ＲＮＡのローリングサークル増幅
開示されるのは、RNA分子増幅のための方法および組成物である。開示の方法は、RNA分子から第１鎖cDNAを合成すること、第１鎖ｃDNA分子を環状化すること、および、環状化第１鎖ｃDNA分子をローリングサークル複製によって複製することを含む。本法は、cDNA合成用の特別プライマー、および、第１鎖cDNA分子環状化用の特別プローブの使用によって支援される。本法は、複数RNA分子、例えば、サンプル中の全RNA分子、または、サンプル中の全ｍRNA分子を複製および増幅するために、あるいは、特定のRNA分子を複製および増幅するために使用することが可能である。環状化第１鎖cDNA分子のローリングサークル複製は、cDNA配列のタンデム反復を含む、長いDNA鎖をもたらす。このタンデム配列DNAは、直接使用すること（例えば、配列の検出のために）、さらに増幅すること、他の任意の目的のために使用することが可能である。2本鎖タンデム配列DNAはまた、転写されて、RNA分子の配列に対して相補的な、または、一致する配列を持つ転写物を生成することも可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子からの第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートすること、
環状化プローブと、第1鎖cDNA分子とを、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する条件下でインキュベートすること、および、
環状化第1鎖cDNA分子を、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートしてRNA配列を増幅すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項３】
各2本鎖ダンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復単位を含み、各タンデム反復単位は対象となる1箇所以上の切断部位を含む方法であって、
2本鎖タンデム配列DNAを複数の切断部位で切断して、タンデム配列DNA断片を生じる工程をさらに含み、前記タンデム配列DNA断片の内の少なくとも一つは、複数のタンデム反復単位を含まないことを特徴とする、請求項2の方法。
【請求項４】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、cDNAプライマーは、対象となる前記切断部位を含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項4の方法。
【請求項６】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項5の方法。
【請求項７】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項6の方法。
【請求項８】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項4の方法。
【請求項９】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、環状化プローブは、前記対象となる切断部位を含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項１０】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、タンデム配列DNA断片の内の少なくとも一つは単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項１１】
前記複数のタンデム配列DNA断片は、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項１２】
前記複数のタンデム配列DNA断片の大部分は、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項11の方法。
【請求項１３】
前記複数のタンデム配列DNA断片の実質的に全てが、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項12の方法。
【請求項１４】
単一タンデム反復単位の1種以上をクローニングすることをさらに含む、請求項13の方法。
【請求項１５】
前記単一タンデム反復単位はクローニング前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項14の方法。
【請求項１６】
対象となるサイズ以上のサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記クローン化されたタンデム反復単位はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項14の方法。
【請求項１８】
単一タンデム反復単位の配列は、環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列に一致し、単一タンデム反復単位の配列は、前記環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列の環状順列であることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項１９】
単一タンデム反復単位の配列は、環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列に一致し、単一タンデム反復単位の配列は、前記環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列の環状順列ではないことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２０】
前記単一タンデム反復単位がcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２１】
ローリングサークル複製は、ローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、プロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項21の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項22の方法。
【請求項２４】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム反復単位を転写する工程をさらに含む方法であって、タンデム反復転写物が単一タンデム反復単位の転写物であることを特徴とする、請求項21の方法。
【請求項２５】
前記タンデム反復転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２６】
前記タンデム反復転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２７】
前記タンデム反復転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２８】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２９】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項28の方法。
【請求項３０】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項29の方法。
【請求項３１】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム反復単位を転写する工程をさらに含む方法であって、タンデム反復転写物が単一タンデム反復単位の転写物であることを特徴とする、請求項28の方法。
【請求項３２】
前記タンデム反復転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３３】
前記タンデム反復転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３４】
前記タンデム反復転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３５】
前記タンデム反復単位は、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項３６】
前記タンデム反復単位は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項３７】
1種以上のタンデム配列DNA断片を1種以上のベクターに挿入して1種以上の組み換えベクターを形成することをさらに含む請求項3の方法。
【請求項３８】
前記タンデム配列DNA断片は、ベクターへの挿入前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがベクターに挿入されることを特徴とする、請求項37の方法。
【請求項３９】
対象となるサイズ以上のサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項38の方法。
【請求項４０】
前記組み換えベクターはcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項37の方法。
【請求項４１】
1種以上の前記タンデム配列DNA断片をクローニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４２】
前記タンデム配列DNA断片は、クローニングの前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項41の方法。
【請求項４３】
対象となるサイズ以上のサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項42の方法。
【請求項４４】
前記クローニングされたタンデム配列DNA断片はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項41の方法。
【請求項４５】
前記タンデム配列DNA断片はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４６】
前記タンデム配列DNA断片の少なくとも一つは単一タンデム反復単位を含み、前記1種以上の単一タンデム反復単位をクローニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４７】
前記単一タンデム反復単位はクローニング前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項46の方法。
【請求項４８】
対象となるサイズ以上のサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項47の方法。
【請求項４９】
前記クローニングされたタンデム反復体はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項46の方法。
【請求項５０】
前記タンデム配列DNA断片は、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５１】
