Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル
【課題】ＩＶ型コラーゲンの特性を保持し、かつゲル強度に優れる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供することを目的とする。
【解決手段】ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルである。Ｉ型コラーゲンによる線維状物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が形成された３次元構造を形成し、生体の基底膜に近似する細胞培養環境を提供することができる。
【解決手段】ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルである。Ｉ型コラーゲンによる線維状物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が形成された３次元構造を形成し、生体の基底膜に近似する細胞培養環境を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＩＶ型コラーゲンによる基底膜の生理機能を再現でき、かつゲル強度に優れるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル、および前記混成ゲルの調製方法、ならびに前記混成ゲルをコーティングしてなる細胞培養プレートなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の身体は、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織と呼ばれる４種類の組織型を組み合わせて構成され、上皮組織や筋組織が主に細胞で構成されるのに対し、結合組織の主体はコラーゲン線維を主成分とする間質と呼ばれる細胞外マトリックスである。また、前記上皮組織と結合組織との間には基底膜と呼ばれるシート状の細胞外マトリックスが存在し、前記筋組織を構成する細胞も基底膜で周囲を覆われ、血管もその内皮細胞は基底膜で裏打ちされている。更に、神経細胞も、例えば末梢神経の軸索を包むシュワン細胞も基底膜を足場とするなど、多細胞生物を構成する細胞の多くは、基底膜をその足場としている。細胞外マトリックスは、細胞の増殖や生存に必要であり、例えば、動物細胞は培養皿に接着し、足場を形成できないと増殖できないばかりかアポトーシスを起こして自滅する。この現象は、細胞増殖の足場依存性（anchorage dependence of cell growth）と呼ばれ、悪性のがん細胞や血球細胞などを除き、多細胞動物を構成する殆ど全ての細胞で観察される現象である。
【０００３】
このような細胞培養の際に足場となる基底膜は、厚さ１００ｎｍほどの極めて薄いシート状の細胞外マトリックスであり、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどからなり、これらが複合的に結合して３次元構造を構成している。例えば、前記ＩＶ型コラーゲンは、基底膜の形態維持を担う主要な構成成分であり、Ｎ末端領域でジスルフィド結合により架橋された四量体を形成する一方で、Ｃ末端の球状領域でend-to-end型に会合し、このＮ末端領域とＣ末端領域の会合を通じて２次元網目構造を構築している。また、ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、十字形の形をした基底膜成分である。α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在する。これらサブユニットの組み合わせにより現時点では１５種類のラミニンが知られており、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。３本のサブユニット鎖は共通のコイルドコイルドメインを持ち、この領域で会合してヘテロ三量体を形成する。一方、各サブユニットのＮ末端領域は互いに親和性を有し、この領域で会合することで基底膜に自己組織化される。なお、基底面で自己会合したラミニンは、ニドゲンを介してＩＶ型コラーゲンと結合し、ＩＶ型コラーゲンが独立に自己会合して作る網目構造で裏打ちされることで物理的な強度を獲得している。更に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが加わり、基底膜分子間の相互作用とジスルフィド結合や非ジスルフィド結合による分子間架橋により、その構造が安定化される。
【０００４】
従来から、細胞外マトリックスに関する研究は、コラーゲンを中心に進められている。ほ乳類では約３０種類の遺伝的に異なるコラーゲンが発見されており、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型などと発見順に命名されている。それぞれ構造、機能、分布が相違するが、α鎖と呼ばれるポリペプチド鎖が３本、互いに巻きついた右巻きの螺旋構造をとり、前記ポリペプチド鎖は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を示す）の繰り返しからなる基本構造を有する点で共通する。なお、Ｉ型コラーゲンでは、３本螺旋領域の両端に、非螺旋領域であるテロペプチドが存在する。
【０００５】
前記した基底膜を構成する主要なコラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンと同様に３本鎖の螺旋構造を形成するが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ構造が中断する部分を有する点でＩ型コラーゲンと相違する。また、ＩＶ型コラーゲンは、Ｎ末端にシステイン残基を多く含む７Ｓ領域と、分子Ｃ末端に非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）とを有し、これら、７Ｓ領域およびＮＣ１領域を介してＩＶ型コラーゲンの二次元網目構造が形成される点で重要な領域である。
【０００６】
一般に、動物の結合組織のコラーゲンは熱処理によって容易に抽出されるが、この場合にはコラーゲンが熱変性によってその特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。コラーゲンはその立体構造を保ったままでは一般に難溶性であり、コラーゲンを溶液として得るには特別な方法が必要となる。ＩＶ型コラーゲンの抽出方法は、胎盤を材料に用いて、ペプシン処理によって胎盤に含まれるＩ，ＩＩＩ，Ｖ，ＩＶ型コラーゲンを抽出した後に、塩分別、カラム等によってＩＶ型コラーゲンを精製する方法（非特許文献１）や、ほぼＩＶ型のみから構成されている動物眼球のレンズカプセルから酸性溶液中でＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出する方法などが知られている（非特許文献２）。
【０００７】
一方、種々のコラーゲンの中で、例えば、Ｉ型コラーゲンは、動物の皮膚・腱・骨などの結合組織の主要構成成分であり、３本のポリペプチド鎖が互いに巻きついた約３００ｎｍの螺旋構造を有する。この３本螺旋体が互いに１／４．４ずつづれながら会合して細い線維を作り、これが更に平行に並んで束を形成し、強い張力に耐えるコラーゲン線維が形成される。Ｉ型コラーゲンの抽出法としては、動物の骨、皮などの材料として、酸性溶液や酵素処理で抽出する方法や(特許文献１)、アルカリ処理による可溶化法等が知られている(非特許文献３)。
前記したＩ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、細胞外マトリックスの構成成分であり、細胞接着因子として働く。細胞培養の際に細胞培養プレートのコラーゲンコートが行われるのはこのためである。一方、Ｉ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、その抽出方法によって線維形成能やゲル形成能その他が相違し、コラーゲンコートの方法によって前記コート層におけるコラーゲンの形状が相違する。ペプシン処理したＩ型コラーゲンの塩酸溶液を細胞培養プレートの表面にのせ、２５℃の無菌の空気流で乾燥させてなる細胞培養プレート（コラーゲンコートデッシュ）と、前記コラーゲンの塩酸溶液に炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭと、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＦＢＳ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを撹拌してコラーゲン培地液を調製し、これを細胞培養プレートに載せ、３７℃で６時間、ＣＯ2条件下でインキュベートしてなる細胞培養プレート（３次元コラーゲン線維ゲル）と、前記コラーゲン培地液と細胞けん濁液とを混合して細胞培養プレートに固定した細胞培養プレート（細胞含有３次元コラーゲンゲル）との３種類で線維芽細胞を培養したところ、コラーゲンコートデッシュと３次元コラーゲン線維ゲルとでは同じ細胞倍増時間であったが、細胞含有３次元コラーゲンゲルでは１．５倍に延長され、有意な増殖抑制が観察されたとの報告がある（非特許文献４）。
【０００８】
また、Ｉ型コラーゲンのカルシウム、マグネシウム不含有リン酸緩衝液を細胞培養プレートにコートし、２時間室温に載置してなる非線維化コラーゲンと、Ｉ型コラーゲンのＰＢＳ（−）溶液を細胞培養プレートに載せ、３７℃、２時間インキュベートして線維状に会合させた線維状コラーゲンとでケラチノサイトを培養したところ、線維状コラーゲンではアポトーシスが引き起こされ（非特許文献５）、分化が引き起こされることが知られている（非特許文献６）。
【０００９】
なお、ＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートとして、コスモ・バイオ株式会社製の登録商標マトリゲルがある。マトリゲルは、マウスのＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）肉腫という基底膜分子を過剰生産する肉腫の抽出物からなり、さらに、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特公昭３７−１４４２６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓａｇｅ Ｈ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，９８９３−９９００ （１９７９）
【非特許文献２】Ｍｕｒａｏｋａ， Ｍ ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ， Ｔ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１４，３５８−３６２ （１９９３）
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｉ， Ｔ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， Ｃｈｅｍ．３５０，１２５７−１２６５ （１９６９）
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｔｒｉｘ， ９，１９３−１９９ （１９８９）
【非特許文献５】Ｆｕｊｉｓａｋｉ， Ｈ． ａｎｄ Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｓ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２８０，２５５−２６９ （２００２）
【非特許文献６】Ｆｕｊｉｓａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ４９，４２６−４３６ （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
コラーゲンコートした細胞培養プレートを使用して細胞培養を行うと、培養細胞は表面にあるコラーゲン受容体であるインテグリンを介してコラーゲン分子に接着し、細胞培養プレート上で増殖する。上皮細胞の幹細胞の維持や分化、増殖には基底膜の存在が必須であり、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートが使用されることが望ましい。
【００１３】
また、コラーゲンは調製方法によって３次元構造を形成し、細胞培養プレートにコートした場合も３次元構造をとりうるか否かによって培養細胞の増殖や分化に相違が生じる。基底膜は、その主成分であるＩＶ型コラーゲンが網目状に広がって構成されるが、細胞培養プレートの表面にＩＶ型コラーゲンの網目構造を再現できれば、より生体の基底膜に近似した細胞増殖環境を形成することができる。
【００１４】
しかしながら、ＩＶ型コラーゲンは、動物の胎盤や眼球のレンズカプセルを抽出原料とするため、大量に製造することが困難である。例えば、市販の登録商標マトリゲルは、マウスのＥＨＳ肉腫からの抽出物であるが、正常細胞の培養には、正常個体から抽出したＩＶ型コラーゲンの使用が好ましく、原料の入手が容易でない。また、ＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によっては、分子相互作用が弱いためゲル化による網目構造を形成することができず、ゲル化する場合でも温度４℃で５日以上静置しなければ網目構造を形成しない。このため、３次元構造の形成に長時間を要し、ＩＶ型コラーゲンによる実質的な３次元構造の形成は容易でない。市販のマトリゲルでは、電子顕微鏡写真によるＩＶ型コラーゲンによる網目状構造を観察することはできない。したがって、ＩＶ型コラーゲンの使用量を低減し、かつ基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性し、簡便に３次元構造を形成することができ、基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性をするＩＶ型コラーゲン含有ゲルの開発が望まれる。
一方、Ｉ型コラーゲンはゲル強度が高く、比較的容易に抽出や精製が行えるため、コラーゲン３次元培養基質として広く使用することができる。
【００１５】
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは基底膜としての機能を有しておらず、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。
【００１６】
また、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してそのゲル強度を高めようとしても、Ｉ型コラーゲンは３７℃で会合体を形成してゲル化し、これより温度を下げると分子分散した溶液となり会合体を形成することができず、一方、ＩＶ型コラーゲンの会合温度は３７℃より低温の４℃である。実際、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる混成ゲルは知られておらず、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとによって３次元ゲルを形成する方法も存在しない。
【００１７】
従って、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して、均一な３次元構造を形成することができ、かつＩＶ型コラーゲンの機能が発揮される、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルの開発が望まれる。
また、基底膜は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの様々な器官の細胞の足場となり、その増殖や分化を調節している。細胞培養プレートとして生体の基底膜に近似した環境を形成することができれば、より生体環境に近い培養を行うことができる。このような基底膜には、ＩＶ型コラーゲンのほかにラミニンが必須の成分として含有されるため、使用するＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにもラミニンが含有されることが好ましい。
【００１８】
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは、会合によって線維化するがこのような線維状コラーゲンに対するラミニンの結合力は弱い。したがって、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してなる混成ゲルからなり、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲル、並びにこのような混成ゲルを使用してなる細胞培養プレートの開発が望まれる。
上記現状に鑑みて、本発明は、ＩＶ型コラーゲンの基底膜の構成成分としての特性を保持し、ゲル強度に優れ、３次元構造を形成しうるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明は、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合し、３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供することを目的とする。
【００２０】
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを細胞培養プレートの表面にコートしてなる細胞培養プレートを提供することを目的とする。
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のＩ型コラーゲンと特定のＩＶ型コラーゲンとを特定条件下で混合したところ、短時間に、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物にＩＶ型コラーゲンによる膜状構造物が結合した３次元ゲルを形成することができること、このような混成３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの使用量が低減されたにもかかわらず、基底膜に含まれるＩＶ型コラーゲンと近似する特性を有すること、この混成３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンと相違して、ＩＶ型コラーゲンの配合量に対応するラミニンを結合することができ、より基底膜に近似する細胞培養環境を形成しうること、このような混成ゲルを細胞培養プレートにコートしてなる細胞培養プレートは、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルが形成されるため、極めて基底膜に近似した細胞培養プレートとなりうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
【００２２】
また本発明は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合していることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
【００２３】
本発明は、更に、ラミニンを含有することを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが細胞培養用の支持体にコーティングされたことを特徴とする、細胞培養プレートを提供するものである。
【００２４】
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供するものである。
