Ｌ−アミノ酸の製造法
【課題】Ｌ−アミノ酸を効率よく生産する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビブリオ属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン等のアミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属等に属するコリネ型細菌、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、エンテロバクター属、パントエア属、メチロバチルス属、もしくはビブリオ属等に属する細菌、又はペニシリウム等に属する糸状菌を用いた発酵法により生産されている。
【０００３】
微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸の直接発酵法においては、培養時の目的生産物の蓄積による浸透圧上昇により、微生物の活性が低下し、長時間生産性が保てないという長年の課題があった。
ビブリオ属細菌は、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛１本を持ち運動する。ビブリオ属細菌は、淡水や海水に見られる。
【０００５】
例えば、ビブリオ属細菌の培養物、菌体、あるいはその処理物を用いて、インドールとセリン、またはインドールとピルビン酸とアンモニウムイオンからＬ−トリプトファンを製造する方法（特許文献１）、Ｎ−カルバミルメチオニンからＬ−メチオニンを製造する方法（特許文献２）やβ−ヒドロキシアスパラギン酸をＬ−セリンを生成する方法（特許文献３）、フェニルアラニンの前駆体からフェニルアラニン又はその誘導体を製造する方法（特許文献５）、２−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩にチミンを作用させてチミジンを生成する方法（特許文献６）などが知られている。
【０００６】
また、目的物質の生産能のある微生物を自然界から単離し、当該微生物を用いて目的物質を生成する方法も従来より知られており、ビブリオ属細菌でのその様な例としては、ビブリオ属に属しエイコサペンタエン酸含有脂質を生成することができる微生物、及び同微生物によるエイコサペンタエン酸の製造法が報告されている（特許文献4）。
【０００７】
しかしながら、ビブリオ属細菌では、糖などからアミノ酸等の目的物質を直接発酵できる能力は知られておらず、糖などからの直接発酵により目的物質生産を行った例は報告されていない。また、目的物質を生成するために、代謝等を改変したビブリオ属細菌や当微生物を用いた物質生産も知られておらず、上記課題を解決する能力を有していることは知られていなかった。
【特許文献１】特開昭56-85291号公報
【特許文献２】特開昭62-275696号公報
【特許文献３】特開昭60-62993号公報
【特許文献４】特開昭 63-216490号公報
【特許文献５】特開昭 62-289194 号公報
【特許文献６】特開平 1-104190 号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンなどのＬ−アミノ酸を効率よく生産するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、これまでＬ−アミノ酸の発酵生産に使用されてこなかったビブリオ属細菌を培地中で培養することにより、非常に効率よくＬ−アミノ酸を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法。
（２）前記培養が、高浸透圧条件で行われることを特徴とする前記方法。
（３）前記高浸透圧条件は、925mOsm以上の条件である前記方法。
（４）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される1種以上のアミノ酸である前記方法。
（５）前記細菌が、Ｌ−アミノ酸アナログに対する耐性を付与することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌である、前記方法。
（６）前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された細菌である、前記方法。（７）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸アナログが、S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンから選択される１種以上のＬ−アミノ酸アナログである前記方法。
（８）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素が、ジヒドロピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる1種以上の酵素である、前記方法。
（９）前記ジヒドロピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼがＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたことを特徴とする前記方法。
（１０）前記細菌がさらにＬ−リジン排出活性が増強するように改変された細菌である、前記方法。
（１１）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸アナログがα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸である前記方法。
（１２）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素がアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、及びスレオニンシンターゼから選ばれる1種以上の酵素である前記方法。
（１３）前記ビブリオ属細菌が、Vibrio abalonicus、Vibrio adaptatus、Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio alginolyticus、Vibrio algosus、Vibrio anguillar
um、Vibrio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio carchariae 、Vibrio coralliilyticus、Vibrio costicola、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio cyclosites、Vibrio diazotrophicus、Vibrio fischeri、Vibrio gazogenes、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio hispanica、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio iliopiscarius、Vibrio lentus、Vibrio liquefaciens、Vibrio logei、Vibrio marinagilis、Vibrio marinofulvus、Vibrio marinovulgaris、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mytili、Vibrio
natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pectenicida、Vibrio pelagius、Vibrio penaeicida、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio psychroerythrus、Vibrio salmonicida、Vibrio shiloii、Vibrio splendidus、Vibrio tyrosinaticus、Vibrio viscosus、Vibrio wodanis、Beneckea pelagia 、及びListonella anguillarumから選択されるビブリオ属細菌である前記方法。
（１４）下記(a)〜（ｊ）のいずれかに記載のＤＮＡである、単離されたＤＮＡ：
(ａ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｂ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｃ) 配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｄ) 配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｅ) 配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｆ) 配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｇ) 配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｈ) 配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｉ) 配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｊ) 配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、非常に効率よくＬ−アミノ酸を生産できる。
特に、ビブリオ属細菌は高浸透圧条件下でも生育が抑制されず、Ｌ−アミノ酸生産能も低下しないことが本発明において見出されたため、高浸透圧条件下においてもＬ−アミノ酸を非常に効率よく蓄積させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜１＞本発明に用いる細菌
本発明に用いる細菌（以下、「本発明の細菌」ともいう）は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌である。
ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。すなわち、本発明の細菌は、糖等を炭素源とする発酵（直接発酵とも呼ばれる）によりＬ−アミノ酸を生産することができるビブリオ属細菌である。したがって、本発明の細菌を用いたＬ−アミノ酸の生産は、細菌細胞を触媒に用いた酵素反応によるＬ−アミノ酸の生成とは異なる。
【００１３】
なお、本発明のビブリオ属細菌は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有するビブリオ属細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、後述するようなビブリオ属細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１４】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンのような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−リジンが好ましい。本発明の細菌は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１５】
ビブリオ属細菌は、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛1本を持って運動し、淡水や海水に見られる細菌である。本発明で用いるビブリオ属細菌は、非病原性のものが望ましく、病原性が知られていないビブリオ細菌は、Biosafety level 1(Office of Health and Safety (OHS) 発行のBiosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 4th Edition)に挙げられており、以下のようなビブリオ属細菌が利用できる。
【００１６】
Vibrio abalonicus ATCC27390
Vibrio adaptatus ATCC19263
Vibrio aerogenes ATCC700797
Vibrio aestuarianus ATCC35048
Vibrio alginolyticus ATCC14582
Vibrio algosus ATCC14390
Vibrio anguillarum ATCC43305
Vibrio calviensis ATCC BAA-606
Vibrio campbellii ATCC25920
Vibrio carchariae ATCC35084
Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450
Vibrio costicola ATCC43147
Vibrio cyclitrophicus ATCC700982
Vibrio cyclosites ATCC14635
Vibrio diazotrophicus ATCC33466
Vibrio fischeri ATCC25918
Vibrio gazogenes ATCC29988
Vibrio halioticoli ATCC700680
Vibrio harveyi ATCC14126
Vibrio hispanica ATCC51589
Vibrio ichthyoenteri ATCC700023
Vibrio iliopiscarius ATCC51760
Vibrio lentus ATCC BAA-539
Vibrio liquefaciens ATCC17058
Vibrio logei ATCC15382
Vibrio marinagilis ATCC14398
Vibrio marinofulvus ATCC14395
Vibrio marinovulgaris ATCC14394
Vibrio mediterranei ATCC43341
Vibrio metschnikovii ATCC7708
Vibrio mytili ATCC51288
Vibrio natriegens ATCC14048
Vibrio navarrensis ATCC51183
Vibrio nereis ATCC25917
Vibrio nigripulchritudo ATCC27043
Vibrio ordalii ATCC33509
Vibrio orientalis ATCC33933
Vibrio pectenicida ATCC700783
Vibrio pelagius ATCC33504
Vibrio penaeicida ATCC51841
Vibrio ponticus ATCC14391
Vibrio proteolyticus ATCC53559
Vibrio psychroerythrus ATCC27364
Vibrio salmonicida ATCC43839
Vibrio shiloii ATCC BAA-91
Vibrio splendidus ATCC33125
Vibrio tyrosinaticus ATCC19378
Vibrio viscosus ATCC BAA-105
Vibrio wodanis ATCC BAA-104
Beneckea pelagia ATCC25916
Listonella anguillarum ATCC19264
【００１７】
Beneckea pelagia、Listonella anguillarumはビブリオ属細菌と近縁であり、現在の分類ではビブリオ属細菌に分類されるものもある（Thompson, F. L. et al. (2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 23, 403-431およびMacian, M. C. et al. (2000) Syst. Appl. Microbiol., 23, 373-375.)。したがって、このような細菌も本発明においてビブリオ属細菌として使用することができる。
【００１８】
なかでもVibrio natriegens（ビブリオ・ナトリージェンス）を用いることが好ましい。Vibrio natriegensは、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属する海洋性の通性嫌気性細菌であり、1958年にウロン酸酸化細菌として分離された（Payne, W. J. (1958) J. Bacteriology, 76, 301）。当初は同じγ−プロピオバクテリアのシュードモナス（Psuedomonas）に属するとされていたが、ベネケア（Beneckea）属に再分類された後、他のBeneckea属と同様にビブリオ属（Vibrio）に編入された．ATCCではBiosafety level 1に分類されており、DSMZ (the German National Resource Centre for Biological Material)でも、Risk Group 1(German classification))に分類されており、病原性は知られていない。
【００１９】
ビブリオ・ナトリージェンスとしては、ビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株（ATCC
14048）株を用いることが出来る。
【００２０】
上記のビブリオ属細菌を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。
【００２１】
ここで、本発明のビブリオ属細菌は、アミノ酸発酵の培養後半の物質が高蓄積する高浸透圧条件、あるいは糖の濃度が高い高浸透圧条件で、従来Ｌ−アミノ酸生産に使用されてきた微生物（例えばエシェリヒア・コリやコリネ型細菌）の生育が不十分であるのに比べ、好適に生育できる。ここで、高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。また、「高浸透圧下で好適に生育できる」とはE. coli野性株の増殖速度が最大時の50%以下に低下する1100mOsmにおいて、増殖速度が最大時の90%程度にしか低下しないことを意味する。
【００２２】
＜２＞ビブリオ属細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法
Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌は、上記のようなビブリオ属細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するためには、従来のコリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の育種に使用されてきた、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、または代謝制御変異株、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組み換え株等の創製法を利用して育種することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター）。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
以下、各種アミノ酸生産能を付与するための方法を例示する。
【００２３】
Ｌ−リジン生産菌
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）-Ｌ−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。特にＬ−リジンアナログとして、S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）に耐性を有する変異株として育種することが好ましい。
【００２４】
ビブリオ属細菌から変異株を得るための変異処理法としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、ビブリオ属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を得ることができる。
【００２５】
Ｌ−アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したビブリオ属細菌を種々の濃度のＬ−アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。
【００２６】
また、栄養要求性変異株は、ビブリオ属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ−アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
【００２７】
例えば、AECに耐性を有するビブリオ・ナトリージェンスのＬ−リジン生産株としては、ビブリオ・ナトリージェンスAJ110593(FERMP-21066)株が挙げられる。
これらの株は、ビブリオ・ナトリージェンスAJ110593株と命名され、平成１８年１０月
２４日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERMP-21066として寄託されている。
【００２８】
次に、Ｌ−リジン生合成系酵素の活性の増強によってＬ−リジン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００２９】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
ビブリオ属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、ビブリオ属で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをビブリオ属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
【００３０】
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、ビブリオ属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12やビブリオ・ナトリージェンスIFO15636等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
【００３１】
また、ビブリオ属の遺伝子は以下のGenbankのデータベースを利用することによって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
