アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キット
【課題】 試料中のアシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を高感度、高精度かつ短時間で測定することができ、しかも、アシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させ、診断基準を統一することができる、アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを提供する。
【解決手段】 アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも、第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板、第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体、前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質および前記標識物質と反応して発色する基質を包含することを特徴とする。
【解決手段】 アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも、第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板、第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体、前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質および前記標識物質と反応して発色する基質を包含することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アシアロＧＭ１（アシアロガングリオシド）は、ガングリオシド（シアル酸を構成糖とするスフィンゴ糖脂質の総称）よりシアル酸残基がはずれたもので、糖脂質の一種である。
このアシアロＧＭ１は、各種疾患の検査にマーカーとして利用されている。たとえば、急性に発症する神経炎の一種であるギラン・バレー症候群や自己免疫性神経疾患等の検査に利用したり、また、腸管障害の検査に利用することも提案されている（特許文献１参照）。たとえば、この特許文献１記載の検査においては、マウスの糞便中のアシアロＧＭ１とフコシルアシアロＧＭ１の含量を、抗アシアロＧＭ１抗体と抗フコシルアシアロＧＭ１抗体を利用した薄層クロマトグラフィ免疫染色法で測定することで、腸管障害を検査している。
【０００３】
しかしながら、特許文献１記載のような薄層クロマトグラフィを用いた検査では、抽出操作や薄層クロマトグラフィプレート上での展開操作も必要であり、長時間を要するという問題があった。
【０００４】
一方、目的の被測定物質を試料中から、高い検出感度で、しかも簡便な測定操作で検出および測定できる、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法（ＥＬＩＳＡ法）が知られているが、このＥＬＩＳＡ法をアシアロＧＭ１の検出に適用した場合、検査実施機関ごとに使用している試薬類やそのグレードの違いや、検出用抗体である抗アシアロＧＭ１抗体の由来やグレード等（たとえば、ＩｇＧやＩｇＭ等といったサブクラスの違い、ポリクローナルやモノクローナル等といったクローン、つまり抗原認識部位の違い等）が統一されていないため、交差反応等の影響により検査データに誤差が生じ、検査実施機関によって診断結果が異なる、つまり診断基準が統一できないという問題があった。
【特許文献１】特開平6-265542号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来のアシアロＧＭ１の免疫学的測定技術の問題点を解決すべく、試料中のアシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を高感度、高精度かつ短時間で測定することができ、しかも、アシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させ、診断基準を統一することができる、新しいアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とし、第２には、結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれビオチンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする。
【０００７】
また、本願発明は、第３には、上記第１または第２の発明を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる工程；
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【０００８】
第４には、アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする。
【０００９】
第５には、上記第４の発明を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体に、第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜４＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【００１０】
さらに、本願発明は、第６には、抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする。
【００１１】
そして、第７には、上記第６の発明を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本願第１から第５の発明によれば、アシアロＧＭ１を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮でき、しかも、アシアロＧＭ１を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができる。
【００１３】
また、第６および第７の発明によれば、抗アシアロＧＭ１抗体を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮でき、しかも、抗アシアロＧＭ１抗体を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１５】
本願発明は、自己免疫性神経疾患の検査マーカーである、生体成分（特に血中）に含まれるアシアロＧＭ１（アシアロガングリオシド）または抗アシアロＧＭ１抗体を測定の対象とした、免疫学的測定キットである。
【００１６】
すなわち、図１に例示したように、本願発明は、第１に、このアシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも、
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としてのビオチン等の結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合するストレプトアビジン等の結合性物質Ｂで修飾された酵素や蛍光タンパク質等の標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴としている。さらに、必要に応じて、発色を停止させるため、塩酸や硫酸等の発色停止剤を具備してもよい。
【００１７】
このアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いた測定方法について説明すると、まず、試験管や培養シャーレ、測定プレート等の基板（担体）上に、第１抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を固定した、第１抗体固相化基板を用意する。このとき、第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体は、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。なお、アシアロＧＭ１との特異的な結合反応を高めるには、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１８】
第１工程として、前記第１抗体固相化基板に、たとえば、ヒトやサル、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ等の生体から公知の方法で被測定試料（たとえば、血液）を採取し、必要に応じて前処理を行って希釈調整した被測定試料を接触させることで、第１抗体固相化基板の第１抗体と被測定試料中に含まれるアシアロＧＭ１とを結合させる。もちろん、被測定試料の由来は、上記生体由来である天然の試料に限定されるものではない。
【００１９】
つづいて、第２工程として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やトリス緩衝液（ＴＢＳ）等の洗浄液で、第２工程における余分な成分（たとえば、未結合のアシアロＧＭ１等）を洗浄した後、前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させることで、被測定試料中に含まれるアシアロＧＭ１に、第２抗体がさらに結合し、アシアロＧＭ１は、第１抗体と第２抗体との間に挟まれた状態（サンドイッチ）となる。このとき、第２抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよい。なお、洗浄液には、必要に応じて、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ-２０（登録商標）やＴｒｉｔｏｎ-Ｘ（登録商標）等や、ブロッキング剤としてスキムミルクやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を含有させてもよい。
【００２０】
第３の工程として、第２工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の第２抗体等）を洗浄した後、前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる。この結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂの両物質による結合は特異的で強いことや、その取り扱いの容易性から、この結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれ、たとえば、ビオチンまたはストレプトアビジン等の生体結合性物質であることが好ましい。つまり、結合性物質Ａがビオチンの場合は、結合性物質Ｂはストレプトアビジンとし、一方、結合性物質Ａがストレプトアビジンの場合は、結合性物質Ｂはビオチンとする。また、標識物質は、たとえば、西洋わさび由来ペルオキシターゼ等の酵素や、緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、放射線物質、また、サマリウム、ユウロピウム、テルビウム等のランタノイド等が使用できる。
【００２１】
第４の工程として、第２工程および第３工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の標識物質等）を洗浄した後、前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる。このとき、基質は、標識物質に合わせたものを適宜に採択する。たとえば、標識物質がペルオキシターゼの場合、基質としてｏ-フェニレンジアミンを使用することで、基質を発色させることができる。
【００２２】
そして、第５の工程として、上記第１の工程から第４の工程によって、基質の発色を、吸光度測定器、分光光度計や蛍光測定器、マルチラベルカウンター等で測定する。
【００２３】
なお、第４の工程の発色操作の後に、必要に応じて、発色停止剤を添加し、基質の発色反応を停止してもよい。この発色停止剤は、標識物質と基質の発色反応系に合わせて適宜に選択する。たとえば、標識物質がペルオキシターゼで、基質がｏ-フェニレンジアミンである発色反応系の場合には、塩酸を利用して発色を停止させることができる。
【００２４】
また、本願発明は、図２に例示したように、第２に、上記アシアロＧＭ１の測定において、
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を特徴とした測定キットでもよい。
【００２５】
この場合、基本的な工程および使用できる抗体の由来、標識物質の種類等は、上記第１の測定方法とほぼ同様であるが、第２抗体である抗アシアロＧＭ１抗体（モノクロ−ナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい）を認識して結合する、標識物質で修飾された標識抗体を用いるため、第２抗体には標識物質による修飾は施されていない。また、この第２の測定キットおよびこの測定キットを用いた測定方法においても、必要に応じて、上記のような発色を停止させる発色停止操作を行ってもよい。
【００２６】
このような本願発明の測定においては、対象となる被測定物質を含む試料とともに、基準となる既知濃度の標準物質（本願発明において、アシアロＧＭ１）を同時測定することで、試料中のアシアロＧＭ１を正確に定量することができる。この測定結果は、抗アシアロＧＭ１抗体の特異性や活性、また、標準物質でアシアロＧＭ１の純度に左右されるが、特に本願発明のアシアロＧＭ１は精製度の高い方法で調製している。たとえば、ウシ脳やラット脳から抽出したり、また、免疫したウサギより採血し、血清を分離採取したものを硫酸アンモニウムにて塩析後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に透析してγグロブリン分画を取得したりする。
【００２７】
このような本願発明によって、ギラン・バレー症候群や自己免疫性神経疾患等の検査および診断ために、その検査マーカーである血中等のアシアロＧＭ１を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮できる。しかも、抗体等を含めた測定試薬を「測定キット」として統一することで、アシアロＧＭ１を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができ、医療機関における診断結果の正確性および信頼性を向上させることができる。
【００２８】
そして、第３に、本願発明は、図３に例示したように、抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し、結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットでもある。具体的には、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体（ＩｇＧタイプ、ＩｇＭタイプを問わない）と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴としている。このとき、試料中の抗アシアロＧＭ１抗体のタイプとしては、上記のとおり、ＩｇＧタイプおよびＩｇＭタイプを問わないため、標識抗体は、たとえば、抗ヒトＩｇＧ抗体でもよいし、抗ヒトＩｇＭ抗体でもよい。また、発色停止剤を具備してもよい。
【００２９】
そして、この抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法としては、少なくとも以下の工程
＜１＞前記アシアロＧＭ１固相化基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴としており、基本的な工程は上記第１および第２のアシアロＧＭ１測定キットを用いた測定方法とほぼ同様であり、測定対象を、たとえば、血中の「抗アシアロＧＭ１抗体」としている点で異なる。
