アダプタ誘導型表示系
【課題】宿主細胞内で外因性ポリペプチドを発現し及び／又は遺伝子パッケージの外表面上で外因性ポリペプチドを表示するためのアダプタ誘導型表示系を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の系は、単量体及び多量体ポリペプチドの遺伝学的に多様なレパートリを表示するために特に有用である。本発明はまた、本発明の表示系の構成要素を含むキット、及び発現ベクターとヘルパーベクターの両方を提供する。同様に提供されるのは、特に問題の外因性ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージである。さらに本発明により提供されるのは本発明の表示系の使用方法である。
【解決手段】本発明の系は、単量体及び多量体ポリペプチドの遺伝学的に多様なレパートリを表示するために特に有用である。本発明はまた、本発明の表示系の構成要素を含むキット、及び発現ベクターとヘルパーベクターの両方を提供する。同様に提供されるのは、特に問題の外因性ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージである。さらに本発明により提供されるのは本発明の表示系の使用方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は係属中の２００１年１１月２日付け米国実用特許出願の一部継続出願であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は表示技術の分野にある。詳しくは、本発明は、遺伝子パッケージ上での外因性ポリペプチド表示のためのアダプタ誘導型表示系（adapter-directed display systems）の生成に関する。本発明で具現化される組成物及び方法は、膨大なポリペプチドのレパートリの中から所望の特性を示す個々の構成員を同定するために特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子パッケージの表面上でのポリペプチドの表示は、実験室において分子の進化を行うための強力な方法となっている。膨大な分子多様性をもつライブラリを構築し望ましい特性をもつ分子を選択する能力により、この技術は広範囲の問題に適用できるものとなってきた。ファージ表示の起源は、George Smithがファージ外皮タンパク質に外因性配列を融合することによってバクテリオファージＭ１３ウイルス粒子の表面上でタンパク質の外因性セグメントを初めて発現した１９８０年代中葉にさかのぼる（Science (1985) 228:1315-1317）。２つの画期的コンセプトが Smithの初期の実験から出現した。まず第１に、個々のファージ粒子が特有のポリペプチドを表示する、膨大で多様なポリペプチドのレパートリを構築することができる、ということが該実験から示唆された。第２に、表現型と遺伝子型との間の直接の物理的結付きが該実験から確認された。すなわち、所望のポリペプチドを表示するファージは同時にポリペプチドをコードするＤＮＡをも保有しており、これはその後の分析のために容易に単離することができる。MaCafferty及びLadnerはこれらのコンセプトを拡張して、ファージ粒子の表面上で表示される１本鎖抗体といったポリペプチドのレパートリをスクリーニングした（米国特許第５，９６９，１０８号及び第５，８３７，５００号）。そのとき以来、ファージ表示が、タンパク質工学に一般的に用いられる技術となった。
【０００４】
George Smithの発見事実に基づいて、一連の表示系が開発されてきた。これらの系は、２つのカテゴリーに大きく分類することができる。第１世代の系は１ベクター系である。この系のベクターは、全ファージゲノムを含有し、その中に外皮タンパク質遺伝子とインフレーム（in frame）で外因性配列を挿入する。結果として得られたファージ粒子は、ファージゲノム全体を担持することから、これらは比較的不安定で感染性が低い。第２世代の系は、一般にファージミド系と呼ばれ、次の２つの構成要素：すなわち、ファージ外皮タンパク質に融合させられた外因性配列を担持するファージミドベクター及びファージ粒子内へのファージミドのパッケージングを可能にするためのファージ由来の複製起点；及び（２）ファージパッケージングのために必要とされる他の全ての配列を担持するヘルパーファージベクター、を有する。ヘルパーベクターは、Amersham Pharmacia Biotechにより製造されるＭ１３Ｋ０７ヘルパーベクター及び Stratagenにより生産されるその誘導体ＶＣＳＭ１３といったように、一般的には複製欠損性のものである。ヘルパーファージによる細菌細胞の重複感染によって、ファージミドベクターを担持するとともに外因性配列を表示する新たにパッケージングされたファージが産生される。
【０００５】
