ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド
反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｄｓＲＮＡを調製する際に、ＲＮＡ干渉の効果の低い低分子物のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを用いたｄｓＲＮＡ分解方法、該方法のための組成物ならびにキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに単離されたポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドによってコードされるＲＮａｓｅＩＩＩを有するポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそれらの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮａｓｅＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）に特異的に作用し、５’−末端リン酸基を持つ平均１５ヌクレオチド単位のオリゴヌクレオチドを生成することができる酵素である。当該酵素は、例えば、大腸菌の３０Ｓ抽出液中に存在する。さらに類似酵素が、ウシ胸腺あるいはトリ胚に存在していることも報告されている。しかしながら、当該酵素は、ＲＮＡ−ＲＮＡの二次構造を一本鎖ＲＮＡと識別する方法等に使用されるのがほとんどであった。（例えば、非特許文献１参照）
【０００３】
一方、最近になってＲＮＡ干渉（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と言う技術が報告された。当該技術は、ｄｓＲＮＡによってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子発現が抑制される現象に基づくものである。ｄｓＲＮＡによって遺伝子サイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチセンスを用いた研究からであった。１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓはｐａｒ−１と呼ばれる遺伝子をアンチセンスＲＮＡで抑制する実験を行なった。アンチセンスＲＮＡを加えると、予想通りｐａｒ−１の発現を抑制したが、驚いたことに、コントロールとして用いたセンスＲＮＡも同様にｐａｒ−１の発現を抑制し、ｐａｒ−１変異株の表現形を示した。（例えば、非特許文献２参照）
この矛盾は、１９９８年にＦｉｒｅらによって解き明かされた。アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを、それぞれＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するとき、わずかに非特異的に逆向きのＲＮＡができてしまう。そのコンタミネーションよってできるｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングの本体であり、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは遺伝子の発現を抑制できないこと、またアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをアニールさせたｄｓＲＮＡが効率よく遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。（例えば、非特許文献３、特許文献１参照）
【０００４】
上記ＲＮＡ干渉においては、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素がｄｓＲＮＡから小分子のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を生成させる。（例えば、非特許文献４、特許文献２参照）
この酵素の作用により生じたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体に取り込まれ、該複合体が標的ｍＲＮＡを認識し、分解すると考えられている。しかしながら、ＲＮＡ干渉に関与すると考えられる各因子についての正確な機能についてはまだまだ未知の部分が多いのが現状であった。（例えば、非特許文献５参照）
【０００５】
一方、微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩもｓｉＲＮＡの調製に利用される。（非特許文献６参照）前記ＲＮａｓｅＩＩＩとしては、例えばエピセントル社（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ社）から大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩが発売され、ｓｉＲＮＡの調製に使用されている。しかしながら、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは反応性が高く、例えば５００塩基対以上の長鎖のｄｓＲＮＡを鋳型とした場合でもすぐに約１０塩基対程度の低分子のものに分解してしまう。この場合、ＲＮＡ干渉に有効とされる約２１塩基対のｓｉＲＮＡを調製する際には、長鎖ｄｓＲＮＡの部分分解を反応温度を下げる、または反応時間を短くするなどの条件改変により実施しなければならないが、前述のように大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは反応性が高いため、その反応条件の制御が困難であり、また部分分解条件においても前述の低分子のものが生じやすいという欠点を有していた。
以上のように、２本鎖ＲＮＡからＲＮＡ干渉を実施する際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを調製する際に、反応条件の制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉効果の低い低分子のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩが求められていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６５０６５５９号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／６８８３６号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／）、ＥＣ ３．１．２６．３
【非特許文献２】Ｇｕｏ Ｓ．他１名 Ｃｅｌｌ １９９５年 ｖｏｌ．８１、ｐ６１１−６２０
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ Ａ．他５名 Ｎａｔｕｒｅ １９９８年 ｖｏｌ．３９、ｐ８０６−８１１
【非特許文献４】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅ．他３名 Ｎａｔｕｒｅ ２００１年 ｖｏｌ．４０９、ｐ３６３−３６６
【非特許文献５】Ｔａｂａｒａ Ｈ．他３名 Ｃｅｌｌ ２００２年 ｖｏｌ．１０９、ｐ８６１−８７１
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ Ｈ．他４名 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００２年 ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１，ｐ５８７５−５８８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｄｓＲＮＡを調製する際に、ＲＮＡ干渉の効果の低い低分子物のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する新規ポリヌクレオチドを提供することにある。また、該ポリヌクレオチドを用いた、従来とは異なったより効率的なｓｉＲＮＡの調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、反応条件の制御が容易という観点から常温菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合よりも低い温度で熱失活させることが可能で、その温度感受性を利用して温和な分解条件を設定することが可能となるようなＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリヌクレオチドについて鋭意検討した結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｓｉＲＮＡを調製する際に、ＲＮＡ干渉の効果の低い低分子物のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有することを見出した。また、４℃においても生育可能な低温性微生物Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ａｃ１０由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニングを試み、目的のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現させることに成功し、該ＲＮａｓｅＩＩＩの活性が、ｓｉＲＮＡ調製時に好適であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の発明は、完全分解後にＲＮＡ干渉に有効な特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する微生物由来のポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明の第２の発明は、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明の第３の発明は、ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明の第４の発明は、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１３】
本発明の第１〜４の発明においては、当該ポリペプチドは、低温性微生物由来であることが好ましく、特に限定はされないが例えば、シェワネラ属微生物であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第５の発明は、下記から選択されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、反応条件に応じて大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を任意に得ることができることを特徴とするポリペプチドであり、
（ａ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列でコードされるアミノ酸配列、に関する。
【００１５】
本発明の第６の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質である本発明の第１〜第４の発明のポリペプチドに関する。
【００１６】
本発明の第７の発明は、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを用いたｄｓＲＮＡの分解方法に関する。
【００１７】
本発明の第７の発明において、特に限定はされないがｄｓＲＮＡの分解物はＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能しうるｄｓＲＮＡであるものが例示される。また、本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で実施しても良く、使用するポリペプチドが、核酸結合活性を有するタンパク質と本発明の第１〜第４の発明のポリペプチドとの融合タンパク質であっても良い。当該核酸結合活性を有するタンパク質は、特に限定はされないが例えば好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールドショックプロテインが例示される。特に限定はされないが例えば、当該コールドショックプロテインは、サーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテインＢが挙げられる。
【００１８】
本発明の第８の発明は、本発明の第７の発明に記載の方法に用いる組成物であって、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用組成物に関する。
【００１９】
本発明の第９の発明は、本発明の第７の発明に記載の方法に用いるキットであって、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用キットに関する。
【００２０】
本発明の第１０の発明は、下記から選択される塩基配列を有する核酸に関する。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列において一ないしは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された塩基配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列。
【００２１】
本発明の第１１の発明は、本発明の第１０の発明の核酸を用いて、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造する方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、反応条件の制御が容易な低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが提供される。さらに本発明のポリペプチドを用いることにより、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｄｓＲＮＡを簡便に、効率よく生成させる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書においてＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を分解するエンドヌクレアーゼのことを言い、一般にはｄｓＲＮＡを完全に消化することで１０塩基対程度の小断片ｄｓＲＮＡを生成する。上記ポリペプチドは、天然型あるいは人工的に修飾されたもののいずれのｄｓＲＮＡをも基質として分解することができる。特に限定はされないが例えば、ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ＣＭＰ ｗ２’−ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ＵＭＰで置き換えたｄｓＲＮＡ等が例示される。
【００２４】
本明細書においてｄｓＲＮＡとは、２本鎖構造を形成したＲＮＡのことであり、特に限定はされないが例えばＲＮＡ干渉の対象となるｍＲＮＡと該ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するＲＮＡとの２本鎖構造を形成したＲＮＡのことを言う。
上記ｄｓＲＮＡには２本鎖構造を保持したＲＮＡ分解物も含まれる。その中には、ＲＮＡ干渉に有用なｓｉ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡも含まれる。また、上記ｄｓＲＮＡならびにその分解物には３’及び／又は５’末端側に一本鎖部分があってもよい。
【００２５】
本明細書において、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡとは、特に限定はされないが例えば、約１０〜１００塩基対の範囲中の特定の長さのｄｓＲＮＡのことを言う。さらに例えば、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｓｉＲＮＡとは約１５〜３０塩基対の範囲、特に２０〜２５塩基対の範囲のｄｓＲＮＡであっても良い。
【００２６】
本明細書において、特定の範囲のｄｓＲＮＡとは、上記ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡであり、約１０塩基対前後の小さなｄｓＲＮＡ分解物の存在比が少ないことを特徴とする。特に限定はされないが、約１０〜１００塩基対の範囲、より好ましくは約１５〜３０塩基対の範囲、さらに好ましくは２０〜２５塩基対の範囲のｄｓＲＮＡであっても良い。
【００２７】
本明細書において反応条件の制御が容易とは、特に限定はされないが例えば、ｄｓＲＮＡ分解反応の場合、当該分解反応において反応速度が遅く、生成する低分子産物を目安（ｄｓＲＮＡ分解産物の長さを目安に）に部分分解の条件を設定し易いもののことを言う。言い換えれば、低分子産物が生じにくいものが好ましい。上記反応条件の制御が容易な酵素を産生するものとしては、特に限定はされないが例えば下記に示す低温性微生物由来のものが好適に使用できる。
【００２８】
本明細書において完全分解とは、酵素量が十分である分解反応において、基質の分解反応が進み分解産物の生産量が定常期に達する（基質と分解物が平衡状態となり量が変化しなくなる）のに十分な時間を経過した分解反応のことを意味する。部分分解とは、完全分解に達する前の分解を意味する。
【００２９】
微生物は、生育できる温度範囲の違いによって、高温性、中温性、低温性微生物に大別される。この低温で生育できる微生物はさらに生育できなくなる上限温度と最適生育温度によって、低温微生物と好冷微生物に細分され、生育限界温度２０℃以下で最適生育温度１５℃以下のものを好冷微生物、生育限界温度２０℃以上のものを低温性微生物と一般に呼称されている。本明細書において、低温性微生物とは、上記低温性微生物のことを言う。本発明において遺伝子源として使用できる微生物は、特に属、種あるいは株などを限定するものではないが、例えばシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属などに分類される低温性微生物等を用いることができる。これらの微生物については公的微生物寄託機関において容易に入手できる。前記シェワネラ属微生物の例として、シェワネラ・ピュ−トリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−２８７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２５）あるいは、シェワネラ属 Ａｃ１０株等が例示される。しかしながら、前記したように、種々の低温性微生物を同様にして遺伝子源として使用することができることは言うまでもない。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、反応条件の制御が容易なポリペプチドである。特に限定はされないが例えば、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチドが例示される。
また、本発明のポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有していても良い。
すなわち、本発明のポリペプチドは、反応条件（温度、時間、酵素濃度等）を任意に設定することにより、今まで大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでは困難であった、特定の範囲のｄｓＲＮＡを容易に得ることができる。さらに、酵素バッファーにマンガンイオンなどの特別な試薬を添加することなく、特定の範囲のｄｓＲＮＡを容易に得ることができるポリペプチドであることが好ましい。
【００３１】
さらに本発明のポリペプチドの別態様としては、ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが例示される。
本発明においては、特に限定はされないが例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩと比較してｄｓＲＮＡ分解活性が遅いものが好ましく、その反応速度が１時間反応させても約１０塩基対程度の断片が生じにくいものが好ましい。