【００３０】
この抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法においても、必要に応じて発色操作の後に塩酸や硫酸等の発色停止剤を添加してもよい。
【００３１】
本願発明における、抗アシアロＧＭ１抗体は、市販のものでもよいし、公知である種々の抗体作製方法によって作製することもできる。たとえば、抗原感作させたラットやマウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の動物の血清免疫グロブリンの画分から、抗原アフィニティーカラム等を利用して精製したり（ポリクローナル抗体）、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させて融合細胞を作製する細胞融合法を利用して抗体を作製したり（モノクローナル抗体）、さらに遺伝子組換え技術によっても抗体を作製することができる（モノクローナル抗体）。
【００３２】
一般に、ポリクローナル抗体と比べ、モノクローナル抗体には以下の問題がある。すなわち、（１）モノクローナル抗体は、結合性の弱い抗体しか得ることができない場合があり、検出感度が低下する可能性があった。また、（２）モノクローナル抗体には交差反応を示すものもあるため、この場合は、結合性の強い抗体であっても正確性を欠くことが予想できる。さらに、（３）モノクローナル抗体作製には多くの時間とコストを要すること、および、免疫原となるアシアロＧＭ１は、正常マウスにとって自己成分であることから、通常の方法による抗アシアロＧＭ１モノクローナル抗体の大量生産は困難であった。このような問題を解消するため、本願発明における抗アシアロＧＭ１抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００３３】
また、抗体を標識物質で修飾するには、たとえば、その扱い易さや結合強度から、ビオチンやストレプトアビジン等のような生体結合性物質を利用することが考慮できる。
【００３４】
以下に実施例を説明し、さらに詳しく本願発明のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットについて説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：アシアロＧＭ１の免疫学的定量測定
図１に沿って、アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット（ＥＬＩＳＡキット）について説明する。
【００３６】
（１）抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体が固定化されている９６穴マイクロプレートを基板（担体）として利用した。なお、基板への抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体の固定化には、炭酸緩衝液（ｐＨ ９．６）にて希釈して、たとえば、９６穴マイクロプレートを基板（担体）とした場合には、各穴に１００μＬずつ添加し、４℃にて一晩静置してインキュベーションすることで、固定化させた。
【００３７】
（２）各穴に、３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（以下、ＰＢＳ−Ｔとする）を添加して、洗浄することを３回繰り返して行った。洗浄後、余分なＰＢＳ−Ｔを、可能な限り除去した。
【００３８】
（３）非特異的な吸着を防止するため、１％（Ｗ/Ｖ）のウシ血清アルブミン含有のリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡとする）を、全穴に２００μＬずつ添加し、プレートにシールし、室温（２０〜２５℃）にて１時間、反応させブロッキングを行った。その後、ＰＢＳ−ＢＳＡを捨て、可能な限り除去した。
【００３９】
（４）試料として、患者血清を１００μＬずつ添加した。また、患者血清中のアシアロＧＭ１濃度を算出するために、精製アシアロＧＭ１（和光純薬製：凍結乾燥品をあらかじめエタノール１ｍＬにて溶解し、使用まで−２０℃にて保存）を、１％（Ｗ/Ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒとする）にて、０．２、１、５、２５、１２５（ｎｇ／ｍＬ）に希釈し、それぞれを各穴に１００μＬずつ添加した。なお、対照として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。そして、プレートにシールして、室温で２時間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４０】
（５）次に、再度ＰＢＳ―Ｔで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン溶液で希釈した、２次抗体であるビオチン標識抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体を、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて０．２５μｇ/ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬずつ分注し、プレートにシールをして室温（２０〜２５℃）で２時間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４１】
（６）各穴を、またＰＢＳ‐Ｔで５回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン溶液で希釈したストレプトアビジン‐西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（和光純薬製）を、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて１０，０００倍希釈し、プレートの各穴に１００μＬずつ分注し、室温（２０〜２５℃）で３０分間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４２】
（７）各穴をＰＢＳ‐Ｔで８回洗浄した後、基質液として、１％のＨ２Ｏ２と１μｇ/ｍＬのｏ−フェニレンジアミン溶液との混合液（和光純薬製）を調製し、これを各穴に１００μＬずつ添加し、プレートにシールを貼付して３７℃で３０分間反応させた。
【００４３】
（８）その後、反応停止液として、２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を各穴に１００μＬずつ添加し静かに攪拌し、反応を停止させ、波長４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（マルチラベルカウンター、ＡＲＶＯ１４２０）にて測定した。その結果、顕著な発色を検出することができた。つまり、血中のアシアロＧＭ１を検出することができた。なお、精製アシアロＧＭ１を添加していない箇所の測定結果を、ブランクとした。
【００４４】
（９）結果、濃度既知の精製アシアロＧＭ１の吸光度を縦軸に、濃度を横軸にとり、検量線を求めた（図４）。吸光度は、試料中のアシアロＧＭ１および標準物質である精製アシアロＧＭ１と結合したビオチン標識抗アシアロＧＭ１抗体量と比例するので、各試料中のアシアロＧＭ１の濃度は、試料の吸光度と検量線との交点より求められ、定量することができた。
実施例２：抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的定量測定
図３に沿って、抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キット（ＥＬＩＳＡキット）について説明する。
【００４５】
