抗原保持細胞を破壊する。ＣＴＬは特に、腫瘍拒絶反応およびウイルス感染との闘いにおいて重要である。
【０００４】
ＣＴＬは、インタクトな外来抗原自体よりむしろＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドフラグメントの形態である抗原を認識する。この抗原は、通常、細胞によって内因的に合成されねばならず、このタンパク質抗原の一部は、細胞質中で小さいペプチドフラグメントに分解される。これらの小さいペプチドのいくつかは、プレゴルジ（ｐｒｅ−Ｇｏｌｇｉ）区画に移行し、そしてクラスＩ重鎖と相互作用して、適切な折り畳みおよびサブユニットβ２ミクログロブリンとの会合を容易にする。次いで、このペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現および特異的ＣＴＬによる潜在的認識のために細胞表面に移動する。
【０００５】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子である、ＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究は、ペプチドが結合する溝が、クラスＩ重鎖のα１およびα２ドメインの折り畳みによって作製されることを示す（非特許文献１）。しかし、この研究において、溝に結合するペプチドの正体は決定されなかった。
【０００６】
非特許文献２は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶出の方法を最初に記載した。続いて、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅおよび共同研究者（非特許文献３）は、クラスＩ分子に結合する天然でプロセシングされたペプチドを特徴付けするためのアプローチを開発した。他の研究者らは、Ｂ型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの従来の自動配列決定法（非特許文献４）およびＡ２．１型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの質量分析法（非特許文献５）によって、種々のＨＰＬＣ画分中のより大量のペプチドの直接的なアミノ酸配列決定を首尾よく達成した。ＭＨＣクラスＩの天然でプロセシングされたペプチドの特徴付けの概論は、ＲｏｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ（非特許文献６）によって示されている。
【０００７】
非特許文献７は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフを使用してＭＨＣ結合能力を予測し得ることを示した。非特許文献８は、ＭＨＣ結合が免疫原性に関連することを示した。何人かの著者（非特許文献９；非特許文献１０）は、クラスＩ結合モチーフが、動物モデルにおける潜在的な免疫原性ペプチドの同定に適用され得るという予備的証拠を提供した。所定のクラスＩアイソタイプの多くのヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、まだ記載されていない。これらの異なる対立遺伝子の合わせられた頻度が、大きな画分またはおそらく大半のヒト非近交系集団をカバーするに非常に十分に高くあるべきであることが所望される。
当該分野における発展にもかかわらず、先行技術はまだ、本研究に基づく有用なヒトペプチドベースのワクチンまたは治療剤を提供していない。本発明は、これらおよび他の利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６（１９８７）
【非特許文献２】Ｂｕｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０６５（１９８８）
【非特許文献３】Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）
【非特許文献４】Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：３２６（１９９１）
【非特許文献５】Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２）
【非特許文献６】ＲｏｅｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：４４７（１９９１）
【非特許文献７】Ｓｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３２９６（１９８９）
【非特許文献８】Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９（１９８９）
【非特許文献９】Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９６３−２９７０（１９９１）
【非特許文献１０】Ｐａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８５２−９５５（１９９１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する結合モチーフのような、対立遺伝子特異的結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。適切なＭＨＣ対立遺伝子に結合する、この免疫原性ペプチドは、好ましくは、９〜１０残基長であり、そして２位および９位のような特定の位置で保存された残基を含む。さらに、これらのペプチドは、９アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、６位および／または７位、および１０アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、４位、５位、７位、８位および／または９位のような他の位置で、本明細書中で定義されるようなネガティブな結合残基を含まない。本発明は、ＨＬＡ Ａ２．１に効率的に結合するペプチドの選択を可能にするモチーフ内の位置を定義する。
【００１０】
本発明のモチーフは、９アミノ酸のペプチドを含み、これらは、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ、ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基、ならびにＶ、Ｌ、Ｉ、Ａ、ＭおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有する。好ましい実施態様において、このペプチドは、Ｖ、Ａ，ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基；ならびにＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＡおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有する。ペプチドが１０残基有する場合、このペプチドは、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ，ＴおよびＱからなる群より選択される、Ｎ末端から２番目の位置の第１の保存された残基；ならびにＶ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＴからなる群より選択される、Ｃ末端の位置で保存された第２の保存された残基を有し；ここで、この第１および第２の残基は、７残基離れている。
【００１１】
本発明はまた、さらなるＭＨＣクラスＩ分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。この免疫原性ペプチドは、代表的に約８〜約１１残基の間であり、そして適切なＭＨＣ対立遺伝子にコードされる結合タンパク質に関与する保存された残基を有する。多数の対立遺伝子特異的モチーフが同定されている。
【００１２】
例えば、ＨＬＡ−Ａ３．２に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、位置２でＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤの第１の保存された残基、およびＣ末端でＫ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＦまたはＡの第２の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６〜７残基離れている。
【００１３】
ＨＬＡ−Ａ１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端に対する位置２で、Ｔ、ＳまたはＭの第１の保存された残基、およびＣ末端でＹの第２の保存された残基を含む。あるいは、このペプチドは、Ｎ末端に対する３位で、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＳまたはＴの第１の保存された残基およびＣ末端でＹの保存された残基を有し得る。
【００１４】
ＨＬＡ−Ａ１１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、２位にＴ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦの第１の保存された残基、およびＣ末端でＫ、Ｒ、ＹまたはＨの第２の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６または７残基離れている。
【００１５】
ＨＬＡ−Ａ２４．１に対するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、位置２でＹ、Ｆ、ＷまたはＭの第１の保存された残基、およびＦ、Ｉ、ＷまたはＬのＣ末端の保存された残基を含む。第１および第２の保存された残基は、好ましくは、６〜７残基離れている。
【００１６】
多くの免疫原性標的タンパク質上のエピトープは、本発明のペプチドを使用して同定され得る。適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、カポージ肉種ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト型結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）およびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。従って、このペプチドは、インビボ治療剤およびエキソビボ治療剤の両方ならびに診断適用のための薬学的組成物に有用である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 組成物であって、ＨＬＡ対立遺伝子特異的結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含有し、該免疫原性ペプチドが、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される、組成物。
（項目２） 特異的ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現する患者において所定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、該方法が、該患者由来の細胞傷害性Ｔ細胞を、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３） 表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する、組成物。
（項目４） 患者において所定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、該方法が、該患者由来の細胞傷害性Ｔ細胞を、表５および表１０に列挙したペプチドからなる群より選択される免疫原性ペプチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（定義）
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と交換可能に用いられ
、代表的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基およびカルボニル基との間のペプ
チド結合によって互いに結合する、一連の残基（代表的に、Ｌ−アミノ酸）とい
う。本発明のオリゴペプチドは、約１５残基長未満であり、そして通常、約８〜
約１１の残基からなり、好ましくは、９または１０残基からなる。
【００１８】
「免疫原性ペプチド」は、このペプチドがＭＨＣ分子に結合し、そしてＣＴＬ
応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。本発
明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し得、そしてこの
免疫原性ペプチドが由来する抗原に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し得る。
【００１９】
免疫原性ペプチドは、本発明のアルゴリズムを使用して簡便に同定される。こ
のアルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にするスコアを生じる数学的
