ｓｉＲＮＡ産生用ベクター
【課題】 植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供すること。
【解決手段】 二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、標的遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入するだけで、この遺伝子に対するサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを植物体内で産生させることができるものである。
【解決手段】 二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、標的遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入するだけで、この遺伝子に対するサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを植物体内で産生させることができるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の原形質連絡（ｐｌａｓｍｏｄｅｓｍａｔａ）を経由した輸送系には、隣接する細胞間の短距離輸送と、伴細胞（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｃｅｌｌ）から篩管（ｐｈｌｏｅｍ）への原形質連絡輸送を介した長距離輸送があることが知られている。最近の研究から、植物は、長距離輸送系を使用して、遺伝子発現を抑制する分子機構の１つであるＲＮＡサイレンシングのシグナルを植物体全体にわたって伝搬させることにより、ウイルスに対する抵抗性を獲得していることが明らかになっている。また、特定の内在ｍＲＮＡが篩管を通して植物体内の離れた場所に輸送され、機能していることも明らかにされてきており、このような植物の篩管を通した遺伝子の転写物の輸送機構に関し、篩管輸送ＲＮＡ（ｐｈｔＲＮＡ：ｐｈｌｏｅｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＲＮＡ）としてジベレリンシグナル伝達系のＧＡＩ（ＧＡ−Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）遺伝子が同定されている。これらの知見を背景に、篩管を通してより多くのＲＮＡサイレンシングのシグナルを輸送するため、ＲＮＡサイレンシングに重要な役割を果たすｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）を植物体内で産生するベクターの研究開発が行われている（例えば特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
ｓｉＲＮＡは２０〜２５ｂｐの低分子ＲＮＡであり、植物体内で形成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）がダイサーによって分断されて生成し、ヘリカーゼによって一本鎖に解離したものは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成して標的のｍＲＮＡに結合し、これを切断することで遺伝子発現を抑制する。特許文献１に記載のｓｉＲＮＡ産生ベクターは、植物体内に導入された後、転写によってヘアピン型のＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）が形成されるように、ＲＮＡサイレンシングの標的遺伝子のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）構造をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。しかしながら、こうした標的遺伝子の逆方向反復塩基配列構造を有するｓｉＲＮＡ産生ベクターは、その都度、標的遺伝子ごとに多くの作業工程を経て作製しなければならず、時間と労力を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６６５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の点に鑑みてなされた本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、請求項１記載の通り、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とする。
また、請求項２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、請求項１記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおいて、ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする。
また、本発明のｓｉＲＮＡ産生方法は、請求項３記載の通り、請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させることを特徴とする。
また、本発明のｓｉＲＮＡ産生ベクターは、請求項４記載の通り、請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いたＧＳＡ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ産生ベクター（ｐｈｔｓｉＧＳＡ）の作製方法、そのｓｉＲＮＡ産生機序と機能評価の結果を示す図である。
【図２】同、ｐｈｔｓｉＧＳＡを導入して作出した形質転換タバコにおけるｐｈｔｓｉＧＳＡの機能評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とするものである。本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いれば、その都度、標的遺伝子ごとに多くの作業工程を経て逆方向反復塩基配列構造を有するｓｉＲＮＡ産生ベクターを作製する必要はなく、標的遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入するだけで、この遺伝子に対するサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを植物体内で産生させることができる。
