ＰＲＲＳワクチンとしての豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの融合タンパク質
【解決手段】本発明は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；および、配列ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）を含有するカルボニル末端ドメインを含む、中和価を誘起する融合タンパク質であるＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３を含む、ＰＲＲＳＶサブユニットワクチンを提供する。
【効果】ＰＲＲＳＶ感染語の豚の肺で、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群で炎症が減少したことから、ＰＱＧＡＢに抗原特異的アレルギー効果がないことが示される。重要なことには、豚の感染試験において、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチンは、対照群よりＰＲＲＳＶ感染に対する防御が良好である。
【効果】ＰＲＲＳＶ感染語の豚の肺で、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群で炎症が減少したことから、ＰＱＧＡＢに抗原特異的アレルギー効果がないことが示される。重要なことには、豚の感染試験において、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチンは、対照群よりＰＲＲＳＶ感染に対する防御が良好である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚におけるＰＲＲＳＶ中和価を誘導するＰＲＲＳサブユニットワクチンの融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚繁殖・呼吸障害症候群は、初めに種々の年齢の豚の気道を襲い、雌豚には生殖機能障害を起こす、豚の感染症である。ＰＲＲＳＶは、感染した豚において中和価を有する抗体を惹起する傾向のない、強靭な耐性ウイルスである。また、ＰＲＲＳＶは、ＲＮＡウイルスであり、単純遺伝系に基づいて容易に再生されるので、遺伝子の変異の可能性が非常に高い。さらに、ＰＲＲＳＶの感染及び発症経路は、２段階に分けることができる：（Ａ）上部および下部生殖器官の上皮組織の感染；および（Ｂ）生殖器官の周辺組織における単球およびマクロファージの感染。従って、ホストは、中和価を有する粘膜免疫に加えて、体液性免疫を持たなければならず、また、感染したウイルスの除去を容易にし、ホストの防御メカニズムを強化する、細胞性免疫反応も持たなければならない。しかしながら、ＰＲＲＳＶ感染豚が自然の状態で中和価を有することはあまり容易ではなく、よって、代表的な抗体は、基本的にはＰＲＲＳＶに対して殆ど効果がなく、ウイルスの変異をも引き起こす。さらに、食細胞活動の抗体依存性の増大においては、抗体はさらに重篤なＰＲＲＳＶ感染を招くのみかもしれない。
【０００３】
台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号（また米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号として）（特許文献１）では、標的細胞特異的融合タンパク質が開示されており、これは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素の一部および機能ドメインを利用して、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７核タンパク質断片を、カルボニル末端に付加されたＫＤＥＬシグナルペプチドと融合する。融合タンパク質は、大腸菌において量産することができる。豚を融合タンパク質で免疫した場合、免疫された豚にＰＲＲＳＶを感染させた後のウイルス血症を減少させるか排除することが可能である。この特許の全文は、本明細書に組み込まれる。
【０００４】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５とＯＲＦ６との間のヘテロ二量化において、ＯＲＦ５のエピトープＣｙｓ−３４およびＯＲＦ６のエピトープＣｙｓ−８は、ウイルス感染およびそのエンベロープ・アセンブリにおいて重大な役割を演じる。（シダー・エリック(Snijder Eric)Ｊ．、ジェシカ(Jessica)Ｃら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００３年１月、７７巻、Ｎｏ．１：９７−１０４頁）（非特許文献１）。なお、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のコンセンサス配列（YKNTHLDLIYNA）は、３８番目のアミノ酸と４４番目のアミノ酸の間のエピトープであり、これはＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ−末端細胞外ドメインに位置し、中和エピトープとして認められていた（オストロウスキ(Ostrowski)Ｍ．、Ｊ．Ａ．ガレオタ(Galeota)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００２年５月、７６巻、Ｎｏ．９：４２４１−４２５０頁）（非特許文献２）。
【特許文献１】台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号（また米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号として）
【非特許文献１】シダー・エリック(Snijder Eric)Ｊ．、ジェシカ(Jessica)Ｃら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００３年１月、７７巻、Ｎｏ．１：９７−１０４頁
【非特許文献２】オストロウスキ(Ostrowski)Ｍ．、Ｊ．Ａ．ガレオタ(Galeota)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００２年５月、７６巻、Ｎｏ．９：４２４１−４２５０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
先行技術には、ＰＥとＫＤＥＬの間に、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６抗原全体を構築することが開示されている。これらの融合タンパク質の免疫の後、豚はＰＲＲＳＶを感染させた肺に重篤な炎症を患い、このことから、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６は、抗原特異的なアレルギー効果を有することが示唆される。明らかに、それらをＰＲＲＳワクチン抗原として使用することは困難である。従って、ワクチンを開発し、豚をＰＲＲＳ感染から効果的に守るために、克服されなければならない多くの問題がある。免疫毒性がより低く、高い中和価を有するように設計する必要がある。
【０００６】
本発明の目的は、融合タンパク質、およびその構築方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、その融合タンパク質を使用して、中和価を有するタンパク質からなるサブユニットワクチンを製造することに関する。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、本発明の融合タンパク質および薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質は：ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；およびＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）断片を含有するカルボニル末端ドメインを含む。
【００１０】
本発明は、さらに、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）断片を含有するカルボニル末端ドメイン；および薬学的に許容されるアジュバントを含む、ワクチンとして与えられ得る医薬組成物を含む。
【００１１】
本発明におけるＰＲＲＳＶの菌株は特に限定されず；アメリカ株、ヨーロッパ株、またはオーストラリア株であってもよい。融合タンパク質のＮ−末端ドメインに含有される断片に、特に制限はないが、好ましくは、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５、ＯＲＦ６等の、抗体性のあらゆるＰＲＲＳＶ断片である。アメリカ株を例に挙げると、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６配列の一部は、好ましくは配列番号１３の通りである。ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５構造タンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、配列番号１２の通りであってもよい。ヨーロッパ株については、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１５の通りであり、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ−末端のアミノ酸配列は、配列番号１４であってもよい。
【００１２】
本発明において、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５の一部およびＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６の一部を含有する融合タンパク質の核酸配列は、修飾されており、配列に特に制限はないが、好ましくは、大腸菌の宿主−ベクター系において大量に発現することができる核酸配列であり、発現されたタンパク質は、野生型のものと同一である。例としてアメリカ株のＰＲＲＳＶを挙げると、好ましくは、修飾された核酸配列は、配列番号１に見られるとおりである。ヨーロッパ株については、好ましくは、修飾された核酸配列は、配列番号１０の通りである。
