ＰＥＧ化ｅＭＩＰ及びその製造方法並びにこれを用いた癌治療剤
【課題】MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾して得られた、癌治療剤や免疫賦活剤として有望な新規なPEG化eMIP、及びその製造方法、並びにPEG化eMIPを有効成分とする癌治療剤を提供する。
【解決手段】MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量10,000〜30,000の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIPであり、また、PEG化反応剤として平均分子量10,000〜30,000のマレイミドPEGを用いて、マレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造するPEG化eMIPの製造方法であり、更に、PEG化eMIPを有効成分として含む癌治療剤である。
【解決手段】MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量10,000〜30,000の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIPであり、また、PEG化反応剤として平均分子量10,000〜30,000のマレイミドPEGを用いて、マレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造するPEG化eMIPの製造方法であり、更に、PEG化eMIPを有効成分として含む癌治療剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（以下、「PEG」という。）で化学修飾して得られた新規なPEG化eMIP、及びその製造方法、並びにこのPEG化eMIPを有効成分として用いた癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌や免疫異常疾患の有力な治療法として、治療用タンパク質を用いる化学療法や免疫療法、更にはこれらの治療法に放射線療法を組み合わせた癌治療法等が着目されており、このような癌や免疫異常疾患の治療に用いられる治療用タンパク質に関する研究についても盛んに進められている。
【０００３】
例えば、アミノ酸約７０個からなるC-Cケモカインファミリーに属するタンパク質のMIP-1α（Macrophage Inflammatory Protein-1α）は、未熟樹状細胞において発現しているケモカインレセプターのCCR1、CCR5に対するリガンドであり、活性化リンパ球、単球等で産生され、そこから放出されて樹状細胞等の遊走を誘導することが知られており（例えば、中野英樹、細胞工学 Vol.19, No.9, pp1304-1310(2000)参照）、また、癌局所や炎症局所に樹状細胞を集積させる能力があり、更に血中に樹状細胞前駆体を数十倍のオーダーで動員する能力があることも見い出されており（Yoneyama H. et al., J. Exp. Med. Vol.193(1), pp35-49(2001), Zhang Y. et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol.96, pp201-209(2004)）、更に、免疫誘導のマウスモデルにおいて、MIP-1αを免疫局所で発現させると、樹状細胞の集積が起こり、抗原特異的な免疫が誘導されることが報告されている（McKay PF et al., Eur. J. immunol., Vol.34, pp1011-1020(2004)）。
【０００４】
また、MIP-1αと同様の生物活性を有するMIP-1α機能的誘導体も知られており、例えば、MIP-1αの２６番目のAspがAlaに置換され、アミノ末端がSerから始まる６９アミノ酸よりなるMIP-1αの変異体（以下、「eMIP」という）が知られている。このeMIPについては、著しく改善された抗凝集能を有すると共に野生型と同等の活性を有することが見い出されており、癌化学療法の副作用である血中の顆粒球減少症の改善についても検討されている（E. Marshall et al., European Journal of Cancer, Vol.34, No.7, pp1023-1029(1998)）。
【０００５】
本発明者らは、このeMIPにおける免疫力の増強作用に着目し、このeMIPについて種々検討した結果、その放射線療法との併用効果、アブスコパル効果（abscopal effect）の増強効果、アジュバント（adjuvant）との併用効果、腫瘍転移抑制効果等を見出して一定の成果を収めると共に、このeMIPを両親媒性高分子、特に、部分ブチルエステル化スチレン-マレイン酸共重合体〔Bu-SMA；スチレンと無水マレイン酸のラジカル共重合により得られるスチレン−マレイン酸共重合体（SMA）の酸無水物をクメン等の有機溶媒に溶解させ、この溶液中に攪拌下にn-ブタノールを滴下して反応させ、部分的に無水環をブチルエステル化させて得られる共重合体〕を用いて化学修飾し、eMIPの１分子に対して２〜３個のBu-SMAが結合した部分ブチルエステル化スチレン-マレイン酸共重合体修飾eMIP（Bu-SMA-eMIP）を調製した（WO 2006/080171 A1参照）。
【０００６】
ここで、治療用タンパク質を両親媒性高分子で化学修飾する目的は、タンパク質を保護してその安定性を高め、投与された生体内を循環する時間（循環半減期）を長くし、また、反復投与による中和抗体の発生を抑制し、これによって治療効果を高めることにある。すなわち、タンパク質が両親媒性高分子で化学修飾されると、その化学結合によってタンパク質の骨格自体にタンパク質分解酵素が物理的に接触するのを有効に遮断することができ、その結果として、タンパク質の分解が防止され、また、特定の条件下でタンパク質の安定性と循環時間が増大し、かつ、免疫原性を減少させることが期待される。
【０００７】
そして、このようにタンパク質を化学修飾する両親媒性高分子として、ポリエチレングリコール(PEG)が知られており、治療用タンパク質を化学修飾する目的でよく用いられている。例えば、アダゲン（Adagen）、すなわちアデノシンデアミナーゼのPEG化製剤は、重篤な合併型免疫不全症の治療に有効であることが証明されており、また、PEG化顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）については、抗癌剤投与時における顆粒球減少症を治療するために使われている。更に、PEG化α-インターフェロンは、既に肝炎治療に使用されており、βインターフェロンは臨床試験中である。その他にも、PEGで修飾されたインターロイキンー１、インターロイキンー６等が知られている。一般に、PEGで化学修飾されたPEG化タンパク質において、PEG分子は、タンパク質に見られるリジン残基又はＮ末端のアミノ基等の反応性基に結合する。
【０００８】
しかるに、例えば、堤 康央らは、このような治療用タンパク質のPEG化に関して、以下のように述べている。すなわち、インターフェロン-α（IFN-α）をPEG化（PEGylation）して得られたPEG 化IFN-αは、Ｃ型肝炎に対する特効薬として臨床に供されているが、依然として、タンパク質の高分子バイオコンジュゲーションによって医薬品化に成功した例は少ないのが現状であり、その最大の原因は、活性発現部位への水溶性高分子の導入による致命的な比活性低下と、バイオコンジュゲート化タンパク質の分子的・機能的な不均一性にある〔「PEG化たんぱく質の現状と今後」、堤 康央、角田慎一、鎌田春彦、バイオテクノロジーフォーラム 第三回学術集会 新世代タンパク質性医薬品の開発動向と規制(H17.12.14主催バイオロジクスフォーラム）〕。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2006/080171 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、先に検討したeMIPがアミノ酸の部分改変型タンパク質製剤であって、反復投与により中和抗体ができる可能性が高いので、また、eMIP自体の安定性、循環半減期の延長、及び免疫原性の減少等の効果（修飾効果）が期待できることから、このeMIPについて、それ自体の薬理学的活性をできるだけ低減させることなくPEG修飾効果を発現させることを目的に、PEGによる化学修飾を試みた。
【００１１】