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。
【００２５】
本発明は、更に、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。
【００２６】
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。
【００２７】
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。
【００２８】
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法を提供するものである。
【００２９】
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記人工基底膜の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによれば、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンと、線維形成能を有するＩ型コラーゲンとを混合することで、収量の少ないＩＶ型コラーゲンの使用量を減らし、ゲル強度に優れ、かつＩＶ型コラーゲンの特性を有する混成ゲルを提供することができる。
【００３１】
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、短時間に、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができる。
【００３２】
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができ、この混成ゲルを細胞培養プレートにコートすることで、より生体の基底膜に近似する細胞培養プレートを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図でり、Ａは、コラーゲンの分子量マーカーであり、Ｂは、製造例１で得た線維形成能を有するＩ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂは、製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】図２は、３次元ゲルを調製した場合のゲル強度を評価する方法を説明する図であり、Ａは、エッペンドルフチューブで形成した実施例１で得たＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルの上にビーズが保持される態様を、Ｂはビーズが底に落下する態様を示し、Ｃは、その模式図である。
【図３】図３は、実施例２、比較例１、比較例２で作成したゲルコーティングウェルプレートの走査型電子顕微鏡写真である。図３Ａは、実施例２、図３Ｂは比較例１、図３Ｃは比較例２の結果を示す。
【図４】Ａ、Ｂ、Ｃは、ＩＶ型コラーゲンの配合量の異なる本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに対するラミニンの結合量を評価したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、Ｄは、ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンを使用した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】図５Ａは、実施例４、図５Ｂは比較例３のゲルの走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実施例５で形成したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを使用して製造したゲルコーティングウェルプレートでＥＳ細胞を培養したＥＳ細胞コロニーの形態を示す図である。図６Ａは、比較例１のＩ型コラーゲンゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｂは、実施例２のＩ型−ゲル化能を有するＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｃは比較例２のＩ型−酵素抽出ＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６ＤはマトリゲルでのＥＳ細胞のコロニーである。
【図７】図７Ａは、Ｏｃｔ−３／４の発現を、図７Ｂは、Ｆｇｆ５の発現を、図７Ｃは、Ｆｌｋ１の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の第１は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルである。
【００３５】
基底膜による細胞培養環境を提供するには、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンを使用することが好ましいが、ＩＶ型コラーゲンは供給量が少なくかつゲル化能も弱い。本発明によれば、少量のＩＶ型コラーゲンにＩ型コラーゲンを混合することで、ＩＶ型コラーゲンの特性を維持したままゲル強度に優れる混成コラーゲンを提供することができる。なお、後記する実施例に示すように、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮するには、ＩＶ型コラーゲンが、上記混成ゲルの中で網目構造を形成する必要がある。従来から、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの混合や、得られた混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法、更には、このような混成ゲルが基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンの特性を維持しうることは、全く知られていなかった。本発明では、ＩＶ型コラーゲンとしてゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用し、Ｉ型コラーゲンとして線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用し、かつ前記ＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、前記Ｉ型コラーゲンを１００〜５００質量部、より好ましくは１００〜３００質量部、混合してなる混成ゲルを提供する。この混成ゲルは、所定条件下で簡便に３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有することが判明した。以下、本発明を詳細に説明する。
（１）線維形成能を有するＩ型コラーゲン
本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が３重螺旋を巻いたものの総称であり、コラーゲン分子は１種類のα鎖からなっていてもよく、別々の遺伝子にコードされた複数種のα鎖からなっていてもよい。α鎖は、通常、α１，α２，α３のようにαの後に数字をつけてよび，さらにコラーゲンの型をつけて，α１（Ｉ）などと称する。本発明では、線維形成能を有するものであれば、例えば、［α１（Ｉ）2α２（Ｉ）］のような天然に存在するＩ型コラーゲンのほか、天然に存在しないような組み合わせの三量体であってもよい。
【００３６】
本発明で使用するＩ型コラーゲンは、線維形成能を有することを特徴とする。線維状のＩ型コラーゲンにＩＶ型コラーゲンを膜状に結合することで、ＩＶ型コラーゲンの基底膜成分の特性が発揮されることが判明したからである。なお、使用するＩ型コラーゲンが線維形成能を有するか否かは、濃度０．１％のＩ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した場合に、会合構造により肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維を形成する場合に線維形成能ありとして確認することができる。
一般に、Ｉ型コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、３本螺旋構造を有し、かつ線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用する点に特徴がある。このようなＩ型コラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、（１）酸性溶液を用いる方法、（２）酵素処理する方法、（３）アルカリ処理による可溶化法等がある。
【００３７】
（ｉ）酸性溶液処理法
Ｉ型コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱を例示することができる。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するため好ましいが、線維形成能を有するＩ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。
【００３８】
例えばウシの真皮を使用する場合には、蛋白質分解酵素阻害剤を加えた食塩を含まない、リン酸緩衝液、もしくはトリス緩衝液（ｐＨ７．６）をもちいてよく洗浄する。または石灰漬によって脱毛処理を行ったのち塩酸で中和水洗した牛皮を使用することができる。
【００３９】
前記した下処理を行った牛皮を１ｃｍ角程度に細切し、組織質重量に対して１０倍の０．５Ｍ酢酸を加え４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。抽出後、遠心分離によって溶け残りの組織を除く。遠心分離によって得た溶液には最終濃度２Ｍとなるように食塩を加えることで、Ｉ型コラーゲンを沈殿させる。さらに上記Ｉ型コラーゲンの沈殿を０．０５Ｍの酢酸に再溶解し、最終濃度１Ｍとなるように食塩を加え、遠心分離によって粗Ｉ型コラーゲンの沈殿を得る。その後、必要に応じてトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に沈殿を溶解し、中性塩分別を行うとＩ型コラーゲンをさらに精製することができる。
【００４０】
上記酸性溶液を使用する方法では、３本螺旋領域の両端の非螺旋領域であるテロペプチドを含む、生体内に存在するコラーゲン分子と同じ状態のコラーゲンを得ることができる。
【００４１】
（ｉｉ）酵素処理法
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、ｐＨ２〜３の塩酸酸性ペプシン溶液に浸し、随時撹拌しながらＩ型コラーゲンの収縮温度である４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。ペプシンにより不溶性コラーゲンが酵素で処理され、不溶性コラーゲンが溶解する。
【００４２】
ついで、０．００５Ｎの塩酸溶液を追加してＩ型コラーゲンの変性温度である３７℃以下、より好ましくは２０〜２５℃で１２〜６０時間撹拌すると、Ｉ型コラーゲンが溶解する。酸溶液としては、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、他の有機酸を好適に使用することができる。
【００４３】
この溶液をろ過し、ろ液を水酸化ナトリウムなどのアルカリでｐＨ６〜８に中和してペプシンを不活化する。その後、再び溶液を酸性に戻し、２モルの食塩を加えてコラーゲンを沈殿させる。その後の操作は上記（ｉ）の酸性溶液処理法と同様にして、粗Ｉ型コラーゲンや精製Ｉ型コラーゲンを得ることができる。
【００４４】
（ｉｉｉ）アルカリ溶液処理
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、１５％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム含有５％水酸化ナトリウムなどの、硫酸ナトリウム含有アルカリ溶液で処理する。３本螺旋構造を維持したコラーゲンを抽出することができる。アルカリ処理の方法は、抽出効率が高い点で優れる。
Ｉ型コラーゲンは、コラーゲンへリックス領域の両端に、螺旋構造をとらない数十残基のアミノ酸からなるテロペプチドが結合し、テロペプチド部分が除去されたコラーゲンをアテロコラーゲンと称する。上記した（ｉｉ）の酵素処理法によるとアテロコラーゲンとしてＩ型コラーゲンを得ることができる。本発明で使用するＩ型コラーゲンとしては、３本螺旋構造を維持でき、かつ線維形成能を有すれば、テロペプチドが除去されたアテロコラーゲンであってもよい。
【００４５】
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、線維形成能を有するＩ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（２）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン
本願明細書において「ＩＶ型コラーゲン」とは、基底膜を構成する主要なコラーゲンであり、その分子は、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインからなっており、Ｎ末端の７Ｓで４分子が重合し、Ｃ末端のＮＣ１で２分子が重合することにより、網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価な分子をいう。ＩＶ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
【００４６】
本発明で使用するＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有することを特徴とする。ゲル化能によって、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に結合させることができる。後記する実施例に示すように、ゲル化能がないＩＶ型コラーゲンを使用すると、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に形成することができず、ＩＶ型コラーゲンとしての特性も発揮することができない。
【００４７】
なお、使用するＩＶ型コラーゲンがゲル化能を有するか否かは、濃度１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有、中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で４℃、５日放置した後に、溶液がＩＶ型コラーゲンの会合によって流動性を失った場合に、ゲル化能ありとして確認することができる。
このようなゲル化能のあるＩＶ型コラーゲンは、酸性溶液を使用して抽出することができる。
【００４８】
まず、ＩＶ型コラーゲンの抽出原料としては、ウシ、ブタ、ウマ等の眼球レンズカプセルや胎盤を例示することができる。特に、眼球レンズカプセルを使用することが好ましい。回収率および純度が高いからである。ただしＩＶ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。
【００４９】
抽出処理方法を以下に示す。
例えば、凍結ウシの眼球レンズカプセルを使用する場合には、解凍後に、まず洗浄工程として、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで眼球レンズカプセルを洗浄する。続いて抽出工程にはいる。眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの１ｍＭの塩酸を添加してホモジナイズし２〜３日間、4℃で静置する。遠心分離後、上澄みを４℃で保存する。上澄みを０．５Ｍの酢酸で透析して前記インヒビターを除去し、ついで凍結乾燥してＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
【００５０】
なお、後記する実施例に示すように、眼球レンズカプセルから抽出したＩＶ型コラーゲンは、α鎖由来のバンドが存在する。１００ｋＤａ以下のコラーゲン由来でない不純物が含まれる場合には、ＤＥＡＥセファロース等のイオン交換樹脂により精製し、純度の高いＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
ＩＶ型コラーゲンは、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインを有し、分子Ｎ末端はシステイン残基を多く含む７Ｓ領域を、分子Ｃ末端は非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）を有し、７Ｓ領域およびＮＣ１領域は、コラーゲン分子が相互作用して基底膜構造を形成するのに重要な役割をもっている。本発明では、ゲル化能を有すれば、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインの全てを有している必要はない。
【００５１】
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（３）ラミニン
ラミニンは、基底膜の構成成分である。ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在し、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。例えば、サブユニットαがα１であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンを、ラミニン１１１と称し、サブユニットαがα２であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンをラミニン２１１と称する。理論上は、サブユニットの組み合わせによって、４５種のラミニンが存在しうる。本発明で使用できるラミニンは、現時点で知られている以下に示す１５種類ラミニン１１１，２１１，１２１，２２１，３３２，３１１，３２１，４１１，４２１，５１１，５２１，２１３，４２３，５２３，３３３のほかに、これから見出されうる他のラミニンを含むことができる。更に、臓器、細胞分泌物からの精製品のほか、リコンビナントラミニンであってもよい。
【００５２】
ＩＶ型コラーゲンは基底膜に普遍的に存在するが、ラミニンの構成サブユニット鎖は、臓器、発生の段階によって相違する。ＩＶ型コラーゲンが基底膜成分として細胞間に共通な基底膜特有の細胞制御を担当し、ラミニンはさらに臓器・発生段階に特徴的な微妙な細胞機能の制御を分担して行っている可能性がある。例えば、ラミニンは、細胞受容体であるインテグリン、ジストログリカン、シンデカンと結合し細胞の分化、増殖を制御していると考えられる。したがって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに種々のラミニンを結合することで、培養細胞の分化や増殖を制御することができる。
（４）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる。前記したように、上記範囲で配合した混成ゲルは、所定条件下で、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合する３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有する。
【００５３】
従来から、３次元細胞培養の基材としてはＩ型コラーゲンが利用されてきたが、Ｉ型コラーゲンは基底膜の特性を有しておらず、再生医療などで必要となるＥＳ細胞の培養には最適とはいえない。従って、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル強度に優れＩＶ型コラーゲンの特性を維持でき、生体の基底膜に近似した細胞培養環境を提供することができる。