かくして、先行技術のファージミド系では、ファージ外表面配列（すなわち外皮配列）の少なくとも一部分に対する外因性配列の融合が必要とされる。最も一般的に用いられる融合部位または表示部位は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩ内にあるが、遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸ融合も報告されている。しかしながら、これらの融合系には、数多くの顕著な制限がある。まず第１に、外皮タンパク質の発現は宿主細胞に対して毒性であり、そのため外皮融合体の緊縮した調節を監視することが必要である。たとえそうであっても、不可避的なプロモータ漏出により、多様なライブラリの構成員の喪失が起こり得る。ライブラリの安定性を維持することは、少なくとも１０9 の複雑さをもつ（抗原結合単位といったような）膨大かつ多様な分子のレパートリを生成するために、特に重要である。第２に、遺伝子ＩＩＩ産物（ｐＩＩＩ）といったような或る種の外皮タンパク質の発現は、後代ファージ粒子の産生のために必要とされるヘルパーファージによる感染に対する耐性を宿主細胞に付与し得る。第３に、遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩファージ表示系を含め、その融合形式は挿入点を外表面配列の５’末端に制限している。そのため外因性ポリペプチドは外表面タンパク質のＮ末端に連結されなくてはならない。その結果、リーディングフレームの内部停止コドンによる頻繁な分断に起因して、これらの融合系により、全リーディングフレームのコーディング配列のフラグメントを含有するｃＤＮＡライブラリを完全に表示させることはできない。その上、融合系は、ヘルパーベクターにより一般に供給される野生型外表面タンパク質と融合体との間の組換えに起因して不安定である。さらに、ファージミドベクターが外表面配列の少なくとも一部分を含有することから、大きなベクターの形質転換効率の低さゆえ、大きな外因性配列が効率的に発現されないことがある。しかしながら、複雑さの高いライブラリの生成にとって、形質転換効率は重要な要因である。
【０００６】
融合ファージミド系に対する様々な修飾が記載されてきた。ＷＯ９１／１７２７１は、外因性配列が「タグ」と「タグリガンド」との相互作用を介して表示されるファージ表示系の構築を提案している。この系は、タグ配列に連結された外因性配列を担持するファージゲノミックベクターを含有する。同ベクターは、外皮タンパク質遺伝子とインフレーム（in frame）で融合されたタグリガンド配列を担持する。該ベクターによる宿主細胞の感染によって、外因性配列を発現するファージ粒子が産生されることになる、ということが推測される。しかしながら、ＷＯ９１／１７２７１の開示は、その概念の実施を可能にする教示を提供していない。例えば、ＷＯ９１／１７２７１は「タグ」と「リガンド」の間の相互作用を介してファージ粒子の表面上にいずれかの配列が表示されたことを実証しておらず、又、タンパク質が発現された場合にそれが生物活性を保持するということも実証していない。その上、提案された系は、同ベクター内に全てのファージ外皮タンパク質遺伝子を担持するファージゲノミックベクターを利用することから、上述したような全ての制限及び欠点を不可避的に受け継いでいる。
【０００７】
Crameri らは、ファージミドベクター上に表示されるべき外因性配列に隣接してＦｏｓ腫瘍遺伝子が挿入され、同ベクター上の遺伝子ＩＩＩに隣接してＪｕｎ腫瘍遺伝子が挿入された、ｃＤＮＡ産物を表示するための系を考案している（Crameri et al. (1993) Gene 137:69-75参照）。これら２つの融合配列は、２つの別々のプロモータの制御下に置かれている。Crameri の手法は、Ｆｏｓタンパク質とＪｕｎタンパク質の間の好ましい相互作用を活用する。すなわち、Ｆｏｓ外因性ポリペプチドが発現されペリプラズム空間に分泌されるにつれて、それはｐＩＩＩ−Ｊｕｎと複合体を形成し、これが次にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージによる重複感染によってファージ粒子内にパッケージングされる。この系の外因性配列は外表面配列に直接には連結されないものの、同ベクターの別々のプロモータの下でのファージ外皮タンパク質ｐＩＩＩの構成性発現は、依然として宿主細胞に対する実質的な毒性をひき起こす。
【０００８】
Crameri 系に類似したもう１つの変異体は、ＷＯ０１／０５９５０に記載されている「システイン結合された」表示系である。外因性ポリペプチドの付着と表示は、外因性配列に含有されているシステイン残基及び外表面配列に挿入されているシステイン残基という２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成によって媒介される。ＷＯ０１／０５９５０に記載されている１ベクター系は、２つの別々のプロモータ制御された発現カセットを担持するファージミドベクターである。すなわちそのうちの１つは外因性配列を発現し、もう１つは外皮タンパク質ｐＩＩＩを発現する。ＷＯ０１／０５９５０に記載されている２ベクター系は、外因性配列を担持するファージミドベクター及び外皮タンパク質ｐＩＩＩを発現するプラスミドを含有する。２つのベクターは、 E. Coli細胞を同時トランスフェクションするために用いられる。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７による重複感染によって、結果として得られるファージ粒子内にファージミド及び／又はプラスミドがパッケージングされる。この系は外表面タンパク質に連結された外因性タンパク質を含む融合体の発現を回避するものの、ここでも１ベクター又は２ベクター系のいずれかにおいて外皮タンパク質ＰＩＩＩが構成性に発現されるため、宿主細胞に対する外皮タンパク質の毒性を少なくおさえることができない。その上、ＷＯ０１／０５９５０に記載されている２ベクター系は、ヘルパーファージによる感染によって外表面配列を担持するが外因性遺伝子を担持しないミスパッケージングされたベクターを伴うファージ粒子を不可避的に産生する。ミスパッケージングは、２ベクター系に付随する周知の問題である。ｐＩＩＩ−補足用プラスミドベクターがヘルパーファージ粒子内にミスパッケージングされることが示されている（Rondot et al. (2000) Nature 19:75-78）。