手順である。代表的に、「結合閾値」を有するアルゴリズムスコアを使用して、
特定の親和性で結合する高い確率を有し、そしてそれは免疫原性であろうペプチ
ドの選択を可能にする。このアルゴリズムは、ペプチドの特定の位置の特定のア
ミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果またはペプチド含有モチーフ中の特定の置換の
結合に対する効果に基づく。
【００２０】
「保存された」残基は、ペプチドの特定の位置で、ランダムな分布によって期
待されるよりも有意により高頻度で存在するアミノ酸である。代表的に、保存さ
れた残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る残基である
。少なくとも１〜３個またはそれより多い（好ましくは２個）、定義された長さ
内の保存された残基は、免疫原性ペプチドについてのモチーフを規定する。これ
らの残基は、代表的に、ペプチドが結合する溝と緊密に接触し、ここで、これら
の側鎖は、この溝自体の特定のポケットに埋まっている。代表的に、免疫原性ペ
プチドは、３つまでの保存された残基、より通常は、２つの保存された残基を含
む。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ネガティブな結合残基」は、特定の位置（例
えば、９マーの位置１、３、および／または７）に存在する場合、結合しないか
、結合の乏しいペプチドであり、次いで免疫原性にならない（すなわち、ＣＴＬ
応答を誘導しない）ペプチドを生じる。
【００２２】
用語「モチーフ」とは、定義された長さ（通常約８〜約１１アミノ酸）のペプ
チドにおける残基のパターンをいい、これは特定のＭＨＣ対立遺伝子によって認
識される。このペプチドモチーフは、通常、各ヒトＭＨＣ対立遺伝子で異なり、
そして高度に保存された残基およびネガティブな残基のパターンにおいて異なる
。
【００２３】
対立遺伝子についての結合モチーフは、正確さの程度の増加を伴い定義され得
る。１つの場合、全ての保存残基は、ペプチドの正確な位置に存在し、そして位
置１、３および／または７でネガティブな残基は存在しない。
【００２４】
句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブな形態に見
出されるようにそれに通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を
いう。従って、本発明のペプチドは、そのインサイチュの環境正常に会合する物
質（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ Ｉ分子）を含まない。タンパク質が均質
にまたは優位なバンドに単離されている場合でさえ、天然タンパク質の５〜１０
％の範囲で所望のタンパク質と共に精製された微量の混入物が存在する。本発明
の単離されたポリペプチドは、外来性の同時精製されたようなタンパク質を含ま
ない。
【００２５】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によって、オリゴペプ
チド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００２６】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、ヒトクラスＩ ＭＨＣ（時折、ＨＬＡと称される）対立遺伝子サブ
タイプについての対立遺伝子特異的ペプチドモチーフの決定に関する。次いで、
これらのモチーフは、潜在的な抗原または自己抗原標的のアミノ酸配列が公知で
ある、任意の所望の抗原（特に、ヒトウイルス疾患、癌または自己免疫疾患に関
連する抗原）由来のＴ細胞エピトープを規定するために使用される。
【００２７】
多くの潜在的な標的タンパク質上のエピトープは、この様式で同定され得る。
適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原お
よび表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイ
ルス抗原、メラノーマ抗原（例えば、ＭＡＧＨ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト
型結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）および
Ｈｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００２８】
これらの抗原由来のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば、免
疫蛍光染色およびフロー微量蛍光測定、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッ
セイ、およびペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害による、例えば、精製クラス
Ｉ分子および放射性ヨウ化ペプチド、ならびに／または空のクラスＩ分子を発現
する細胞を使用するアッセイにおいて、適切なＭＨＣ分子へ結合するそれらの能
力を試験する。クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、感染または免疫さ
れた個体に由来するＣＴＬに対する標的として機能するそれらの能力について、
ならびに潜在的な治療剤として、ウイルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反
応し得るＣＴＬ集団を生じさせ得る、初期のインビトロまたはインビボのＣＴＬ
応答を誘導するそれらの能力について、さらに評価される。
【００２９】
ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子座
によりコードされる。ＨＬＡ−Ａ抗原およびＨＬＡ−Ｂ抗原は、適切な等密度で
細胞表面に発現されるが、ＨＬＡ−Ｃの発現は、有意により低い（おそらく、１
０倍程度低い）。これらの遺伝子座の各々は、多くの対立遺伝子を有する。本発
明のペプチド結合モチーフは、各々の対立遺伝子サブタイプに比較的特異的であ
る。
【００３０】
ペプチドベースのワクチンについて、本発明のペプチドは、好ましくは、ヒト
集団において広範な分布を有するＭＨＣ Ｉ分子によって認識されるモチーフを
含む。ＭＨＣ対立遺伝子は、異なる民族群および人種内で異なる頻度で存在する
ために、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は、その標的集団に依存する。表１は、異
なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座の種々の対立遺伝子産物の頻度を示す。例えば
、大半のコーカソイド集団は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ（特に、
ＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２およびＡ２４．１）に結合するペプチドによ
ってカバーされる。同様に、大半のアジア集団は、第５の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ
１１．２へのペプチド結合を加え、包含される。
【００３１】
【表１】
ＤｕＰｏｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ，第１巻、Ｈｉｓ
ｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９より編集された表
*Ｎ−ネグロイド；Ａ＝アジア人；Ｃ＝コーカソイド。括弧内の数は、本分析
に含まれる個体の数を表す。
【００３２】
ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸
残基の左（Ｎ末端）に、そしてカルボキシル基が各アミノ酸残基の右（Ｃ末端）
に表される、従来の慣行に従う。本発明の選択された特定の実施態様を表す式に
おいて、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的に示されないが、他
で特定されない限り、生理学的ｐＨ値で想定される形態にある。アミノ酸の構造
式において、各残基は、標準的な３文字または１文字表記によって一般的に表さ
れる。アミノ酸残基のＬ型は、大文字の１文字表記または３文字記号の最初の文
字の大文字表記によって表され、そしてＤ形態を有するこれらのアミノ酸に対す
るＤ形態は、小文字の１文字表記または小文字の３文字表記によって表される。
グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単位「Ｇｌｙ」またはＧと称する。
【００３３】
本発明のペプチドを同定するために使用される手順は、一般に、Ｆａｌｋら、
Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）（本明細書中で参考として援用され
る）に記載の方法に従う。要するに、この方法は、代表的に、免疫沈降またはア
フィニティークロマトグラフィーによる、適切な細胞または細胞株からのＭＨＣ
クラスＩ分子のラージスケールでの単離を含む。当業者に等しく周知の、所望の
ＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例としては、イオン交換クロマトグラフ
ィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体
（ｌｉｇａｎｄ）クロマトグラフィー、および上記の技術の全ての組み合わせを
含む。
【００３４】
代表的な場合、免疫沈降を使用して、所望の対立遺伝子を単離する。多くのプ
ロトコルが、使用する抗体の特異性に依存して使用され得る。例えば、対立遺伝
子特異的ｍＡｂ試薬は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ１、およびＨＬＡ−Ｃ分子のア
フィニティー精製のために使用され得る。ＨＬＡ−Ａ分子の単離のためのいくつ
かのｍＡｂ試薬が、利用可能である（表２を参照のこと）。従って、標的された
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の各々について、ＨＬＡ−Ａ分子の直接的な単離のために
使用され得る試薬が利用可能である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂで
調製されるアフィニティーカラムは、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精
製するために首尾よく使用される。
【００３５】
対立遺伝子特異的ｍＡｂに加え、広範な反応性の抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＡ
ｂ（例えば、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１）、および１つの抗ＨＬＡ−Ｂ，
Ｃ ｍＡｂである、Ｂ１．２３．２は、以前の適用において記載された代替的な
アフィニティー精製プロトコルにおいて使用され得る。
【００３６】
【表２】
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、代表的には、
酸処理を用いて溶出される。ペプチドはまた、種々の標準的な変性手段（例えば
、熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組合せ）によ
ってクラスＩ分子から解離され得る。
【００３７】
ペプチド画分は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨ
Ｃ分子からさらに分離され、そして配列決定される。ペプチドは、当業者に周知
の種々の他の標準的な手段（濾過、限外濾過、電気泳動、サイズクロマトグラフ
ィー、特異的抗体を用いる沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳
動などを含む）によって分離され得る。
【００３８】
単離されたペプチドの配列決定は、エドマン分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら
，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１，３９９（１９８３））のような標準
的な技術に従って実施され得る。配列決定のために適切な他の方法は、以前に記
載された通りの個々のペプチドの質量分析配列決定（本明細書中に参考として援
用される、Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２））を含
む。種々のクラスＩ分子由来の大量の不均質なペプチド（例えば、プールされた
ＨＰＬＣ画分）のアミノ酸配列決定は、代表的には、各クラスＩ対立遺伝子につ
いて特徴的な配列モチーフを示す。
【００３９】
種々のクラスＩ対立遺伝子について特異的なモチーフの定義は、アミノ酸配列
が公知である抗原性タンパク質由来の可能性のあるペプチドエピトープの同定を
可能にする。代表的には、可能性のあるペプチドエピトープの同定は、モチーフ
の存在について所望の抗原のアミノ酸配列を走査するためにコンピューターを用
いて最初に実施される。次いで、エピトープ配列が合成される。ＭＨＣクラス分
