酵素的測定試薬の安定化方法
【課題】芳香族環にアルコキシ基を有する色原体の保存中の自然着色を回避し、該色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させることにより、誤差のない正確な測定を行うことができる方法を提供する。
【解決手段】芳香族環にアルコキシ基を有する色原体とペルオキシダーゼとを共存させる必要のある試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させる。
【解決手段】芳香族環にアルコキシ基を有する色原体とペルオキシダーゼとを共存させる必要のある試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的測定試薬を用いた試料中の特定成分の測定における、測定試薬の安定化方法及び色原体の自然着色回避方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの生体試料中に含まれる特定成分を測定することは、疾病の診断において大変有用なものであり、臨床検査においては酵素学的測定法が普及し、様々な測定方法が開発されている。このような方法としては、例えば、酸化酵素を用いて、特定成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより生成した過酸化水素の測定を行い、これにより生体試料中に含まれる特定成分を測定する方法を挙げることができる。
例えば、コレステロール、尿酸、及びブドウ糖等の測定に、それぞれコレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、及びグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を働かせて過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより測定し、これより各特定成分を正確に測定することができる。
【０００３】
従来、この方法に用いられる被酸化性発色試薬としては、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、又は３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等の自己発色型発色試薬、若しくはフェノール又はその誘導体あるいはアニリン誘導体等の水素供与体である色原体と、その縮合対象物として、４−アミノアンチピリン等のカップラーとを組み合わせたものが用いられてきた。
また、これらの被酸化性発色試薬のうち、自己発色型発色試薬は、長期保存により発色試薬自身が着色し、試薬ブランクの上昇が生じることが知られている。これに対して、水素供与体（色原体）とカップラーとを組み合わせた被酸化性発色試薬は、水素供与体（色原体）とカップラー（４−アミノアンチピリン等）を別々の試薬に含有させて保存することにより、保存中に色原体とカップラーとの酸化縮合反応が生じることによる発色試薬の着色を避け、試薬ブランクの上昇を抑えられることが知られている。
また、前記の色原体は、生体試料中のビリルビンやアスコルビン酸等の還元性物質の影響を受け易いことも知られている（例えば、非特許文献１参照。）。このため、還元性物質の影響を受け難い色原体として、芳香族環（ベンゼン環）に電子吸引性基であるアルコキシ基を有するアニリン誘導体（例えば、ＨＤＡＯＳ等）が広く使用されている（例えば、特許文献１参照。）
【０００４】
ところが、還元性物質の影響を受け難い色原体には、アジ化物等の成分混入により色原体の着色を生じたり（例えば、特許文献２参照。）、保存中に自然着色を生じ易いという問題があった。自然着色の問題については、芳香族環にアルキル基を有するアニリン誘導体を用いて自然着色を回避するという方法が提示されている（例えば、特許文献３参照。）。しかしながら、この方法は色原体自体を着色が生じにくい物に変えるというものであって、色原体が保存中に自然着色してしまうという問題の根本的な解決には至っていない。
このように、アニリン誘導体等の色原体には、保存中に自然着色してしまうことにより、測定に用いる波長によっては、反応吸光度に影響を与え、試料中の特定成分を正確に測定できないという問題がある。このため、この問題を解決する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１６５１９８号公報
【特許文献２】特開２０００−２８５３３号公報
【特許文献３】特開２００３−２３０４００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】臨床化学 ８巻，１号，６３〜７２頁，１９８０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体の保存中の自然着色を回避し、該色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させることにより、誤差のない正確な測定を行うことができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体の保存中の自然着色が、色原体とペルオキシダーゼが共存する事によって生じる事を初めて見出した。本来、色原体はカップラーとの結合によって、初めて可視部の波長に吸収を持つ色素を形成し発色するものであるが、本発明者による更なる検討の結果、色原体とペルオキシダーゼの共存による色原体自身の着色は、水素受容体との色素形成とは構造も色調も全く異なる物であることが分かった。
通常、この様な色原体の自然着色については、ハイドロサルファイトやＮ−アセチルシステイン等の還元剤を添加する事で抑制することができる。しかしながら、色原体（水素供与体）とカップラー（水素受容体）との色素形成が酸化反応である為、ここに還元剤を添加すると本来検出すべき酸化反応、即ち色素の形成を阻害してしまうという問題があった。
【０００９】
このため、本発明者が鋭意検討を行った結果、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体とペルオキシダーゼを共存させる必要のある試薬に、ラジカル捕捉剤であるブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等を添加することにより、ペルオキシダーゼによる色原体の着色反応を抑制することができ、かつカップラーとの色素形成を阻害することなく、酵素的測定試薬を安定化できることを見出した。これにより、色原体の自然着色の問題を解決し、該色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
（２）前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、前記（１）記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
（３）酵素的測定試薬の安定化が、色原体の自然着色を防止することによるものである、前記（１）又は（２）に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
（４）色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、色原体の自然着色の防止方法。
（５）前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、前記（４）記載の色原体の自然着色の防止方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることにより、ペルオキシダーゼと色原体が共存した場合でも、ペルオキシダーゼによる色原体の自然着色を防ぐことができるものである。そして、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明および対照試薬の開始時からの吸光度を示した図である。
【図２】本発明および対照試薬の開始時からの吸光度を示した図である。
【図３】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図４】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図５】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図６】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕 酵素的測定試薬
（１）被酸化性発色試薬
本発明において用いられる被酸化性発色試薬とは、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素を測定することにより特定成分を測定する場合に、ペルオキシダーゼの作用により過酸化水素と酸化縮合させ色素を生成させるための、色原体とカップラーの組み合わせからなる試薬のことをいう。
【００１４】