【００３２】
本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。ビブリオ属由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、ビブリオ属由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、ビブリオ属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。
尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００３３】
また、アルパルトキナーゼをコードする遺伝子は、ホモログが存在することがあり、
アスパルトキナーゼ活性を有する限り、遺伝子源は限定されない。
例えば、ビブリオ・ナトリージェンスのAK遺伝子としては、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子が挙げられる。
【００３４】
配列番号21はビブリオ・ナトリージェンスのAKO遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号21においては、塩基番号526-528のGTG、塩基番号544-546のGTGあるいは塩基番号568-570のGTGが開始コドンであり、塩基番号1711-1713のTGAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号21の塩基番号526-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号1-395）、塩基番号544-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号7-395）、または塩基番号568-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号15-395）を有するDNAがAKO遺伝子として使用できる。
【００３５】
配列番号23はビブリオ・ナトリージェンスのthrA遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号23においては、塩基番号486-488のATG、塩基番号591-593のGTGあるいは塩基番号633-635のGTGが開始コドンであり、塩基番号2943-2945のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号23の塩基番号486-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号1-819）、塩基番号591-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号35-819）、または塩基番号633-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号50-819）を有するDNAがthrA遺伝子として使用できる。
【００３６】
配列番号25はビブリオ・ナトリージェンスのmetL遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号25においては、塩基番号376-378のATG、塩基番号487-489のGTGあるいは塩基番号490-492のGTGが開始コドンであり、塩基番号2782-2784のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号25の塩基番号376-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号1-802）、塩基番号487-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号38-802）、または塩基番号490-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号39-802）を有するDNAがmetL遺伝子として使用できる。
【００３７】
配列番号27はビブリオ・ナトリージェンスのlysC遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号27においては、塩基番号1060-1062のGTGあるいは塩基番号1117-1119のATGが開始コドンであり、塩基番号2410〜2412のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号27の塩基番号1060-2409の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号28のアミノ酸番号1-450）、または塩基番号1117-2409（コードされるアミノ酸配列は配列番号28のアミノ酸番号20-450）を有するDNAがlysC遺伝子として使用できる。
【００３８】
配列番号29はビブリオ・ナトリージェンスのputative-AK遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号29においては、塩基番号344-346のATG、塩基番号380-382のATGあるいは塩基番号470-472のATGが開始コドンであり、塩基番号1766-1768のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号29の塩基番号344-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号1-474）、
塩基番号380-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号13-474）、または塩基番号470-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号43-474）を有するDNAがputative-AK遺伝子として使用できる。
【００３９】
また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００４０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４１】
なお、アスパルトキナーゼ活性は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法によって測定することができる。
【００４２】
また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子はいずれも野生型遺伝子には限られず、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、各遺伝子の上記のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
【００４３】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、上記機能が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。上記のような遺
伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように上記オープンリーディングフレームの塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００４４】
さらに、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、各遺伝子の上記オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００４５】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００４６】
また、ビブリオ属で機能するベクターとは、例えばビブリオ属で自律複製出来るプラスミドであれば、いずれでも用いることが出来る。ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる．選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる．
【００４７】
dapA及びlysCとビブリオ属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００４８】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００４９】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００５０】
上記のように調製した組換えＤＮＡをビブリオ属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
【００５１】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。ビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
【００５２】
DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５３】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００５４】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
【００５５】
本発明のビブリオ属細菌はＬ−リジン排出活性を増強させることによってＬ−リジン生産能が高められた細菌であってもよい。例えば、ybjE遺伝子の発現量を増加させること、lysE遺伝子の発現量を増加させることでＬ−リジン排出活性を高めることができる（特開2005-237379、WO97/23697号パンフレット）。
【００５６】
さらに、本発明の細菌は、さらに、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐してＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA,
ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットを参照にして構築できる。
【００５７】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、又はIS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００５８】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでビブリオ属に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００５９】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
【００６０】
Ｌ−トリプトファン生産菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強するように改変することによって構築できる。ここで、アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性をより強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子をビブリオ属に属する細菌に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。（国際公開第94/08031号パンフレット参照）
【００６１】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入する方法が挙げられる。（特開昭57-71397号
公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００６２】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損させたり、trpRに変異を導入することによっても好適なＬ−トリプトファン生産菌が得られる（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。
【００６３】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌は、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有するように改変することによっても構築できる。
また、Ｌ−トリプトファン生産菌としては、３−フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）すること、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株することによっても構築できる。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇させてもよい。（欧州特許763127号明細書参照）また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン生合成系、Ｌ−チロシン生合成系を弱化させてもよい。（US4,371,614）
【００６５】
また、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、エシェリヒア・コリのaroFを用いる場合、Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラギン酸または１８１番目のＬ−セリンを他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラギン酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ−プロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミノ酸残基、または１５７番目のＬ−メチオニン及び２１９番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族アミノ酸生産菌を得ることができる。（EP0488424）
【００６６】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、上述のような改変のほかに、tyrA,tyrRを欠損させた株や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、又はyedA遺伝子を増幅した株を用いることができる。
【００６７】
Ｌ−スレオニン生産能を有するビブリオ属に属する細菌として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化するように改変することによって取得できる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよ
い。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたビブリオ属に属する細菌に導入してもよい。例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を低下させることによって、スレオニン分解を抑制することができる。
【００６８】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。したがって、この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００６９】
また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにビブリオ属細菌を改変するために、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性を付与してもよい。
【００７０】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、上述に記載した遺伝子より取得できる。
【００７１】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子やそれらの遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することもＬ−スレオニン生産菌の育種に好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００７２】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、及び／又はＬ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００７３】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属細菌を構築するためには、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変することが望ましい。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)
、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA,
pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素遺伝子の中では、CS、PEPC及びGDHのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。（米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書）
【００７４】
また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増大するように改変してもよい（欧州特許出願公開1352966号明細書）し、L-グルタミン酸を排出するタンパク質をコードするyhfK遺伝子を増幅してもよい。（WO2005/085419号パンフレット）
【００７５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属に属する細菌としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた細菌を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましく、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損した菌株は、欧州特許0952221号公報、0955368号公報、米国特許5,378,616号公報を参照にして構築することが出来る。
【００７６】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する細菌としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量が増大した細菌を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼ（phosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase）（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノ−５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase）（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（amidotransferase）(hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
【００７７】
また、スルファグアニジン、D,Ｌ−1,2,4-triazole-3-alanine、及びストレプトマイシン耐性を付与することによってもＬ−ヒスチジン生産菌が得られる（ロシア2119536号）。
【００７８】
Ｌ−システイン生産菌を構築するためには、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下するように改変すること（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持させるように改変することが好ましい。（特開平11-155571号公報）
【００７９】
Ｌ−アルギニン生産菌を得るためには、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するように改変することが好ましい。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するように改変することも、Ｌ−アルギニン生産菌の育種法として好適である。
【００８０】
またＬ−アルギニン生産能を有するビブリオ属細菌として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を増大させた細菌を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ遺伝子（argA）としては、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型酵素をコードする変異型遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００８１】
Ｌ−ロイシン生産菌は、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、tyrB遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させること（特開2004-024259）、または4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシン耐性を有するように改変することによって取得することができる。また、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作する用に改変すること、（欧州特許第1067191号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するように改変すること（米国特許第5,763,231号明細書）によっても好適なＬ−ロイシン生産菌を構築することが出来る。