この結果、本発明者らは、eMIPの１分子に対して１個又は２個のPEG基が導入されたPEG化eMIPの調製に成功すると共に、意外なことには、PEG化学修飾によりeMIPの生物活性（例えば、走化性）が低下するにもかかわらず、in vitroでの抗腫瘍活性がむしろ増大することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾して得られた、癌治療剤や免疫賦活剤として有望な新規なPEG化eMIPを提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、このような癌治療剤や免疫賦活剤として有望なPEG化eMIPを製造するための製造方法を提供することにある。
更に、本発明の他の目的は、このようなPEG化eMIPを有効成分として含む癌治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量１０，０００〜３０，０００の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIPである。
【００１５】
また、本発明は、eMIPをPEGで化学修飾するためのPEG化反応剤として、平均分子量が10,000〜30,000であって、かつ、その反応基がマレイミド基で置換されたマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造することを特徴とするPEG化eMIPの製造方法である。
【００１６】
更に、本発明は、このようなPEG化eMIPを有効成分として含むことを特徴とする癌治療剤である。
【００１７】
本発明において、eMIPを化学修飾する直鎖型又は分枝型のPEGは、その平均分子量が10,000以上30,000以下であるのがよく、平均分子量が10,000未満であるとeMIPそれ自体の薬理学的活性（特に、抗腫瘍活性）よりその活性が低下する傾向にあり、また、平均分子量が30,000を超えても同様にeMIPそれ自体の薬理学的活性よりその活性が低下する傾向が認められる。
【００１８】
また、eMIPに化学修飾させるPEG基の数については、特に制限されるものではないが、eMIPそれ自体の薬理学的活性を可及的に低下させることなく効果的に発現させる上で、好ましくは１個又は２個であり、より好ましくは１個であるのがよい。
【００１９】
本発明において、PEG化eMIPの調製に用いるeMIPについては、例えば、ヒトMIP-1αcDNAの部位特異的変異によりeMIPのcDNAを調製し、このeMIPのcDNAを用いてShizosaccharamyces pombeを形質転換させることによりeMIP発現株を取得し、次いで、このeMIP発現株を培養して培地中にeMIPを分泌させ、得られた培地上清を精製して調製することができる。
【００２０】
この目的で用いるヒトMIP-1αについては、７０個のアミノ酸からなる70アミノ酸型のヒト成熟型MIP-1αや、CD8+T細胞又はHTLV-1感染細胞のMT4培養液上清から得られて６６個のアミノ酸からなる66アミノ酸型MIP-1αを始めとして、70アミノ酸型MIP-1αとは配列が３残基異なって遺伝子コピー数の異なる非対立遺伝子LD78β等のこれまでに知られているものを使用することができる。
【００２１】
また、本発明のPEG化eMIPの調製に用いるPEG化反応剤については、その平均分子量が10,000以上30,000以下の直鎖型又は分枝型であって、かつ、その反応基がeMIPのアミノ基と反応する−NHS基、−CHO基、−マレイミド基（Maleimide group）等であるものを挙げることができ、特にeMIPの１分子に１個のPEG基を導入する上で、より好ましくはマレイミド基を有するマレイミドPEG（Maleimide-PEG）である。このようなPEG化反応剤としては、例えば日本油脂社製のポリエチレングリコール(PEG)誘導体「商品名：SUNBRIGHTシリーズ」中のCSシリーズ（−CO-CH2CH2-COO-NHS）、GSシリーズ（−CO-CH2CH2CH2-COO-NHS）、ASシリーズ（−CH2-COO-NHS）、HSシリーズ（−CH2CH2CH2CH2CH2-COO-NHS）、NPシリーズ（−CO2-phenyl-NO2）、ALシリーズ（−CH2CH2-CHO）、DEシリーズ（−CH2CH2CH(OC2H5
)2）、MAシリーズ（−CH2CH2CH2NHCOCH2CH2-Maleimide）等がある。
【００２２】
本発明において、eMIPにPEG化反応剤を反応させてPEG化eMIPを調製する際の反応条件については、これまでにタンパク質のPRG化学修飾の際に採用されている反応条件を採用できるものではあるが、特にeMIPの１分子に１個のPEG基を導入する上で、好ましくはPEG化反応剤としてマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の条件下、より好ましくはｐＨ８．０〜８．４の条件下で反応させるのがよい。このeMIPのアミノ基に対するマレイミドPEGの反応比率が１倍より少ないと、未反応eMIP量が増して不経済であり、反対に、１．５倍より多くなると、多分子PEG修飾化(polyPEGylation)の問題が生じ、また、反応条件が酸性条件下になるとeMIPの―S-S―結合が開裂し、eMIPの薬理学的活性が変化し、また、低減する虞がある。
【００２３】
本発明のPEG化eMIPは、その走化性に関する生物活性をみると、PEG化されていないeMIP
それ自体と比較して、その生物活性を示す濃度が１０〜１００倍の範囲で必要になって生物活性が低下しているにもかかわらず、例えば放射線照射後投与のin vitro抗腫瘍効果確認試験において、抗腫瘍効果がむしろ増大するという意外な効果を発現した。
【００２４】
本発明のPEG化eMIPは、eMIPそれ自体と同様に、いわゆるＥＰＲ（electron paramagnetic resonance）効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待され、癌治療剤として有用であるほか、免疫賦活剤としても期待される。すなわち、PEG化eMIPが直接・間接に関与する癌の発症予防剤又は治療剤として提供されるほか、炎症性疾患や臓器障害の発症予防剤又は治療剤としても期待される。また、一般的に使用されている抗がん剤と併用することも可能である。
【００２５】
また、本発明のPEG化eMIPは、eMIPそれ自体と同様に、非経口的に投与するのが好ましく、例えば、水、若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液又は懸濁液などの注射剤として用いられることが好ましいが、注射剤以外の剤形、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
【００２６】
このようにして得られるPEG化eMIPの製剤は、例えば、ヒト又は哺乳動物対して投与することができる。本発明の有効成分の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、非経口的に投与する場合の該有効成分の１回投与量は、例えば、成人（体重６０kgとして）に投与する場合、一回につき約０．０１〜２０mg程度、好ましくは約０．１〜１０mg程度である。他の動物の場合も、６０kg当たりに換算した量を投与することができる。本発明に関わる免疫増強剤は、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾して得られる癌治療剤や免疫賦活剤として有望な新規なPEG化eMIPを提供するほか、特に、種々のPEG修飾効果が期待されるだけでなく、抗腫瘍活性に優れた癌治療剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例１の反応液をSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００２９】
【図２】図２は、実施例２の反応液をSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００３０】
【図３】図３は、実施例２の反応液から未反応eMIPを除去した後にSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００３１】
【図４】図４は、試験例１の生物活性測定の結果を示すグラフ図である。
【００３２】
【図５】図５は、試験例２における照射固形腫瘍増殖抑制効果（右側のグラフ図）及び非照射固形腫瘍における増殖抑制効果（abscopal effect）（左側のグラフ図）の測定結果を示すグラフ図である。
【００３３】