また、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ラミニンなどの他の基底膜成分を結合することができる。生体の基底膜では、ＩＶ型コラーゲンの網目構造とラミニンとが複合的に結合して、基底膜の立体構造を形成している。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに更にラミニンを結合することで、より基底膜に近似する細胞培養環境を提供することができる。ラミニンの結合量は、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜１５０μｇ／ｍｌとする。なお、結合させるラミニンの種類には特に制限はなく、その目的に応じて、各種のラミニンから選択して結合させることができる。
なお、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、含水ゲルである。前記Ｉ型コラーゲンと前記ＩＶ型コラーゲンとの配合割合は上記の範囲であるが、混成ゲルに含まれる前記Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの総濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜８ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｍｌである。この範囲で、基底膜に近似するゲル強度を確保し、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮することができる。
【００５４】
一方、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを形成した後にこれを乾燥および凍結してもよい。これにより、高度の保存性を確保することができる。なお、ついで培養液など添加することで、再度３次元ゲルを形成することができる。
（５）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを使用するが、簡便な方法で３次元ゲルを形成することができることが判明した。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法には、特に限定はないが、以下の方法を好適に使用することができる。すなわち、
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより、３次元ゲルを形成することができる。
(ｉ)ＩＶ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩＶ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。ＩＶ型コラーゲンは、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。
（ｉｉ）Ｉ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。Ｉ型コラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンと同様に、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、ＩＶ型コラーゲン溶液と同様に、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。Ｉ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｉｉ）混成コラーゲン溶液の調製
前記濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対し、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で混合して混成コラーゲン溶液を得る。上記温度であれば、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの双方をゲル化させずに混合することができる。なお、得られるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにおける各コラーゲンの配合割合は、前記ＩＶ型コラーゲン溶液とＩ型コラーゲン溶液との配合量を上記範囲で選択することで調整することができる。ＩＶ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｖ）混成コラーゲン緩衝溶液の調製
本発明では、上記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％とし、かつ溶液を中性にする。
【００５５】
Ｉ型コラーゲンから線維状構造物を形成する方法としては、前記非特許文献４に記載されるように、Ｉ型コラーゲンの塩酸溶液に、炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭなどを添加して３７℃で６時間、５％ＣＯ2条件下でインキュベートする方法が知られているが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して３次元ゲルが形成されることは全く知られていない。本発明では、温度０〜４℃で、前記混成コラーゲン溶液に上記塩化ナトリウム濃度の中性緩衝液を添加することで、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンの双方のゲル化を防止しつつ各コラーゲンを均一に混合し、併せて溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％に調整する。
【００５６】
なお、塩化ナトリウム含有中性緩衝液の調製に使用する中性緩衝液としては、ｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であり、最も好ましくはｐＨ７．６の緩衝液であり、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液を使用することができる。また、塩化ナトリウムの濃度は、生理食塩水の塩濃度である０．９質量％の５〜２０倍、より好ましくは７〜１５倍の塩濃度とする。例えば、塩化ナトリウム９質量％を含有する塩化ナトリウム含有中性緩衝液を使用する場合には、この１／１０を使用することで、簡便に０．９質量％に調製することができる。
（ｖ）３次元ゲル化
前記混成コラーゲン緩衝溶液を、温度３０〜４０℃、より好ましくは３５〜３７℃に１０分〜２時間、より好ましくは３０〜６０分インキュベートする。この工程により、従来、４℃でなければ会合しなかったＩＶ型コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンが共存することで会合してゲル化することが判明した。すなわち、Ｉ型コラーゲンの線維化温度である３７℃で、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを同時にゲル化させることができる。しかも、従来の方法では、ＩＶ型コラーゲンをゲル化させるために５日間という長時間を要したが、本発明によれば、２時間以内という極めて短時間にゲル化できるのである。しかも、その３次元構造は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造にＩＶ型コラーゲンによる膜状物が形成されたものであり、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの網目構造に類似する。この結果、本発明の混成ゲルは、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの特性をよく保持することができる。
（ｖｉ）ラミニンの添加
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、基底膜成分であるラミニンを添加することができ、これにより、より基底膜に近似する混成ゲルを調製することができる。
【００５７】
ラミニンを結合する方法にも、特に限定はないが、好ましくは、前記３次元ゲルを形成した後に、３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートする。基底膜では、ラミニンも会合体を形成するが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルにおいて、ラミニンが結合するか否かは不明であった。本発明では、混成コラーゲン溶液にラミニン溶液を混合するのではなく、一端、３次元ゲルを形成した後にラミニン溶液を添加し、これを上記条件でインキュベートすることで、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにラミニンを結合しうることを見出した。
【００５８】
なお、ラミニンを添加するＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを構成するためラミニンを添加した後にこれを撹拌することはできない。しかしながら、３次元ゲル上にラミニンを重層してインキュベートすると、重層したラミニンがゲルと結合し、保持される。インキュベートしたのち、緩衝液や細胞培養液で３次元ゲルを洗浄すれば、ラミニン結合Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製することができる。
【００５９】
ラミニンは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などに溶解したものを使用することが好ましい。
（６）細胞培養プレート
本発明における細胞培養プレートを構成する支持体とは、細胞培養に使用され、かつＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを固定できるものを広く含む。したがって、チップ、アレイ、マイクロタイタープレートやマイクロウェルプレートなどのプレート、シャーレ、スライドグラス、フィルム、ビーズなども含まれる。
【００６０】
また、支持体への固定方法は化学的結合のほかに物理的な結合であってもよい。支持体として使用する材料としては、例えば、ガラス、天然および合成ポリマー、金属（合金も含まれる）などを例示することができ、これらは２種以上を組み合わせてなる複合体であってもよい。
【００６１】
前記ポリマーとしては、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどを例示することができる。
【００６２】
また、本発明では、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜も支持体として使用することができる。
本発明の細胞培養プレートは、細胞培養用の支持体に前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルがコーティングされたものである。好ましくは、前記混成ゲルが３次元ゲルを形成するものである。３次元ゲルによってＩＶ型コラーゲンの特性が発揮され、基底膜に近似する培養環境を形成しうるからである。なお、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、前記支持体の全面にコーティングされている必要はなく、少なくとも細胞培養面にコーティングされていればよい。
本発明の細胞培養プレートは、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
【００６３】
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養プレートに載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより３次元ゲルを形成することを特徴とする。
【００６４】
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、細胞培養プレートに載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする点にある。これにより、細胞培養プレート上に３次元ゲルを形成することができる。
【００６５】
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、細胞培養プレートに、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルを形成することができる。
本発明の細胞培養プレートを使用して、幹細胞を培養することができる。なお、幹細胞とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。幹細胞としては、胚性幹（ＥＳ）細胞や組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞などがある。自己複製能を有し、多分化能を有すれば、人工的に作製した細胞、たとえば、融合細胞、再プログラム化された細胞、人工多能性幹細胞なども、幹細胞に含まれる。
（７）人工基底膜
本発明では、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを使用して、人工基底膜を調製することができる。なお、人工基底膜とは、生体の基底膜を模したものであり、例えば、前記細胞培養プレートは、人工基底膜を表面に有する細胞培養プレートである。
【００６６】
このような人工基底膜は、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを平板に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これによりして３次元ゲルを形成することを特徴とする。
【００６７】
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、平板に載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートし、前記平板から前記３次元ゲルを回収する点にある。これにより、３次元ゲルのみからなる人工基底膜を調製することができる。
【００６８】
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、平板に、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルからなる人工基底膜を形成することができる。
【実施例】
【００６９】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
(製造例１)
牛の真皮を５％の食塩水で洗浄して可溶性タンパクを除去した。この牛皮を、ｐＨ８のトリプシン水溶液に浸し、随時撹拌しながら２５℃で９０時間放置した。ついで、牛皮を流水で水洗して酵素を除去し、ｐＨ２〜３の酢酸酸溶液に浸漬し、２０〜２５℃で２４時間撹拌して粘稠な溶液を得た。抽出したＩ型コラーゲンは、酸性、中性下での塩析を繰り返して精製した。
【００７０】
このＩ型コラーゲンを、濃度０．１％に調整し、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した。前記加温により会合して線維状構造物を形成し、肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維が形成された。
【００７１】
なお、得られたＩ型コラーゲンを５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、α１、α２の２種類の異なったα鎖、およびα鎖の２量体であるβ鎖の存在が確認された。結果を図１のＢに示す。
(製造例２)
５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで牛眼球レンズカプセルを洗浄した。続いて抽出工程として、前記眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの０．５Ｍの酢酸を添加してホモジナイズし３日間、4℃で撹拌した。遠心分離後、上澄みを４℃で保存した。上澄みを１ｍＭの塩酸で透析して前記インヒビターを除去してＩＶ型コラーゲンを得た。なお、ＩＶ型コラーゲンは、凍結乾燥して保存した。
【００７２】
上記ＩＶ型コラーゲンを濃度１ｍｇ／ｍｌ、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６に調整し、４℃、５日放置したところ会合してゲル化した。
得られたＩＶ型コラーゲンで、還元状態の５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、１６０〜１８０ｋＤａ付近に３本のＩＶ型コラーゲンα鎖由来のバンドが見られた。結果を図１のＣに示す。
（実施例１）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとからコラーゲン混成ゲルを作成した。
【００７３】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。
【００７４】
（２） この溶液をエッペンドルフチューブに入れ、５％ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
その後、ゲル上に静かにジルコニアビーズをのせ、１時間後に観察した。ゲルが形成され、図２のＡのようにビーズがゲルの上面に保持された。なお、ゲル形成が不十分な場合には、図２のＢに示すようにビーズが低面に落下する。なお、図２のＣは、これを模式的に示す図である。
（実施例２）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混合物およびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとから本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを作成した。
【００７５】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。
【００７６】
（２） 前記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートを、ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例１）
コラーゲンＩ型ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンからＩ型コラーゲンゲルを作成した。
【００７７】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１３６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加した。ｐＨを確認したところ、ｐＨ７．６であった。
【００７８】
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例２）
Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンより混成コラーゲンゲルを作成した。酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有しなかった。