【００１３】
本発明における、融合タンパク質の緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの好ましい具体例は、無毒化された緑膿菌外毒素であり、これはドメインＩＩＩを除く緑膿菌外毒素Ａ由来の断片である。好ましくは、緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの断片は、標的細胞上の受容体と反応し、認識し、結合する能力のあるリガンド部分として作用する。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、当業界で知られている好適なアジュバント：分散剤、湿潤剤（ツイーン８０等）、または懸濁液で調製された滅菌注射剤（滅菌注射液または油性溶液等）を含むことができる。滅菌注射製剤は、無害の注射の間、滅菌注射剤または懸濁液の希釈剤または溶媒中、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液中でも、使用することができる。許容される担体または溶媒には、マンニトール、水、リンガー液、および塩化ナトリウムの等張液が含まれる。さらに、先行技術において、殺菌し固定した油剤が溶媒または懸濁培地として使用されている（例えば、合成モノグリセリド類またはジグリセリド類）。脂肪酸類（オレイン酸類またはグリセリド誘導体等）および天然の薬学的に許容される油剤（オリーブ油またはヒマシ油等、特にそのポリオキシエチル化誘導体）が注射製剤において使用することができる。油剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤、分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤をも含むことができる。ツイーン(Tween)類およびスパン(Span)類のような、他の通常使用される界面活性剤、または乳化剤およびバイオアベイラビリティー増強剤（薬学的に許容されるミョウバン固体、液体、または他の投与形態を製造する際に通常使用される）もまた、目的物を調製するために使用することができる。
【００１５】
経口投与のための組成物は、限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤、水懸濁剤、分散剤、および液剤を含む、経口投与が許容されるあらゆる投与形態であることができる。経口投与目的のための錠剤の場合、代表的な担体には、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤がしばしば添加される。カプセル剤での経口投与には、好適な希釈剤にラクトースおよびコーンスターチが含まれる。水分散剤または乳剤の経口投与の場合、有効成分は、乳剤または懸濁剤と会合して、油相中に懸濁または分散されるであろう。必要に応じて、ある種の甘味料、香料、または着色剤を添加することができる。
【００１６】
鼻エアロゾルまたは吸入組成物は、薬学製剤の業界でよく知られた技術に従って調製することができる。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、フッ化炭素類、および／または当業界で知られている他の溶解剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の液剤として調製することができる。融合タンパク質を含有する組成物は、直腸投与のための座剤の形態で投与することもできる。
【００１７】
医薬組成物の担体は、「許容され」なければならないが、即ち、製剤中の有効成分に適合性があり（好ましくは有効成分を安定化する能力があり）、処置される被術者に有害であってはならない。担体の他の例には、コロイド状の二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ黄色１０号(D&C Yellow No. 10)が含まれる。
【００１８】
本発明における融合タンパク質の医薬組成物は、好ましくは免疫アジュバントを含む。使用される免疫アジュバントは限定されず、アルミゲルおよび、フロイントの(Freund's)ＦＣＡまたはＦＩＡまたはモノオレイン酸マンニド乳化剤（ＩＳＡ７２０またはＩＳＡ２０６、ＳＥＰＰＩＣ（登録商標）、フランス）等の油性乳剤、好ましくはＩＳＡ２０６を含む、当業界で知られている、ワクチンに使用されるあらゆる慣用のものであってもよい。
【００１９】
本発明の他の目的、優位点、および新規な特徴は、添付した図面と併せて、以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の特徴は、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６において、多数のＮ−末端アミノ酸を残して殆どの構造タンパク質を除去し、それによって融合タンパク質鎖ＰＱＧＡＢを構築し、その後そのペプチド鎖をＰＥとＫＤＥＬ３配列の間に挿入することが可能であった場合に、融合タンパク質ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−ＫＤＥＬ３がマウスおよび豚の免疫試験によって血清中和価を有したことが確認されたという知見を基にしている。
【００２１】
以下の実施例は、本発明の説明をするために提示され、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２２】
実施例１：ＰＲＲＳＶアメリカ株のＰＱＧＡＢ融合タンパク質
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５およびＯＲＦ６のタンパク質配列は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)（ＮＣＢＩ、米国）データベースより得た。ウイルス感染の上述のメカニズムに基づき、中和価を有するＰＲＲＳＶの領域は、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６のそれぞれのＮ−末端であることが知られていた。即ち、ＯＲＦ６構造タンパク質の第２〜２６アミノ酸（配列番号１３）、およびＯＲＦ５構造タンパク質の第３０〜６０アミノ酸（配列番号１２）である。この２つのペプチドが融合したアミノ酸配列を以下に示す。
【００２３】
GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA
【００２４】
ＰＲＲＳＶ−ＯＲＦ６−２〜２６−ＯＲＦ５−３１〜６３融合ペプチドの配列は、（ＯＲＦ６）−G2SSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY26（配列番号１３）および（ＯＲＦ５）−A31SNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWL ANKFDWA63（配列番号１２）ペプチドの組み合わせであったが、ここで断片GSSLDDFCを「Ｐ」、断片YDSTAPQKVLLAFSITYを「Ｑ」、断片ASNDSSSHLQLIYNLTLCを「Ａ」、およびELNGTDWLANKFDWAを「Ｂ」と定める。断片ＰＱはＯＲＦ６の一部であり、断片ＡＢはＯＲＦ５の一部である。ＧはＰＱおよびＡＢポリペプチドの隙間または橋である。Ｇは、ＯＲＦ６の２７番目のアミノ酸または２７番目からあらゆる関連コドンまでのＯＲＦ６のあらゆるポリペプチド断片であってもよい。Ｇの位置には、ＰＱおよびＡＢのポリペプチド内のいずれのアミノ酸も付加することができない。
【００２５】
実施例では、インビボで免疫防御を誘導する効果を得るために、ＰＱＧＡＢ融合ペプチド領域を使用して、中和価および免疫防御を誘導する能力のある鍵タンパク質（エピトープ）を構築する。ＰＥ−ＰＱＧＡＢ融合タンパク質の略図、および、ＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢおよびＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３のプラスミド構築のフローチャートを、それぞれ図１および図２に示す。
【００２６】
実施例２
ＰＱＧＡＢペプチドをコードする核酸配列の調製を以下に示す。アミノ酸は、ヌクレオチドトリプレットの種々の集合に対応するので、大腸菌による認識および発現が容易でない対応するヌクレオチドトリプレットの代わりに、大腸菌系において発現させるのに好適な対応するヌクレオチドトリプレットを文献（http://www.kazusa.or.jp/codon等）から得ることが好ましい。同様に、ＰＱＧＡＢペプチドをコードする配列を酵母菌系において発現させることが可能であるならば、酵母菌系（サッカロミセス(Saccharomyces)またはピチア属(Pichia spp.)等）での発現に好適なヌクレオチドトリプレットが好ましい。
【００２７】
大腸菌系で発現させるのに好適なヌクレオチドトリプレットと対応する配列は、ＰＱＧＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列に従って定めた。対応する配列の５’および３’末端に、その後のクローニングのための制限部位を付加した。消化効率を改善し、ＰＣＲプライマーの設計を容易にするため、配列の両末端に、ＣＣＣ、ＡＡＡ、ＧＧＧ、またはＴＴＴ等の、複製塩基を有するヌクレオチドトリプレットを付加することもあり得る。ＰＱＧＡＢ融合タンパク質をコードする核酸配列を、配列番号１に示す。
【００２８】
配列番号１には全部で２０７のヌクレオチドがあり、制限酵素によってプラスミドにクローニングされた場合、いくつかのヌクレオチドトリプレットが切除され、１８０−１８６のヌクレオチドがプラスミドに結合したままであった。
【００２９】