【図６】図６は、試験例２における腫瘍増殖抑制効果の測定結果を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、参考例、実施例、及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態をより具体的に説明する。
【００３５】
［参考例１：MIP-1α変異体eMIPの製造］
eMIPのcDNAは、ヒトMIP-1αcDNAをテンプレートとし、Quick Change Kit (Stratagene社)を用いて、gac(Asp26)からgcc(Ala26)への部位特異的変異により調製した。
【００３６】
すなわち、下記表１に示す塩基配列（配列番号１）を有する１２５ngの変異プライマーRQ1、テンプレートプラスミドDNA(pBlue-RQ1)１０ng、及び５０μMｄNTPを含む５０μlの反応系にPfu-turbo(2.5U/μl)１μlを添加し、９５℃３０秒の変性に続き、９５℃３０秒、５５℃１分及び６８度７分を１サイクルとする変性を１２サイクル行った後、反応系に１μlの制限酵素DpnIを添加し、３７℃で１時間反応させることによりテンプレートDNAを切断し、変異プラスミドpBlue-eMIPのみを回収した。
【００３７】
次に、変異部位が正しく置換されたことをDNA配列解析により確認した後、・プラスミドpBlue-eMIPを鋳型とし、下記表１に示す塩基配列（配列番号３及び４）を有するprimer（EMIP-FW1, EMIP-RV1）を用いてKOD polymerase PCRを９４℃２４０秒の変性に続き、９４℃３０秒、５０℃３０秒及び７２℃１分を１サイクルとする変性を２０サイクル行った。得られたPCR産物を制限酵素Afl IIとKpn Iでトリミングした後、Afl IIとKpn Iで処理したpSL2P3M5ベクターにサブクローニングした。S. pombeの染色体にeMIP遺伝子を組込むために、まず染色体外複製型ベクターpTL2P3eMIPから発現カセット（hCMV promoter - P3 signal - eMIP ORF - terminator）をSpe IとBst1107 Iで切り出し、１．４kbpのフラグメントを回収した。同じくpXL1ベクターをSpe IとBst1107 Iで処理し、７．３ｋbpのフラグメントを回収した。得られた２つのフラグメントを連結し、染色体組込み型ベクターpTL2P3eMIP-XL(8.7 kbp)を作製した。eMIP遺伝子を最終的に４個組み込んだeMIP発現ベクターpTL2P3eMIP-4XL得た。これをBstW I消化により線状化した後、S. pombe [leu1-32 h- ] （ATCC 23848）を酢酸リチウム法（Okazaki et al, Nucleic Acids Research 18: 6485-6489）により形質転換した。形質転換された酵母を、ロイシン欠如最小栄養培地プレート（MMA#プレート）上において、30℃で静置培養した。得られたコロニーを、SDC-Leu##液体培地に接種し30℃で24時間培養することにより、組換え酵母ASP1973（Leu+）を取得した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
アミノ酸（L-アラニン、L(+)-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L(+)-イソロイシン、L-ロイシン、L(+)-リシン、L-メチオニン、L(-)-フェニルアラニン、L(-)-プロリン、L-セリン、L(-)-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン）、追加ビタミン（塩化コリン、葉酸、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、チミジン、リボフラビンリン酸、ナトリウム二水和物）、及びグルコースを補填したSMF23培地を用い、200リットル(L)ジャーファンメンター（Jar fermentor)培養槽にて３０℃４８時間培養することにより、培地中にeMIPを分泌させた。
【００４０】
この培地上清を０．２２μmのフィルターにてろ過除菌し、得られたろ過除菌したものを出発材料とし、AKTA-primeシステム(GEヘルスケア社製)を用いて組換えeMIPの精製を行った。
【００４１】
すなわち、培地上清に１０倍濃度のギ酸緩衝液〔0.5M-Formic acid(pH4.0)〕を1/10量添加し、次いで最終的にｐＨ４．０及び濃度０．０１%となるようにTween20を添加してサンプルを調製した。
次に、AKTA-primeシステム(GEヘルスケア社)を用いて、上で得られたサンプルを、予め５０mMのFormic acid(pH4.0)で平衡化させた陽イオン交換クロマトグラフィ（GEヘルスケア社製SP-FFカラム；5mLサイズ)に５mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。
【００４２】
eMIPの50mMギ酸濃度で平衡化されているSP-FFカラムからの溶出は、1M-塩化ナトリウムを含むギ酸緩衝液(pH4.0)をグラジエント(gradient)で添加して行った。高濃度のギ酸で溶出したeMIP SP-FFカラム溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて確認した。
ピーク画分は、ギ酸を除去するため５０mMのリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した。
【００４３】
続いて、上記のeMIP SP-FFカラム溶出画分を疎水クロマトグラフィ（GEヘルスケア社製HIC Phenyl-FFカラム；1mlサイズ)に１mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。HIC Phenyl-FFカラムからのeMIPの溶出は、1M-硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液(pH7.0)をグラジエントで添加して行った。HIC Phenyl-FFカラムからのeMIPの溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。ピーク画分は、硫酸アンモニウムを除去するために１０mMのリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した。
【００４４】
更に引き続いて、上記のeMIPのHIC Phenyl-FFカラム溶出画分をアフィニティクロマトグラフィ（チッソ社製Heparin Affinityカラム；5mlサイズ)に１mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。eMIPの溶出は、1M-塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(pH7.0)をグラジエントで添加して行った。eMIPのHeparin Affinityカラム溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて確認した。ピーク画分を回収した後、超純水（MiliQ水）に透析した後、PEG修飾用のeMIP試料溶液として用いた。
【００４５】
［実施例１：PEG化eMIPの調製］
先に調製した１０mg/mlのeMIP試料溶液中に1mM-EDTAを含む0.1M-Bicine(pH8.0)を等量加え、そこにDMFに溶解した平均分子量５kDaの直鎖型のα-Succinimidyloxysuccinyl-ω-methoxy（NHS)-PEGsを、eMIPのアミノ基１モルに対してPEG基が１．５倍モルとなるように過剰量添加し、４℃で軽く攪拌しながら２日間反応させた。
【００４６】
得られた反応液を、SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図１に示す。
図１に示す結果から明らかなように、直鎖型5kD-PEG基が２個（18kD付近）、４個（28kD付近）、あるいは８個（48kD付近）結合したPEG化eMIP(PEG-eMIP)が合成されていることが確認された。
【００４７】
［実施例２：PEG化eMIPの調製］
先に調製したeMIP試料溶液を用い、また、平均分子量４０kDa及び２０kDaの分岐型のマレイミドPEG（Maleimide-PEGs）と平均分子量２０kDa、１２kDa、及び５ｋDaの直鎖型のマレイミドPEG（Maleimide-PEGs）とを用い、上記実施例１と同様に、１０mg/mlのeMIP試料溶液中に1mM-EDTAを含む0.1M-Bicine(pH8.0)を等量添加し、次いで、得られた溶液中に各マレイミドPEGのDMSO溶液を、eMIPのアミノ基１モルに対してPEG基が１．５倍モルとなるように添加し、４℃で軽く攪拌しながら２日間反応させた。