【００７９】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１１２μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（胎盤より、非特許文献１に記載のＳａｇｅらの方法によってペプシン酵素によって抽出した、ゲル化能を有さないＩＶ型コラーゲン：５ｍｇ／ｍｌ）２４μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。ｐＨは７．６であった。
【００８０】
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（実施例３）
実施例２、比較例１、比較例２で作成したゲルコーティングウェルプレートを、下記方法で調製した後に走査型電子顕微鏡で観察した。
【００８１】
（１）上記ウェルプレートの各ウェルのゲル上に、２％グルタルアルデヒド５０μｌを添加し、２時間、４℃で静置した。
（２）二次固定として１％四酸化オスミウムを添加し、１時間室温で静置した。
【００８２】
（３）５０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、７０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、８０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、９０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９９．５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行い、脱水を行った。
【００８３】
（４）ついで、ｔ−ブチルアルコール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行って置換した。
（５）置換後、終夜凍結乾燥した。
【００８４】
（６）凍結乾燥サンプルを、２０秒白金コートした後、１５ｋＶ、１００００倍で走査型電子顕微鏡（ＪＣＭ−５７００（ＪＥＯＬ））で観察した。結果を図３に示す。実施例２のゲルを図３Ａに、比較例１のゲルを図３Ｂに、比較例２のゲルを図３Ｃに示す。
【００８５】
(結果)
（１） 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲンは線維状であり、実施例２、比較例１、比較例２の各ゲルでは、いずれも線維状物が観察された。各ゲルは、Ｉ型コラーゲンの線維状物によって基本構造が構築されると推察される。
【００８６】
（２） 図３Ａに示すように、実施例２の本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、Ｉ型コラーゲン線維と共に膜状の構成物が観察された。図３Ｂとの比較により、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンは線維形成能を有するＩ型コラーゲンと混合することで、Ｉ型コラーゲン線維間に膜状物を形成しうることが判明した。
【００８７】
（３） 一方、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲン線維とゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを加えた比較例２のゲルは、線維状の構造物のみであり、膜状の構造物は存在しなかった。ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンはゲル化能を有するものと会合能が相違し、Ｉ型コラーゲンからなる線維と線維との間にＩＶ型コラーゲンによる膜状物を形成することができなかった。
（実施例４）
（１）製造例１で得たＩ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）に、製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを、氷冷しつつ０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ加えた。
【００８８】
（２）実施例１と同様に操作して、氷冷しながら塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、その後、３７℃で１時間インキュベートを行ってゲル化させた。
（３）得られたゲルをＰＢＳで３回洗浄した後に、５０μｇ／ｍｌとなるようにラミニン１１１またはラミニン５１１溶液を添加した。
【００８９】
（４）３７℃で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳで２０分間、３回洗浄した。その後、ゲルを２倍濃度の還元バッファー（メルカプトエタノール含有）に溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルに結合したラミニンをウェスタンブロットで検出した。結果を図４に示す。
【００９０】
（５）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルに、ラミニン１１１、ラミニン５１１を添加したものを、実施例４と同様の方法で固定化した後に、実施例４と同様に走査型電子顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。
(比較例３)
製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンに代えて、ゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）を１．０ｍｇ／ｍｌ加えた以外は、実施例４と同様に操作してゲルを調製し、実施例４と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図４に示す。
(結果)
（１） 図４のＡは、線維形成能を有するＩ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＢは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＣは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＤは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルである。
【００９１】
図４のＡ〜Ｃから、Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルでは、Ｉ型コラーゲンに対する前記ＩＶ型コラーゲンの混合量に応じて、ラミニンの結合量が増加した。このようなラミニンの結合量の増加は、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方で同様に観察された。
【００９２】
（２） 図４のＣと図４のＤとの比較から、Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルでは、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方でその結合量が少なかった。このことから、抽出方法の異なるＩＶ型コラーゲンは、ラミニンの結合量が相違することが判明し、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用することでＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにラミニンを効率的に組込めることが推察された。
【００９３】
（３） 図５Ａは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルにラミニン１１１を添加したものであり、図５Ｂは、ラミニン５１１を添加したものである。図５Ａ、図５Ｂの双方において、ラミニンの添加によって線維間に膜状物の形成が観察された。一方、図５Ａでは均一に線維間に薄い膜構造が形成されるのに対し、図５Ｂでは、図５Ａよりも均一性が低く、添加したラミニンの種類によってＩ型ゲルに付随する膜構造が異なっていた。
（実施例５）
（１） Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの配合割合を３：１に変更した以外は、実施例２と同様の方法でＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製し、実施例２と同様にしてゲルコーティングウェルプレートを製造した。
【００９４】
（２） グラスゴー最小必須培地（ギブコ社製）に、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムを添加して培地を調製した。
【００９５】
ＥＳ細胞株（ｈｔ７）を、３．８×１０3ｃｅｌｌｓ／９６ウェル分注し、３７℃、５％、ＣＯ2条件下で５日間培養して自発的に分化させた。
１日１回の頻度で培地交換行うと共に、細胞の形態を観察した。
【００９６】
ＥＳ細胞コロニーの形態を図６に示す。
また、培養５日目の細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって分化マーカー遺伝子の発現を調べた。遺伝子発現レベルを図７に示す。
(比較例４)
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに代えて、比較例１のコラーゲンＩ型ゲル、比較例２のＩ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルを使用した以外は実施例５と同様に操作してゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。また、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン製）を終濃度５ｍｇ/ｍｌで５０μｌ／ウェル加え、３７℃１時間ゲル化させたゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。
【００９７】
また、実施例５と同様にして、各ゲルコートウェルプレートについて、ＥＳ細胞コロニーの形態と遺伝子発現レベルとを観察した。
(結果)
コロニーの形態観察
（１） 図６Ａは、比較例１のＩ型コラーゲンゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｂは、実施例２のＩ型−ゲル化能を有するＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｃは比較例２のＩ型−酵素抽出ＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６ＤはマトリゲルでのＥＳ細胞のコロニーである。
【００９８】
図６Ａに示すように、Ｉ型コラーゲンゲルでは比較的少数の大きいコロニーが形成されていた。一方、図６Ｂに示すように、本発明のＩ型−ＩＶ型混成ゲルでは比較的小型のコロニーが多数個形成されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンの配合によって、ＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。
【００９９】
（２） 図６Ｃのゲルは、Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型混成ゲルである。図６Ｃのコロニーは、比較的大きなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと相違する。図６Ｂのコロニーは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルであり、ＩＶ型コラーゲンの抽出方法によって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル上でのＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。特に、図６Ｃのゲルにはゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンが含まれる点で図６Ａのゲルと相違するが、両者のコロニーは比較的大きなものが散在する点で共通する。このことは、図６Ｃで使用した酵素抽出ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの混成ゲルでは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルで惹起されるＥＳ細胞の応答がみられないことを示している。
【０１００】
（３） 図６Ｄは、マトリゲルでＥＳ細胞を培養したコロニーであり、前記ゲルには、基底膜の構成成分であり、上皮細胞の接着を支持し、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されている。図６Ｄのコロニーは、小さなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと共通する。このことは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが、それ自体で、基底膜成分が配合されたゲルと類似するＥＳ細胞の応答を惹起できることを示すものである。
マウスＥＳ細胞の分化マーカー遺伝子発現の解析
（１） マウスＥＳ細胞、実施例５で培養したＥＳ細胞、比較例４で培養したＥＳ細胞について、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５、および中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現を観察した。図７Ａは、Ｏｃｔ−３／４の発現を、図７Ｂは、Ｆｇｆ５の発現を、図７Ｃは、Ｆｌｋ１の発現を示す図である。
【０１０１】
図７Ａに示すように、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４の発現は、いずれのゲルでもＥＳ細胞より低下していた。いずれのゲルを使用した場合でも、ＥＳ細胞の分化が促進されたことが示唆された。
【０１０２】
（２） 図７Ｂに示すように、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルおよびマトリゲルで強く誘導されていた。マトリゲルには、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンがこれらの成分と同様の外胚葉への分化促進能を有することが示唆された。
【０１０３】
一方、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは、Ｆｇｆ５の発現が低いレベルにとどまっていた。このことは、酵素抽出ＩＶ型コラーゲンによる外胚葉への分化促進能は、Ｉ型コラーゲンと同レベルであることを示唆している。
【０１０４】
（３） 図７Ｃに示すように、中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルでは抑制され、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは発現が亢進していた。このことから、Ｉ型コラーゲンは、中胚葉への分化促進能を有し、かつ酵素抽出ＩＶ型コラーゲンもＩ型コラーゲンと同様の中胚葉への分化促進能を有することが示唆された。
【０１０５】
（４） 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃを比較すると、Ｉ型コラーゲンとＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルとは、Ｏｃｔ−３／４、Ｆｇｆ５、Ｆｌｋ１の発現量がいずれも類似する傾向にあった。また、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルとは、上記３種の発現量がいずれも類似する傾向にあった。このことは、Ｉ型コラーゲンに配合したＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によってＥＳ細胞の分化に対する生理活性が異なることを示すものである。特に、ＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出することで、基底膜成分を含有するマトリゲルと類似する分化能が発揮される点に特徴があった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、簡便な操作によって３次元ゲルを形成することができ、前記３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンに由来するゲル強度を保持し、かつＩＶ型コラーゲンによる基底膜成分としての特性を保持するものであり、これを用いて細胞培養プレートを調製すれば、生体の基底膜の環境に近似した培養環境を安価に提供することができ、有用である。
【技術分野】
【０００１】
ＩＶ型コラーゲンによる基底膜の生理機能を再現でき、かつゲル強度に優れるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル、および前記混成ゲルの調製方法、ならびに前記混成ゲルをコーティングしてなる細胞培養プレートなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の身体は、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織と呼ばれる４種類の組織型を組み合わせて構成され、上皮組織や筋組織が主に細胞で構成されるのに対し、結合組織の主体はコラーゲン線維を主成分とする間質と呼ばれる細胞外マトリックスである。また、前記上皮組織と結合組織との間には基底膜と呼ばれるシート状の細胞外マトリックスが存在し、前記筋組織を構成する細胞も基底膜で周囲を覆われ、血管もその内皮細胞は基底膜で裏打ちされている。更に、神経細胞も、例えば末梢神経の軸索を包むシュワン細胞も基底膜を足場とするなど、多細胞生物を構成する細胞の多くは、基底膜をその足場としている。細胞外マトリックスは、細胞の増殖や生存に必要であり、例えば、動物細胞は培養皿に接着し、足場を形成できないと増殖できないばかりかアポトーシスを起こして自滅する。この現象は、細胞増殖の足場依存性（anchorage dependence of cell growth）と呼ばれ、悪性のがん細胞や血球細胞などを除き、多細胞動物を構成する殆ど全ての細胞で観察される現象である。
【０００３】
このような細胞培養の際に足場となる基底膜は、厚さ１００ｎｍほどの極めて薄いシート状の細胞外マトリックスであり、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどからなり、これらが複合的に結合して３次元構造を構成している。例えば、前記ＩＶ型コラーゲンは、基底膜の形態維持を担う主要な構成成分であり、Ｎ末端領域でジスルフィド結合により架橋された四量体を形成する一方で、Ｃ末端の球状領域でend-to-end型に会合し、このＮ末端領域とＣ末端領域の会合を通じて２次元網目構造を構築している。また、ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、十字形の形をした基底膜成分である。α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在する。これらサブユニットの組み合わせにより現時点では１５種類のラミニンが知られており、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。３本のサブユニット鎖は共通のコイルドコイルドメインを持ち、この領域で会合してヘテロ三量体を形成する。一方、各サブユニットのＮ末端領域は互いに親和性を有し、この領域で会合することで基底膜に自己組織化される。なお、基底面で自己会合したラミニンは、ニドゲンを介してＩＶ型コラーゲンと結合し、ＩＶ型コラーゲンが独立に自己会合して作る網目構造で裏打ちされることで物理的な強度を獲得している。更に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが加わり、基底膜分子間の相互作用とジスルフィド結合や非ジスルフィド結合による分子間架橋により、その構造が安定化される。