ＰＱＧＡＢ融合タンパク質をコードする標的核酸配列が同定された場合、核酸配列の制限地図を、合成の前に、ＤＮＡストライダー(Strider)で分析し、その後、制限地図に従って、標的配列の各末端をその後のクローニングのための制限部位配列に結合させた。標的配列の合成産物は、クローニングの前にある種の制限酵素で消化しなければならないので、使用される酵素に感受性を持つ全ての制限部位は、配列の構造領域では避けることが好ましい。クローニング酵素にさらされる制限部位が標的配列の構造領域に存在するならば、標的配列は、同一のアミノ酸の異なるコドンが使用されるように再度指定して、標的配列の構造領域におけるクローニングのため、同一の制限部位を除かなければならない。
【００３０】
その後、台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号に（米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号としても）開示された方法を用いて、野生型タンパク質が大腸菌系によって大量に発現されるように、野生型アミノ酸配列の対応するヌクレオチドコドンを修飾する。修飾の本質は、野生型核酸配列を、正常に発現されたアミノ酸に影響せず、大腸菌での発現の有効性を保持するように修飾することである。修飾された核酸配列は、種々のプライマー対を使用してＰＣＲによって合成することができる。プライマーは、表１に示すように番号を付す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
正方向および逆方向プライマーの配列を以下に示す：
【００３３】
正方向プライマーＦ１（配列番号２）は、配列番号１の８１〜１２４番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GCT TTC TCC ATC ACC TAC GCT TCC AAC GAC TCC TCC TCC CAC CT-3'；
【００３４】
正方向プライマーＦ２（配列番号３）は、配列番号１の４８〜９６番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-C GAC TCC ACC GCT CCC CAG AAA GTT CTG CTG GCT TTC TCC ATC ACC TA-3'；
【００３５】
正方向プライマーＦ３（配列番号４）は、配列番号１の２２〜６５番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GGT TCC TCC CTG GAC GAC TTC TGC TAC GAC TCC ACC GCT CCC CA-3'；
【００３６】
正方向プライマーＦ４（配列番号５）は、配列番号１の１〜４１番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-CCC AAA CCC CAT ATG GAA TTC GGT TCC TCC CTG GAC GAC T-3'；
【００３７】
逆方向プライマーＲ１（配列番号６）は、配列番号１の１４８〜１０６番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-A CAG GGT CAG GTT GTA GAT CAG TTG CAG GTG GGA GGA GGA GTC-3'；
【００３８】
逆方向プライマーＲ２（配列番号７）は、配列番号１の１７６〜１３３番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GC CAG CCA GTC GGT ACC GTT CAG TTC GCA CAG GGT CAG GTT GTA-3'；
【００３９】
逆方向プライマーＲ３（配列番号８）は、配列番号１の２０４〜１６４番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-TTT TTT CTC GAG AGC CCA GTC GAA TTT GTT AGC CAG CCA GTC GG-3'；
【００４０】
上記において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、遺伝子配列の逆方向の相補的配列であった。
【００４１】
初めに、ＤＮＡの鋳型を用いずに合成された断片で実施した。正方向プライマーＦ１および逆方向プライマーＲ１を、各プライマーの３‘末端の１０〜１８塩基を互いに相補的に設計して、互いにハイブリッド化し、得られた複合体を解読し、二重らせんＤＮＡ鋳型産物を得るためにポリメラーゼによって補完した。
【００４２】
初回のＰＣＲの後、２回目のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、０．０１〜４μｌのＰＣＲ産物を採り、そこに第二のプライマー対、即ち、正方向プライマーＦ２および逆方向プライマーＲ２、各０．０１〜４μｌを、必要なｄＮＴＰ類、試薬およびＰｆｕポリメラーゼと同時に添加し、２回目のＰＣＲを実施した。同様に、プライマー対Ｆ３およびＲ３をそこに添加し、ＰＣＲを再度実施した；プライマー対Ｆ４およびＲ３を用いて操作を繰り返し、それにより、２０７ｂｐの修飾されたＰＱＧＡＢ核酸配列を得た。
【００４３】
合成された核酸断片を、電気泳動に付し、予想した大きさであることを確認した。図３に示す通り、ＰＱＧＡＢ−１（２０７ｂｐ）；ＰＱＧＡＢから４つのＤＮＡ断片a、ｂ、ｃ、およびｄ（a：７０ｂｐ、ｂ：１２９ｂｐ、ｃ：１８６ｂｐ、ｄ：２０７ｂｐ）が生成された。
【００４４】
実施例３：ＰＲＲＳＶヨーロッパ株のＰＱＧＡＢ断片
実施例１および２における融合タンパク質の設計は、アメリカ株ＰＲＲＳＶを狙ったが、アメリカ株ＰＲＲＳＶとは別に、ヨーロッパ株およびオーストラリア株もまた世界的にかなり普及している。構造アミノ酸の類似性は高くなく６０〜８０％だけであるので、他のＯＲＦ５およびＯＲＦ６融合タンパク質の設計を、実施例１および２と同様の方法で行って、プライマーを設計および合成することができる。
【００４５】
ＰＲＲＳＶヨーロッパ株のＰＱＧＡＢを例にとり、融合ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１１に示す。これは、ＰＲＲＳＶヨーロッパ株の、ＯＲＦ６−Ｍ１〜Ｉ２８（配列番号１５）、およびＯＲＦ５−Ｆ３１〜Ａ６４（配列番号１４）を含有する。
【００４６】
配列を確認した後、ＰＲＲＳＶヨーロッパ株融合タンパク質の調製を、実施例１〜２と同様の方法で実施することができる。修飾された核酸配列は、種々のプライマー対を用いてＰＣＲによって合成することができる。プライマーは、表２に示す通り番号を付す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
ＰＱＧＡＢ−ＥＰ融合タンパク質をコードする標的核酸配列は、実施例２に記載された方法に従うことにより、インビトロで、上記に示したようなプライマーで合成することができる。消化効率を改善し、ＰＣＲプライマーの設計を容易にするため、配列の両末端に、ＣＣＣ、ＡＡＡ、ＧＧＧ、またはＴＴＴ等の、複製塩基を有するヌクレオチドトリプレットを付加することもあり得る。ＰＱＧＡＢ−ＥＰ融合タンパク質をコードする核酸配列を、配列番号１０に示す。
【００４９】
実施例４：標的配列を含有するプラスミドの構築
実施例２の産物を例にとる。合成された２０７ｂｐのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で消化し、結合機能および転位機能を有するペプチド配列、およびカルボキシル末端ペプチドを含有する大腸菌プラスミドに結合したところ、得られたプラスミドはｐＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３であった。
【００５０】
Ｔ７プロモーターおよびそこに構築される抗生物質抵抗性（アンピシリン）マーカーを有するｐＥＴ１５プラスミドは、ＰＲＲＳＶ ＰＱＧＡＢ断片および無毒化された緑膿菌(Pseudomonas)外毒素（ドメインＩＩＩを除く緑膿菌外毒素Ａ）の融合タンパク質を発現することができる。ベクター地図を図４に示す。
【００５１】
最後に、上記のプラスミドを融合タンパク質を発現する能力のある細菌株または細胞中に形質転換した。
【００５２】
実施例５：標的タンパク質の発現および分析
上記のプラスミドを有することを確認された細菌株は、個体群の９０％において、プラスミドとＰＱＧＡＢ遺伝子の両者を含有していた。菌株は、２ｍｌずつのグリセリン中の貯蔵品として調製し、−７０℃で保管した。無菌環境において、２ｍｌの保管された貯蔵品を、オートクレーブで処理し２００ｍｌのＬＢ（＋５００μｇ／ｍｌアンピシリン）を入れた５００ｍｌのフラスコ中に植菌し、ロータリーインキュベーターで３７℃、１５０ｒｐｍで１０〜１２時間振とうし、培養物を得た。ＯＤ６００が１．０±０．４に達するまで、液体を培養した。
【００５３】
無菌環境において、５０ｍｌの培養液体を、それぞれ１２５０ｍｌのＬＢ（＋５００μｇ／ｍｌアンピシリン＋５０ｍｌ １０％グルコース）を入れた３０００ｍｌのフラスコ８個中に植菌し、ＯＤ６００が０．３±０．１に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで２〜３時間振とうし、５０ｐｐｍのＩＰＴＧを添加し、タンパク質産生が完了するように、培養物を再度３７℃、１５０ｒｐｍで２時間で振とうした。
【００５４】
次に、封入体に含有されるＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３を、８Ｍ尿素抽出法によって溶解し、抽出したＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３タンパク質を図５に示す。１０リットルロットの培養液体から、３００〜４００ｍｇの抗原を得ることができた。得られた抗原は、ウエスタンブロット、クームスブルー染色およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析し、バンドの濃度は濃度計で測定して、抗原溶液に含有されるタンパク質を定量した。免疫化およびウイルス感染を進行させるため、０．２±０．０２ｍｇのタンパク質を低用量注射の主成分として用いた。