子への結合能が、種々の異なる方法で測定される。１つの手段は、上記の関連出
願に記載される通りのクラスＩ分子結合アッセイである。文献に記載される他の
代替手段としては、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
１：３８９３（１９９１））、インビトロアセンブリアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎ
ｄら，Ｃｅｌｌ ６２：２８５（１９９０））、および変異させた細胞（ｅｌｌ
ｓ）（例えば、ＲＭＡ−Ｓ）を用いる、ＦＡＣＳに基づくアッセイ（Ｍｅｌｉｅ
ｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３（１９９１））が挙げられ
る。
【００４０】
次いで、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイにおいてポジティブであると試験される
ペプチドが、これらのペプチドの、インビトロで特異的ＣＴＬ応答を誘導する能
力についてアッセイされる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされた抗
原提示細胞は、応答細胞集団においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセ
イされ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞
であり得る（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１８２（１９８７）
；Ｂｏｏｇ，Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２１９（１９８８））。
【００４１】
あるいは、クラスＩ分子を、内部でプロセシングされたペプチドとともに負荷
する能力を欠損する変異体哺乳動物細胞株（例えば、マウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ（
Ｋａｅｒｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：６７５（１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒ
ｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０（１９９１）
）、およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリッドＴ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２（１９９０））であって、適切なヒトクラス
Ｉ遺伝子でトランスフェクトされた変異体哺乳動物細胞株は、ペプチドをこれら
の細胞に添加する場合、このペプチドがインビトロで一次ＣＴＬ応答を誘導する
能力について試験するために便利に用いられる。用いられ得る他の真核生物細胞
株としては、蚊の幼生（ＡＴＣＣ細胞株ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１
５９１、６５８５、６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨト
ウムシ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、蛾（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）、およ
びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株（例えば、シュナイダー細胞株（Ｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７：３５３−３６５（
１９２７）を参照のこと））のような種々の昆虫細胞株が挙げられる。
【００４２】
末梢血リンパ球は、正常なドナーまたは患者の簡便な静脈穿刺または白血球搬
出の後に便利に単離され、そしてＣＴＬ前駆体の応答細胞供給源として用いられ
る。１つの実施態様では、適切な抗原提示細胞は、１０μＭ〜１００μＭのペプ
チドとともに無血清培地中で４時間、適切な培養条件下でインキュベートされる
。次いで、ペプチドを負荷した抗原提示細胞は、応答細胞集団とともにインビト
ロで７日間〜１０日間、最適化された培養条件下でインキュベートされる。ポジ
ティブなＣＴＬ活性化は、培養物を、特異的なペプチドをパルスした標的、なら
びにこのペプチド配列が誘導された内因的にプロセシングされた形態の関連のウ
イルスまたは腫瘍抗原を発現する標的細胞の両方の、放射性標識された標的細胞
を殺傷するＣＴＬの存在についてアッセイすることにより決定され得る。
【００４３】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ拘束は、適切または不適切なヒトＭＨＣクラスＩ
を発現する種々のペプチド標的細胞に対して試験することにより決定される。Ｍ
ＨＣ結合アッセイにおいてポジティブと試験され、そして特異的ＣＴＬ応答を生
じるペプチドは、本明細書中で免疫原性ペプチドと呼ばれる。
【００４４】
この免疫原性ペプチドは、合成によって、または組換えＤＮＡ技術によって、
または天然の供給源（例えば、ウイルス全体または腫瘍全体）から調製され得る
。これらのペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質お
よびそれらのフラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施態様には、こ
れらのペプチドは、合成によって、天然のフラグメントまたは粒子に対して結合
体化され得る。
【００４５】
これらのポリペプチドまたはペプチドは、種々の長さであり得、それらの中性
（非荷電）形態または塩である形態のいずれかであり得、そしてグリコシル化、
側鎖の酸化、もしくはリン酸化のような改変を含まないか、またはその改変が本
明細書中に記載される通りのポリペプチドの生物学的活性を破壊しないことを条
件として、これらの改変を含むかのいずれかであり得る。
【００４６】
望ましくは、これらのペプチドは、大きなペプチドの生物学的活性の実質的に
全てを依然として維持しながらも、できる限り小さい。可能な場合、本発明のペ
プチドを、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合している内因的にプロセシン
グされたウイルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている、
９または１０個のアミノ酸残基の長さに最適化することが所望され得る。
【００４７】
所望の活性を有するペプチドは、所望のＭＨＣ分子に結合し、そして適切なＴ
細胞を活性化する、未改変のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加させ
ながらも、または少なくとも維持しながらも、特定の所望の特性（例えば、改善
された薬理学的特徴）を提供するように必要に応じて改変され得る。例えば、こ
れらのペプチドは、種々の変更（例えば、保存的または非保存的のいずれかの置
換）に供され得、ここで、このような変更は、それらの用途における特定の利点
（例えば、改善されたＭＨＣ結合）を提供し得る。保存的置換によって、アミノ
酸残基を、生物学的および／または化学的に類似である別のアミノ酸残基で（例
えば、ある疎水性残基を別のもので、またはある極性残基を別のもので）置換す
ることが意味される。このような置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せが挙げられる。単一アミノ酸
置換の効果はまた、Ｄアミノ酸を用いてプローブされ得る。このような改変は、
本明細書中に参考として援用される、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６），ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ編（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），１−２８４頁（１９７９）
；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ
），第２版（１９８４）に記載される通りの周知のペプチド合成手順を用いて行
われ得る。
【００４８】
これらのペプチドはまた、この化合物のアミノ酸配列を、例えば、アミノ酸の
付加または欠失によって伸張または減少させることにより改変され得る。本発明
のペプチドまたはアナログは、特定の残基の順番または組成を変更することによ
り改変され得、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基（例えば、重要な接触
部位のアミノ酸残基または保存された残基）が、一般には生物学的活性に有害な
効果を与えずに変更されないかもしれないことは容易に理解される。重要でない
アミノ酸は、タンパク質中で天然に存在するアミノ酸（例えば、Ｌ−α−アミノ
酸）またはそれらのＤ異性体に制限される必要はなく、非天然のアミノ酸（例え
ば、β−γ−δ−アミノ酸）ならびにＬ−α−アミノ酸の多くの誘導体をも含み
得る。
【００４９】
代表的には、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドは、結合に対する静電
荷、疎水性などの効果を決定するために用いられる。例えば、一連の正に荷電し
たアミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負に荷電したアミノ酸（例え
ば、Ｇｌｕ）の置換は、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞レセプターに向かって異
なる感受性パターンを示すペプチドの長さに沿って行われる。さらに、小さな、
比較的中性の部分（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基）を用
いる複数の置換が用いられ得る。これらの置換物は、ホモオリゴマーまたはヘテ
ロオリゴマーであり得る。置換または付加される残基の数およびタイプは、必須
の接触点の間で必要とされる間隔、および求められる特定の機能的特性（例えば
、疎水性対親水性）に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターについての
、親ペプチドの親和性と比較して増加した結合親和性はまた、このような置換に
よって達成され得る。とにかく、このような置換は、例えば、結合を破壊し得る
立体妨害および電荷妨害を回避するように選択されたアミノ酸残基または他の分
子フラグメントを用いるべきである。
【００５０】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基の置換である。置換、欠失、挿入、また
はそれらの任意の組合せは、最終的なペプチドに到達するように組み合わされ得
る。置換改変体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる
残基がその場所に挿入されている改変体である。このような置換は、一般に、ペ
プチドの特徴を精巧に調整することが所望される場合には、以下の表３に従って
行われる。
【００５１】
【表３】
機能（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターについての親和性）におけ
る実質的変更は、表３における置換よりも保存性が低い置換を選択することによ
り、すなわち、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、シート
またはヘリックス構造など）、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、ま
たは（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの効果においてより有意に
異なる残基を選択することにより行われる。ペプチド特性に最大の変化を生じる
と一般に期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリル）が疎水性残基
（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニ
ル）を置換しているもの（または疎水性残基で置換されているもの）；（ｂ）陽
性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が陰
性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）を置換しているもの（または
陰性残基によって置換されているもの）；あるいは（ｃ）嵩高い側鎖を有する残
基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）を
置換しているもの（または側鎖を有さない残基によって置換されているもの）で
ある。
【００５２】
これらのペプチドはまた、免疫原性ペプチドにおける２以上の残基の同配体を
有し得る。本明細書中に定義される場合の同配体は、第１の配列の立体的コンホ
メーションが、第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列を置
