がんの再発リスクの判定方法
【課題】がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞で発現している膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいてがんの再発リスクを判定することができる方法を提供する。
【解決手段】腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定する。膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる。
【解決手段】腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定する。膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの再発リスクの判定方法に関する。より詳しくは、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞の分子を分析し、その分析結果に基づいてがんの再発リスクを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、臨床において、がんの再発リスクを様々なパラメータに基づいて判定することが行われている。例えば、非特許文献１では、早期乳がんの再発リスクを、チロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体の一種であるＨＥＲ２の発現量に基づいて判定することが提案されている。また、特許文献１では、サイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比に基づいてがんの再発リスクを判定する方法が提案されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１１６２４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｏｅｎｓｕｕ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．９， ２００３， ９２３−９３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臨床におけるがんの再発リスクの判定は、術後の治療方針等に影響するものであるため、正確且つ安定に行われる必要があり、このため、上記パラメータ以外の、細胞のがん化等に関係するパラメータを用いてがんの再発リスクを判定することが検討されている。
【０００５】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞で発現している膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいてがんの再発リスクを判定することができる方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法である。
本発明者らは、細胞増殖に関わる膜貫通タンパク質であって、その発現や活性の異常ががんの原因になることが知られているチロシンキナーゼについて研究を重ねた結果、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値という、今までとは違う新しいパラメータを用いれば、がんの再発リスクを判定することができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
上記判定が、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較し、前記活性値が閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが低いと判定するものであってもよい。
【０００８】
上記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる。
【０００９】
上記試料調製工程は、前記腫瘍組織中の細胞を緩衝液中で破砕し、破砕された細胞と界面活性剤を含む溶液とを混合し、得られた混合液の上清を採取することにより膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製するものであってもよい。
上記試料調製工程において、界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００１０】
上記膜貫通型チロシンキナーゼは、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）及び血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）を含むことができる。
【００１１】
上記基質は、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い複数種類の基質の混合物、又は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質であることが好ましく、ユニバーサル基質が、グルタミン酸残基及びチロシン残基を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含むことがさらに好ましい。
【００１２】
上記判定方法は、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータとに基づいて、がんの再発リスクを判定することができる。
【００１３】
上記判定は、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、前記ＣＤＫのパラメータと第二の閾値とを比較し、前記活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、前記ＣＤＫのパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定することができる。
【００１４】
上記ＣＤＫのパラメータは、前記腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに前記腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、前記第一ＣＤＫ比活性と前記第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）であることができる。
【００１５】
上記ＣＤＫ比活性比は、前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、前記第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、前記比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られ、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値及び前記ＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、腫瘍細胞に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を反映した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値という新しいパラメータを用いることにより、がんの再発リスクを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の第１の実施形態の判定方法は、腫瘍細胞に存在する膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法である。
【００１８】
上記判定方法が適用されるがんは、造血器由来の悪性腫瘍、上皮細胞由来の癌腫、肉腫等である。造血器由来の悪性腫瘍としては、白血病、悪性リンパ腫等を例示することができる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がん等を例示することができる。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫等を例示することができる。
【００１９】
判定に用いられる細胞は、がん患者から採取された腫瘍組織に含まれる細胞であればよい。判定に用いられる細胞は、初期がん、早期がん又は進行がんの腫瘍組織中の細胞のいずれでもよい。例えば、乳がんの場合、好ましくは、ステージ分類において「ステージＩ」〜「ステージＩＩＩＡ」の悪性腫瘍の細胞である。本発明は、早期がんだけでなく、進行がんの再発リスクを判定することができることが１つの大きな特徴である。
ステージ分類とは悪性腫瘍の悪性度を示す分類である。例えば乳がんの場合、悪性度の低い順にステージＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶに分類される。このステージ分類は、ＴＮＭ分類に基づいている。ＴＮＭ分類とは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）による悪性腫瘍の病期分類である。「Ｔ」は原発腫瘍の規模を示し、Ｔ０（原発巣が確認できない）〜Ｔ４（腫瘤が対外へ露出）に分けられる。「Ｎ」は近傍リンパ節への浸潤度合いを示し、Ｎ０（リンパ節転移なし）〜Ｎ３（体の正中に近いところにあるリンパ節（胸骨傍リンパ節）に転移が疑われる）に分けられる。「Ｍ」は遠隔転移の有無を表し、Ｍ０（遠隔転移なし）及びＭ１（遠隔転移あり）に分けられる。
【００２０】
腫瘍組織は、例えば、手術により摘出された腫瘍組織、生検により採取された腫瘍組織などが挙げられる。
【００２１】
上記判定方法により、がんの再発リスク（再発のしやすさ）を判定することができる。
再発とは、生体から腫瘍を摘出して一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合、及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能等に左右される。
【００２２】
膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、腫瘍細胞の細胞膜に存在する様々な膜貫通型チロシンキナーゼを、単離・精製することなく、包括的に測定した活性値である。この包括的な活性値は、例えば、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い各基質の混合物又は様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質を用いることにより測定することができる。
このようにして得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、腫瘍細胞の細胞膜に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を反映したものである。ゆえに、腫瘍細胞を使用して膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定することにより、得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することが可能になる。そして、このようにして得られたがんの再発リスクの判定結果は、がんの術後の治療方針等を検討する上で非常に有用な情報となる。
【００２３】
膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞膜に存在する膜貫通型のチロシンキナーゼのことであって、細胞の増殖、細胞の生存、細胞の分化や血管新生等において重要な役割を果たしている。例えば、膜貫通型チロシンキナーゼには細胞のがん化に関わるものが多く、その発現量の異常や酵素活性の異常が細胞のがん化を引き起こすことが知られている。細胞膜に存在するチロシンキナーゼであれば特に限定されない。具体的には、例えば、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）等の増殖因子受容体が挙げられる。なお、ＨＥＲファミリーは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を含む。
【００２４】
膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞の細胞膜から回収される。細胞は、生体から採取された生体試料に含まれる細胞であってもよいし、生体から採取された細胞を株化した培養細胞であってもよい。具体的には、細胞として腫瘍細胞を使用することができる。そして、腫瘍細胞は、がん患者から採取された生体試料（腫瘍組織）に含まれる腫瘍細胞であってもよいし、がん患者から採取された腫瘍細胞を株化した培養細胞であってもよい。
【００２５】
膜貫通型チロシンキナーゼを回収する方法は、細胞から細胞質を分離して様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製するような方法であれば特に限定されない。例えば、以下の方法により膜貫通型チロシンキナーゼを回収することができる。まず、細胞の細胞膜を適当な緩衝液（以下、ホモジナイズ試薬とする）中で破砕し、遠心分離によって上清と沈殿物とを分離して上清を除去する。この上清には、細胞質由来のタンパク質等が含まれており、沈殿物には種々の膜貫通型チロシンキナーゼを保持した細胞膜の断片が含まれている。この沈殿物と、界面活性剤を含む溶液（以下、可溶化処理液とする）とを混合し、遠心分離によって上清と沈殿物とを分離する。上清には界面活性剤によりミセル化した、種々の膜貫通型チロシンキナーゼを含む細胞膜が含有されており、沈殿物には不溶性タンパク質及びＤＮＡ等が含有されている。そして、この上清を、膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料とする。このようにして調製された試料中では、断片化された細胞膜に種々の膜貫通型チロシンキナーゼが貫通した状態で、その細胞膜が界面活性剤によりミセル化されている。
【００２６】
なお、膜貫通型チロシンキナーゼは、リガンドが結合することによってホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することが知られている。上述した方法により調製された試料には、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成可能な程度に立体構造を保持した状態で膜貫通型チロシンキナーゼが含まれている。したがって、上述した方法により調製された試料を用いることにより、より正確に、腫瘍の再発リスク（すなわち、がんの再発リスク）を判定することが可能になる。
【００２７】
ホモジナイズ試薬は、細胞を破砕する際に、膜貫通型チロシンキナーゼが変性するのを防ぐために用いられる。ｐＨとしては、膜貫通型チロシンキナーゼを変性させたり失活させたりすることなく、安定した状態で回収できる範囲であれば特に限定されず、好ましくは４．０〜９．０、より好ましくは４．５〜８．５、さらに好ましくは５．０〜８．０である。
ホモジナイズ試薬は、緩衝剤を含むことが好ましい。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホチノプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ〔２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸〕、Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕、トリシン〔Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〕等が挙げられる。
可溶化処理液も、上記のような緩衝剤を含み、ホモジナイズ試薬と同程度のｐＨであることが好ましい。なお、ホモジナイズ試薬及び／又は可溶化処理液に、プロテアーゼインヒビター、脱リン酸化酵素阻害剤、ＳＨ基の酸化を防ぐための試薬（以下、ＳＨ基安定剤とする）等を添加して用いてもよい。
【００２８】
細胞膜の破砕の方法としては、細胞膜を断片化することができれば特に限定されない。例えば、ピペットによる吸引排出、ボルテックスミキサーによる攪拌、ブレンダーによる破砕、ペッスルによる加圧、超音波処理装置による超音波処理等が挙げられる。
【００２９】
可溶化処理液に含まれる界面活性剤は、断片化した細胞膜を可溶化（ミセル化）するために用いることができる。ただし、細胞膜に含まれる膜貫通型チロシンキナーゼを分解したり変性したりしないものを用いることが好ましい。電荷を有する界面活性剤は、膜貫通型チロシンキナーゼに結合して立体構造を変化させる可能性があるため、膜貫通型チロシンキナーゼに実質的に結合しない非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルエーテル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル等を基本構造として有するものが挙げられる。具体的には、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０、Ｓｈｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄの登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、トゥイーン（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｂｒｉｊ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｅｍｕｌｇｅｎ（花王株式会社の登録商標）等が挙げられる。可溶化処理液中の界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜３％、さらに好ましくは０．１〜１％である。
【００３０】
プロテアーゼインヒビターは、膜貫通型チロシンキナーゼが、細胞に含まれるプロテアーゼによって分解されることを防ぐために用いることができる。プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のメタロプロテアーゼインヒビター、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼインヒビター、ヨードアセトアミド、Ｅ−６４等のシステインプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。これらのプロテアーゼインヒビターは単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。また、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）のような、あらかじめ複数のプロテアーゼインヒビターが混合された市販品を用いることもできる。
【００３１】
脱リン酸化酵素阻害剤は、膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性が、細胞内に含まれる脱リン酸化酵素によって低下させられることを防ぐために用いることができる。脱リン酸化酵素阻害剤としては、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、オカダ酸等が挙げられる。脱リン酸化酵素阻害剤は、単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
【００３２】
ＳＨ基安定剤は、膜貫通型チロシンキナーゼの失活を防ぐために用いることができる。酵素に含まれるＳＨ基は、酸化されてより安定なジスルフィドを形成しやすい。ジスルフィドの形成は、酵素の構造を変化させるため、酵素の失活の原因となることがある。ＳＨ基の酸化は、ＳＨ基を含有する試薬によって防ぐことができる。ＳＨ基安定剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、システイン、ホモシステイン、補酵素Ａ、ジヒドロリポ酸等が挙げられる。ホモジナイズ試薬及び／又は可溶化処理液中のＳＨ基安定剤の濃度は、ＳＨ基安定剤としてＤＴＴを用いる場合には、好ましくは０．０５〜２ｍＭ、より好ましくは０．０７〜１．７ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１．５ｍＭである。ＳＨ基安定剤として２−メルカプトエタノールを用いる場合には、好ましくは０．１〜１５ｍＭ、より好ましくは０．３〜１３ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１２ｍＭである。
【００３３】
本実施形態では、細胞から細胞質を分離して複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製し、この試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定する。
この膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定するために、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質を利用する。具体的には、試料に含まれる膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させる。この接触によって、試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により基質をリン酸化する。そして、リン酸化された基質を検出し、得られた検出結果に基づいて膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定することができる。好ましくは、膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料と、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質と、リン酸基供与体と、を混合して接触させ、チロシンキナーゼ活性によりリン酸化された基質を検出する。膜貫通型チロシンキナーゼは、自己リン酸化により活性化され、それにより基質をリン酸化してシグナルを伝える。しかしながら、自己リン酸化されていても、基質をリン酸化するとは限らない。ゆえに、基質のリン酸化を検出する方が、より正確に活性値を測定することができる。
【００３４】