【００５５】
実施例６：豚における免疫化およびウイルス感染
ＳＰＦ農場において、豚をランダムに５頭ずつの３群に分けた。各群は、空調および循環機器を備えた隔離室で飼育した。１４〜２８日齢のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３免疫群の豚に、１ｍｌのＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３（注射１回当り、タンパク質２００μｇ含有）を含有し、１ｍｌのＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ（登録商標）、フランス）中に乳化させた２ｍｌのワクチンを筋肉注射し、この免疫処置を２回実施した。免疫群ＧＰ５＆Ｍは、ＰＥ−ＯＲＦ５−Ｋ３およびＰＥ−ＯＲＦ６−Ｋ３（注射１回当り、タンパク質２００μｇ含有）でそれぞれ免疫した。対照群は免疫せず飼育した。
【００５６】
最終接種の２週間後、１００ｍｇのケタミン溶液を筋肉注射して豚を鎮静した後、１ｍｌの２％リドカインを豚の鼻腔に滴下して、咳反射を抑制し、その後、豚にウイルスを経鼻的に接種した。各群の５頭の豚に、投与量１ｍｌ当り１×１０7ＴＣＩＤ50のＭＤ−１株のＰＲＲＳＶ培養物１ｍｌを接種した。
【００５７】
接種１４日後、豚を病理解剖した。肺または肝臓試料を採取し（頭葉中央部および尾状葉周縁部の両部より）、次の組織病理試験のために、１０％中性緩衝ホルムアルデヒドで固定した。試験は盲検法で実施し、間質性肺炎の重篤度に基づいて、０〜６で評価した（オプリエスニッヒ(Opriessnig)Ｔ、Ｐ．Ｇ．ハルブル(Halbur)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、７６（２００２年）：１１８３７−１１８４４頁、およびハルブル(Halbur)、Ｐ．Ｇ．、Ｐ．Ｓ．パウル(Paul)ら、１９９６年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８：１１−２０）が、ここで重篤度は数値とともに上昇する。
【００５８】
試験結果
２回目の免疫の２週間後、豚の血液中の白血球をＰＲＲＳＶについて試験した。結果から、ＰＲＲＳＶ接種前は、全ての豚でウイルス血症は起きなかったことが示された。白血球試料は、ウイルス接種後３、７、および１４日後に、それぞれＲＴ−ＰＣＲで試験した。結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
２週間の試験の後、死亡した豚および生存していた豚を含む、全ての豚を解剖した。顕微鏡検査により、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６ワクチン群のウイルス接種豚、および対照群の肺には、より拡大した病変および重篤な間質性肺炎が見られたが、一方、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群では、それ程の拡大病変および重篤な間質性肺炎は見られなかった。表４に示す通り、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群は、対照群およびＯＲＦ５およびＯＲＦ６ワクチン群より、間質性肺炎の重篤度が低いことが示された。
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
上述の試験は、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３が豚をＰＲＲＳＶ感染から効果的に防御できるだけではなく、他のワクチン（ＰＥ−ＯＲＦ５−Ｋ３、ＰＥ−ＯＲＦ６−Ｋ３等）よりも間質性肺炎の誘起を軽くすることもできることを明確に示す。
【００６４】
免疫した豚の抗体価の変化を表６に示す。Ａ群はＩｇＧ ＥＬＩＳＡ価が良好であるが、ＩＦＡおよびＮＴ価はＣ群より低い。また、表５より、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６は、免疫およびウイルス感染の後、抗原特異的アレルギー効果を有することが示される。それらをＰＲＲＳワクチン抗原として使用することは難しいことが明白である。
【００６５】
【表６】
【００６６】
本発明は、その好ましい態様に関して説明がなされたが、多数の他の可能な修正および変化は、ここに特許請求された通りの発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、実施例１のＰＥ−ＰＱＧＡＢ融合タンパク質の略図である。
【図２ａ】図２は、実施例１のＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミド構築のフローチャートである。
【図２ｂ】図２は、実施例１のＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミド構築のフローチャートである。
【図３】図３は、実施例１に従って合成された核酸断片と、４つのＤＮＡ断片（ａ：７０ｂｐ、ｂ：１２９ｂｐ、ｃ：１８６ｂｐ、ｄ：２０４ｂｐ）の電気泳動の図である。
【図４】図４は、ＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミドマップである。
【図５】図５は、大腸菌宿主ベクター系で誘導され、８Ｍ尿素抽出によって封入体から抽出されたタンパク質の結果である。レーン０ｈ、２ｈ：大腸菌をｐＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３でＩＰＴＧ誘導後、０時間および２時間の全溶解試料；および、レーン８Ｍ：ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３の８Ｍ尿素タンパク質抽出。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚におけるＰＲＲＳＶ中和価を誘導するＰＲＲＳサブユニットワクチンの融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚繁殖・呼吸障害症候群は、初めに種々の年齢の豚の気道を襲い、雌豚には生殖機能障害を起こす、豚の感染症である。ＰＲＲＳＶは、感染した豚において中和価を有する抗体を惹起する傾向のない、強靭な耐性ウイルスである。また、ＰＲＲＳＶは、ＲＮＡウイルスであり、単純遺伝系に基づいて容易に再生されるので、遺伝子の変異の可能性が非常に高い。さらに、ＰＲＲＳＶの感染及び発症経路は、２段階に分けることができる：（Ａ）上部および下部生殖器官の上皮組織の感染；および（Ｂ）生殖器官の周辺組織における単球およびマクロファージの感染。従って、ホストは、中和価を有する粘膜免疫に加えて、体液性免疫を持たなければならず、また、感染したウイルスの除去を容易にし、ホストの防御メカニズムを強化する、細胞性免疫反応も持たなければならない。しかしながら、ＰＲＲＳＶ感染豚が自然の状態で中和価を有することはあまり容易ではなく、よって、代表的な抗体は、基本的にはＰＲＲＳＶに対して殆ど効果がなく、ウイルスの変異をも引き起こす。さらに、食細胞活動の抗体依存性の増大においては、抗体はさらに重篤なＰＲＲＳＶ感染を招くのみかもしれない。
【０００３】
台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号（また米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号として）（特許文献１）では、標的細胞特異的融合タンパク質が開示されており、これは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素の一部および機能ドメインを利用して、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７核タンパク質断片を、カルボニル末端に付加されたＫＤＥＬシグナルペプチドと融合する。融合タンパク質は、大腸菌において量産することができる。豚を融合タンパク質で免疫した場合、免疫された豚にＰＲＲＳＶを感染させた後のウイルス血症を減少させるか排除することが可能である。この特許の全文は、本明細書に組み込まれる。
【０００４】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５とＯＲＦ６との間のヘテロ二量化において、ＯＲＦ５のエピトープＣｙｓ−３４およびＯＲＦ６のエピトープＣｙｓ−８は、ウイルス感染およびそのエンベロープ・アセンブリにおいて重大な役割を演じる。（シダー・エリック(Snijder Eric)Ｊ．、ジェシカ(Jessica)Ｃら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００３年１月、７７巻、Ｎｏ．１：９７−１０４頁）（非特許文献１）。なお、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のコンセンサス配列（YKNTHLDLIYNA）は、３８番目のアミノ酸と４４番目のアミノ酸の間のエピトープであり、これはＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ−末端細胞外ドメインに位置し、中和エピトープとして認められていた（オストロウスキ(Ostrowski)Ｍ．、Ｊ．Ａ．ガレオタ(Galeota)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００２年５月、７６巻、Ｎｏ．９：４２４１−４２５０頁）（非特許文献２）。
【特許文献１】台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号（また米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号として）
【非特許文献１】シダー・エリック(Snijder Eric)Ｊ．、ジェシカ(Jessica)Ｃら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００３年１月、７７巻、Ｎｏ．１：９７−１０４頁