換し得る２以上の残基の配列である。この用語は、当業者に周知のペプチド骨格
改変を特異的に含む。このような改変としては、アミド窒素、α炭素、アミドカ
ルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸張、欠失、または骨格の架橋が挙
げられる。一般的に、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，１９８３）を参照の
こと。
【００５３】
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチドの改変は、インビボ
でのペプチドの安定性を増加させる際に特に有用である。安定性は、多数の方法
においてアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼおよび種々の生物学的培地（
例えば、ヒト血漿および血清）は、安定性を試験するために用いられている。例
えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）を参照のこと。本発明のペプチド
の半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて便利に決定される。こ
のプロトコルは、一般に以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、熱
不活化していない）は、使用前に遠心分離によって脱脂（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅ
）される。次いで、この血清は、ＲＰＭＩ組織培養培地を用いて２５％になるよ
うに希釈され、そしてペプチドの安定性を試験するために用いられる。所定の時
間間隔で、少量の反応溶液を取り出し、そして６％トリクロロ酢酸水溶液または
エタノールのいずれかに添加する。濁った反応サンプルを１５分間冷却（４℃）
し、次いで回転させて沈澱した血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプ
チドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いる逆相ＨＰＬＣによ
って決定する。
【００５４】
規定されたＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子を有する多数の細胞が公知で
あり、そして容易に利用可能である。例えば、ヒトＥＢＶで形質転換されたＢ細
胞株は、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子の分取単離のために優れた供給
源であることが示されている。充分に特徴付けされた細胞株は、個人的供給源お
よび商業的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，第６版（１９８８）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０／１９９１
Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（ＮＩＧＭＳ）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｃａｍｄｅｎ，
ＮＪ；およびＡＳＨＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏ
ｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，７５ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂｏｓ
ｔｏｎ，ＭＡ ０２１１５）から入手可能である。表４は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子についての供給源として用いるために適切ないくつかのＢ細胞株を列挙する。
これらの細胞株の全ては、大きなバッチで増殖させ得、それゆえ、ＭＨＣ分子の
大規模産生に有用である。当業者は、これらが単に例示的な細胞株であること、
および他の多くの細胞供給源が用いられ得ることを認識する。ＨＬＡ−Ｂについ
てホモ接合性の類似のＥＢＶ Ｂ細胞株およびＨＬＡ−Ｃについてホモ接合性の
類似のＥＢＶ Ｂ細胞株は、それぞれ、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ
対立遺伝子についての供給源として役立ち得る。
【００５５】
【表４】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらのアナログは、改善さ
れた血清半減期以外の所望の特性を提供するように改変され得る。例えば、この
ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少な
くとも１つのエピトープを含む配列を連結することにより増強され得る。特に好
ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー結合体は、スペーサー分子によって連結さ
れる。このスペーサーは、代表的に、比較的小さな、中性の分子（例えば、生理
学的条件化で実質的に非荷電のアミノ酸またはアミノ酸模倣物）から構成される
。スペーサーは、代表的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸
もしくは中性極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。この必要に
応じて存在するスペーサーは同じ残基から構成される必要性はなく、従って、ヘ
テロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場
合、このスペーサーは、通常、少なくとも１または２の残基であり、より通常は
、３〜６の残基である。あるいは、このＣＴＬペプチドは、Ｔヘルパーペプチド
にスペーサーなしで連結され得る。
【００５６】
この免疫原性ペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接的またはスペーサーを介
してのいずれかで、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれ
かで連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのア
ミノ末端は、アシル化され得る。例示的なＴヘルパーペプチドとしては、破傷風
トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアサーカム
スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）３８２〜３９８および３７
８〜３８９が挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施態様では、本発明の薬学的組成物中に、ＣＴＬのプライミング
を補助する少なくとも１つの成分を含むことが所望され得る。脂質は、インビボ
でウイルス抗原に対するＣＴＬのプライミングを補助し得る薬剤であると同定さ
れている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基残基のαアミノ基およびε
アミノ基に結合され得、次いで、例えば、１以上の連結残基（例えば、Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して免疫原性ペプチドへ
と連結され得る。次いで、この脂質化されたペプチドは、リポソーム中に取り込
まれるか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中に
乳化されて、ミセル形態で直接注射され得る。好ましい実施態様では、特に有効
な免疫原は、Ｌｙｓのαアミノ基およびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含
み、このＬｙｓは、結合（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して免疫原性ペプチド
のアミノ末端に結合している。
【００５８】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシルテイニルセリル（ｇｌｙｃｅ
ｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ）−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペ
プチドに共有結合された場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために
用いられ得る。本明細書中に参考として援用される、Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：５６１−５６４（１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドは、
例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは個体に投与されて
、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライミングし得る。さらに、中和抗
体の誘導はまた、適切なエピトープを提示するペプチドへと結合体化されたＰ３
ＣＳＳでプライミングされ得るので、この２つの組成物が合わされて、感染に対
する体液性および細胞媒介性の両方の応答をより効率的に惹起し得る。
【００５９】
さらに、さらなるアミノ酸が、ペプチドを１つのものを別のものへと連結する
ことの容易さ、キャリア支持体もしくはより大きなペプチドへと結合すること、
ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的な特性を改変すること
などを提供するために、ペプチドの末端に付加され得る。チロシン、システイン
、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸などのようなアミノ酸が、ペプ
チドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入され得る。いくつかの場
合、Ｃ末端での改変は、そのペプチドの結合の特徴を変更し得る。さらに、これ
らのペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ2アセチル化（例えば、ア
ルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化）、末端カルボキ
シルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミン）などによって改変されてい
ることによって天然の配列とは異なり得る。いくつかの例では、これらの改変は
、支持体または他の分子へと連結するための部位を提供し得る。
【００６０】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。それらが相対
的に短いサイズであるので、これらのペプチドは、従来の技術に従って溶液中で
または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販されており、そ
して公知のプロトコルに従って用いられ得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹ
ｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第
２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４）を参照のこと。
【００６１】
あるいは、組換えＤＮＡ技術が用いられ得、ここで、目的の免疫原性ペプチド
をコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞
中に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養さ
れる。これらの手順は一般に、本明細書中で参考として援用される、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般的に記載
される通りに当該分野で公知である。従って、本発明の１以上のペプチド配列を
含む融合タンパク質は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いられ得る
。
【００６２】
本明細書中で意図される長さのペプチドについてのコード配列は、化学的技術
（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１
８５（１９８１）のホスホトリエステル法）によって合成され得るので、改変は
、適切な塩基でネイティブなペプチド配列をコードする塩基を置換することによ
って簡便に行われ得る。次いで、このコード配列には、適切なリンカーが提供さ
れ得、そして当該分野で市販される発現ベクター中に連結され得、そしてこれら
のベクターを用いて適切な宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を産生し得
る。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在利用可能である。こ