【００４８】
得られた反応液を、SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図２に示す。
この図２に示す結果から明らかなように、この実施例２においては、いずれの分子量タイプのPEGにおいても、１分子のeMIPに１個のPEG基が導入されたPEG-eMIPが合成されていることが確認された。
【００４９】
ここで、上記SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）において、同時に未反応のeMIPも確認されたため、それを除去するために以下のゲルろ過による精製処理を行った。このゲルろ過の操作は全て４℃のクロマトチャンバー内にて行った。すなわち、５カラム体積以上のダルベッコ（Dulbecco）リン酸緩衝塩類溶液(D-PBS)を用いて平衡化したHiload 16/60 Superdex 75pg（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に反応溶液を添加し、１ml/minの流速にて２ml/Fractionで回収した。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にてeMIP溶出画分を確認した後、PEG-eMIP画分のみを回収した。
【００５０】
PEG-eMIP画分を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図３に示す。
PEG-eMIP画分を回収した後、D-PBSにて透析し、Ａ280を測定して、eMIP濃度を以下の式により求めた。
eMIP濃度（mg/mL）＝（吸光度÷12.0）×10（12.0：eMIP原薬の比吸光度）
【００５１】
［試験例１：PEG-eMIPの生物活性測定］
上記実施例２で各マレイミドPEGを用いて得られた平均分子量の異なる分岐形又は直鎖型の各PEG-eMIP（分岐型40kDa、分岐型20kDa、直鎖型20kDa、直鎖型12kDa、及び直鎖型5kDa）について、細胞遊走活性測定装置（NEURO PROBE社製ChemoTx #101-5）を用い、その生物活性（走化性）をBoyden法により測定した。測定方法は、付属の取り扱い説明書に従って実施した。
【００５２】
すなわち、先ず、細胞遊走活性測定装置の下部ウェルに、eMIP及び各PEG-eMIPの希釈溶液をそれぞれ２９．５μl/wellずつ入れ、付属の遊走膜を取り付け、その上に１×１０7cells/mlに調整したJurkat/CCR1細胞を２５μl添加した。次に、３７℃で２時間反応させた後、サンプル試料を除去し、遊走膜を取り外して、ウェル内の細胞溶液をファンネルプレート(NEURO PROBE社製)に移した。予め希釈調整しておいたCell Counting Kit-F（Dojindo社製）を１１０μl/wellとなるように添加し、遮光条件下３７℃３０分間の条件で反応させた後、プレートリーダー(BERTHOLD社製)にて吸光度(Excitation:485nm; Emission:535nm)の測定を行った。
【００５３】
この生物活性測定の結果を図４に示す。
この図４に示す結果から明らかなように、eMIPは０．６８×１０-8Mで最大活性が認められたのに対して、40kDa-分岐型及び20kDa-分岐型のPEG-eMIPは０．６８×１０-7Mで、20kDa-直鎖型及び5kDa-直鎖型のPEG-eMIPは０．６８×１０-8Mで、また、12kDa-直鎖型のPEG-eMIPは０．６８×１０-6Mでそれぞれ最大活性が認められた。いずれのPEG-eMIPについてもこのin vitro試験において活性を有することが示され、また、各PEG-eMIPのPEG分子量間における活性の差は、全てのPEG-eMIPにおいて、遊走のピークになる濃度はeMIPのそれの１０倍から１００倍の範囲内で認められたものの、ピーク濃度における遊走活性の強さはeMIPと同程度の生物活性が認められた。
【００５４】
［試験例２：PEG-eMIPの抗腫瘍効果確認試験］
上記実施例２で得られた各PEG-eMIPの抗腫瘍効果確認試験を実施した。
試験方法は、1週間飼育した後のBALB/cマウス（6週齢、雄性:日本SLC株式会社）を実験動物として使用し、また、マウス大腸癌細胞株のColon26についてはin vitroで継代培養したものを使用し、Colon26をマウス背部皮下に２×１０5cellsずつ左右２箇所に移植し、固形腫瘍を作成した。
【００５５】
腫瘍径が１０mm程度に増殖した１８日目に、右側の腫瘍に６Gyの放射線を照射し、その翌日、eMIP又は各PEG-eMIP（分岐型20kDa：B20kD、直鎖型20kDa：D20kD）の投与量が１μg/mouseとなるように、２９ゲージ針(NIPRO)を用いてマウスに静脈内投与した。ネガティブコントロール群にはD-PBSを投与した。２〜３日毎に腫瘍径とマウス体重を測定し、投与開始から１５日目まで経過観察した
【００５６】
図５に、右側の照射固形腫瘍増殖抑制効果の観察結果〔図５(a)〕と左側の非照射固形腫瘍の増殖抑制効果（abscopal effect；遠達効果）の観察結果〔図５(b)〕とを示す。なお、図５中、「Cont」はネガティブコントロールを示し、「Rad」は放射線照射のみの場合を示し、「Rad/eMIP」は放射線照射とeMIP投与の場合を示し、「Rad/PEG-eMIP D20kD」は放射線照射とPEG-eMIP D20kD投与の場合を示し、また、「Rad/PEG-eMIP D20kD」は放射線照射とPEG-eMIP B20kD投与の場合を示す。
【００５７】
この図５に示された結果から明らかなように、eMIPは放射線照射した右側の腫瘍増殖抑制効果を有意に増強し、５０%以上の抑制効果を示し、また、非照射固形腫瘍の増殖抑制効果（abscopal effect；遠達効果）も示したが、その効果は比較的弱かった。
【００５８】
一方、この抗腫瘍効果確認試験に用いた平均分子量２０kDaの分岐型及び直鎖型のPEG−eMIPは、共にその照射固形腫瘍増殖抑制効果がeMIP単回投与のそれよりもより有効であった。また、非照射固形腫瘍における増殖抑制効果（abscopal effect）は、直鎖型20kDのPEG-eMIPがeMIPの効果を顕著に上回った。
【００５９】
次に、マウス背部皮下に２×１０5cellsのColon26を右１箇所に移植し、固型腫瘍を作成した。腫瘍径が１０mm程度に増殖した１８日目に、右側の腫瘍に６Gyの放射線を照射し、その翌日、eMIP又は各PEG-eMIP（分岐型40kDa、分岐型20kDa、直鎖型20kDa、直鎖型12kDa、及び直鎖型5kDa）の投与量が１μg/mouseとなるように、２９ゲージ針(NIPRO)を用いてマウスに静脈内投与した。ネガティブコントロール群にはD-PBSを投与した。２〜３日毎に腫瘍径及び体重の測定を行い、投与開始から１５日目までの腫瘍増殖抑制効果を経過観察した。
観察結果を図６に示す。なお、図６中、「Cont」はネガティブコントロールを示し、また、「Rad」は放射線照射のみの場合を示す。
【００６０】
この図６に示す結果から明らかなように、eMIPは放射線照射の効果を有意に増強し、腫瘍増殖を５０%以上抑制した。一方、５種類のPEG-eMIPのうち、平均分子量２０kDaの分岐型及び直鎖型と平均分子量１２kDaの直鎖型のものがeMIP単回投与の場合に比べてより有効であり、PEG-eMIPは、そのPEG平均分子量が１０，０００以上３０，０００以下の場合にeMIPの抗腫瘍効果を著しく強化することが判明した。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（以下、「PEG」という。）で化学修飾して得られた新規なPEG化eMIP、及びその製造方法、並びにこのPEG化eMIPを有効成分として用いた癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌や免疫異常疾患の有力な治療法として、治療用タンパク質を用いる化学療法や免疫療法、更にはこれらの治療法に放射線療法を組み合わせた癌治療法等が着目されており、このような癌や免疫異常疾患の治療に用いられる治療用タンパク質に関する研究についても盛んに進められている。
【０００３】