本発明において色原体とは、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、酸化縮合の反応時に水素を放出する水素供与体のことをいい、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、後記の４−アミノアンチピリン等のカップラーとともに酸化縮合し色素を生成するものをいう。本発明においては、色原体として、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しており、かつ、カップラーとの酸化縮合反応により色素を生成できるアニリン誘導体であれば、いずれのアニリン誘導体でも使用することができる。
【００１５】
なお、本発明における芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体としては、例えば、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は置換若しくは非置換のアルキル基、Ｒ５は、水素原子又はフッ素原子、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は、水素原子又は置換若しくは非置換のアルコキシ基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つの基は置換若しくは非置換のアルコキシ基を表す）で表される化合物を挙げることができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２が置換若しくは非置換のアルキル基の場合、該アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝状の炭素数が１〜５のアルキル基又は炭素数が１〜５のアミノアルキル基等を挙げることができ、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基等が挙げられる。
また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のアルコキシ基としては、例えば、直鎖又は分枝状の炭素数が１〜５のアルコキシ基を挙げることができ、より具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基等が挙げられる。
なお、置換アルキル基及び置換アルコキシル基における置換基としては、例えば、置換数１〜３の、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基、置換若しくは非置換のアミノ基、アミド基、アシル基、エステル基、カルボキシル基、シアノ基、シリル基等
を挙げることができる。
【００１８】
本発明における、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、
Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）等を挙げることができる。
【００１９】
また、色原体の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００２０】
カップラーとは、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、前記の色原体とともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
また、カップラーの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲が特に好ましい。
【００２１】
（２）酸化酵素
本発明において、酸化酵素とは、生体成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいう。
ここで、酸化酵素としては、例えば、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、又はピルビン酸オキシダーゼ等を挙げることができる。
また、本発明において、酸化酵素の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、７〜８００単位／Ｌの範囲にあることが好ましい。
【００２２】
（３）ペルオキシダーゼ
本発明において、ペルオキシダーゼとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの等を挙げることができる。
なお、このペルオキシダーゼとしては、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、２０単位／Ｌ以上であることが好ましい。
【００２３】
（４）測定における他の構成成分
本発明においては、前記の成分の他に、測定反応に使用する成分、基質、色素、公知の防腐剤、又は安定化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００２４】
（５）測定時のｐＨ
本発明において、酵素的測定試薬による測定反応液測定時のｐＨ範囲は、使用する酵素等により適宜設定すればよい。
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、若しくはＣＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
【００２５】
〔２〕 ラジカル捕捉剤
本発明は、酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする。本発明においては、このラジカル捕捉剤を酵素的測定試薬に含有させることにより、前記した色原体（芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体）とペルオキシダーゼとが共存した場合でも、ペルオキシダーゼの作用により色原体を着色させることなく、正確な測定を行うことが可能となる。
【００２６】
ここで、ラジカル捕捉剤は、ラジカルを捕捉し安定化する性質をもつものである必要がある。本発明においては、ラジカル捕捉剤として、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等を挙げることができる。
【００２７】
また、ラジカル捕捉剤の濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．００１〜１００ｍｇ／Ｌの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１０ｍｇ／ｄＬの範囲にあることがより好ましく、０．１〜１ｍｇ／ｄＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００２８】
〔３〕 酵素的測定試薬の安定化方法
本発明における酵素的測定試薬は、前記した色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する従来より公知の１試薬系又は２試薬系以上の複数試薬系のものであり、例えば、生体成分に酸化酵素を作用させて直接又は間接的に過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ並びに色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬と混合し、生成した発色物を測定する従来公知の酵素的測定試薬のことをいう。
また、本発明においては、酵素的測定試薬が、少なくとも前記した色原体とペルオキシダーゼとを、同じ試薬中に含むものである。
【００２９】
本発明の酵素的測定試薬の安定化方法は、前記した酵素的測定試薬に、前記したラジカル捕捉剤の少なくとも１種類を含有させることによって実施することができる。
更に、本発明は、前記した色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬であれば、いずれにも実施することができる。
なお、このラジカル捕捉剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００３０】
〔３〕 色原体の自然着色の防止方法
本発明における、色原体の自然着色を防止する方法は、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬において、測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることによるものである。
この前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬において、前記ラジカル捕捉剤を含有させることにより、色原体の自然着色を防止して発色試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができる。
また、本発明における色原体の自然着色を防止する方法を実施する際の試薬の構成成分等は、前記した通りである。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−１）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００３３】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