の融合タンパク質の発現のために、このコード配列には、所望の細胞宿主におけ
る発現のための発現ベクターを提供するための、作動可能に連結された開始コド
ンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、ならびに通
常は複製系が提供される。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列が、所
望のコード配列の挿入のために便利な制限部位を含むプラスミド中に提供される
。得られる発現ベクターは、適切な細菌宿主中に形質転換される。もちろん、適
切なベクターおよび制御配列を用いる、酵母または哺乳動物細胞宿主もまた用い
られ得る。
【００６３】
本発明のペプチドならびにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、哺
乳動物（特にヒト）へ投与して、ウイルス感染および癌を処置および／または予
防するために有用である。本発明の免疫原性ペプチドを用いて処置または予防さ
れ得る疾患の例としては、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ感染、ＡＩＤ
Ｓ、腎臓癌、頚部癌、リンパ腫、ＣＭＶ、マラリア、および尖圭コンジローム（
ｓｏｎｄｌｙｌｏｍａ ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書中に記載されるような、免疫学的に有効な量の１以上のペプチドを含
有するワクチンは、本発明のさらなる実施態様である。適切に免疫原性のエピト
ープが一旦同定されたら、これらは、本明細書中で「ワクチン」組成物と呼ばれ
る種々の手段によって選別および送達され得る。このようなワクチン組成物とし
ては、例えば、以下が挙げられ得る：リポペプチド（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら
，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラク
チド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェア中に封入されたペプチド
組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２
８７−２９４（１９９１）；Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−
３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１（１
９９５）を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含まれるペプチ
ド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８
７５（１９９０）；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３
５−２４３（１９９８）を参照のこと）、複数抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例え
ば、Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４
０９−５４１３（１９８８）；Ｔａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１９６：１７−３２（１９９６）を参照のこと）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅ
ｒｋｕｓら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ編，３７９頁（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，
Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５（１９８６）；Ｈｕら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：
５３７（１９８６）；Ｋｉｅｎｙら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４：７９０（１９８６）；Ｔｏｐら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１
４８（１９７１）；Ｃｈａｎｄａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５（１９
９０））、ウイルス起源または合成起源の粒子（Ｋｏｆｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５（１９９６）；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｓ
ｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６（１９９３）；Ｆａｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．７：６４９（１９９５））、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎら、Ａｎｎｕ
．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９（１９８６）；Ｇｕｐｔａら，Ｖａｃｃ
ｉｎｅ １１：２９３（１９９３））、リポソーム（Ｒｅｄｄｙら，Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４８：１５８５（１９９２）；Ｒｏｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄ
ａｙ １７：１３１（１９９６））、または裸のもしくは粒子に吸収されたｃＤ
ＮＡ（Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）；Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ ｉ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７（１９９３）；Ｓｈｉｖｅｒ
ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａ
ｕｆｍａｎｎ編，４２３頁（１９９６）；ＣｅａｓｅおよびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３（１９９４）、ならびにＥ
ｌｄｒｉｄｇｅら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６（１９９３））。レセ
プター媒介標的化としても公知の、毒素標的化送達技術（例えば、Ａｖａｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓ
ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の毒素標的化送達技術）もまた用いられ得る。
【００６５】
さらに、本発明によるワクチンは、１以上の本願ペプチドの組成物を含む。ペ
プチドは、それ自体のキャリアに対して個々に連結され得る；あるいは、ペプチ
ドは、活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして存在し得る
。このようなポリマーは、増加した免疫学的反応という利点を有し、そして種々
のペプチドエピトープを用いてポリマーを作製する場合、免疫応答のために標的
化される、病原体生物の１以上のタンパク質または腫瘍関連ペプチド由来の種々
の抗原性決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を
有する。
【００６６】
本発明のワクチンと共に用いられ得る有用なキャリアが当該分野で周知であり
、そしてこれらのキャリアとしては、例えば、チログロブリン、アルブミン（例
えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリ
Ｌ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコア
タンパク質などが挙げられる。ワクチンは、水または生理食塩水（好ましくは、
リン酸緩衝化生理食塩水）のような生理学的に寛容可能な（すなわち、受容可能
な）希釈剤を含み得る。このワクチンはまた、代表的にはアジュバントを含む。
不完全フロイトアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、また
はミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の物質の例である。さら
に、本明細書中に開示されるように、ＣＴＬ応答は、脂質（例えば、トリパルミ
トイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙ
ｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ−ｓｅｒｉｎｅ：Ｐ3
ＣＳＳ）に対して本発明のペプチドを結合体化させることによってプライム（ｐ
ｒｉｍｅ）され得る。
【００６７】
本明細書中に非常に詳細に開示されるように、本発明によるペプチド組成物で
の、注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、髄腔内、または他の適
切な経路を介する免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望される抗原に特異的な大
量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答する。その結果として、この
宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性
感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性となるか、またはこの抗原が腫瘍に
関連する場合、少なくともいくらかの治療的利益を誘導する。
【００６８】
いくつかの例では、本発明のクラスＩペプチドワクチンと、目的の標的抗原へ
の（特にウイルスエンベロープ抗原への）中和抗体応答を誘導または促進するワ
クチンとを合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施態様
は、本発明によるクラスＩおよびクラスＩＩのエピトープを含有する。このよう
な組成物の別の実施態様は、本発明によるクラスＩおよび／またはクラスＩＩの
エピトープを、ＰＡＤＲＥTM（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
分子（米国特許第５，７３６，１４２号に記載される）とともに含有する。さら
に、これらの任意の実施態様は、核酸媒介様式として投与され得る。
【００６９】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチドは、ガンをすでに罹患して
いるか、または目的のウイルスに感染している個体に投与される。感染の潜伏期
または急性期にある個体は、適切に、免疫原性ペプチドを別々に用いて、または
他の処置と組み合わせて処置され得る。治療適用において、組成物は、ウイルス
または腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発するため、ならびに症状および
／または合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で、
患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」として
規定される。この用途のために有効な量は、例えば、ペプチド組成、投与の様式
、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、な
らびに処方医の判断に依存するが、一般的には、最初の免疫（これは、治療的投
与または予防的投与のためである）については、７０ｋｇの患者では約１．０μ
ｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの範囲であり、患者の血液中の特異的ＣＴＬ
活性を測定することにより、患者の応答および状態に依存して、数週間から数ヶ
月にわたる追加免疫レジメに従う、約１．０μｇ〜約１０，０００μｇのペプチ
ドの追加投薬量が続く。本発明のペプチドおよび組成物が、一般的に、重篤な疾
患状態（すなわち、生命を脅かす状況または生命を脅かす可能性のある状況）で
使用され得ることを心に留めておかなければならない。このような場合において
、外来性物質の最小化およびペプチドの比較的無毒性の性質を考慮して、実質的
に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そしてこのこと
は処置医によって望ましいと感じられ得る。
【００７０】
治療用途のために、投与は、ウイルス感染の最初の徴候のとき、または腫瘍の
検出もしくは外科的除去のとき、または急性感染の場合は診断のすぐ後に開始す
べきである。これには、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、およびその