【０００４】
従来から、細胞外マトリックスに関する研究は、コラーゲンを中心に進められている。ほ乳類では約３０種類の遺伝的に異なるコラーゲンが発見されており、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型などと発見順に命名されている。それぞれ構造、機能、分布が相違するが、α鎖と呼ばれるポリペプチド鎖が３本、互いに巻きついた右巻きの螺旋構造をとり、前記ポリペプチド鎖は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を示す）の繰り返しからなる基本構造を有する点で共通する。なお、Ｉ型コラーゲンでは、３本螺旋領域の両端に、非螺旋領域であるテロペプチドが存在する。
【０００５】
前記した基底膜を構成する主要なコラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンと同様に３本鎖の螺旋構造を形成するが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ構造が中断する部分を有する点でＩ型コラーゲンと相違する。また、ＩＶ型コラーゲンは、Ｎ末端にシステイン残基を多く含む７Ｓ領域と、分子Ｃ末端に非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）とを有し、これら、７Ｓ領域およびＮＣ１領域を介してＩＶ型コラーゲンの二次元網目構造が形成される点で重要な領域である。
【０００６】
一般に、動物の結合組織のコラーゲンは熱処理によって容易に抽出されるが、この場合にはコラーゲンが熱変性によってその特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。コラーゲンはその立体構造を保ったままでは一般に難溶性であり、コラーゲンを溶液として得るには特別な方法が必要となる。ＩＶ型コラーゲンの抽出方法は、胎盤を材料に用いて、ペプシン処理によって胎盤に含まれるＩ，ＩＩＩ，Ｖ，ＩＶ型コラーゲンを抽出した後に、塩分別、カラム等によってＩＶ型コラーゲンを精製する方法（非特許文献１）や、ほぼＩＶ型のみから構成されている動物眼球のレンズカプセルから酸性溶液中でＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出する方法などが知られている（非特許文献２）。
【０００７】
一方、種々のコラーゲンの中で、例えば、Ｉ型コラーゲンは、動物の皮膚・腱・骨などの結合組織の主要構成成分であり、３本のポリペプチド鎖が互いに巻きついた約３００ｎｍの螺旋構造を有する。この３本螺旋体が互いに１／４．４ずつづれながら会合して細い線維を作り、これが更に平行に並んで束を形成し、強い張力に耐えるコラーゲン線維が形成される。Ｉ型コラーゲンの抽出法としては、動物の骨、皮などの材料として、酸性溶液や酵素処理で抽出する方法や(特許文献１)、アルカリ処理による可溶化法等が知られている(非特許文献３)。
前記したＩ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、細胞外マトリックスの構成成分であり、細胞接着因子として働く。細胞培養の際に細胞培養プレートのコラーゲンコートが行われるのはこのためである。一方、Ｉ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、その抽出方法によって線維形成能やゲル形成能その他が相違し、コラーゲンコートの方法によって前記コート層におけるコラーゲンの形状が相違する。ペプシン処理したＩ型コラーゲンの塩酸溶液を細胞培養プレートの表面にのせ、２５℃の無菌の空気流で乾燥させてなる細胞培養プレート（コラーゲンコートデッシュ）と、前記コラーゲンの塩酸溶液に炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭと、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＦＢＳ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを撹拌してコラーゲン培地液を調製し、これを細胞培養プレートに載せ、３７℃で６時間、ＣＯ2条件下でインキュベートしてなる細胞培養プレート（３次元コラーゲン線維ゲル）と、前記コラーゲン培地液と細胞けん濁液とを混合して細胞培養プレートに固定した細胞培養プレート（細胞含有３次元コラーゲンゲル）との３種類で線維芽細胞を培養したところ、コラーゲンコートデッシュと３次元コラーゲン線維ゲルとでは同じ細胞倍増時間であったが、細胞含有３次元コラーゲンゲルでは１．５倍に延長され、有意な増殖抑制が観察されたとの報告がある（非特許文献４）。
【０００８】
また、Ｉ型コラーゲンのカルシウム、マグネシウム不含有リン酸緩衝液を細胞培養プレートにコートし、２時間室温に載置してなる非線維化コラーゲンと、Ｉ型コラーゲンのＰＢＳ（−）溶液を細胞培養プレートに載せ、３７℃、２時間インキュベートして線維状に会合させた線維状コラーゲンとでケラチノサイトを培養したところ、線維状コラーゲンではアポトーシスが引き起こされ（非特許文献５）、分化が引き起こされることが知られている（非特許文献６）。
【０００９】
なお、ＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートとして、コスモ・バイオ株式会社製の登録商標マトリゲルがある。マトリゲルは、マウスのＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）肉腫という基底膜分子を過剰生産する肉腫の抽出物からなり、さらに、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特公昭３７−１４４２６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓａｇｅ Ｈ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，９８９３−９９００ （１９７９）
【非特許文献２】Ｍｕｒａｏｋａ， Ｍ ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ， Ｔ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１４，３５８−３６２ （１９９３）
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｉ， Ｔ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， Ｃｈｅｍ．３５０，１２５７−１２６５ （１９６９）
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｔｒｉｘ， ９，１９３−１９９ （１９８９）
【非特許文献５】Ｆｕｊｉｓａｋｉ， Ｈ． ａｎｄ Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｓ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２８０，２５５−２６９ （２００２）
【非特許文献６】Ｆｕｊｉｓａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ４９，４２６−４３６ （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
コラーゲンコートした細胞培養プレートを使用して細胞培養を行うと、培養細胞は表面にあるコラーゲン受容体であるインテグリンを介してコラーゲン分子に接着し、細胞培養プレート上で増殖する。上皮細胞の幹細胞の維持や分化、増殖には基底膜の存在が必須であり、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートが使用されることが望ましい。
【００１３】
また、コラーゲンは調製方法によって３次元構造を形成し、細胞培養プレートにコートした場合も３次元構造をとりうるか否かによって培養細胞の増殖や分化に相違が生じる。基底膜は、その主成分であるＩＶ型コラーゲンが網目状に広がって構成されるが、細胞培養プレートの表面にＩＶ型コラーゲンの網目構造を再現できれば、より生体の基底膜に近似した細胞増殖環境を形成することができる。
【００１４】
しかしながら、ＩＶ型コラーゲンは、動物の胎盤や眼球のレンズカプセルを抽出原料とするため、大量に製造することが困難である。例えば、市販の登録商標マトリゲルは、マウスのＥＨＳ肉腫からの抽出物であるが、正常細胞の培養には、正常個体から抽出したＩＶ型コラーゲンの使用が好ましく、原料の入手が容易でない。また、ＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によっては、分子相互作用が弱いためゲル化による網目構造を形成することができず、ゲル化する場合でも温度４℃で５日以上静置しなければ網目構造を形成しない。このため、３次元構造の形成に長時間を要し、ＩＶ型コラーゲンによる実質的な３次元構造の形成は容易でない。市販のマトリゲルでは、電子顕微鏡写真によるＩＶ型コラーゲンによる網目状構造を観察することはできない。したがって、ＩＶ型コラーゲンの使用量を低減し、かつ基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性し、簡便に３次元構造を形成することができ、基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性をするＩＶ型コラーゲン含有ゲルの開発が望まれる。
一方、Ｉ型コラーゲンはゲル強度が高く、比較的容易に抽出や精製が行えるため、コラーゲン３次元培養基質として広く使用することができる。
【００１５】
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは基底膜としての機能を有しておらず、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。
【００１６】
また、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してそのゲル強度を高めようとしても、Ｉ型コラーゲンは３７℃で会合体を形成してゲル化し、これより温度を下げると分子分散した溶液となり会合体を形成することができず、一方、ＩＶ型コラーゲンの会合温度は３７℃より低温の４℃である。実際、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる混成ゲルは知られておらず、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとによって３次元ゲルを形成する方法も存在しない。
【００１７】
従って、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して、均一な３次元構造を形成することができ、かつＩＶ型コラーゲンの機能が発揮される、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルの開発が望まれる。
また、基底膜は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの様々な器官の細胞の足場となり、その増殖や分化を調節している。細胞培養プレートとして生体の基底膜に近似した環境を形成することができれば、より生体環境に近い培養を行うことができる。このような基底膜には、ＩＶ型コラーゲンのほかにラミニンが必須の成分として含有されるため、使用するＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにもラミニンが含有されることが好ましい。
【００１８】
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは、会合によって線維化するがこのような線維状コラーゲンに対するラミニンの結合力は弱い。したがって、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してなる混成ゲルからなり、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲル、並びにこのような混成ゲルを使用してなる細胞培養プレートの開発が望まれる。
上記現状に鑑みて、本発明は、ＩＶ型コラーゲンの基底膜の構成成分としての特性を保持し、ゲル強度に優れ、３次元構造を形成しうるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明は、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合し、３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供することを目的とする。
【００２０】
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを細胞培養プレートの表面にコートしてなる細胞培養プレートを提供することを目的とする。
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のＩ型コラーゲンと特定のＩＶ型コラーゲンとを特定条件下で混合したところ、短時間に、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物にＩＶ型コラーゲンによる膜状構造物が結合した３次元ゲルを形成することができること、このような混成３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの使用量が低減されたにもかかわらず、基底膜に含まれるＩＶ型コラーゲンと近似する特性を有すること、この混成３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンと相違して、ＩＶ型コラーゲンの配合量に対応するラミニンを結合することができ、より基底膜に近似する細胞培養環境を形成しうること、このような混成ゲルを細胞培養プレートにコートしてなる細胞培養プレートは、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルが形成されるため、極めて基底膜に近似した細胞培養プレートとなりうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
【００２２】
また本発明は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合していることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
【００２３】
本発明は、更に、ラミニンを含有することを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが細胞培養用の支持体にコーティングされたことを特徴とする、細胞培養プレートを提供するものである。
【００２４】
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供するものである。
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。
【００２５】
本発明は、更に、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。
【００２６】
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。
【００２７】
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。
【００２８】
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法を提供するものである。
【００２９】
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記人工基底膜の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによれば、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンと、線維形成能を有するＩ型コラーゲンとを混合することで、収量の少ないＩＶ型コラーゲンの使用量を減らし、ゲル強度に優れ、かつＩＶ型コラーゲンの特性を有する混成ゲルを提供することができる。
【００３１】
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、短時間に、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができる。
【００３２】
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができ、この混成ゲルを細胞培養プレートにコートすることで、より生体の基底膜に近似する細胞培養プレートを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図でり、Ａは、コラーゲンの分子量マーカーであり、Ｂは、製造例１で得た線維形成能を有するＩ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂは、製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】図２は、３次元ゲルを調製した場合のゲル強度を評価する方法を説明する図であり、Ａは、エッペンドルフチューブで形成した実施例１で得たＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルの上にビーズが保持される態様を、Ｂはビーズが底に落下する態様を示し、Ｃは、その模式図である。
【図３】図３は、実施例２、比較例１、比較例２で作成したゲルコーティングウェルプレートの走査型電子顕微鏡写真である。図３Ａは、実施例２、図３Ｂは比較例１、図３Ｃは比較例２の結果を示す。
【図４】Ａ、Ｂ、Ｃは、ＩＶ型コラーゲンの配合量の異なる本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに対するラミニンの結合量を評価したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、Ｄは、ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンを使用した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】図５Ａは、実施例４、図５Ｂは比較例３のゲルの走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実施例５で形成したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを使用して製造したゲルコーティングウェルプレートでＥＳ細胞を培養したＥＳ細胞コロニーの形態を示す図である。図６Ａは、比較例１のＩ型コラーゲンゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｂは、実施例２のＩ型−ゲル化能を有するＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｃは比較例２のＩ型−酵素抽出ＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６ＤはマトリゲルでのＥＳ細胞のコロニーである。