表１に記載の７種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．０（２０℃）に調整して、７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 １０ｍＭ
トライトンＸ−１００ ５．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００３４】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００３５】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、尿酸測定用第２試薬を調製した。
グッド緩衝液 １００ｍＭ
４−アミノアンチピリン １．９７ｍＭ
ウリカーゼ ８００単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
【００３６】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、３７℃にて７日間保存した。
【００３７】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存開始時及び、保存２日後、並びに７日後に、７種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、日立製作所製７１８０型自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬２００μＬずつを加え、３７℃・５分後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３８】
４．測定結果
上記３の測定結果を表１及び図１に示した。
なお、表１のカッコ内の数値は、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後の吸光度からそれぞれ、保存開始時の吸光度を差し引いた値である。すなわち、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後における、保存開始時に対する５４６ｎｍの吸光度上昇（色原体着色）の値を示したものである。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１及び図１から明らかなように、ＢＨＴを含有させていない対照・尿酸測定用第１試薬では、保存２日後で既に吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が見られており、保存７日後では更に吸光度が上昇していることが分かる。
【００４１】
これに対して、ＢＨＴを第１試薬に含有させた本発明・尿酸測定用第１試薬では、色原体の種類により程度の差はあるものの、ＢＨＴを含有させない場合に比べて、吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が抑制されていることが分かる。
【００４２】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００４３】
〔実施例２〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−２）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００４４】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）（東京化成）を含有させること以外は組成が実施例１の１の（１）の本発明・第１試薬と同じである、本発明・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００４５】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００４６】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００４７】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、３７℃にて７日間保存した。
【００４８】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存開始時及び、保存２日後、並びに７日後に、７種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、日立製作所製７１８０型自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬２００μＬずつを加え、３７℃・５分後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
４．測定結果
上記３の測定結果を表２及び図２に示した。
なお、表２のカッコ内の数値は、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後の吸光度からそれぞれ、保存開始時の吸光度を差し引いた値である。すなわち、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後における、保存開始時に対する５４６ｎｍの吸光度上昇（色原体着色）の値を示したものである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２及び図２から明らかなように、ＢＨＡを含有させていない対照・尿酸測定用第１試薬では、保存２日後で既に吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が見られており、保存７日後では更に吸光度が上昇していることが分かる。
【００５２】
これに対して、ＢＨＡを第１試薬に含有させた本発明・尿酸測定用第１試薬では、色原体の種類により程度の差はあるものの、ＢＨＡを含有させない場合に比べて、吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が抑制されていることが分かる。
【００５３】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００５４】
〔実施例３〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−３）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００５５】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
表３に記載の４種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．０（２０℃）に調整して、４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 １０ｍＭ
トライトンＸ−１００ ５．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００５６】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００５７】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００５８】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した４種類の対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００５９】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、４種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６０】
４．測定結果
上記３の測定結果を表３〜５及び図３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
表３〜５から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図３から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００６５】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００６６】
〔実施例４〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−４）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００６７】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させること以外は組成が実施例３の１の（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００６８】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００６９】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００７０】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した４種類の対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００７１】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、４種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７２】