前記タンデム配列DNA断片は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５２】
前記cDNAプライマーはRNA相補部分を含み、前記RNA相補部分は、1種以上のRNA分子にハイブリダイズし、前記cDNAプライマーは、第1鎖cDNA分子の合成時に、第1鎖cDNA分子に取り込まれることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項５３】
前記RNA相補部分はポリ(dT)を含み、前記RNA分子はmRNA分子であることを特徴とする請求項52の方法。
【請求項５４】
前記RNA相補部分は、1種以上のRNA分子の配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項５５】
前記RNA相補部分は、RNA分子の内の一つの配列に対して相補的であり、前記cDNAプライマーは前記RNA分子に対して特異的であることを特徴とする、請求項54の方法。
【請求項５６】
前記cDNAプライマーはさらに対象となる切断部位を含むことを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項５７】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項５８】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項57の方法。
【請求項５９】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項58の方法。
【請求項６０】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項６１】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成し、各2本鎖タンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復体を含み、各タンデム反復体は切断部位を含む方法であって、
前記2本鎖配列DNAを複数の切断部位において切断してタンデム配列DNA断片を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項６２】
前記cDNAプライマーはプローブ相補部分をさらに含み、前記プローブ相補部分は、環状化プローブの配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６３】
前記cDNAプライマーはプライマー相補部分をさらに含み、前記プライマー相補部分は、ローリングサークル複製プライマーに対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６４】
前記cDNAプライマーはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項63の方法。
【請求項６５】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項64の方法。
【請求項６６】
前記cDNAプライマーはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６７】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６８】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項68の方法。
【請求項６９】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項68の方法。
【請求項７０】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７１】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７２】
前記ヌクレオチドの約50%以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７３】
前記ヌクレオチドの全てがリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７４】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７５】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７６】
前記ヌクレオチドの約50%以上は2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７７】
前記ヌクレオチドの全てが2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７８】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７９】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項８０】
前記cDNAプライマーは、第1鎖cDNA分子の合成時に第1鎖cDNA分子に取り込まれ、前記環状化プローブは、cDNA相補部分およびプライマー相補部分を含み、前記cDNA相補部分は、1種以上の第1鎖cDNA分子にハイブリダイズし、前記プライマー相補部分は、第1鎖cDNA分子に取り込まれたcDNAプライマーにハイブリダイズし、cDNA相補部分の第1鎖cDNA分子に対するハイブリダイゼーション、および、プライマー相補部分のcDNAプライマーに対するハイブリダイゼーションは、第1鎖cDNA分子の末端同士を接近させ、それによって、第1鎖cDNA分子の環状化を仲介することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項８１】
前記cDNA相補部分は、ランダムな、または部分的にランダムな配列を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８２】
前記cDNA相補部分はヌクレオチドを含み、1種以上の前記ヌクレオチドが普遍的塩基を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８３】
前記普遍的塩基は5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロールであることを特徴とする、請求項82の方法。
【請求項８４】
前記cDNA相補部分はヌクレオチドを含み、1種以上の前記ヌクレオチドは1種以上のヌクレオチドと塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８５】
1種以上のヌクレオチドと塩基対を形成することが可能な前記ヌクレオチドはイノシンか、または、普遍的塩基を含むヌクレオチドであることを特徴とする、請求項84の方法。
【請求項８６】
前記普遍的塩基は5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロールであることを特徴とする、請求項85の方法。
【請求項８７】
前記環状化プローブはさらに切断部位を含み、前記プライマー相補部分は前記切断部位を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８８】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項８９】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項88の方法。
【請求項９０】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項89の方法。
【請求項９１】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項９２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成し、各2本鎖タンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復体を含み、各タンデム反復体は切断部位を含む方法であって、
前記2本鎖配列DNAを複数の切断部位において切断してタンデム配列DNA断片を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項９３】
前記プライマー相補部分は、cDNAプライマーの配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９４】
前記環状化プローブは、第2プライマー相補部分をさらに含み、前記第2プライマー相補部分は、二次DNA鎖変位プライマーに対して相補的であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９５】
前記環状化プローブはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、ローリングサークル複製プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項94の方法。
【請求項９６】
前記環状化プローブは、さらにプロモーター部分を含むことを特徴とする、請求項95の方法。
【請求項９７】
前記環状化プローブはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９８】
前記環状化プローブは、さらにプロモーター部分を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９９】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項98の方法。
【請求項１００】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項99の方法。
【請求項１０１】
前記環状化プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１０２】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０３】
前記ヌクレオチドの約50%以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０４】
前記ヌクレオチドの全てがリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０５】
前記環状化プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１０６】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０７】
前記ヌクレオチドの約50%以上は2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０８】
前記ヌクレオチドの全てが2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０９】
前記環状プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１１０】