上述した少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質としては、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い各基質の混合物を使用することができる。この混合物は、膜貫通型チロシンキナーゼに対する特異性が異なる複数種類の基質を含む。特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い基質としては、例えば、ＨＥＲ１に対して特異性の高い基質であるＧｒｂ２、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ヒストンＨ２Ｂ（ＨＨ２Ｂ）、ホスホリパーゼＣ ガンマ等を用いることができる。また、ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（スタラタジーン社）のような市販の基質をＨＥＲ１に対して特異性の高い基質として用いることもできる。ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ストラタジーン社）のような市販の基質をＨＥＲ１に対して特異性の高い基質として用いることもできる。ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＧＳＴと、ＨＥＲ１の酵素活性によってリン酸化されるよう人為的に作製された基質との融合タンパク質である。測定において異なる基質の混合物を使用することにより、試料中の種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが可能になる。
【００３５】
また、上述した少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質としては、複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質を使用することができる。例えば、ユニバーサル基質は、各膜貫通型チロシンキナーゼに対する共通の基質である。ユニバーサル基質は、第１の膜貫通型チロシンキナーゼ、第１膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第２の膜貫通型チロシンキナーゼ、第１及び第２膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第３の膜貫通型チロシンキナーゼ、並びに第１、第２及び第３膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第４の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されうる。言い換えると、ユニバーサル基質は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されうる。そのような基質としては、膜貫通型チロシンキナーゼの種類に関わらず、チロシンキナーゼによりリン酸化されるように人為的に作製された、公知の合成ペプチドが挙げられる。例えば、Ｎｏｒｉｏ Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２６０， Ｎｏ．１７， ９７９３−９８０４、 Ｓｅｒｇｅｉ Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ ２５９， Ｎｏ．４， ２０５１−２０５４、及びＭ． Ａｄｂｅｌ−Ｇｈａｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．８７， ７０６１−７０６５等の文献において、チロシンキナーゼの基質として使用されている合成ペプチドが挙げられる。これらの文献に開示されている合成ペプチドは、グルタミン酸（以下、Ｇｌｕと省略する）及びチロシン残基（以下、Ｔｙｒと省略する）を含むアミノ酸配列からなり、Ｔｙｒが２種類以上のチロシンキナーゼによりリン酸化され得るよう人為的に作製された合成ペプチドである。上記アミノ酸配列としては、具体的には、４つのＧｌｕと１つのＴｙｒとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ａとする）、１つのＧｌｕと１つのＴｙｒとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｂとする）、６つのＧｌｕと１つのＴｙｒと３つのアラニン残基（以下、Ａｌａと省略する）とからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｃとする）、１つのＧｌｕと１つのＴｙｒと１つのＡｌａとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｄとする）、２つのＧｌｕと１つのＴｙｒと６つのＡｌａと５つのリジン残基（以下、Ｌｙｓと省略する）とからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｅとする）等が例示できる。なお、Ｔｏｎｙ Ｈｕｎｔｅｒ， １９８２， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２５７， Ｎｏ．９， ４８４３−４８４８の文献において、チロシンキナーゼによるＴｙｒのリン酸化には酸性アミノ酸残基が重要であるという報告があり、これより、特に、酸性のアミノ酸残基であるＧｌｕを多く含有するアミノ酸配列ａやアミノ酸配列ｃが好ましい。測定においてこのような基質を使用することにより、試料中に含まれる種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが可能になる。
【００３６】
なお、より正確にがんの再発リスクを評価するためには、できるだけ多くの種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を含む膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが好ましい。ゆえに、上述したユニバーサル基質を使用することが好ましい。
【００３７】
膜貫通型チロシンキナーゼが触媒する酵素反応では、自己リン酸化により活性化した膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性により、リン酸基供与体のリン酸化基が基質に取り込まれる。ここで、リン酸基供与体としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）、３２Ｐ標識したアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）等が挙げられる。
【００３８】
上記基質は、アフィニティータグを有することが好ましい。アフィニティータグと、アフィニティータグと結合可能な結合物質を有する固相（以下、結合物質付固相とする）を用いて、基質を回収することができる。具体的には、アフィニティータグを有する基質と、結合物質付固相とが結合した複合体を回収し、回収した複合体におけるアフィニティータグと、結合物質付固相が有する結合物質との結合を解離させることにより、基質を回収することができる。
【００３９】
アフィニティータグは、結合物質に結合可能であり、基質の膜貫通型チロシンキナーゼへの結合や基質のリン酸化を妨害しない物質であれば特に限定されない。アフィニティータグとしては、例えば、ポリペプチド、ハプテン等を用いることができる。具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとする）、ヒスチジン、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ社）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等を用いることができる。
【００４０】
アフィニティータグを有する基質としては、例えば、基質とアフィニティータグとの融合タンパク質を用いることができる。融合タンパク質としては、アフィニティータグと基質とを結合させたものを用いてもよいし、アフィニティータグと基質との融合タンパク質を発現する組換え遺伝子を有するベクターを宿主に導入し、宿主が産生した融合タンパク質を回収して用いてもよい。
【００４１】
結合物質は、アフィニティータグと解離可能に結合できるものであれば特に限定されない。結合物質としては、例えば、グルタチオン、ニッケル、アミロース、ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）、Ｍｙｃ抗体、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ社）等が挙げられる。
【００４２】
固相は、結合物質と結合可能である担体であれば特に限定されない。固相の材質としては、例えば、多糖類、プラスチック、ガラス等が挙げられる。固相の形状としては、例えば、ビーズ、ゲル等が挙げられる。固相の具体例としては、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、ガラスビーズ、シリコーンゲル等が挙げられる。また、上述したビーズやゲルをカラムに充填して用いることもできる。
【００４３】
アフィニティータグと結合物質付固相との組み合わせとしては、以下のような例が挙げられる。
アフィニティータグとしてＧＳＴを選択した場合、結合物質付固相は、例えばグルタチオンセファロースビーズ（以下、グルタチオンビーズとする）を用いることができる。膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性によってリン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させる。これを回収し、還元型グルタチオンを添加すると、ＧＳＴとグルタチオンビーズとの結合を解離させることができる。これにより、リン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅを回収することができる。リン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅを回収する際には、あらかじめＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させてから酵素反応に用いてもよいし、酵素反応後にＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させてもよい。
また、アフィニティータグとしてヒスチジンを選択した場合、結合物質付固相は、例えばニッケルアガロースビーズを用いることができる。ヒスチジンとニッケルとの結合は、例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ等の酸や、イミダゾールを用いて解離することができる。
アフィニティータグとしてマルトース結合タンパク質を選択した場合。結合物質付固相は、例えばアミロース磁性ビーズを用いることができる。マルトース結合タンパク質とアミロースとの結合は、例えば、遊離のアミロースを添加することにより解離させることができる。
アフィニティータグとしてＦＬＡＧペプチドを選択した場合、結合物質付固相は、シグマ社のＦＬＡＧアフィニティーゲルを用いることができる。ＦＬＡＧペプチドとＦＬＡＧアフィニティーゲルとの結合は、例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ等の酸や、３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）を用いて解離させることができる。
アフィニティータグとしてＭｙｃタグを選択した場合、結合物質付固相は、例えばＭｙｃ抗体を結合したアガロースビーズを用いることができる。また、アフィニティータグとしてＨＡタグを選択した場合、結合物質付固相は、ＨＡ抗体を結合したアガロースビーズを用いることができる。ＭｙｃタグとＭｙｃ抗体との結合、ＨＡタグとＨＡ抗体との結合はどちらも、例えば、酸やアルカリを加えてタンパク質を変性させることにより、解離させることができる。この時、変性したタンパク質を元の状態に戻すことのできる酸又はアルカリを選択することが好ましい。具体的には、例えば、酸では塩酸等、アルカリでは水酸化ナトリウム等が挙げられる。
アフィニティータグとしてＳｔｒｅｐタグを選択した場合、結合物質付固相としてはＩＢＡ ＧｍｂＨ社のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ固相化ゲルカラムを用いることができる。ＳｔｒｅｐタグとＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎとの結合は、例えば、ストレプトアビジンと可逆的に反応するデスチオビオチンを用いて解離させることができる。
【００４４】
試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと基質とを酵素反応させた後、基質を回収する前に、加熱処理、冷却処理、又はＥＤＴＡ等を用いて酵素反応を停止させてもよい。基質の回収工程において、さらに酵素反応が進んでしまうことがあり、試料ごとに測定結果にバラつきを生じさせる原因となる可能性があるが、酵素反応を停止させることにより、これを回避することができる。
【００４５】
リン酸化された基質を検出するため、標識物質を用いる。標識物質としては、例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素等が挙げられるが、これに限定されない。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミン等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等が挙げられる。
【００４６】
リン酸化された基質を検出するため、リン酸化された基質に標識物質を結合させる。例えば、標識物質を有し且つリン酸化された基質に特異的に結合可能な抗体を用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。
あるいは、リン酸化された基質に特異的に結合可能な抗体（以下、リン酸化基質認識抗体とする）と、リン酸化基質認識抗体に結合可能な抗体（以下、二次抗体とする）であって且つ標識物質を有する抗体を用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。この場合、リン酸化基質認識抗体と二次抗体とを介して、標識物質をリン酸化された基質に実質的に結合させることができる。
あるいは、リン酸化基質認識抗体と、ビオチンを有する二次抗体と、標識物質を有するアビジンとを用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。この場合、リン酸化基質認識抗体と二次抗体とビオチンとアビジンとを介して、標識物質をリン酸化された基質に実質的に結合させることができる。なお、二次抗体がアビジンを有し、ビオチンが標識物質を有していてもよい。
あるいは、ビオチンを有するリン酸化基質認識抗体と、標識物質を有するアビジンとを用いてもよいし、アビジンを有するリン酸化基質認識抗体と、標識物質を有するビオチンとを用いてもよい。
標識物質が発するシグナルを検出することにより、リン酸化された基質を検出することができ、これにより膜貫通型チロシンキナーゼの活性を測定することができる。
【００４７】
上述したリン酸化基質認識抗体及び二次抗体は、動物に抗原を接触させて免疫を促し、この動物の血液を精製して得られた抗体、遺伝子組換えによって得られた抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いることができる。また、これらの抗体のうち少なくとも２種類を混合したものを用いることもできる。ここでいう抗体とは、抗体のフラグメント及びその誘導体も含む。具体例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ｓＦｖフラグメント等（Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５９：５８２１−５８３３及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６）が挙げられる。抗体のクラスはＩｇＧ、ＩｇＭ等を用いることができるが、これに限定されない。
【００４８】
リン酸化された基質の検出方法は、標識物質の種類により適宜選択される。標識物質が蛍光物質である場合、ウエスタンブロッティングによって基質のリン酸化を検出することができる。リン酸化された基質をメンブレンで分離し、リン酸化基質認識抗体を加えてリン酸化された基質と結合させ、さらに蛍光物質を有する二次抗体をリン酸化基質認識抗体に結合させ、この結合を検出すればよい。リン酸化された基質を、上述したアフィニティータグを用いてあらかじめ分離した場合は、ウエスタンブロッティングの代わりにスロットブロット法を用いて基質のリン酸化を検出することもできる。標識物質として、蛍光物質の代わりに酵素を用いることもできる。酵素を用いる場合、二次抗体の有する酵素を、基質に加えて発光反応させ、この発色を検出すればよい。
また、リン酸化された基質を含む溶液をチューブに収容し、蛍光物質を有するリン酸化基質認識抗体を加えてリン酸化された基質と結合させ、蛍光強度を測定することにより、基質のリン酸化を検出することもできる。
標識物質が酵素である場合、固相酵素免疫検定法（以下、ＥＬＩＳＡ法とする）によって基質のリン酸化を検出することができる。ＥＬＩＳＡ法には、直接吸着法及びサンドイッチ法が含まれる。
直接吸着法では、リン酸化された基質を固相の表面に吸着させ、酵素を有するリン酸化基質認識抗体を加え、リン酸化された基質と結合させる。次に、リン酸化基質認識抗体が有する酵素を、基質に加えて発色反応させ、この発色を検出すればよい。
サンドイッチ法では、固相にリン酸化基質認識抗体を結合させ（以下、固相抗体とする）、リン酸化された基質に加えて固相抗体と結合させる。次に、酵素を有するリン酸化基質認識抗体（以下、標識抗体とする）を加え、リン酸化された基質と結合させる。標識抗体の有する酵素を、基質に加えて発色反応させ、この発色を検出すればよい。
例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としてニトロテトラゾリウムブルークロライド（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェイト（ＢＣＩＰ）の混合溶液を用いて反応させ、発色させることができる。酵素がペルオキシダーゼである場合、基質としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて反応させ、発色させることができる。
サンドイッチ法を用いる場合、固相抗体と標識抗体とは、リン酸化された基質の異なる部位に結合することが好ましい。すなわち、リン酸化された基質に複数の抗体結合部位があるか、用いる２種類の抗体がリン酸化された基質の異なる抗原決定基を認識することが好ましい。
標識物質が放射性同位元素である場合、放射線免疫検出法（以下、ＲＩＡとする）によって基質のリン酸化を検出することができる。具体的には、放射性同位元素を有するリン酸化基質認識抗体をリン酸化された基質に結合させ、放射線をシンチレーションカウンター等によって測定し、基質のリン酸化を検出することができる。
【００４９】
このようにして、本実施形態の方法では、試料中の種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定する。そして、得られた包括的な活性値は、細胞に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性を反映したものである。ゆえに、上述した方法において、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞を使用して包括的な活性値を測定する場合、得られた包括的な活性値に基づいて、腫瘍の再発リスク（すなわち、がんの再発リスク）を精度よく評価することが可能になる。
【００５０】
がんの再発リスクは、上述したような方法で得られた、試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて評価することができる。具体的には、得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と所定の閾値とを比較し、前記活性値が閾値より小さい場合に、がんの再発リスクが低いと評価することができる。
閾値は、測定対象の腫瘍細胞の種類等によって適宜決められる。閾値は、例えば、再発の有無が既知の複数のがん患者から得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて設定することができる。具体的には、複数のがん患者から採取した悪性腫瘍の細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の情報と当該がん患者の再発の有無の情報とに基づいて、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群（例えば、再発リスクが高い群と低い群）に区別できる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の値を選択し、それを閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で閾値を設定することができる。複数の乳がん患者から採取された乳がん細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の情報と当該乳がん患者の摘出手術後５年間の再発の有無の情報に基づいて、当該乳がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の値を選択すればよい。
また、複数の閾値を設定することにより、当該がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）、中程度の群（中リスク群）、低い群（低リスク群）など多段階にがんの再発リスクを評価することも可能である。
【００５１】
上述したように、膜貫通型チロシンキナーゼは細胞のがん化に関わるものである。また、上記の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、細胞膜に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値である。以上のことから、この膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を用いることにより、腫瘍細胞のがん化を精度よく捉えることができる。
よって、この第一の実施形態の判定方法を用いると、精度よく再発リスクを判定することができる。
【００５２】
また、本発明の第２の実施形態の判定方法は、上述した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータ（ＣＤＫパラメータ）とに基づいて、がんの再発リスクを判定するものである。
【００５３】
上記判定は、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較することにより行われる。
膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値との比較は、上述した第１の実施形態で示した方法と同様に行うことができる。なお、本実施形態では、上記の第１の実施形態で示した「閾値」を「第一の閾値」と表記する。
本実施形態では、さらに、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較する。
【００５４】
このＣＤＫパラメータは、腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータであればよい。ＣＤＫパラメータとしては、例えば、腫瘍細胞のＣＤＫの活性値と発現量との比（ＣＤＫ比活性）が挙げられる。さらに、腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が挙げられる。ＣＤＫパラメータとしては、ＣＤＫ比活性比がより好ましい。