【０００９】
最終的に、上述の先行技術のファージ表示系は、細菌表示系といったような他の表示系との両立性をもたない。同ファージ表示された外因性配列を細菌細胞上に直接に提示するためには、外因性配列をまず細菌表示ベクターにサブクローニングしなければならない。
【００１０】
従って、遺伝子パッケージ上での外因性表示のための改善された組成物及び方法に対する相当の必要性がなおも存在している。理想的な系は以前に報告された系の欠点を回避するものとなるだろう。本発明は、これらの必要性を満たすとともに、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、ペプチド結合により遺伝子パッケージのいずれの外表面配列にも連結されていないポリペプチドの表示を可能にする系の設計にある。該実験的設計はファージ粒子といったような遺伝子パッケージ上での所望の特性をもつタンパク質の提示及び／又は選択のための前例のない柔軟性を提供する。本発明のファージ表示系の技術的利点は、多種多様である。まず第１に本発明の系は、発現ベクターによる外表面タンパク質の発現に付随する全ての欠点を回避する。上述のように、これらの欠点としては、（１）外表面配列の構成性発現の結果としての宿主細胞に対する高い毒性；（２）後代ファージ粒子の産生に必要とされるヘルパーファージの感染に対する宿主細胞の耐性；（３）Ｎ末端融合産物の一方向表示に起因する、表示されるべきタンパク質の配向に対する制限；及び（４）ヘルパーベクターによって一般に提供される野生型外表面配列と融合外表面配列との間の組換えに起因する、融合産物の不安定性、が含まれる。第２に、本発明の系は、ＷＯ０１／０５９５０で記載されている２ベクター系で使用されているプラスミドのような、外表面配列を担持するが問題の遺伝子を担持しないプラスミドのミスパッケージングの可能性を無くする。先行技術の表示系が有するこれら及び他の固有の欠点を回避する一方で、本発明の系はさらに、１つの遺伝子パッケージにつきポリペプチドの単数のコピー（一価表示）又は複数のコピー（多価表示）を提示する柔軟性をも提供する。本発明の系は、特に問題の分子（molecules of particular interest）を結合する固有の能力に基づいて、膨大かつ多様なポリペプチドのレパートリ（すなわち抗原結合単位）を発現およびスクリーニングするために特に有用である。本発明の系によって表示されるポリペプチドは機能的である。
【００１２】
従って、本発明は、遺伝子パッケージの外表面上に外因性ポリペプチドを表示するためのアダプタ誘導型表示系を提供する。本発明の系は、（ａ）第１のアダプタ配列にインフレーム（in frame）で融合された外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如している、発現ベクターと、（ｂ）該遺伝子パッケージをパッケージングするために必要な外表面タンパク質をコードする外表面配列を含み、該外表面タンパク質の少なくとも１つが第２のアダプタにインフレームで融合された、ヘルパーベクターとを含んで成り、前記第１のアダプタと第２のアダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、第１アダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用（pairwise interaction）を介して該ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。
【００１３】
利用される遺伝子パッケージは、ウイルス、細胞及び胞子であり得る。１つの実施形態において、本発明の系はファージ表示系である。外表面配列はファージの機能的外皮タンパク質をコードする。好ましい外表面配列は、繊維状ファージ等のファージの機能的外皮タンパク質をコードする。好ましい外表面配列は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ、遺伝子ＶＩ、遺伝子ＶＩＩ、遺伝子ＶＩＩＩ及び遺伝子ＩＸから成る群より選択される。
【００１４】
もう１つの実施形態において、本発明の系は細菌表示系である。発現ベクターでは除外されているものの細菌ヘルパーベクターに含まれている外表面配列が、細菌外表面タンパク質をコードする。好ましい外表面タンパク質は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ、ＴｒａＴ、Ｐａｌ、Ｏｐｒｌ、Ｉｎｐ及びＡＩＤＡ−Ｉから成る群より選択される。
【００１５】
本発明の表示系を構築するために、第１のアダプタと第２のアダプタは、ホモ二量体化配列又はヘテロ二量体化配列であり得る。好ましいホモ二量体化配列は、ジスルフィド結合を形成する能力をもつ２つの対合するシステイン残基である。好ましいヘテロ二量体化配列としては、ヘテロ二量体レセプタＧＡＢＡB レセプタ１及び２に由来するもののような、生理緩衝液条件下及び／又は生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたないものが含まれる。他の好ましいアダプタは高次コイル二次構造を採用するものであってよい。
【００１６】