【００１０】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおけるユニットＡは、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。ユニットＡの構築は、例えば、特許文献１などに記載のヘアピン型のＲＮＡが形成されるためのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造をプロモーターとターミネーターの間に組み込んで行えばよい（逆方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい）。また、センス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をそれぞれ別個にプロモーターとターミネーターの間に組み込んだタンデム型に構成してもよい。ユニットＡに組み込む配列は、生物由来の遺伝子の配列であってもよいし人工的に設計した配列であってもよく、その配列長は、例えば５０〜１０００ｂｐとすればよい。
【００１１】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおけるユニットＢは、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。１次ｓｉＲＮＡが結合する配列は、例えばユニットＡに組み込んだセンス鎖配列と同じであってよい。
【００１２】
ユニットＡおよびユニットＢで用いるプロモーターは、植物体内でプロモーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばＣａＭＶ３５ＳプロモーターやＧＡＳプロモーターなどを用いることができるが、篩管を通してより多くのＲＮＡサイレンシングのシグナルを輸送するためには、伴細胞でより多くのｓｉＲＮＡが産生されるのが有効であることに鑑みれば、ユニットＡおよびユニットＢで用いるプロモーターは、伴細胞で特異的に機能するプロモーターが望ましい。このようなプロモーターとしては、例えばＣｏＹＭＶ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）プロモーターなどが挙げられる。ユニットＡおよびユニットＢで用いるターミネーターは、植物体内でターミネーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばＮＯＳターミネーターなどを用いることができる。
【００１３】
なお、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、ｐＧＰＴＶ、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１２１−ｈｍなどの植物の形質転換用ベクターを用いて自体公知の遺伝子組換え技術によって作製することができる。ユニットＡとユニットＢはどちらが上流側（５’末端側）であってもよい。
【００１４】
標的遺伝子の配列（例えば配列長が５０〜１０００ｂｐのもの）を本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入すると、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写される。このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣを形成して結合すると、これを切断し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲ）によりキメラＲＮＡの切断物を鋳型にした相補鎖の合成が行われて二本鎖ＲＮＡが形成される。そして、この二本鎖ＲＮＡがダイサーによって分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生する（新たな領域由来のｓｉＲＮＡが産生されるいわゆるｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ現象：図１参照）。なお、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに標的遺伝子の配列を組み込んだｓｉＲＮＡ産生ベクターの植物体内への導入は、自体公知の方法、例えば、このｓｉＲＮＡ産生ベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株などのアグロバクテリウムに導入した後、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムをアグロインフィルトレーション法によって植物に感染させることで行うことができる（必要であれば例えばＢｕｒｏｗ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８：１２４−１３９．１９９０やＲａｔｃｈｌｉｆ，Ｆ．ＣＧ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：１２０７−１２１６．１９９９などを参照のこと）。
【００１５】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いれば、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制されることで、例えば品質の改良や病原菌に対する抵抗性の増強といった改変が可能となる遺伝子を標的遺伝子とするＲＮＡサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを産生させるためのベクターを時間と労力をかけることなく作製することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
（１）本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いたＧＳＡ遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡ産生ベクター（ｐｈｔｓｉＧＳＡ）の作製
最初に、ｐＧＰＴＶベクターのビアラフォス抵抗性遺伝子（選抜マーカー）でない遺伝子部分にユニットＡとユニットＢを挿入することで（ユニットＢが上流側）、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを作製した。ユニットＡには緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のＯＲＦ（配列長：７９２ｂｐ）の＋３８１〜４８０ｂｐの１００ｂｐのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造の間にＣＡＴ１（カタラーゼ）遺伝子由来のイントロン（配列長：２０１ｂｐ、Ｏｈｔａ，Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１：６：８０５−８１３．１９９０）をスペーサーとして連結して組み込んだ。ユニットＢにはマルチクローニングサイトとして３種類の制限酵素認識サイト（ＡｐａＬＩ，ＡｖｒＩＩ，ＸｈｏＩ）を設け、その下流にユニットＡに組み込んだＧＦＰ遺伝子のセンス鎖配列を組み込んだ。なお、ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターはいずれも伴細胞で特異的に機能するＣｏＹＭＶプロモーターを用い、ターミネーターはいずれもＮＯＳターミネーターを用いた。次に、ユニットＢのマルチクローニングサイトに標的遺伝子として植物の内生遺伝子であるクロロフィル合成経路に関与するＧＳＡ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ １−Ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ＮｔＧＳＡ２）のＯＲＦ（配位長：１４３７ｂｐ）の＋２８〜８９１ｂｐの８６４ｂｐのセンス鎖配列を組み込んで目的とするｐｈｔｓｉＧＳＡを得た（図１参照）。