【００５５】
ＣＤＫは、がん患者における悪性腫瘍の状態を正確に反映するパラメータとして知られている。ＣＤＫとは、サイクリンというタンパク質が結合することによって活性化される酵素の総称で、その種類に応じて細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫの種類としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７等が挙げられる。本実施形態では少なくとも２種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫ）を用いることが好ましく、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることが特に好ましい。すなわち、第一ＣＤＫがＣＤＫ１であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ２であるか、又は、第一ＣＤＫがＣＤＫ２であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ１であることが好ましい。
そして、好ましいＣＤＫパラメータとしては、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性の組み合わせ、又は、ＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が挙げられ、特にＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が好ましい。
【００５６】
第一ＣＤＫ比活性は、腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比であって、第一ＣＤＫの活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）を用いることができる。第二ＣＤＫ比活性は、腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比であって、第二ＣＤＫの活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）を用いることができる。
【００５７】
ＣＤＫ比活性比は、それぞれ上記のようにして求められた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比である。第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比としては、第一ＣＤＫ比活性を第二ＣＤＫ比活性で除することにより得られる値、第二ＣＤＫ比活性を第一ＣＤＫ比活性で除することにより得られる値等を用いることができる。
【００５８】
ＣＤＫ比活性比は、腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られる。
【００５９】
第二の閾値は、測定対象の腫瘍細胞等によって適宜決められる。第二の閾値は、例えば、再発の有無が既知の複数のがん患者から得られたＣＤＫパラメータに基づいて設定することができる。具体的には、複数のがん患者から採取した悪性腫瘍の細胞のＣＤＫパラメータの情報と当該がん患者の再発の有無の情報とに基づいて、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群（例えば、再発リスクが高い群と低い群）に区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で第二の閾値を設定することができる。複数の乳がん患者から採取された乳がん細胞のＣＤＫパラメータの情報と当該乳がん患者の摘出手術後５年間の再発の有無の情報に基づいて、当該乳がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できるＣＤＫパラメータの値を選択すればよい。
また、上記第一の閾値と組み合わせることによって、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群に区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で閾値を設定することができる。上記第一の閾値により区別された高リスク群及び／又は低リスク群を、さらに、再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。
また、複数の第二の閾値を設定することにより、当該がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）、中程度の群（中リスク群）、低い群（低リスク群）など多段階にがんの再発リスクを評価することも可能である。
【００６０】
ＣＤＫの活性値及び発現量の測定に供される測定用試料は、上記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の測定に使用した腫瘍組織中の細胞を用いて調製される。ＣＤＫの活性値や発現量が測定できれば、その調製方法は特に限定されない。測定用試料としては、細胞可溶化液を用いることができる。細胞可溶化液とは、がん患者から採取した腫瘍組織に緩衝液を添加し、緩衝液中で腫瘍組織中の腫瘍細胞を物理的及び／又は化学的に破砕することにより得られる試料のことである。ＣＤＫの活性値又は発現量を測定する場合、細胞可溶化液を遠心分離して得られる上清を測定用試料として用いることが好ましい。ここで用いられる緩衝液には、界面活性剤やプロテアーゼインヒビター等を適宜含有させてもよい。
【００６１】
ＣＤＫの活性値及び発現量の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、上記特許文献１に開示の方法、特開２００７−６１０８８号公報に開示の方法等を用いることができる。
【００６２】
再発リスクの判定は、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較することにより行われる。例えば、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、ＣＤＫパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定することができる。
【００６３】
上述したように、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を用いることにより、腫瘍細胞のがん化を精度よく捉えることができる。
さらに、ＣＤＫは細胞の増殖に深く関わるため、ＣＤＫパラメータを用いることにより、腫瘍細胞の増殖能を精度よく捉えることができる。ここで、細胞の増殖能は、がんの再発リスクを左右する１つの大きな要素である。
よって、この第二の実施形態の判定方法を用いると、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値とＣＤＫパラメータの両方を用いることにより、さらに精度よく再発リスクを判定することができる。
【００６４】
上記本実施形態の方法は、コンピュータにおいて実行させることが好ましい。以下、上記第二の実施形態の判定方法を実施するためのコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。なお、ここで説明する第二の実施形態の判定方法では、ＣＤＫパラメータとして、ＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が使用されている。
【００６５】
図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けの記憶装置１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、記憶装置１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
【００６６】
図２は、上記第一の判定方法による再発リスク判定を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムは記憶装置（ハードディスク）１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により検体の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（以下、第一パラメータという）及びＣＤＫのパラメータであるＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性：ＣＤＫ比活性比）（以下、第二パラメータという）が入力されると、ＣＰＵ１１０ａが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。
【００６７】
ＣＰＵ１１０ａは、予めプログラムのデータとして記憶装置（ハードディスク）１１０ｄに記憶されていた第一パラメータに対応する第一の閾値、及び第二パラメータに対応する第二の閾値を呼び出す。そして、第一の閾値と第一パラメータデータとの比較、及び第二の閾値と第二パラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。
【００６８】
次に、ＣＰＵ１１０ａは、比較結果に基づいて再発リスクの予測判定を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０ａは、第一パラメータが第一の閾値未満であり、且つ第二パラメータが第二の閾値未満である場合には、再発リスク「低」と判定する。
【００６９】
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００７０】
なお、本実施形態においては、各種パラメータデータや活性値等を、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではなく、例えば、操作者による入力ではなく、各種パラメータデータや活性値等が測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介して自動的に取得されるようにしてもよい。また、ＣＤＫ比活性比として、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値及びＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。また、ディスプレイ１２０に出力するのは判定結果だけで限られず、例えば、第一パラメータ及び第二パラメータをそれぞれの閾値と比較した結果を判定結果と一緒に出力してもかまわない。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明の方法について、実施例に基づき、より具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００７２】
以下の実施例では、複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼの種類に対するユニバーサル基質を使用した。まず、基質を作製する方法を説明する。
【００７３】
チロシンキナーゼの基質の作製
４つのグルタミン酸残基と１つのチロシン残基とからなる配列が５回繰り返されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド（以下、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ペプチドとする）とＧＳＴとの融合タンパク質を作製し、この融合タンパク質を、膜貫通型チロシンキナーゼの種類にかかわらず膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化され得る基質として用いた。以下、この融合タンパク質をＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質とする。
【００７４】
ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質は、以下の方法で作製した。ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）をコードするＤＮＡ（配列番号２）、このＤＮＡの塩基配列を基に設計したセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）及びＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより得られた増幅産物（以下、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ＤＮＡとする）及びＧＳＴ融合タンパク質発現用のプラスミドベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を制限酵素（ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１）で処理し、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ−３に組み込み、組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームし、この大腸菌を液体培地（ＬＢ培地）中で培養液の吸光度（６００ｎｍ）が０．６になるまで培養した。この培養した大腸菌に１ｍＭ ＩＰＴＧ（培養液中の濃度）を添加して４時間培養し、発現を誘導した。次に、大腸菌を溶菌し、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いてＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を回収した。このＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質のアミノ酸配列を配列番号５に示した。
【００７５】
次に、作製したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が、種々の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されることを確認した。
【００７６】
参考例
ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質のリン酸化の検出
市販の膜貫通型チロシンキナーゼの細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＩＣＤ）を用いてＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質をリン酸化し、ウエスタンブロッティングによりリン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を検出した。なお、膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから構成されており、細胞内ドメインにチロシンキナーゼの活性を示す部位が存在する。
【００７７】
（反応用試料の調製）
緩衝液１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２％プロテアーゼインヒビター（以下、ＰＩとする）、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）５０μｌと市販の膜貫通型チロシンキナーゼのＩＣＤ ０．５ｐｍｏｌとを混合し、これを反応用試料として以下の酵素反応に用いた。ここでは、ＩＣＤとして、ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ β Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＰＤＧＦＲ−βとする）、ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＶＥＧＦＲ１とする）、ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＶＥＧＦＲ２とする）、ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ１とする）、ＥｒｂＢ２ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ２とする）、ＥｒｂＢ４ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ４とする）、ＩＧＦ−１Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＩＧＦ１Ｒとする）（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。なお、緩衝液１とＰＤＧＦＲ−βとを混合したものを反応用試料ｉとし、緩衝液１とＶＥＧＦＲ１とを混合したものを反応用試料ｉｉとし、緩衝液１とＶＥＧＦＲ２とを混合したものを反応用試料ｉｉｉとし、緩衝液１とＨＥＲ１とを混合したものを反応用試料ｉｖとし、緩衝液１とＨＥＲ２とを混合したものを反応用試料ｖとし、緩衝液１とＨＥＲ４とを混合したものを反応用試料ｖｉとし、緩衝液１とＩＧＦ１Ｒとを混合したものを反応用試料ｖｉｉとする。
【００７８】
（酵素反応）
反応用試料ｉ２５μｌと、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む基質溶液１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ ＮＰ−４０、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、４０μＭ ＡＴＰ及び５μｇ ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む）２５μｌとを混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。この反応液に、ＳＤＳサンプルバッファーｐＨ６．８（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０％グリセロール、８％ ＳＤＳ、及び１０％ ２−メルカプトエタノールを含む）２５μｌを加え、１００℃で５分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をＳＤＳ用試料ｉ（＋）とする。同様にして、反応用試料ｉｉ〜ｖｉｉからＳＤＳ用試料ｉｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）を調製した。
【００７９】
また、反応用試料ｉ ２５μｌと、ＡＴＰを含まない基質溶液２（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ ＮＰ−４０、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、及び５μｇ ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む）２５μｌとを混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。この反応液に、上述したＳＤＳサンプルバッファー２５μｌを加え、１００℃で５分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をＳＤＳ用試料ｉ（−）とする。同様にして、反応用試料ｉｉ〜ｖｉｉからＳＤＳ用試料ｉｉ（−）〜ｖｉｉ（−）を調製した。基質溶液２は、ＡＴＰが含有されていない点を除いて、基質溶液１と同じ組成である。そして、ＳＤＳ用試料ｉ（−）〜ｖｉｉ（−）は、ＳＤＳ用試料ｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）のネガティブコントロールとして使用した。
【００８０】
（リン酸化されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質の検出）
各ＳＤＳ用試料をポリアクリルアミドゲル〔ＰＡＧミニ「第一」４／２０（１３Ｗ）（第一化学薬品株式会社）〕を別々のウェルに注入し、泳動槽〔カセット電気泳動槽「第一」ＤＰＥ−１０２０（ミニ２連式）（第一化学薬品株式会社）〕を用いて２５ｍＡで７０分間電気泳動した。電気泳動によって分離したタンパク質を、ミニトランスブロットセル（バイオラッド社）を用いて１００Ｖで１時間電圧をかけ、ポリアクリルアミドゲルからポリビニリデンフロライド（ＰＶＤＦ）メンブレン〔Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ ０．４５μｍ ポアサイズ（ミリポア社）〕に転写した。このＰＶＤＦメンブランを、４％ブロックエース（大日本住友製薬株式会社）溶液で６０分間ブロッキングした。ブロッキングしたＰＶＤＦメンブランを、一次抗体溶液〔０．４％ブロックエース及び０．５μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｌｏｎｅ ４Ｇ１０（ｕｐｓｔａｔｅ社）を含む〕２ｍｌ中で６０分間振とうした後、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）で３回洗浄した。次に、このＰＶＤＦメンブランを、二次抗体溶液〔０．４％ブロックエース及び２．７μｇ／ｍｌ抗マウスイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体 ＦＩＴＣ標識（ＤＡＫＯ社）を含む〕２ｍｌ中で６０分間振とうした後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。このＰＶＤＦメンブランを乾燥させ、画像解析装置〔Ｐｈａｒｏｓ ＦＸ ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社）〕を用いて解析し、蛍光を検出した。このようにしてウエスタンブロッティングにより、ＳＤＳ用試料ｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）及びＳＤＳ用試料ｉ（−）〜ｖｉｉ（−）に含まれるリン酸化されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を検出した。
【００８１】
図３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図中のｉは膜貫通型チロシンキナーゼとしてＰＤＧＦＲ−βを、ｉｉはＶＥＧＦＲ１を、ｉｉｉはＶＥＧＦＲ２を、ｉｖはＨＥＲ１を、ｖはＨＥＲ２を、ｖｉはＨＥＲ４を、ｖｉｉはＩＧＦ１Ｒを用いた場合の結果を示す。また、ｉ〜ｖｉｉの各写真においては、−は、ＡＴＰを含まない基質溶液２を用いて調製したＳＤＳ用試料から得られた結果である。＋は、ＡＴＰを含む基質溶液１を用いて調製したＳＤＳ用試料から得られた結果である。Ｐ−ＩＣＤは、自己リン酸化した膜貫通型チロシンキナーゼが発現する位置を示し、Ｐ−ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）は、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置を示している。