本発明はまた、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドを表示するためのヘルパーベクターを提供する。該ベクターは、該遺伝子パッケージをパッケージングするために必要な外表面配列を含み、該表面提示配列の少なくとも１つがアダプタにインフレーム（in frame）で融合され、前記アダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、該ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。１つの態様において、本発明のヘルパーベクターは細菌ヘルパーベクターである（例えば図２６参照）。もう１つの態様において、ヘルパーベクターはファージヘルパーベクターである（本明細書において「ウルトラヘルパー(UltraHelper）ファージベクター」ともいう）。好ましいファージヘルパーベクターとしては、限定されないが、図５Ａに示されるＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクター、図１３Ａに示さるＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクター及び図１９Ａに示されるＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターが含まれる。
【００１７】
本発明はさらに、遺伝子パッケージの内部又はその外表面上でポリペプチドを産生するための発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、第１のアダプタにインフレーム（in frame）で融合された該ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該ベクターは該遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如しており、該遺伝子パッケージの外表面上での該ポリペプチドの表示は第１のアダプタと第２のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して媒介され、第２のアダプタは外表面配列に融合されている。１つの態様において、発現ベクターはファージミドである。本ファージ表示系のファージミドの例としては、図９Ａに示されるｐＡＢＭＸ１４、図１５Ａに示されるｐＡＢＭＸ１５、及び図２５Ａに示されるｐＡＭＢＸ２２がある。
【００１８】
同じく本発明に含まれるのは、本発明のアダプタ誘導型表示系を含んで成るキットであり、該系の個々の構成要素が発現ベクター及びヘルパーベクターを含む。本発明でさらに提供されるのは、本発明のベクターを含んで成る宿主細胞である。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、その外表面上に融合ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを提供する。該融合ポリペプチドは、第１のアダプタとインフレーム（in frame）で融合された表示されるべきポリペプチド配列を含んで成り、前記第１のアダプタは、適切な宿主細胞内で融合ポリペプチドが産生されるときに、外表面タンパク質に連結された第２のアダプタと第１のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して融合ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。遺伝子パッケージは、ウイルス、細胞及び胞子であり得る。
【００２０】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つが上記の遺伝子パッケージである複数の遺伝子パッケージを含んで成る、選択可能ライブラリを提供する。
【００２１】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、本発明のアダプタ誘導型表示系を適切な宿主細胞内で転写および翻訳させることにより、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドを表示するための方法を提供する。この方法により生成する選択可能ライブラリも同じく本発明に包含される。
【００２２】
本発明はさらに、遺伝子パッケージ上に表示される外因性ポリペプチドとテスト物質との間の特異的相互作用の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）上記の方法に従って調製される外因性ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを提供する段階；（ｂ）安定なポリペプチド−物質複合体を形成するのに適切な条件下でテスト物質と遺伝子パッケージを接触させる段階；及び（ｃ）遺伝子パッケージ上の安定なポリペプチド−物質複合体の形成を検出し、それにより特異的相互作用の存在を検出する段階、を含んで成る。１つの態様において、外因性ポリペプチドは、抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質及び核タンパク質から成る群より選択される。好ましい態様において、外因性ポリペプチドは抗原結合単位である。テスト物質は、タンパク質、炭水化物、脂質及びこれらの組合せから構成され得る。好ましいテスト物質は、抗原又はリガンドである。
【００２３】