（１）アシアロＧＭ１が固定化されている９６穴マイクロプレートを基板（担体）として利用した。なお、基板へのアシアロＧＭ１（和光純薬製；凍結乾燥品をエタノール１ｍＬにて溶解したもので、使用まで−２０℃にて保存）の固定化には、エタノールにて１μｇ/ｍＬに希釈して、たとえば、９６穴マイクロプレートを基板（担体）の各穴に１００μｌずつ添加し、室温（２０〜２５℃）にて４時間静置し、各穴を乾燥することで、固定化させた。
【００４６】
（２）各穴に、３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（以下、ＰＢＳ−Ｔとする）を添加して、洗浄することを３回繰り返して行った。洗浄後、余分なＰＢＳ−Ｔを、可能な限り除去した。
【００４７】
（３）非特異的な吸着を防止するため、１％（Ｗ/Ｖ）のウシ血清アルブミン含有のリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡとする）を、全穴に２００μＬずつ添加し、プレートにシールし、室温（２０〜２５℃）にて１時間、反応させブロッキングを行った。その後、ＰＢＳ−ＢＳＡを捨て、可能な限り除去した。
【００４８】
（４）定量用として抗アシアロGM1ポリクローナル抗体（和光純薬製）を、１％（Ｗ/Ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒとする）にて１００倍〜６４００倍まで倍々に希釈したもの、および試料としての患者血清をＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍希釈したものそれぞれを、プレートの各穴に１００μＬずつ添加した。また、陰性対照（ネガティブコントロール）として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。そして、プレートにシールして、４℃にて一晩反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４９】
（５）再度、ＰＢＳ-Ｔで３回洗浄した。その後、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで０．２５μｇ/ｍＬに希釈したビオチン標識抗ヒトＩｇＧ抗体またはビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれも、和光純薬製）を、試料を加えた各穴に１００μＬずつ分注した。また、抗アシアロＧＭ１抗体を加えた穴には、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで０．２５μｇ/ｍＬに希釈した、２次抗体としてのビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（和光純薬製）を１００μＬ加えた。そして、プレートにシールをして、室温（２０〜２５℃）で２時間反応させた。なお、陰性対照（ネガティブコントロール）として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００５０】
（６）各穴をＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで、１００００倍に希釈したストレプトアビジン‐西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（和光純薬製）を、各穴に１００μｌずつ分注し、プレートにシールをして、室温（２０〜２５℃）で３０分間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００５１】
（７）そして、各穴をＰＢＳ−Ｔで８回洗浄した後、基質液として、１％のＨ２Ｏ２と１μｇ/ｍＬのｏ−フェニレンジアミン溶液との混合液（和光純薬製）を調製し、これを各穴に１００μＬずつ添加し、プレートにシールを貼付して３７℃で３０分間反応させた。
【００５２】
（８）その後、反応停止液として、２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を各穴に１００μＬずつ添加して静かに攪拌し、発色を停止させ、波長４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（マルチラベルカウンター、ＡＲＶＯ１４２０）にて測定した。結果、顕著な発色を検出することができた。つまり、血中の抗アシアロＧＭ１抗体を検出することができた。なお、精製アシアロＧＭ１を添加していない箇所を、ブランクとした。
【００５３】
（９）以上の方法により測定した抗アシアロＧＭ１抗体の吸光度を縦軸に、抗体の希釈倍数を横軸にとり標準曲線を求めた（図５）。標準曲線は、シグモイド曲線となり、抗体の最高吸光度の半値（５０％値）を示す時の希釈倍数を標準曲線より求めた。このときの抗体の結合活性を１ｕｎｉｔと規定した。試料の吸光度と標準曲線との交点より、試料中の抗アシアロＧＭ１抗体活性（ｕｎｉｔ）を求めた。そして、試料を１００倍希釈して測定したため、求めた抗アシアロＧＭ１抗体活性を１００倍して、補正し、血清中の抗アシアロＧＭ１抗体活性とした。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本願発明にかかるアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法の工程を例示した模式図である。
【図２】本願発明にかかるアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法における、別の実施形態での工程を例示した模式図である。
【図３】本願発明にかかる抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法の工程を例示した模式図である。
【図４】本願発明における標準物質である精製アシアロＧＭ１の検量線を示した図である。
【図５】本願発明における抗アシアロＧＭ１抗体の標準曲線を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アシアロＧＭ１（アシアロガングリオシド）は、ガングリオシド（シアル酸を構成糖とするスフィンゴ糖脂質の総称）よりシアル酸残基がはずれたもので、糖脂質の一種である。
このアシアロＧＭ１は、各種疾患の検査にマーカーとして利用されている。たとえば、急性に発症する神経炎の一種であるギラン・バレー症候群や自己免疫性神経疾患等の検査に利用したり、また、腸管障害の検査に利用することも提案されている（特許文献１参照）。たとえば、この特許文献１記載の検査においては、マウスの糞便中のアシアロＧＭ１とフコシルアシアロＧＭ１の含量を、抗アシアロＧＭ１抗体と抗フコシルアシアロＧＭ１抗体を利用した薄層クロマトグラフィ免疫染色法で測定することで、腸管障害を検査している。
【０００３】
しかしながら、特許文献１記載のような薄層クロマトグラフィを用いた検査では、抽出操作や薄層クロマトグラフィプレート上での展開操作も必要であり、長時間を要するという問題があった。
【０００４】
一方、目的の被測定物質を試料中から、高い検出感度で、しかも簡便な測定操作で検出および測定できる、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法（ＥＬＩＳＡ法）が知られているが、このＥＬＩＳＡ法をアシアロＧＭ１の検出に適用した場合、検査実施機関ごとに使用している試薬類やそのグレードの違いや、検出用抗体である抗アシアロＧＭ１抗体の由来やグレード等（たとえば、ＩｇＧやＩｇＭ等といったサブクラスの違い、ポリクローナルやモノクローナル等といったクローン、つまり抗原認識部位の違い等）が統一されていないため、交差反応等の影響により検査データに誤差が生じ、検査実施機関によって診断結果が異なる、つまり診断基準が統一できないという問題があった。