前記環状プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１１１】
ローリングサークル複製はローリングサークルプライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークルプライマーはランダム配列であり、前記ローリングサークル複製は、環状化第1鎖cDNA分子の複数箇所においてプライミングされることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製はローリングサークル複製プライマーによってプライミングされることを特徴とする、請求項111の方法。
【請求項１１３】
前記環状化第1鎖cDNA分子は、指数関数型ローリングサークル増幅によって増幅されることを特徴とする、請求項111の方法。
【請求項１１４】
ローリングサークル複製は、複数のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、環状化第1鎖cDNA分子の複数箇所においてプライミングされることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１５】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上のDNA鎖変位プライマーによってプライミングされることを特徴とする、請求項114の方法。
【請求項１１６】
前記環状化第1鎖cDNA分子は、指数関数型ローリングサークル増幅によって増幅されることを特徴とする、請求項114の方法。
【請求項１１７】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されず、前記タンデム配列DNAは、RNA分子の配列に一致する配列を含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１８】
前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項117の方法。
【請求項１１９】
前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項117の方法。
【請求項１２０】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されず、前記タンデム配列DNAは、RNA分子の配列に一致する配列を含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２１】
前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項120の方法。
【請求項１２２】
前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項120の方法。
【請求項１２３】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記ローリングサークル複製プライマーは5′リン酸基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記タンデム配列DNAは変質させ、前記二次タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２４】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２５】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２６】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２７】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記ローリングサークル複製プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′リン酸基を有し、前記タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記二次タンデム配列DNAは変質させ、前記タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２８】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１２９】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１３０】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１３１】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記環状化プローブは5′リン酸基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記タンデム配列DNAは変質させ、前記二次タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１３２】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３３】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３４】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３５】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記環状化プローブは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′リン酸基を有し、前記タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記二次タンデム配列DNAは変質させ、前記タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１３６】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３７】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３８】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３９】
ローリングサークル複製は、ローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製プライマーはプロモーター部分をさらに含み、前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらすことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１４０】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４１】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項140の方法。
【請求項１４２】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム配列DNAを転写する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４３】
前記タンデム配列転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４４】
前記タンデム配列転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４５】
前記タンデム配列転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４６】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含み、前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらすことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１４７】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項146の方法。
【請求項１４８】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項147の方法。
【請求項１４９】
タンデム配列転写物が生産されるタンデム配列DNAを転写する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項146の方法。
【請求項１５０】
前記タンデム配列転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５１】
前記タンデム配列転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５２】
前記タンデム配列転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５３】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、前記方法は
前記タンデム配列DNA中に1種以上の標的配列を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１５４】
前記1種以上の標的配列は前記RNA分子の標的配列に一致し、前記1種以上の標的配列の検出は、RNAサンプルにおける対応RNA分子の存在を示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５５】
前記RNAサンプルは被験体から得られたものであり、前記１種以上の標的配列は、病気または状態に関連し、病気または状態に関連する前記1種以上の標的配列の検出は、前記RNAサンプルを提供した被験体が、前記関連する病気または状態の危険性がある、またはないことを示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５６】
複数の第1鎖cDNA分子が、複数のRNA分子から合成され、複数のタンデム配列DNAが形成され、前記複数のタンデム配列DNAは前記複数のRNA分子と一致し、複数の標的配列が検出され、検出された前記複数の標的配列は、RNAサンプルから得られる配列カタログを構成することを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５７】
前記方法は、前記配列カタログを、異なるRNAサンプルから同様にして生産された別の配列カタログと比較する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項156の方法。
【請求項１５８】
前記配列カタログにおける対象となる配列の有無は、RNAサンプルを提供した前記被験体が、病気または状態の危険性がある、またはないことを示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５９】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、複数の第1鎖cDNA分子が複数のRNA分子から合成され、複数のタンデム配列DNAが形成され、前記複数のタンデム配列DNAは前記複数のRNA分子と一致し、前記複数のタンデム配列DNAは、RNAサンプルから得られる配列カタログを構成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６０】