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩよりもｄｓＲＮＡ分解速度が遅いため、反応時間、反応温度等を選択することにより、任意の特定の長さのｄｓＲＮＡを調製することができる。前記特性を利用することにより、これまでの大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでは困難であった、ｄｓＲＮＡの部分分解も実施することができる。さらに、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩよりもＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し難い低分子のｄｓＲＮＡが生成しにくいポリペプチドである。言い換えれば、当該ポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩに比較して、長鎖ｄｓＲＮＡ（約５００〜１０００塩基対）の分解速度が遅く、また約１０塩基対程度の低分子分解物が生じにくいことから、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡをより簡便に、効率的に調製することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡを調製することができる。特に限定はされないが、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するものが例示される。また、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、上記機能を有する範囲であれば上記アミノ酸配列あるいは塩基配列において、一ないしは複数個のアミノ酸あるいは塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加されたものも本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに含まれる。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
さらに、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列表の配列番号４）に少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドは、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
【００３３】
さらに配列番号１で表わされるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相当する配列番号１で表わされるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同等のｄｓＲＮＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、特に限定はされないが、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル第３版〔サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、用いるプローブのＴｍ−２５℃の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。
【００３４】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
【００３５】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
【００３６】
さらに、本発明によって開示された塩基配列（配列表の配列番号１）に少なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より好ましくは９０％の相同性を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。
【００３７】
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（タカラバイオ社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。当該ポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【００３９】
遺伝子操作による上記酵素、ポリペプチドの製造方法としては、例えば、該ＲＮａｓｅＩＩＩをコードするＤＮＡ配列が宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、オペレーター及びターミネーター配列と共に、宿主生物中で複製されるベクターに挿入されたプラスミドを用いて形質転換された宿主細胞、または該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、オペレーター及びターミネーター配列と共に、宿主細胞ＤＮＡにインテグレーションされることで形質転換された宿主細胞を、ＲＮａｓｅＩＩＩの発現できる条件のもとに培養し、さらにＲＮａｓｅＩＩＩを培養液から回収する方法が挙げられる。
【００４０】
また、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩは、該ＲＮａｓｅＩＩＩをコードするポリヌクレオチド等を基にして得られる該ＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列に関する知見を基に、従来のＲＮａｓｅＩＩＩをコードするＤＮＡを改変する遺伝子工学の手法によって生産されるものであってもよい。
特に限定はされないが、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドにおいて、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したものも本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質に含まれる。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
さらに、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態のものであってもよい。
【００４１】
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクターには、特に限定はなく、市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限定はされないが例えばｐＥＴシステム（ノバジェン社製）を用いることができる。さらに、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターが挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターで製造する方法が例示される。
すなわち、本発明の製造方法においては、ｓｉＲＮＡを生成させ得る機能を保持できるポリペプチドを発現できるベクターであればいずれもが好適に使用できる。
また、当該ｓｉＲＮＡを生成させ得る機能を最終的に保持できるポリペプチドを得られるならば、ポリペプチド発現時は封入体の形態であるがその後のリホールディング操作により当該機能を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
【００４２】
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩを採取するには、一般の大腸菌組み換え酵素採取の手段に準じて行えば良い。即ち、大腸菌組み換え体を培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から分離することができる。この菌体を破砕して無細胞抽出液を調製し、粗酵素液として以下の精製操作に用いる。また、酵素が菌体外に分泌されている場合には、菌体が除去された培養液上清を粗酵素液とすることができる。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
【００４３】
ポリペプチドを遺伝子工学的に製造したり、その製造物を使用するに当たり、そのポリペプチドがどの生物由来であるかは、その製造効率、使用効果に大きな影響を与える。すなわち、本発明のポリペプチドは、ヒトＤｉｃｅｒに比べて、大量にかつ安価に製造することができる。さらに、Ｄｉｃｅｒに比べて、基質の切れ残りが少なく、反応時間が短いので、大量の基質を処理するのに適している。
【００４４】
（２）本発明のポリペプチドを用いたｄｓＲＮＡの分解方法
本発明のｄｓＲＮＡの分解方法は、上記（１）記載のポリペプチドを用いることを特徴とする。本発明の方法において、上記ポリペプチドを用いることにより、反応条件（時間、温度、酵素濃度等）を制御することにより、例えば特定の範囲のｓｉＲＮＡを調製することができる。特に限定はされないが例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩより温和な反応条件、３０℃の反応温度で反応でき、ＲＮＡ干渉の際に効果的の望める長さのｓｉＲＮＡをより簡便に、効率的に調製することができる。
【００４５】
さらに本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下に行うことを特徴とする。当該核酸結合タンパクとしては、結果的にｄｓＲＮＡ分解活性を促進するものであれば特に限定はなく、例えば、上記ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質等が好適に使用できる。
当該ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質としては特に限定はないが、コールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が例示される。特に常温域で機能し得るコールド ショック プロテインが好適に使用でき、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテインが好ましい。特に限定はされないが、例えばプロテイン サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のコールド ショック プロテインＢ（ＣｓｐＢ）タンパク質、モレキュラー マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第１１巻（５）、８３３−８３９頁（１９９４）記載の大腸菌由来ＣｓｐＢタンパク質、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１７４巻（２０）、６３２６−６３３５頁（１９９２）記載のバチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＣｓｐＢタンパク質が好適に使用できる。
当該ＣｓｐＢタンパク質を上記（１）記載のポリペプチドと組み合わせることにより、当該ｄｓＲＮＡ分解活性を促進させることができる。さらに、本発明の方法においては、当該核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ合成活性を有するタンパク質は、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形態のものであってもよい。
【００４６】
（３）本発明の方法に使用される組成物
本発明の組成物は、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応を効率よく行うための組成物であり、例えばＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを効率よく調製するための組成物である。当該組成物は、上記（１）記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含む組成物である。
上記ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドにおいて、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したポリペプチドであっても良い。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、本発明の組成物には、上記ポリペプチドを安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
【００４７】
さらに当該組成物は、核酸結合活性を有するタンパク質を含んでいてもよく、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド ショック プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好ましい。
【００４８】
さらに本発明の組成物の別態様としては、上記の核酸結合活性を有するタンパク質と本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を含有していてもよい。
【００４９】
（４）本発明の方法に使用されるキット
本発明の方法に使用されるキットは、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応を効率よく行うためのキットであり、例えばＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを効率よく調製するためのキットである。
本発明のキットには、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。該ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとしては、上記（１）で挙げられたものが好適に使用できる。さらに本発明のキットには、上記ポリペプチドを安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
【００５０】
さらに当該キットは、核酸結合活性を有するタンパク質を含んでいてもよく、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド ショック プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好ましい。
【００５１】
さらに本発明のキットの別態様としては、上記の核酸結合活性を有するタンパク質と本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を含有していてもよい。
【００５２】
さらに、本発明のキットには、上記以外のコンポーネント、例えば基質となるｄｓＲＮＡの合成を行なうための試薬、反応の結果生成された特定の長さのｄｓＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い。特に限定はされないが例えば、分解産物であるｓｉＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い
本発明のキットを用いることで、ＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを簡便に、効率的に調製することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００５４】
実施例１ ショットガンライブラリーの調製
（１）ゲノムＤＮＡの調製
シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）Ａｃ１０株を０．１５ｇ／ｍｌトリプトン、０．０１ｇ／ｍｌ酵母エキス、０．３ｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、０．０１ｇ／ｍｌグルコース、１１．５ｍＭリン酸水素二カリウム、７．４ｍＭリン酸二水素カリウム、４ｍＭ硫酸マグネシウムを含む培地５ｍｌに植菌し、１５℃で４０時間培養した。この培養液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、沈殿物として得られた菌体を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５００μｌに懸濁した。この懸濁液に１０％ＳＤＳを５０μｌ添加し、よく混和した後２０ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅａｓｅＫ（タカラバイオ社製）を５μｌ加えて５０℃で３時間保温した。さらに、クロロホルムを５００μｌ加えて３０分間ゆっくり振とうし、１００００ｇ、１０分間、遠心し、上清を分取後１．５ｍｌのエタノールを添加した。綿状になったゲノムＤＮＡをチップで絡め取り、７０％エタノールでの洗浄を２回行なった後、５０℃で乾燥させ１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１００μｌに溶解させ、ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００５５】
（２）ライブラリーの作成
実施例１−（１）で得られたゲノムＤＮＡ溶液を２μｇ／２００μｌに調製し、このゲノムＤＮＡをＨｙｄｒｏｓｈｅｒ（ＧＥＮＥ ＭＡＣＨＩＮＥＳ社製）を用いて、サイクル２０、スピード４の条件で、平均鎖長が１．０ｋｂｐとなるように切断した。この切断ＤＮＡ溶液にＰｅｌｌｅｔ ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を２μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を２０μｌ、エタノールを６００μｌ加えてエタノール沈殿を行ない、沈殿を乾燥後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液のうち５μｌを、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、平滑化反応、リン酸化反応、ライゲーション反応を添付のプロトコールに従い行なった。なお、ライゲーション反応のベクターとして、ｐＵＣ１８ ＳｍａＩ／ＢＡＰ（アマシャムファルマシア社製）及びｐＵＣ１１８ ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）を用いた。上記キットを用いて得られた溶液をＴＥ緩衝液で１００μｌにし、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。このライゲーション溶液に、大腸菌コンピテントセルとしてＤＨ１０Ｂ ｅｌｅｃｔｒｏ ｃｅｌｌ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を５０μｌ加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦの条件でエレクトロポレーションを行なった。この溶液に、１ｍｌ ＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振とうし、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で培養を行なった。その結果、およそ１０００個のコロニーが得られ、一部のコロニーについてＰＣＲ反応によるインサートチェックを行い、４００万個のクローンからなるショットガンライブラリーを調製した。
【００５６】
実施例２ ゲノム配列の解析
（１）ゲノム配列の決定