例えば、アミノ酸約７０個からなるC-Cケモカインファミリーに属するタンパク質のMIP-1α（Macrophage Inflammatory Protein-1α）は、未熟樹状細胞において発現しているケモカインレセプターのCCR1、CCR5に対するリガンドであり、活性化リンパ球、単球等で産生され、そこから放出されて樹状細胞等の遊走を誘導することが知られており（例えば、中野英樹、細胞工学 Vol.19, No.9, pp1304-1310(2000)参照）、また、癌局所や炎症局所に樹状細胞を集積させる能力があり、更に血中に樹状細胞前駆体を数十倍のオーダーで動員する能力があることも見い出されており（Yoneyama H. et al., J. Exp. Med. Vol.193(1), pp35-49(2001), Zhang Y. et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol.96, pp201-209(2004)）、更に、免疫誘導のマウスモデルにおいて、MIP-1αを免疫局所で発現させると、樹状細胞の集積が起こり、抗原特異的な免疫が誘導されることが報告されている（McKay PF et al., Eur. J. immunol., Vol.34, pp1011-1020(2004)）。
【０００４】
また、MIP-1αと同様の生物活性を有するMIP-1α機能的誘導体も知られており、例えば、MIP-1αの２６番目のAspがAlaに置換され、アミノ末端がSerから始まる６９アミノ酸よりなるMIP-1αの変異体（以下、「eMIP」という）が知られている。このeMIPについては、著しく改善された抗凝集能を有すると共に野生型と同等の活性を有することが見い出されており、癌化学療法の副作用である血中の顆粒球減少症の改善についても検討されている（E. Marshall et al., European Journal of Cancer, Vol.34, No.7, pp1023-1029(1998)）。
【０００５】
本発明者らは、このeMIPにおける免疫力の増強作用に着目し、このeMIPについて種々検討した結果、その放射線療法との併用効果、アブスコパル効果（abscopal effect）の増強効果、アジュバント（adjuvant）との併用効果、腫瘍転移抑制効果等を見出して一定の成果を収めると共に、このeMIPを両親媒性高分子、特に、部分ブチルエステル化スチレン-マレイン酸共重合体〔Bu-SMA；スチレンと無水マレイン酸のラジカル共重合により得られるスチレン−マレイン酸共重合体（SMA）の酸無水物をクメン等の有機溶媒に溶解させ、この溶液中に攪拌下にn-ブタノールを滴下して反応させ、部分的に無水環をブチルエステル化させて得られる共重合体〕を用いて化学修飾し、eMIPの１分子に対して２〜３個のBu-SMAが結合した部分ブチルエステル化スチレン-マレイン酸共重合体修飾eMIP（Bu-SMA-eMIP）を調製した（WO 2006/080171 A1参照）。
【０００６】
ここで、治療用タンパク質を両親媒性高分子で化学修飾する目的は、タンパク質を保護してその安定性を高め、投与された生体内を循環する時間（循環半減期）を長くし、また、反復投与による中和抗体の発生を抑制し、これによって治療効果を高めることにある。すなわち、タンパク質が両親媒性高分子で化学修飾されると、その化学結合によってタンパク質の骨格自体にタンパク質分解酵素が物理的に接触するのを有効に遮断することができ、その結果として、タンパク質の分解が防止され、また、特定の条件下でタンパク質の安定性と循環時間が増大し、かつ、免疫原性を減少させることが期待される。
【０００７】
そして、このようにタンパク質を化学修飾する両親媒性高分子として、ポリエチレングリコール(PEG)が知られており、治療用タンパク質を化学修飾する目的でよく用いられている。例えば、アダゲン（Adagen）、すなわちアデノシンデアミナーゼのPEG化製剤は、重篤な合併型免疫不全症の治療に有効であることが証明されており、また、PEG化顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）については、抗癌剤投与時における顆粒球減少症を治療するために使われている。更に、PEG化α-インターフェロンは、既に肝炎治療に使用されており、βインターフェロンは臨床試験中である。その他にも、PEGで修飾されたインターロイキンー１、インターロイキンー６等が知られている。一般に、PEGで化学修飾されたPEG化タンパク質において、PEG分子は、タンパク質に見られるリジン残基又はＮ末端のアミノ基等の反応性基に結合する。
【０００８】
しかるに、例えば、堤 康央らは、このような治療用タンパク質のPEG化に関して、以下のように述べている。すなわち、インターフェロン-α（IFN-α）をPEG化（PEGylation）して得られたPEG 化IFN-αは、Ｃ型肝炎に対する特効薬として臨床に供されているが、依然として、タンパク質の高分子バイオコンジュゲーションによって医薬品化に成功した例は少ないのが現状であり、その最大の原因は、活性発現部位への水溶性高分子の導入による致命的な比活性低下と、バイオコンジュゲート化タンパク質の分子的・機能的な不均一性にある〔「PEG化たんぱく質の現状と今後」、堤 康央、角田慎一、鎌田春彦、バイオテクノロジーフォーラム 第三回学術集会 新世代タンパク質性医薬品の開発動向と規制(H17.12.14主催バイオロジクスフォーラム）〕。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2006/080171 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、先に検討したeMIPがアミノ酸の部分改変型タンパク質製剤であって、反復投与により中和抗体ができる可能性が高いので、また、eMIP自体の安定性、循環半減期の延長、及び免疫原性の減少等の効果（修飾効果）が期待できることから、このeMIPについて、それ自体の薬理学的活性をできるだけ低減させることなくPEG修飾効果を発現させることを目的に、PEGによる化学修飾を試みた。
【００１１】
この結果、本発明者らは、eMIPの１分子に対して１個又は２個のPEG基が導入されたPEG化eMIPの調製に成功すると共に、意外なことには、PEG化学修飾によりeMIPの生物活性（例えば、走化性）が低下するにもかかわらず、in vitroでの抗腫瘍活性がむしろ増大することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾して得られた、癌治療剤や免疫賦活剤として有望な新規なPEG化eMIPを提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、このような癌治療剤や免疫賦活剤として有望なPEG化eMIPを製造するための製造方法を提供することにある。
更に、本発明の他の目的は、このようなPEG化eMIPを有効成分として含む癌治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量１０，０００〜３０，０００の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIPである。
【００１５】
また、本発明は、eMIPをPEGで化学修飾するためのPEG化反応剤として、平均分子量が10,000〜30,000であって、かつ、その反応基がマレイミド基で置換されたマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造することを特徴とするPEG化eMIPの製造方法である。
【００１６】
更に、本発明は、このようなPEG化eMIPを有効成分として含むことを特徴とする癌治療剤である。
【００１７】
本発明において、eMIPを化学修飾する直鎖型又は分枝型のPEGは、その平均分子量が10,000以上30,000以下であるのがよく、平均分子量が10,000未満であるとeMIPそれ自体の薬理学的活性（特に、抗腫瘍活性）よりその活性が低下する傾向にあり、また、平均分子量が30,000を超えても同様にeMIPそれ自体の薬理学的活性よりその活性が低下する傾向が認められる。
【００１８】
また、eMIPに化学修飾させるPEG基の数については、特に制限されるものではないが、eMIPそれ自体の薬理学的活性を可及的に低下させることなく効果的に発現させる上で、好ましくは１個又は２個であり、より好ましくは１個であるのがよい。
【００１９】
本発明において、PEG化eMIPの調製に用いるeMIPについては、例えば、ヒトMIP-1αcDNAの部位特異的変異によりeMIPのcDNAを調製し、このeMIPのcDNAを用いてShizosaccharamyces pombeを形質転換させることによりeMIP発現株を取得し、次いで、このeMIP発現株を培養して培地中にeMIPを分泌させ、得られた培地上清を精製して調製することができる。