前記配列カタログは、前記RNAサンプル中のRNA分子の相当数と一致するタンデム配列DNAを含むことを特徴とする、請求項159の方法。
【請求項１６１】
前記配列カタログは、前記RNAサンプル中のRNA分子の実質的に同数と一致するタンデム配列DNAを含むことを特徴とする、請求項160の方法。
【請求項１６２】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらす方法において、
前記タンデム配列DNA中の1種以上の標的配列の配列決定をする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６３】
前記1種以上の標的配列は、前記RNA分子中の標的配列と一致し、前記1種以上の標的配列の配列は、前記RNAサンプル中の対応RNA分子の配列に一致することを特徴とする、請求項162の方法。
【請求項１６４】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらす方法であって、
ローリングサークル複製後に、タンデム配列DNAを、タンデム配列DNAの複製を促進する条件下にインキュベートして、タンデム配列DNAの複製時に、複製された鎖の内の少なくとも一つが、別の複製鎖の鎖変位複製によって、前記タンデム配列DNAから移動させられる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６５】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、タンデム配列DNAは複製されて、ローリングサークル複製時に、二次タンデム配列DNAを形成し、前記方法は、ローリングサークル複製後に、
タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAの複製を促進する条件下にインキュベートして、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAの複製時に、複製された鎖の内の少なくとも一つが、別の複製鎖の鎖変位複製によって、前記タンデム配列DNA、または二次タンデム配列DNAから移動させられる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６６】
前記第1鎖cDNA分子の少なくとも一つは、少なくとも一つの別の第1鎖cDNA分子に連結されて、一本以上の第1鎖cDNAコンカテマーを形成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６７】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化せず、前記環状化されない第1鎖cDNAコンカテマーは鎖変位複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１６８】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１６９】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化せず、前記未環状化第1鎖cDNAコンカテマーは鎖変位複製によって複製され、前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１７０】
第1鎖cDNA分子の合成を促進する前記条件は、cDNA分子とRNAサンプルとを逆転写酵素の存在下にインキュベートすることを含み、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する前記条件は、環状化プローブと第1鎖cDNA分子とをリガーゼの存在下にインキュベートすることを含み、環状化第1cDNA分子のローリングサークル複製を促進する前記条件は、環状化第1鎖cDNA分子をDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートすることを含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１７１】
前記RNA分子はｍRNA分子であり、前記cDNAプライマーは5'-GTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号1）であり、前記環状化プローブは5'-AAAAGCGGCCGCACNNNNNN-3'（配列番号2）であり、前記逆転写酵素はSuperscript II逆転写酵素であり、前記リガーゼはT4 DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼは、φ29 DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項170の方法。
【請求項１７２】
第1鎖cDNA分子の合成後で、第1鎖cDNA分子の環状化前に、
第1鎖cDNA分子を、RNAse H活性の存在下にインキュベートすること、
第1鎖cDNA分子をアルカリ条件下にインキュベートすること、
第1鎖cDNA分子を中和すること、および、
第1鎖cDNA分子を精製すること
をさらに含むことを特徴とする、請求項170の方法。
【請求項１７３】
前記RNAse H活性は、RNAse H+逆転写酵素によって与えられ、前記アルカリ条件は、0.1M NaOHを添加することによって生成され、前記第1鎖cDNA分子は、0.1M HClを添加することによって中和されることを特徴とする、請求項172の方法。
【請求項１７４】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子から第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートする工程であって、第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件は、cDNAサンプルとRNAサンプルとを逆転写酵素の存在下にインキュベートすることを含む工程、
第1鎖cDNA分子を、RNAse H活性の存在下にインキュベートする工程、
第1鎖cDNA分子をアルカリ条件下にインキュベートする工程、
第1鎖cDNA分子を中和する工程、
第1鎖cDNA分子を精製する工程、
環状化プローブと第1鎖cDNA分子とを、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する条件下でインキュベートする工程であって、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する前記条件は、環状化プローブと第1鎖cDNA分子をリガーゼの存在下にインキュベートする工程、
環状化第1鎖cDNA分子を、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートしてRNA配列を増幅する工程であって、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する前記条件は、環状化第1鎖cDNA分子をDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートすることを含む工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７５】
前記RNA分子はｍRNA分子であり、前記cDNAプライマーは5'-GTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号1）であり、前記環状化プローブは5'-AAAAGCGGCCGCACNNNNNN-3'（配列番号2）であり、前記逆転写酵素はSuperscript II逆転写酵素であり、前記RNAse H活性は、RNAse H+逆転写酵素によって与えられ、前記アルカリ条件は、0.1M NaOHを添加することによって生成され、前記第1鎖cDNA分子は、0.1M HClを添加することによって中和され、前記リガーゼはT4 DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼは、φ29 DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項174の方法。
【請求項１７６】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子から第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートする工程、
環状化プローブと第1鎖cDNA分子を、第1鎖cDNA分子同士が相互に連結して第1鎖cDNAコンカテマーを形成するのを促進する条件下でインキュベートする工程、および、
第1鎖cDNAコンカテマーを、第1鎖cDNAコンカテマーの鎖変位複製を促進する条件下でインキュベートし、RNA配列を増幅する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７７】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【請求項１７８】
前記第1鎖cDNA分子の内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNA分子はローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【請求項１７９】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製され、前記第1鎖cDNA分子の内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNA分子はローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【請求項１】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子からの第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートすること、
環状化プローブと、第1鎖cDNA分子とを、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する条件下でインキュベートすること、および、
環状化第1鎖cDNA分子を、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートしてRNA配列を増幅すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項３】
各2本鎖ダンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復単位を含み、各タンデム反復単位は対象となる1箇所以上の切断部位を含む方法であって、
2本鎖タンデム配列DNAを複数の切断部位で切断して、タンデム配列DNA断片を生じる工程をさらに含み、前記タンデム配列DNA断片の内の少なくとも一つは、複数のタンデム反復単位を含まないことを特徴とする、請求項2の方法。