【非特許文献２】オストロウスキ(Ostrowski)Ｍ．、Ｊ．Ａ．ガレオタ(Galeota)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、２００２年５月、７６巻、Ｎｏ．９：４２４１−４２５０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
先行技術には、ＰＥとＫＤＥＬの間に、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６抗原全体を構築することが開示されている。これらの融合タンパク質の免疫の後、豚はＰＲＲＳＶを感染させた肺に重篤な炎症を患い、このことから、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６は、抗原特異的なアレルギー効果を有することが示唆される。明らかに、それらをＰＲＲＳワクチン抗原として使用することは困難である。従って、ワクチンを開発し、豚をＰＲＲＳ感染から効果的に守るために、克服されなければならない多くの問題がある。免疫毒性がより低く、高い中和価を有するように設計する必要がある。
【０００６】
本発明の目的は、融合タンパク質、およびその構築方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、その融合タンパク質を使用して、中和価を有するタンパク質からなるサブユニットワクチンを製造することに関する。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、本発明の融合タンパク質および薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質は：ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；およびＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）断片を含有するカルボニル末端ドメインを含む。
【００１０】
本発明は、さらに、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）断片を含有するカルボニル末端ドメイン；および薬学的に許容されるアジュバントを含む、ワクチンとして与えられ得る医薬組成物を含む。
【００１１】
本発明におけるＰＲＲＳＶの菌株は特に限定されず；アメリカ株、ヨーロッパ株、またはオーストラリア株であってもよい。融合タンパク質のＮ−末端ドメインに含有される断片に、特に制限はないが、好ましくは、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５、ＯＲＦ６等の、抗体性のあらゆるＰＲＲＳＶ断片である。アメリカ株を例に挙げると、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６配列の一部は、好ましくは配列番号１３の通りである。ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５構造タンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、配列番号１２の通りであってもよい。ヨーロッパ株については、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１５の通りであり、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ−末端のアミノ酸配列は、配列番号１４であってもよい。
【００１２】
本発明において、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５の一部およびＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６の一部を含有する融合タンパク質の核酸配列は、修飾されており、配列に特に制限はないが、好ましくは、大腸菌の宿主−ベクター系において大量に発現することができる核酸配列であり、発現されたタンパク質は、野生型のものと同一である。例としてアメリカ株のＰＲＲＳＶを挙げると、好ましくは、修飾された核酸配列は、配列番号１に見られるとおりである。ヨーロッパ株については、好ましくは、修飾された核酸配列は、配列番号１０の通りである。
【００１３】
本発明における、融合タンパク質の緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ結合および転位ドメインの好ましい具体例は、無毒化された緑膿菌外毒素であり、これはドメインＩＩＩを除く緑膿菌外毒素Ａ由来の断片である。好ましくは、緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの断片は、標的細胞上の受容体と反応し、認識し、結合する能力のあるリガンド部分として作用する。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、当業界で知られている好適なアジュバント：分散剤、湿潤剤（ツイーン８０等）、または懸濁液で調製された滅菌注射剤（滅菌注射液または油性溶液等）を含むことができる。滅菌注射製剤は、無害の注射の間、滅菌注射剤または懸濁液の希釈剤または溶媒中、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液中でも、使用することができる。許容される担体または溶媒には、マンニトール、水、リンガー液、および塩化ナトリウムの等張液が含まれる。さらに、先行技術において、殺菌し固定した油剤が溶媒または懸濁培地として使用されている（例えば、合成モノグリセリド類またはジグリセリド類）。脂肪酸類（オレイン酸類またはグリセリド誘導体等）および天然の薬学的に許容される油剤（オリーブ油またはヒマシ油等、特にそのポリオキシエチル化誘導体）が注射製剤において使用することができる。油剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤、分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤をも含むことができる。ツイーン(Tween)類およびスパン(Span)類のような、他の通常使用される界面活性剤、または乳化剤およびバイオアベイラビリティー増強剤（薬学的に許容されるミョウバン固体、液体、または他の投与形態を製造する際に通常使用される）もまた、目的物を調製するために使用することができる。
【００１５】
経口投与のための組成物は、限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤、水懸濁剤、分散剤、および液剤を含む、経口投与が許容されるあらゆる投与形態であることができる。経口投与目的のための錠剤の場合、代表的な担体には、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤がしばしば添加される。カプセル剤での経口投与には、好適な希釈剤にラクトースおよびコーンスターチが含まれる。水分散剤または乳剤の経口投与の場合、有効成分は、乳剤または懸濁剤と会合して、油相中に懸濁または分散されるであろう。必要に応じて、ある種の甘味料、香料、または着色剤を添加することができる。
【００１６】
鼻エアロゾルまたは吸入組成物は、薬学製剤の業界でよく知られた技術に従って調製することができる。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、フッ化炭素類、および／または当業界で知られている他の溶解剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の液剤として調製することができる。融合タンパク質を含有する組成物は、直腸投与のための座剤の形態で投与することもできる。
【００１７】
医薬組成物の担体は、「許容され」なければならないが、即ち、製剤中の有効成分に適合性があり（好ましくは有効成分を安定化する能力があり）、処置される被術者に有害であってはならない。担体の他の例には、コロイド状の二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ黄色１０号(D&C Yellow No. 10)が含まれる。
【００１８】
本発明における融合タンパク質の医薬組成物は、好ましくは免疫アジュバントを含む。使用される免疫アジュバントは限定されず、アルミゲルおよび、フロイントの(Freund's)ＦＣＡまたはＦＩＡまたはモノオレイン酸マンニド乳化剤（ＩＳＡ７２０またはＩＳＡ２０６、ＳＥＰＰＩＣ（登録商標）、フランス）等の油性乳剤、好ましくはＩＳＡ２０６を含む、当業界で知られている、ワクチンに使用されるあらゆる慣用のものであってもよい。
【００１９】
本発明の他の目的、優位点、および新規な特徴は、添付した図面と併せて、以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の特徴は、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６において、多数のＮ−末端アミノ酸を残して殆どの構造タンパク質を除去し、それによって融合タンパク質鎖ＰＱＧＡＢを構築し、その後そのペプチド鎖をＰＥとＫＤＥＬ３配列の間に挿入することが可能であった場合に、融合タンパク質ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−ＫＤＥＬ３がマウスおよび豚の免疫試験によって血清中和価を有したことが確認されたという知見を基にしている。
【００２１】
以下の実施例は、本発明の説明をするために提示され、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２２】
実施例１：ＰＲＲＳＶアメリカ株のＰＱＧＡＢ融合タンパク質