最後に本発明は、所望の特性をもったポリペプチドを取得する方法を提供する。該方法は（ａ）本発明の方法によって作成された選択可能ライブラリを提供する段階；及び（ｂ）選択可能ライブラリをスクリーニングすることにより、所望の特性をもったポリペプチドを表示する少なくとも１つの遺伝子パッケージを取得する段階、を含んで成る。１つの態様において、所望の特性は、問題の物質に対する結合特異性である。もう１つの態様において、選択可能ライブラリをスクリーニングする段階は、所望の特性をもったポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを単離する段階をさらに含む。かかる段階は、所望の特性をもつポリペプチドをコードする遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を取得する段階をさらに含んでよい。所望の特性をもつポリペプチドは、以下のタイプのタンパク質：すなわち抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質及び核タンパク質、の１つであり得る。
【００２４】
本明細書で使用される略記の説明
１．Ｎｓｃ：非１本鎖
２．Ｓｃ：１本鎖
３．Ａｂｕ：抗原結合単位（単数）
４．Ａｂｕｓ：抗原結合単位（複数）
５．Ｌ鎖：軽鎖
６．Ｈ鎖：重鎖
７．ＶＬ：軽鎖可変領域
８．ＶＨ：重鎖可変領域
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のアダプタ誘導型表示系の実験的設計の概略図である。描かれている表示系は、適切な宿主細胞内での可溶性外因性ポリペプチドの発現を可能にするばかりでなく、遺伝子パッケージの外表面上での外因性配列の表示をも可能にする。該系は、発現ベクター及びヘルパーベクターといった２つの構成要素を有する。 E. Coli細菌といったような宿主細胞内に発現ベクターを単独で導入することにより、アダプタ（「アダプタ１」と称する、図１の中央図を参照）とインフレームで融合された外因性ポリペプチドの発現および細菌ペリプラズムへの分泌が導かれる。第２のアダプタ（「アダプタ２」と称する、左図参照）とインフレームで融合されたファージ外表面配列を担持するヘルパーファージベクターによる細菌細胞の重複感染によって、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介してファージ粒子上での外因性ポリペプチドの表示が可能となる。発現ライブラリを構築するために、この発現ベクター内に多様なＤＮＡ配列を挿入することができる。ヘルパーファージの重複感染によって、多様なファージ表示ライブラリが生じる。同様にして、第２のアダプタ（「アダプタ２」と称する、右図参照）とインフレームで融合された細菌外表面配列を担持するヘルパー細菌ベクターをパッケージングするファージミド粒子による細菌細胞の感染によって、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介して細菌上での外因性ポリペプチドの表示が可能となる。同様にして、選択可能細菌表示ライブラリを構築することもできる。
【００２６】
【図２】カナマイシン耐性ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ陽性クローンについてのファージＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示す図である。４８のクローンが、ファージ生成についてスクリーニングされた。Ｃ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２が、ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ陽性クローンを表わす。Ｆ１及びＦ２は、親Ｍ１３ＫＯ７ファージの２つの正の対照を表わす。
【００２７】
【図３Ａ】ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージベクターの概略図である。
【図３Ｂ】ヘルパーファージベクター中に含まれる遺伝子ＩＩＩリーダー配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。遺伝子ＩＩＩのコーディング領域を改変することなく、ＫｐｎＩ制限部位がリーダー配列の下流側に導入されている。
【００２８】
【図４】ベクターｐＡＢＭＣ６の概略図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩ配列の５’側に配置されたＫｐｎＩ部位、部分的遺伝子ＩＩＩリーダー配列、ＧＲ２コーディング配列およびＭｙｃ−タグを含んでいる。
【００２９】
【図５Ａ】ＧＭ−ウルトラヘルパー ファージの概略図である。
【図５Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。
【図５Ｃ】ＧＲ２−Ｍｙｃドメイン内のトリプシン切断部位（Ｔｒｙｐ）を描く図である。
【００３０】
【図６】ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。これらの結果はＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子の組立てを示している。レーン１及び７は、ｋＤａで表わした分子量マーカーを示す。レーン２−５は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合を発現するＧＭ−ウルトラヘルパーファージの４つのクローンを示す。レーン６は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合配列を担持しないＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージの負の対照を示す。
【００３１】