【請求項４】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、cDNAプライマーは、対象となる前記切断部位を含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項4の方法。
【請求項６】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項5の方法。
【請求項７】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項6の方法。
【請求項８】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項4の方法。
【請求項９】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、環状化プローブは、前記対象となる切断部位を含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項１０】
各タンデム反復単位は対象となる単一切断部位を含み、タンデム配列DNA断片の内の少なくとも一つは単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項１１】
前記複数のタンデム配列DNA断片は、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項１２】
前記複数のタンデム配列DNA断片の大部分は、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項11の方法。
【請求項１３】
前記複数のタンデム配列DNA断片の実質的に全てが、単一タンデム反復単位から成ることを特徴とする、請求項12の方法。
【請求項１４】
単一タンデム反復単位の1種以上をクローニングすることをさらに含む、請求項13の方法。
【請求項１５】
前記単一タンデム反復単位はクローニング前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項14の方法。
【請求項１６】
対象となるサイズ以上のサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記クローン化されたタンデム反復単位はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項14の方法。
【請求項１８】
単一タンデム反復単位の配列は、環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列に一致し、単一タンデム反復単位の配列は、前記環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列の環状順列であることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項１９】
単一タンデム反復単位の配列は、環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列に一致し、単一タンデム反復単位の配列は、前記環状化第1鎖cDNA分子の内の一つの配列の環状順列ではないことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２０】
前記単一タンデム反復単位がcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２１】
ローリングサークル複製は、ローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、プロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項21の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項22の方法。
【請求項２４】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム反復単位を転写する工程をさらに含む方法であって、タンデム反復転写物が単一タンデム反復単位の転写物であることを特徴とする、請求項21の方法。
【請求項２５】
前記タンデム反復転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２６】
前記タンデム反復転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２７】
前記タンデム反復転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項24の方法。
【請求項２８】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項２９】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項28の方法。
【請求項３０】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項29の方法。
【請求項３１】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム反復単位を転写する工程をさらに含む方法であって、タンデム反復転写物が単一タンデム反復単位の転写物であることを特徴とする、請求項28の方法。
【請求項３２】
前記タンデム反復転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３３】
前記タンデム反復転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３４】
前記タンデム反復転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項31の方法。
【請求項３５】
前記タンデム反復単位は、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項３６】
前記タンデム反復単位は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項10の方法。
【請求項３７】
1種以上のタンデム配列DNA断片を1種以上のベクターに挿入して1種以上の組み換えベクターを形成することをさらに含む請求項3の方法。
【請求項３８】
前記タンデム配列DNA断片は、ベクターへの挿入前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがベクターに挿入されることを特徴とする、請求項37の方法。
【請求項３９】
対象となるサイズ以上のサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項38の方法。
【請求項４０】
前記組み換えベクターはcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項37の方法。
【請求項４１】
1種以上の前記タンデム配列DNA断片をクローニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４２】
前記タンデム配列DNA断片は、クローニングの前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項41の方法。
【請求項４３】
対象となるサイズ以上のサイズを持つタンデム配列DNA断片のみがクローニングされることを特徴とする、請求項42の方法。
【請求項４４】
前記クローニングされたタンデム配列DNA断片はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項41の方法。
【請求項４５】
前記タンデム配列DNA断片はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４６】
前記タンデム配列DNA断片の少なくとも一つは単一タンデム反復単位を含み、前記1種以上の単一タンデム反復単位をクローニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項４７】
前記単一タンデム反復単位はクローニング前にサイズに基づいて分離され、対象となるサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項46の方法。
【請求項４８】
対象となるサイズ以上のサイズを持つ単一タンデム反復単位のみがクローニングされることを特徴とする、請求項47の方法。
【請求項４９】
前記クローニングされたタンデム反復体はcDNAライブラリーを構成することを特徴とする、請求項46の方法。
【請求項５０】
前記タンデム配列DNA断片は、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５１】
前記タンデム配列DNA断片は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項3の方法。
【請求項５２】
前記cDNAプライマーはRNA相補部分を含み、前記RNA相補部分は、1種以上のRNA分子にハイブリダイズし、前記cDNAプライマーは、第1鎖cDNA分子の合成時に、第1鎖cDNA分子に取り込まれることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項５３】
前記RNA相補部分はポリ(dT)を含み、前記RNA分子はmRNA分子であることを特徴とする請求項52の方法。
【請求項５４】
前記RNA相補部分は、1種以上のRNA分子の配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項５５】
前記RNA相補部分は、RNA分子の内の一つの配列に対して相補的であり、前記cDNAプライマーは前記RNA分子に対して特異的であることを特徴とする、請求項54の方法。
【請求項５６】
前記cDNAプライマーはさらに対象となる切断部位を含むことを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項５７】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項５８】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項57の方法。
【請求項５９】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項58の方法。
【請求項６０】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項６１】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成し、各2本鎖タンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復体を含み、各タンデム反復体は切断部位を含む方法であって、
前記2本鎖配列DNAを複数の切断部位において切断してタンデム配列DNA断片を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項56の方法。
【請求項６２】