実施例１で得られたショットガンライブラリーのそれぞれの大腸菌クローン４３２００個から、以下の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。大腸菌クローンを１ｇ／ｍｌトリプトン、０．５ｇ／ｍｌ酵母エキス、１ｇ／ｍｌ塩化ナトリウムを含む培養液２００μｌで３７℃、１４時間の条件で培養した。この培養液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、沈殿物として得られた菌体をプラスミド抽出ロボット（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液８０μｌに懸濁し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ溶液を含む溶液８０μｌを加え、さらに３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．２）溶液８０μｌを添加した。この懸濁液をＮＡプレート（ミリポア社製）に移し吸引して菌体残渣を除き、清浄した溶液を８Ｍグアニジン溶液１５０μｌを加えたＦＢプレート（ミリポア社製）に移した。さらに吸引操作によりＦＢプレートにプラスミドＤＮＡを吸着し、８０％エタノールで３回洗浄後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液７０μｌでプラスミドＤＮＡを溶出した。
【００５７】
このプラスミドＤＮＡ２μｌに、滅菌水０．８７５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度のＭ１３−４７ならびにＲＶ−Ｍプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を０．１２５μｌ、ＤｙｎａｍｉｃＥＴ ２μｌを加え、９５℃３０秒、５０℃２０秒、６０℃１分２０秒を１サイクルとする４０サイクルのＰＣＲ条件で反応を行ない、反応溶液をシークエンサーＭｅｇａＢＡＣＥ １０００（アマシャム ファルマシア社製）を用いて塩基配列の解析を行なった。こうして得られた塩基配列データをコンピュータープログラムＣＡＰ４（Ｐｒａｃｅｌ社製）により、集合、整列、解析を行ない、１つのゲノム配列として構築した。
【００５８】
（２）遺伝子の解析
上記実施例２−（１）で得られたゲノム配列から、コンピュータープログラムＧｅｎｍａｒｋ ｖ．２．４ｃ（Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．）を用いてＯＲＦ解析を行なったところ、４９３５個のＯＲＦが予測された。これらのＯＲＦについて、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｖｅｒ２．０）を用いて、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋでのホモロジーサーチを行なったところ、３０７５個のＯＲＦについてその機能が推定され、ＢＬＡＳＴ検索によりそれぞれのＯＲＦにどの酵素とホモロジーがあるのかの情報を得た。その中から低温性微生物であるシュワネラｓｐ．Ａｃ１０株より、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する目的のＲＮａｓｅＩＩＩと推定される遺伝子を取得した。
【００５９】
実施例３ ＲＮａｓｅＩＩＩのクローニングと発現
（１）発現ベクターの構築
以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、実施例２−（２）で得られたＲＮａｓｅＩＩＩの塩基配列より、配列表の配列番号２及び３記載の塩基配列を有する合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらに上記ＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３７にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸番号２２１〜２２６に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３７にもつ。
【００６０】
次に上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ１μｌ、１０μｌの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、それぞれ２０ｐｍｏｌの合成プライマー１及び２、５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリラーゼ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【００６１】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約６８０ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを６４μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【００６２】
次に平成９年１０月３１日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−１６４９６として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２３（国際寄託への移管請求日：平成１０年９月２４日）として寄託されているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭＭ０４７と命名、表示されたプラスミドベクターｐＭＭ０４７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を培養し、常法によりプラスミドベクターｐＭＭ０４７を精製し、当該ベクターを基に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを調製した。
【００６３】
上記ｐＣｏｌｄ０８ベクターは、上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理した後、上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【００６４】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩとした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩと命名、表示され、平成１５年９月２２日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−１９５２６として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７５（国際寄託への移管請求日：平成１６年７月２８日）として寄託されている。
【００６５】
（２）発現、精製
上記実施例３−（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を１００ｍｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。前記培養後、１５℃に保温したインキュベーター内で１０分間振とうした後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、５ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
【００６６】
上記上清の抽出液約５ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）にｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００］を１０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄して、約１ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ１５ｍｍのカラムに充填し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで２回洗浄した。次に５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭイミダゾール］で樹脂を洗浄後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭイミダゾール］、続いて５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。
【００６７】
洗浄後、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、１００ｍＭイミダゾール］で溶出操作を行った。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭジチオスレイトール］で透析を行ない、その後、セントリコン（アミコン社製）を用いて約１０倍（約３００μｌ）まで濃縮を行なった。この精製濃縮サンプルの一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約２７，５００のところに目的タンパク質のバンドが確認され、タンパク質濃度は約４ｍｇ／ｍｌであった。さらに、当該サンプルについてＡｎｔｉ Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（キアゲン社製）を用い、その添付プロトコルに従って抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティング検出を行なったところ、目的のタンパク質バンドが発色検出された。
上記タンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列、Ｈｉｓ ｔａｇ配列ならびにＦａｃｔｏｒ Ｘａ配列等のアミノ酸配列を付加したものであり、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドである。
【００６８】
実施例４ ＲＮａｓｅＩＩＩ活性の測定
（１）ｄｓＲＮＡ分解活性
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性を測定した。当該活性測定は以下のようにして行った。
まず、活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
すなわち、プラスミドｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ｒｓＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号６）について、プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入したｐＤＯＮ−ｒｓＧＦＰを鋳型とし、配列表の配列番号７記載のＴ７プロモーター配列をもったｄｓｒ−１プライマーと配列表の配列番号８記載のｄｓｒ−２プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応により約７００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡ（以下ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡと略称する）を調製した。
【００６９】
上記方法で調製したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇ、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
一方、対照となる市販の大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）の場合は、酵素液１μｌを基質となるｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇに添加し、３３ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液中で全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
【００７０】
以上の反応液を調製し、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドの場合は３０℃で、また大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは３７℃で一定時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００７１】
その結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドで切断した産物は、３０分間の切断でも１００塩基対以上の分解産物が確認される部分分解の段階であり、１時間切断しても２０塩基対よりも大きい切断断片が確認できた。また、一晩（約１８時間）切断したものでも、１時間切断したものとほぼ同様の切断パターンを示し、約２０塩基対前後の長さのところにメインの分解産物が確認できた。一方、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合、３０分間切断すると約１０塩基対前後の低分子分解物が主産物であることが確認できた。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドでは、約１０塩基対前後の低分子分解物が生じにくく、また部分分解による分解産物の調製が容易であることが確認できた。
【００７２】
（２）温度感受性の検討
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性における温度感受性について検討した。対照として大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）を用いた。当該活性測定は以下のようにして行った。
すなわち、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５μｌとしたものを酵素液とし、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃で１０分間及び２０分間処理した。この反応溶液に、上記実施例４−（１）で使用したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇを加えて１０μｌとしたものを、３０℃で１時間反応させた。
【００７３】
一方、対照の大腸菌由来ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）の場合は、酵素液１μｌを３３ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液に加えて全量を５μｌとしたものを反応液とし、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃で１０分間及び２０分間処理した。その後、ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡを５μｇ加えて１０μｌとしたものを３７℃で１時間反応させた。
反応終了後、これらの反応液５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００７４】
その結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドの場合、５０℃で２０分間処理したものではｄｓＲＮＡ分解活性が確認されず、一方、大腸菌のＲＮａｓｅＩＩＩの場合、６０℃で２０分間処理したもので活性が確認されなかった。
すなわち、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩと比較して、熱感受性が高く、より低い温度での失活が可能であることが判明した。
【００７５】
実施例５
本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを用いて調製したｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販の大腸菌由来ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、上記実施例４−（１）に記載の方法で行った。すなわち低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合はｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１５μｇ分を、３０℃、６０分間で切断し、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩの場合は、完全分解の場合、ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１５μｇ分を、３７℃、６０分間で切断し、また部分分解の場合は３７℃で１０分間切断して調製した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下の評価に使用した。
【００７６】
ＲＮＡ干渉に関する評価は、以下のようにして行った。
すなわち、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：５×１０４）２４ｗｅｌｌプレートに撒き、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、５０μｌの無血清培地に３μｌのＴｒａｎｓＩＴ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。そこに４μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬を加えて穏やかに混和し、室温で５分間放置した。そこに上記で調製したｄｓＲＮＡ分解物を５００ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置し、これをＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液とした。Ｗｅｌｌ中の無血清培地を２５０μｌになるように添加したものに、ＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、０．３μｇのｐＱＢＩ２５のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
表１に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ａｃ１０由来のＲＮａｓｅＩＩＩ分解物は、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの完全分解産物及び部分分解産物よりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００７９】
実施例６ ｄｓＲＮＡ基質を変えた場合のＲＮａｓｅＩＩＩ活性
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性の基質となるｄｓＲＮＡをルシフェラーゼ遺伝子より作製し評価した。実施例４−（１）と同様にｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
【００８０】
すなわち、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）に挿入されているルシフェラーゼをコードする遺伝子について、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）を鋳型とし、配列表の配列番号９記載のＴ７プロモーター配列をもったｄｓｌ−１プライマーと配列表の配列番号１０記載のｄｓｌ−２プライマーを用いてＰＣＲ（増幅断片長約５００塩基対）、前記ｄｓｌ−１プライマーと配列表の配列番号１１記載のｄｓｌ−３プライマーを用いてＰＣＲ（増幅断片長約１０００塩基対）を行い、２種類の増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応により約５００ｂｐの長さ及び約１０００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。
【００８１】