【特許文献１】特開平6-265542号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来のアシアロＧＭ１の免疫学的測定技術の問題点を解決すべく、試料中のアシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を高感度、高精度かつ短時間で測定することができ、しかも、アシアロＧＭ１や抗アシアロＧＭ１抗体を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させ、診断基準を統一することができる、新しいアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とし、第２には、結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれビオチンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする。
【０００７】
また、本願発明は、第３には、上記第１または第２の発明を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる工程；
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【０００８】
第４には、アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする。
【０００９】
第５には、上記第４の発明を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体に、第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜４＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【００１０】
さらに、本願発明は、第６には、抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする。
【００１１】
そして、第７には、上記第６の発明を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本願第１から第５の発明によれば、アシアロＧＭ１を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮でき、しかも、アシアロＧＭ１を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができる。
【００１３】
また、第６および第７の発明によれば、抗アシアロＧＭ１抗体を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮でき、しかも、抗アシアロＧＭ１抗体を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１５】
本願発明は、自己免疫性神経疾患の検査マーカーである、生体成分（特に血中）に含まれるアシアロＧＭ１（アシアロガングリオシド）または抗アシアロＧＭ１抗体を測定の対象とした、免疫学的測定キットである。
【００１６】
すなわち、図１に例示したように、本願発明は、第１に、このアシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも、
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としてのビオチン等の結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合するストレプトアビジン等の結合性物質Ｂで修飾された酵素や蛍光タンパク質等の標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴としている。さらに、必要に応じて、発色を停止させるため、塩酸や硫酸等の発色停止剤を具備してもよい。
【００１７】
このアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いた測定方法について説明すると、まず、試験管や培養シャーレ、測定プレート等の基板（担体）上に、第１抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を固定した、第１抗体固相化基板を用意する。このとき、第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体は、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。なお、アシアロＧＭ１との特異的な結合反応を高めるには、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１８】
第１工程として、前記第１抗体固相化基板に、たとえば、ヒトやサル、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ等の生体から公知の方法で被測定試料（たとえば、血液）を採取し、必要に応じて前処理を行って希釈調整した被測定試料を接触させることで、第１抗体固相化基板の第１抗体と被測定試料中に含まれるアシアロＧＭ１とを結合させる。もちろん、被測定試料の由来は、上記生体由来である天然の試料に限定されるものではない。
【００１９】
つづいて、第２工程として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やトリス緩衝液（ＴＢＳ）等の洗浄液で、第２工程における余分な成分（たとえば、未結合のアシアロＧＭ１等）を洗浄した後、前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させることで、被測定試料中に含まれるアシアロＧＭ１に、第２抗体がさらに結合し、アシアロＧＭ１は、第１抗体と第２抗体との間に挟まれた状態（サンドイッチ）となる。このとき、第２抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよい。なお、洗浄液には、必要に応じて、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ-２０（登録商標）やＴｒｉｔｏｎ-Ｘ（登録商標）等や、ブロッキング剤としてスキムミルクやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を含有させてもよい。
【００２０】
第３の工程として、第２工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の第２抗体等）を洗浄した後、前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる。この結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂの両物質による結合は特異的で強いことや、その取り扱いの容易性から、この結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれ、たとえば、ビオチンまたはストレプトアビジン等の生体結合性物質であることが好ましい。つまり、結合性物質Ａがビオチンの場合は、結合性物質Ｂはストレプトアビジンとし、一方、結合性物質Ａがストレプトアビジンの場合は、結合性物質Ｂはビオチンとする。また、標識物質は、たとえば、西洋わさび由来ペルオキシターゼ等の酵素や、緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、放射線物質、また、サマリウム、ユウロピウム、テルビウム等のランタノイド等が使用できる。
【００２１】
第４の工程として、第２工程および第３工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の標識物質等）を洗浄した後、前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる。このとき、基質は、標識物質に合わせたものを適宜に採択する。たとえば、標識物質がペルオキシターゼの場合、基質としてｏ-フェニレンジアミンを使用することで、基質を発色させることができる。
【００２２】
そして、第５の工程として、上記第１の工程から第４の工程によって、基質の発色を、吸光度測定器、分光光度計や蛍光測定器、マルチラベルカウンター等で測定する。