前記cDNAプライマーはプローブ相補部分をさらに含み、前記プローブ相補部分は、環状化プローブの配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６３】
前記cDNAプライマーはプライマー相補部分をさらに含み、前記プライマー相補部分は、ローリングサークル複製プライマーに対して相補的であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６４】
前記cDNAプライマーはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項63の方法。
【請求項６５】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項64の方法。
【請求項６６】
前記cDNAプライマーはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６７】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含むことを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項６８】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項68の方法。
【請求項６９】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項68の方法。
【請求項７０】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７１】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７２】
前記ヌクレオチドの約50%以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７３】
前記ヌクレオチドの全てがリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項70の方法。
【請求項７４】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７５】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７６】
前記ヌクレオチドの約50%以上は2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７７】
前記ヌクレオチドの全てが2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項74の方法。
【請求項７８】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項７９】
前記cDNAプライマーはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項52の方法。
【請求項８０】
前記cDNAプライマーは、第1鎖cDNA分子の合成時に第1鎖cDNA分子に取り込まれ、前記環状化プローブは、cDNA相補部分およびプライマー相補部分を含み、前記cDNA相補部分は、1種以上の第1鎖cDNA分子にハイブリダイズし、前記プライマー相補部分は、第1鎖cDNA分子に取り込まれたcDNAプライマーにハイブリダイズし、cDNA相補部分の第1鎖cDNA分子に対するハイブリダイゼーション、および、プライマー相補部分のcDNAプライマーに対するハイブリダイゼーションは、第1鎖cDNA分子の末端同士を接近させ、それによって、第1鎖cDNA分子の環状化を仲介することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項８１】
前記cDNA相補部分は、ランダムな、または部分的にランダムな配列を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８２】
前記cDNA相補部分はヌクレオチドを含み、1種以上の前記ヌクレオチドが普遍的塩基を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８３】
前記普遍的塩基は5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロールであることを特徴とする、請求項82の方法。
【請求項８４】
前記cDNA相補部分はヌクレオチドを含み、1種以上の前記ヌクレオチドは1種以上のヌクレオチドと塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８５】
1種以上のヌクレオチドと塩基対を形成することが可能な前記ヌクレオチドはイノシンか、または、普遍的塩基を含むヌクレオチドであることを特徴とする、請求項84の方法。
【請求項８６】
前記普遍的塩基は5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロールであることを特徴とする、請求項85の方法。
【請求項８７】
前記環状化プローブはさらに切断部位を含み、前記プライマー相補部分は前記切断部位を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項８８】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも7個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項８９】
前記制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8個のヌクレオチドを含む認識配列を有することを特徴とする、請求項88の方法。
【請求項９０】
前記制限エンドヌクレアーゼは、Not I, Asc I, AsiS I, Fse I, Pac I, Pme I, Sbf I, Sfi I、またはSwa Iであることを特徴とする、請求項89の方法。
【請求項９１】
前記切断部位は制限エンドヌクレアーゼの切断部位であり、前記制限エンドヌクレアーゼは、平均して各65,536個以上のヌクレオチド毎に1回出現する認識配列を有することを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項９２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAおよび前記二次タンデム配列DNAは2本鎖タンデム配列DNAを形成し、各2本鎖タンデム配列DNAは、同じ配列の複数のタンデム反復体を含み、各タンデム反復体は切断部位を含む方法であって、
前記2本鎖配列DNAを複数の切断部位において切断してタンデム配列DNA断片を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項87の方法。
【請求項９３】
前記プライマー相補部分は、cDNAプライマーの配列に対して相補的であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９４】
前記環状化プローブは、第2プライマー相補部分をさらに含み、前記第2プライマー相補部分は、二次DNA鎖変位プライマーに対して相補的であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９５】
前記環状化プローブはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、ローリングサークル複製プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項94の方法。
【請求項９６】
前記環状化プローブは、さらにプロモーター部分を含むことを特徴とする、請求項95の方法。
【請求項９７】
前記環状化プローブはプライマー一致部分をさらに含み、前記プライマー一致部分は、二次DNA鎖変位プライマーの配列に一致することを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９８】
前記環状化プローブは、さらにプロモーター部分を含むことを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項９９】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項98の方法。
【請求項１００】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項99の方法。
【請求項１０１】
前記環状化プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１０２】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０３】
前記ヌクレオチドの約50%以上はリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０４】
前記ヌクレオチドの全てがリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項101の方法。
【請求項１０５】
前記環状化プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドの1個以上が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１０６】
前記ヌクレオチドの約10%から約50%が2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０７】
前記ヌクレオチドの約50%以上は2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０８】
前記ヌクレオチドの全てが2′-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項105の方法。
【請求項１０９】
前記環状プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１１０】
前記環状プローブはヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと2′-O-メチルリボヌクレオチドとの混合物であることを特徴とする、請求項80の方法。
【請求項１１１】
ローリングサークル複製はローリングサークルプライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークルプライマーはランダム配列であり、前記ローリングサークル複製は、環状化第1鎖cDNA分子の複数箇所においてプライミングされることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１２】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製はローリングサークル複製プライマーによってプライミングされることを特徴とする、請求項111の方法。
【請求項１１３】
前記環状化第1鎖cDNA分子は、指数関数型ローリングサークル増幅によって増幅されることを特徴とする、請求項111の方法。
【請求項１１４】