上記方法で調製したｄｓＲＮＡ５μｇ、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
以上の反応液を調製し、３０℃で、一定時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００８２】
その結果、切断産物は、１時間切断しても２０塩基対よりも大きい切断断片が確認できた。また、一晩（約１８時間）切断したものでも、１時間切断したものとほぼ同様の切断パターンを示した。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドでは、鋳型を変えた場合及び基質となるｄｓＲＮＡの長さを変えた場合においても、約１０塩基対前後の低分子分解物が生じにくく、また部分分解による分解産物の調製が容易であることが確認できた。
【００８３】
実施例７ ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子の検討
（１）ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子を検討するために、常温域で核酸結合活性を有するタンパク質について検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質は入手が困難である。従って、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質をモデルタンパク質として用いた。当該タンパク質は、プロテイン サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の方法で調製した。
【００８４】
（２）サーモトガ マリティマ由来ＣｓｐＢのｄｓＲＮＡ分解への効果
ＣｓｐＢを添加した形でのｄｓＲＮＡ分解活性は以下のように測定した。
すなわち、ＲＮａｓｅＩＩＩを酵素として用いた場合、実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル（酵素液）１μｌ、上記（１）で調製したＣｓｐＢ溶液１μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ１μｇ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。
ＣｓｐＢタンパク質の濃度は、それぞれ終濃度で９．２ｎｇ／μｌ、１８．４ｎｇ／μｌ、９２ｎｇ／μｌになるように添加し、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。
以上の反応液を調製し、３０℃で１時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。
【００８５】
その結果、全ての添加量においてＣｓｐＢ添加によるｄｓＲＮＡの分解の促進が確認できた。
【００８６】
実施例８ ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡから調製したｄｓＲＮＡ分解サンプルの評価
本発明の低温性微生物由来ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて調製したｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）を用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例４−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例３−（２）記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ由来ＲＮａｓｅＩＩＩを２μｌ用いて、上記実施例４−（１）で調製したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３０℃、１時間で切断し、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（１Ｕ／μｌ）については２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１０分（部分分解）および６０分（完全分解）で切断した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。
【００８７】
すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｄｓＲＮＡ分解物を５５．６ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を，Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
【００８９】
表２に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較して平均蛍光強度の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩｓｐ．ＡＣ１０によって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様にＲＮＡｉ効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のための調製に有用であることが確認できた。
【００９０】
上記実施例６で調製した細胞サンプルについてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出しｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲに供しｒｓＧＦＰのｍＲＮＡを定量する事で、ＲＮＡ干渉の評価を行った。
【００９１】
すなわち、ｓｉＲＮＡ導入後ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した細胞からｔｒｉｚｏｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出、精製した。なおこの際の作業は、添付のプロトコルに従って行った。そのトータルＲＮＡを８０ｎｇ、５×Ｍ−ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ社製）１μｌ、ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ １００ｐｍｏｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社製）２０Ｕ、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １００Ｕ、を加え、滅菌水で全量を２０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、４２℃１０分、９５℃２分の反応を行った。この反応液に２０μｌの反応希釈液（１×Ｍ−ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）を加え、これを１０μｌずつに分注した。前述の反応物１０μｌに、１０×Ｒ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、２５０ｍＭ Ｍｇ２＋ ０．３μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．７５μｌ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）１．２５Ｕ、滅菌水で３０００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、１００％ＤＭＳＯ １．２５μｌを加え、β−ａｃｔｉｎ（タカラバイオ社製）、ＧＡＰＤＨ（タカラバイオ社製）、ｒｓＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ−Ｆ：配列番号１４、ｒｓＧＦＰ−Ｒ：配列番号１５）、Ｎｅｏ（Ｎｅｏ−Ｆ：配列番号１６、Ｎｅｏ−Ｒ：配列番号１７）を検出するための合成プライマーを５ｐｍｏｌずつ加え、滅菌水で全量を２５μｌとした。前記反応液をＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｕｎｉｔ（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、１０秒で熱変性を行った後、９５℃５秒、６０℃２０秒を１サイクルとする４５サイクルの反応を行なった。得られたデータを解析することで，ヒト由来のβ−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、および導入プラスミド由来のｒｓＧＦＰ、ＮｅｏのｍＲＮＡ量を定量した。その結果を表３に示す。
【００９２】
【表３】
【００９３】
表３に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してｒｓＧＦＰのｍＲＮＡ量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様の効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００９４】
実施例９ ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡから調製したｄｓＲＮＡ分解物の評価
上記実施例３−（２）で調製したサンプルについて、ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡを基質として上記実施例８と同様の操作を行い、ｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉効果を評価した。ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡは、実施例６で調整した５００ｂｐのものを用いた。
【００９５】
ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例４−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例３−（２）記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩを２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３０℃、１時間で切断し、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（１Ｕ／μｌ）については２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１０分（部分分解）および６０分（完全分解）で切断した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。また、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて３７℃、１０分で切断した産物については、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、２１ｂｐ近辺のバンドを切り出した。この切り出したゲル片にＴＥ ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１６時間振とうし、その溶出液からエタノール沈殿により切断産物を回収した。これをゲル回収サンプルとした。
【００９６】
ＲＮＡ干渉に関する評価は以下のように行った。すなわち、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．５μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡを５００ｎｇ、１６６．７ｎｇ、５５．６ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を，Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたアッセイに供することで、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対する、ｄｓＲＮＡ分解物を添加した場合のＧＬ３タンパク質発現の阻害効果を測定した。そのアッセイ方法については添付の説明書に従った。その結果を表４に示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表４では、コントロール（ベクターのみ）と比較してそのＧＬ３発現量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様にＲＮＡ干渉効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。またその効果は切断産物をゲル回収したものより優れていることが明らかとなった。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００９９】
実施例１０ Ｓｈｅｗａｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩとヒト由来Ｄｉｃｅｒの比較
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩで調製したｄｓＲＮＡと、ヒト由来Ｄｉｃｅｒで調製したｄｓＲＮＡを用いて、ＲＮＡ干渉効果の比較を行った。なお実施例９記載のルシフェラーゼを用いた評価系を利用した。
【０１００】
ヒト由来Ｄｉｃｅｒとしては、市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）を用いた。また、実際の操作は上記実施例９の方法に従った。ただし、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行う２９３細胞は、９５％コンフレントになるまでＣＯ２インキュベーター内で培養したものを用いた。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してＧＬ３ｍＲＮＡ量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得らるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同程度のＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが提供される。該ポリペプチドは、ＲＮＡ干渉において最適なｓｉＲＮＡを調製することができる。また、本発明の方法によりＲＮＡ干渉等において有用な、ｓｉＲＮＡの調製方法が提供される。さらに本発明の方法を簡便に実施することができる組成物ならびにキットが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ １ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５；Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｒ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｒ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−３ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｅｏ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｅｏ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに単離されたポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドによってコードされるＲＮａｓｅＩＩＩを有するポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそれらの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮａｓｅＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）に特異的に作用し、５’−末端リン酸基を持つ平均１５ヌクレオチド単位のオリゴヌクレオチドを生成することができる酵素である。当該酵素は、例えば、大腸菌の３０Ｓ抽出液中に存在する。さらに類似酵素が、ウシ胸腺あるいはトリ胚に存在していることも報告されている。しかしながら、当該酵素は、ＲＮＡ−ＲＮＡの二次構造を一本鎖ＲＮＡと識別する方法等に使用されるのがほとんどであった。（例えば、非特許文献１参照）
【０００３】
一方、最近になってＲＮＡ干渉（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と言う技術が報告された。当該技術は、ｄｓＲＮＡによってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子発現が抑制される現象に基づくものである。ｄｓＲＮＡによって遺伝子サイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチセンスを用いた研究からであった。１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓはｐａｒ−１と呼ばれる遺伝子をアンチセンスＲＮＡで抑制する実験を行なった。アンチセンスＲＮＡを加えると、予想通りｐａｒ−１の発現を抑制したが、驚いたことに、コントロールとして用いたセンスＲＮＡも同様にｐａｒ−１の発現を抑制し、ｐａｒ−１変異株の表現形を示した。（例えば、非特許文献２参照）
この矛盾は、１９９８年にＦｉｒｅらによって解き明かされた。アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを、それぞれＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するとき、わずかに非特異的に逆向きのＲＮＡができてしまう。そのコンタミネーションよってできるｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングの本体であり、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは遺伝子の発現を抑制できないこと、またアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをアニールさせたｄｓＲＮＡが効率よく遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。（例えば、非特許文献３、特許文献１参照）
【０００４】
上記ＲＮＡ干渉においては、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素がｄｓＲＮＡから小分子のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を生成させる。（例えば、非特許文献４、特許文献２参照）
この酵素の作用により生じたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体に取り込まれ、該複合体が標的ｍＲＮＡを認識し、分解すると考えられている。しかしながら、ＲＮＡ干渉に関与すると考えられる各因子についての正確な機能についてはまだまだ未知の部分が多いのが現状であった。（例えば、非特許文献５参照）
【０００５】