【００８２】
Ｌ−イソロイシン生産菌は、６−ジメチルアミノプリン耐性（特開平5-304969号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）、チアイソロイシン耐性（特開平5-130882号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性（特開平5-130882号公報）、またはアルギニンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）を付与することによって取得することができる。また、組換え体ビブリオ属細菌は、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強する方法（特開平2-458号公報、特開平2-42988号公報、特開平8-47397号公報）等によって得られる。
【００８３】
Ｌ−バリン生産菌は、WO96/06926に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びプロトンATPaseを欠損する変異を有するように改変すること、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片を細胞内に導入することによって構築することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書）。また、ilvGMEDAオペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
【００８４】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００８５】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fba;国際公開03/04664号パンフレット）、
ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００８６】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochromoe bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００８７】
＜３＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、上述の方法によって育種されたビブリオ属に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収する方法である。なお、本発明のＬ−アミノ酸の製造法はグルコースやシュクロースなどの炭素源からＬ−アミノ酸を製造する発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法であり、特許文献１〜５で開示されているような、ビブリオ属細菌を生物触媒として用いてＬ−アミノ酸の前駆体からＬ−アミノ酸を製造する方法は含まない。
【００８８】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロースを炭素源として用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。また、本発明の微生物を培養する際には、ある一定濃度の塩を含んでいることがなお好ましい。塩とは目的物質がカウンタイオンと結合して塩化したものでもよいし、食塩（NaClでもよい）なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８９】
また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ホモセリンを、Ｌ−トリプトファン発酵では、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。
【００９０】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００９１】
尚、本発明においては、特に高浸透圧下で培養することによって、より効果が発揮できる。高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。
従って、Ｌ−リジン発酵の場合、61g/L以上、好ましくは79g/L以上、さらに好ましくは115g/L以上のＬ−リジンを培地中に蓄積するような条件が好ましい。
【００９２】
また、糖を原料として直接発酵を行う場合、例えばグルコースの場合は、66g/L以上、好ましくは94g/L以上、さらに好ましくは152g/L以上のグルコースを培地中に含むとより効果が発揮でき、シュークロースの場合は、66g/L以上、好ましくは94g/L以上、さらに好ましくは152g/L以上のシュークロースを培地中に含むとより効果が発揮できる。
【実施例】
【００９３】
〔実施例１〕ビブリオ・ナトリージェンス（V. natriegens）を用いた高浸透圧下でのＬ−リジン生産
（１）V. natriegensのＬ−リジンのアナログ S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）耐性化によるＬ−リジン生産株の取得
V. natriegens野生株からのAEC耐性株取得
V. natriegens野生株IFO15636株（ATCC 14048、AJ13670）からＬ−リジンアナログであるAECへの耐性株を得るため、以下の方法でIFO15636株を変異剤N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）を用いて変異処理した。
【００９４】
V. natriegens野生株をLB-NaCl寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast
extract、30 g/L NaCl、0.4 g/L MgSO4および20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を25 mL 試験管に入れた4 ml LB-NaCl培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaClおよび0.4 g/L MgSO4を含む。pH 7.0）に接種し37℃で19時間振とう培養した。その培養液40μlを500 mL 坂口フラスコに入れた50 ml LB-NaCl培地に加え37℃で3時間振とう培養した。培養後の培養液の660 nmにおける吸光度は0.34であった。培養後の菌体を1000×gで10分間遠心することで集菌し、5 mL ML培地（2.0g/L グルコース、1.5 g/L Na2HPO4、1.5 g/L KH2PO4、3.0
g/L (NH4)SO4、15 g/L NaCl、40μM MgSO4、6μM FeCl3、24.8μM CaCl2、0.7μM ZnSO4、0.7μM CuSO4、0.8μM CoCl2、1.7μM H3BO3、1.3μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.3）に懸濁した。この菌体懸濁液1 mLに終濃度5μg/mLとなるようにNTGを加え35℃で10分間放置した。NTG処理された菌体を15000×gで30秒間遠心して集菌後、1 mL ML培地で2回洗浄し、1 mL ML培地に懸濁した。
【００９５】
変異処理菌体からAEC耐性を示す株を取得した。具体的には、懸濁液50μl（108個の細胞を含む）を0.1 g/L AECを含むML寒天培地（ML培地に20 g/L 寒天を加えたもの）に接種し37℃で培養し、コロニー形成できる株を取得した。V. natriegens野生株が0.1 g/L AECを含むML寒天培地で形成したコロニー数はNTG処理株が形成したコロニー数の1/10であった。24時間培養後にコロニー形成が観察された株を55株(（I）)、48時間後コロニー形成形成が観察された株を59株(（II）)、そして72時間培養にコロニー形成が観察された株を59株(（III）)得た。
これらの株を再度0.1 g/L AECを含むML寒天培地に塗りつけて37℃で18時間培養し、良好に生育するものを選択した。上記の（I）からは28株、上記（II）からは47株そして上記（III）からは40株の良好に増殖する株をそれぞれ得た。この合計115株をV. natriegens AEC耐性株とした。
【００９６】
V. natriegens AEC耐性株のＬ−リジン生産能評価
V. natriegens AEC耐性株115株のＬ−リジン生産能を25 mL 試験管を用いて評価した。以下の実験において、Ｌ−リジン濃度とグルコース濃度はバイオテックアナライザーAS-2
10（サクラ精機株式会社、日本）そして660nmの吸光度（OD）はDU-800（ベックマンコールター社、米国）を用いてそれぞれ計測した。Ｌ−リジン濃度測定には培養液の原液を用いた。グルコース濃度は培養液を20倍希釈して測定を行った。そして、ODは培養液を51倍希釈して測定を行った。
【００９７】
はじめに、25 mL 試験管に入れた4mL LB-NaCl培地にV. natriegens AEC耐性株115株を植菌し37℃で18時間振とう培養した。その培養液100 μlを25 mL 試験管に入れた4 mL MS-NaCl培地（40 g/L グルコース、2.0 g/L Yeast extract、1.0 g/L KH2PO4、24 g/L (NH4)SO4、4 mM MgSO4、15 g/L NaCl、36 μM MnSO4、36 μM FeSO4および0.8 μM CaCO3を含む。pH 7.0）に接種し37℃で振とう培養した。培養開始4時間後および24時間後に培養液のＬ−リジン濃度を測定した。
【００９８】
その結果、培養開始4時間後もしくは24時間後に0.7mM以上のＬ−リジン蓄積が観察されたAEC耐性株は、サンプルNo.28-15、No.28-28、No.28-29、No.28-36およびNo.29-29であった（表１）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
上記5株をフラスコ培養し、Ｌ−リジン生産能を評価した。具体的には、25 mL試験管に入れた4mL LB-NaCl培地を用いて37℃で15時間振とう培養した。その培養液10 μlを25 mL試験管に入れた4mL LB-NaCl培地に接種し37℃で1.5時間振とう培養した後、ODが0.01となるようにそれぞれ500 mL 坂口フラスコに入れた20 mL MS-NaCl培地に接種し37℃で振とう培養した。培養開始4時間後、7時間後、9時間後および24時間後に培養液のＬ−リジン濃度、グルコース濃度そしてODを測定した。
結果を図1、2および3に示す。最も高いＬ−リジン蓄積が観察されたのはサンプルNo.28-15（FERM P-21066）で、最大1.4 mMのＬ−リジンの蓄積が観察された。
【０１０１】
（２）V. natriegensを用いた高浸透圧下でのＬ−リジン生産
種々の浸透圧下でのV. natriegensのＬ−リジン生産をE. coliＬ−リジン生産株のものと比較した。具体的には、V. natriegens AEC耐性株No.28-15株（FERM P-21066）、No.28-28株、No.28-29株をE. coli WC196株（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）を対照として、0.2Mから1M (培地の浸透圧は926 mOsm〜2447 mOsm)のNaClを含む培地で培養し、Ｌ−リジン生産量を測定した。そのための培地および培養方法ならびに分析方法を以下に示す。
【０１０２】
〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース 40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O 1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
NaCl 終濃度が0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1M の各濃度になるように添加
【０１０３】
〔培養方法〕
プレシード培養；V. natriegensは、保存状態の菌をLB＋MgSO4+NaCl寒天培地(MgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)を含むLB培地)に接種し、34℃で培養した。E. coliはLB寒天培地に接種し、37℃で培養した。
種（seed）試験管培養；プレシード培養した菌をLB＋MgSO4+NaCl液体培地（V. natriegens）またはLB液体培地（E. coli）に接種し、37℃、16時間培養した。
主(main)培養；種培養液1mlを20mlのMS液体培地に接種し、37℃、 500ml容坂口フラスコで培養した。
【０１０４】
〔分析方法〕
グルコース濃度、及びＬ−リジン濃度は、培養液を15,000rpmで5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザーAS-210（サクラ精器）により測定した。浸透圧は 米国アドバンス社製 The Advanced Osmometer Model 3900を用いて測定した。
【０１０５】
各浸透圧における最大比Ｌ−リジン生産速度を図4に示した。それによると、E. coli WC196株は高浸透圧下ではＬ−リジンを蓄積することができなかったが、V. natriegens AEC耐性株No.28-15株、No.28-28株、No.28-29株は高浸透圧下でもＬ−リジンを多量蓄積することがわかった。
【０１０６】
〔実施例２〕Ｌ−リジンによる高浸透圧下でのV. natriegensの増殖
高Ｌ−リジン濃度下におけるV. natriegensとE. coliの増殖を比較観察した。
V. natriegens 野生株IFO15636株をLB-NaCl寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaCl、0.4 g/L MgSO4および20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で15時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を0.2 %グルコースを含むM9-NaCl培地（15 g/L NaCl、6.0 g/L Na2HPO4、3.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L NH4Cl、1.0 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4、4.8 μM CaCl2、0.7 μM ZnSO4、0.7 μM CuSO4、0.8 μM CoCl2、1.7 μM H3BO3、1.3 μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.0）に接種し、30℃で24時間培養した。培養後の濁度を分光光度計DU-800（Beckman Coulter, Inc.米国）を用いて波長660nmで計測したところ0.67であった。その培養液60μlを0.04 %グルコースを含む6種類のM9培地（0.05、0.27、0.55、0.82、1.1あるいは1.4 MのＬ−リジンをそれぞれ含む）4 mLに接種し、小型振盪培養装置（TN-1506、アドバンテック東洋株式会社、日本）を用いて30℃で培養し15分毎に660nmでの吸光度を観察した。
【０１０７】
また、E. coli 野生株MG1655株（ATCC No.47076）をLB寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、5 g/L NaClおよび20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で15時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を0.2 %グルコースを含むM9培地（6.0 g/L Na2HPO4、3.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L NH4Cl、1.0 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4、4.8 μM CaCl2、0.7 μM ZnSO4、0.7 μM CuSO4、0.8 μM CoCl2、1.7 μM H3BO3、1.3 μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.0）に接種し、30℃で24時間培養した。培養後の濁度は0.67であった。その培養液60μlを0.04 %グルコースを含む6種類のM9培地（0.05、0.27、0.55、0.82、1.1あるいは1.4 MのＬ−リジンをそれぞれ含む）4 mLに接種し、小
型振盪培養装置TN-1506を用いて30℃で培養し15分毎に660nmでの吸光度OD660を観察した。
【０１０８】
V. natriegensおよびE. coliの増殖曲線からそれぞれ最大比増殖速度を求め比較を行った。ここで最大比増殖速度は、15分毎に比増殖速度を
【０１０９】
比増殖速度 (h-1) = 4×(ln(t1でのOD660) - ln(t0でのOD660))
t0 とt1の差は15分
に従い求め、最も値が高かった比増殖速度を各条件での最大比増殖速度とした。
【０１１０】
各Ｌ−リジン濃度におけるM9培地の浸透圧は、菌を接種する前の培地をadvanced CRYOMATICTM Osmometer（ADVANCED INSTRUMENTS、Inc.、米国）を用いて測定した。
【０１１１】
培養観察した結果、1550 mOsmの浸透圧下（Ｌ−リジン濃度0.8 M）においてV. natriegensでは増殖が観察されたが、E. coliでは増殖が観察されなかった（図5）。
【０１１２】
また、増殖が観察された全てのＬ−リジン濃度においてV. natriegensはE. coliよりも増殖が速く、今回観察された最も低いV. natriegens でも最大比増殖速度（浸透圧1550 mOsmのとき観察された）は0.79 h-1であり、今回観察されたE. coliの最も大きな最大比増殖速度（浸透圧670 mOsmのとき観察された）の1.7倍であった。
【０１１３】
〔実施例３〕グルコースによる高浸透圧下でのV. natriegensの増殖
V. natriegens 野生株IFO15636株をLB-NaCl寒天培地に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を4 mL LB-NaCl培地に接種し37℃で14時間培養した。その培養液8μLを4 mL LB-NaCl培地に接種し37℃で3.5時間培養した。培養後の660nmの吸光度（OD660）は1.7であった。そのV. natriegens 野生株培養液471μlを0.2〜0.8 Mグルコースを含むMS培地（2.0 g/L Yeast extract、1.0 g/L KH2PO4、24 g/L (NH4)SO4、4 mM MgSO4、36
μM MnSO4、36 μM FeSO4そして0.8 μM CaCO3を含む。pH 7.0）に加え37 ℃で培養し、OD660と培養液中のグルコース濃度を経時観察した。
【０１１４】
また、E. coli野生株W3110株をLB寒天培地に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を4 mL LB培地に接種し37℃で14時間培養した。その培養液8μLを4 mL LB培地に接種し37℃で3.5時間培養した。培養後のOD660は0.9であった。そのV. natriegens
野生株培養液889μlを0.2〜0.8 Mグルコースを含むMS培地に接種し37 ℃で培養し、OD660と培養液中のグルコース濃度を経時観察した。
【０１１５】
OD660は分光光度計（U-2001、日立製作所、日本）を用いて計測した。グルコース濃度はバイオテックアナライザー（AS-210、サクラ精機株式会社、日本）を用いて計測した。各グルコース濃度におけるMS培地の浸透圧は、菌を接種する前の培地をadvanced CRYOMATICTM Osmometer（ADVANCED INSTRUMENTS、Inc.、米国）を用いて計測した。
OD660とグルコース濃度の変化から培養開始4.5時間後の各浸透圧下における比糖消費速度を計算し比較した。
その結果、各浸透圧下においてV. natriegensはE. coliよりも比糖消費速度が高かった（図6）。
【０１１６】
〔実施例４〕V. natriegens Ｌ−リジン生合成強化によるＬ−リジン生産
V. natriegens野生株AJ13670（IFO15636）及びAEC耐性株No.28-15株（FERM P-21066）、No.28-28株、No.28-29株にＬ−リジン生合成系遺伝子（lysC、dapA、dapB及びddh）を搭載したplasmid、pCABD2を導入し、Ｌ−リジン生産培養を行った。対照として、各株にベクターpRSのみを導入した株も作製し、同様に培養を行った。V. natriegensへのプラス
ミドDNAの導入は、エレクトロポレーション法により以下のように行った。MgSO4 0.4g/l,
NaCl(終濃度 3%)を含むLB培地で対数増殖期後期(OD=0.6から0.8)まで培養した菌体を2mM
HEPES(pH6.8)100 mM sucrose 5 mM CaCl2で3回洗浄した後、10 % glycerolにけん濁し、プラスミドDNAを添加し、9 kV/cm、25μF、200Ωのパルスをかけた後、MgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)、0.4% glucoseを含むLB培地中で2時間から3時間、34℃で振とう培養を行い、500 mg/lのストレプトマイシンを含むMgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)入りのLB寒天培地で、プラスミドが導入されたクローンを選択した。得られた株の培養は、実施例１と同様に行った。培養は、プレシード(Pre-seed)培養、種（seed）試験管培養、主(main)培養を通して、34℃で行い、培地にはストレプトマイシン500mg/lを添加した。主(main)培養は、終濃度0.5%のNaClを含むMS培地を用いた。培養9.3時間目のOD、培地に蓄積されたＬ−リジン濃度、対消費糖収率を表2に示す。その結果、V. natriegens No.28-15株、No.28-28株、No.28-29株のＬ−リジン生産能はＬ−リジン生合成系遺伝子を導入することによりさらに向上することがわかった。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