【００１８】
（２）ｐｈｔｓｉＧＳＡの機能評価
（ａ）ｐｈｔｓｉＧＳＡのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株を用い、その単一コロニーをＬＢ培地（組成は表１参照）に抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ）を添加した培地に植え付け、２８℃で２４時間振盪培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、４℃にて６０００ｒｐｍで１０分間遠心し、回収した菌を滅菌水および１０％グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを１０％グリセロール１ｍＬで懸濁し、そのうちの４０μＬを（１）で作製したｐｈｔｓｉＧＳＡ０．５〜１．０μｇと混合し、混合液をキュベットに移し、２０ｋＶ／ｃｍ，６ｍｓの条件でエレクトロポレーションすることで、ｐｈｔｓｉＧＳＡをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にＬＢ培地１ｍＬを加え、１．５ｍＬチューブに回収し、２８℃で２４時間培養した。抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天培地上に培養液を塗布し、２８℃で３日間培養した。得られたコロニーを新しいＬＢ培地で培養し、アグロインフィルトレーションに用いた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
（ｂ）ｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムの植物への感染
ＬＢ培地５ｍＬに抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、ｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムを２８℃で一晩培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、室温にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように懸濁液培地（組成は表２参照）に懸濁した。明所条件下の温室にて４週間栽培したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に８Ｇの注射針で穴をあけ、０．５ｍＬ程度の菌液を注入することでアグロインフィルトレーションした。その後、注入葉および最上位葉の腋芽を残し、葉や腋芽・頂芽を剃刀刃にて切除してから、明所条件下の温室にて５日間栽培した後、注入葉からＲＮＡ抽出を行った。
【００２１】
【表２】
【００２２】
（ｃ）ＲＮＡ抽出
液体窒素を用いて注入葉を十分にすりつぶし、ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、４％のＳａｒｋｏｓｙｌ、１６ｍＭのＤＴＴ）を加えよく混和した。等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて２分間ほど混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、再び等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、１／３量の８ＭのＬｉＣｌを加え、よく混和し、氷上で一晩沈殿させた。遠心分離を行うことで得た上清に対してエタノール沈殿を行い、沈殿産物を滅菌水に溶解し、１／３量の２０％のＰＥＧ８０００／２ＭのＮａＣｌを加えて混和し、氷上で１時間静置した後、遠心分離を行い、上清を新しいチューブに移してエタノール沈殿を行い、低分子ＲＮＡを含む上清を得、ノーザンブロット分析に供するまでこの状態で−８０℃に静置した。
【００２３】
（ｄ）ノーザンブロット分析
各サンプルを遠心分離して沈殿させ、適当量の滅菌水に溶解し、１レーンあたり低分子ＲＮＡが１０μｇ相当になるように調整した。１５％アクリルアミド変性ゲルで分離した後、メンブレンに転写した。メンブレンにＲＮＡプローブ（適当な領域をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりＤＩＧをラベリング）を加えて４５℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、常温で２×ＳＳＣで２回、５５℃で２×ＳＳＣ／０．５％のＳＤＳで２回メンブレンを洗浄し、ＣＤＰ−ｓｔａｒによりＲＮＡプローブのシグナルを視覚化した。結果を図１に示す。なお、図１には、ユニットＡもユニットＢも挿入していないベクターを植物体内に導入した場合の結果（ｎ．ｃ．）、ユニットＡのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）、ユニットＢのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）、ユニットＡのみを挿入したベクターとユニットＢのみを挿入したベクターを混合して同時に植物体内に導入した場合の結果（ｓｉｌｅｎｃｅｒ＋ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）、ユニットＢに組み込んだＧＳＡ遺伝子のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列の逆方向反復塩基配列構造を組み込んでなるベクターを植物体内に導入した場合の結果（ＧＳＡ ｐ．ｃ．）をあわせて示す（１レーンあたりの低分子ＲＮＡ量はすべて１０μｇに統一）。図１から明らかなように、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いて作製したｐｈｔｓｉＧＳＡは、植物の内生遺伝子であるＧＳＡ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＳＡ）を大量に産生することがわかった。
【００２４】
（３）ｐｈｔｓｉＧＳＡの導入による形質転換タバコの作出