【００２３】
なお、第４の工程の発色操作の後に、必要に応じて、発色停止剤を添加し、基質の発色反応を停止してもよい。この発色停止剤は、標識物質と基質の発色反応系に合わせて適宜に選択する。たとえば、標識物質がペルオキシターゼで、基質がｏ-フェニレンジアミンである発色反応系の場合には、塩酸を利用して発色を停止させることができる。
【００２４】
また、本願発明は、図２に例示したように、第２に、上記アシアロＧＭ１の測定において、
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を特徴とした測定キットでもよい。
【００２５】
この場合、基本的な工程および使用できる抗体の由来、標識物質の種類等は、上記第１の測定方法とほぼ同様であるが、第２抗体である抗アシアロＧＭ１抗体（モノクロ−ナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい）を認識して結合する、標識物質で修飾された標識抗体を用いるため、第２抗体には標識物質による修飾は施されていない。また、この第２の測定キットおよびこの測定キットを用いた測定方法においても、必要に応じて、上記のような発色を停止させる発色停止操作を行ってもよい。
【００２６】
このような本願発明の測定においては、対象となる被測定物質を含む試料とともに、基準となる既知濃度の標準物質（本願発明において、アシアロＧＭ１）を同時測定することで、試料中のアシアロＧＭ１を正確に定量することができる。この測定結果は、抗アシアロＧＭ１抗体の特異性や活性、また、標準物質でアシアロＧＭ１の純度に左右されるが、特に本願発明のアシアロＧＭ１は精製度の高い方法で調製している。たとえば、ウシ脳やラット脳から抽出したり、また、免疫したウサギより採血し、血清を分離採取したものを硫酸アンモニウムにて塩析後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に透析してγグロブリン分画を取得したりする。
【００２７】
このような本願発明によって、ギラン・バレー症候群や自己免疫性神経疾患等の検査および診断ために、その検査マーカーである血中等のアシアロＧＭ１を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮できる。しかも、抗体等を含めた測定試薬を「測定キット」として統一することで、アシアロＧＭ１を検査する検査実施機関によって検査結果が異なることを減少させることができ、医療機関における診断結果の正確性および信頼性を向上させることができる。
【００２８】
そして、第３に、本願発明は、図３に例示したように、抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し、結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットでもある。具体的には、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体（ＩｇＧタイプ、ＩｇＭタイプを問わない）と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴としている。このとき、試料中の抗アシアロＧＭ１抗体のタイプとしては、上記のとおり、ＩｇＧタイプおよびＩｇＭタイプを問わないため、標識抗体は、たとえば、抗ヒトＩｇＧ抗体でもよいし、抗ヒトＩｇＭ抗体でもよい。また、発色停止剤を具備してもよい。
【００２９】
そして、この抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法としては、少なくとも以下の工程
＜１＞前記アシアロＧＭ１固相化基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴としており、基本的な工程は上記第１および第２のアシアロＧＭ１測定キットを用いた測定方法とほぼ同様であり、測定対象を、たとえば、血中の「抗アシアロＧＭ１抗体」としている点で異なる。
【００３０】
この抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法においても、必要に応じて発色操作の後に塩酸や硫酸等の発色停止剤を添加してもよい。
【００３１】
本願発明における、抗アシアロＧＭ１抗体は、市販のものでもよいし、公知である種々の抗体作製方法によって作製することもできる。たとえば、抗原感作させたラットやマウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の動物の血清免疫グロブリンの画分から、抗原アフィニティーカラム等を利用して精製したり（ポリクローナル抗体）、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させて融合細胞を作製する細胞融合法を利用して抗体を作製したり（モノクローナル抗体）、さらに遺伝子組換え技術によっても抗体を作製することができる（モノクローナル抗体）。
【００３２】
一般に、ポリクローナル抗体と比べ、モノクローナル抗体には以下の問題がある。すなわち、（１）モノクローナル抗体は、結合性の弱い抗体しか得ることができない場合があり、検出感度が低下する可能性があった。また、（２）モノクローナル抗体には交差反応を示すものもあるため、この場合は、結合性の強い抗体であっても正確性を欠くことが予想できる。さらに、（３）モノクローナル抗体作製には多くの時間とコストを要すること、および、免疫原となるアシアロＧＭ１は、正常マウスにとって自己成分であることから、通常の方法による抗アシアロＧＭ１モノクローナル抗体の大量生産は困難であった。このような問題を解消するため、本願発明における抗アシアロＧＭ１抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００３３】
また、抗体を標識物質で修飾するには、たとえば、その扱い易さや結合強度から、ビオチンやストレプトアビジン等のような生体結合性物質を利用することが考慮できる。
【００３４】
以下に実施例を説明し、さらに詳しく本願発明のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットについて説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：アシアロＧＭ１の免疫学的定量測定
図１に沿って、アシアロＧＭ１の免疫学的測定キット（ＥＬＩＳＡキット）について説明する。
【００３６】
（１）抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体が固定化されている９６穴マイクロプレートを基板（担体）として利用した。なお、基板への抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体の固定化には、炭酸緩衝液（ｐＨ ９．６）にて希釈して、たとえば、９６穴マイクロプレートを基板（担体）とした場合には、各穴に１００μＬずつ添加し、４℃にて一晩静置してインキュベーションすることで、固定化させた。
【００３７】
（２）各穴に、３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（以下、ＰＢＳ−Ｔとする）を添加して、洗浄することを３回繰り返して行った。洗浄後、余分なＰＢＳ−Ｔを、可能な限り除去した。
【００３８】
（３）非特異的な吸着を防止するため、１％（Ｗ/Ｖ）のウシ血清アルブミン含有のリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡとする）を、全穴に２００μＬずつ添加し、プレートにシールし、室温（２０〜２５℃）にて１時間、反応させブロッキングを行った。その後、ＰＢＳ−ＢＳＡを捨て、可能な限り除去した。
【００３９】