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５およびＯＲＦ６のタンパク質配列は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)（ＮＣＢＩ、米国）データベースより得た。ウイルス感染の上述のメカニズムに基づき、中和価を有するＰＲＲＳＶの領域は、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６のそれぞれのＮ−末端であることが知られていた。即ち、ＯＲＦ６構造タンパク質の第２〜２６アミノ酸（配列番号１３）、およびＯＲＦ５構造タンパク質の第３０〜６０アミノ酸（配列番号１２）である。この２つのペプチドが融合したアミノ酸配列を以下に示す。
【００２３】
GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA
【００２４】
ＰＲＲＳＶ−ＯＲＦ６−２〜２６−ＯＲＦ５−３１〜６３融合ペプチドの配列は、（ＯＲＦ６）−G2SSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY26（配列番号１３）および（ＯＲＦ５）−A31SNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWL ANKFDWA63（配列番号１２）ペプチドの組み合わせであったが、ここで断片GSSLDDFCを「Ｐ」、断片YDSTAPQKVLLAFSITYを「Ｑ」、断片ASNDSSSHLQLIYNLTLCを「Ａ」、およびELNGTDWLANKFDWAを「Ｂ」と定める。断片ＰＱはＯＲＦ６の一部であり、断片ＡＢはＯＲＦ５の一部である。ＧはＰＱおよびＡＢポリペプチドの隙間または橋である。Ｇは、ＯＲＦ６の２７番目のアミノ酸または２７番目からあらゆる関連コドンまでのＯＲＦ６のあらゆるポリペプチド断片であってもよい。Ｇの位置には、ＰＱおよびＡＢのポリペプチド内のいずれのアミノ酸も付加することができない。
【００２５】
実施例では、インビボで免疫防御を誘導する効果を得るために、ＰＱＧＡＢ融合ペプチド領域を使用して、中和価および免疫防御を誘導する能力のある鍵タンパク質（エピトープ）を構築する。ＰＥ−ＰＱＧＡＢ融合タンパク質の略図、および、ＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢおよびＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３のプラスミド構築のフローチャートを、それぞれ図１および図２に示す。
【００２６】
実施例２
ＰＱＧＡＢペプチドをコードする核酸配列の調製を以下に示す。アミノ酸は、ヌクレオチドトリプレットの種々の集合に対応するので、大腸菌による認識および発現が容易でない対応するヌクレオチドトリプレットの代わりに、大腸菌系において発現させるのに好適な対応するヌクレオチドトリプレットを文献（http://www.kazusa.or.jp/codon等）から得ることが好ましい。同様に、ＰＱＧＡＢペプチドをコードする配列を酵母菌系において発現させることが可能であるならば、酵母菌系（サッカロミセス(Saccharomyces)またはピチア属(Pichia spp.)等）での発現に好適なヌクレオチドトリプレットが好ましい。
【００２７】
大腸菌系で発現させるのに好適なヌクレオチドトリプレットと対応する配列は、ＰＱＧＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列に従って定めた。対応する配列の５’および３’末端に、その後のクローニングのための制限部位を付加した。消化効率を改善し、ＰＣＲプライマーの設計を容易にするため、配列の両末端に、ＣＣＣ、ＡＡＡ、ＧＧＧ、またはＴＴＴ等の、複製塩基を有するヌクレオチドトリプレットを付加することもあり得る。ＰＱＧＡＢ融合タンパク質をコードする核酸配列を、配列番号１に示す。
【００２８】
配列番号１には全部で２０７のヌクレオチドがあり、制限酵素によってプラスミドにクローニングされた場合、いくつかのヌクレオチドトリプレットが切除され、１８０−１８６のヌクレオチドがプラスミドに結合したままであった。
【００２９】
ＰＱＧＡＢ融合タンパク質をコードする標的核酸配列が同定された場合、核酸配列の制限地図を、合成の前に、ＤＮＡストライダー(Strider)で分析し、その後、制限地図に従って、標的配列の各末端をその後のクローニングのための制限部位配列に結合させた。標的配列の合成産物は、クローニングの前にある種の制限酵素で消化しなければならないので、使用される酵素に感受性を持つ全ての制限部位は、配列の構造領域では避けることが好ましい。クローニング酵素にさらされる制限部位が標的配列の構造領域に存在するならば、標的配列は、同一のアミノ酸の異なるコドンが使用されるように再度指定して、標的配列の構造領域におけるクローニングのため、同一の制限部位を除かなければならない。
【００３０】
その後、台湾特許第Ｉ−２２８９９３３号に（米国特許公開第２００４／０２１４７６１７号としても）開示された方法を用いて、野生型タンパク質が大腸菌系によって大量に発現されるように、野生型アミノ酸配列の対応するヌクレオチドコドンを修飾する。修飾の本質は、野生型核酸配列を、正常に発現されたアミノ酸に影響せず、大腸菌での発現の有効性を保持するように修飾することである。修飾された核酸配列は、種々のプライマー対を使用してＰＣＲによって合成することができる。プライマーは、表１に示すように番号を付す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
正方向および逆方向プライマーの配列を以下に示す：
【００３３】
正方向プライマーＦ１（配列番号２）は、配列番号１の８１〜１２４番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GCT TTC TCC ATC ACC TAC GCT TCC AAC GAC TCC TCC TCC CAC CT-3'；
【００３４】
正方向プライマーＦ２（配列番号３）は、配列番号１の４８〜９６番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-C GAC TCC ACC GCT CCC CAG AAA GTT CTG CTG GCT TTC TCC ATC ACC TA-3'；
【００３５】
正方向プライマーＦ３（配列番号４）は、配列番号１の２２〜６５番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GGT TCC TCC CTG GAC GAC TTC TGC TAC GAC TCC ACC GCT CCC CA-3'；
【００３６】
正方向プライマーＦ４（配列番号５）は、配列番号１の１〜４１番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-CCC AAA CCC CAT ATG GAA TTC GGT TCC TCC CTG GAC GAC T-3'；
【００３７】
逆方向プライマーＲ１（配列番号６）は、配列番号１の１４８〜１０６番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-A CAG GGT CAG GTT GTA GAT CAG TTG CAG GTG GGA GGA GGA GTC-3'；
【００３８】
逆方向プライマーＲ２（配列番号７）は、配列番号１の１７６〜１３３番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-GC CAG CCA GTC GGT ACC GTT CAG TTC GCA CAG GGT CAG GTT GTA-3'；
【００３９】
逆方向プライマーＲ３（配列番号８）は、配列番号１の２０４〜１６４番目のアミノ酸に対応する。即ち、
5'-TTT TTT CTC GAG AGC CCA GTC GAA TTT GTT AGC CAG CCA GTC GG-3'；
【００４０】
上記において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、遺伝子配列の逆方向の相補的配列であった。
【００４１】
初めに、ＤＮＡの鋳型を用いずに合成された断片で実施した。正方向プライマーＦ１および逆方向プライマーＲ１を、各プライマーの３‘末端の１０〜１８塩基を互いに相補的に設計して、互いにハイブリッド化し、得られた複合体を解読し、二重らせんＤＮＡ鋳型産物を得るためにポリメラーゼによって補完した。
【００４２】
初回のＰＣＲの後、２回目のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、０．０１〜４μｌのＰＣＲ産物を採り、そこに第二のプライマー対、即ち、正方向プライマーＦ２および逆方向プライマーＲ２、各０．０１〜４μｌを、必要なｄＮＴＰ類、試薬およびＰｆｕポリメラーゼと同時に添加し、２回目のＰＣＲを実施した。同様に、プライマー対Ｆ３およびＲ３をそこに添加し、ＰＣＲを再度実施した；プライマー対Ｆ４およびＲ３を用いて操作を繰り返し、それにより、２０７ｂｐの修飾されたＰＱＧＡＢ核酸配列を得た。
【００４３】
合成された核酸断片を、電気泳動に付し、予想した大きさであることを確認した。図３に示す通り、ＰＱＧＡＢ−１（２０７ｂｐ）；ＰＱＧＡＢから４つのＤＮＡ断片a、ｂ、ｃ、およびｄ（a：７０ｂｐ、ｂ：１２９ｂｐ、ｃ：１８６ｂｐ、ｄ：２０７ｂｐ）が生成された。
【００４４】
実施例３：ＰＲＲＳＶヨーロッパ株のＰＱＧＡＢ断片
実施例１および２における融合タンパク質の設計は、アメリカ株ＰＲＲＳＶを狙ったが、アメリカ株ＰＲＲＳＶとは別に、ヨーロッパ株およびオーストラリア株もまた世界的にかなり普及している。構造アミノ酸の類似性は高くなく６０〜８０％だけであるので、他のＯＲＦ５およびＯＲＦ６融合タンパク質の設計を、実施例１および２と同様の方法で行って、プライマーを設計および合成することができる。
【００４５】
ＰＲＲＳＶヨーロッパ株のＰＱＧＡＢを例にとり、融合ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１１に示す。これは、ＰＲＲＳＶヨーロッパ株の、ＯＲＦ６−Ｍ１〜Ｉ２８（配列番号１５）、およびＯＲＦ５−Ｆ３１〜Ａ６４（配列番号１４）を含有する。