【００８２】
図３のｉ〜ｖｉｉの全ての＋において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置に単一のバンドが見られた。これより、上記（１）で作製されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が、多くの種類の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されることがわかった。
【００８３】
なお、図３のｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉ及びｖｉｉの−において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置にバンドが見られないのは、酵素反応において反応液にＡＴＰが含まれず、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質がリン酸化されなかったためであると考えられる。一方、図１のｉ及びｖの−において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置に非常に薄いバンドが見られたが、この原因としては、検出に用いた抗体が非特異的に結合したため、又は、測定で使用した製品に微量のＡＴＰが混在していたため、等が考えられる。
【００８４】
実施例１
本例では、がん患者から採取した腫瘍細胞から膜貫通型チロシンキナーゼを含む反応用試料を調製し、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を用いて測定用試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定し、この活性値に基づいてがんの再発リスクを判定した。
【００８５】
（１）反応用試料の調製
乳がん患者３１名（患者１〜３１）から摘出した腫瘍組織３１検体（約８〜１２５ｍｍ３）から下記のようにして反応用試料１〜３１を調製した。なお、３１検体についての、病理医の判定結果（ＴＮＭ分類、リンパ節転移の状態、がん組織の大きさ、術後５年間の再発の有無及び再発場所）を表１に示す。患者１〜３１には、早期がん（ステージＩ又はＩＩＡ）だけでなく、進行がん（ステージＩＩＢ又はＩＩＩＡ）も含まれている。
【００８６】
【表１】
【００８７】
表１中、「ＬＮ」は、手術時のリンパ節転移の状態を示し、「ａ」は所属リンパ節に転移が認められなかったもの、「ｂ」は所属リンパ節のうち１〜３個に転移が認められたもの、「ｃ」は所属リンパ節のうち４個以上に転移が認められたものに分類される。「Ｔ」は、手術時の原発巣のサイズを示し、腫瘍径２ｃｍ以下を「ａ」、腫瘍径２〜５ｃｍを「ｂ」、腫瘍径５ｃｍ以上を「ｃ」で示す。
【００８８】
反応用試料１〜３１の調製方法は以下のとおりである。
各腫瘍組織と細胞処理液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）１ｍｌとを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を破壊し、細胞溶液を調製した。得られた細胞溶液を遠心分離し、上清を廃棄して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞膜可溶化液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）とを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を可溶化し、遠心分離して上清を回収した。この上清を反応用試料として用いた。
【００８９】
（２）キナーゼ反応
各チューブに反応溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール及び２００μＭ ＡＴＰを含む）５０μｌを入れ、その中に上記（１）で調製した反応用試料１〜３１をそれぞれ１０μｇ、及び参考例（１）において調製したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質５μｇを加え、２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、５０μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、反応を停止させた。こうして得られた溶液を測定用試料１〜３１とする。
【００９０】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
測定用試料１〜３１にそれぞれ４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー３３μｌを添加し、１００℃で５分間加熱した。そして、加熱した測定用試料１〜３１をそれぞれ１３μｌずつ電気泳動槽（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１１１）にセットしたプレキャストゲル（ＰＡＧＥミニ第一４／２０）の別々のウェルに注入し、電気泳動を行った。電気泳動終了後、硝子板からウェルを外し、ミリポア社製Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬメンブラン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１ＥＪ０８４Ｅ０３）にゲルのタンパク質を転写した。タンパク質転写後のメンブランをブロックエース（大日本住友製薬製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＫ−Ｂ８０）に漬け、１時間室温でブロッキングした。その後、１×ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄することを３回繰り返した。そのメンブランを、１／１０希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した一次抗体〔ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｌｏｎｅ ４Ｇ１０（ＵＰＳＴＡＴＥ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．０５−３２１）〕液に漬け、１時間室温で振とうさせた。その後、１×ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄することを３回繰り返した。そして、１／１０希釈したブロックエースで１０００倍に希釈した二次抗体〔ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ／ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ０２６１）〕液に漬け、１時間室温で振とうさせ、１×ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄することを３回繰り返した。メンブランを乾燥させ、シグナルをイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＥＲ ＦＸ）で検出し、バンドの濃さを数値化したものを活性値とした。
【００９１】
（４）閾値の設定
乳がん患者３１名を手術後５年間に再発したか否かで再発グループと非再発グループとに分け、患者のグループ（横軸）に対して乳がん患者３１名について測定した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を縦軸としたグラフを作成した。そのグラフを図４に示す。そして、再発グループと非再発グループとを高値群と低値群とに分離できる活性値を閾値とした。閾値は１０００００であり、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が閾値（１０００００）より小さい場合を再発リスクが小さい（再発リスク「低」）と判断した。
【００９２】
（５）再発リスク判定
表１及び図４に示された結果から、乳がん患者３１例のうち術後５年間で再発を起こしたのは１０例であった（再発率３２％）。一方、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて再発リスクを判定した場合、図４に示された結果から、乳がん患者３１例のうち７例が再発リスク「低」と判定され、この７例のうち術後５年間で再発を起こしたのは１例であった（再発率１４％）。
【００９３】
以上より、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較することにより再発リスクが低い群を分類することができ、再発を起こすか否かを予測することができる。また、この予測結果を、早期がんだけでなく進行がんの患者の治療方針を決定する際の指標とすることができる。
【００９４】
実施例２
本例では、実施例１と同じがん患者から採取した腫瘍細胞を用い、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値とＣＤＫ比活性比とを測定し、この活性値及びＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定した。
なお、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は実施例１で測定した値を使用する。
【００９５】
（１）ＣＤＫ測定用試料の調製
実施例１で使用した腫瘍組織３１検体について、緩衝液中の腫瘍組織が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａ〔０．１ｗ／ｖ％ ノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４及び１００μｌ／ｍｌプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む〕と腫瘍組織とをチューブに収容した。
電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍組織をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清をＣＤＫ測定用試料として用いた。
【００９６】
（２）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、ＣＤＫ測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンにＣＤＫ測定用試料中のタンパク質を吸着させた。
ウェルに洗浄液Ｂ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％ ＢＳＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにビオチン化した抗ウサギＣＤＫ１抗体（二次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で約３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノールで約５分間濯ぎ、約２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社）によって分析、測定した。測定値は検量線をもとに算出した。
【００９７】
検量線は、０．００５％ノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより作成した。
【００９８】
ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は、上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行った。
【００９９】
（３）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらにＣＤＫ測定用試料を添加した。ＣＤＫ測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。
ここに抗ＣＤＫ１抗体（サンタクルズ社）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社）を加えて４℃で１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。
反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／Ｖ％ ノニデットＰ−４０及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含む）で３回洗浄し、１５μｌの緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー社）１０μｇ、５ｍＭ ＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間振とうしてキナーゼ反応を行い、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。
この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭ ヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）とを添加して室温で９０分間、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基が導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。
ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールを添加することより行った。
ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％ ＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で１時間反応させた。
反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで３回洗浄した。
洗浄後、蛍光イメージアナライザＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社）を用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行った。活性値は、検量線に基づいて算出された。
【０１００】
検量線は、２種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。したがって、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【０１０１】
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズ社）を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【０１０２】
（４）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
【０１０３】
（５）閾値の設定
ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性＝ＣＤＫ比活性比）に対応する第二の閾値を設定し、この第二の閾値とＣＤＫ比活性比とを比較した結果と、実施例１の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値（第一の閾値）とを比較した結果とを組み合わせてがんの再発リスクの判定を行った。
【０１０４】
乳がん患者３１名のＣＤＫ比活性比（横軸）に対して膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を縦軸としたグラフを作成した。そのグラフを図５に示す。第一の閾値は、実施例１と同じく１０００００とした。そして、第二の閾値は、１５に設定した。この値は、ＣＤＫ比活性比を高値群と低値群とに分離できる値である。膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第一の閾値（１０００００）より小さく、且つ、ＣＤＫ比活性比が第二の閾値（１５）より小さい場合に、再発リスクが小さい（再発リスク「低」）と判断した。
【０１０５】
（６）再発リスク判定
図５に示された結果から、乳がん患者３１例のうち２８例が、そのＣＤＫ比活性比が第二の閾値（１５）未満であった。その２８例のうち、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第１の閾値（１０００００）未満であった例は６例であり、この６例が再発リスク「低」と判断された。そして、この６例のうち術後５年間で再発を起こしたのは０例であった。
【０１０６】
以上より、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値との比較結果と、ＣＤＫのパラメータであるＣＤＫ比活性比と第二の閾値との比較結果とを組み合わせることにより再発リスクが低い群を分類することができ、再発を起こすか否かをより精度よく予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本実施形態の方法を実施するためのコンピュータシステムの概略図である。
【図２】第一の実施形態の判定方法に基づいた判定フローである。
【図３】本実施形態で作製されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質の、膜貫通型チロシンキナーゼによるリン酸化を検出した結果である。
【図４】患者のグループ（横軸）と膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（縦軸）との関係を示すグラフである。
【図５】ＣＤＫ比活性比（横軸）と膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（縦軸）との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０８】
１００ システム
１１０ コンピュータ本体
１１０ａ ＣＰＵ
１１０ｂ〜１１０ｄ 記憶装置
１１０ｅ 読出装置
１１０ｆ 入出力インターフェイス
１１０ｈ 画像出力インターフェイス
１１０ｉ バス
１２０ ディスプレイ
１３０ 入力デバイス
１４０ 外部記録媒体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの再発リスクの判定方法に関する。より詳しくは、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞の分子を分析し、その分析結果に基づいてがんの再発リスクを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、臨床において、がんの再発リスクを様々なパラメータに基づいて判定することが行われている。例えば、非特許文献１では、早期乳がんの再発リスクを、チロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体の一種であるＨＥＲ２の発現量に基づいて判定することが提案されている。また、特許文献１では、サイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比に基づいてがんの再発リスクを判定する方法が提案されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１１６２４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｏｅｎｓｕｕ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．９， ２００３， ９２３−９３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臨床におけるがんの再発リスクの判定は、術後の治療方針等に影響するものであるため、正確且つ安定に行われる必要があり、このため、上記パラメータ以外の、細胞のがん化等に関係するパラメータを用いてがんの再発リスクを判定することが検討されている。
【０００５】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞で発現している膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいてがんの再発リスクを判定することができる方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法である。
本発明者らは、細胞増殖に関わる膜貫通タンパク質であって、その発現や活性の異常ががんの原因になることが知られているチロシンキナーゼについて研究を重ねた結果、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値という、今までとは違う新しいパラメータを用いれば、がんの再発リスクを判定することができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
上記判定が、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較し、前記活性値が閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが低いと判定するものであってもよい。
【０００８】
上記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる。
【０００９】
上記試料調製工程は、前記腫瘍組織中の細胞を緩衝液中で破砕し、破砕された細胞と界面活性剤を含む溶液とを混合し、得られた混合液の上清を採取することにより膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製するものであってもよい。
上記試料調製工程において、界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００１０】
上記膜貫通型チロシンキナーゼは、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）及び血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）を含むことができる。
【００１１】
上記基質は、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い複数種類の基質の混合物、又は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質であることが好ましく、ユニバーサル基質が、グルタミン酸残基及びチロシン残基を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含むことがさらに好ましい。
【００１２】
上記判定方法は、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータとに基づいて、がんの再発リスクを判定することができる。