一方、微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩもｓｉＲＮＡの調製に利用される。（非特許文献６参照）前記ＲＮａｓｅＩＩＩとしては、例えばエピセントル社（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ社）から大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩが発売され、ｓｉＲＮＡの調製に使用されている。しかしながら、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは反応性が高く、例えば５００塩基対以上の長鎖のｄｓＲＮＡを鋳型とした場合でもすぐに約１０塩基対程度の低分子のものに分解してしまう。この場合、ＲＮＡ干渉に有効とされる約２１塩基対のｓｉＲＮＡを調製する際には、長鎖ｄｓＲＮＡの部分分解を反応温度を下げる、または反応時間を短くするなどの条件改変により実施しなければならないが、前述のように大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは反応性が高いため、その反応条件の制御が困難であり、また部分分解条件においても前述の低分子のものが生じやすいという欠点を有していた。
以上のように、２本鎖ＲＮＡからＲＮＡ干渉を実施する際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを調製する際に、反応条件の制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉効果の低い低分子のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩが求められていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６５０６５５９号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／６８８３６号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／）、ＥＣ ３．１．２６．３
【非特許文献２】Ｇｕｏ Ｓ．他１名 Ｃｅｌｌ １９９５年 ｖｏｌ．８１、ｐ６１１−６２０
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ Ａ．他５名 Ｎａｔｕｒｅ １９９８年 ｖｏｌ．３９、ｐ８０６−８１１
【非特許文献４】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅ．他３名 Ｎａｔｕｒｅ ２００１年 ｖｏｌ．４０９、ｐ３６３−３６６
【非特許文献５】Ｔａｂａｒａ Ｈ．他３名 Ｃｅｌｌ ２００２年 ｖｏｌ．１０９、ｐ８６１−８７１
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ Ｈ．他４名 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００２年 ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１，ｐ５８７５−５８８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｄｓＲＮＡを調製する際に、ＲＮＡ干渉の効果の低い低分子物のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する新規ポリヌクレオチドを提供することにある。また、該ポリヌクレオチドを用いた、従来とは異なったより効率的なｓｉＲＮＡの調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、反応条件の制御が容易という観点から常温菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合よりも低い温度で熱失活させることが可能で、その温度感受性を利用して温和な分解条件を設定することが可能となるようなＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリヌクレオチドについて鋭意検討した結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易で、さらにＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｓｉＲＮＡを調製する際に、ＲＮＡ干渉の効果の低い低分子物のものが生じにくいＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有することを見出した。また、４℃においても生育可能な低温性微生物Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ａｃ１０由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニングを試み、目的のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現させることに成功し、該ＲＮａｓｅＩＩＩの活性が、ｓｉＲＮＡ調製時に好適であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の発明は、完全分解後にＲＮＡ干渉に有効な特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する微生物由来のポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明の第２の発明は、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明の第３の発明は、ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明の第４の発明は、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１３】
本発明の第１〜４の発明においては、当該ポリペプチドは、低温性微生物由来であることが好ましく、特に限定はされないが例えば、シェワネラ属微生物であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第５の発明は、下記から選択されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、反応条件に応じて大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を任意に得ることができることを特徴とするポリペプチドであり、
（ａ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列でコードされるアミノ酸配列、に関する。
【００１５】
本発明の第６の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質である本発明の第１〜第４の発明のポリペプチドに関する。
【００１６】
本発明の第７の発明は、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを用いたｄｓＲＮＡの分解方法に関する。
【００１７】
本発明の第７の発明において、特に限定はされないがｄｓＲＮＡの分解物はＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能しうるｄｓＲＮＡであるものが例示される。また、本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で実施しても良く、使用するポリペプチドが、核酸結合活性を有するタンパク質と本発明の第１〜第４の発明のポリペプチドとの融合タンパク質であっても良い。当該核酸結合活性を有するタンパク質は、特に限定はされないが例えば好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールドショックプロテインが例示される。特に限定はされないが例えば、当該コールドショックプロテインは、サーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテインＢが挙げられる。
【００１８】
本発明の第８の発明は、本発明の第７の発明に記載の方法に用いる組成物であって、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用組成物に関する。
【００１９】
本発明の第９の発明は、本発明の第７の発明に記載の方法に用いるキットであって、本発明の第１〜第６の発明のポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用キットに関する。
【００２０】
本発明の第１０の発明は、下記から選択される塩基配列を有する核酸に関する。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列において一ないしは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された塩基配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列。
【００２１】
本発明の第１１の発明は、本発明の第１０の発明の核酸を用いて、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造する方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、反応条件の制御が容易な低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが提供される。さらに本発明のポリペプチドを用いることにより、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｄｓＲＮＡを簡便に、効率よく生成させる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書においてＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を分解するエンドヌクレアーゼのことを言い、一般にはｄｓＲＮＡを完全に消化することで１０塩基対程度の小断片ｄｓＲＮＡを生成する。上記ポリペプチドは、天然型あるいは人工的に修飾されたもののいずれのｄｓＲＮＡをも基質として分解することができる。特に限定はされないが例えば、ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ＣＭＰ ｗ２’−ｆｌｕｏｒｉｎｅ−ＵＭＰで置き換えたｄｓＲＮＡ等が例示される。
【００２４】
本明細書においてｄｓＲＮＡとは、２本鎖構造を形成したＲＮＡのことであり、特に限定はされないが例えばＲＮＡ干渉の対象となるｍＲＮＡと該ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するＲＮＡとの２本鎖構造を形成したＲＮＡのことを言う。
上記ｄｓＲＮＡには２本鎖構造を保持したＲＮＡ分解物も含まれる。その中には、ＲＮＡ干渉に有用なｓｉ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡも含まれる。また、上記ｄｓＲＮＡならびにその分解物には３’及び／又は５’末端側に一本鎖部分があってもよい。
【００２５】
本明細書において、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡとは、特に限定はされないが例えば、約１０〜１００塩基対の範囲中の特定の長さのｄｓＲＮＡのことを言う。さらに例えば、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得る長さのｓｉＲＮＡとは約１５〜３０塩基対の範囲、特に２０〜２５塩基対の範囲のｄｓＲＮＡであっても良い。
【００２６】
本明細書において、特定の範囲のｄｓＲＮＡとは、上記ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡであり、約１０塩基対前後の小さなｄｓＲＮＡ分解物の存在比が少ないことを特徴とする。特に限定はされないが、約１０〜１００塩基対の範囲、より好ましくは約１５〜３０塩基対の範囲、さらに好ましくは２０〜２５塩基対の範囲のｄｓＲＮＡであっても良い。
【００２７】
本明細書において反応条件の制御が容易とは、特に限定はされないが例えば、ｄｓＲＮＡ分解反応の場合、当該分解反応において反応速度が遅く、生成する低分子産物を目安（ｄｓＲＮＡ分解産物の長さを目安に）に部分分解の条件を設定し易いもののことを言う。言い換えれば、低分子産物が生じにくいものが好ましい。上記反応条件の制御が容易な酵素を産生するものとしては、特に限定はされないが例えば下記に示す低温性微生物由来のものが好適に使用できる。
【００２８】
本明細書において完全分解とは、酵素量が十分である分解反応において、基質の分解反応が進み分解産物の生産量が定常期に達する（基質と分解物が平衡状態となり量が変化しなくなる）のに十分な時間を経過した分解反応のことを意味する。部分分解とは、完全分解に達する前の分解を意味する。
【００２９】
微生物は、生育できる温度範囲の違いによって、高温性、中温性、低温性微生物に大別される。この低温で生育できる微生物はさらに生育できなくなる上限温度と最適生育温度によって、低温微生物と好冷微生物に細分され、生育限界温度２０℃以下で最適生育温度１５℃以下のものを好冷微生物、生育限界温度２０℃以上のものを低温性微生物と一般に呼称されている。本明細書において、低温性微生物とは、上記低温性微生物のことを言う。本発明において遺伝子源として使用できる微生物は、特に属、種あるいは株などを限定するものではないが、例えばシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属などに分類される低温性微生物等を用いることができる。これらの微生物については公的微生物寄託機関において容易に入手できる。前記シェワネラ属微生物の例として、シェワネラ・ピュ−トリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−２８７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２５）あるいは、シェワネラ属 Ａｃ１０株等が例示される。しかしながら、前記したように、種々の低温性微生物を同様にして遺伝子源として使用することができることは言うまでもない。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、反応条件の制御が容易なポリペプチドである。特に限定はされないが例えば、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲のｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチドが例示される。
また、本発明のポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有していても良い。
すなわち、本発明のポリペプチドは、反応条件（温度、時間、酵素濃度等）を任意に設定することにより、今まで大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでは困難であった、特定の範囲のｄｓＲＮＡを容易に得ることができる。さらに、酵素バッファーにマンガンイオンなどの特別な試薬を添加することなく、特定の範囲のｄｓＲＮＡを容易に得ることができるポリペプチドであることが好ましい。
【００３１】
さらに本発明のポリペプチドの別態様としては、ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが例示される。
本発明においては、特に限定はされないが例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩと比較してｄｓＲＮＡ分解活性が遅いものが好ましく、その反応速度が１時間反応させても約１０塩基対程度の断片が生じにくいものが好ましい。
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩよりもｄｓＲＮＡ分解速度が遅いため、反応時間、反応温度等を選択することにより、任意の特定の長さのｄｓＲＮＡを調製することができる。前記特性を利用することにより、これまでの大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでは困難であった、ｄｓＲＮＡの部分分解も実施することができる。さらに、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩよりもＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し難い低分子のｄｓＲＮＡが生成しにくいポリペプチドである。言い換えれば、当該ポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩに比較して、長鎖ｄｓＲＮＡ（約５００〜１０００塩基対）の分解速度が遅く、また約１０塩基対程度の低分子分解物が生じにくいことから、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡをより簡便に、効率的に調製することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、ＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能し得るｄｓＲＮＡを調製することができる。特に限定はされないが、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するものが例示される。また、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、上記機能を有する範囲であれば上記アミノ酸配列あるいは塩基配列において、一ないしは複数個のアミノ酸あるいは塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加されたものも本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドに含まれる。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
さらに、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列表の配列番号４）に少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドは、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
【００３３】
さらに配列番号１で表わされるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相当する配列番号１で表わされるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同等のｄｓＲＮＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、特に限定はされないが、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル第３版〔サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、用いるプローブのＴｍ−２５℃の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。
【００３４】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
【００３５】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
【００３６】
さらに、本発明によって開示された塩基配列（配列表の配列番号１）に少なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より好ましくは９０％の相同性を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。
【００３７】
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（タカラバイオ社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。当該ポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【００３９】