【図７】図７Ａは、Ｏｃｔ−３／４の発現を、図７Ｂは、Ｆｇｆ５の発現を、図７Ｃは、Ｆｌｋ１の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の第１は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルである。
【００３５】
基底膜による細胞培養環境を提供するには、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンを使用することが好ましいが、ＩＶ型コラーゲンは供給量が少なくかつゲル化能も弱い。本発明によれば、少量のＩＶ型コラーゲンにＩ型コラーゲンを混合することで、ＩＶ型コラーゲンの特性を維持したままゲル強度に優れる混成コラーゲンを提供することができる。なお、後記する実施例に示すように、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮するには、ＩＶ型コラーゲンが、上記混成ゲルの中で網目構造を形成する必要がある。従来から、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの混合や、得られた混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法、更には、このような混成ゲルが基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンの特性を維持しうることは、全く知られていなかった。本発明では、ＩＶ型コラーゲンとしてゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用し、Ｉ型コラーゲンとして線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用し、かつ前記ＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、前記Ｉ型コラーゲンを１００〜５００質量部、より好ましくは１００〜３００質量部、混合してなる混成ゲルを提供する。この混成ゲルは、所定条件下で簡便に３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有することが判明した。以下、本発明を詳細に説明する。
（１）線維形成能を有するＩ型コラーゲン
本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が３重螺旋を巻いたものの総称であり、コラーゲン分子は１種類のα鎖からなっていてもよく、別々の遺伝子にコードされた複数種のα鎖からなっていてもよい。α鎖は、通常、α１，α２，α３のようにαの後に数字をつけてよび，さらにコラーゲンの型をつけて，α１（Ｉ）などと称する。本発明では、線維形成能を有するものであれば、例えば、［α１（Ｉ）2α２（Ｉ）］のような天然に存在するＩ型コラーゲンのほか、天然に存在しないような組み合わせの三量体であってもよい。
【００３６】
本発明で使用するＩ型コラーゲンは、線維形成能を有することを特徴とする。線維状のＩ型コラーゲンにＩＶ型コラーゲンを膜状に結合することで、ＩＶ型コラーゲンの基底膜成分の特性が発揮されることが判明したからである。なお、使用するＩ型コラーゲンが線維形成能を有するか否かは、濃度０．１％のＩ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した場合に、会合構造により肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維を形成する場合に線維形成能ありとして確認することができる。
一般に、Ｉ型コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、３本螺旋構造を有し、かつ線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用する点に特徴がある。このようなＩ型コラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、（１）酸性溶液を用いる方法、（２）酵素処理する方法、（３）アルカリ処理による可溶化法等がある。
【００３７】
（ｉ）酸性溶液処理法
Ｉ型コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱を例示することができる。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するため好ましいが、線維形成能を有するＩ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。
【００３８】
例えばウシの真皮を使用する場合には、蛋白質分解酵素阻害剤を加えた食塩を含まない、リン酸緩衝液、もしくはトリス緩衝液（ｐＨ７．６）をもちいてよく洗浄する。または石灰漬によって脱毛処理を行ったのち塩酸で中和水洗した牛皮を使用することができる。
【００３９】
前記した下処理を行った牛皮を１ｃｍ角程度に細切し、組織質重量に対して１０倍の０．５Ｍ酢酸を加え４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。抽出後、遠心分離によって溶け残りの組織を除く。遠心分離によって得た溶液には最終濃度２Ｍとなるように食塩を加えることで、Ｉ型コラーゲンを沈殿させる。さらに上記Ｉ型コラーゲンの沈殿を０．０５Ｍの酢酸に再溶解し、最終濃度１Ｍとなるように食塩を加え、遠心分離によって粗Ｉ型コラーゲンの沈殿を得る。その後、必要に応じてトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に沈殿を溶解し、中性塩分別を行うとＩ型コラーゲンをさらに精製することができる。
【００４０】
上記酸性溶液を使用する方法では、３本螺旋領域の両端の非螺旋領域であるテロペプチドを含む、生体内に存在するコラーゲン分子と同じ状態のコラーゲンを得ることができる。
【００４１】
（ｉｉ）酵素処理法
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、ｐＨ２〜３の塩酸酸性ペプシン溶液に浸し、随時撹拌しながらＩ型コラーゲンの収縮温度である４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。ペプシンにより不溶性コラーゲンが酵素で処理され、不溶性コラーゲンが溶解する。
【００４２】
ついで、０．００５Ｎの塩酸溶液を追加してＩ型コラーゲンの変性温度である３７℃以下、より好ましくは２０〜２５℃で１２〜６０時間撹拌すると、Ｉ型コラーゲンが溶解する。酸溶液としては、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、他の有機酸を好適に使用することができる。
【００４３】
この溶液をろ過し、ろ液を水酸化ナトリウムなどのアルカリでｐＨ６〜８に中和してペプシンを不活化する。その後、再び溶液を酸性に戻し、２モルの食塩を加えてコラーゲンを沈殿させる。その後の操作は上記（ｉ）の酸性溶液処理法と同様にして、粗Ｉ型コラーゲンや精製Ｉ型コラーゲンを得ることができる。
【００４４】
（ｉｉｉ）アルカリ溶液処理
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、１５％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム含有５％水酸化ナトリウムなどの、硫酸ナトリウム含有アルカリ溶液で処理する。３本螺旋構造を維持したコラーゲンを抽出することができる。アルカリ処理の方法は、抽出効率が高い点で優れる。
Ｉ型コラーゲンは、コラーゲンへリックス領域の両端に、螺旋構造をとらない数十残基のアミノ酸からなるテロペプチドが結合し、テロペプチド部分が除去されたコラーゲンをアテロコラーゲンと称する。上記した（ｉｉ）の酵素処理法によるとアテロコラーゲンとしてＩ型コラーゲンを得ることができる。本発明で使用するＩ型コラーゲンとしては、３本螺旋構造を維持でき、かつ線維形成能を有すれば、テロペプチドが除去されたアテロコラーゲンであってもよい。
【００４５】
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、線維形成能を有するＩ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（２）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン
本願明細書において「ＩＶ型コラーゲン」とは、基底膜を構成する主要なコラーゲンであり、その分子は、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインからなっており、Ｎ末端の７Ｓで４分子が重合し、Ｃ末端のＮＣ１で２分子が重合することにより、網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価な分子をいう。ＩＶ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
【００４６】
本発明で使用するＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有することを特徴とする。ゲル化能によって、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に結合させることができる。後記する実施例に示すように、ゲル化能がないＩＶ型コラーゲンを使用すると、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に形成することができず、ＩＶ型コラーゲンとしての特性も発揮することができない。
【００４７】
なお、使用するＩＶ型コラーゲンがゲル化能を有するか否かは、濃度１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有、中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で４℃、５日放置した後に、溶液がＩＶ型コラーゲンの会合によって流動性を失った場合に、ゲル化能ありとして確認することができる。
このようなゲル化能のあるＩＶ型コラーゲンは、酸性溶液を使用して抽出することができる。
【００４８】
まず、ＩＶ型コラーゲンの抽出原料としては、ウシ、ブタ、ウマ等の眼球レンズカプセルや胎盤を例示することができる。特に、眼球レンズカプセルを使用することが好ましい。回収率および純度が高いからである。ただしＩＶ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。
【００４９】
抽出処理方法を以下に示す。
例えば、凍結ウシの眼球レンズカプセルを使用する場合には、解凍後に、まず洗浄工程として、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで眼球レンズカプセルを洗浄する。続いて抽出工程にはいる。眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの１ｍＭの塩酸を添加してホモジナイズし２〜３日間、4℃で静置する。遠心分離後、上澄みを４℃で保存する。上澄みを０．５Ｍの酢酸で透析して前記インヒビターを除去し、ついで凍結乾燥してＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
【００５０】
なお、後記する実施例に示すように、眼球レンズカプセルから抽出したＩＶ型コラーゲンは、α鎖由来のバンドが存在する。１００ｋＤａ以下のコラーゲン由来でない不純物が含まれる場合には、ＤＥＡＥセファロース等のイオン交換樹脂により精製し、純度の高いＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
ＩＶ型コラーゲンは、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインを有し、分子Ｎ末端はシステイン残基を多く含む７Ｓ領域を、分子Ｃ末端は非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）を有し、７Ｓ領域およびＮＣ１領域は、コラーゲン分子が相互作用して基底膜構造を形成するのに重要な役割をもっている。本発明では、ゲル化能を有すれば、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインの全てを有している必要はない。
【００５１】
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（３）ラミニン
ラミニンは、基底膜の構成成分である。ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在し、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。例えば、サブユニットαがα１であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンを、ラミニン１１１と称し、サブユニットαがα２であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンをラミニン２１１と称する。理論上は、サブユニットの組み合わせによって、４５種のラミニンが存在しうる。本発明で使用できるラミニンは、現時点で知られている以下に示す１５種類ラミニン１１１，２１１，１２１，２２１，３３２，３１１，３２１，４１１，４２１，５１１，５２１，２１３，４２３，５２３，３３３のほかに、これから見出されうる他のラミニンを含むことができる。更に、臓器、細胞分泌物からの精製品のほか、リコンビナントラミニンであってもよい。
【００５２】
ＩＶ型コラーゲンは基底膜に普遍的に存在するが、ラミニンの構成サブユニット鎖は、臓器、発生の段階によって相違する。ＩＶ型コラーゲンが基底膜成分として細胞間に共通な基底膜特有の細胞制御を担当し、ラミニンはさらに臓器・発生段階に特徴的な微妙な細胞機能の制御を分担して行っている可能性がある。例えば、ラミニンは、細胞受容体であるインテグリン、ジストログリカン、シンデカンと結合し細胞の分化、増殖を制御していると考えられる。したがって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに種々のラミニンを結合することで、培養細胞の分化や増殖を制御することができる。
（４）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる。前記したように、上記範囲で配合した混成ゲルは、所定条件下で、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合する３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有する。
【００５３】
従来から、３次元細胞培養の基材としてはＩ型コラーゲンが利用されてきたが、Ｉ型コラーゲンは基底膜の特性を有しておらず、再生医療などで必要となるＥＳ細胞の培養には最適とはいえない。従って、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル強度に優れＩＶ型コラーゲンの特性を維持でき、生体の基底膜に近似した細胞培養環境を提供することができる。
また、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ラミニンなどの他の基底膜成分を結合することができる。生体の基底膜では、ＩＶ型コラーゲンの網目構造とラミニンとが複合的に結合して、基底膜の立体構造を形成している。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに更にラミニンを結合することで、より基底膜に近似する細胞培養環境を提供することができる。ラミニンの結合量は、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜１５０μｇ／ｍｌとする。なお、結合させるラミニンの種類には特に制限はなく、その目的に応じて、各種のラミニンから選択して結合させることができる。
なお、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、含水ゲルである。前記Ｉ型コラーゲンと前記ＩＶ型コラーゲンとの配合割合は上記の範囲であるが、混成ゲルに含まれる前記Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの総濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜８ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｍｌである。この範囲で、基底膜に近似するゲル強度を確保し、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮することができる。
【００５４】
一方、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを形成した後にこれを乾燥および凍結してもよい。これにより、高度の保存性を確保することができる。なお、ついで培養液など添加することで、再度３次元ゲルを形成することができる。
（５）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを使用するが、簡便な方法で３次元ゲルを形成することができることが判明した。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法には、特に限定はないが、以下の方法を好適に使用することができる。すなわち、
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより、３次元ゲルを形成することができる。
(ｉ)ＩＶ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩＶ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。ＩＶ型コラーゲンは、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。
（ｉｉ）Ｉ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。Ｉ型コラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンと同様に、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、ＩＶ型コラーゲン溶液と同様に、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。Ｉ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｉｉ）混成コラーゲン溶液の調製