【００１３】
上記判定は、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、前記ＣＤＫのパラメータと第二の閾値とを比較し、前記活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、前記ＣＤＫのパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定することができる。
【００１４】
上記ＣＤＫのパラメータは、前記腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに前記腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、前記第一ＣＤＫ比活性と前記第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）であることができる。
【００１５】
上記ＣＤＫ比活性比は、前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、前記第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、前記比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られ、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値及び前記ＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、腫瘍細胞に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を反映した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値という新しいパラメータを用いることにより、がんの再発リスクを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の第１の実施形態の判定方法は、腫瘍細胞に存在する膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法である。
【００１８】
上記判定方法が適用されるがんは、造血器由来の悪性腫瘍、上皮細胞由来の癌腫、肉腫等である。造血器由来の悪性腫瘍としては、白血病、悪性リンパ腫等を例示することができる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がん等を例示することができる。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫等を例示することができる。
【００１９】
判定に用いられる細胞は、がん患者から採取された腫瘍組織に含まれる細胞であればよい。判定に用いられる細胞は、初期がん、早期がん又は進行がんの腫瘍組織中の細胞のいずれでもよい。例えば、乳がんの場合、好ましくは、ステージ分類において「ステージＩ」〜「ステージＩＩＩＡ」の悪性腫瘍の細胞である。本発明は、早期がんだけでなく、進行がんの再発リスクを判定することができることが１つの大きな特徴である。
ステージ分類とは悪性腫瘍の悪性度を示す分類である。例えば乳がんの場合、悪性度の低い順にステージＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶに分類される。このステージ分類は、ＴＮＭ分類に基づいている。ＴＮＭ分類とは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）による悪性腫瘍の病期分類である。「Ｔ」は原発腫瘍の規模を示し、Ｔ０（原発巣が確認できない）〜Ｔ４（腫瘤が対外へ露出）に分けられる。「Ｎ」は近傍リンパ節への浸潤度合いを示し、Ｎ０（リンパ節転移なし）〜Ｎ３（体の正中に近いところにあるリンパ節（胸骨傍リンパ節）に転移が疑われる）に分けられる。「Ｍ」は遠隔転移の有無を表し、Ｍ０（遠隔転移なし）及びＭ１（遠隔転移あり）に分けられる。
【００２０】
腫瘍組織は、例えば、手術により摘出された腫瘍組織、生検により採取された腫瘍組織などが挙げられる。
【００２１】
上記判定方法により、がんの再発リスク（再発のしやすさ）を判定することができる。
再発とは、生体から腫瘍を摘出して一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合、及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能等に左右される。
【００２２】
膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、腫瘍細胞の細胞膜に存在する様々な膜貫通型チロシンキナーゼを、単離・精製することなく、包括的に測定した活性値である。この包括的な活性値は、例えば、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い各基質の混合物又は様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質を用いることにより測定することができる。
このようにして得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、腫瘍細胞の細胞膜に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を反映したものである。ゆえに、腫瘍細胞を使用して膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定することにより、得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することが可能になる。そして、このようにして得られたがんの再発リスクの判定結果は、がんの術後の治療方針等を検討する上で非常に有用な情報となる。
【００２３】
膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞膜に存在する膜貫通型のチロシンキナーゼのことであって、細胞の増殖、細胞の生存、細胞の分化や血管新生等において重要な役割を果たしている。例えば、膜貫通型チロシンキナーゼには細胞のがん化に関わるものが多く、その発現量の異常や酵素活性の異常が細胞のがん化を引き起こすことが知られている。細胞膜に存在するチロシンキナーゼであれば特に限定されない。具体的には、例えば、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）等の増殖因子受容体が挙げられる。なお、ＨＥＲファミリーは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を含む。
【００２４】
膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞の細胞膜から回収される。細胞は、生体から採取された生体試料に含まれる細胞であってもよいし、生体から採取された細胞を株化した培養細胞であってもよい。具体的には、細胞として腫瘍細胞を使用することができる。そして、腫瘍細胞は、がん患者から採取された生体試料（腫瘍組織）に含まれる腫瘍細胞であってもよいし、がん患者から採取された腫瘍細胞を株化した培養細胞であってもよい。
【００２５】
膜貫通型チロシンキナーゼを回収する方法は、細胞から細胞質を分離して様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製するような方法であれば特に限定されない。例えば、以下の方法により膜貫通型チロシンキナーゼを回収することができる。まず、細胞の細胞膜を適当な緩衝液（以下、ホモジナイズ試薬とする）中で破砕し、遠心分離によって上清と沈殿物とを分離して上清を除去する。この上清には、細胞質由来のタンパク質等が含まれており、沈殿物には種々の膜貫通型チロシンキナーゼを保持した細胞膜の断片が含まれている。この沈殿物と、界面活性剤を含む溶液（以下、可溶化処理液とする）とを混合し、遠心分離によって上清と沈殿物とを分離する。上清には界面活性剤によりミセル化した、種々の膜貫通型チロシンキナーゼを含む細胞膜が含有されており、沈殿物には不溶性タンパク質及びＤＮＡ等が含有されている。そして、この上清を、膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料とする。このようにして調製された試料中では、断片化された細胞膜に種々の膜貫通型チロシンキナーゼが貫通した状態で、その細胞膜が界面活性剤によりミセル化されている。
【００２６】
なお、膜貫通型チロシンキナーゼは、リガンドが結合することによってホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することが知られている。上述した方法により調製された試料には、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成可能な程度に立体構造を保持した状態で膜貫通型チロシンキナーゼが含まれている。したがって、上述した方法により調製された試料を用いることにより、より正確に、腫瘍の再発リスク（すなわち、がんの再発リスク）を判定することが可能になる。
【００２７】
ホモジナイズ試薬は、細胞を破砕する際に、膜貫通型チロシンキナーゼが変性するのを防ぐために用いられる。ｐＨとしては、膜貫通型チロシンキナーゼを変性させたり失活させたりすることなく、安定した状態で回収できる範囲であれば特に限定されず、好ましくは４．０〜９．０、より好ましくは４．５〜８．５、さらに好ましくは５．０〜８．０である。
ホモジナイズ試薬は、緩衝剤を含むことが好ましい。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホチノプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ〔２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸〕、Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕、トリシン〔Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〕等が挙げられる。
可溶化処理液も、上記のような緩衝剤を含み、ホモジナイズ試薬と同程度のｐＨであることが好ましい。なお、ホモジナイズ試薬及び／又は可溶化処理液に、プロテアーゼインヒビター、脱リン酸化酵素阻害剤、ＳＨ基の酸化を防ぐための試薬（以下、ＳＨ基安定剤とする）等を添加して用いてもよい。
【００２８】
細胞膜の破砕の方法としては、細胞膜を断片化することができれば特に限定されない。例えば、ピペットによる吸引排出、ボルテックスミキサーによる攪拌、ブレンダーによる破砕、ペッスルによる加圧、超音波処理装置による超音波処理等が挙げられる。
【００２９】
可溶化処理液に含まれる界面活性剤は、断片化した細胞膜を可溶化（ミセル化）するために用いることができる。ただし、細胞膜に含まれる膜貫通型チロシンキナーゼを分解したり変性したりしないものを用いることが好ましい。電荷を有する界面活性剤は、膜貫通型チロシンキナーゼに結合して立体構造を変化させる可能性があるため、膜貫通型チロシンキナーゼに実質的に結合しない非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルエーテル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル等を基本構造として有するものが挙げられる。具体的には、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０、Ｓｈｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄの登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、トゥイーン（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｂｒｉｊ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｅｍｕｌｇｅｎ（花王株式会社の登録商標）等が挙げられる。可溶化処理液中の界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜３％、さらに好ましくは０．１〜１％である。
【００３０】
プロテアーゼインヒビターは、膜貫通型チロシンキナーゼが、細胞に含まれるプロテアーゼによって分解されることを防ぐために用いることができる。プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のメタロプロテアーゼインヒビター、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼインヒビター、ヨードアセトアミド、Ｅ−６４等のシステインプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。これらのプロテアーゼインヒビターは単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。また、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）のような、あらかじめ複数のプロテアーゼインヒビターが混合された市販品を用いることもできる。
【００３１】
脱リン酸化酵素阻害剤は、膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性が、細胞内に含まれる脱リン酸化酵素によって低下させられることを防ぐために用いることができる。脱リン酸化酵素阻害剤としては、例えば、オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、オカダ酸等が挙げられる。脱リン酸化酵素阻害剤は、単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
【００３２】
ＳＨ基安定剤は、膜貫通型チロシンキナーゼの失活を防ぐために用いることができる。酵素に含まれるＳＨ基は、酸化されてより安定なジスルフィドを形成しやすい。ジスルフィドの形成は、酵素の構造を変化させるため、酵素の失活の原因となることがある。ＳＨ基の酸化は、ＳＨ基を含有する試薬によって防ぐことができる。ＳＨ基安定剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、システイン、ホモシステイン、補酵素Ａ、ジヒドロリポ酸等が挙げられる。ホモジナイズ試薬及び／又は可溶化処理液中のＳＨ基安定剤の濃度は、ＳＨ基安定剤としてＤＴＴを用いる場合には、好ましくは０．０５〜２ｍＭ、より好ましくは０．０７〜１．７ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１．５ｍＭである。ＳＨ基安定剤として２−メルカプトエタノールを用いる場合には、好ましくは０．１〜１５ｍＭ、より好ましくは０．３〜１３ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１２ｍＭである。
【００３３】
本実施形態では、細胞から細胞質を分離して複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製し、この試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定する。
この膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定するために、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質を利用する。具体的には、試料に含まれる膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させる。この接触によって、試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により基質をリン酸化する。そして、リン酸化された基質を検出し、得られた検出結果に基づいて膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定することができる。好ましくは、膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料と、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質と、リン酸基供与体と、を混合して接触させ、チロシンキナーゼ活性によりリン酸化された基質を検出する。膜貫通型チロシンキナーゼは、自己リン酸化により活性化され、それにより基質をリン酸化してシグナルを伝える。しかしながら、自己リン酸化されていても、基質をリン酸化するとは限らない。ゆえに、基質のリン酸化を検出する方が、より正確に活性値を測定することができる。
【００３４】
上述した少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質としては、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い各基質の混合物を使用することができる。この混合物は、膜貫通型チロシンキナーゼに対する特異性が異なる複数種類の基質を含む。特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い基質としては、例えば、ＨＥＲ１に対して特異性の高い基質であるＧｒｂ２、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ヒストンＨ２Ｂ（ＨＨ２Ｂ）、ホスホリパーゼＣ ガンマ等を用いることができる。また、ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（スタラタジーン社）のような市販の基質をＨＥＲ１に対して特異性の高い基質として用いることもできる。ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ストラタジーン社）のような市販の基質をＨＥＲ１に対して特異性の高い基質として用いることもできる。ＧＳＴ ＥＧＦＲ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＧＳＴと、ＨＥＲ１の酵素活性によってリン酸化されるよう人為的に作製された基質との融合タンパク質である。測定において異なる基質の混合物を使用することにより、試料中の種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが可能になる。
【００３５】
また、上述した少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質としては、複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質を使用することができる。例えば、ユニバーサル基質は、各膜貫通型チロシンキナーゼに対する共通の基質である。ユニバーサル基質は、第１の膜貫通型チロシンキナーゼ、第１膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第２の膜貫通型チロシンキナーゼ、第１及び第２膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第３の膜貫通型チロシンキナーゼ、並びに第１、第２及び第３膜貫通型チロシンキナーゼとは異なる第４の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されうる。言い換えると、ユニバーサル基質は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されうる。そのような基質としては、膜貫通型チロシンキナーゼの種類に関わらず、チロシンキナーゼによりリン酸化されるように人為的に作製された、公知の合成ペプチドが挙げられる。例えば、Ｎｏｒｉｏ Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２６０， Ｎｏ．１７， ９７９３−９８０４、 Ｓｅｒｇｅｉ Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ ２５９， Ｎｏ．４， ２０５１−２０５４、及びＭ． Ａｄｂｅｌ−Ｇｈａｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．８７， ７０６１−７０６５等の文献において、チロシンキナーゼの基質として使用されている合成ペプチドが挙げられる。これらの文献に開示されている合成ペプチドは、グルタミン酸（以下、Ｇｌｕと省略する）及びチロシン残基（以下、Ｔｙｒと省略する）を含むアミノ酸配列からなり、Ｔｙｒが２種類以上のチロシンキナーゼによりリン酸化され得るよう人為的に作製された合成ペプチドである。上記アミノ酸配列としては、具体的には、４つのＧｌｕと１つのＴｙｒとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ａとする）、１つのＧｌｕと１つのＴｙｒとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｂとする）、６つのＧｌｕと１つのＴｙｒと３つのアラニン残基（以下、Ａｌａと省略する）とからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｃとする）、１つのＧｌｕと１つのＴｙｒと１つのＡｌａとからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｄとする）、２つのＧｌｕと１つのＴｙｒと６つのＡｌａと５つのリジン残基（以下、Ｌｙｓと省略する）とからなる配列が２回以上繰り返されたアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列ｅとする）等が例示できる。なお、Ｔｏｎｙ Ｈｕｎｔｅｒ， １９８２， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２５７， Ｎｏ．９， ４８４３−４８４８の文献において、チロシンキナーゼによるＴｙｒのリン酸化には酸性アミノ酸残基が重要であるという報告があり、これより、特に、酸性のアミノ酸残基であるＧｌｕを多く含有するアミノ酸配列ａやアミノ酸配列ｃが好ましい。測定においてこのような基質を使用することにより、試料中に含まれる種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが可能になる。
【００３６】
なお、より正確にがんの再発リスクを評価するためには、できるだけ多くの種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を含む膜貫通型チロシンキナーゼ活性値を測定することが好ましい。ゆえに、上述したユニバーサル基質を使用することが好ましい。
【００３７】