〔実施例５〕AK遺伝子増幅によるＬ−リジン生産V. natriegens AK遺伝子の取得
V. natriegensアスパルトキナーゼ遺伝子の取得
【０１１９】
V. natriegensのAKO遺伝子の塩基配列を決定するため、上記ゲノム解読済みのビブリオ属細菌（Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus）のAKO遺伝子（NCBI-GeneID：2615216、1190071及び1178506）において保存されている塩基配列を元に配列番号1から配列番号4に示すオリゴヌクレオチドを合成した。また、V. natriegensのthrA、metL、lysC（AKIII遺伝子）そしてputative AK遺伝子の配列を決定するため、上記ビブリオ属細菌のthrA（NCBI-GeneID：2613033、1187962そして1177497）、metL（NCBI-GeneID：2615512、1190314そして1178287）、lysC（AKIII遺伝子）（NCBI-GeneID：2614988、1190261そして1178339）そしてputative AK遺伝子（NCBI-GeneID：2612362そして1189226）において種間で保存されている塩基配列を元にオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、thrAの塩基配列を解読するため配列番号5から11、metLの塩基配列を解読するため配列番号12から16、lysCの塩基配列を解読するため配列番号17と18、putative AK遺伝子の塩基配列を解読するため配列番号19と20に示すオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号1から20において、ｒはｇとａの混合塩基を示し、ｙはｔとｃの混合塩基を示し、ｍはａとｃの混合塩基を示し、ｋはｇとｔの混合塩基を示し、ｓはｇとｃの混合塩基を示し、ｗはａとｔの混合塩基を示し、例えばT(C/T)Gは、TCGとTTGの配列を持つオリゴヌクレオチドが混在していることを示す。
【０１２０】
保存配列をもとに作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、V. natriegens IFO15636株（野生株）ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、各遺伝子の部分断片を取得した。具体的には、表3のプライマー組み合わせでPCRを行った。ゲノムDNAはDNeasy Tissue kit（QIAGEN、ドイツ）を用いて調製した。PCRは98℃で1分間反応させた後、
98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒を30サイクル繰り返し、72℃で10分反応させる条件で行った。得られたPCR産物に含まれる未反応プライマーやdNTPをMicroSpin S-400 HR（GE healthcar、米国）を用いて除去して後の実験に用いた。
【０１２１】
次に、得られた各遺伝子の部分断片を鋳型とし、各々の増幅に用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてCEQ dye termination cycle sequencing with Quick start kit（Beckman Coulter、米国）を使い各AK遺伝子ホモログ部分断片の塩基配列を決定した。解読された各AK遺伝子ホモログ部分断片の塩基配列から順次各配列と相補的なオリゴヌクレオチドを合成し各遺伝子の部分断片の塩基配列を解読した。
【０１２２】
続いて、Takara LA PCR in vitro cloning kit (タカラバイオ株式会社、日本)を用いて、先に得られた遺伝子部分断片の上下流域を取得し、塩基配列を決定した。
【０１２３】
その結果、V. natriegens のAKO遺伝子は0.6 kbpと0.2 kbp、thrAは0.8 kbpと0.4 kbp、metLは0.4 kbpと0.5 kbp、lysCは0.4 kbpと1.0 kbpそしてputative AK遺伝子は0.4 kbpと0.8 kbpの部分断片の上下流域の塩基配列をそれぞれ解読でき、AKO遺伝子（1779 bp、配列番号21）、thrA（3547 bp、配列番号23）、metL（3214 bp、配列番号25）、lysC（2648 bp、配列番号27）そしてputative AK遺伝子（2331 bp、配列番号29）の塩基配列を解読することができた。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
次に、GENETYXネットワーク版 Version 7.0.6（株式会社ゼネティックス、日本）を使って上記5種類のAK遺伝子のオープンレーディングフレーム（ORF）解析を行った。その結果、AKO遺伝子の開始コドンは配列番号21の塩基番号526-528のGTG、塩基番号544-546のGTGあるいは塩基番号568-570のGTGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号1711-1713のTGAが考えられた。thrAの開始コドンは配列番号23の塩基番号486-488のATG、塩基番号591-593のGTGあるいは塩基番号633-635のGTGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号2943-2945のTAAが考えられた。metLの開始コドンは配列番号25の塩基番号376-378のATG、塩基番号487-489のGTGあるいは塩基番号490-492のGTGが開始コドンと考えられ、
終止コドンは塩基番号2782-2784のTAAが考えられた。lysCの開始コドンは配列番号27の塩基番号1060-1062のGTGあるいは塩基番号1117-1119のATGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号2410〜2412のTAAが考えられた。putative AK遺伝子の開始コドンは配列番号29の塩基番号344-346のATG、塩基番号380-382のATGあるいは塩基番号470-472のATGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号1766-1768のTAAが考えられた。
【０１２６】
V. natriegensアスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング
AKO遺伝子をクローニングするため、DNeasy Tissue kit（QIAGEN、ドイツ）を使い調製したV. natriegens野生株（IFO15636株）ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号31と配列番号32のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCRは98℃で1分間反応させた後、98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 150秒を30サイクル繰り返し、72℃で5分間反応させる条件で行った。得られたPCR産物から未反応のプライマーやdNTPをMicroSpin S-400 HR（GE healthcare、米国）を用いて除去し、AKO遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。
【０１２７】
得られたAKO遺伝子を含むDNA断片をSmaIとEcoRI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃60分間処理した。続いて、制限酵素処理されたAKO遺伝子とSmaIとEcoRIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28とをそれぞれライゲーションし、pSTV28_AKOを得た。
【０１２８】
同様にしてV. natiregens thrA、metL、lysCそしてputative AK遺伝子をクローニングするため、thrA増幅では配列番号33と配列番号34のオリゴヌクレオチド、metL増幅では配列番号35と配列番号36のオリゴヌクレオチド、lysC増幅では配列番号37と配列番号38のオリゴヌクレオチド、putative AK遺伝子増幅では配列番号39と配列番号40のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとして用いてAKO遺伝子増幅時と同じ条件でPCRを行い、thrA、metL、lysCおよびputative AK遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。
【０１２９】
得られたDNA断片のうちmetLを含む断片を制限酵素SmaI（タカラバイオ株式会社、日本）とSacI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃、60分間処理した。制限酵素処理されたmetLを含む断片とSmaIとSacIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28（タカラバイオ株式会社、日本）とをライゲーションし、pSTV28_AKIIを得た。
【０１３０】
一方、得られたDNA断片のうちthrA、lysCそしてputative AK遺伝子を含む断片をSmaIとEcoRI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃、60分間処理した。制限酵素処理されたthrA、lysCそしてputative AK遺伝子を含む断片とSmaIとEcoRIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28とをそれぞれライゲーションし、pSTV28_AKI、pSTV28_AKIIIそしてpSTV28_putative-AKを得た。
【０１３１】
得られたAK遺伝子、またはその遺伝子配列を利用し、AKの活性を適宜強化することにより、Ｌ−リジン生産能の向上したビブリオ属細菌を構築しＬ−リジン生産を行わせることができる。
【０１３２】
ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる。選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。
【０１３３】
〔配列表の説明〕
配列番号１：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号２：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号３：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号４：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号５：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号６：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号７：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号８：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号９：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号10：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号11：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号12：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号13：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号14：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号15：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号16：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号17：lysC遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号18：lysC遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号19：putative-AK遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号20：putative-AK遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号21：V. natriegensのAKO遺伝子の塩基配列
配列番号22：V. natriegensのAKO遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号23：V. natriegensのthrA遺伝子の塩基配列
配列番号24：V. natriegensのthrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号25：V. natriegensのmetL遺伝子の塩基配列
配列番号26：V. natriegensのmetL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号27：V. natriegensのlysC遺伝子の塩基配列
配列番号28：V. natriegensのlysC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号29：V. natriegensのputative-AK遺伝子の塩基配列
配列番号30：V. natriegensのputative-AK遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号31：AKO遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号32：AKO遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号33：thrA遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号34：thrA遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号35：metL遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号36：metL遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号37：lysC遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号38：lysC遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号39：putative-AK遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号40：putative-AK遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】V. natriegens野生株およびAEC耐性株のOD経時変化を示すグラフ。
【図２】V. natriegens野生株およびAEC耐性株の培養液中のグルコース濃度経時変化を示すグラフ。
【図３】V. natriegens野生株およびAEC耐性株の培養液中のリジン濃度経時変化を示すグラフ。
【図４】各浸透圧におけるE. coli野生株及びV. natriegens AEC耐性株の最大比Ｌ−リジン生産速度を示すグラフ。
【図５】Ｌ−リジンによる高浸透圧条件下でのE. coliとV. natriegensの増殖速度を示すグラフ。
【図６】グルコースによる高浸透圧条件下でのE. coliとV. natriegensの糖消費速度を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビブリオ属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン等のアミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属等に属するコリネ型細菌、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、エンテロバクター属、パントエア属、メチロバチルス属、もしくはビブリオ属等に属する細菌、又はペニシリウム等に属する糸状菌を用いた発酵法により生産されている。
【０００３】
微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸の直接発酵法においては、培養時の目的生産物の蓄積による浸透圧上昇により、微生物の活性が低下し、長時間生産性が保てないという長年の課題があった。
ビブリオ属細菌は、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛１本を持ち運動する。ビブリオ属細菌は、淡水や海水に見られる。
【０００５】
例えば、ビブリオ属細菌の培養物、菌体、あるいはその処理物を用いて、インドールとセリン、またはインドールとピルビン酸とアンモニウムイオンからＬ−トリプトファンを製造する方法（特許文献１）、Ｎ−カルバミルメチオニンからＬ−メチオニンを製造する方法（特許文献２）やβ−ヒドロキシアスパラギン酸をＬ−セリンを生成する方法（特許文献３）、フェニルアラニンの前駆体からフェニルアラニン又はその誘導体を製造する方法（特許文献５）、２−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩にチミンを作用させてチミジンを生成する方法（特許文献６）などが知られている。
【０００６】
また、目的物質の生産能のある微生物を自然界から単離し、当該微生物を用いて目的物質を生成する方法も従来より知られており、ビブリオ属細菌でのその様な例としては、ビブリオ属に属しエイコサペンタエン酸含有脂質を生成することができる微生物、及び同微生物によるエイコサペンタエン酸の製造法が報告されている（特許文献4）。
【０００７】
しかしながら、ビブリオ属細菌では、糖などからアミノ酸等の目的物質を直接発酵できる能力は知られておらず、糖などからの直接発酵により目的物質生産を行った例は報告されていない。また、目的物質を生成するために、代謝等を改変したビブリオ属細菌や当微生物を用いた物質生産も知られておらず、上記課題を解決する能力を有していることは知られていなかった。
【特許文献１】特開昭56-85291号公報
【特許文献２】特開昭62-275696号公報
【特許文献３】特開昭60-62993号公報
【特許文献４】特開昭 63-216490号公報
【特許文献５】特開昭 62-289194 号公報
【特許文献６】特開平 1-104190 号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンなどのＬ−アミノ酸を効率よく生産するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、これまでＬ−アミノ酸の発酵生産に使用されてこなかったビブリオ属細菌を培地中で培養することにより、非常に効率よくＬ−アミノ酸を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法。
（２）前記培養が、高浸透圧条件で行われることを特徴とする前記方法。
（３）前記高浸透圧条件は、925mOsm以上の条件である前記方法。
（４）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される1種以上のアミノ酸である前記方法。
（５）前記細菌が、Ｌ−アミノ酸アナログに対する耐性を付与することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌である、前記方法。
（６）前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された細菌である、前記方法。（７）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸アナログが、S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンから選択される１種以上のＬ−アミノ酸アナログである前記方法。
（８）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素が、ジヒドロピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる1種以上の酵素である、前記方法。
（９）前記ジヒドロピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼがＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたことを特徴とする前記方法。
（１０）前記細菌がさらにＬ−リジン排出活性が増強するように改変された細菌である、前記方法。
（１１）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸アナログがα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸である前記方法。
（１２）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素がアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、及びスレオニンシンターゼから選ばれる1種以上の酵素である前記方法。
（１３）前記ビブリオ属細菌が、Vibrio abalonicus、Vibrio adaptatus、Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio alginolyticus、Vibrio algosus、Vibrio anguillar