ローリングサークル複製は、複数のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、環状化第1鎖cDNA分子の複数箇所においてプライミングされることを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１５】
前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上のDNA鎖変位プライマーによってプライミングされることを特徴とする、請求項114の方法。
【請求項１１６】
前記環状化第1鎖cDNA分子は、指数関数型ローリングサークル増幅によって増幅されることを特徴とする、請求項114の方法。
【請求項１１７】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されず、前記タンデム配列DNAは、RNA分子の配列に一致する配列を含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１１８】
前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項117の方法。
【請求項１１９】
前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項117の方法。
【請求項１２０】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されず、前記タンデム配列DNAは、RNA分子の配列に一致する配列を含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２１】
前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項120の方法。
【請求項１２２】
前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項120の方法。
【請求項１２３】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記ローリングサークル複製プライマーは5′リン酸基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記タンデム配列DNAは変質させ、前記二次タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２４】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２５】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２６】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項123の方法。
【請求項１２７】
ローリングサークル複製は、1種以上のローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記ローリングサークル複製プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′リン酸基を有し、前記タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記二次タンデム配列DNAは変質させ、前記タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１２８】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１２９】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１３０】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項127の方法。
【請求項１３１】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記環状化プローブは5′リン酸基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′ヒドロキシル基を有し、前記タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記タンデム配列DNAは変質させ、前記二次タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１３２】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３３】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３４】
前記二次タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に相補的な配列を含み、前記二次タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項131の方法。
【請求項１３５】
ローリングサークル複製は、環状化プローブによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製は、タンデム配列DNAの形成をもたらし、前記タンデム配列DNAは複製されて二次タンデム配列DNAを形成し、前記タンデム配列DNAの複製は、1種以上の二次DNA鎖変位プライマーによってプライミングされる方法であって、
前記環状化プローブは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次DNA鎖変位プライマーは5′リン酸基を有し、前記タンデム配列DNAは5′ヒドロキシル基を有し、前記二次タンデム配列DNAは5′リン酸基を有し、
前記方法は、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、リン酸基依存性エキソヌクレアーゼの存在下にインキュベートして、前記二次タンデム配列DNAは変質させ、前記タンデム配列DNAは残される工程をさらに含む
ことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１３６】
前記リン酸基依存性エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３７】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３８】
前記タンデム配列DNAは前記RNA分子の配列に一致する配列を含み、前記タンデム配列DNAは、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項135の方法。
【請求項１３９】
ローリングサークル複製は、ローリングサークル複製プライマーによってプライミングされ、前記ローリングサークル複製プライマーはプロモーター部分をさらに含み、前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらすことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１４０】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４１】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項140の方法。
【請求項１４２】
タンデム反復転写物が生産されるタンデム配列DNAを転写する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４３】
前記タンデム配列転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４４】
前記タンデム配列転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４５】
前記タンデム配列転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項142の方法。
【請求項１４６】
前記cDNAプライマーはプロモーター部分をさらに含み、前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらすことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１４７】
前記プロモーター部分は、ファージRNAポリメラーゼまたは細菌RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項146の方法。
【請求項１４８】
前記プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ用のプロモーターであることを特徴とする、請求項147の方法。
【請求項１４９】
タンデム配列転写物が生産されるタンデム配列DNAを転写する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項146の方法。
【請求項１５０】
前記タンデム配列転写物が、直接または間接に、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５１】
前記タンデム配列転写物は、固相基板に関連付けられることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５２】
前記タンデム配列転写物が翻訳されることを特徴とする、請求項149の方法。
【請求項１５３】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、前記方法は
前記タンデム配列DNA中に1種以上の標的配列を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１５４】
前記1種以上の標的配列は前記RNA分子の標的配列に一致し、前記1種以上の標的配列の検出は、RNAサンプルにおける対応RNA分子の存在を示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５５】
前記RNAサンプルは被験体から得られたものであり、前記１種以上の標的配列は、病気または状態に関連し、病気または状態に関連する前記1種以上の標的配列の検出は、前記RNAサンプルを提供した被験体が、前記関連する病気または状態の危険性がある、またはないことを示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５６】
複数の第1鎖cDNA分子が、複数のRNA分子から合成され、複数のタンデム配列DNAが形成され、前記複数のタンデム配列DNAは前記複数のRNA分子と一致し、複数の標的配列が検出され、検出された前記複数の標的配列は、RNAサンプルから得られる配列カタログを構成することを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５７】
前記方法は、前記配列カタログを、異なるRNAサンプルから同様にして生産された別の配列カタログと比較する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項156の方法。
【請求項１５８】
前記配列カタログにおける対象となる配列の有無は、RNAサンプルを提供した前記被験体が、病気または状態の危険性がある、またはないことを示すことを特徴とする、請求項153の方法。