膜貫通型チロシンキナーゼが触媒する酵素反応では、自己リン酸化により活性化した膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性により、リン酸基供与体のリン酸化基が基質に取り込まれる。ここで、リン酸基供与体としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）、３２Ｐ標識したアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）等が挙げられる。
【００３８】
上記基質は、アフィニティータグを有することが好ましい。アフィニティータグと、アフィニティータグと結合可能な結合物質を有する固相（以下、結合物質付固相とする）を用いて、基質を回収することができる。具体的には、アフィニティータグを有する基質と、結合物質付固相とが結合した複合体を回収し、回収した複合体におけるアフィニティータグと、結合物質付固相が有する結合物質との結合を解離させることにより、基質を回収することができる。
【００３９】
アフィニティータグは、結合物質に結合可能であり、基質の膜貫通型チロシンキナーゼへの結合や基質のリン酸化を妨害しない物質であれば特に限定されない。アフィニティータグとしては、例えば、ポリペプチド、ハプテン等を用いることができる。具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとする）、ヒスチジン、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ社）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等を用いることができる。
【００４０】
アフィニティータグを有する基質としては、例えば、基質とアフィニティータグとの融合タンパク質を用いることができる。融合タンパク質としては、アフィニティータグと基質とを結合させたものを用いてもよいし、アフィニティータグと基質との融合タンパク質を発現する組換え遺伝子を有するベクターを宿主に導入し、宿主が産生した融合タンパク質を回収して用いてもよい。
【００４１】
結合物質は、アフィニティータグと解離可能に結合できるものであれば特に限定されない。結合物質としては、例えば、グルタチオン、ニッケル、アミロース、ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）、Ｍｙｃ抗体、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ社）等が挙げられる。
【００４２】
固相は、結合物質と結合可能である担体であれば特に限定されない。固相の材質としては、例えば、多糖類、プラスチック、ガラス等が挙げられる。固相の形状としては、例えば、ビーズ、ゲル等が挙げられる。固相の具体例としては、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、ガラスビーズ、シリコーンゲル等が挙げられる。また、上述したビーズやゲルをカラムに充填して用いることもできる。
【００４３】
アフィニティータグと結合物質付固相との組み合わせとしては、以下のような例が挙げられる。
アフィニティータグとしてＧＳＴを選択した場合、結合物質付固相は、例えばグルタチオンセファロースビーズ（以下、グルタチオンビーズとする）を用いることができる。膜貫通型チロシンキナーゼの酵素活性によってリン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させる。これを回収し、還元型グルタチオンを添加すると、ＧＳＴとグルタチオンビーズとの結合を解離させることができる。これにより、リン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅを回収することができる。リン酸化したＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅを回収する際には、あらかじめＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させてから酵素反応に用いてもよいし、酵素反応後にＧＳＴ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅとグルタチオンビーズとを結合させてもよい。
また、アフィニティータグとしてヒスチジンを選択した場合、結合物質付固相は、例えばニッケルアガロースビーズを用いることができる。ヒスチジンとニッケルとの結合は、例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ等の酸や、イミダゾールを用いて解離することができる。
アフィニティータグとしてマルトース結合タンパク質を選択した場合。結合物質付固相は、例えばアミロース磁性ビーズを用いることができる。マルトース結合タンパク質とアミロースとの結合は、例えば、遊離のアミロースを添加することにより解離させることができる。
アフィニティータグとしてＦＬＡＧペプチドを選択した場合、結合物質付固相は、シグマ社のＦＬＡＧアフィニティーゲルを用いることができる。ＦＬＡＧペプチドとＦＬＡＧアフィニティーゲルとの結合は、例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ等の酸や、３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ社）を用いて解離させることができる。
アフィニティータグとしてＭｙｃタグを選択した場合、結合物質付固相は、例えばＭｙｃ抗体を結合したアガロースビーズを用いることができる。また、アフィニティータグとしてＨＡタグを選択した場合、結合物質付固相は、ＨＡ抗体を結合したアガロースビーズを用いることができる。ＭｙｃタグとＭｙｃ抗体との結合、ＨＡタグとＨＡ抗体との結合はどちらも、例えば、酸やアルカリを加えてタンパク質を変性させることにより、解離させることができる。この時、変性したタンパク質を元の状態に戻すことのできる酸又はアルカリを選択することが好ましい。具体的には、例えば、酸では塩酸等、アルカリでは水酸化ナトリウム等が挙げられる。
アフィニティータグとしてＳｔｒｅｐタグを選択した場合、結合物質付固相としてはＩＢＡ ＧｍｂＨ社のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ固相化ゲルカラムを用いることができる。ＳｔｒｅｐタグとＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎとの結合は、例えば、ストレプトアビジンと可逆的に反応するデスチオビオチンを用いて解離させることができる。
【００４４】
試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと基質とを酵素反応させた後、基質を回収する前に、加熱処理、冷却処理、又はＥＤＴＡ等を用いて酵素反応を停止させてもよい。基質の回収工程において、さらに酵素反応が進んでしまうことがあり、試料ごとに測定結果にバラつきを生じさせる原因となる可能性があるが、酵素反応を停止させることにより、これを回避することができる。
【００４５】
リン酸化された基質を検出するため、標識物質を用いる。標識物質としては、例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素等が挙げられるが、これに限定されない。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミン等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等が挙げられる。
【００４６】
リン酸化された基質を検出するため、リン酸化された基質に標識物質を結合させる。例えば、標識物質を有し且つリン酸化された基質に特異的に結合可能な抗体を用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。
あるいは、リン酸化された基質に特異的に結合可能な抗体（以下、リン酸化基質認識抗体とする）と、リン酸化基質認識抗体に結合可能な抗体（以下、二次抗体とする）であって且つ標識物質を有する抗体を用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。この場合、リン酸化基質認識抗体と二次抗体とを介して、標識物質をリン酸化された基質に実質的に結合させることができる。
あるいは、リン酸化基質認識抗体と、ビオチンを有する二次抗体と、標識物質を有するアビジンとを用いることにより、リン酸化された基質に標識物質を結合させることができる。この場合、リン酸化基質認識抗体と二次抗体とビオチンとアビジンとを介して、標識物質をリン酸化された基質に実質的に結合させることができる。なお、二次抗体がアビジンを有し、ビオチンが標識物質を有していてもよい。
あるいは、ビオチンを有するリン酸化基質認識抗体と、標識物質を有するアビジンとを用いてもよいし、アビジンを有するリン酸化基質認識抗体と、標識物質を有するビオチンとを用いてもよい。
標識物質が発するシグナルを検出することにより、リン酸化された基質を検出することができ、これにより膜貫通型チロシンキナーゼの活性を測定することができる。
【００４７】
上述したリン酸化基質認識抗体及び二次抗体は、動物に抗原を接触させて免疫を促し、この動物の血液を精製して得られた抗体、遺伝子組換えによって得られた抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いることができる。また、これらの抗体のうち少なくとも２種類を混合したものを用いることもできる。ここでいう抗体とは、抗体のフラグメント及びその誘導体も含む。具体例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ｓＦｖフラグメント等（Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５９：５８２１−５８３３及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６）が挙げられる。抗体のクラスはＩｇＧ、ＩｇＭ等を用いることができるが、これに限定されない。
【００４８】
リン酸化された基質の検出方法は、標識物質の種類により適宜選択される。標識物質が蛍光物質である場合、ウエスタンブロッティングによって基質のリン酸化を検出することができる。リン酸化された基質をメンブレンで分離し、リン酸化基質認識抗体を加えてリン酸化された基質と結合させ、さらに蛍光物質を有する二次抗体をリン酸化基質認識抗体に結合させ、この結合を検出すればよい。リン酸化された基質を、上述したアフィニティータグを用いてあらかじめ分離した場合は、ウエスタンブロッティングの代わりにスロットブロット法を用いて基質のリン酸化を検出することもできる。標識物質として、蛍光物質の代わりに酵素を用いることもできる。酵素を用いる場合、二次抗体の有する酵素を、基質に加えて発光反応させ、この発色を検出すればよい。
また、リン酸化された基質を含む溶液をチューブに収容し、蛍光物質を有するリン酸化基質認識抗体を加えてリン酸化された基質と結合させ、蛍光強度を測定することにより、基質のリン酸化を検出することもできる。
標識物質が酵素である場合、固相酵素免疫検定法（以下、ＥＬＩＳＡ法とする）によって基質のリン酸化を検出することができる。ＥＬＩＳＡ法には、直接吸着法及びサンドイッチ法が含まれる。
直接吸着法では、リン酸化された基質を固相の表面に吸着させ、酵素を有するリン酸化基質認識抗体を加え、リン酸化された基質と結合させる。次に、リン酸化基質認識抗体が有する酵素を、基質に加えて発色反応させ、この発色を検出すればよい。
サンドイッチ法では、固相にリン酸化基質認識抗体を結合させ（以下、固相抗体とする）、リン酸化された基質に加えて固相抗体と結合させる。次に、酵素を有するリン酸化基質認識抗体（以下、標識抗体とする）を加え、リン酸化された基質と結合させる。標識抗体の有する酵素を、基質に加えて発色反応させ、この発色を検出すればよい。
例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としてニトロテトラゾリウムブルークロライド（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェイト（ＢＣＩＰ）の混合溶液を用いて反応させ、発色させることができる。酵素がペルオキシダーゼである場合、基質としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて反応させ、発色させることができる。
サンドイッチ法を用いる場合、固相抗体と標識抗体とは、リン酸化された基質の異なる部位に結合することが好ましい。すなわち、リン酸化された基質に複数の抗体結合部位があるか、用いる２種類の抗体がリン酸化された基質の異なる抗原決定基を認識することが好ましい。
標識物質が放射性同位元素である場合、放射線免疫検出法（以下、ＲＩＡとする）によって基質のリン酸化を検出することができる。具体的には、放射性同位元素を有するリン酸化基質認識抗体をリン酸化された基質に結合させ、放射線をシンチレーションカウンター等によって測定し、基質のリン酸化を検出することができる。
【００４９】
このようにして、本実施形態の方法では、試料中の種々の膜貫通型チロシンキナーゼからなる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定する。そして、得られた包括的な活性値は、細胞に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性を反映したものである。ゆえに、上述した方法において、がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞を使用して包括的な活性値を測定する場合、得られた包括的な活性値に基づいて、腫瘍の再発リスク（すなわち、がんの再発リスク）を精度よく評価することが可能になる。
【００５０】
がんの再発リスクは、上述したような方法で得られた、試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて評価することができる。具体的には、得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と所定の閾値とを比較し、前記活性値が閾値より小さい場合に、がんの再発リスクが低いと評価することができる。
閾値は、測定対象の腫瘍細胞の種類等によって適宜決められる。閾値は、例えば、再発の有無が既知の複数のがん患者から得られた膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて設定することができる。具体的には、複数のがん患者から採取した悪性腫瘍の細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の情報と当該がん患者の再発の有無の情報とに基づいて、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群（例えば、再発リスクが高い群と低い群）に区別できる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の値を選択し、それを閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で閾値を設定することができる。複数の乳がん患者から採取された乳がん細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の情報と当該乳がん患者の摘出手術後５年間の再発の有無の情報に基づいて、当該乳がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できる膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の値を選択すればよい。
また、複数の閾値を設定することにより、当該がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）、中程度の群（中リスク群）、低い群（低リスク群）など多段階にがんの再発リスクを評価することも可能である。
【００５１】
上述したように、膜貫通型チロシンキナーゼは細胞のがん化に関わるものである。また、上記の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は、細胞膜に存在する様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値である。以上のことから、この膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を用いることにより、腫瘍細胞のがん化を精度よく捉えることができる。
よって、この第一の実施形態の判定方法を用いると、精度よく再発リスクを判定することができる。
【００５２】
また、本発明の第２の実施形態の判定方法は、上述した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータ（ＣＤＫパラメータ）とに基づいて、がんの再発リスクを判定するものである。
【００５３】
上記判定は、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較することにより行われる。
膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値との比較は、上述した第１の実施形態で示した方法と同様に行うことができる。なお、本実施形態では、上記の第１の実施形態で示した「閾値」を「第一の閾値」と表記する。
本実施形態では、さらに、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較する。
【００５４】
このＣＤＫパラメータは、腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータであればよい。ＣＤＫパラメータとしては、例えば、腫瘍細胞のＣＤＫの活性値と発現量との比（ＣＤＫ比活性）が挙げられる。さらに、腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が挙げられる。ＣＤＫパラメータとしては、ＣＤＫ比活性比がより好ましい。
【００５５】
ＣＤＫは、がん患者における悪性腫瘍の状態を正確に反映するパラメータとして知られている。ＣＤＫとは、サイクリンというタンパク質が結合することによって活性化される酵素の総称で、その種類に応じて細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫの種類としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７等が挙げられる。本実施形態では少なくとも２種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫ）を用いることが好ましく、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることが特に好ましい。すなわち、第一ＣＤＫがＣＤＫ１であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ２であるか、又は、第一ＣＤＫがＣＤＫ２であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ１であることが好ましい。
そして、好ましいＣＤＫパラメータとしては、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性の組み合わせ、又は、ＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が挙げられ、特にＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が好ましい。
【００５６】
第一ＣＤＫ比活性は、腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比であって、第一ＣＤＫの活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）を用いることができる。第二ＣＤＫ比活性は、腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比であって、第二ＣＤＫの活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）を用いることができる。
【００５７】
ＣＤＫ比活性比は、それぞれ上記のようにして求められた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比である。第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比としては、第一ＣＤＫ比活性を第二ＣＤＫ比活性で除することにより得られる値、第二ＣＤＫ比活性を第一ＣＤＫ比活性で除することにより得られる値等を用いることができる。
【００５８】
ＣＤＫ比活性比は、腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られる。
【００５９】
第二の閾値は、測定対象の腫瘍細胞等によって適宜決められる。第二の閾値は、例えば、再発の有無が既知の複数のがん患者から得られたＣＤＫパラメータに基づいて設定することができる。具体的には、複数のがん患者から採取した悪性腫瘍の細胞のＣＤＫパラメータの情報と当該がん患者の再発の有無の情報とに基づいて、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群（例えば、再発リスクが高い群と低い群）に区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で第二の閾値を設定することができる。複数の乳がん患者から採取された乳がん細胞のＣＤＫパラメータの情報と当該乳がん患者の摘出手術後５年間の再発の有無の情報に基づいて、当該乳がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できるＣＤＫパラメータの値を選択すればよい。
また、上記第一の閾値と組み合わせることによって、当該がん患者の集団を再発リスクが異なる群に区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。例えば、測定対象が乳がん由来の腫瘍細胞の場合、次のような方法で閾値を設定することができる。上記第一の閾値により区別された高リスク群及び／又は低リスク群を、さらに、再発リスクが高い群（高リスク群）と低い群（低リスク群）とに区別できるＣＤＫパラメータの値を選択し、それを第二の閾値とすればよい。
また、複数の第二の閾値を設定することにより、当該がん患者の集団を再発リスクが高い群（高リスク群）、中程度の群（中リスク群）、低い群（低リスク群）など多段階にがんの再発リスクを評価することも可能である。
【００６０】
ＣＤＫの活性値及び発現量の測定に供される測定用試料は、上記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値の測定に使用した腫瘍組織中の細胞を用いて調製される。ＣＤＫの活性値や発現量が測定できれば、その調製方法は特に限定されない。測定用試料としては、細胞可溶化液を用いることができる。細胞可溶化液とは、がん患者から採取した腫瘍組織に緩衝液を添加し、緩衝液中で腫瘍組織中の腫瘍細胞を物理的及び／又は化学的に破砕することにより得られる試料のことである。ＣＤＫの活性値又は発現量を測定する場合、細胞可溶化液を遠心分離して得られる上清を測定用試料として用いることが好ましい。ここで用いられる緩衝液には、界面活性剤やプロテアーゼインヒビター等を適宜含有させてもよい。