um、Vibrio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio carchariae 、Vibrio coralliilyticus、Vibrio costicola、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio cyclosites、Vibrio diazotrophicus、Vibrio fischeri、Vibrio gazogenes、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio hispanica、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio iliopiscarius、Vibrio lentus、Vibrio liquefaciens、Vibrio logei、Vibrio marinagilis、Vibrio marinofulvus、Vibrio marinovulgaris、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mytili、Vibrio
natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pectenicida、Vibrio pelagius、Vibrio penaeicida、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio psychroerythrus、Vibrio salmonicida、Vibrio shiloii、Vibrio splendidus、Vibrio tyrosinaticus、Vibrio viscosus、Vibrio wodanis、Beneckea pelagia 、及びListonella anguillarumから選択されるビブリオ属細菌である前記方法。
（１４）下記(a)〜（ｊ）のいずれかに記載のＤＮＡである、単離されたＤＮＡ：
(ａ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｂ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｃ) 配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｄ) 配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｅ) 配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｆ) 配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｇ) 配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｈ) 配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｉ) 配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｊ) 配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、非常に効率よくＬ−アミノ酸を生産できる。
特に、ビブリオ属細菌は高浸透圧条件下でも生育が抑制されず、Ｌ−アミノ酸生産能も低下しないことが本発明において見出されたため、高浸透圧条件下においてもＬ−アミノ酸を非常に効率よく蓄積させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜１＞本発明に用いる細菌
本発明に用いる細菌（以下、「本発明の細菌」ともいう）は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌である。
ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。すなわち、本発明の細菌は、糖等を炭素源とする発酵（直接発酵とも呼ばれる）によりＬ−アミノ酸を生産することができるビブリオ属細菌である。したがって、本発明の細菌を用いたＬ−アミノ酸の生産は、細菌細胞を触媒に用いた酵素反応によるＬ−アミノ酸の生成とは異なる。
【００１３】
なお、本発明のビブリオ属細菌は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有するビブリオ属細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、後述するようなビブリオ属細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１４】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンのような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−リジンが好ましい。本発明の細菌は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１５】
ビブリオ属細菌は、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛1本を持って運動し、淡水や海水に見られる細菌である。本発明で用いるビブリオ属細菌は、非病原性のものが望ましく、病原性が知られていないビブリオ細菌は、Biosafety level 1(Office of Health and Safety (OHS) 発行のBiosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 4th Edition)に挙げられており、以下のようなビブリオ属細菌が利用できる。
【００１６】
Vibrio abalonicus ATCC27390
Vibrio adaptatus ATCC19263
Vibrio aerogenes ATCC700797
Vibrio aestuarianus ATCC35048
Vibrio alginolyticus ATCC14582
Vibrio algosus ATCC14390
Vibrio anguillarum ATCC43305
Vibrio calviensis ATCC BAA-606
Vibrio campbellii ATCC25920
Vibrio carchariae ATCC35084
Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450
Vibrio costicola ATCC43147
Vibrio cyclitrophicus ATCC700982
Vibrio cyclosites ATCC14635
Vibrio diazotrophicus ATCC33466
Vibrio fischeri ATCC25918
Vibrio gazogenes ATCC29988
Vibrio halioticoli ATCC700680
Vibrio harveyi ATCC14126
Vibrio hispanica ATCC51589
Vibrio ichthyoenteri ATCC700023
Vibrio iliopiscarius ATCC51760
Vibrio lentus ATCC BAA-539
Vibrio liquefaciens ATCC17058
Vibrio logei ATCC15382
Vibrio marinagilis ATCC14398
Vibrio marinofulvus ATCC14395
Vibrio marinovulgaris ATCC14394
Vibrio mediterranei ATCC43341
Vibrio metschnikovii ATCC7708
Vibrio mytili ATCC51288
Vibrio natriegens ATCC14048
Vibrio navarrensis ATCC51183
Vibrio nereis ATCC25917
Vibrio nigripulchritudo ATCC27043
Vibrio ordalii ATCC33509
Vibrio orientalis ATCC33933
Vibrio pectenicida ATCC700783
Vibrio pelagius ATCC33504
Vibrio penaeicida ATCC51841
Vibrio ponticus ATCC14391
Vibrio proteolyticus ATCC53559
Vibrio psychroerythrus ATCC27364
Vibrio salmonicida ATCC43839
Vibrio shiloii ATCC BAA-91
Vibrio splendidus ATCC33125
Vibrio tyrosinaticus ATCC19378
Vibrio viscosus ATCC BAA-105
Vibrio wodanis ATCC BAA-104
Beneckea pelagia ATCC25916
Listonella anguillarum ATCC19264
【００１７】
Beneckea pelagia、Listonella anguillarumはビブリオ属細菌と近縁であり、現在の分類ではビブリオ属細菌に分類されるものもある（Thompson, F. L. et al. (2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 23, 403-431およびMacian, M. C. et al. (2000) Syst. Appl. Microbiol., 23, 373-375.)。したがって、このような細菌も本発明においてビブリオ属細菌として使用することができる。
【００１８】
なかでもVibrio natriegens（ビブリオ・ナトリージェンス）を用いることが好ましい。Vibrio natriegensは、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属する海洋性の通性嫌気性細菌であり、1958年にウロン酸酸化細菌として分離された（Payne, W. J. (1958) J. Bacteriology, 76, 301）。当初は同じγ−プロピオバクテリアのシュードモナス（Psuedomonas）に属するとされていたが、ベネケア（Beneckea）属に再分類された後、他のBeneckea属と同様にビブリオ属（Vibrio）に編入された．ATCCではBiosafety level 1に分類されており、DSMZ (the German National Resource Centre for Biological Material)でも、Risk Group 1(German classification))に分類されており、病原性は知られていない。
【００１９】
ビブリオ・ナトリージェンスとしては、ビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株（ATCC
14048）株を用いることが出来る。
【００２０】
上記のビブリオ属細菌を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。
【００２１】
ここで、本発明のビブリオ属細菌は、アミノ酸発酵の培養後半の物質が高蓄積する高浸透圧条件、あるいは糖の濃度が高い高浸透圧条件で、従来Ｌ−アミノ酸生産に使用されてきた微生物（例えばエシェリヒア・コリやコリネ型細菌）の生育が不十分であるのに比べ、好適に生育できる。ここで、高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。また、「高浸透圧下で好適に生育できる」とはE. coli野性株の増殖速度が最大時の50%以下に低下する1100mOsmにおいて、増殖速度が最大時の90%程度にしか低下しないことを意味する。
【００２２】
＜２＞ビブリオ属細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法
Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌は、上記のようなビブリオ属細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するためには、従来のコリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の育種に使用されてきた、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、または代謝制御変異株、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組み換え株等の創製法を利用して育種することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター）。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
以下、各種アミノ酸生産能を付与するための方法を例示する。
【００２３】
Ｌ−リジン生産菌
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）-Ｌ−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。特にＬ−リジンアナログとして、S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）に耐性を有する変異株として育種することが好ましい。
【００２４】
ビブリオ属細菌から変異株を得るための変異処理法としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、ビブリオ属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を得ることができる。
【００２５】
Ｌ−アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したビブリオ属細菌を種々の濃度のＬ−アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。
【００２６】
また、栄養要求性変異株は、ビブリオ属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ−アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
【００２７】
例えば、AECに耐性を有するビブリオ・ナトリージェンスのＬ−リジン生産株としては、ビブリオ・ナトリージェンスAJ110593(FERMP-21066)株が挙げられる。
これらの株は、ビブリオ・ナトリージェンスAJ110593株と命名され、平成１８年１０月
２４日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERMP-21066として寄託されている。
【００２８】
次に、Ｌ−リジン生合成系酵素の活性の増強によってＬ−リジン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００２９】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
ビブリオ属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、ビブリオ属で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをビブリオ属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
【００３０】
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、ビブリオ属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12やビブリオ・ナトリージェンスIFO15636等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
【００３１】
また、ビブリオ属の遺伝子は以下のGenbankのデータベースを利用することによって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
【００３２】
本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。ビブリオ属由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、ビブリオ属由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、ビブリオ属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。
尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００３３】
また、アルパルトキナーゼをコードする遺伝子は、ホモログが存在することがあり、
アスパルトキナーゼ活性を有する限り、遺伝子源は限定されない。
例えば、ビブリオ・ナトリージェンスのAK遺伝子としては、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子が挙げられる。
【００３４】
配列番号21はビブリオ・ナトリージェンスのAKO遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号21においては、塩基番号526-528のGTG、塩基番号544-546のGTGあるいは塩基番号568-570のGTGが開始コドンであり、塩基番号1711-1713のTGAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号21の塩基番号526-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号1-395）、塩基番号544-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号7-395）、または塩基番号568-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号22のアミノ酸番号15-395）を有するDNAがAKO遺伝子として使用できる。
【００３５】
配列番号23はビブリオ・ナトリージェンスのthrA遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号23においては、塩基番号486-488のATG、塩基番号591-593のGTGあるいは塩基番号633-635のGTGが開始コドンであり、塩基番号2943-2945のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号23の塩基番号486-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号1-819）、塩基番号591-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号35-819）、または塩基番号633-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号24のアミノ酸番号50-819）を有するDNAがthrA遺伝子として使用できる。
【００３６】
配列番号25はビブリオ・ナトリージェンスのmetL遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号25においては、塩基番号376-378のATG、塩基番号487-489のGTGあるいは塩基番号490-492のGTGが開始コドンであり、塩基番号2782-2784のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号25の塩基番号376-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号1-802）、塩基番号487-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号38-802）、または塩基番号490-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号26のアミノ酸番号39-802）を有するDNAがmetL遺伝子として使用できる。
【００３７】
配列番号27はビブリオ・ナトリージェンスのlysC遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号27においては、塩基番号1060-1062のGTGあるいは塩基番号1117-1119のATGが開始コドンであり、塩基番号2410〜2412のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号27の塩基番号1060-2409の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号28のアミノ酸番号1-450）、または塩基番号1117-2409（コードされるアミノ酸配列は配列番号28のアミノ酸番号20-450）を有するDNAがlysC遺伝子として使用できる。
【００３８】
配列番号29はビブリオ・ナトリージェンスのputative-AK遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号29においては、塩基番号344-346のATG、塩基番号380-382のATGあるいは塩基番号470-472のATGが開始コドンであり、塩基番号1766-1768のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号29の塩基番号344-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号1-474）、
塩基番号380-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号13-474）、または塩基番号470-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号30のアミノ酸番号43-474）を有するDNAがputative-AK遺伝子として使用できる。