【００４６】
配列を確認した後、ＰＲＲＳＶヨーロッパ株融合タンパク質の調製を、実施例１〜２と同様の方法で実施することができる。修飾された核酸配列は、種々のプライマー対を用いてＰＣＲによって合成することができる。プライマーは、表２に示す通り番号を付す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
ＰＱＧＡＢ−ＥＰ融合タンパク質をコードする標的核酸配列は、実施例２に記載された方法に従うことにより、インビトロで、上記に示したようなプライマーで合成することができる。消化効率を改善し、ＰＣＲプライマーの設計を容易にするため、配列の両末端に、ＣＣＣ、ＡＡＡ、ＧＧＧ、またはＴＴＴ等の、複製塩基を有するヌクレオチドトリプレットを付加することもあり得る。ＰＱＧＡＢ−ＥＰ融合タンパク質をコードする核酸配列を、配列番号１０に示す。
【００４９】
実施例４：標的配列を含有するプラスミドの構築
実施例２の産物を例にとる。合成された２０７ｂｐのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で消化し、結合機能および転位機能を有するペプチド配列、およびカルボキシル末端ペプチドを含有する大腸菌プラスミドに結合したところ、得られたプラスミドはｐＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３であった。
【００５０】
Ｔ７プロモーターおよびそこに構築される抗生物質抵抗性（アンピシリン）マーカーを有するｐＥＴ１５プラスミドは、ＰＲＲＳＶ ＰＱＧＡＢ断片および無毒化された緑膿菌(Pseudomonas)外毒素（ドメインＩＩＩを除く緑膿菌外毒素Ａ）の融合タンパク質を発現することができる。ベクター地図を図４に示す。
【００５１】
最後に、上記のプラスミドを融合タンパク質を発現する能力のある細菌株または細胞中に形質転換した。
【００５２】
実施例５：標的タンパク質の発現および分析
上記のプラスミドを有することを確認された細菌株は、個体群の９０％において、プラスミドとＰＱＧＡＢ遺伝子の両者を含有していた。菌株は、２ｍｌずつのグリセリン中の貯蔵品として調製し、−７０℃で保管した。無菌環境において、２ｍｌの保管された貯蔵品を、オートクレーブで処理し２００ｍｌのＬＢ（＋５００μｇ／ｍｌアンピシリン）を入れた５００ｍｌのフラスコ中に植菌し、ロータリーインキュベーターで３７℃、１５０ｒｐｍで１０〜１２時間振とうし、培養物を得た。ＯＤ６００が１．０±０．４に達するまで、液体を培養した。
【００５３】
無菌環境において、５０ｍｌの培養液体を、それぞれ１２５０ｍｌのＬＢ（＋５００μｇ／ｍｌアンピシリン＋５０ｍｌ １０％グルコース）を入れた３０００ｍｌのフラスコ８個中に植菌し、ＯＤ６００が０．３±０．１に達するまで、３７℃、１５０ｒｐｍで２〜３時間振とうし、５０ｐｐｍのＩＰＴＧを添加し、タンパク質産生が完了するように、培養物を再度３７℃、１５０ｒｐｍで２時間で振とうした。
【００５４】
次に、封入体に含有されるＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３を、８Ｍ尿素抽出法によって溶解し、抽出したＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３タンパク質を図５に示す。１０リットルロットの培養液体から、３００〜４００ｍｇの抗原を得ることができた。得られた抗原は、ウエスタンブロット、クームスブルー染色およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析し、バンドの濃度は濃度計で測定して、抗原溶液に含有されるタンパク質を定量した。免疫化およびウイルス感染を進行させるため、０．２±０．０２ｍｇのタンパク質を低用量注射の主成分として用いた。
【００５５】
実施例６：豚における免疫化およびウイルス感染
ＳＰＦ農場において、豚をランダムに５頭ずつの３群に分けた。各群は、空調および循環機器を備えた隔離室で飼育した。１４〜２８日齢のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３免疫群の豚に、１ｍｌのＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３（注射１回当り、タンパク質２００μｇ含有）を含有し、１ｍｌのＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ（登録商標）、フランス）中に乳化させた２ｍｌのワクチンを筋肉注射し、この免疫処置を２回実施した。免疫群ＧＰ５＆Ｍは、ＰＥ−ＯＲＦ５−Ｋ３およびＰＥ−ＯＲＦ６−Ｋ３（注射１回当り、タンパク質２００μｇ含有）でそれぞれ免疫した。対照群は免疫せず飼育した。
【００５６】
最終接種の２週間後、１００ｍｇのケタミン溶液を筋肉注射して豚を鎮静した後、１ｍｌの２％リドカインを豚の鼻腔に滴下して、咳反射を抑制し、その後、豚にウイルスを経鼻的に接種した。各群の５頭の豚に、投与量１ｍｌ当り１×１０7ＴＣＩＤ50のＭＤ−１株のＰＲＲＳＶ培養物１ｍｌを接種した。
【００５７】
接種１４日後、豚を病理解剖した。肺または肝臓試料を採取し（頭葉中央部および尾状葉周縁部の両部より）、次の組織病理試験のために、１０％中性緩衝ホルムアルデヒドで固定した。試験は盲検法で実施し、間質性肺炎の重篤度に基づいて、０〜６で評価した（オプリエスニッヒ(Opriessnig)Ｔ、Ｐ．Ｇ．ハルブル(Halbur)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(Journal of Virology)、７６（２００２年）：１１８３７−１１８４４頁、およびハルブル(Halbur)、Ｐ．Ｇ．、Ｐ．Ｓ．パウル(Paul)ら、１９９６年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８：１１−２０）が、ここで重篤度は数値とともに上昇する。
【００５８】
試験結果
２回目の免疫の２週間後、豚の血液中の白血球をＰＲＲＳＶについて試験した。結果から、ＰＲＲＳＶ接種前は、全ての豚でウイルス血症は起きなかったことが示された。白血球試料は、ウイルス接種後３、７、および１４日後に、それぞれＲＴ−ＰＣＲで試験した。結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
２週間の試験の後、死亡した豚および生存していた豚を含む、全ての豚を解剖した。顕微鏡検査により、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６ワクチン群のウイルス接種豚、および対照群の肺には、より拡大した病変および重篤な間質性肺炎が見られたが、一方、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群では、それ程の拡大病変および重篤な間質性肺炎は見られなかった。表４に示す通り、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３ワクチン群は、対照群およびＯＲＦ５およびＯＲＦ６ワクチン群より、間質性肺炎の重篤度が低いことが示された。
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
上述の試験は、本発明のＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３が豚をＰＲＲＳＶ感染から効果的に防御できるだけではなく、他のワクチン（ＰＥ−ＯＲＦ５−Ｋ３、ＰＥ−ＯＲＦ６−Ｋ３等）よりも間質性肺炎の誘起を軽くすることもできることを明確に示す。
【００６４】
免疫した豚の抗体価の変化を表６に示す。Ａ群はＩｇＧ ＥＬＩＳＡ価が良好であるが、ＩＦＡおよびＮＴ価はＣ群より低い。また、表５より、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５またはＯＲＦ６は、免疫およびウイルス感染の後、抗原特異的アレルギー効果を有することが示される。それらをＰＲＲＳワクチン抗原として使用することは難しいことが明白である。
【００６５】
【表６】
【００６６】
本発明は、その好ましい態様に関して説明がなされたが、多数の他の可能な修正および変化は、ここに特許請求された通りの発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、実施例１のＰＥ−ＰＱＧＡＢ融合タンパク質の略図である。
【図２ａ】図２は、実施例１のＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミド構築のフローチャートである。
【図２ｂ】図２は、実施例１のＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミド構築のフローチャートである。
【図３】図３は、実施例１に従って合成された核酸断片と、４つのＤＮＡ断片（ａ：７０ｂｐ、ｂ：１２９ｂｐ、ｃ：１８６ｂｐ、ｄ：２０４ｂｐ）の電気泳動の図である。
【図４】図４は、ＰＥ（ΔＩＩＩ）−ＰＱＧＡＢのプラスミドマップである。
【図５】図５は、大腸菌宿主ベクター系で誘導され、８Ｍ尿素抽出によって封入体から抽出されたタンパク質の結果である。レーン０ｈ、２ｈ：大腸菌をｐＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３でＩＰＴＧ誘導後、０時間および２時間の全溶解試料；および、レーン８Ｍ：ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３の８Ｍ尿素タンパク質抽出。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；
緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；および
配列ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）を含有するカルボニル末端ドメイン