後の期間、追加用量が続く。慢性の感染において、負荷用量、続く追加用量が必
要とされ得る。
【００７１】
本発明の組成物での感染個体の処置は、急性感染個体において感染の消散を早
め得る。慢性の感染を発症しやすい（または、その素因を有する）個体について
、この組成物は、急性から慢性への感染の進行を妨げるための方法において特に
有用である。この発症しやすい個体が、感染の前または感染の間に、例えば、本
明細書中で記載されるように同定される場合、この組成物は、これらの個体に対
して標的化され得、より大きな集団への投与の必要性を最小にし得る。
【００７２】
ペプチド組成物はまた、慢性の感染の処置のため、および免疫系を刺激してキ
ャリアにおけるウイルス感染細胞を排除するために使用され得る。細胞傷害性Ｔ
細応答を効果的に刺激するために充分な量の免疫強化ペプチドを処方物および投
与態様において提供することが重要である。従って、慢性の感染の処置について
、代表的な用量は、１用量あたり７０ｋｇの患者について、約１．０μｇ〜約５
０，０００μｇ、好ましくは、約５μｇから１０，０００μｇの範囲である。免
疫用量、その後の例えば、１週間から４週間の確立された間隔をおいての追加免
疫用量が、おそらく、個体を効果的に免疫するために延長された期間にわたって
必要とされ得る。慢性の感染の場合、投与は、少なくとも臨床的な症状または研
究室試験が、ウイルス感染が排除されたかまたは実質的に減少したことを示すま
で、およびその後の期間継続されるべきである。
【００７３】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、または局部
的投与が意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈
内、皮下、皮内、または筋肉内に）投与される。従って、本発明は、受容可能な
キャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解されたかまたは懸濁された免疫
原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性
キャリア（例えば、水、緩衝化した水、０．９％の生理食塩水、０．３％のグリ
シン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来の、周知の
滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は
、投与の前に滅菌の溶液と合わされる凍結乾燥調製物としての使用のためにパッ
ケージングされ得るかまたは凍結乾燥され得る。この組成物は、生理学的条件に
近似するために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整お
よび緩衝化剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレ
ート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
【００７４】
薬学的処方物中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は、非常に広く変化し得
る。すなわち、約０．１重量％未満、通常は約２重量％から、または少なくとも
約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上の程度の高さまでであり、そして
選択される特定の投与態様に従って、流体容量、粘度などによって主に選択され
る。
【００７５】
本発明のペプチドはまた、特定の細胞組織（例えば、リンパ組織）に対してペ
プチドを標的化するようにリポソームを介して投与され得る。リポソームはまた
、ペプチドの半減期を増大させる際に有用である。リポソームとしては、乳濁物
、発泡体、ミセル、不溶性の単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などが挙げ
られる。これらの調製物では、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部と
して、単独で、または例えば、リンパ系細胞の中でも一般的なレセプターに結合
する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせ
て、または他の治療用もしくは免疫原性組成物とともに取り込まれる。従って、
本発明の所望のペプチドで満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位に対し
て指向され得、ここで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性ペプ
チド組成物を送達する。本発明での使用のためのリポソームは、標準的なベシク
ル形成脂質から形成され、これは、一般的に、中性の、および陰性に荷電したリ
ン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一
般的には、例えば、リポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中のリポソー
ムの安定性の考慮によって導かれる。本明細書中で参考として援用される、例え
ば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６
７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号
、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されるよ
うな種々の方法が、リポソームの調製に利用可能である。
【００７６】
免疫細胞を標的化するために、リポソーム中に取りこまれるべきリガンドとし
ては、例えば、所望の免疫系の細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその
フラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含有するリポソーム懸濁物が、静脈内
、局部的、局所的などで、とりわけ投与様式、送達されるべきペプチド、および
処置されるべき疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【００７７】
固形の組成物について、従来の無毒性の固形キャリアが使用され得る。この固
形キャリアとしては、例えば、薬学的グレードの、マンニトール、ラクトース、
デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セル
ロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。経口投与につ
いて、薬学的に受容可能な無毒性の組成物が、任意の通常使用される賦形剤（例
えば、上記に列挙されるキャリア）、および一般的に１０〜９５％（さらに好ま
しくは、２５％〜７５％の濃度で）の有効成分（すなわち、本発明の１つ以上の
ペプチド）を取り込むことによって形成される。
【００７８】
エアロゾル投与について、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤およ
びプロペラントとともに、細かく分けられた形態で供給される。ペプチドの代表
的なパーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％であり、好ましくは、１重
量％〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん、無毒性でなければならず、
そして好ましくはプロペラントに可溶性でなければならない。このような薬剤の
代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分的なエステル
（例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、カプロン酸、
オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン
酸、オレスチン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）であ
る。混合されたエステル（例えば、混合されたまたは天然のグリセリド）が使用
され得る。界面活性剤は、この組成物の０．１重量％〜２０重量％を構成し得、
好ましくは、０．２５重量％〜５重量％を構成する。組成物の残りは、通常、プ
ロペラントである。所望される場合は、キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達の
ためにはレシチンを用いるように、含まれ得る。
【００７９】
本明細書中に記載されるようなペプチド組成物での、注射、エアロゾル、経口
、経皮、または他の経路を介する免疫によって、宿主の免疫系は、所望される抗
原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、そしてこ
の宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または慢性の感染
の発症に対して耐性となる。
【００８０】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、ウイルス感染もしくはガンを
罹患しやすいか、またはそうでなければウイルス感染もしくはガンの危険性を有
する患者に、抗原に対する免疫応答を誘発し、従って患者自体の免疫応答能力を
増強するために投与される。このような量は、「免疫原的に有効な用量」として
規定される。この用途において、正確な量はさらに、患者の健康状態および体重
、投与様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者あた
り約１．０μｇから約５０，０００μｇの範囲であり、より一般的には、７０ｋ
ｇの体重あたり約１０μｇから約１０，０００μｇの範囲である。
【００８１】
いくつかの場合、本発明のペプチドワクチンを、目的のウイルス（特に、ウイ
ルスエンベロープ抗原）に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと合わせるこ
とが所望され得る。
【００８２】
治療または免疫の目的のために、１以上の本発明のペプチドをコードする核酸
はまた、患者に投与され得る。多数の方法が、核酸を患者に送達するために従来
用いられている。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。こ
のアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−
１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，
５８９，４６６号に記載される。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，
２５３号に記載されるような、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使
用して投与され得る。ＤＮＡのみから構成される粒子が投与され得る。あるいは
、ＤＮＡは、金粒子のような粒子に接着され得る。
【００８３】
核酸はまた、カチオン性化合物（例えば、カチオン性脂質）に対して複合体化
されて送達され得る。脂質によって媒介される遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ
９６／１８３７２；ＷＯ ９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌ
ｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９
１（１９８８）；Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ ９１／０
６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載される。
【００８４】
本発明のペプチドはまた、弱毒化されたウイルス宿主（例えば、ワクシニアま
たは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチには、本発明のペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使
用を含む。急性または慢性に感染した宿主への導入、または未感染の宿主への導
入によって、この組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それ
によって宿主のＣＴＬ応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用なワクシ
ニアベクターおよび方法は、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特
許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌ
ｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、本明細書
中で参考として援用されるＳｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４