（２）の（ａ）で作製したｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムを、抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬｂＧ培地（組成は表３参照）２０ｍＬで２８℃で一晩培養し、継代してさらに６時間振盪培養した。その後、室温にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように共存培地（組成は表４参照）に懸濁した。この懸濁液にＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉切片を浸し、ペーパータオル上に置床して余分な菌液を取り除いた後、共存培地にｇｅｌｌａｎｇｕｍを０．３％添加して調製した固体培地上に葉切片を置床し、暗所条件下の室温にて３日間培養した。選抜薬剤（４．０ｍｇ／Ｌのビアラフォスおよび３７５ｍｇ／Ｌのオーグメンチン）を含む選抜培地（基礎となる培地の組成は表５参照）に葉切片を移植し、明所条件下の室温にて２．５〜３．５ヶ月間培養した（選抜培地は約１ヶ月ごとに更新）。カルスから得られてきたシュートは選抜薬剤を含むＭＳ培地（組成は表６参照）に移植し、ビアラフォス耐性およびＰＣＲによるｐｈｔｓｉＧＳＡ由来の塩基配列の検出により形質転換体であることを確認した。こうして得られた形質転換体は、順化し自殖によりその後代を得た後、４．０ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含むＭＳ培地に播種し、ビアラフォス耐性により形質転換体であることの確認と挿入コピー数の確認を行い、順次、各系統の世代更新を進めてホモ化を行った。その結果、Ｔ２世代のホモ個体は、葉脈に沿って葉緑素が減少しており、ｐｈｔｓｉＧＳＡの導入によってその標的遺伝子であるＧＳＡ遺伝子のサイレンシングが発動していることが確認できた（図２Ａ）。また、（２）の（ｃ）と（ｄ）と同様にして、この形質転換タバコの葉からＲＮＡ抽出を行い、低分子ＲＮＡのノーザンブロット分析を行ったところ、ｐｈｔｓｉＧＳＡのユニットＡから産生されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）とともに、ユニットＢから産生されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＳＡ）が検出できた（図２Ｂ：５．８Ｓ ｒＲＮＡは当量の低分子ＲＮＡを泳動したことを示すコントロール）。
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の原形質連絡（ｐｌａｓｍｏｄｅｓｍａｔａ）を経由した輸送系には、隣接する細胞間の短距離輸送と、伴細胞（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｃｅｌｌ）から篩管（ｐｈｌｏｅｍ）への原形質連絡輸送を介した長距離輸送があることが知られている。最近の研究から、植物は、長距離輸送系を使用して、遺伝子発現を抑制する分子機構の１つであるＲＮＡサイレンシングのシグナルを植物体全体にわたって伝搬させることにより、ウイルスに対する抵抗性を獲得していることが明らかになっている。また、特定の内在ｍＲＮＡが篩管を通して植物体内の離れた場所に輸送され、機能していることも明らかにされてきており、このような植物の篩管を通した遺伝子の転写物の輸送機構に関し、篩管輸送ＲＮＡ（ｐｈｔＲＮＡ：ｐｈｌｏｅｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＲＮＡ）としてジベレリンシグナル伝達系のＧＡＩ（ＧＡ−Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）遺伝子が同定されている。これらの知見を背景に、篩管を通してより多くのＲＮＡサイレンシングのシグナルを輸送するため、ＲＮＡサイレンシングに重要な役割を果たすｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）を植物体内で産生するベクターの研究開発が行われている（例えば特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
ｓｉＲＮＡは２０〜２５ｂｐの低分子ＲＮＡであり、植物体内で形成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）がダイサーによって分断されて生成し、ヘリカーゼによって一本鎖に解離したものは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成して標的のｍＲＮＡに結合し、これを切断することで遺伝子発現を抑制する。特許文献１に記載のｓｉＲＮＡ産生ベクターは、植物体内に導入された後、転写によってヘアピン型のＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）が形成されるように、ＲＮＡサイレンシングの標的遺伝子のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）構造をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。しかしながら、こうした標的遺伝子の逆方向反復塩基配列構造を有するｓｉＲＮＡ産生ベクターは、その都度、標的遺伝子ごとに多くの作業工程を経て作製しなければならず、時間と労力を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６６５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の点に鑑みてなされた本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、請求項１記載の通り、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とする。
また、請求項２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、請求項１記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおいて、ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする。
また、本発明のｓｉＲＮＡ産生方法は、請求項３記載の通り、請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させることを特徴とする。
また、本発明のｓｉＲＮＡ産生ベクターは、請求項４記載の通り、請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いたＧＳＡ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ産生ベクター（ｐｈｔｓｉＧＳＡ）の作製方法、そのｓｉＲＮＡ産生機序と機能評価の結果を示す図である。