４．測定結果
上記３の測定結果を表６〜８及び図４に示した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
表６〜８から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図４から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００７７】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００７８】
〔実施例５〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−５）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００７９】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）総コレステロール測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整し、総コレステロール測定用第１試薬を調製した。
グッド緩衝剤 ４０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ０．４４ｍＭ
エマルゲン１１０８（花王） ５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ ２００単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ケーソンＣＧ １３０ｍｇ／Ｌ
【００８０】
（２）本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製
表９に記載の３種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．５（２０℃）に調整して、３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 ２０ｍＭ
エマルゲン１１０８（花王） ５ｇ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ３３０単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １６００単位／Ｌ
ケーソンＣＧ １３０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００８１】
（３）対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（２）の本発明・第２試薬と同じである、３種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００８２】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（２）で調製した３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び上記１の（３）で調製した３種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００８３】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、３種類の本発明及び対照総コレステロール測定用第２試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８４】
４．測定結果
上記３の測定結果を表９〜１１及び図５に示した。
【００８５】
【表９】
【００８６】
【表１０】
【００８７】
【表１１】
【００８８】
表９〜１１から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図５から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００８９】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００９０】
〔実施例６〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−６）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００９１】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）総コレステロール測定用第１試薬の調製
実施例１の１の（１）の総コレステロール測定用第１試薬と同様にして、第１試薬を調製した。
【００９２】
（２）本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させること以外は組成が実施例５の１の（２）の本発明・第２試薬と同じである、３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００９３】
（３）対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第２試薬と同じである、４種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００９４】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（２）で調製した３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び上記１の（３）で調製した３種類の対照・総コレステロール測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００９５】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、３種類の本発明及び対照総コレステロール測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９６】
４．測定結果
上記３の測定結果を表１２〜１４及び図６に示した。
【００９７】
【表１２】
【００９８】
【表１３】
【００９９】
【表１４】
【０１００】
表１２〜１４から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図６から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【０１０１】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的測定試薬を用いた試料中の特定成分の測定における、測定試薬の安定化方法及び色原体の自然着色回避方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの生体試料中に含まれる特定成分を測定することは、疾病の診断において大変有用なものであり、臨床検査においては酵素学的測定法が普及し、様々な測定方法が開発されている。このような方法としては、例えば、酸化酵素を用いて、特定成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより生成した過酸化水素の測定を行い、これにより生体試料中に含まれる特定成分を測定する方法を挙げることができる。
例えば、コレステロール、尿酸、及びブドウ糖等の測定に、それぞれコレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、及びグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を働かせて過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより測定し、これより各特定成分を正確に測定することができる。
【０００３】
従来、この方法に用いられる被酸化性発色試薬としては、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、又は３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等の自己発色型発色試薬、若しくはフェノール又はその誘導体あるいはアニリン誘導体等の水素供与体である色原体と、その縮合対象物として、４−アミノアンチピリン等のカップラーとを組み合わせたものが用いられてきた。
また、これらの被酸化性発色試薬のうち、自己発色型発色試薬は、長期保存により発色試薬自身が着色し、試薬ブランクの上昇が生じることが知られている。これに対して、水素供与体（色原体）とカップラーとを組み合わせた被酸化性発色試薬は、水素供与体（色原体）とカップラー（４−アミノアンチピリン等）を別々の試薬に含有させて保存することにより、保存中に色原体とカップラーとの酸化縮合反応が生じることによる発色試薬の着色を避け、試薬ブランクの上昇を抑えられることが知られている。