を含む、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質。
【請求項２】
ＰＲＲＳＶがアメリカ株である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
ＰＲＲＳＶがヨーロッパ株である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１３である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項５】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１２である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項６】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項７】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１５である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項８】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１４である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項９】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１０である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項１０】
（ａ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド、緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部、および配列ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）を含有するカルボニル末端ドメインを有する、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質；および
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、ワクチンとしての医薬組成物。
【請求項１１】
ＰＲＲＳＶがアメリカ株である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
ＰＲＲＳＶがヨーロッパ株である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１３】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１３である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１２である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１５】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１６】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１５である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１７】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１４である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１８】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１０である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１９】
担体が、フロイントのＦＣＡ、ミョウバン、ＦＩＡ、及びモノオレイン酸マンニド乳化剤（ＩＳＡ７２０またはＩＳＡ２０６）よりなる群から選択されるアジュバントを含む、請求項１０の医薬組成物。
【請求項２０】
アジュバントがＩＳＡ２０６である、請求項１９の医薬組成物。
【請求項１】
ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド；
緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部；および
配列ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）を含有するカルボニル末端ドメイン
を含む、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質。
【請求項２】
ＰＲＲＳＶがアメリカ株である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
ＰＲＲＳＶがヨーロッパ株である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１３である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項５】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１２である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項６】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１である、請求項２の融合タンパク質。
【請求項７】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１５である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項８】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１４である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項９】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１０である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項１０】
（ａ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６構造タンパク質のＮ−末端部分を含有するキメラポリペプチド、緑膿菌外毒素Ａ結合および転位ドメインの一部、および配列ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ−ＫＤＥＬ（Ｋ３）を含有するカルボニル末端ドメインを有する、ＰＥ−ＰＱＧＡＢ−Ｋ３融合タンパク質；および
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、ワクチンとしての医薬組成物。
【請求項１１】
ＰＲＲＳＶがアメリカ株である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
ＰＲＲＳＶがヨーロッパ株である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１３】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１３である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１２である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１５】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１６】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１５である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１７】
キメラポリペプチドにおける、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部分のアミノ酸配列が、配列番号１４である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１８】
キメラポリペプチドの核酸配列が、配列番号１０である、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１９】
担体が、フロイントのＦＣＡ、ミョウバン、ＦＩＡ、及びモノオレイン酸マンニド乳化剤（ＩＳＡ７２０またはＩＳＡ２０６）よりなる群から選択されるアジュバントを含む、請求項１０の医薬組成物。
【請求項２０】
アジュバントがＩＳＡ２０６である、請求項１９の医薬組成物。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１３５３７（Ｐ２００８−１３５３７Ａ）
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８７４３０（Ｐ２００６−２８７４３０）
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（５０６３５５４７５）ヘルスバンクス バイオテック カンパニー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（５０６３５５４７５）ヘルスバンクス バイオテック カンパニー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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