【図２】同、ｐｈｔｓｉＧＳＡを導入して作出した形質転換タバコにおけるｐｈｔｓｉＧＳＡの機能評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とするものである。本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いれば、その都度、標的遺伝子ごとに多くの作業工程を経て逆方向反復塩基配列構造を有するｓｉＲＮＡ産生ベクターを作製する必要はなく、標的遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入するだけで、この遺伝子に対するサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを植物体内で産生させることができる。
【００１０】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおけるユニットＡは、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。ユニットＡの構築は、例えば、特許文献１などに記載のヘアピン型のＲＮＡが形成されるためのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造をプロモーターとターミネーターの間に組み込んで行えばよい（逆方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい）。また、センス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をそれぞれ別個にプロモーターとターミネーターの間に組み込んだタンデム型に構成してもよい。ユニットＡに組み込む配列は、生物由来の遺伝子の配列であってもよいし人工的に設計した配列であってもよく、その配列長は、例えば５０〜１０００ｂｐとすればよい。
【００１１】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターにおけるユニットＢは、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。１次ｓｉＲＮＡが結合する配列は、例えばユニットＡに組み込んだセンス鎖配列と同じであってよい。
【００１２】
ユニットＡおよびユニットＢで用いるプロモーターは、植物体内でプロモーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばＣａＭＶ３５ＳプロモーターやＧＡＳプロモーターなどを用いることができるが、篩管を通してより多くのＲＮＡサイレンシングのシグナルを輸送するためには、伴細胞でより多くのｓｉＲＮＡが産生されるのが有効であることに鑑みれば、ユニットＡおよびユニットＢで用いるプロモーターは、伴細胞で特異的に機能するプロモーターが望ましい。このようなプロモーターとしては、例えばＣｏＹＭＶ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）プロモーターなどが挙げられる。ユニットＡおよびユニットＢで用いるターミネーターは、植物体内でターミネーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばＮＯＳターミネーターなどを用いることができる。
【００１３】
なお、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターは、ｐＧＰＴＶ、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１２１−ｈｍなどの植物の形質転換用ベクターを用いて自体公知の遺伝子組換え技術によって作製することができる。ユニットＡとユニットＢはどちらが上流側（５’末端側）であってもよい。
【００１４】
標的遺伝子の配列（例えば配列長が５０〜１０００ｂｐのもの）を本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入すると、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写される。このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣを形成して結合すると、これを切断し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲ）によりキメラＲＮＡの切断物を鋳型にした相補鎖の合成が行われて二本鎖ＲＮＡが形成される。そして、この二本鎖ＲＮＡがダイサーによって分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生する（新たな領域由来のｓｉＲＮＡが産生されるいわゆるｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ現象：図１参照）。なお、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに標的遺伝子の配列を組み込んだｓｉＲＮＡ産生ベクターの植物体内への導入は、自体公知の方法、例えば、このｓｉＲＮＡ産生ベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株などのアグロバクテリウムに導入した後、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムをアグロインフィルトレーション法によって植物に感染させることで行うことができる（必要であれば例えばＢｕｒｏｗ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８：１２４−１３９．１９９０やＲａｔｃｈｌｉｆ，Ｆ．ＣＧ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：１２０７−１２１６．１９９９などを参照のこと）。
【００１５】
本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いれば、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制されることで、例えば品質の改良や病原菌に対する抵抗性の増強といった改変が可能となる遺伝子を標的遺伝子とするＲＮＡサイレンシングを発動するｓｉＲＮＡを産生させるためのベクターを時間と労力をかけることなく作製することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
（１）本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いたＧＳＡ遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡ産生ベクター（ｐｈｔｓｉＧＳＡ）の作製