また、前記の色原体は、生体試料中のビリルビンやアスコルビン酸等の還元性物質の影響を受け易いことも知られている（例えば、非特許文献１参照。）。このため、還元性物質の影響を受け難い色原体として、芳香族環（ベンゼン環）に電子吸引性基であるアルコキシ基を有するアニリン誘導体（例えば、ＨＤＡＯＳ等）が広く使用されている（例えば、特許文献１参照。）
【０００４】
ところが、還元性物質の影響を受け難い色原体には、アジ化物等の成分混入により色原体の着色を生じたり（例えば、特許文献２参照。）、保存中に自然着色を生じ易いという問題があった。自然着色の問題については、芳香族環にアルキル基を有するアニリン誘導体を用いて自然着色を回避するという方法が提示されている（例えば、特許文献３参照。）。しかしながら、この方法は色原体自体を着色が生じにくい物に変えるというものであって、色原体が保存中に自然着色してしまうという問題の根本的な解決には至っていない。
このように、アニリン誘導体等の色原体には、保存中に自然着色してしまうことにより、測定に用いる波長によっては、反応吸光度に影響を与え、試料中の特定成分を正確に測定できないという問題がある。このため、この問題を解決する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１６５１９８号公報
【特許文献２】特開２０００−２８５３３号公報
【特許文献３】特開２００３−２３０４００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】臨床化学 ８巻，１号，６３〜７２頁，１９８０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体の保存中の自然着色を回避し、該色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させることにより、誤差のない正確な測定を行うことができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体の保存中の自然着色が、色原体とペルオキシダーゼが共存する事によって生じる事を初めて見出した。本来、色原体はカップラーとの結合によって、初めて可視部の波長に吸収を持つ色素を形成し発色するものであるが、本発明者による更なる検討の結果、色原体とペルオキシダーゼの共存による色原体自身の着色は、水素受容体との色素形成とは構造も色調も全く異なる物であることが分かった。
通常、この様な色原体の自然着色については、ハイドロサルファイトやＮ−アセチルシステイン等の還元剤を添加する事で抑制することができる。しかしながら、色原体（水素供与体）とカップラー（水素受容体）との色素形成が酸化反応である為、ここに還元剤を添加すると本来検出すべき酸化反応、即ち色素の形成を阻害してしまうという問題があった。
【０００９】
このため、本発明者が鋭意検討を行った結果、芳香族環にアルコキシ基を有する色原体とペルオキシダーゼを共存させる必要のある試薬に、ラジカル捕捉剤であるブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等を添加することにより、ペルオキシダーゼによる色原体の着色反応を抑制することができ、かつカップラーとの色素形成を阻害することなく、酵素的測定試薬を安定化できることを見出した。これにより、色原体の自然着色の問題を解決し、該色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
（２）前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、前記（１）記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
（３）酵素的測定試薬の安定化が、色原体の自然着色を防止することによるものである、前記（１）又は（２）に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
（４）色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、色原体の自然着色の防止方法。
（５）前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、前記（４）記載の色原体の自然着色の防止方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることにより、ペルオキシダーゼと色原体が共存した場合でも、ペルオキシダーゼによる色原体の自然着色を防ぐことができるものである。そして、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明および対照試薬の開始時からの吸光度を示した図である。
【図２】本発明および対照試薬の開始時からの吸光度を示した図である。
【図３】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図４】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図５】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【図６】対照試薬から本発明試薬のスペクトルを差引いた差のスペクトルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕 酵素的測定試薬
（１）被酸化性発色試薬
本発明において用いられる被酸化性発色試薬とは、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素を測定することにより特定成分を測定する場合に、ペルオキシダーゼの作用により過酸化水素と酸化縮合させ色素を生成させるための、色原体とカップラーの組み合わせからなる試薬のことをいう。
【００１４】
本発明において色原体とは、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、酸化縮合の反応時に水素を放出する水素供与体のことをいい、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、後記の４−アミノアンチピリン等のカップラーとともに酸化縮合し色素を生成するものをいう。本発明においては、色原体として、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しており、かつ、カップラーとの酸化縮合反応により色素を生成できるアニリン誘導体であれば、いずれのアニリン誘導体でも使用することができる。
【００１５】
なお、本発明における芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体としては、例えば、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は置換若しくは非置換のアルキル基、Ｒ５は、水素原子又はフッ素原子、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は、水素原子又は置換若しくは非置換のアルコキシ基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つの基は置換若しくは非置換のアルコキシ基を表す）で表される化合物を挙げることができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２が置換若しくは非置換のアルキル基の場合、該アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝状の炭素数が１〜５のアルキル基又は炭素数が１〜５のアミノアルキル基等を挙げることができ、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基等が挙げられる。
また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のアルコキシ基としては、例えば、直鎖又は分枝状の炭素数が１〜５のアルコキシ基を挙げることができ、より具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基等が挙げられる。
なお、置換アルキル基及び置換アルコキシル基における置換基としては、例えば、置換数１〜３の、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基、置換若しくは非置換のアミノ基、アミド基、アシル基、エステル基、カルボキシル基、シアノ基、シリル基等
を挙げることができる。
【００１８】
本発明における、芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、
Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）等を挙げることができる。
【００１９】
また、色原体の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００２０】