【００２０】
この目的で用いるヒトMIP-1αについては、７０個のアミノ酸からなる70アミノ酸型のヒト成熟型MIP-1αや、CD8+T細胞又はHTLV-1感染細胞のMT4培養液上清から得られて６６個のアミノ酸からなる66アミノ酸型MIP-1αを始めとして、70アミノ酸型MIP-1αとは配列が３残基異なって遺伝子コピー数の異なる非対立遺伝子LD78β等のこれまでに知られているものを使用することができる。
【００２１】
また、本発明のPEG化eMIPの調製に用いるPEG化反応剤については、その平均分子量が10,000以上30,000以下の直鎖型又は分枝型であって、かつ、その反応基がeMIPのアミノ基と反応する−NHS基、−CHO基、−マレイミド基（Maleimide group）等であるものを挙げることができ、特にeMIPの１分子に１個のPEG基を導入する上で、より好ましくはマレイミド基を有するマレイミドPEG（Maleimide-PEG）である。このようなPEG化反応剤としては、例えば日本油脂社製のポリエチレングリコール(PEG)誘導体「商品名：SUNBRIGHTシリーズ」中のCSシリーズ（−CO-CH2CH2-COO-NHS）、GSシリーズ（−CO-CH2CH2CH2-COO-NHS）、ASシリーズ（−CH2-COO-NHS）、HSシリーズ（−CH2CH2CH2CH2CH2-COO-NHS）、NPシリーズ（−CO2-phenyl-NO2）、ALシリーズ（−CH2CH2-CHO）、DEシリーズ（−CH2CH2CH(OC2H5
)2）、MAシリーズ（−CH2CH2CH2NHCOCH2CH2-Maleimide）等がある。
【００２２】
本発明において、eMIPにPEG化反応剤を反応させてPEG化eMIPを調製する際の反応条件については、これまでにタンパク質のPRG化学修飾の際に採用されている反応条件を採用できるものではあるが、特にeMIPの１分子に１個のPEG基を導入する上で、好ましくはPEG化反応剤としてマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の条件下、より好ましくはｐＨ８．０〜８．４の条件下で反応させるのがよい。このeMIPのアミノ基に対するマレイミドPEGの反応比率が１倍より少ないと、未反応eMIP量が増して不経済であり、反対に、１．５倍より多くなると、多分子PEG修飾化(polyPEGylation)の問題が生じ、また、反応条件が酸性条件下になるとeMIPの―S-S―結合が開裂し、eMIPの薬理学的活性が変化し、また、低減する虞がある。
【００２３】
本発明のPEG化eMIPは、その走化性に関する生物活性をみると、PEG化されていないeMIP
それ自体と比較して、その生物活性を示す濃度が１０〜１００倍の範囲で必要になって生物活性が低下しているにもかかわらず、例えば放射線照射後投与のin vitro抗腫瘍効果確認試験において、抗腫瘍効果がむしろ増大するという意外な効果を発現した。
【００２４】
本発明のPEG化eMIPは、eMIPそれ自体と同様に、いわゆるＥＰＲ（electron paramagnetic resonance）効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待され、癌治療剤として有用であるほか、免疫賦活剤としても期待される。すなわち、PEG化eMIPが直接・間接に関与する癌の発症予防剤又は治療剤として提供されるほか、炎症性疾患や臓器障害の発症予防剤又は治療剤としても期待される。また、一般的に使用されている抗がん剤と併用することも可能である。
【００２５】
また、本発明のPEG化eMIPは、eMIPそれ自体と同様に、非経口的に投与するのが好ましく、例えば、水、若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液又は懸濁液などの注射剤として用いられることが好ましいが、注射剤以外の剤形、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
【００２６】
このようにして得られるPEG化eMIPの製剤は、例えば、ヒト又は哺乳動物対して投与することができる。本発明の有効成分の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、非経口的に投与する場合の該有効成分の１回投与量は、例えば、成人（体重６０kgとして）に投与する場合、一回につき約０．０１〜２０mg程度、好ましくは約０．１〜１０mg程度である。他の動物の場合も、６０kg当たりに換算した量を投与することができる。本発明に関わる免疫増強剤は、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、MIP-1αの変異体であるeMIPを所定のポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾して得られる癌治療剤や免疫賦活剤として有望な新規なPEG化eMIPを提供するほか、特に、種々のPEG修飾効果が期待されるだけでなく、抗腫瘍活性に優れた癌治療剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例１の反応液をSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００２９】
【図２】図２は、実施例２の反応液をSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００３０】
【図３】図３は、実施例２の反応液から未反応eMIPを除去した後にSDS-ポリアクリル電気泳動で確認した結果を示すSDS-PAGE図である。
【００３１】
【図４】図４は、試験例１の生物活性測定の結果を示すグラフ図である。
【００３２】
【図５】図５は、試験例２における照射固形腫瘍増殖抑制効果（右側のグラフ図）及び非照射固形腫瘍における増殖抑制効果（abscopal effect）（左側のグラフ図）の測定結果を示すグラフ図である。
【００３３】
【図６】図６は、試験例２における腫瘍増殖抑制効果の測定結果を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、参考例、実施例、及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態をより具体的に説明する。
【００３５】
［参考例１：MIP-1α変異体eMIPの製造］
eMIPのcDNAは、ヒトMIP-1αcDNAをテンプレートとし、Quick Change Kit (Stratagene社)を用いて、gac(Asp26)からgcc(Ala26)への部位特異的変異により調製した。
【００３６】
すなわち、下記表１に示す塩基配列（配列番号１）を有する１２５ngの変異プライマーRQ1、テンプレートプラスミドDNA(pBlue-RQ1)１０ng、及び５０μMｄNTPを含む５０μlの反応系にPfu-turbo(2.5U/μl)１μlを添加し、９５℃３０秒の変性に続き、９５℃３０秒、５５℃１分及び６８度７分を１サイクルとする変性を１２サイクル行った後、反応系に１μlの制限酵素DpnIを添加し、３７℃で１時間反応させることによりテンプレートDNAを切断し、変異プラスミドpBlue-eMIPのみを回収した。
【００３７】
次に、変異部位が正しく置換されたことをDNA配列解析により確認した後、・プラスミドpBlue-eMIPを鋳型とし、下記表１に示す塩基配列（配列番号３及び４）を有するprimer（EMIP-FW1, EMIP-RV1）を用いてKOD polymerase PCRを９４℃２４０秒の変性に続き、９４℃３０秒、５０℃３０秒及び７２℃１分を１サイクルとする変性を２０サイクル行った。得られたPCR産物を制限酵素Afl IIとKpn Iでトリミングした後、Afl IIとKpn Iで処理したpSL2P3M5ベクターにサブクローニングした。S. pombeの染色体にeMIP遺伝子を組込むために、まず染色体外複製型ベクターpTL2P3eMIPから発現カセット（hCMV promoter - P3 signal - eMIP ORF - terminator）をSpe IとBst1107 Iで切り出し、１．４kbpのフラグメントを回収した。同じくpXL1ベクターをSpe IとBst1107 Iで処理し、７．３ｋbpのフラグメントを回収した。得られた２つのフラグメントを連結し、染色体組込み型ベクターpTL2P3eMIP-XL(8.7 kbp)を作製した。eMIP遺伝子を最終的に４個組み込んだeMIP発現ベクターpTL2P3eMIP-4XL得た。これをBstW I消化により線状化した後、S. pombe [leu1-32 h- ] （ATCC 23848）を酢酸リチウム法（Okazaki et al, Nucleic Acids Research 18: 6485-6489）により形質転換した。形質転換された酵母を、ロイシン欠如最小栄養培地プレート（MMA#プレート）上において、30℃で静置培養した。得られたコロニーを、SDC-Leu##液体培地に接種し30℃で24時間培養することにより、組換え酵母ASP1973（Leu+）を取得した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