６０（１９９１））に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫に
有用な広範な種々の他のベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ベクターなど）は、本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【００８５】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の複数
のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞中での発現の
ための選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作
製するために、このエピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使
用表が、各アミノ酸のコドン選択を導くために使用される。これらのエピトープ
をコードするＤＮＡ配列は、直接的に付加されて、連続するポリペプチド配列を
作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメン
トが、ミニ遺伝子の設計に取り込まれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配
列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴリン
パ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体残留シグナル。さら
に、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、合成の（例えば、ポリアラニン）または
天然に存在する隣接配列をＣＴＬエピトープに隣接して含むことによって改善さ
れ得る。
【００８６】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリ
ゴヌクレオチドをアセンブリすることによって、ＤＮＡに転換される。重複して
いるオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知の技術を使用して適切
な条件下で合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオ
チドの末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結される。次いで、ＣＴＬエ
ピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクター
にクローニングされ得る。
【００８７】
当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞中での発現を確実にするために
ベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが必要とされる：ミニ遺伝
子の挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写
の終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃ
ｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多
数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモータ
ー）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について
は、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照の
こと。
【００８８】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するため
に所望され得る。いくつかの場合、イントロンが、効率的な遺伝子発現のために
必要とされ、そして１つ以上の合成のまたは天然に存在するイントロンが、ミニ
遺伝子の転写領域に取りこまれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列を含むこともまた、ミ
ニ遺伝子の発現を増大させるために考慮され得る。免疫刺激配列（ＩＳＳまたは
ＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすことが、近年提唱さ
れている。これらの配列は、免疫原性を増強することが見出される場合、ミニ遺
伝子のコード配列の外側に、ベクター中に含まれ得る。
【００８９】
いくつかの実施態様において、ミニ遺伝子にコードされるエピトープ、および
免疫原性を増強するかまたは減少させるために含まれる第２のタンパク質の産生
を可能にする二シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用さ
れ得る。同時発現される場合に免疫応答を有益に増強し得るタンパク質またはポ
リペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、サイトカイン誘導性分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または同時刺激性分子
が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに連結
され得、そしてＣＴＬエピトープとは別に発現され得る。このことは、ＣＴＬエ
ピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向を可能にする。必要と
される場合、このことは、ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効
率的な進入を促進し得、それによって、ＣＴＬ誘導を改良する。ＣＴＬ誘導とは
対照的に、免疫抑制性分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答
を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【００９０】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポ
リリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ
株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ
遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる全ての他のエレ
メントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確な
プラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンク（ｂａｎｋ）および作業細
胞バンクとして保存され得る。
【００９１】
治療的な量のプラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発酵、その後の精製
によって産生される。作業細胞バンクに由来するアリコートは、発酵培地（例え
ば、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）を接種するために使用され、そして周知の
技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクターにおいて飽和するまで増殖
される。プラスミドＤＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎより提供される固相アニオン交換
樹脂のような、標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要とされる場
合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の技術を使用して、開環状
および直鎖状の形態から単離され得る。
【００９２】
精製されたプラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製さ
れ得る。これらのうち最も単純なものは、無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中での凍結乾燥したＤＮＡの再構成である。種々の方法が記載されており、
そして新規の技術が利用可能となり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂
質とともに好都合に処方される。さらに、糖脂質、フソジェニック（ｆｕｓｏｇ
ｅｎｉｃ）リポソーム、防御的、相互作用的、非縮合（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓ
ｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）として総称的に呼ばれるペプチドおよび化合物がまた、安
定性、筋肉内分散、特異的な器官もしくは細胞型へのトラフィッキングのような
変量に影響を与えるために、精製されたプラスミドＤＮＡに対して複合体化され
得る。
【００９３】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープの発現
およびＭＨＣクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。プラス
ミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切であ
る、哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最
終的な処方物に依存する。エレクトロポレーションは、カチオン性脂質が直接的
なインビトロでのトランスフェクションを可能にするにもかかわらず、「裸の」
ＤＮＡについて使用され得る。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプ
ラスミドが、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用するトランスフェクトされ
た細胞の富化を可能にするために、同時トランスフェクトされ得る。次いで、こ
れらの細胞は、クロム−５１で標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株の標
的細胞として使用される。５１Ｃｒの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ
遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の産生を示す。
【００９４】
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能的試験のための第２
のアプローチである。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウ
スは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（
例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについてはＩＰ
）。免疫の２１日後、脾細胞を回収し、そして試験される各エピトープをコード
するペプチドの存在下で１週間再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ
）は、ペプチドを負荷したクロム−５１標識化標的細胞の細胞溶解について、標
準的な技術を使用してアッセイされる。ミニ遺伝子によってコードされるエピト
ープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作された標的細胞の溶解は、Ｃ
ＴＬのインビボ誘導のためのＤＮＡワクチン機能を実証する。
【００９５】
抗原性ペプチドは、ＣＴＬをエキソビボで誘発するために同様に用いられ得る
。得られるＣＴＬは、他の従来の形態の治療に応答しないか、またはペプチドワ
クチンアプローチの治療に応答しない、患者における慢性の感染（ウイルス性ま
たは細菌性）または腫瘍を処置するために用いられ得る。特定の病原体（感染性
因子または腫瘍抗原）に対するエキソビボでのＣＴＬ応答は、組織培養において
、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源およ
び適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることにより誘導される。
適切なインキュベーション時間（代表的には１〜４週間）（このとき、これらの
ＣＴＬｐが活性化され、そして成熟し、そして増殖してエフェクターＣＴＬにな
る）の後、これらの細胞は、患者に注入し戻され、ここでこれらはそれらの特異
的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊する。特異的細胞傷害性Ｔ細
胞の生成のためのインビトロでの条件を最適化するために、刺激細胞の培養物は
、適切な無血清培地中で維持される。
【００９６】
刺激細胞と、活性化されるべき細胞（例えば、前駆体ＣＤ8+細胞）とのインキ