カップラーとは、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、前記の色原体とともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
また、カップラーの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲が特に好ましい。
【００２１】
（２）酸化酵素
本発明において、酸化酵素とは、生体成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいう。
ここで、酸化酵素としては、例えば、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、又はピルビン酸オキシダーゼ等を挙げることができる。
また、本発明において、酸化酵素の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、７〜８００単位／Ｌの範囲にあることが好ましい。
【００２２】
（３）ペルオキシダーゼ
本発明において、ペルオキシダーゼとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの等を挙げることができる。
なお、このペルオキシダーゼとしては、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、２０単位／Ｌ以上であることが好ましい。
【００２３】
（４）測定における他の構成成分
本発明においては、前記の成分の他に、測定反応に使用する成分、基質、色素、公知の防腐剤、又は安定化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００２４】
（５）測定時のｐＨ
本発明において、酵素的測定試薬による測定反応液測定時のｐＨ範囲は、使用する酵素等により適宜設定すればよい。
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、若しくはＣＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
【００２５】
〔２〕 ラジカル捕捉剤
本発明は、酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする。本発明においては、このラジカル捕捉剤を酵素的測定試薬に含有させることにより、前記した色原体（芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体）とペルオキシダーゼとが共存した場合でも、ペルオキシダーゼの作用により色原体を着色させることなく、正確な測定を行うことが可能となる。
【００２６】
ここで、ラジカル捕捉剤は、ラジカルを捕捉し安定化する性質をもつものである必要がある。本発明においては、ラジカル捕捉剤として、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等を挙げることができる。
【００２７】
また、ラジカル捕捉剤の濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．００１〜１００ｍｇ／Ｌの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１０ｍｇ／ｄＬの範囲にあることがより好ましく、０．１〜１ｍｇ／ｄＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００２８】
〔３〕 酵素的測定試薬の安定化方法
本発明における酵素的測定試薬は、前記した色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する従来より公知の１試薬系又は２試薬系以上の複数試薬系のものであり、例えば、生体成分に酸化酵素を作用させて直接又は間接的に過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ並びに色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬と混合し、生成した発色物を測定する従来公知の酵素的測定試薬のことをいう。
また、本発明においては、酵素的測定試薬が、少なくとも前記した色原体とペルオキシダーゼとを、同じ試薬中に含むものである。
【００２９】
本発明の酵素的測定試薬の安定化方法は、前記した酵素的測定試薬に、前記したラジカル捕捉剤の少なくとも１種類を含有させることによって実施することができる。
更に、本発明は、前記した色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬であれば、いずれにも実施することができる。
なお、このラジカル捕捉剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００３０】
〔３〕 色原体の自然着色の防止方法
本発明における、色原体の自然着色を防止する方法は、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬において、測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させることによるものである。
この前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む酵素的測定試薬において、前記ラジカル捕捉剤を含有させることにより、色原体の自然着色を防止して発色試薬の保存安定性を向上させ、誤差のない正確な測定を行うことができる。
また、本発明における色原体の自然着色を防止する方法を実施する際の試薬の構成成分等は、前記した通りである。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−１）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００３３】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
表１に記載の７種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．０（２０℃）に調整して、７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 １０ｍＭ
トライトンＸ−１００ ５．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００３４】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００３５】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、尿酸測定用第２試薬を調製した。
グッド緩衝液 １００ｍＭ
４−アミノアンチピリン １．９７ｍＭ
ウリカーゼ ８００単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
【００３６】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、３７℃にて７日間保存した。
【００３７】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存開始時及び、保存２日後、並びに７日後に、７種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、日立製作所製７１８０型自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬２００μＬずつを加え、３７℃・５分後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３８】
４．測定結果
上記３の測定結果を表１及び図１に示した。
なお、表１のカッコ内の数値は、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後の吸光度からそれぞれ、保存開始時の吸光度を差し引いた値である。すなわち、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後における、保存開始時に対する５４６ｎｍの吸光度上昇（色原体着色）の値を示したものである。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１及び図１から明らかなように、ＢＨＴを含有させていない対照・尿酸測定用第１試薬では、保存２日後で既に吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が見られており、保存７日後では更に吸光度が上昇していることが分かる。
【００４１】
これに対して、ＢＨＴを第１試薬に含有させた本発明・尿酸測定用第１試薬では、色原体の種類により程度の差はあるものの、ＢＨＴを含有させない場合に比べて、吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が抑制されていることが分かる。