最初に、ｐＧＰＴＶベクターのビアラフォス抵抗性遺伝子（選抜マーカー）でない遺伝子部分にユニットＡとユニットＢを挿入することで（ユニットＢが上流側）、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを作製した。ユニットＡには緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のＯＲＦ（配列長：７９２ｂｐ）の＋３８１〜４８０ｂｐの１００ｂｐのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造の間にＣＡＴ１（カタラーゼ）遺伝子由来のイントロン（配列長：２０１ｂｐ、Ｏｈｔａ，Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１：６：８０５−８１３．１９９０）をスペーサーとして連結して組み込んだ。ユニットＢにはマルチクローニングサイトとして３種類の制限酵素認識サイト（ＡｐａＬＩ，ＡｖｒＩＩ，ＸｈｏＩ）を設け、その下流にユニットＡに組み込んだＧＦＰ遺伝子のセンス鎖配列を組み込んだ。なお、ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターはいずれも伴細胞で特異的に機能するＣｏＹＭＶプロモーターを用い、ターミネーターはいずれもＮＯＳターミネーターを用いた。次に、ユニットＢのマルチクローニングサイトに標的遺伝子として植物の内生遺伝子であるクロロフィル合成経路に関与するＧＳＡ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ １−Ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ＮｔＧＳＡ２）のＯＲＦ（配位長：１４３７ｂｐ）の＋２８〜８９１ｂｐの８６４ｂｐのセンス鎖配列を組み込んで目的とするｐｈｔｓｉＧＳＡを得た（図１参照）。
【００１８】
（２）ｐｈｔｓｉＧＳＡの機能評価
（ａ）ｐｈｔｓｉＧＳＡのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株を用い、その単一コロニーをＬＢ培地（組成は表１参照）に抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ）を添加した培地に植え付け、２８℃で２４時間振盪培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、４℃にて６０００ｒｐｍで１０分間遠心し、回収した菌を滅菌水および１０％グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを１０％グリセロール１ｍＬで懸濁し、そのうちの４０μＬを（１）で作製したｐｈｔｓｉＧＳＡ０．５〜１．０μｇと混合し、混合液をキュベットに移し、２０ｋＶ／ｃｍ，６ｍｓの条件でエレクトロポレーションすることで、ｐｈｔｓｉＧＳＡをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にＬＢ培地１ｍＬを加え、１．５ｍＬチューブに回収し、２８℃で２４時間培養した。抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天培地上に培養液を塗布し、２８℃で３日間培養した。得られたコロニーを新しいＬＢ培地で培養し、アグロインフィルトレーションに用いた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
（ｂ）ｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムの植物への感染
ＬＢ培地５ｍＬに抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、ｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムを２８℃で一晩培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、室温にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように懸濁液培地（組成は表２参照）に懸濁した。明所条件下の温室にて４週間栽培したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に８Ｇの注射針で穴をあけ、０．５ｍＬ程度の菌液を注入することでアグロインフィルトレーションした。その後、注入葉および最上位葉の腋芽を残し、葉や腋芽・頂芽を剃刀刃にて切除してから、明所条件下の温室にて５日間栽培した後、注入葉からＲＮＡ抽出を行った。
【００２１】
【表２】
【００２２】
（ｃ）ＲＮＡ抽出
液体窒素を用いて注入葉を十分にすりつぶし、ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、４％のＳａｒｋｏｓｙｌ、１６ｍＭのＤＴＴ）を加えよく混和した。等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて２分間ほど混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、再び等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、１／３量の８ＭのＬｉＣｌを加え、よく混和し、氷上で一晩沈殿させた。遠心分離を行うことで得た上清に対してエタノール沈殿を行い、沈殿産物を滅菌水に溶解し、１／３量の２０％のＰＥＧ８０００／２ＭのＮａＣｌを加えて混和し、氷上で１時間静置した後、遠心分離を行い、上清を新しいチューブに移してエタノール沈殿を行い、低分子ＲＮＡを含む上清を得、ノーザンブロット分析に供するまでこの状態で−８０℃に静置した。
【００２３】
（ｄ）ノーザンブロット分析
各サンプルを遠心分離して沈殿させ、適当量の滅菌水に溶解し、１レーンあたり低分子ＲＮＡが１０μｇ相当になるように調整した。１５％アクリルアミド変性ゲルで分離した後、メンブレンに転写した。メンブレンにＲＮＡプローブ（適当な領域をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりＤＩＧをラベリング）を加えて４５℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、常温で２×ＳＳＣで２回、５５℃で２×ＳＳＣ／０．５％のＳＤＳで２回メンブレンを洗浄し、ＣＤＰ−ｓｔａｒによりＲＮＡプローブのシグナルを視覚化した。結果を図１に示す。なお、図１には、ユニットＡもユニットＢも挿入していないベクターを植物体内に導入した場合の結果（ｎ．ｃ．）、ユニットＡのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）、ユニットＢのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）、ユニットＡのみを挿入したベクターとユニットＢのみを挿入したベクターを混合して同時に植物体内に導入した場合の結果（ｓｉｌｅｎｃｅｒ＋ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）、ユニットＢに組み込んだＧＳＡ遺伝子のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列の逆方向反復塩基配列構造を組み込んでなるベクターを植物体内に導入した場合の結果（ＧＳＡ ｐ．ｃ．）をあわせて示す（１レーンあたりの低分子ＲＮＡ量はすべて１０μｇに統一）。図１から明らかなように、本発明のｓｉＲＮＡ産生用ベクターを用いて作製したｐｈｔｓｉＧＳＡは、植物の内生遺伝子であるＧＳＡ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＳＡ）を大量に産生することがわかった。