遺伝子操作による上記酵素、ポリペプチドの製造方法としては、例えば、該ＲＮａｓｅＩＩＩをコードするＤＮＡ配列が宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、オペレーター及びターミネーター配列と共に、宿主生物中で複製されるベクターに挿入されたプラスミドを用いて形質転換された宿主細胞、または該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、オペレーター及びターミネーター配列と共に、宿主細胞ＤＮＡにインテグレーションされることで形質転換された宿主細胞を、ＲＮａｓｅＩＩＩの発現できる条件のもとに培養し、さらにＲＮａｓｅＩＩＩを培養液から回収する方法が挙げられる。
【００４０】
また、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩは、該ＲＮａｓｅＩＩＩをコードするポリヌクレオチド等を基にして得られる該ＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列に関する知見を基に、従来のＲＮａｓｅＩＩＩをコードするＤＮＡを改変する遺伝子工学の手法によって生産されるものであってもよい。
特に限定はされないが、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドにおいて、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したものも本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質に含まれる。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
さらに、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態のものであってもよい。
【００４１】
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクターには、特に限定はなく、市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限定はされないが例えばｐＥＴシステム（ノバジェン社製）を用いることができる。さらに、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターが挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターで製造する方法が例示される。
すなわち、本発明の製造方法においては、ｓｉＲＮＡを生成させ得る機能を保持できるポリペプチドを発現できるベクターであればいずれもが好適に使用できる。
また、当該ｓｉＲＮＡを生成させ得る機能を最終的に保持できるポリペプチドを得られるならば、ポリペプチド発現時は封入体の形態であるがその後のリホールディング操作により当該機能を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
【００４２】
本発明のＲＮａｓｅＩＩＩを採取するには、一般の大腸菌組み換え酵素採取の手段に準じて行えば良い。即ち、大腸菌組み換え体を培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から分離することができる。この菌体を破砕して無細胞抽出液を調製し、粗酵素液として以下の精製操作に用いる。また、酵素が菌体外に分泌されている場合には、菌体が除去された培養液上清を粗酵素液とすることができる。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
【００４３】
ポリペプチドを遺伝子工学的に製造したり、その製造物を使用するに当たり、そのポリペプチドがどの生物由来であるかは、その製造効率、使用効果に大きな影響を与える。すなわち、本発明のポリペプチドは、ヒトＤｉｃｅｒに比べて、大量にかつ安価に製造することができる。さらに、Ｄｉｃｅｒに比べて、基質の切れ残りが少なく、反応時間が短いので、大量の基質を処理するのに適している。
【００４４】
（２）本発明のポリペプチドを用いたｄｓＲＮＡの分解方法
本発明のｄｓＲＮＡの分解方法は、上記（１）記載のポリペプチドを用いることを特徴とする。本発明の方法において、上記ポリペプチドを用いることにより、反応条件（時間、温度、酵素濃度等）を制御することにより、例えば特定の範囲のｓｉＲＮＡを調製することができる。特に限定はされないが例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩより温和な反応条件、３０℃の反応温度で反応でき、ＲＮＡ干渉の際に効果的の望める長さのｓｉＲＮＡをより簡便に、効率的に調製することができる。
【００４５】
さらに本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下に行うことを特徴とする。当該核酸結合タンパクとしては、結果的にｄｓＲＮＡ分解活性を促進するものであれば特に限定はなく、例えば、上記ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質等が好適に使用できる。
当該ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質としては特に限定はないが、コールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が例示される。特に常温域で機能し得るコールド ショック プロテインが好適に使用でき、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテインが好ましい。特に限定はされないが、例えばプロテイン サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のコールド ショック プロテインＢ（ＣｓｐＢ）タンパク質、モレキュラー マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第１１巻（５）、８３３−８３９頁（１９９４）記載の大腸菌由来ＣｓｐＢタンパク質、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１７４巻（２０）、６３２６−６３３５頁（１９９２）記載のバチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＣｓｐＢタンパク質が好適に使用できる。
当該ＣｓｐＢタンパク質を上記（１）記載のポリペプチドと組み合わせることにより、当該ｄｓＲＮＡ分解活性を促進させることができる。さらに、本発明の方法においては、当該核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ合成活性を有するタンパク質は、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形態のものであってもよい。
【００４６】
（３）本発明の方法に使用される組成物
本発明の組成物は、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応を効率よく行うための組成物であり、例えばＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを効率よく調製するための組成物である。当該組成物は、上記（１）記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含む組成物である。
上記ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドにおいて、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したポリペプチドであっても良い。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、本発明の組成物には、上記ポリペプチドを安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
【００４７】
さらに当該組成物は、核酸結合活性を有するタンパク質を含んでいてもよく、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド ショック プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好ましい。
【００４８】
さらに本発明の組成物の別態様としては、上記の核酸結合活性を有するタンパク質と本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を含有していてもよい。
【００４９】
（４）本発明の方法に使用されるキット
本発明の方法に使用されるキットは、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応を効率よく行うためのキットであり、例えばＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを効率よく調製するためのキットである。
本発明のキットには、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。該ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとしては、上記（１）で挙げられたものが好適に使用できる。さらに本発明のキットには、上記ポリペプチドを安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
【００５０】
さらに当該キットは、核酸結合活性を有するタンパク質を含んでいてもよく、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド ショック プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好ましい。
【００５１】
さらに本発明のキットの別態様としては、上記の核酸結合活性を有するタンパク質と本発明のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を含有していてもよい。
【００５２】
さらに、本発明のキットには、上記以外のコンポーネント、例えば基質となるｄｓＲＮＡの合成を行なうための試薬、反応の結果生成された特定の長さのｄｓＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い。特に限定はされないが例えば、分解産物であるｓｉＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い
本発明のキットを用いることで、ＲＮＡ干渉の際に効果の望める長さのｓｉＲＮＡを簡便に、効率的に調製することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００５４】
実施例１ ショットガンライブラリーの調製
（１）ゲノムＤＮＡの調製
シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．）Ａｃ１０株を０．１５ｇ／ｍｌトリプトン、０．０１ｇ／ｍｌ酵母エキス、０．３ｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、０．０１ｇ／ｍｌグルコース、１１．５ｍＭリン酸水素二カリウム、７．４ｍＭリン酸二水素カリウム、４ｍＭ硫酸マグネシウムを含む培地５ｍｌに植菌し、１５℃で４０時間培養した。この培養液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、沈殿物として得られた菌体を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５００μｌに懸濁した。この懸濁液に１０％ＳＤＳを５０μｌ添加し、よく混和した後２０ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅａｓｅＫ（タカラバイオ社製）を５μｌ加えて５０℃で３時間保温した。さらに、クロロホルムを５００μｌ加えて３０分間ゆっくり振とうし、１００００ｇ、１０分間、遠心し、上清を分取後１．５ｍｌのエタノールを添加した。綿状になったゲノムＤＮＡをチップで絡め取り、７０％エタノールでの洗浄を２回行なった後、５０℃で乾燥させ１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１００μｌに溶解させ、ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００５５】
（２）ライブラリーの作成
実施例１−（１）で得られたゲノムＤＮＡ溶液を２μｇ／２００μｌに調製し、このゲノムＤＮＡをＨｙｄｒｏｓｈｅｒ（ＧＥＮＥ ＭＡＣＨＩＮＥＳ社製）を用いて、サイクル２０、スピード４の条件で、平均鎖長が１．０ｋｂｐとなるように切断した。この切断ＤＮＡ溶液にＰｅｌｌｅｔ ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を２μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を２０μｌ、エタノールを６００μｌ加えてエタノール沈殿を行ない、沈殿を乾燥後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液のうち５μｌを、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、平滑化反応、リン酸化反応、ライゲーション反応を添付のプロトコールに従い行なった。なお、ライゲーション反応のベクターとして、ｐＵＣ１８ ＳｍａＩ／ＢＡＰ（アマシャムファルマシア社製）及びｐＵＣ１１８ ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）を用いた。上記キットを用いて得られた溶液をＴＥ緩衝液で１００μｌにし、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。このライゲーション溶液に、大腸菌コンピテントセルとしてＤＨ１０Ｂ ｅｌｅｃｔｒｏ ｃｅｌｌ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を５０μｌ加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦの条件でエレクトロポレーションを行なった。この溶液に、１ｍｌ ＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振とうし、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で培養を行なった。その結果、およそ１０００個のコロニーが得られ、一部のコロニーについてＰＣＲ反応によるインサートチェックを行い、４００万個のクローンからなるショットガンライブラリーを調製した。
【００５６】
実施例２ ゲノム配列の解析
（１）ゲノム配列の決定
実施例１で得られたショットガンライブラリーのそれぞれの大腸菌クローン４３２００個から、以下の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。大腸菌クローンを１ｇ／ｍｌトリプトン、０．５ｇ／ｍｌ酵母エキス、１ｇ／ｍｌ塩化ナトリウムを含む培養液２００μｌで３７℃、１４時間の条件で培養した。この培養液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、沈殿物として得られた菌体をプラスミド抽出ロボット（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液８０μｌに懸濁し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ溶液を含む溶液８０μｌを加え、さらに３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．２）溶液８０μｌを添加した。この懸濁液をＮＡプレート（ミリポア社製）に移し吸引して菌体残渣を除き、清浄した溶液を８Ｍグアニジン溶液１５０μｌを加えたＦＢプレート（ミリポア社製）に移した。さらに吸引操作によりＦＢプレートにプラスミドＤＮＡを吸着し、８０％エタノールで３回洗浄後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液７０μｌでプラスミドＤＮＡを溶出した。
【００５７】
このプラスミドＤＮＡ２μｌに、滅菌水０．８７５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度のＭ１３−４７ならびにＲＶ−Ｍプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を０．１２５μｌ、ＤｙｎａｍｉｃＥＴ ２μｌを加え、９５℃３０秒、５０℃２０秒、６０℃１分２０秒を１サイクルとする４０サイクルのＰＣＲ条件で反応を行ない、反応溶液をシークエンサーＭｅｇａＢＡＣＥ １０００（アマシャム ファルマシア社製）を用いて塩基配列の解析を行なった。こうして得られた塩基配列データをコンピュータープログラムＣＡＰ４（Ｐｒａｃｅｌ社製）により、集合、整列、解析を行ない、１つのゲノム配列として構築した。
【００５８】
（２）遺伝子の解析
上記実施例２−（１）で得られたゲノム配列から、コンピュータープログラムＧｅｎｍａｒｋ ｖ．２．４ｃ（Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．）を用いてＯＲＦ解析を行なったところ、４９３５個のＯＲＦが予測された。これらのＯＲＦについて、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｖｅｒ２．０）を用いて、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋでのホモロジーサーチを行なったところ、３０７５個のＯＲＦについてその機能が推定され、ＢＬＡＳＴ検索によりそれぞれのＯＲＦにどの酵素とホモロジーがあるのかの情報を得た。その中から低温性微生物であるシュワネラｓｐ．Ａｃ１０株より、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する目的のＲＮａｓｅＩＩＩと推定される遺伝子を取得した。
【００５９】
実施例３ ＲＮａｓｅＩＩＩのクローニングと発現
（１）発現ベクターの構築
以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、実施例２−（２）で得られたＲＮａｓｅＩＩＩの塩基配列より、配列表の配列番号２及び３記載の塩基配列を有する合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらに上記ＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３７にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）のアミノ酸番号２２１〜２２６に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３７にもつ。
【００６０】
次に上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ１μｌ、１０μｌの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、それぞれ２０ｐｍｏｌの合成プライマー１及び２、５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリラーゼ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【００６１】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約６８０ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを６４μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【００６２】