【００４２】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００４３】
〔実施例２〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−２）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００４４】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）（東京化成）を含有させること以外は組成が実施例１の１の（１）の本発明・第１試薬と同じである、本発明・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００４５】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００４６】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００４７】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した７種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、３７℃にて７日間保存した。
【００４８】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存開始時及び、保存２日後、並びに７日後に、７種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、日立製作所製７１８０型自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬２００μＬずつを加え、３７℃・５分後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
４．測定結果
上記３の測定結果を表２及び図２に示した。
なお、表２のカッコ内の数値は、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後の吸光度からそれぞれ、保存開始時の吸光度を差し引いた値である。すなわち、本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の保存２日後及び７日後における、保存開始時に対する５４６ｎｍの吸光度上昇（色原体着色）の値を示したものである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２及び図２から明らかなように、ＢＨＡを含有させていない対照・尿酸測定用第１試薬では、保存２日後で既に吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が見られており、保存７日後では更に吸光度が上昇していることが分かる。
【００５２】
これに対して、ＢＨＡを第１試薬に含有させた本発明・尿酸測定用第１試薬では、色原体の種類により程度の差はあるものの、ＢＨＡを含有させない場合に比べて、吸光度の上昇、すなわち色原体の着色が抑制されていることが分かる。
【００５３】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００５４】
〔実施例３〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−３）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００５５】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
表３に記載の４種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．０（２０℃）に調整して、４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 １０ｍＭ
トライトンＸ−１００ ５．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ゲンタマイシン硫酸塩 １０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００５６】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００５７】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００５８】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した４種類の対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００５９】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、４種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６０】
４．測定結果
上記３の測定結果を表３〜５及び図３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
表３〜５から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図３から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００６５】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００６６】
〔実施例４〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−４）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００６７】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させること以外は組成が実施例３の１の（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００６８】
（２）対照・尿酸測定用第１試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、４種類の対照・尿酸測定用第１試薬を調製した。
【００６９】
（３）尿酸測定用第２試薬の調製
実施例１の１の（３）の尿酸測定用第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。
【００７０】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（１）で調製した４種類の本発明・尿酸測定用第１試薬及び上記１の（２）で調製した４種類の対照・尿酸測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００７１】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、４種類の本発明及び対照尿酸測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７２】
４．測定結果
上記３の測定結果を表６〜８及び図４に示した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
表６〜８から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の尿酸測定用第１試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図４から明らかなように、対照の尿酸測定用第１試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００７７】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００７８】
〔実施例５〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−５）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００７９】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）総コレステロール測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整し、総コレステロール測定用第１試薬を調製した。
グッド緩衝剤 ４０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ０．４４ｍＭ
エマルゲン１１０８（花王） ５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ ２００単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ
ケーソンＣＧ １３０ｍｇ／Ｌ
【００８０】
（２）本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製