【００６１】
ＣＤＫの活性値及び発現量の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、上記特許文献１に開示の方法、特開２００７−６１０８８号公報に開示の方法等を用いることができる。
【００６２】
再発リスクの判定は、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、ＣＤＫパラメータと第二の閾値とを比較することにより行われる。例えば、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、ＣＤＫパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定することができる。
【００６３】
上述したように、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を用いることにより、腫瘍細胞のがん化を精度よく捉えることができる。
さらに、ＣＤＫは細胞の増殖に深く関わるため、ＣＤＫパラメータを用いることにより、腫瘍細胞の増殖能を精度よく捉えることができる。ここで、細胞の増殖能は、がんの再発リスクを左右する１つの大きな要素である。
よって、この第二の実施形態の判定方法を用いると、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値とＣＤＫパラメータの両方を用いることにより、さらに精度よく再発リスクを判定することができる。
【００６４】
上記本実施形態の方法は、コンピュータにおいて実行させることが好ましい。以下、上記第二の実施形態の判定方法を実施するためのコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。なお、ここで説明する第二の実施形態の判定方法では、ＣＤＫパラメータとして、ＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ比活性比）が使用されている。
【００６５】
図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けの記憶装置１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、記憶装置１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
【００６６】
図２は、上記第一の判定方法による再発リスク判定を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムは記憶装置（ハードディスク）１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により検体の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（以下、第一パラメータという）及びＣＤＫのパラメータであるＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性：ＣＤＫ比活性比）（以下、第二パラメータという）が入力されると、ＣＰＵ１１０ａが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。
【００６７】
ＣＰＵ１１０ａは、予めプログラムのデータとして記憶装置（ハードディスク）１１０ｄに記憶されていた第一パラメータに対応する第一の閾値、及び第二パラメータに対応する第二の閾値を呼び出す。そして、第一の閾値と第一パラメータデータとの比較、及び第二の閾値と第二パラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。
【００６８】
次に、ＣＰＵ１１０ａは、比較結果に基づいて再発リスクの予測判定を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０ａは、第一パラメータが第一の閾値未満であり、且つ第二パラメータが第二の閾値未満である場合には、再発リスク「低」と判定する。
【００６９】
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００７０】
なお、本実施形態においては、各種パラメータデータや活性値等を、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではなく、例えば、操作者による入力ではなく、各種パラメータデータや活性値等が測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介して自動的に取得されるようにしてもよい。また、ＣＤＫ比活性比として、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値及びＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。また、ディスプレイ１２０に出力するのは判定結果だけで限られず、例えば、第一パラメータ及び第二パラメータをそれぞれの閾値と比較した結果を判定結果と一緒に出力してもかまわない。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明の方法について、実施例に基づき、より具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００７２】
以下の実施例では、複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼの種類に対するユニバーサル基質を使用した。まず、基質を作製する方法を説明する。
【００７３】
チロシンキナーゼの基質の作製
４つのグルタミン酸残基と１つのチロシン残基とからなる配列が５回繰り返されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド（以下、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ペプチドとする）とＧＳＴとの融合タンパク質を作製し、この融合タンパク質を、膜貫通型チロシンキナーゼの種類にかかわらず膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化され得る基質として用いた。以下、この融合タンパク質をＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質とする。
【００７４】
ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質は、以下の方法で作製した。ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）をコードするＤＮＡ（配列番号２）、このＤＮＡの塩基配列を基に設計したセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）及びＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより得られた増幅産物（以下、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ＤＮＡとする）及びＧＳＴ融合タンパク質発現用のプラスミドベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を制限酵素（ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１）で処理し、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）ＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ−３に組み込み、組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームし、この大腸菌を液体培地（ＬＢ培地）中で培養液の吸光度（６００ｎｍ）が０．６になるまで培養した。この培養した大腸菌に１ｍＭ ＩＰＴＧ（培養液中の濃度）を添加して４時間培養し、発現を誘導した。次に、大腸菌を溶菌し、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いてＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を回収した。このＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質のアミノ酸配列を配列番号５に示した。
【００７５】
次に、作製したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が、種々の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されることを確認した。
【００７６】
参考例
ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質のリン酸化の検出
市販の膜貫通型チロシンキナーゼの細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＩＣＤ）を用いてＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質をリン酸化し、ウエスタンブロッティングによりリン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を検出した。なお、膜貫通型チロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから構成されており、細胞内ドメインにチロシンキナーゼの活性を示す部位が存在する。
【００７７】
（反応用試料の調製）
緩衝液１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２％プロテアーゼインヒビター（以下、ＰＩとする）、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）５０μｌと市販の膜貫通型チロシンキナーゼのＩＣＤ ０．５ｐｍｏｌとを混合し、これを反応用試料として以下の酵素反応に用いた。ここでは、ＩＣＤとして、ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ β Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＰＤＧＦＲ−βとする）、ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＶＥＧＦＲ１とする）、ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＶＥＧＦＲ２とする）、ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ１とする）、ＥｒｂＢ２ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ２とする）、ＥｒｂＢ４ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＨＥＲ４とする）、ＩＧＦ−１Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＩＧＦ１Ｒとする）（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。なお、緩衝液１とＰＤＧＦＲ−βとを混合したものを反応用試料ｉとし、緩衝液１とＶＥＧＦＲ１とを混合したものを反応用試料ｉｉとし、緩衝液１とＶＥＧＦＲ２とを混合したものを反応用試料ｉｉｉとし、緩衝液１とＨＥＲ１とを混合したものを反応用試料ｉｖとし、緩衝液１とＨＥＲ２とを混合したものを反応用試料ｖとし、緩衝液１とＨＥＲ４とを混合したものを反応用試料ｖｉとし、緩衝液１とＩＧＦ１Ｒとを混合したものを反応用試料ｖｉｉとする。
【００７８】
（酵素反応）
反応用試料ｉ２５μｌと、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む基質溶液１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ ＮＰ−４０、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、４０μＭ ＡＴＰ及び５μｇ ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む）２５μｌとを混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。この反応液に、ＳＤＳサンプルバッファーｐＨ６．８（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０％グリセロール、８％ ＳＤＳ、及び１０％ ２−メルカプトエタノールを含む）２５μｌを加え、１００℃で５分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をＳＤＳ用試料ｉ（＋）とする。同様にして、反応用試料ｉｉ〜ｖｉｉからＳＤＳ用試料ｉｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）を調製した。
【００７９】
また、反応用試料ｉ ２５μｌと、ＡＴＰを含まない基質溶液２（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ ＮＰ−４０、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、及び５μｇ ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を含む）２５μｌとを混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。この反応液に、上述したＳＤＳサンプルバッファー２５μｌを加え、１００℃で５分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をＳＤＳ用試料ｉ（−）とする。同様にして、反応用試料ｉｉ〜ｖｉｉからＳＤＳ用試料ｉｉ（−）〜ｖｉｉ（−）を調製した。基質溶液２は、ＡＴＰが含有されていない点を除いて、基質溶液１と同じ組成である。そして、ＳＤＳ用試料ｉ（−）〜ｖｉｉ（−）は、ＳＤＳ用試料ｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）のネガティブコントロールとして使用した。
【００８０】
（リン酸化されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質の検出）
各ＳＤＳ用試料をポリアクリルアミドゲル〔ＰＡＧミニ「第一」４／２０（１３Ｗ）（第一化学薬品株式会社）〕を別々のウェルに注入し、泳動槽〔カセット電気泳動槽「第一」ＤＰＥ−１０２０（ミニ２連式）（第一化学薬品株式会社）〕を用いて２５ｍＡで７０分間電気泳動した。電気泳動によって分離したタンパク質を、ミニトランスブロットセル（バイオラッド社）を用いて１００Ｖで１時間電圧をかけ、ポリアクリルアミドゲルからポリビニリデンフロライド（ＰＶＤＦ）メンブレン〔Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ ０．４５μｍ ポアサイズ（ミリポア社）〕に転写した。このＰＶＤＦメンブランを、４％ブロックエース（大日本住友製薬株式会社）溶液で６０分間ブロッキングした。ブロッキングしたＰＶＤＦメンブランを、一次抗体溶液〔０．４％ブロックエース及び０．５μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｌｏｎｅ ４Ｇ１０（ｕｐｓｔａｔｅ社）を含む〕２ｍｌ中で６０分間振とうした後、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）で３回洗浄した。次に、このＰＶＤＦメンブランを、二次抗体溶液〔０．４％ブロックエース及び２．７μｇ／ｍｌ抗マウスイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体 ＦＩＴＣ標識（ＤＡＫＯ社）を含む〕２ｍｌ中で６０分間振とうした後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。このＰＶＤＦメンブランを乾燥させ、画像解析装置〔Ｐｈａｒｏｓ ＦＸ ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社）〕を用いて解析し、蛍光を検出した。このようにしてウエスタンブロッティングにより、ＳＤＳ用試料ｉ（＋）〜ｖｉｉ（＋）及びＳＤＳ用試料ｉ（−）〜ｖｉｉ（−）に含まれるリン酸化されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を検出した。
【００８１】
図３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図中のｉは膜貫通型チロシンキナーゼとしてＰＤＧＦＲ−βを、ｉｉはＶＥＧＦＲ１を、ｉｉｉはＶＥＧＦＲ２を、ｉｖはＨＥＲ１を、ｖはＨＥＲ２を、ｖｉはＨＥＲ４を、ｖｉｉはＩＧＦ１Ｒを用いた場合の結果を示す。また、ｉ〜ｖｉｉの各写真においては、−は、ＡＴＰを含まない基質溶液２を用いて調製したＳＤＳ用試料から得られた結果である。＋は、ＡＴＰを含む基質溶液１を用いて調製したＳＤＳ用試料から得られた結果である。Ｐ−ＩＣＤは、自己リン酸化した膜貫通型チロシンキナーゼが発現する位置を示し、Ｐ−ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）は、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置を示している。
【００８２】
図３のｉ〜ｖｉｉの全ての＋において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置に単一のバンドが見られた。これより、上記（１）で作製されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が、多くの種類の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されることがわかった。
【００８３】
なお、図３のｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉ及びｖｉｉの−において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置にバンドが見られないのは、酵素反応において反応液にＡＴＰが含まれず、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質がリン酸化されなかったためであると考えられる。一方、図１のｉ及びｖの−において、リン酸化したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質が出現する位置に非常に薄いバンドが見られたが、この原因としては、検出に用いた抗体が非特異的に結合したため、又は、測定で使用した製品に微量のＡＴＰが混在していたため、等が考えられる。
【００８４】
実施例１
本例では、がん患者から採取した腫瘍細胞から膜貫通型チロシンキナーゼを含む反応用試料を調製し、ＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質を用いて測定用試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を測定し、この活性値に基づいてがんの再発リスクを判定した。
【００８５】
（１）反応用試料の調製
乳がん患者３１名（患者１〜３１）から摘出した腫瘍組織３１検体（約８〜１２５ｍｍ３）から下記のようにして反応用試料１〜３１を調製した。なお、３１検体についての、病理医の判定結果（ＴＮＭ分類、リンパ節転移の状態、がん組織の大きさ、術後５年間の再発の有無及び再発場所）を表１に示す。患者１〜３１には、早期がん（ステージＩ又はＩＩＡ）だけでなく、進行がん（ステージＩＩＢ又はＩＩＩＡ）も含まれている。
【００８６】
【表１】
【００８７】
表１中、「ＬＮ」は、手術時のリンパ節転移の状態を示し、「ａ」は所属リンパ節に転移が認められなかったもの、「ｂ」は所属リンパ節のうち１〜３個に転移が認められたもの、「ｃ」は所属リンパ節のうち４個以上に転移が認められたものに分類される。「Ｔ」は、手術時の原発巣のサイズを示し、腫瘍径２ｃｍ以下を「ａ」、腫瘍径２〜５ｃｍを「ｂ」、腫瘍径５ｃｍ以上を「ｃ」で示す。
【００８８】
反応用試料１〜３１の調製方法は以下のとおりである。
各腫瘍組織と細胞処理液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）１ｍｌとを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を破壊し、細胞溶液を調製した。得られた細胞溶液を遠心分離し、上清を廃棄して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞膜可溶化液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）、１０％グリセロール、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び５０ｍＭ ＮａＦを含む）とを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を可溶化し、遠心分離して上清を回収した。この上清を反応用試料として用いた。
【００８９】
（２）キナーゼ反応
各チューブに反応溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２％ ＰＩ、１０％グリセロール及び２００μＭ ＡＴＰを含む）５０μｌを入れ、その中に上記（１）で調製した反応用試料１〜３１をそれぞれ１０μｇ、及び参考例（１）において調製したＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質５μｇを加え、２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、５０μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、反応を停止させた。こうして得られた溶液を測定用試料１〜３１とする。
【００９０】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