前記濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対し、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で混合して混成コラーゲン溶液を得る。上記温度であれば、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの双方をゲル化させずに混合することができる。なお、得られるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにおける各コラーゲンの配合割合は、前記ＩＶ型コラーゲン溶液とＩ型コラーゲン溶液との配合量を上記範囲で選択することで調整することができる。ＩＶ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｖ）混成コラーゲン緩衝溶液の調製
本発明では、上記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％とし、かつ溶液を中性にする。
【００５５】
Ｉ型コラーゲンから線維状構造物を形成する方法としては、前記非特許文献４に記載されるように、Ｉ型コラーゲンの塩酸溶液に、炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭなどを添加して３７℃で６時間、５％ＣＯ2条件下でインキュベートする方法が知られているが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して３次元ゲルが形成されることは全く知られていない。本発明では、温度０〜４℃で、前記混成コラーゲン溶液に上記塩化ナトリウム濃度の中性緩衝液を添加することで、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンの双方のゲル化を防止しつつ各コラーゲンを均一に混合し、併せて溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％に調整する。
【００５６】
なお、塩化ナトリウム含有中性緩衝液の調製に使用する中性緩衝液としては、ｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であり、最も好ましくはｐＨ７．６の緩衝液であり、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液を使用することができる。また、塩化ナトリウムの濃度は、生理食塩水の塩濃度である０．９質量％の５〜２０倍、より好ましくは７〜１５倍の塩濃度とする。例えば、塩化ナトリウム９質量％を含有する塩化ナトリウム含有中性緩衝液を使用する場合には、この１／１０を使用することで、簡便に０．９質量％に調製することができる。
（ｖ）３次元ゲル化
前記混成コラーゲン緩衝溶液を、温度３０〜４０℃、より好ましくは３５〜３７℃に１０分〜２時間、より好ましくは３０〜６０分インキュベートする。この工程により、従来、４℃でなければ会合しなかったＩＶ型コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンが共存することで会合してゲル化することが判明した。すなわち、Ｉ型コラーゲンの線維化温度である３７℃で、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを同時にゲル化させることができる。しかも、従来の方法では、ＩＶ型コラーゲンをゲル化させるために５日間という長時間を要したが、本発明によれば、２時間以内という極めて短時間にゲル化できるのである。しかも、その３次元構造は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造にＩＶ型コラーゲンによる膜状物が形成されたものであり、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの網目構造に類似する。この結果、本発明の混成ゲルは、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの特性をよく保持することができる。
（ｖｉ）ラミニンの添加
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、基底膜成分であるラミニンを添加することができ、これにより、より基底膜に近似する混成ゲルを調製することができる。
【００５７】
ラミニンを結合する方法にも、特に限定はないが、好ましくは、前記３次元ゲルを形成した後に、３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートする。基底膜では、ラミニンも会合体を形成するが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルにおいて、ラミニンが結合するか否かは不明であった。本発明では、混成コラーゲン溶液にラミニン溶液を混合するのではなく、一端、３次元ゲルを形成した後にラミニン溶液を添加し、これを上記条件でインキュベートすることで、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにラミニンを結合しうることを見出した。
【００５８】
なお、ラミニンを添加するＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを構成するためラミニンを添加した後にこれを撹拌することはできない。しかしながら、３次元ゲル上にラミニンを重層してインキュベートすると、重層したラミニンがゲルと結合し、保持される。インキュベートしたのち、緩衝液や細胞培養液で３次元ゲルを洗浄すれば、ラミニン結合Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製することができる。
【００５９】
ラミニンは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などに溶解したものを使用することが好ましい。
（６）細胞培養プレート
本発明における細胞培養プレートを構成する支持体とは、細胞培養に使用され、かつＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを固定できるものを広く含む。したがって、チップ、アレイ、マイクロタイタープレートやマイクロウェルプレートなどのプレート、シャーレ、スライドグラス、フィルム、ビーズなども含まれる。
【００６０】
また、支持体への固定方法は化学的結合のほかに物理的な結合であってもよい。支持体として使用する材料としては、例えば、ガラス、天然および合成ポリマー、金属（合金も含まれる）などを例示することができ、これらは２種以上を組み合わせてなる複合体であってもよい。
【００６１】
前記ポリマーとしては、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどを例示することができる。
【００６２】
また、本発明では、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜も支持体として使用することができる。
本発明の細胞培養プレートは、細胞培養用の支持体に前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルがコーティングされたものである。好ましくは、前記混成ゲルが３次元ゲルを形成するものである。３次元ゲルによってＩＶ型コラーゲンの特性が発揮され、基底膜に近似する培養環境を形成しうるからである。なお、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、前記支持体の全面にコーティングされている必要はなく、少なくとも細胞培養面にコーティングされていればよい。
本発明の細胞培養プレートは、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
【００６３】
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養プレートに載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより３次元ゲルを形成することを特徴とする。
【００６４】
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、細胞培養プレートに載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする点にある。これにより、細胞培養プレート上に３次元ゲルを形成することができる。
【００６５】
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、細胞培養プレートに、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルを形成することができる。
本発明の細胞培養プレートを使用して、幹細胞を培養することができる。なお、幹細胞とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。幹細胞としては、胚性幹（ＥＳ）細胞や組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞などがある。自己複製能を有し、多分化能を有すれば、人工的に作製した細胞、たとえば、融合細胞、再プログラム化された細胞、人工多能性幹細胞なども、幹細胞に含まれる。
（７）人工基底膜
本発明では、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを使用して、人工基底膜を調製することができる。なお、人工基底膜とは、生体の基底膜を模したものであり、例えば、前記細胞培養プレートは、人工基底膜を表面に有する細胞培養プレートである。
【００６６】
このような人工基底膜は、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを平板に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これによりして３次元ゲルを形成することを特徴とする。
【００６７】
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、平板に載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートし、前記平板から前記３次元ゲルを回収する点にある。これにより、３次元ゲルのみからなる人工基底膜を調製することができる。
【００６８】
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、平板に、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルからなる人工基底膜を形成することができる。
【実施例】
【００６９】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
(製造例１)
牛の真皮を５％の食塩水で洗浄して可溶性タンパクを除去した。この牛皮を、ｐＨ８のトリプシン水溶液に浸し、随時撹拌しながら２５℃で９０時間放置した。ついで、牛皮を流水で水洗して酵素を除去し、ｐＨ２〜３の酢酸酸溶液に浸漬し、２０〜２５℃で２４時間撹拌して粘稠な溶液を得た。抽出したＩ型コラーゲンは、酸性、中性下での塩析を繰り返して精製した。
【００７０】
このＩ型コラーゲンを、濃度０．１％に調整し、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した。前記加温により会合して線維状構造物を形成し、肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維が形成された。
【００７１】
なお、得られたＩ型コラーゲンを５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、α１、α２の２種類の異なったα鎖、およびα鎖の２量体であるβ鎖の存在が確認された。結果を図１のＢに示す。
(製造例２)
５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで牛眼球レンズカプセルを洗浄した。続いて抽出工程として、前記眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの０．５Ｍの酢酸を添加してホモジナイズし３日間、4℃で撹拌した。遠心分離後、上澄みを４℃で保存した。上澄みを１ｍＭの塩酸で透析して前記インヒビターを除去してＩＶ型コラーゲンを得た。なお、ＩＶ型コラーゲンは、凍結乾燥して保存した。
【００７２】
上記ＩＶ型コラーゲンを濃度１ｍｇ／ｍｌ、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６に調整し、４℃、５日放置したところ会合してゲル化した。
得られたＩＶ型コラーゲンで、還元状態の５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、１６０〜１８０ｋＤａ付近に３本のＩＶ型コラーゲンα鎖由来のバンドが見られた。結果を図１のＣに示す。
（実施例１）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとからコラーゲン混成ゲルを作成した。
【００７３】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。
【００７４】
（２） この溶液をエッペンドルフチューブに入れ、５％ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
その後、ゲル上に静かにジルコニアビーズをのせ、１時間後に観察した。ゲルが形成され、図２のＡのようにビーズがゲルの上面に保持された。なお、ゲル形成が不十分な場合には、図２のＢに示すようにビーズが低面に落下する。なお、図２のＣは、これを模式的に示す図である。
（実施例２）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混合物およびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとから本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを作成した。
【００７５】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。
【００７６】
（２） 前記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートを、ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例１）
コラーゲンＩ型ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンからＩ型コラーゲンゲルを作成した。
【００７７】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１３６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加した。ｐＨを確認したところ、ｐＨ７．６であった。
【００７８】
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例２）
Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンより混成コラーゲンゲルを作成した。酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有しなかった。
【００７９】
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１１２μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（胎盤より、非特許文献１に記載のＳａｇｅらの方法によってペプシン酵素によって抽出した、ゲル化能を有さないＩＶ型コラーゲン：５ｍｇ／ｍｌ）２４μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。ｐＨは７．６であった。
【００８０】
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（実施例３）
実施例２、比較例１、比較例２で作成したゲルコーティングウェルプレートを、下記方法で調製した後に走査型電子顕微鏡で観察した。
【００８１】
（１）上記ウェルプレートの各ウェルのゲル上に、２％グルタルアルデヒド５０μｌを添加し、２時間、４℃で静置した。
（２）二次固定として１％四酸化オスミウムを添加し、１時間室温で静置した。
【００８２】
（３）５０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、７０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、８０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、９０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９９．５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行い、脱水を行った。
【００８３】
（４）ついで、ｔ−ブチルアルコール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行って置換した。
（５）置換後、終夜凍結乾燥した。
【００８４】
（６）凍結乾燥サンプルを、２０秒白金コートした後、１５ｋＶ、１００００倍で走査型電子顕微鏡（ＪＣＭ−５７００（ＪＥＯＬ））で観察した。結果を図３に示す。実施例２のゲルを図３Ａに、比較例１のゲルを図３Ｂに、比較例２のゲルを図３Ｃに示す。
【００８５】
(結果)
（１） 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲンは線維状であり、実施例２、比較例１、比較例２の各ゲルでは、いずれも線維状物が観察された。各ゲルは、Ｉ型コラーゲンの線維状物によって基本構造が構築されると推察される。
【００８６】
（２） 図３Ａに示すように、実施例２の本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、Ｉ型コラーゲン線維と共に膜状の構成物が観察された。図３Ｂとの比較により、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンは線維形成能を有するＩ型コラーゲンと混合することで、Ｉ型コラーゲン線維間に膜状物を形成しうることが判明した。
【００８７】
（３） 一方、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲン線維とゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを加えた比較例２のゲルは、線維状の構造物のみであり、膜状の構造物は存在しなかった。ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンはゲル化能を有するものと会合能が相違し、Ｉ型コラーゲンからなる線維と線維との間にＩＶ型コラーゲンによる膜状物を形成することができなかった。
（実施例４）
（１）製造例１で得たＩ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）に、製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを、氷冷しつつ０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ加えた。