アミノ酸（L-アラニン、L(+)-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L(+)-イソロイシン、L-ロイシン、L(+)-リシン、L-メチオニン、L(-)-フェニルアラニン、L(-)-プロリン、L-セリン、L(-)-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン）、追加ビタミン（塩化コリン、葉酸、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、チミジン、リボフラビンリン酸、ナトリウム二水和物）、及びグルコースを補填したSMF23培地を用い、200リットル(L)ジャーファンメンター（Jar fermentor)培養槽にて３０℃４８時間培養することにより、培地中にeMIPを分泌させた。
【００４０】
この培地上清を０．２２μmのフィルターにてろ過除菌し、得られたろ過除菌したものを出発材料とし、AKTA-primeシステム(GEヘルスケア社製)を用いて組換えeMIPの精製を行った。
【００４１】
すなわち、培地上清に１０倍濃度のギ酸緩衝液〔0.5M-Formic acid(pH4.0)〕を1/10量添加し、次いで最終的にｐＨ４．０及び濃度０．０１%となるようにTween20を添加してサンプルを調製した。
次に、AKTA-primeシステム(GEヘルスケア社)を用いて、上で得られたサンプルを、予め５０mMのFormic acid(pH4.0)で平衡化させた陽イオン交換クロマトグラフィ（GEヘルスケア社製SP-FFカラム；5mLサイズ)に５mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。
【００４２】
eMIPの50mMギ酸濃度で平衡化されているSP-FFカラムからの溶出は、1M-塩化ナトリウムを含むギ酸緩衝液(pH4.0)をグラジエント(gradient)で添加して行った。高濃度のギ酸で溶出したeMIP SP-FFカラム溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて確認した。
ピーク画分は、ギ酸を除去するため５０mMのリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した。
【００４３】
続いて、上記のeMIP SP-FFカラム溶出画分を疎水クロマトグラフィ（GEヘルスケア社製HIC Phenyl-FFカラム；1mlサイズ)に１mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。HIC Phenyl-FFカラムからのeMIPの溶出は、1M-硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液(pH7.0)をグラジエントで添加して行った。HIC Phenyl-FFカラムからのeMIPの溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。ピーク画分は、硫酸アンモニウムを除去するために１０mMのリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した。
【００４４】
更に引き続いて、上記のeMIPのHIC Phenyl-FFカラム溶出画分をアフィニティクロマトグラフィ（チッソ社製Heparin Affinityカラム；5mlサイズ)に１mL/minの速度で送液し、このカラムにeMIPを吸着させた。eMIPの溶出は、1M-塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(pH7.0)をグラジエントで添加して行った。eMIPのHeparin Affinityカラム溶出画分は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて確認した。ピーク画分を回収した後、超純水（MiliQ水）に透析した後、PEG修飾用のeMIP試料溶液として用いた。
【００４５】
［実施例１：PEG化eMIPの調製］
先に調製した１０mg/mlのeMIP試料溶液中に1mM-EDTAを含む0.1M-Bicine(pH8.0)を等量加え、そこにDMFに溶解した平均分子量５kDaの直鎖型のα-Succinimidyloxysuccinyl-ω-methoxy（NHS)-PEGsを、eMIPのアミノ基１モルに対してPEG基が１．５倍モルとなるように過剰量添加し、４℃で軽く攪拌しながら２日間反応させた。
【００４６】
得られた反応液を、SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図１に示す。
図１に示す結果から明らかなように、直鎖型5kD-PEG基が２個（18kD付近）、４個（28kD付近）、あるいは８個（48kD付近）結合したPEG化eMIP(PEG-eMIP)が合成されていることが確認された。
【００４７】
［実施例２：PEG化eMIPの調製］
先に調製したeMIP試料溶液を用い、また、平均分子量４０kDa及び２０kDaの分岐型のマレイミドPEG（Maleimide-PEGs）と平均分子量２０kDa、１２kDa、及び５ｋDaの直鎖型のマレイミドPEG（Maleimide-PEGs）とを用い、上記実施例１と同様に、１０mg/mlのeMIP試料溶液中に1mM-EDTAを含む0.1M-Bicine(pH8.0)を等量添加し、次いで、得られた溶液中に各マレイミドPEGのDMSO溶液を、eMIPのアミノ基１モルに対してPEG基が１．５倍モルとなるように添加し、４℃で軽く攪拌しながら２日間反応させた。
【００４８】
得られた反応液を、SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図２に示す。
この図２に示す結果から明らかなように、この実施例２においては、いずれの分子量タイプのPEGにおいても、１分子のeMIPに１個のPEG基が導入されたPEG-eMIPが合成されていることが確認された。
【００４９】
ここで、上記SDS-ポリアクリル電気泳動（SDS-PAGE）において、同時に未反応のeMIPも確認されたため、それを除去するために以下のゲルろ過による精製処理を行った。このゲルろ過の操作は全て４℃のクロマトチャンバー内にて行った。すなわち、５カラム体積以上のダルベッコ（Dulbecco）リン酸緩衝塩類溶液(D-PBS)を用いて平衡化したHiload 16/60 Superdex 75pg（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に反応溶液を添加し、１ml/minの流速にて２ml/Fractionで回収した。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にてeMIP溶出画分を確認した後、PEG-eMIP画分のみを回収した。
【００５０】
PEG-eMIP画分を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にて確認した。結果を図３に示す。
PEG-eMIP画分を回収した後、D-PBSにて透析し、Ａ280を測定して、eMIP濃度を以下の式により求めた。
eMIP濃度（mg/mL）＝（吸光度÷12.0）×10（12.0：eMIP原薬の比吸光度）
【００５１】
［試験例１：PEG-eMIPの生物活性測定］
上記実施例２で各マレイミドPEGを用いて得られた平均分子量の異なる分岐形又は直鎖型の各PEG-eMIP（分岐型40kDa、分岐型20kDa、直鎖型20kDa、直鎖型12kDa、及び直鎖型5kDa）について、細胞遊走活性測定装置（NEURO PROBE社製ChemoTx #101-5）を用い、その生物活性（走化性）をBoyden法により測定した。測定方法は、付属の取り扱い説明書に従って実施した。