測定用試料１〜３１にそれぞれ４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー３３μｌを添加し、１００℃で５分間加熱した。そして、加熱した測定用試料１〜３１をそれぞれ１３μｌずつ電気泳動槽（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１１１）にセットしたプレキャストゲル（ＰＡＧＥミニ第一４／２０）の別々のウェルに注入し、電気泳動を行った。電気泳動終了後、硝子板からウェルを外し、ミリポア社製Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬメンブラン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１ＥＪ０８４Ｅ０３）にゲルのタンパク質を転写した。タンパク質転写後のメンブランをブロックエース（大日本住友製薬製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＫ−Ｂ８０）に漬け、１時間室温でブロッキングした。その後、１×ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄することを３回繰り返した。そのメンブランを、１／１０希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した一次抗体〔ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｌｏｎｅ ４Ｇ１０（ＵＰＳＴＡＴＥ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．０５−３２１）〕液に漬け、１時間室温で振とうさせた。その後、１×ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄することを３回繰り返した。そして、１／１０希釈したブロックエースで１０００倍に希釈した二次抗体〔ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ／ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ０２６１）〕液に漬け、１時間室温で振とうさせ、１×ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄することを３回繰り返した。メンブランを乾燥させ、シグナルをイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＥＲ ＦＸ）で検出し、バンドの濃さを数値化したものを活性値とした。
【００９１】
（４）閾値の設定
乳がん患者３１名を手術後５年間に再発したか否かで再発グループと非再発グループとに分け、患者のグループ（横軸）に対して乳がん患者３１名について測定した膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を縦軸としたグラフを作成した。そのグラフを図４に示す。そして、再発グループと非再発グループとを高値群と低値群とに分離できる活性値を閾値とした。閾値は１０００００であり、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が閾値（１０００００）より小さい場合を再発リスクが小さい（再発リスク「低」）と判断した。
【００９２】
（５）再発リスク判定
表１及び図４に示された結果から、乳がん患者３１例のうち術後５年間で再発を起こしたのは１０例であった（再発率３２％）。一方、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて再発リスクを判定した場合、図４に示された結果から、乳がん患者３１例のうち７例が再発リスク「低」と判定され、この７例のうち術後５年間で再発を起こしたのは１例であった（再発率１４％）。
【００９３】
以上より、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較することにより再発リスクが低い群を分類することができ、再発を起こすか否かを予測することができる。また、この予測結果を、早期がんだけでなく進行がんの患者の治療方針を決定する際の指標とすることができる。
【００９４】
実施例２
本例では、実施例１と同じがん患者から採取した腫瘍細胞を用い、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値とＣＤＫ比活性比とを測定し、この活性値及びＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定した。
なお、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値は実施例１で測定した値を使用する。
【００９５】
（１）ＣＤＫ測定用試料の調製
実施例１で使用した腫瘍組織３１検体について、緩衝液中の腫瘍組織が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａ〔０．１ｗ／ｖ％ ノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４及び１００μｌ／ｍｌプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む〕と腫瘍組織とをチューブに収容した。
電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍組織をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清をＣＤＫ測定用試料として用いた。
【００９６】
（２）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、ＣＤＫ測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンにＣＤＫ測定用試料中のタンパク質を吸着させた。
ウェルに洗浄液Ｂ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％ ＢＳＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにビオチン化した抗ウサギＣＤＫ１抗体（二次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で約３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノールで約５分間濯ぎ、約２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社）によって分析、測定した。測定値は検量線をもとに算出した。
【００９７】
検量線は、０．００５％ノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより作成した。
【００９８】
ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は、上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行った。
【００９９】
（３）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらにＣＤＫ測定用試料を添加した。ＣＤＫ測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。
ここに抗ＣＤＫ１抗体（サンタクルズ社）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社）を加えて４℃で１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。
反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／Ｖ％ ノニデットＰ−４０及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含む）で３回洗浄し、１５μｌの緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー社）１０μｇ、５ｍＭ ＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間振とうしてキナーゼ反応を行い、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。
この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭ ヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）とを添加して室温で９０分間、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基が導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。
ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールを添加することより行った。
ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％ ＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で１時間反応させた。
反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで３回洗浄した。
洗浄後、蛍光イメージアナライザＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社）を用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行った。活性値は、検量線に基づいて算出された。
【０１００】
検量線は、２種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。したがって、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【０１０１】
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズ社）を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【０１０２】
（４）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
【０１０３】
（５）閾値の設定
ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性＝ＣＤＫ比活性比）に対応する第二の閾値を設定し、この第二の閾値とＣＤＫ比活性比とを比較した結果と、実施例１の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値（第一の閾値）とを比較した結果とを組み合わせてがんの再発リスクの判定を行った。
【０１０４】
乳がん患者３１名のＣＤＫ比活性比（横軸）に対して膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値を縦軸としたグラフを作成した。そのグラフを図５に示す。第一の閾値は、実施例１と同じく１０００００とした。そして、第二の閾値は、１５に設定した。この値は、ＣＤＫ比活性比を高値群と低値群とに分離できる値である。膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第一の閾値（１０００００）より小さく、且つ、ＣＤＫ比活性比が第二の閾値（１５）より小さい場合に、再発リスクが小さい（再発リスク「低」）と判断した。
【０１０５】
（６）再発リスク判定
図５に示された結果から、乳がん患者３１例のうち２８例が、そのＣＤＫ比活性比が第二の閾値（１５）未満であった。その２８例のうち、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が第１の閾値（１０００００）未満であった例は６例であり、この６例が再発リスク「低」と判断された。そして、この６例のうち術後５年間で再発を起こしたのは０例であった。
【０１０６】
以上より、膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値との比較結果と、ＣＤＫのパラメータであるＣＤＫ比活性比と第二の閾値との比較結果とを組み合わせることにより再発リスクが低い群を分類することができ、再発を起こすか否かをより精度よく予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本実施形態の方法を実施するためのコンピュータシステムの概略図である。
【図２】第一の実施形態の判定方法に基づいた判定フローである。
【図３】本実施形態で作製されたＧＳＴ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質の、膜貫通型チロシンキナーゼによるリン酸化を検出した結果である。
【図４】患者のグループ（横軸）と膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（縦軸）との関係を示すグラフである。
【図５】ＣＤＫ比活性比（横軸）と膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値（縦軸）との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０８】
１００ システム
１１０ コンピュータ本体
１１０ａ ＣＰＵ
１１０ｂ〜１１０ｄ 記憶装置
１１０ｅ 読出装置
１１０ｆ 入出力インターフェイス
１１０ｈ 画像出力インターフェイス
１１０ｉ バス
１２０ ディスプレイ
１３０ 入力デバイス
１４０ 外部記録媒体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法。
【請求項２】
前記判定が、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較し、前記活性値が閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが低いと判定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が、
がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、
前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、
前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、
前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料調製工程が、前記腫瘍組織中の細胞を緩衝液中で破砕し、破砕された細胞と界面活性剤を含む溶液とを混合し、得られた混合液の上清を採取することにより膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記膜貫通型チロシンキナーゼが、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）及び血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）を含む請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い複数種類の基質の混合物、又は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質である請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ユニバーサル基質が、グルタミン酸残基及びチロシン残基を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータとに基づいて、がんの再発リスクを判定する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記判定が、
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、
前記ＣＤＫのパラメータと第二の閾値とを比較し、
前記活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、前記ＣＤＫのパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤＫのパラメータが、前記腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに前記腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、前記第一ＣＤＫ比活性と前記第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）である請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＫ比活性比が、
前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、
前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、
前記第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、
前記比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られ、
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値及び前記ＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定する請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
腫瘍細胞の膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値に基づいて、がんの再発リスクを判定することを特徴とするがんの再発リスクの判定方法。
【請求項２】
前記判定が、前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と閾値とを比較し、前記活性値が閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが低いと判定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値が、
がん患者から採取した腫瘍組織中の細胞から細胞質を分離して、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する試料調製工程と、
前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼと、少なくとも２種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対する基質とを接触させて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性により前記基質をリン酸化する接触工程と、
前記リン酸化された基質を検出する検出工程と、
前記検出結果に基づいて、前記試料中の膜貫通型チロシンキナーゼの活性値を測定する測定工程と、によって得られる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料調製工程が、前記腫瘍組織中の細胞を緩衝液中で破砕し、破砕された細胞と界面活性剤を含む溶液とを混合し、得られた混合液の上清を採取することにより膜貫通型チロシンキナーゼを含む試料を調製する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記膜貫通型チロシンキナーゼが、インスリン様増殖因子受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＥＲ）及び血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）を含む請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が、特定の膜貫通型チロシンキナーゼに対して特異性の高い複数種類の基質の混合物、又は、様々な種類の膜貫通型チロシンキナーゼに対するユニバーサル基質である請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ユニバーサル基質が、グルタミン酸残基及びチロシン残基を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と、さらに、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて得られるＣＤＫのパラメータとに基づいて、がんの再発リスクを判定する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記判定が、
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値と第一の閾値とを比較し、
前記ＣＤＫのパラメータと第二の閾値とを比較し、
前記活性値が第一の閾値よりも小さく、且つ、前記ＣＤＫのパラメータが第二の閾値よりも小さい場合に、がんの再発リスクが小さいと判定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤＫのパラメータが、前記腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）並びに前記腫瘍細胞の第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）に基づいて得られる、前記第一ＣＤＫ比活性と前記第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）である請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＫ比活性比が、
前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの活性値及び第二ＣＤＫの活性値を測定する活性測定工程と、
前記腫瘍細胞から第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量を測定する発現測定工程と、
前記第一ＣＤＫの活性値と発現量との比（第一ＣＤＫ比活性）、及び前記第二ＣＤＫの活性値と発現量との比（第二ＣＤＫ比活性）を算出する比活性算出工程と、
前記比活性算出工程により得られた第一ＣＤＫ比活性と第二ＣＤＫ比活性との比（ＣＤＫ比活性比）を算出する比活性比算出工程と、によって得られ、
前記膜貫通型チロシンキナーゼの包括的な活性値及び前記ＣＤＫ比活性比に基づいてがんの再発リスクを判定する請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【公開番号】特開２００９−８９６７２（Ｐ２００９−８９６７２Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６４６１３（Ｐ２００７−２６４６１３）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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