【００８８】
（２）実施例１と同様に操作して、氷冷しながら塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、その後、３７℃で１時間インキュベートを行ってゲル化させた。
（３）得られたゲルをＰＢＳで３回洗浄した後に、５０μｇ／ｍｌとなるようにラミニン１１１またはラミニン５１１溶液を添加した。
【００８９】
（４）３７℃で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳで２０分間、３回洗浄した。その後、ゲルを２倍濃度の還元バッファー（メルカプトエタノール含有）に溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルに結合したラミニンをウェスタンブロットで検出した。結果を図４に示す。
【００９０】
（５）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルに、ラミニン１１１、ラミニン５１１を添加したものを、実施例４と同様の方法で固定化した後に、実施例４と同様に走査型電子顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。
(比較例３)
製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンに代えて、ゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）を１．０ｍｇ／ｍｌ加えた以外は、実施例４と同様に操作してゲルを調製し、実施例４と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図４に示す。
(結果)
（１） 図４のＡは、線維形成能を有するＩ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＢは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＣは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＤは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルである。
【００９１】
図４のＡ〜Ｃから、Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルでは、Ｉ型コラーゲンに対する前記ＩＶ型コラーゲンの混合量に応じて、ラミニンの結合量が増加した。このようなラミニンの結合量の増加は、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方で同様に観察された。
【００９２】
（２） 図４のＣと図４のＤとの比較から、Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルでは、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方でその結合量が少なかった。このことから、抽出方法の異なるＩＶ型コラーゲンは、ラミニンの結合量が相違することが判明し、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用することでＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにラミニンを効率的に組込めることが推察された。
【００９３】
（３） 図５Ａは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルにラミニン１１１を添加したものであり、図５Ｂは、ラミニン５１１を添加したものである。図５Ａ、図５Ｂの双方において、ラミニンの添加によって線維間に膜状物の形成が観察された。一方、図５Ａでは均一に線維間に薄い膜構造が形成されるのに対し、図５Ｂでは、図５Ａよりも均一性が低く、添加したラミニンの種類によってＩ型ゲルに付随する膜構造が異なっていた。
（実施例５）
（１） Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの配合割合を３：１に変更した以外は、実施例２と同様の方法でＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製し、実施例２と同様にしてゲルコーティングウェルプレートを製造した。
【００９４】
（２） グラスゴー最小必須培地（ギブコ社製）に、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムを添加して培地を調製した。
【００９５】
ＥＳ細胞株（ｈｔ７）を、３．８×１０3ｃｅｌｌｓ／９６ウェル分注し、３７℃、５％、ＣＯ2条件下で５日間培養して自発的に分化させた。
１日１回の頻度で培地交換行うと共に、細胞の形態を観察した。
【００９６】
ＥＳ細胞コロニーの形態を図６に示す。
また、培養５日目の細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって分化マーカー遺伝子の発現を調べた。遺伝子発現レベルを図７に示す。
(比較例４)
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに代えて、比較例１のコラーゲンＩ型ゲル、比較例２のＩ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルを使用した以外は実施例５と同様に操作してゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。また、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン製）を終濃度５ｍｇ/ｍｌで５０μｌ／ウェル加え、３７℃１時間ゲル化させたゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。
【００９７】
また、実施例５と同様にして、各ゲルコートウェルプレートについて、ＥＳ細胞コロニーの形態と遺伝子発現レベルとを観察した。
(結果)
コロニーの形態観察
（１） 図６Ａは、比較例１のＩ型コラーゲンゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｂは、実施例２のＩ型−ゲル化能を有するＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｃは比較例２のＩ型−酵素抽出ＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６ＤはマトリゲルでのＥＳ細胞のコロニーである。
【００９８】
図６Ａに示すように、Ｉ型コラーゲンゲルでは比較的少数の大きいコロニーが形成されていた。一方、図６Ｂに示すように、本発明のＩ型−ＩＶ型混成ゲルでは比較的小型のコロニーが多数個形成されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンの配合によって、ＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。
【００９９】
（２） 図６Ｃのゲルは、Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型混成ゲルである。図６Ｃのコロニーは、比較的大きなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと相違する。図６Ｂのコロニーは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルであり、ＩＶ型コラーゲンの抽出方法によって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル上でのＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。特に、図６Ｃのゲルにはゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンが含まれる点で図６Ａのゲルと相違するが、両者のコロニーは比較的大きなものが散在する点で共通する。このことは、図６Ｃで使用した酵素抽出ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの混成ゲルでは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルで惹起されるＥＳ細胞の応答がみられないことを示している。
【０１００】
（３） 図６Ｄは、マトリゲルでＥＳ細胞を培養したコロニーであり、前記ゲルには、基底膜の構成成分であり、上皮細胞の接着を支持し、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されている。図６Ｄのコロニーは、小さなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと共通する。このことは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが、それ自体で、基底膜成分が配合されたゲルと類似するＥＳ細胞の応答を惹起できることを示すものである。
マウスＥＳ細胞の分化マーカー遺伝子発現の解析
（１） マウスＥＳ細胞、実施例５で培養したＥＳ細胞、比較例４で培養したＥＳ細胞について、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５、および中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現を観察した。図７Ａは、Ｏｃｔ−３／４の発現を、図７Ｂは、Ｆｇｆ５の発現を、図７Ｃは、Ｆｌｋ１の発現を示す図である。
【０１０１】
図７Ａに示すように、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４の発現は、いずれのゲルでもＥＳ細胞より低下していた。いずれのゲルを使用した場合でも、ＥＳ細胞の分化が促進されたことが示唆された。
【０１０２】
（２） 図７Ｂに示すように、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルおよびマトリゲルで強く誘導されていた。マトリゲルには、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンがこれらの成分と同様の外胚葉への分化促進能を有することが示唆された。
【０１０３】
一方、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは、Ｆｇｆ５の発現が低いレベルにとどまっていた。このことは、酵素抽出ＩＶ型コラーゲンによる外胚葉への分化促進能は、Ｉ型コラーゲンと同レベルであることを示唆している。
【０１０４】
（３） 図７Ｃに示すように、中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルでは抑制され、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは発現が亢進していた。このことから、Ｉ型コラーゲンは、中胚葉への分化促進能を有し、かつ酵素抽出ＩＶ型コラーゲンもＩ型コラーゲンと同様の中胚葉への分化促進能を有することが示唆された。
【０１０５】
（４） 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃを比較すると、Ｉ型コラーゲンとＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルとは、Ｏｃｔ−３／４、Ｆｇｆ５、Ｆｌｋ１の発現量がいずれも類似する傾向にあった。また、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルとは、上記３種の発現量がいずれも類似する傾向にあった。このことは、Ｉ型コラーゲンに配合したＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によってＥＳ細胞の分化に対する生理活性が異なることを示すものである。特に、ＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出することで、基底膜成分を含有するマトリゲルと類似する分化能が発揮される点に特徴があった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、簡便な操作によって３次元ゲルを形成することができ、前記３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンに由来するゲル強度を保持し、かつＩＶ型コラーゲンによる基底膜成分としての特性を保持するものであり、これを用いて細胞培養プレートを調製すれば、生体の基底膜の環境に近似した培養環境を安価に提供することができ、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項２】
Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合していることを特徴とする、請求項１記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項３】
更に、ラミニンを含有することを特徴とする、請求項１または２に記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが細胞培養用の支持体にコーティングされたことを特徴とする、細胞培養プレート。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜。
【請求項６】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
ついで、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法。
【請求項７】
更に、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項６記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法。
【請求項８】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法。
【請求項９】
前記３次元ゲルの形成についで、
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項８記載の細胞培養プレートの製造方法。
【請求項１０】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、
ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法。
【請求項１１】
前記３次元ゲルの形成についで、
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項１０記載の人工基底膜の製造方法。
【請求項１】
ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項２】
Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合していることを特徴とする、請求項１記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項３】
更に、ラミニンを含有することを特徴とする、請求項１または２に記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが細胞培養用の支持体にコーティングされたことを特徴とする、細胞培養プレート。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜。
【請求項６】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
ついで、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法。
【請求項７】
更に、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項６記載のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法。
【請求項８】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法。
【請求項９】
前記３次元ゲルの形成についで、
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項８記載の細胞培養プレートの製造方法。
【請求項１０】
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、
ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法。
【請求項１１】
前記３次元ゲルの形成についで、
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項１０記載の人工基底膜の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−７９７９５（Ｐ２０１１−７９７９５Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３５３４８（Ｐ２００９−２３５３４８）
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 掲載日 平成２１年４月２４日、掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｐ５．ｉｎｆｏｃ．ｎｅｄｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ／ＳｅａｒｃｈＲｅｓｕｌｔＤｅｔａｉｌ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「研究用モデル細胞の創製技術開発／分子構成を最適化した人工基底膜によるＥＳ細胞の分化誘導制御技術の開発」に係る業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５９９０５５４３０）財団法人日本皮革研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 掲載日 平成２１年４月２４日、掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｐ５．ｉｎｆｏｃ．ｎｅｄｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ／ＳｅａｒｃｈＲｅｓｕｌｔＤｅｔａｉｌ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「研究用モデル細胞の創製技術開発／分子構成を最適化した人工基底膜によるＥＳ細胞の分化誘導制御技術の開発」に係る業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５９９０５５４３０）財団法人日本皮革研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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