【図７】ＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子に組立てられるＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を検出するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。図６に示すファージクローン６、１８及び２０がテストされた。負の対照としてＫＯ７ヘルパーファージが含まれた。
【００３２】
【図８】増大する量のトリプシンを用いたウルトラヘルパーファージ由来のＧＲ２−Ｍｙｃドメインの良好な切断を実証するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージは負の対照としての役割をした。
【００３３】
【図９Ａ】ベクターｐＡＢＭＸ１４の概略図である。
【図９Ｂ】ｐＡＢＭＸ１４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、および下流側配列ｐｌａｃ―ＲＢＳ―ｐｅｌＢ―ＧＲ１−ＤＨ（ＨＡ及び６×His tag ）の発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞での可溶性タンパク質の表示または産生のための外因性配列を挿入するために、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００３４】
【図１０】ＧＭ−ウルトラヘルパーファージ又はＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。細菌ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−アダプタ１融合体の発現のためのｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。それぞれの抗原に対する用量依存性ファージ結合が、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの感染によってのみ観察され、負の対照Ｍ１３ＫＯ７ファージによっては観察されなかった。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミド及びＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖ表示を実証する。
【００３５】
【図１１】図１１の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージによる重複感染を受けたファージミドベクターｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１を保有するＴＧ１細胞内でファージ粒子が生成された負の対照を表わす。レーン２は、ファージミドｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ベクター及びＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターにより生成されたファージ粒子を表わす。外因性配列ｓｃＦｖが検出された。レーン３は、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージを単独で用いた負の対照を表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン２においてのみ、ＧＲ１とＧＲ２とのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドを検出する。レーン２内の遊離ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩと比べた場合、約２倍ものｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体が表示された。これは、各ファージ粒子が平均して１よりも多くのｓｃＦｖ−ＧＲ１融合体のコピーを担持しているということを表わす。ｐＩＩＩ−Ｍｙｃ−ＧＲ２二量体に対応するバンドがレーン３内で検出された。ｐＩＩＩ−Ｍｙｃ−ＧＲ２二量体の形成は、ＧＡＢＡB レセプタ２アダプタ配列の下流側で導入されたシステイン残基対に起因していた。ＧＡＢＡB レセプタ２のアダプタ配列はそれ自体、生理体温の条件下で及び／又は生理緩衝液の条件下でホモ二量体を形成する傾向をもたない（Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図１１の右図参照）、レーン２内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの重複感染によるｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ融合体の表示を確認するものである。
【００３６】
【図１２】ベクターｐＡＢＭＣ１３の概略図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩの５’側に配置されたＫｐｎＩ部位を有する部分的ｇＩＩＩリーダー配列、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙコーディング配列、及びＭｙｃ−タグを含む、ＤＮＡフラグメントを含有している。
【００３７】
【図１３Ａ】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの概略図である。