（４）試料として、患者血清を１００μＬずつ添加した。また、患者血清中のアシアロＧＭ１濃度を算出するために、精製アシアロＧＭ１（和光純薬製：凍結乾燥品をあらかじめエタノール１ｍＬにて溶解し、使用まで−２０℃にて保存）を、１％（Ｗ/Ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒとする）にて、０．２、１、５、２５、１２５（ｎｇ／ｍＬ）に希釈し、それぞれを各穴に１００μＬずつ添加した。なお、対照として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。そして、プレートにシールして、室温で２時間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４０】
（５）次に、再度ＰＢＳ―Ｔで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン溶液で希釈した、２次抗体であるビオチン標識抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体を、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて０．２５μｇ/ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬずつ分注し、プレートにシールをして室温（２０〜２５℃）で２時間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４１】
（６）各穴を、またＰＢＳ‐Ｔで５回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン溶液で希釈したストレプトアビジン‐西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（和光純薬製）を、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて１０，０００倍希釈し、プレートの各穴に１００μＬずつ分注し、室温（２０〜２５℃）で３０分間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４２】
（７）各穴をＰＢＳ‐Ｔで８回洗浄した後、基質液として、１％のＨ２Ｏ２と１μｇ/ｍＬのｏ−フェニレンジアミン溶液との混合液（和光純薬製）を調製し、これを各穴に１００μＬずつ添加し、プレートにシールを貼付して３７℃で３０分間反応させた。
【００４３】
（８）その後、反応停止液として、２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を各穴に１００μＬずつ添加し静かに攪拌し、反応を停止させ、波長４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（マルチラベルカウンター、ＡＲＶＯ１４２０）にて測定した。その結果、顕著な発色を検出することができた。つまり、血中のアシアロＧＭ１を検出することができた。なお、精製アシアロＧＭ１を添加していない箇所の測定結果を、ブランクとした。
【００４４】
（９）結果、濃度既知の精製アシアロＧＭ１の吸光度を縦軸に、濃度を横軸にとり、検量線を求めた（図４）。吸光度は、試料中のアシアロＧＭ１および標準物質である精製アシアロＧＭ１と結合したビオチン標識抗アシアロＧＭ１抗体量と比例するので、各試料中のアシアロＧＭ１の濃度は、試料の吸光度と検量線との交点より求められ、定量することができた。
実施例２：抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的定量測定
図３に沿って、抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キット（ＥＬＩＳＡキット）について説明する。
【００４５】
（１）アシアロＧＭ１が固定化されている９６穴マイクロプレートを基板（担体）として利用した。なお、基板へのアシアロＧＭ１（和光純薬製；凍結乾燥品をエタノール１ｍＬにて溶解したもので、使用まで−２０℃にて保存）の固定化には、エタノールにて１μｇ/ｍＬに希釈して、たとえば、９６穴マイクロプレートを基板（担体）の各穴に１００μｌずつ添加し、室温（２０〜２５℃）にて４時間静置し、各穴を乾燥することで、固定化させた。
【００４６】
（２）各穴に、３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（以下、ＰＢＳ−Ｔとする）を添加して、洗浄することを３回繰り返して行った。洗浄後、余分なＰＢＳ−Ｔを、可能な限り除去した。
【００４７】
（３）非特異的な吸着を防止するため、１％（Ｗ/Ｖ）のウシ血清アルブミン含有のリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−ＢＳＡとする）を、全穴に２００μＬずつ添加し、プレートにシールし、室温（２０〜２５℃）にて１時間、反応させブロッキングを行った。その後、ＰＢＳ−ＢＳＡを捨て、可能な限り除去した。
【００４８】
（４）定量用として抗アシアロGM1ポリクローナル抗体（和光純薬製）を、１％（Ｗ/Ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒとする）にて１００倍〜６４００倍まで倍々に希釈したもの、および試料としての患者血清をＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍希釈したものそれぞれを、プレートの各穴に１００μＬずつ添加した。また、陰性対照（ネガティブコントロール）として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。そして、プレートにシールして、４℃にて一晩反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００４９】
（５）再度、ＰＢＳ-Ｔで３回洗浄した。その後、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで０．２５μｇ/ｍＬに希釈したビオチン標識抗ヒトＩｇＧ抗体またはビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれも、和光純薬製）を、試料を加えた各穴に１００μＬずつ分注した。また、抗アシアロＧＭ１抗体を加えた穴には、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで０．２５μｇ/ｍＬに希釈した、２次抗体としてのビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（和光純薬製）を１００μＬ加えた。そして、プレートにシールをして、室温（２０〜２５℃）で２時間反応させた。なお、陰性対照（ネガティブコントロール）として、１００μＬのＤｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのみを添加した穴も準備した。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００５０】
（６）各穴をＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、上記Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで、１００００倍に希釈したストレプトアビジン‐西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（和光純薬製）を、各穴に１００μｌずつ分注し、プレートにシールをして、室温（２０〜２５℃）で３０分間反応させた。反応後、反応液を捨て、可能な限り除去した。
【００５１】
（７）そして、各穴をＰＢＳ−Ｔで８回洗浄した後、基質液として、１％のＨ２Ｏ２と１μｇ/ｍＬのｏ−フェニレンジアミン溶液との混合液（和光純薬製）を調製し、これを各穴に１００μＬずつ添加し、プレートにシールを貼付して３７℃で３０分間反応させた。
【００５２】