次に平成９年１０月３１日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−１６４９６として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２３（国際寄託への移管請求日：平成１０年９月２４日）として寄託されているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭＭ０４７と命名、表示されたプラスミドベクターｐＭＭ０４７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を培養し、常法によりプラスミドベクターｐＭＭ０４７を精製し、当該ベクターを基に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを調製した。
【００６３】
上記ｐＣｏｌｄ０８ベクターは、上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理した後、上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【００６４】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩとした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩと命名、表示され、平成１５年９月２２日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−１９５２６として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７５（国際寄託への移管請求日：平成１６年７月２８日）として寄託されている。
【００６５】
（２）発現、精製
上記実施例３−（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８ ＳＨＥ−ＲＮＩＩＩを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を１００ｍｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。前記培養後、１５℃に保温したインキュベーター内で１０分間振とうした後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、５ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
【００６６】
上記上清の抽出液約５ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）にｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００］を１０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄して、約１ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ１５ｍｍのカラムに充填し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで２回洗浄した。次に５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭイミダゾール］で樹脂を洗浄後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭイミダゾール］、続いて５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。
【００６７】
洗浄後、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、１００ｍＭイミダゾール］で溶出操作を行った。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭジチオスレイトール］で透析を行ない、その後、セントリコン（アミコン社製）を用いて約１０倍（約３００μｌ）まで濃縮を行なった。この精製濃縮サンプルの一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約２７，５００のところに目的タンパク質のバンドが確認され、タンパク質濃度は約４ｍｇ／ｍｌであった。さらに、当該サンプルについてＡｎｔｉ Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（キアゲン社製）を用い、その添付プロトコルに従って抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティング検出を行なったところ、目的のタンパク質バンドが発色検出された。
上記タンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＢ配列、Ｈｉｓ ｔａｇ配列ならびにＦａｃｔｏｒ Ｘａ配列等のアミノ酸配列を付加したものであり、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドである。
【００６８】
実施例４ ＲＮａｓｅＩＩＩ活性の測定
（１）ｄｓＲＮＡ分解活性
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性を測定した。当該活性測定は以下のようにして行った。
まず、活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
すなわち、プラスミドｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ｒｓＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号６）について、プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入したｐＤＯＮ−ｒｓＧＦＰを鋳型とし、配列表の配列番号７記載のＴ７プロモーター配列をもったｄｓｒ−１プライマーと配列表の配列番号８記載のｄｓｒ−２プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応により約７００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡ（以下ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡと略称する）を調製した。
【００６９】
上記方法で調製したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇ、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
一方、対照となる市販の大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）の場合は、酵素液１μｌを基質となるｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇに添加し、３３ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液中で全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
【００７０】
以上の反応液を調製し、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドの場合は３０℃で、また大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは３７℃で一定時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００７１】
その結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドで切断した産物は、３０分間の切断でも１００塩基対以上の分解産物が確認される部分分解の段階であり、１時間切断しても２０塩基対よりも大きい切断断片が確認できた。また、一晩（約１８時間）切断したものでも、１時間切断したものとほぼ同様の切断パターンを示し、約２０塩基対前後の長さのところにメインの分解産物が確認できた。一方、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合、３０分間切断すると約１０塩基対前後の低分子分解物が主産物であることが確認できた。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドでは、約１０塩基対前後の低分子分解物が生じにくく、また部分分解による分解産物の調製が容易であることが確認できた。
【００７２】
（２）温度感受性の検討
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性における温度感受性について検討した。対照として大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）を用いた。当該活性測定は以下のようにして行った。
すなわち、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５μｌとしたものを酵素液とし、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃で１０分間及び２０分間処理した。この反応溶液に、上記実施例４−（１）で使用したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ５μｇを加えて１０μｌとしたものを、３０℃で１時間反応させた。
【００７３】
一方、対照の大腸菌由来ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）の場合は、酵素液１μｌを３３ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液に加えて全量を５μｌとしたものを反応液とし、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃で１０分間及び２０分間処理した。その後、ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡを５μｇ加えて１０μｌとしたものを３７℃で１時間反応させた。
反応終了後、これらの反応液５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００７４】
その結果、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドの場合、５０℃で２０分間処理したものではｄｓＲＮＡ分解活性が確認されず、一方、大腸菌のＲＮａｓｅＩＩＩの場合、６０℃で２０分間処理したもので活性が確認されなかった。
すなわち、低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩと比較して、熱感受性が高く、より低い温度での失活が可能であることが判明した。
【００７５】
実施例５
本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを用いて調製したｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販の大腸菌由来ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、上記実施例４−（１）に記載の方法で行った。すなわち低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩの場合はｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１５μｇ分を、３０℃、６０分間で切断し、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩの場合は、完全分解の場合、ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１５μｇ分を、３７℃、６０分間で切断し、また部分分解の場合は３７℃で１０分間切断して調製した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下の評価に使用した。
【００７６】
ＲＮＡ干渉に関する評価は、以下のようにして行った。
すなわち、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：５×１０４）２４ｗｅｌｌプレートに撒き、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、５０μｌの無血清培地に３μｌのＴｒａｎｓＩＴ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。そこに４μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬を加えて穏やかに混和し、室温で５分間放置した。そこに上記で調製したｄｓＲＮＡ分解物を５００ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置し、これをＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液とした。Ｗｅｌｌ中の無血清培地を２５０μｌになるように添加したものに、ＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、０．３μｇのｐＱＢＩ２５のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
表１に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ａｃ１０由来のＲＮａｓｅＩＩＩ分解物は、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩの完全分解産物及び部分分解産物よりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００７９】
実施例６ ｄｓＲＮＡ基質を変えた場合のＲＮａｓｅＩＩＩ活性
上記実施例３−（２）で調製したＲＮａｓｅＩＩＩサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性の基質となるｄｓＲＮＡをルシフェラーゼ遺伝子より作製し評価した。実施例４−（１）と同様にｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
【００８０】
すなわち、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）に挿入されているルシフェラーゼをコードする遺伝子について、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）を鋳型とし、配列表の配列番号９記載のＴ７プロモーター配列をもったｄｓｌ−１プライマーと配列表の配列番号１０記載のｄｓｌ−２プライマーを用いてＰＣＲ（増幅断片長約５００塩基対）、前記ｄｓｌ−１プライマーと配列表の配列番号１１記載のｄｓｌ−３プライマーを用いてＰＣＲ（増幅断片長約１０００塩基対）を行い、２種類の増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応により約５００ｂｐの長さ及び約１０００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。
【００８１】
上記方法で調製したｄｓＲＮＡ５μｇ、上記実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。
以上の反応液を調製し、３０℃で、一定時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。
【００８２】
その結果、切断産物は、１時間切断しても２０塩基対よりも大きい切断断片が確認できた。また、一晩（約１８時間）切断したものでも、１時間切断したものとほぼ同様の切断パターンを示した。
以上のことから、本発明の低温性微生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドでは、鋳型を変えた場合及び基質となるｄｓＲＮＡの長さを変えた場合においても、約１０塩基対前後の低分子分解物が生じにくく、また部分分解による分解産物の調製が容易であることが確認できた。
【００８３】
実施例７ ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子の検討
（１）ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子を検討するために、常温域で核酸結合活性を有するタンパク質について検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質は入手が困難である。従って、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列を有するサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質をモデルタンパク質として用いた。当該タンパク質は、プロテイン サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の方法で調製した。
【００８４】
（２）サーモトガ マリティマ由来ＣｓｐＢのｄｓＲＮＡ分解への効果
ＣｓｐＢを添加した形でのｄｓＲＮＡ分解活性は以下のように測定した。
すなわち、ＲＮａｓｅＩＩＩを酵素として用いた場合、実施例３−（２）で調製したタンパク質サンプル（酵素液）１μｌ、上記（１）で調製したＣｓｐＢ溶液１μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ１μｇ、３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液１μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイトール］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。
ＣｓｐＢタンパク質の濃度は、それぞれ終濃度で９．２ｎｇ／μｌ、１８．４ｎｇ／μｌ、９２ｎｇ／μｌになるように添加し、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。
以上の反応液を調製し、３０℃で１時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。
【００８５】
その結果、全ての添加量においてＣｓｐＢ添加によるｄｓＲＮＡの分解の促進が確認できた。
【００８６】
実施例８ ｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡから調製したｄｓＲＮＡ分解サンプルの評価
本発明の低温性微生物由来ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて調製したｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）を用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例４−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例３−（２）記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ由来ＲＮａｓｅＩＩＩを２μｌ用いて、上記実施例４−（１）で調製したｒｓＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３０℃、１時間で切断し、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（１Ｕ／μｌ）については２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１０分（部分分解）および６０分（完全分解）で切断した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。