【請求項１５９】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、複数の第1鎖cDNA分子が複数のRNA分子から合成され、複数のタンデム配列DNAが形成され、前記複数のタンデム配列DNAは前記複数のRNA分子と一致し、前記複数のタンデム配列DNAは、RNAサンプルから得られる配列カタログを構成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６０】
前記配列カタログは、前記RNAサンプル中のRNA分子の相当数と一致するタンデム配列DNAを含むことを特徴とする、請求項159の方法。
【請求項１６１】
前記配列カタログは、前記RNAサンプル中のRNA分子の実質的に同数と一致するタンデム配列DNAを含むことを特徴とする、請求項160の方法。
【請求項１６２】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらす方法において、
前記タンデム配列DNA中の1種以上の標的配列の配列決定をする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６３】
前記1種以上の標的配列は、前記RNA分子中の標的配列と一致し、前記1種以上の標的配列の配列は、前記RNAサンプル中の対応RNA分子の配列に一致することを特徴とする、請求項162の方法。
【請求項１６４】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらす方法であって、
ローリングサークル複製後に、タンデム配列DNAを、タンデム配列DNAの複製を促進する条件下にインキュベートして、タンデム配列DNAの複製時に、複製された鎖の内の少なくとも一つが、別の複製鎖の鎖変位複製によって、前記タンデム配列DNAから移動させられる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６５】
前記ローリングサークル複製はタンデム配列DNAの形成をもたらし、タンデム配列DNAは複製されて、ローリングサークル複製時に、二次タンデム配列DNAを形成し、前記方法は、ローリングサークル複製後に、
タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAとを、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAの複製を促進する条件下にインキュベートして、タンデム配列DNAと二次タンデム配列DNAの複製時に、複製された鎖の内の少なくとも一つが、別の複製鎖の鎖変位複製によって、前記タンデム配列DNA、または二次タンデム配列DNAから移動させられる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６６】
前記第1鎖cDNA分子の少なくとも一つは、少なくとも一つの別の第1鎖cDNA分子に連結されて、一本以上の第1鎖cDNAコンカテマーを形成することを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１６７】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化せず、前記環状化されない第1鎖cDNAコンカテマーは鎖変位複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１６８】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１６９】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化せず、前記未環状化第1鎖cDNAコンカテマーは鎖変位複製によって複製され、前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも1本は環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項166の方法。
【請求項１７０】
第1鎖cDNA分子の合成を促進する前記条件は、cDNA分子とRNAサンプルとを逆転写酵素の存在下にインキュベートすることを含み、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する前記条件は、環状化プローブと第1鎖cDNA分子とをリガーゼの存在下にインキュベートすることを含み、環状化第1cDNA分子のローリングサークル複製を促進する前記条件は、環状化第1鎖cDNA分子をDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートすることを含むことを特徴とする、請求項1の方法。
【請求項１７１】
前記RNA分子はｍRNA分子であり、前記cDNAプライマーは5'-GTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号1）であり、前記環状化プローブは5'-AAAAGCGGCCGCACNNNNNN-3'（配列番号2）であり、前記逆転写酵素はSuperscript II逆転写酵素であり、前記リガーゼはT4 DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼは、φ29 DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項170の方法。
【請求項１７２】
第1鎖cDNA分子の合成後で、第1鎖cDNA分子の環状化前に、
第1鎖cDNA分子を、RNAse H活性の存在下にインキュベートすること、
第1鎖cDNA分子をアルカリ条件下にインキュベートすること、
第1鎖cDNA分子を中和すること、および、
第1鎖cDNA分子を精製すること
をさらに含むことを特徴とする、請求項170の方法。
【請求項１７３】
前記RNAse H活性は、RNAse H+逆転写酵素によって与えられ、前記アルカリ条件は、0.1M NaOHを添加することによって生成され、前記第1鎖cDNA分子は、0.1M HClを添加することによって中和されることを特徴とする、請求項172の方法。
【請求項１７４】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子から第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートする工程であって、第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件は、cDNAサンプルとRNAサンプルとを逆転写酵素の存在下にインキュベートすることを含む工程、
第1鎖cDNA分子を、RNAse H活性の存在下にインキュベートする工程、
第1鎖cDNA分子をアルカリ条件下にインキュベートする工程、
第1鎖cDNA分子を中和する工程、
第1鎖cDNA分子を精製する工程、
環状化プローブと第1鎖cDNA分子とを、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する条件下でインキュベートする工程であって、第1鎖cDNA分子の環状化を促進する前記条件は、環状化プローブと第1鎖cDNA分子をリガーゼの存在下にインキュベートする工程、
環状化第1鎖cDNA分子を、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートしてRNA配列を増幅する工程であって、環状化第1鎖cDNA分子のローリングサークル複製を促進する前記条件は、環状化第1鎖cDNA分子をDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートすることを含む工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７５】
前記RNA分子はｍRNA分子であり、前記cDNAプライマーは5'-GTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号1）であり、前記環状化プローブは5'-AAAAGCGGCCGCACNNNNNN-3'（配列番号2）であり、前記逆転写酵素はSuperscript II逆転写酵素であり、前記RNAse H活性は、RNAse H+逆転写酵素によって与えられ、前記アルカリ条件は、0.1M NaOHを添加することによって生成され、前記第1鎖cDNA分子は、0.1M HClを添加することによって中和され、前記リガーゼはT4 DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼは、φ29 DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項174の方法。
【請求項１７６】
RNA配列を増幅する方法であって、
cDNAプライマーと、RNA分子を含むRNAサンプルとを、前記RNA分子から第1鎖cDNA分子の合成を促進する条件下でインキュベートする工程、
環状化プローブと第1鎖cDNA分子を、第1鎖cDNA分子同士が相互に連結して第1鎖cDNAコンカテマーを形成するのを促進する条件下でインキュベートする工程、および、
第1鎖cDNAコンカテマーを、第1鎖cDNAコンカテマーの鎖変位複製を促進する条件下でインキュベートし、RNA配列を増幅する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７７】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【請求項１７８】
前記第1鎖cDNA分子の内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNA分子はローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【請求項１７９】
前記第1鎖cDNAコンカテマーの内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNAコンカテマーはローリングサークル複製によって複製され、前記第1鎖cDNA分子の内の少なくとも一つは環状化され、前記環状化第1鎖cDNA分子はローリングサークル複製によって複製されることを特徴とする、請求項176の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５１２０８１（Ｐ２００６−５１２０８１Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６５３８５（Ｐ２００４−５６５３８５）
【出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３９４３０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１１９
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３９４３０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１１９
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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