（８）その後、反応停止液として、２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を各穴に１００μＬずつ添加して静かに攪拌し、発色を停止させ、波長４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（マルチラベルカウンター、ＡＲＶＯ１４２０）にて測定した。結果、顕著な発色を検出することができた。つまり、血中の抗アシアロＧＭ１抗体を検出することができた。なお、精製アシアロＧＭ１を添加していない箇所を、ブランクとした。
【００５３】
（９）以上の方法により測定した抗アシアロＧＭ１抗体の吸光度を縦軸に、抗体の希釈倍数を横軸にとり標準曲線を求めた（図５）。標準曲線は、シグモイド曲線となり、抗体の最高吸光度の半値（５０％値）を示す時の希釈倍数を標準曲線より求めた。このときの抗体の結合活性を１ｕｎｉｔと規定した。試料の吸光度と標準曲線との交点より、試料中の抗アシアロＧＭ１抗体活性（ｕｎｉｔ）を求めた。そして、試料を１００倍希釈して測定したため、求めた抗アシアロＧＭ１抗体活性を１００倍して、補正し、血清中の抗アシアロＧＭ１抗体活性とした。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本願発明にかかるアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法の工程を例示した模式図である。
【図２】本願発明にかかるアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法における、別の実施形態での工程を例示した模式図である。
【図３】本願発明にかかる抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法の工程を例示した模式図である。
【図４】本願発明における標準物質である精製アシアロＧＭ１の検量線を示した図である。
【図５】本願発明における抗アシアロＧＭ１抗体の標準曲線を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項２】
結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれビオチンまたはストレプトアビジンである請求項１に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる工程；
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法。
【請求項４】
アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項５】
請求項４に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体に、第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜４＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法。
【請求項６】
抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キット。
【請求項７】
請求項６に記載の抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法。
【請求項１】
アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞前記結合性物質Ａと対応して結合する結合性物質Ｂで修飾された標識物質；および
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項２】
結合性物質Ａおよび結合性物質Ｂは、それぞれビオチンまたはストレプトアビジンである請求項１に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として結合性物質Ａで修飾された修飾化抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体の結合性物質Ａに、結合性物質Ｂで修飾された標識物質を接触させる工程；
＜４＞前記標識物質と反応して発色する基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法。
【請求項４】
アシアロＧＭ１を特異的に認識し結合する抗アシアロＧＭ１抗体を用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板；
＜２＞第２抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体；
＜３＞第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜４＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定キット。
【請求項５】
請求項４に記載のアシアロＧＭ１の免疫学的測定キットを用いたアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞第１抗体としての抗アシアロＧＭ１抗体が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、第２抗体として抗アシアロＧＭ１抗体を接触させる工程；
＜３＞前記第２抗体に、第２抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜４＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜５＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とするアシアロＧＭ１の免疫学的測定方法。
【請求項６】
抗アシアロＧＭ１抗体を特異的に認識し結合する標識抗体を用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットであって、少なくとも
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板；
＜２＞抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体；および
＜３＞標識抗体の標識物質と反応して発色する基質；
を具備することを特徴とする抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キット。
【請求項７】
請求項６に記載の抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定キットを用いた抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法であって、少なくとも以下の工程
＜１＞アシアロＧＭ１が固定されている基板に、被測定試料を接触させる工程；
＜２＞前記被測定試料に、抗アシアロＧＭ１抗体と結合する、標識物質で修飾された標識抗体を接触させる工程；
＜３＞前記標識抗体の標識物質に基質を接触させ、基質を発色させる工程；および
＜４＞基質の発色量を測定する工程；
を含むことを特徴とする抗アシアロＧＭ１抗体の免疫学的測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２８４３３０（Ｐ２００６−２８４３３０Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１０３６８２（Ｐ２００５−１０３６８２）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４１４５３６４）国立大学法人群馬大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４１４５３６４）国立大学法人群馬大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
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