【００３９】
また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００４０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４１】
なお、アスパルトキナーゼ活性は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法によって測定することができる。
【００４２】
また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子はいずれも野生型遺伝子には限られず、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、各遺伝子の上記のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
【００４３】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、上記機能が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。上記のような遺
伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように上記オープンリーディングフレームの塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００４４】
さらに、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、各遺伝子の上記オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００４５】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００４６】
また、ビブリオ属で機能するベクターとは、例えばビブリオ属で自律複製出来るプラスミドであれば、いずれでも用いることが出来る。ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる．選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる．
【００４７】
dapA及びlysCとビブリオ属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００４８】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００４９】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００５０】
上記のように調製した組換えＤＮＡをビブリオ属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
【００５１】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。ビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
【００５２】
DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５３】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００５４】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
【００５５】
本発明のビブリオ属細菌はＬ−リジン排出活性を増強させることによってＬ−リジン生産能が高められた細菌であってもよい。例えば、ybjE遺伝子の発現量を増加させること、lysE遺伝子の発現量を増加させることでＬ−リジン排出活性を高めることができる（特開2005-237379、WO97/23697号パンフレット）。
【００５６】
さらに、本発明の細菌は、さらに、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐してＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA,
ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットを参照にして構築できる。
【００５７】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、又はIS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００５８】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでビブリオ属に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００５９】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
【００６０】
Ｌ−トリプトファン生産菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強するように改変することによって構築できる。ここで、アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性をより強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子をビブリオ属に属する細菌に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。（国際公開第94/08031号パンフレット参照）
【００６１】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入する方法が挙げられる。（特開昭57-71397号
公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００６２】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損させたり、trpRに変異を導入することによっても好適なＬ−トリプトファン生産菌が得られる（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。
【００６３】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌は、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有するように改変することによっても構築できる。
また、Ｌ−トリプトファン生産菌としては、３−フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）すること、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株することによっても構築できる。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇させてもよい。（欧州特許763127号明細書参照）また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン生合成系、Ｌ−チロシン生合成系を弱化させてもよい。（US4,371,614）
【００６５】
また、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、エシェリヒア・コリのaroFを用いる場合、Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラギン酸または１８１番目のＬ−セリンを他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラギン酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ−プロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミノ酸残基、または１５７番目のＬ−メチオニン及び２１９番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族アミノ酸生産菌を得ることができる。（EP0488424）
【００６６】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、上述のような改変のほかに、tyrA,tyrRを欠損させた株や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、又はyedA遺伝子を増幅した株を用いることができる。
【００６７】
Ｌ−スレオニン生産能を有するビブリオ属に属する細菌として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化するように改変することによって取得できる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよ
い。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたビブリオ属に属する細菌に導入してもよい。例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を低下させることによって、スレオニン分解を抑制することができる。
【００６８】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。したがって、この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００６９】
また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにビブリオ属細菌を改変するために、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性を付与してもよい。
【００７０】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、上述に記載した遺伝子より取得できる。
【００７１】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子やそれらの遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することもＬ−スレオニン生産菌の育種に好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００７２】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、及び／又はＬ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００７３】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属細菌を構築するためには、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変することが望ましい。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)
、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA,
pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素遺伝子の中では、CS、PEPC及びGDHのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。（米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書）
【００７４】
また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増大するように改変してもよい（欧州特許出願公開1352966号明細書）し、L-グルタミン酸を排出するタンパク質をコードするyhfK遺伝子を増幅してもよい。（WO2005/085419号パンフレット）
【００７５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属に属する細菌としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた細菌を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましく、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損した菌株は、欧州特許0952221号公報、0955368号公報、米国特許5,378,616号公報を参照にして構築することが出来る。
【００７６】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する細菌としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量が増大した細菌を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼ（phosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase）（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノ−５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase）（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（amidotransferase）(hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
【００７７】
また、スルファグアニジン、D,Ｌ−1,2,4-triazole-3-alanine、及びストレプトマイシン耐性を付与することによってもＬ−ヒスチジン生産菌が得られる（ロシア2119536号）。
【００７８】
Ｌ−システイン生産菌を構築するためには、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下するように改変すること（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持させるように改変することが好ましい。（特開平11-155571号公報）
【００７９】
Ｌ−アルギニン生産菌を得るためには、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するように改変することが好ましい。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するように改変することも、Ｌ−アルギニン生産菌の育種法として好適である。
【００８０】
またＬ−アルギニン生産能を有するビブリオ属細菌として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を増大させた細菌を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ遺伝子（argA）としては、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型酵素をコードする変異型遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００８１】
Ｌ−ロイシン生産菌は、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、tyrB遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させること（特開2004-024259）、または4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシン耐性を有するように改変することによって取得することができる。また、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作する用に改変すること、（欧州特許第1067191号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するように改変すること（米国特許第5,763,231号明細書）によっても好適なＬ−ロイシン生産菌を構築することが出来る。
【００８２】
Ｌ−イソロイシン生産菌は、６−ジメチルアミノプリン耐性（特開平5-304969号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）、チアイソロイシン耐性（特開平5-130882号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性（特開平5-130882号公報）、またはアルギニンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）を付与することによって取得することができる。また、組換え体ビブリオ属細菌は、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強する方法（特開平2-458号公報、特開平2-42988号公報、特開平8-47397号公報）等によって得られる。
【００８３】
Ｌ−バリン生産菌は、WO96/06926に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びプロトンATPaseを欠損する変異を有するように改変すること、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片を細胞内に導入することによって構築することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書）。また、ilvGMEDAオペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
【００８４】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００８５】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fba;国際公開03/04664号パンフレット）、
ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００８６】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochromoe bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００８７】
＜３＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、上述の方法によって育種されたビブリオ属に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収する方法である。なお、本発明のＬ−アミノ酸の製造法はグルコースやシュクロースなどの炭素源からＬ−アミノ酸を製造する発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法であり、特許文献１〜５で開示されているような、ビブリオ属細菌を生物触媒として用いてＬ−アミノ酸の前駆体からＬ−アミノ酸を製造する方法は含まない。
【００８８】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロースを炭素源として用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。また、本発明の微生物を培養する際には、ある一定濃度の塩を含んでいることがなお好ましい。塩とは目的物質がカウンタイオンと結合して塩化したものでもよいし、食塩（NaClでもよい）なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８９】
また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ホモセリンを、Ｌ−トリプトファン発酵では、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。
【００９０】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００９１】
尚、本発明においては、特に高浸透圧下で培養することによって、より効果が発揮できる。高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。
従って、Ｌ−リジン発酵の場合、61g/L以上、好ましくは79g/L以上、さらに好ましくは115g/L以上のＬ−リジンを培地中に蓄積するような条件が好ましい。
【００９２】
また、糖を原料として直接発酵を行う場合、例えばグルコースの場合は、66g/L以上、好ましくは94g/L以上、さらに好ましくは152g/L以上のグルコースを培地中に含むとより効果が発揮でき、シュークロースの場合は、66g/L以上、好ましくは94g/L以上、さらに好ましくは152g/L以上のシュークロースを培地中に含むとより効果が発揮できる。
【実施例】
【００９３】
〔実施例１〕ビブリオ・ナトリージェンス（V. natriegens）を用いた高浸透圧下でのＬ−リジン生産
（１）V. natriegensのＬ−リジンのアナログ S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）耐性化によるＬ−リジン生産株の取得
V. natriegens野生株からのAEC耐性株取得
V. natriegens野生株IFO15636株（ATCC 14048、AJ13670）からＬ−リジンアナログであるAECへの耐性株を得るため、以下の方法でIFO15636株を変異剤N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）を用いて変異処理した。
【００９４】
V. natriegens野生株をLB-NaCl寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast
extract、30 g/L NaCl、0.4 g/L MgSO4および20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を25 mL 試験管に入れた4 ml LB-NaCl培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaClおよび0.4 g/L MgSO4を含む。pH 7.0）に接種し37℃で19時間振とう培養した。その培養液40μlを500 mL 坂口フラスコに入れた50 ml LB-NaCl培地に加え37℃で3時間振とう培養した。培養後の培養液の660 nmにおける吸光度は0.34であった。培養後の菌体を1000×gで10分間遠心することで集菌し、5 mL ML培地（2.0g/L グルコース、1.5 g/L Na2HPO4、1.5 g/L KH2PO4、3.0
g/L (NH4)SO4、15 g/L NaCl、40μM MgSO4、6μM FeCl3、24.8μM CaCl2、0.7μM ZnSO4、0.7μM CuSO4、0.8μM CoCl2、1.7μM H3BO3、1.3μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.3）に懸濁した。この菌体懸濁液1 mLに終濃度5μg/mLとなるようにNTGを加え35℃で10分間放置した。NTG処理された菌体を15000×gで30秒間遠心して集菌後、1 mL ML培地で2回洗浄し、1 mL ML培地に懸濁した。
【００９５】
変異処理菌体からAEC耐性を示す株を取得した。具体的には、懸濁液50μl（108個の細胞を含む）を0.1 g/L AECを含むML寒天培地（ML培地に20 g/L 寒天を加えたもの）に接種し37℃で培養し、コロニー形成できる株を取得した。V. natriegens野生株が0.1 g/L AECを含むML寒天培地で形成したコロニー数はNTG処理株が形成したコロニー数の1/10であった。24時間培養後にコロニー形成が観察された株を55株(（I）)、48時間後コロニー形成形成が観察された株を59株(（II）)、そして72時間培養にコロニー形成が観察された株を59株(（III）)得た。
これらの株を再度0.1 g/L AECを含むML寒天培地に塗りつけて37℃で18時間培養し、良好に生育するものを選択した。上記の（I）からは28株、上記（II）からは47株そして上記（III）からは40株の良好に増殖する株をそれぞれ得た。この合計115株をV. natriegens AEC耐性株とした。
【００９６】
V. natriegens AEC耐性株のＬ−リジン生産能評価
V. natriegens AEC耐性株115株のＬ−リジン生産能を25 mL 試験管を用いて評価した。以下の実験において、Ｌ−リジン濃度とグルコース濃度はバイオテックアナライザーAS-2
10（サクラ精機株式会社、日本）そして660nmの吸光度（OD）はDU-800（ベックマンコールター社、米国）を用いてそれぞれ計測した。Ｌ−リジン濃度測定には培養液の原液を用いた。グルコース濃度は培養液を20倍希釈して測定を行った。そして、ODは培養液を51倍希釈して測定を行った。
【００９７】
はじめに、25 mL 試験管に入れた4mL LB-NaCl培地にV. natriegens AEC耐性株115株を植菌し37℃で18時間振とう培養した。その培養液100 μlを25 mL 試験管に入れた4 mL MS-NaCl培地（40 g/L グルコース、2.0 g/L Yeast extract、1.0 g/L KH2PO4、24 g/L (NH4)SO4、4 mM MgSO4、15 g/L NaCl、36 μM MnSO4、36 μM FeSO4および0.8 μM CaCO3を含む。pH 7.0）に接種し37℃で振とう培養した。培養開始4時間後および24時間後に培養液のＬ−リジン濃度を測定した。
【００９８】
その結果、培養開始4時間後もしくは24時間後に0.7mM以上のＬ−リジン蓄積が観察されたAEC耐性株は、サンプルNo.28-15、No.28-28、No.28-29、No.28-36およびNo.29-29であった（表１）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
上記5株をフラスコ培養し、Ｌ−リジン生産能を評価した。具体的には、25 mL試験管に入れた4mL LB-NaCl培地を用いて37℃で15時間振とう培養した。その培養液10 μlを25 mL試験管に入れた4mL LB-NaCl培地に接種し37℃で1.5時間振とう培養した後、ODが0.01となるようにそれぞれ500 mL 坂口フラスコに入れた20 mL MS-NaCl培地に接種し37℃で振とう培養した。培養開始4時間後、7時間後、9時間後および24時間後に培養液のＬ−リジン濃度、グルコース濃度そしてODを測定した。
結果を図1、2および3に示す。最も高いＬ−リジン蓄積が観察されたのはサンプルNo.28-15（FERM P-21066）で、最大1.4 mMのＬ−リジンの蓄積が観察された。
【０１０１】
（２）V. natriegensを用いた高浸透圧下でのＬ−リジン生産
種々の浸透圧下でのV. natriegensのＬ−リジン生産をE. coliＬ−リジン生産株のものと比較した。具体的には、V. natriegens AEC耐性株No.28-15株（FERM P-21066）、No.28-28株、No.28-29株をE. coli WC196株（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）を対照として、0.2Mから1M (培地の浸透圧は926 mOsm〜2447 mOsm)のNaClを含む培地で培養し、Ｌ−リジン生産量を測定した。そのための培地および培養方法ならびに分析方法を以下に示す。
【０１０２】
〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース 40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O 1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
NaCl 終濃度が0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1M の各濃度になるように添加
【０１０３】
〔培養方法〕
プレシード培養；V. natriegensは、保存状態の菌をLB＋MgSO4+NaCl寒天培地(MgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)を含むLB培地)に接種し、34℃で培養した。E. coliはLB寒天培地に接種し、37℃で培養した。
種（seed）試験管培養；プレシード培養した菌をLB＋MgSO4+NaCl液体培地（V. natriegens）またはLB液体培地（E. coli）に接種し、37℃、16時間培養した。
主(main)培養；種培養液1mlを20mlのMS液体培地に接種し、37℃、 500ml容坂口フラスコで培養した。
【０１０４】
〔分析方法〕
グルコース濃度、及びＬ−リジン濃度は、培養液を15,000rpmで5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザーAS-210（サクラ精器）により測定した。浸透圧は 米国アドバンス社製 The Advanced Osmometer Model 3900を用いて測定した。
【０１０５】
各浸透圧における最大比Ｌ−リジン生産速度を図4に示した。それによると、E. coli WC196株は高浸透圧下ではＬ−リジンを蓄積することができなかったが、V. natriegens AEC耐性株No.28-15株、No.28-28株、No.28-29株は高浸透圧下でもＬ−リジンを多量蓄積することがわかった。
【０１０６】
〔実施例２〕Ｌ−リジンによる高浸透圧下でのV. natriegensの増殖
高Ｌ−リジン濃度下におけるV. natriegensとE. coliの増殖を比較観察した。
V. natriegens 野生株IFO15636株をLB-NaCl寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaCl、0.4 g/L MgSO4および20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で15時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を0.2 %グルコースを含むM9-NaCl培地（15 g/L NaCl、6.0 g/L Na2HPO4、3.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L NH4Cl、1.0 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4、4.8 μM CaCl2、0.7 μM ZnSO4、0.7 μM CuSO4、0.8 μM CoCl2、1.7 μM H3BO3、1.3 μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.0）に接種し、30℃で24時間培養した。培養後の濁度を分光光度計DU-800（Beckman Coulter, Inc.米国）を用いて波長660nmで計測したところ0.67であった。その培養液60μlを0.04 %グルコースを含む6種類のM9培地（0.05、0.27、0.55、0.82、1.1あるいは1.4 MのＬ−リジンをそれぞれ含む）4 mLに接種し、小型振盪培養装置（TN-1506、アドバンテック東洋株式会社、日本）を用いて30℃で培養し15分毎に660nmでの吸光度を観察した。
【０１０７】
また、E. coli 野生株MG1655株（ATCC No.47076）をLB寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、5 g/L NaClおよび20 g/L寒天を含む。pH 7.0）に接種し、37℃で15時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を0.2 %グルコースを含むM9培地（6.0 g/L Na2HPO4、3.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L NH4Cl、1.0 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4、4.8 μM CaCl2、0.7 μM ZnSO4、0.7 μM CuSO4、0.8 μM CoCl2、1.7 μM H3BO3、1.3 μM Na2MoO4および0.7 μM MnCl 2を含む。pH 7.0）に接種し、30℃で24時間培養した。培養後の濁度は0.67であった。その培養液60μlを0.04 %グルコースを含む6種類のM9培地（0.05、0.27、0.55、0.82、1.1あるいは1.4 MのＬ−リジンをそれぞれ含む）4 mLに接種し、小
型振盪培養装置TN-1506を用いて30℃で培養し15分毎に660nmでの吸光度OD660を観察した。
【０１０８】
V. natriegensおよびE. coliの増殖曲線からそれぞれ最大比増殖速度を求め比較を行った。ここで最大比増殖速度は、15分毎に比増殖速度を
【０１０９】
比増殖速度 (h-1) = 4×(ln(t1でのOD660) - ln(t0でのOD660))
t0 とt1の差は15分
に従い求め、最も値が高かった比増殖速度を各条件での最大比増殖速度とした。
【０１１０】
各Ｌ−リジン濃度におけるM9培地の浸透圧は、菌を接種する前の培地をadvanced CRYOMATICTM Osmometer（ADVANCED INSTRUMENTS、Inc.、米国）を用いて測定した。
【０１１１】
培養観察した結果、1550 mOsmの浸透圧下（Ｌ−リジン濃度0.8 M）においてV. natriegensでは増殖が観察されたが、E. coliでは増殖が観察されなかった（図5）。
【０１１２】
また、増殖が観察された全てのＬ−リジン濃度においてV. natriegensはE. coliよりも増殖が速く、今回観察された最も低いV. natriegens でも最大比増殖速度（浸透圧1550 mOsmのとき観察された）は0.79 h-1であり、今回観察されたE. coliの最も大きな最大比増殖速度（浸透圧670 mOsmのとき観察された）の1.7倍であった。
【０１１３】
〔実施例３〕グルコースによる高浸透圧下でのV. natriegensの増殖
V. natriegens 野生株IFO15636株をLB-NaCl寒天培地に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を4 mL LB-NaCl培地に接種し37℃で14時間培養した。その培養液8μLを4 mL LB-NaCl培地に接種し37℃で3.5時間培養した。培養後の660nmの吸光度（OD660）は1.7であった。そのV. natriegens 野生株培養液471μlを0.2〜0.8 Mグルコースを含むMS培地（2.0 g/L Yeast extract、1.0 g/L KH2PO4、24 g/L (NH4)SO4、4 mM MgSO4、36
μM MnSO4、36 μM FeSO4そして0.8 μM CaCO3を含む。pH 7.0）に加え37 ℃で培養し、OD660と培養液中のグルコース濃度を経時観察した。
【０１１４】
また、E. coli野生株W3110株をLB寒天培地に接種し、37℃で6時間培養した。寒天培地上で増殖した菌を4 mL LB培地に接種し37℃で14時間培養した。その培養液8μLを4 mL LB培地に接種し37℃で3.5時間培養した。培養後のOD660は0.9であった。そのV. natriegens
野生株培養液889μlを0.2〜0.8 Mグルコースを含むMS培地に接種し37 ℃で培養し、OD660と培養液中のグルコース濃度を経時観察した。
【０１１５】
OD660は分光光度計（U-2001、日立製作所、日本）を用いて計測した。グルコース濃度はバイオテックアナライザー（AS-210、サクラ精機株式会社、日本）を用いて計測した。各グルコース濃度におけるMS培地の浸透圧は、菌を接種する前の培地をadvanced CRYOMATICTM Osmometer（ADVANCED INSTRUMENTS、Inc.、米国）を用いて計測した。
OD660とグルコース濃度の変化から培養開始4.5時間後の各浸透圧下における比糖消費速度を計算し比較した。
その結果、各浸透圧下においてV. natriegensはE. coliよりも比糖消費速度が高かった（図6）。
【０１１６】
〔実施例４〕V. natriegens Ｌ−リジン生合成強化によるＬ−リジン生産
V. natriegens野生株AJ13670（IFO15636）及びAEC耐性株No.28-15株（FERM P-21066）、No.28-28株、No.28-29株にＬ−リジン生合成系遺伝子（lysC、dapA、dapB及びddh）を搭載したplasmid、pCABD2を導入し、Ｌ−リジン生産培養を行った。対照として、各株にベクターpRSのみを導入した株も作製し、同様に培養を行った。V. natriegensへのプラス
ミドDNAの導入は、エレクトロポレーション法により以下のように行った。MgSO4 0.4g/l,
NaCl(終濃度 3%)を含むLB培地で対数増殖期後期(OD=0.6から0.8)まで培養した菌体を2mM
HEPES(pH6.8)100 mM sucrose 5 mM CaCl2で3回洗浄した後、10 % glycerolにけん濁し、プラスミドDNAを添加し、9 kV/cm、25μF、200Ωのパルスをかけた後、MgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)、0.4% glucoseを含むLB培地中で2時間から3時間、34℃で振とう培養を行い、500 mg/lのストレプトマイシンを含むMgSO4 0.4g/l, NaCl(終濃度 3%)入りのLB寒天培地で、プラスミドが導入されたクローンを選択した。得られた株の培養は、実施例１と同様に行った。培養は、プレシード(Pre-seed)培養、種（seed）試験管培養、主(main)培養を通して、34℃で行い、培地にはストレプトマイシン500mg/lを添加した。主(main)培養は、終濃度0.5%のNaClを含むMS培地を用いた。培養9.3時間目のOD、培地に蓄積されたＬ−リジン濃度、対消費糖収率を表2に示す。その結果、V. natriegens No.28-15株、No.28-28株、No.28-29株のＬ−リジン生産能はＬ−リジン生合成系遺伝子を導入することによりさらに向上することがわかった。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
〔実施例５〕AK遺伝子増幅によるＬ−リジン生産V. natriegens AK遺伝子の取得
V. natriegensアスパルトキナーゼ遺伝子の取得
【０１１９】
V. natriegensのAKO遺伝子の塩基配列を決定するため、上記ゲノム解読済みのビブリオ属細菌（Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus）のAKO遺伝子（NCBI-GeneID：2615216、1190071及び1178506）において保存されている塩基配列を元に配列番号1から配列番号4に示すオリゴヌクレオチドを合成した。また、V. natriegensのthrA、metL、lysC（AKIII遺伝子）そしてputative AK遺伝子の配列を決定するため、上記ビブリオ属細菌のthrA（NCBI-GeneID：2613033、1187962そして1177497）、metL（NCBI-GeneID：2615512、1190314そして1178287）、lysC（AKIII遺伝子）（NCBI-GeneID：2614988、1190261そして1178339）そしてputative AK遺伝子（NCBI-GeneID：2612362そして1189226）において種間で保存されている塩基配列を元にオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、thrAの塩基配列を解読するため配列番号5から11、metLの塩基配列を解読するため配列番号12から16、lysCの塩基配列を解読するため配列番号17と18、putative AK遺伝子の塩基配列を解読するため配列番号19と20に示すオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号1から20において、ｒはｇとａの混合塩基を示し、ｙはｔとｃの混合塩基を示し、ｍはａとｃの混合塩基を示し、ｋはｇとｔの混合塩基を示し、ｓはｇとｃの混合塩基を示し、ｗはａとｔの混合塩基を示し、例えばT(C/T)Gは、TCGとTTGの配列を持つオリゴヌクレオチドが混在していることを示す。
【０１２０】
保存配列をもとに作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、V. natriegens IFO15636株（野生株）ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、各遺伝子の部分断片を取得した。具体的には、表3のプライマー組み合わせでPCRを行った。ゲノムDNAはDNeasy Tissue kit（QIAGEN、ドイツ）を用いて調製した。PCRは98℃で1分間反応させた後、
98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒を30サイクル繰り返し、72℃で10分反応させる条件で行った。得られたPCR産物に含まれる未反応プライマーやdNTPをMicroSpin S-400 HR（GE healthcar、米国）を用いて除去して後の実験に用いた。
【０１２１】
次に、得られた各遺伝子の部分断片を鋳型とし、各々の増幅に用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてCEQ dye termination cycle sequencing with Quick start kit（Beckman Coulter、米国）を使い各AK遺伝子ホモログ部分断片の塩基配列を決定した。解読された各AK遺伝子ホモログ部分断片の塩基配列から順次各配列と相補的なオリゴヌクレオチドを合成し各遺伝子の部分断片の塩基配列を解読した。
【０１２２】
続いて、Takara LA PCR in vitro cloning kit (タカラバイオ株式会社、日本)を用いて、先に得られた遺伝子部分断片の上下流域を取得し、塩基配列を決定した。
【０１２３】
その結果、V. natriegens のAKO遺伝子は0.6 kbpと0.2 kbp、thrAは0.8 kbpと0.4 kbp、metLは0.4 kbpと0.5 kbp、lysCは0.4 kbpと1.0 kbpそしてputative AK遺伝子は0.4 kbpと0.8 kbpの部分断片の上下流域の塩基配列をそれぞれ解読でき、AKO遺伝子（1779 bp、配列番号21）、thrA（3547 bp、配列番号23）、metL（3214 bp、配列番号25）、lysC（2648 bp、配列番号27）そしてputative AK遺伝子（2331 bp、配列番号29）の塩基配列を解読することができた。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
次に、GENETYXネットワーク版 Version 7.0.6（株式会社ゼネティックス、日本）を使って上記5種類のAK遺伝子のオープンレーディングフレーム（ORF）解析を行った。その結果、AKO遺伝子の開始コドンは配列番号21の塩基番号526-528のGTG、塩基番号544-546のGTGあるいは塩基番号568-570のGTGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号1711-1713のTGAが考えられた。thrAの開始コドンは配列番号23の塩基番号486-488のATG、塩基番号591-593のGTGあるいは塩基番号633-635のGTGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号2943-2945のTAAが考えられた。metLの開始コドンは配列番号25の塩基番号376-378のATG、塩基番号487-489のGTGあるいは塩基番号490-492のGTGが開始コドンと考えられ、
終止コドンは塩基番号2782-2784のTAAが考えられた。lysCの開始コドンは配列番号27の塩基番号1060-1062のGTGあるいは塩基番号1117-1119のATGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号2410〜2412のTAAが考えられた。putative AK遺伝子の開始コドンは配列番号29の塩基番号344-346のATG、塩基番号380-382のATGあるいは塩基番号470-472のATGが開始コドンと考えられ、終止コドンは塩基番号1766-1768のTAAが考えられた。