ュベーションの前に、刺激細胞の表面上に発現されるべきヒトクラスＩ分子に負
荷されるのに充分な量の抗原性ペプチドが刺激細胞培養物に添加される。本発明
では、ペプチドの充分な量は、約２００、そして好ましくは２００以上のヒトク
ラスＩ ＭＨＣ分子が、各刺激細胞の表面上に発現されるべきペプチドととに負
荷されることを可能にする量である。好ましくは、刺激細胞は、２０μｇ／ｍｌ
を超えるペプチドとともにインキュベートされる。
【００９７】
次いで、休止ＣＤ８＋細胞または前駆ＣＤ８＋細胞は、適切な刺激細胞を有す
る培養において、ＣＤ８＋細胞を活性化するために充分な時間の間インキュベー
トされる。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は、抗原特異的溶液で活性化される。休止
ＣＤ８＋細胞または前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の、刺激細胞に対する比
は、個体毎に変動し得、そして個体のリンパ球の培養条件に対する順応性、なら
びに記載された処置様式が用いられる疾患状態または他の状態の性質および重篤
度のような変量にさらに依存し得る。しかし、好ましくは、リンパ球：刺激細胞
の比は、約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激培養物は、
治療的に有用なまたは効果的な数のＣＤ８＋細胞を刺激するために必要な期間の
間維持され得る。
【００９８】
インビトロでのＣＴＬの誘導は、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的ＭＨＣクラスＩ
分子に結合しているペプチドの特異的認識を必要とする。ＡＰＣあたりの特異的
ＭＨＣ／ペプチド複合体の数は、ＣＴＬの刺激のために、特に一次免疫応答のた
めに重大である。細胞あたり少量のペプチド／ＭＨＣ複合体が、細胞をＣＴＬに
よる溶解に感受性にするために充分であるか、または二次ＣＴＬ応答を刺激する
ために充分であるが、一次応答の間のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の好首尾の活性
化は、有意に多い数のＭＨＣ／ペプチド複合体を必要とする。細胞上での空の主
要組織適合遺伝子複合体分子のペプチド負荷は、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答
の誘導を可能にする。細胞上での空の主要組織適合遺伝子複合体分子のペプチド
負荷は、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を可能にする。
【００９９】
変異体細胞株は、全てのヒトＭＨＣ対立遺伝子に存在するわけではないので、
内因性ＭＨＣ結合ペプチドをＡＰＣの表面から除去する技術を用い、その後、得
られる空のＭＨＣ分子に目的の免疫原性ペプチドを負荷することが有利である。
患者の非形質転換（非腫瘍形成性）非感染細胞、および好ましくは自己細胞の、
ＡＰＣとしての使用は、エキスビボＣＴＬ治療の開発に向けてのＣＴＬ誘導プロ
トコルの設計のために所望される。本願は、内因性ＭＨＣ結合ペプチドをＡＰＣ
の表面から剥がし、その後、所望のペプチドをロードするための方法を開示する
。
【０１００】
安定なＭＨＣクラスＩ分子は、以下のエレメントから形成される三量体複合体
である：１）通常、８〜１０残基のペプチド、２）α１ドメインおよびα２ドメ
イン中にペプチド結合部位を保有する膜貫通重鎖多型性タンパク質鎖、ならびに
３）非共有結合的に結合した非多型軽鎖である、β２ミクロブロブリン。複合体
から、結合したペプチドを除去することおよび／またはβ２ミクログロブリンを
解離することは、ＭＨＣクラスＩ分子を非機能的および不安定にし、迅速な分解
を生じる。ＰＢＭＣから単離された全てのＭＨＣクラスＩ分子は、その分子に結
合している内因性ペプチドを有する。それゆえ、第１段階は、ＡＰＣ上のＭＨＣ
クラスＩ分子に結合している全ての内因性ペプチドを、外因性ペプチドがそれに
添加され得る前にそれらの分解を生じることなく除去することである。
【０１０１】
結合したペプチドのＭＨＣクラスＩ分子を遊離させるための２つの可能な方法
は、培養温度を３７℃から２６℃へと、一晩の間低下させてβ２ミクログロブリ
ンを不安定化する工程、および穏やかな酸処理を用いて細胞から内因性ペプチド
を剥がす工程を含む。この方法は、前に結合していたペプチドを細胞外環境へと
遊離させ、新たな外因性ペプチドが空のクラスＩ分子に結合することを可能にす
る。低温インキュベーション方法は、外因性ペプチドがＭＨＣ複合体に効率的に
結合することを可能にするが、２６℃での一晩の培養（これは、細胞の代謝速度
を遅くし得る）を必要とする。ＭＨＣ分子を活性には合成しない細胞（例えば、
休止ＰＢＭＣ）が、低温手順によっては多量の空の表面ＭＨＣ分子を生じないこ
ともまたあるようである。
【０１０２】
厳しい酸ストリッピングは、トリフルオロ酢酸（ｐＨ２）でのペプチドの抽出
、または免疫アフィニティー精製したクラスＩペプチド複合体の酸変性を含む。
これらの方法は、ＣＴＬ誘導が可能ではない。なぜなら、抗原提示のために重要
であるＡＰＣの生存度および最適な代謝状態を保ちながら、内因性ペプチドを除
去することが重要であるからである。ｐＨ３の穏やかな酸性溶液（例えば、グリ
シンまたはクエン酸−リン酸緩衝液）は、内因性ペプチドを同定するために、お
よび腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを同定するために用いられている。ＭＨＣクラス
Ｉ分子のみが不安定化され（そして結合したペプチドが放出される）、一方、他
の表面抗原（ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む）は、インタクトなままであるという
点で、この処理は特に有効である。最も重要なことには、穏やかな酸性溶液での
細胞の処理は、細胞の生存度にも代謝状態にも影響を与えない。穏やかな酸処理
は、迅速である。なぜなら、内因性ペプチドのストリッピングは、４℃にて２分
間で生じ、そしてＡＰＣは、適切なペプチドが負荷された後にその機能を果たす
準備ができているからである。この技術は、一次抗原特異的ＣＴＬを生じるため
のペプチド特異的ＡＰＣを作製するために本明細書中で利用される。得られるＡ
ＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬを誘導する際に効率的である。
【０１０３】
活性化ＣＤ８＋細胞は、種々の公知の方法のうちの１つを用いて刺激細胞から
効果的に分離され得る。例えば、刺激細胞に、刺激細胞に負荷されるペプチドに
、またはＣＤ８＋細胞（またはそれらのセグメント）に特異的なモノクローナル
抗体は、それらの適切な相補的リガンドを結合するために利用され得る。次いで
、抗体タグ化分子は、刺激細胞／エフェクター細胞混合物から、適切な手段（例
えば、周知の免疫沈降またはイムノアッセイ方法）によって抽出され得る。
【０１０４】
有効な、細胞傷害性量の活性化ＣＤ８＋細胞は、インビトロでの用途とインビ
ボでの用途との間で変動し得、そしてそれらのキラー細胞の最終的な標的である
細胞の量および型によって変動し得る。この量はまた、患者の状態に依存して変
動し得、そして開業医によって全ての適切な因子を考慮して決定されるべきであ
る。しかし、マウスにおいて用いられる約５×１０6〜５×１０7細胞と比較して
、好ましくは約１×１０6〜約１×１０12、より好ましくは約１×１０8〜約１×
１０11、そしてさらにより好ましくは約１×１０9〜約１×１０10個の活性化Ｃ
Ｄ８＋細胞が、成人ヒトのために利用される。
【０１０５】
好ましくは、上記のように、活性化ＣＤ８＋細胞は、処置されるべき個体への
ＣＤ８＋細胞の投与の前に、細胞培養物から収集される。しかし、他の現行の処
置様式および提唱される処置様式とは異なり、本発明の方法は、腫瘍形成性では
ない細胞培養系を用いることに留意することが重要である。それゆえ、刺激細胞
と活性化ＣＤ８＋細胞との完全な分離が達成されないならば、少数の刺激細胞の
投与に関連することが公知の固有の危険性は存在せず、一方、哺乳動物腫瘍促進
細胞の投与は、極めて危険であり得る。
【０１０６】
細胞成分を再度導入する方法は、当該分野で公知であり、そしてこの方法とし
ては、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅ
ｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号に例示される手順のような
手順が挙げられる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋細胞の投与は適切
である。
【０１０７】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するために用い
られ得る。このような抗体は、潜在的な診断剤または治療剤として有用であり得
る。
【０１０８】
これらのペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発
明のペプチドは、ペプチドもしくは関連ペプチドを用いる処置レジメに対する特
定の個体の感受性を決定するために用いられ得、従って、既存の処置プロトコル
を改変する際に、または罹患個体についての予後を決定する際に有用であり得る
。さらに、これらのペプチドはまた、どの個体が、慢性の感染を発症するかなり
の危険性にあるかを予測するために用いられ得る。
【０１０９】
本明細書中に引用した全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の各刊行
物または特許出願が、参考として援用されると具体的かつ個別に示されたかのよ
うに、本明細書中で参考として援用される。
【０１１０】
前述の発明は、理解の明確化の目的のための実例および例としていくぶん詳細
に記載したが、本発明の教示を考慮して、特定の変更および改変が、添付の特許
請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく本発明に行われ得ることが当
業者には容易に明らかである。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、そして限定のために提供される
わけではない。当業者は、変更または改変され得る種々の重要でないパラメータ
ーが、本質的に類似の結果を生じることを容易に理解する。
【０１１２】
（実施例１）
クラスＩ抗原の単離を、上記の関連出願に記載されるとおりに実施した。次い
で、天然でプロセシングされたペプチドを、上記の関連出願に記載されるとおり
に単離および配列決定した。対立遺伝子特異的モチーフおよびアルゴリズムを決
定し、そして定量的結合アッセイを実施した。
【０１１３】
ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子について上記で同定されたモチーフを用いて、多
数の抗原由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。表５
は、これらの検索の結果を提供する。
【０１１４】
【表５】
本発明のペプチドを同定するために、クラスＩ抗原単離、ならびに天然でプロ
セシングされたペプチドの単離および配列決定を、関連出願に記載されるとおり
に実施した。次いで、これらのペプチドを用いて、以下の各々の対立遺伝子につ
いての特異的結合モチーフを規定した：Ａ３．２、Ａ１、Ａ１１およびＡ２４．
１。これらのモチーフを、上記に記載する。以下の表６〜表９に記載されるこれ
らのモチーフは、関連出願において記載されるように、天然でプロセシングされ
たペプチドの配列決定データプールから規定される。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
【表９】
（実施例２）
種々のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子について上記で同定されたモチーフを用いて
、種々の病原体および腫瘍関連タンパク質由来のアミノ酸配列を、これらのモチ
ーフの存在について分析した。関連出願において記載したスクリーニングを実施
した。表１０は、これらの抗原の検索結果を提供する。
【０１１９】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【公開番号】特開２０１０−９０１６７（Ｐ２０１０−９０１６７Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４４４６（Ｐ２０１０−４４４６）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【分割の表示】特願２０００−５５４４００（Ｐ２０００−５５４４００）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５００５２１０３８）エピミューン インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【分割の表示】特願２０００−５５４４００（Ｐ２０００−５５４４００）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５００５２１０３８）エピミューン インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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