表９に記載の３種類の色原体をそれぞれ１．０ｍＭと、下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．５（２０℃）に調整して、３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液 ２０ｍＭ
エマルゲン１１０８（花王） ５ｇ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ３３０単位／Ｌ
ペルオキシダーゼ １６００単位／Ｌ
ケーソンＣＧ １３０ｍｇ／Ｌ
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−
メチルフェノール（ＢＨＴ）（東京化成） １．０ｍｇ／Ｌ
【００８１】
（３）対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を含有させないこと以外は組成が上記（２）の本発明・第２試薬と同じである、３種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００８２】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（２）で調製した３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び上記１の（３）で調製した３種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００８３】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、３種類の本発明及び対照総コレステロール測定用第２試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８４】
４．測定結果
上記３の測定結果を表９〜１１及び図５に示した。
【００８５】
【表９】
【００８６】
【表１０】
【００８７】
【表１１】
【００８８】
表９〜１１から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図５から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【００８９】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【００９０】
〔実施例６〕
（本発明による試薬保存中における色原体の着色抑制効果の確認−６）
芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）とペルオキシダーゼが共存する酵素的測定試薬にラジカル捕捉剤を含有させた場合の色原体の着色抑制効果を確認した。
【００９１】
１．酵素的測定試薬の調製
（１）総コレステロール測定用第１試薬の調製
実施例１の１の（１）の総コレステロール測定用第１試薬と同様にして、第１試薬を調製した。
【００９２】
（２）本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）の代わりに１．０ｍｇ／Ｌの２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させること以外は組成が実施例５の１の（２）の本発明・第２試薬と同じである、３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００９３】
（３）対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール（ＢＨＡ）を含有させないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第２試薬と同じである、４種類の対照・総コレステロール測定用第２試薬を調製した。
【００９４】
２．安定性検討のための試薬の保存
上記１の（２）で調製した３種類の本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び上記１の（３）で調製した３種類の対照・総コレステロール測定用第１試薬をそれぞれ密栓し、５℃にて保存した。
【００９５】
３．保存した試薬の安定性の確認
保存９０日後に、３種類の本発明及び対照総コレステロール測定用第１試薬の各々が着色しているか否かを各試薬の吸光度測定により確認した。
各試薬の吸光度測定は、東芝メディカルシステムズ製ＴＢＡ−１２０ＦＲ自動分析装置を用いて行った。精製水３．３μＬに各第１試薬１６０μＬずつを加え、３７℃５分後の３４０ｎｍ、３８０ｎｍ、４０４ｎｍ、４１６ｎｍ、４５０ｎｍ、４７６ｎｍ、５００ｎｍ、５２４ｎｍ、５４８ｎｍ、５７２ｎｍ、６０４ｎｍ、６２８ｎｍ、６６０ｎｍ、７００ｎｍ、７４８ｎｍ、８０４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９６】
４．測定結果
上記３の測定結果を表１２〜１４及び図６に示した。
【００９７】
【表１２】
【００９８】
【表１３】
【００９９】
【表１４】
【０１００】
表１２〜１４から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後の吸光度がどの波長においても上昇、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。これに対して、本発明の総コレステロール測定用第２試薬では、保存９０日後においても、ほとんど吸光度の上昇が見られていないことが分かる。特に酵素的測定試薬における発色試薬の検出波長として一般に用いられている４００〜６００ｎｍにおける吸光度上昇、即ち着色が生じていないことが分かる。
また、図６から明らかなように、対照の総コレステロール測定用第２試薬では本発明試薬の吸収スペクトル差引き後のスペクトルにおいて、可視部の吸収が増大、すなわち色原体の着色が生じていることが分かる。
【０１０１】
これらの結果から、ペルオキシダーゼと芳香族環の２位、３位、５位又は６位の少なくとも一つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体（色原体）が共存する酵素的測定試薬に、ラジカル捕捉剤を含有させることにより、試薬保存中に色原体が自然着色するのを抑えることができ、前記色原体を発色試薬として用いる酵素的測定試薬の保存安定性を向上できることが確かめられた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項２】
前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、請求項１記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項３】
酵素的測定試薬の安定化が、色原体の自然着色を防止することによるものである、請求項１又は２に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項４】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、色原体の自然着色の防止方法。
【請求項５】
前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、請求項４記載の色原体の自然着色の防止方法。
【請求項１】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項２】
前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、請求項１記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項３】
酵素的測定試薬の安定化が、色原体の自然着色を防止することによるものである、請求項１又は２に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項４】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを含有する酵素的測定試薬であって、前記色原体が、芳香族環の２位、３位、５位又は６位のうち少なくとも１つにアルコキシ基が結合しているアニリン誘導体であり、少なくとも前記色原体とペルオキシダーゼとを同時に含む測定試薬において、ラジカル捕捉剤を含有させることを特徴とする、色原体の自然着色の防止方法。
【請求項５】
前記ラジカル捕捉剤が、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールである、請求項４記載の色原体の自然着色の防止方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−７４８５９（Ｐ２０１３−７４８５９Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１７９４５（Ｐ２０１１−２１７９４５）
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
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