【０１２６】
V. natriegensアスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング
AKO遺伝子をクローニングするため、DNeasy Tissue kit（QIAGEN、ドイツ）を使い調製したV. natriegens野生株（IFO15636株）ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号31と配列番号32のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCRは98℃で1分間反応させた後、98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 150秒を30サイクル繰り返し、72℃で5分間反応させる条件で行った。得られたPCR産物から未反応のプライマーやdNTPをMicroSpin S-400 HR（GE healthcare、米国）を用いて除去し、AKO遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。
【０１２７】
得られたAKO遺伝子を含むDNA断片をSmaIとEcoRI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃60分間処理した。続いて、制限酵素処理されたAKO遺伝子とSmaIとEcoRIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28とをそれぞれライゲーションし、pSTV28_AKOを得た。
【０１２８】
同様にしてV. natiregens thrA、metL、lysCそしてputative AK遺伝子をクローニングするため、thrA増幅では配列番号33と配列番号34のオリゴヌクレオチド、metL増幅では配列番号35と配列番号36のオリゴヌクレオチド、lysC増幅では配列番号37と配列番号38のオリゴヌクレオチド、putative AK遺伝子増幅では配列番号39と配列番号40のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとして用いてAKO遺伝子増幅時と同じ条件でPCRを行い、thrA、metL、lysCおよびputative AK遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。
【０１２９】
得られたDNA断片のうちmetLを含む断片を制限酵素SmaI（タカラバイオ株式会社、日本）とSacI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃、60分間処理した。制限酵素処理されたmetLを含む断片とSmaIとSacIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28（タカラバイオ株式会社、日本）とをライゲーションし、pSTV28_AKIIを得た。
【０１３０】
一方、得られたDNA断片のうちthrA、lysCそしてputative AK遺伝子を含む断片をSmaIとEcoRI（タカラバイオ株式会社、日本）で37℃、60分間処理した。制限酵素処理されたthrA、lysCそしてputative AK遺伝子を含む断片とSmaIとEcoRIで同様に制限酵素処理されたベクターpSTV28とをそれぞれライゲーションし、pSTV28_AKI、pSTV28_AKIIIそしてpSTV28_putative-AKを得た。
【０１３１】
得られたAK遺伝子、またはその遺伝子配列を利用し、AKの活性を適宜強化することにより、Ｌ−リジン生産能の向上したビブリオ属細菌を構築しＬ−リジン生産を行わせることができる。
【０１３２】
ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる。選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。
【０１３３】
〔配列表の説明〕
配列番号１：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号２：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号３：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号４：AKO遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号５：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号６：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号７：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号８：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号９：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号10：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号11：thrA遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号12：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号13：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号14：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号15：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号16：metL遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号17：lysC遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号18：lysC遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号19：putative-AK遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号20：putative-AK遺伝子塩基配列解析用のプライマーの塩基配列
配列番号21：V. natriegensのAKO遺伝子の塩基配列
配列番号22：V. natriegensのAKO遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号23：V. natriegensのthrA遺伝子の塩基配列
配列番号24：V. natriegensのthrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号25：V. natriegensのmetL遺伝子の塩基配列
配列番号26：V. natriegensのmetL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号27：V. natriegensのlysC遺伝子の塩基配列
配列番号28：V. natriegensのlysC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号29：V. natriegensのputative-AK遺伝子の塩基配列
配列番号30：V. natriegensのputative-AK遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号31：AKO遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号32：AKO遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号33：thrA遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号34：thrA遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号35：metL遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号36：metL遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号37：lysC遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号38：lysC遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号39：putative-AK遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
配列番号40：putative-AK遺伝子増幅用のPCRプライマーの塩基配列
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】V. natriegens野生株およびAEC耐性株のOD経時変化を示すグラフ。
【図２】V. natriegens野生株およびAEC耐性株の培養液中のグルコース濃度経時変化を示すグラフ。
【図３】V. natriegens野生株およびAEC耐性株の培養液中のリジン濃度経時変化を示すグラフ。
【図４】各浸透圧におけるE. coli野生株及びV. natriegens AEC耐性株の最大比Ｌ−リジン生産速度を示すグラフ。
【図５】Ｌ−リジンによる高浸透圧条件下でのE. coliとV. natriegensの増殖速度を示すグラフ。
【図６】グルコースによる高浸透圧条件下でのE. coliとV. natriegensの糖消費速度を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記培養が、高浸透圧条件下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高浸透圧条件は、925mOsm以上の条件である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、Ｌ−アミノ酸アナログに対する耐性を付与することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸アナログが、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンから選択される１種以上のＬ−アミノ酸アナログである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素が、ジヒドロピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種又はそれ以上の酵素である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ジヒドロピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼが、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌が、さらにＬ−リジン排出活性が増強するように改変された細菌である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、前記Ｌ−アミノ酸アナログがα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸である請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素がアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、及びスレオニンシンターゼから選ばれる１種又はそれ以上の酵素である請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビブリオ属細菌が、Vibrio abalonicus、Vibrio adaptatus、Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio alginolyticus、Vibrio algosus、Vibrio anguillarum、Vi
brio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio carchariae 、Vibrio coralliilyticus、Vibrio costicola、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio cyclosites、Vibrio diazotrophicus、Vibrio fischeri、Vibrio gazogenes、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio
hispanica、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio iliopiscarius、Vibrio lentus、Vibrio liquefaciens、Vibrio logei、Vibrio marinagilis、Vibrio marinofulvus、Vibrio marinovulgaris、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mytili、Vibrio natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pectenicida、Vibrio pelagius、Vibrio penaeicida、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio psychroerythrus、Vibrio salmonicida、Vibrio shiloii、Vibrio splendidus、Vibrio tyrosinaticus、Vibrio viscosus、Vibrio wodanis、Beneckea pelagia 、及びListonella anguillarumから選択されるビブリオ属細菌である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｊ）のいずれかに記載のＤＮＡである、単離されたＤＮＡ：
(ａ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｂ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｃ)配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｄ)配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｅ)配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｆ)配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｇ)配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｈ)配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｉ)配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｊ)配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記培養が、高浸透圧条件下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高浸透圧条件は、925mOsm以上の条件である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、Ｌ−アミノ酸アナログに対する耐性を付与することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸アナログが、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンから選択される１種以上のＬ−アミノ酸アナログである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素が、ジヒドロピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種又はそれ以上の酵素である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ジヒドロピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼが、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌が、さらにＬ−リジン排出活性が増強するように改変された細菌である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、前記Ｌ−アミノ酸アナログがα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸である請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素がアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、及びスレオニンシンターゼから選ばれる１種又はそれ以上の酵素である請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビブリオ属細菌が、Vibrio abalonicus、Vibrio adaptatus、Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio alginolyticus、Vibrio algosus、Vibrio anguillarum、Vi
brio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio carchariae 、Vibrio coralliilyticus、Vibrio costicola、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio cyclosites、Vibrio diazotrophicus、Vibrio fischeri、Vibrio gazogenes、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio
hispanica、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio iliopiscarius、Vibrio lentus、Vibrio liquefaciens、Vibrio logei、Vibrio marinagilis、Vibrio marinofulvus、Vibrio marinovulgaris、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mytili、Vibrio natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pectenicida、Vibrio pelagius、Vibrio penaeicida、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio psychroerythrus、Vibrio salmonicida、Vibrio shiloii、Vibrio splendidus、Vibrio tyrosinaticus、Vibrio viscosus、Vibrio wodanis、Beneckea pelagia 、及びListonella anguillarumから選択されるビブリオ属細菌である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｊ）のいずれかに記載のＤＮＡである、単離されたＤＮＡ：
(ａ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｂ) 配列番号２１の塩基番号５６８〜１７１０の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｃ)配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｄ)配列番号２３の塩基番号６３３〜２９４２の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｅ)配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｆ)配列番号２５の塩基番号４９０〜２７８１の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｇ)配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｈ)配列番号２７の塩基番号１１１７〜２４０９の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ｉ)配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列を含むＤＮＡ、
(ｊ)配列番号２９の塩基番号４７０〜１７６５の塩基配列の相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−８８３０１（Ｐ２０１０−８８３０１Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２９１０（Ｐ２００７−２２９１０）
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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