【００２４】
（３）ｐｈｔｓｉＧＳＡの導入による形質転換タバコの作出
（２）の（ａ）で作製したｐｈｔｓｉＧＳＡを保持するアグロバクテリウムを、抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬｂＧ培地（組成は表３参照）２０ｍＬで２８℃で一晩培養し、継代してさらに６時間振盪培養した。その後、室温にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように共存培地（組成は表４参照）に懸濁した。この懸濁液にＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉切片を浸し、ペーパータオル上に置床して余分な菌液を取り除いた後、共存培地にｇｅｌｌａｎｇｕｍを０．３％添加して調製した固体培地上に葉切片を置床し、暗所条件下の室温にて３日間培養した。選抜薬剤（４．０ｍｇ／Ｌのビアラフォスおよび３７５ｍｇ／Ｌのオーグメンチン）を含む選抜培地（基礎となる培地の組成は表５参照）に葉切片を移植し、明所条件下の室温にて２．５〜３．５ヶ月間培養した（選抜培地は約１ヶ月ごとに更新）。カルスから得られてきたシュートは選抜薬剤を含むＭＳ培地（組成は表６参照）に移植し、ビアラフォス耐性およびＰＣＲによるｐｈｔｓｉＧＳＡ由来の塩基配列の検出により形質転換体であることを確認した。こうして得られた形質転換体は、順化し自殖によりその後代を得た後、４．０ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含むＭＳ培地に播種し、ビアラフォス耐性により形質転換体であることの確認と挿入コピー数の確認を行い、順次、各系統の世代更新を進めてホモ化を行った。その結果、Ｔ２世代のホモ個体は、葉脈に沿って葉緑素が減少しており、ｐｈｔｓｉＧＳＡの導入によってその標的遺伝子であるＧＳＡ遺伝子のサイレンシングが発動していることが確認できた（図２Ａ）。また、（２）の（ｃ）と（ｄ）と同様にして、この形質転換タバコの葉からＲＮＡ抽出を行い、低分子ＲＮＡのノーザンブロット分析を行ったところ、ｐｈｔｓｉＧＳＡのユニットＡから産生されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）とともに、ユニットＢから産生されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＳＡ）が検出できた（図２Ｂ：５．８Ｓ ｒＲＮＡは当量の低分子ＲＮＡを泳動したことを示すコントロール）。
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生するｓｉＲＮＡ産生ベクターを簡便に作製することができるｓｉＲＮＡ産生用ベクターを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とするｓｉＲＮＡ産生用ベクター。
【請求項２】
ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする請求項１記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクター。
【請求項３】
請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させることを特徴とするｓｉＲＮＡ産生方法。
【請求項４】
請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とするｓｉＲＮＡ産生ベクター。
【請求項１】
植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させるためのｓｉＲＮＡ産生用ベクターであって、二本鎖ＲＮＡを形成させて１次ｓｉＲＮＡを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＡと、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと１次ｓｉＲＮＡが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットＢを少なくとも含み、目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列をユニットＢのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と１次ｓｉＲＮＡが結合する配列からなるキメラ配列からキメラＲＮＡが転写され、このキメラＲＮＡにユニットＡによって産生された１次ｓｉＲＮＡが結合し、これを切断した後、このキメラＲＮＡの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖ＲＮＡが形成され、この二本鎖ＲＮＡが分断されることで目的のｓｉＲＮＡが産生するようにしたことを特徴とするｓｉＲＮＡ産生用ベクター。
【請求項２】
ユニットＡおよびユニットＢのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする請求項１記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクター。
【請求項３】
請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のｓｉＲＮＡを産生させることを特徴とするｓｉＲＮＡ産生方法。
【請求項４】
請求項１または２記載のｓｉＲＮＡ産生用ベクターのユニットＢのマルチクローニングサイトに目的のｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とするｓｉＲＮＡ産生ベクター。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２１７７４３（Ｐ２０１１−２１７７４３Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６６１２７（Ｐ２０１１−６６１２７）
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
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