【００８７】
すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｄｓＲＮＡ分解物を５５．６ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を，Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ分解物溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
【００８９】
表２に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較して平均蛍光強度の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩｓｐ．ＡＣ１０によって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様にＲＮＡｉ効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のための調製に有用であることが確認できた。
【００９０】
上記実施例６で調製した細胞サンプルについてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出しｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲに供しｒｓＧＦＰのｍＲＮＡを定量する事で、ＲＮＡ干渉の評価を行った。
【００９１】
すなわち、ｓｉＲＮＡ導入後ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した細胞からｔｒｉｚｏｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出、精製した。なおこの際の作業は、添付のプロトコルに従って行った。そのトータルＲＮＡを８０ｎｇ、５×Ｍ−ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ社製）１μｌ、ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ １００ｐｍｏｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社製）２０Ｕ、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １００Ｕ、を加え、滅菌水で全量を２０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、４２℃１０分、９５℃２分の反応を行った。この反応液に２０μｌの反応希釈液（１×Ｍ−ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）を加え、これを１０μｌずつに分注した。前述の反応物１０μｌに、１０×Ｒ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、２５０ｍＭ Ｍｇ２＋ ０．３μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．７５μｌ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）１．２５Ｕ、滅菌水で３０００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、１００％ＤＭＳＯ １．２５μｌを加え、β−ａｃｔｉｎ（タカラバイオ社製）、ＧＡＰＤＨ（タカラバイオ社製）、ｒｓＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ−Ｆ：配列番号１４、ｒｓＧＦＰ−Ｒ：配列番号１５）、Ｎｅｏ（Ｎｅｏ−Ｆ：配列番号１６、Ｎｅｏ−Ｒ：配列番号１７）を検出するための合成プライマーを５ｐｍｏｌずつ加え、滅菌水で全量を２５μｌとした。前記反応液をＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｕｎｉｔ（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、１０秒で熱変性を行った後、９５℃５秒、６０℃２０秒を１サイクルとする４５サイクルの反応を行なった。得られたデータを解析することで，ヒト由来のβ−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、および導入プラスミド由来のｒｓＧＦＰ、ＮｅｏのｍＲＮＡ量を定量した。その結果を表３に示す。
【００９２】
【表３】
【００９３】
表３に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してｒｓＧＦＰのｍＲＮＡ量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様の効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００９４】
実施例９ ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡから調製したｄｓＲＮＡ分解物の評価
上記実施例３−（２）で調製したサンプルについて、ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡを基質として上記実施例８と同様の操作を行い、ｄｓＲＮＡ分解物のＲＮＡ干渉効果を評価した。ルシフェラーゼ由来ｄｓＲＮＡは、実施例６で調整した５００ｂｐのものを用いた。
【００９５】
ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例４−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例３−（２）記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩを２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３０℃、１時間で切断し、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩ（１Ｕ／μｌ）については２μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１０分（部分分解）および６０分（完全分解）で切断した。これらの切断産物をＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ １、２（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。また、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて３７℃、１０分で切断した産物については、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、２１ｂｐ近辺のバンドを切り出した。この切り出したゲル片にＴＥ ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１６時間振とうし、その溶出液からエタノール沈殿により切断産物を回収した。これをゲル回収サンプルとした。
【００９６】
ＲＮＡ干渉に関する評価は以下のように行った。すなわち、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約８０％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．５μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡを５００ｎｇ、１６６．７ｎｇ、５５．６ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を，Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたアッセイに供することで、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対する、ｄｓＲＮＡ分解物を添加した場合のＧＬ３タンパク質発現の阻害効果を測定した。そのアッセイ方法については添付の説明書に従った。その結果を表４に示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表４では、コントロール（ベクターのみ）と比較してそのＧＬ３発現量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得られるｄｓＲＮＡ分解物は、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩと同様にＲＮＡ干渉効果を示し、市販Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。またその効果は切断産物をゲル回収したものより優れていることが明らかとなった。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【００９９】
実施例１０ Ｓｈｅｗａｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩとヒト由来Ｄｉｃｅｒの比較
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩで調製したｄｓＲＮＡと、ヒト由来Ｄｉｃｅｒで調製したｄｓＲＮＡを用いて、ＲＮＡ干渉効果の比較を行った。なお実施例９記載のルシフェラーゼを用いた評価系を利用した。
【０１００】
ヒト由来Ｄｉｃｅｒとしては、市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）を用いた。また、実際の操作は上記実施例９の方法に従った。ただし、ｄｓＲＮＡ分解物導入を行う２９３細胞は、９５％コンフレントになるまでＣＯ２インキュベーター内で培養したものを用いた。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してＧＬ３ｍＲＮＡ量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＲＮａｓｅＩＩＩによって得らるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同程度のＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により反応条件によるｄｓＲＮＡ分解産物の長さの制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドが提供される。該ポリペプチドは、ＲＮＡ干渉において最適なｓｉＲＮＡを調製することができる。また、本発明の方法によりＲＮＡ干渉等において有用な、ｓｉＲＮＡの調製方法が提供される。さらに本発明の方法を簡便に実施することができる組成物ならびにキットが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ １ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５；Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ１０ ＲＮａｓｅＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｒ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｒ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｄｓｌ−３ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｅｏ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｅｏ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全分解後にＲＮＡ干渉に有効な特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する微生物由来のポリペプチド。
【請求項２】
反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
低温性微生物由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
低温性微生物がシェワネラ属微生物であることを特徴とする請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
下記から選択されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列でコードされるアミノ酸配列
【請求項８】
核酸結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡに請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを作用させる工程を包含するｄｓＲＮＡの分解方法。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡの分解物がＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能しうるｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で実施することを特徴とする請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
核酸結合活性を有するタンパク質が好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールドショックプロテインであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
コールド ショック プロテインがサーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテインＢであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３記載の方法に用いる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用組成物。
【請求項１５】
請求項９〜１３記載の方法に用いるキットであって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用キット。
【請求項１６】
下記から選択される塩基配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列において一ないしは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された塩基配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸を含む宿主細胞を培養する工程およびＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを培養液から回収する工程を包含する、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【請求項１】
完全分解後にＲＮＡ干渉に有効な特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する微生物由来のポリペプチド。
【請求項２】
反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
ｄｓＲＮＡ分解速度が、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅いことを特徴とする、反応条件の制御が容易なＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩのｄｓＲＮＡ分解速度よりも遅く反応条件の制御が容易なポリペプチドであって、約１０塩基対前後の小さいｄｓＲＮＡ分解物が生じにくい特性を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
低温性微生物由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
低温性微生物がシェワネラ属微生物であることを特徴とする請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
下記から選択されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩでｄｓＲＮＡを処理して得られた最終分解物よりも大きい特定の範囲の長さのｄｓＲＮＡ分解物を得ることができることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列でコードされるアミノ酸配列
【請求項８】
核酸結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡに請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを作用させる工程を包含するｄｓＲＮＡの分解方法。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡの分解物がＲＮＡ干渉においてｓｉＲＮＡとして機能しうるｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で実施することを特徴とする請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
核酸結合活性を有するタンパク質が好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールドショックプロテインであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
コールド ショック プロテインがサーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテインＢであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３記載の方法に用いる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用組成物。
【請求項１５】
請求項９〜１３記載の方法に用いるキットであって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解用キット。
【請求項１６】
下記から選択される塩基配列を有するＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列において一ないしは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された塩基配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸を含む宿主細胞を培養する工程およびＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを培養液から回収する工程を包含する、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９４８
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４２５４（Ｐ２００５−５１４２５４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２５５
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２５５
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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