【００５２】
すなわち、先ず、細胞遊走活性測定装置の下部ウェルに、eMIP及び各PEG-eMIPの希釈溶液をそれぞれ２９．５μl/wellずつ入れ、付属の遊走膜を取り付け、その上に１×１０7cells/mlに調整したJurkat/CCR1細胞を２５μl添加した。次に、３７℃で２時間反応させた後、サンプル試料を除去し、遊走膜を取り外して、ウェル内の細胞溶液をファンネルプレート(NEURO PROBE社製)に移した。予め希釈調整しておいたCell Counting Kit-F（Dojindo社製）を１１０μl/wellとなるように添加し、遮光条件下３７℃３０分間の条件で反応させた後、プレートリーダー(BERTHOLD社製)にて吸光度(Excitation:485nm; Emission:535nm)の測定を行った。
【００５３】
この生物活性測定の結果を図４に示す。
この図４に示す結果から明らかなように、eMIPは０．６８×１０-8Mで最大活性が認められたのに対して、40kDa-分岐型及び20kDa-分岐型のPEG-eMIPは０．６８×１０-7Mで、20kDa-直鎖型及び5kDa-直鎖型のPEG-eMIPは０．６８×１０-8Mで、また、12kDa-直鎖型のPEG-eMIPは０．６８×１０-6Mでそれぞれ最大活性が認められた。いずれのPEG-eMIPについてもこのin vitro試験において活性を有することが示され、また、各PEG-eMIPのPEG分子量間における活性の差は、全てのPEG-eMIPにおいて、遊走のピークになる濃度はeMIPのそれの１０倍から１００倍の範囲内で認められたものの、ピーク濃度における遊走活性の強さはeMIPと同程度の生物活性が認められた。
【００５４】
［試験例２：PEG-eMIPの抗腫瘍効果確認試験］
上記実施例２で得られた各PEG-eMIPの抗腫瘍効果確認試験を実施した。
試験方法は、1週間飼育した後のBALB/cマウス（6週齢、雄性:日本SLC株式会社）を実験動物として使用し、また、マウス大腸癌細胞株のColon26についてはin vitroで継代培養したものを使用し、Colon26をマウス背部皮下に２×１０5cellsずつ左右２箇所に移植し、固形腫瘍を作成した。
【００５５】
腫瘍径が１０mm程度に増殖した１８日目に、右側の腫瘍に６Gyの放射線を照射し、その翌日、eMIP又は各PEG-eMIP（分岐型20kDa：B20kD、直鎖型20kDa：D20kD）の投与量が１μg/mouseとなるように、２９ゲージ針(NIPRO)を用いてマウスに静脈内投与した。ネガティブコントロール群にはD-PBSを投与した。２〜３日毎に腫瘍径とマウス体重を測定し、投与開始から１５日目まで経過観察した
【００５６】
図５に、右側の照射固形腫瘍増殖抑制効果の観察結果〔図５(a)〕と左側の非照射固形腫瘍の増殖抑制効果（abscopal effect；遠達効果）の観察結果〔図５(b)〕とを示す。なお、図５中、「Cont」はネガティブコントロールを示し、「Rad」は放射線照射のみの場合を示し、「Rad/eMIP」は放射線照射とeMIP投与の場合を示し、「Rad/PEG-eMIP D20kD」は放射線照射とPEG-eMIP D20kD投与の場合を示し、また、「Rad/PEG-eMIP D20kD」は放射線照射とPEG-eMIP B20kD投与の場合を示す。
【００５７】
この図５に示された結果から明らかなように、eMIPは放射線照射した右側の腫瘍増殖抑制効果を有意に増強し、５０%以上の抑制効果を示し、また、非照射固形腫瘍の増殖抑制効果（abscopal effect；遠達効果）も示したが、その効果は比較的弱かった。
【００５８】
一方、この抗腫瘍効果確認試験に用いた平均分子量２０kDaの分岐型及び直鎖型のPEG−eMIPは、共にその照射固形腫瘍増殖抑制効果がeMIP単回投与のそれよりもより有効であった。また、非照射固形腫瘍における増殖抑制効果（abscopal effect）は、直鎖型20kDのPEG-eMIPがeMIPの効果を顕著に上回った。
【００５９】
次に、マウス背部皮下に２×１０5cellsのColon26を右１箇所に移植し、固型腫瘍を作成した。腫瘍径が１０mm程度に増殖した１８日目に、右側の腫瘍に６Gyの放射線を照射し、その翌日、eMIP又は各PEG-eMIP（分岐型40kDa、分岐型20kDa、直鎖型20kDa、直鎖型12kDa、及び直鎖型5kDa）の投与量が１μg/mouseとなるように、２９ゲージ針(NIPRO)を用いてマウスに静脈内投与した。ネガティブコントロール群にはD-PBSを投与した。２〜３日毎に腫瘍径及び体重の測定を行い、投与開始から１５日目までの腫瘍増殖抑制効果を経過観察した。
観察結果を図６に示す。なお、図６中、「Cont」はネガティブコントロールを示し、また、「Rad」は放射線照射のみの場合を示す。
【００６０】
この図６に示す結果から明らかなように、eMIPは放射線照射の効果を有意に増強し、腫瘍増殖を５０%以上抑制した。一方、５種類のPEG-eMIPのうち、平均分子量２０kDaの分岐型及び直鎖型と平均分子量１２kDaの直鎖型のものがeMIP単回投与の場合に比べてより有効であり、PEG-eMIPは、そのPEG平均分子量が１０，０００以上３０，０００以下の場合にeMIPの抗腫瘍効果を著しく強化することが判明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量10,000〜30,000の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIP。
【請求項２】
eMIPにはその１分子に対して１個又は２個のPEG基が導入されている請求項１に記載のPEG化eMIP。
【請求項３】
eMIPにはその１分子に対して１個のPEG基が導入されている請求項２に記載のPEG化eMIP。
【請求項４】
eMIPをPEGで化学修飾するためのPEG化反応剤として、平均分子量が10,000〜30,000であって、かつ、その反応基がマレイミド基で置換されたマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造することを特徴とするPEG化eMIPの製造方法。
【請求項５】
有効成分として請求項１〜３の何れかに記載のPEG化eMIPを含むことを特徴とする癌治療剤。
【請求項６】
PEG化eMIPが、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPである請求項５に記載の癌治療剤。
【請求項１】
MIP-1αの変異体であるeMIPを平均分子量10,000〜30,000の直鎖型又は分枝型ポリエチレングリコール（PEG）で化学修飾してなるPEG化eMIP。
【請求項２】
eMIPにはその１分子に対して１個又は２個のPEG基が導入されている請求項１に記載のPEG化eMIP。
【請求項３】
eMIPにはその１分子に対して１個のPEG基が導入されている請求項２に記載のPEG化eMIP。
【請求項４】
eMIPをPEGで化学修飾するためのPEG化反応剤として、平均分子量が10,000〜30,000であって、かつ、その反応基がマレイミド基で置換されたマレイミドPEGを用いると共に、このマレイミドPEGをeMIPのアミノ基に対して反応比率１〜１．５倍の割合で、かつ、塩基性条件下で反応させ、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPを製造することを特徴とするPEG化eMIPの製造方法。
【請求項５】
有効成分として請求項１〜３の何れかに記載のPEG化eMIPを含むことを特徴とする癌治療剤。
【請求項６】
PEG化eMIPが、eMIPの１分子に対して１個のPEG基が導入されたPEG化eMIPである請求項５に記載の癌治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１６８５２１（Ｐ２０１１−１６８５２１Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３３０４４（Ｐ２０１０−３３０４４）
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５００２０１４０６）株式会社ＥＣＩ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５００２０１４０６）株式会社ＥＣＩ (12)
【Ｆターム（参考）】
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