【図１３Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩ配列の５’側に配置されたＭｙｃ−タグと融合されたＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードするヌクレオチド配列を含有している。さらに、該ベクターは、遺伝子ＩＩＩリーダー配列とＣｙｓ−Ｍｙｃコーディング領域によりフランキングされた(flanked）アンバー停止コドンを含む。アンバーコドンの導入は、サプレッサー細菌菌株内のみでファージ産生を可能にする。
【００３８】
【図１４】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子に組立てられるＣｙｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合体を検出するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。レーン１は、負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを表わす。レーン２−６は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージの５つのクローンを表わす。レーン７は、正の対照であるＧＭ−ウルトラヘルパーファージを表わす。
【００３９】
【図１５Ａ】ベクターｐＡＢＭＸ１５の概略図である。
【図１５Ｂ】ｐＡＢＭＸ１５の完全ヌクレオチド配列を示す図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐｅｌＢ−ＨＡ−Ｃｙｓの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞での可溶性タンパク質の表示または産生のための外因性配列を挿入するために、ＮｃｏI／ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ又はＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００４０】
【図１６】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージ又はＭ１３ＫＯ７（「ＫＯ７」とも表記される）ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。細菌ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体の発現のためｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１５ファージミド及びＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖ表示を実証する。ライン３−６に示される感染多重度（ＭＩＯ）１〜１００の範囲でｓｃＦｖ表示レベルにおける大きな変化は無かった。ライン１及び２は、ＫＯ７ヘルパーファージの２つの負の対照を表わす。レーン２により示されるように、負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いた場合、ｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓが全く検出されなかった。
【００４１】
【図１７】図１７の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、ＫＯ７ファージを単独で用いた負の対照を表わす。レーン２は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを単独で用いた負の対照を表わす。レーン３は、ファージミドｐＡＢＭＸ１５により発現されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体がＫＯ７ファージによる重複感染によって検出されなかった負の対照を表わしている。レーン４は、ファージミドｐＡＢＭＸ１５により発現されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体がＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターによる重複感染によって良好に表示されたファージクローンを表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン４においてのみ、対合するシステインのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ−Ｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドを検出する。この結果は、ファージミドが、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージによってではなくＣＭ−ウルトラヘルパーファージによってレスキュー（rescue）された場合にのみｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓの表示が生じることを示す。ｐＩＩＩ配列の５’末端で導入された２つのシステイン残基の間で確立されたジスルフィド結合に起因して、ライン２及びライン４でｐＩＩＩ−Ｍｙｃ二量体が検出された。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図１７の右図参照）、対照レーン１−３内ではなくレーン４内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ−Ｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージのレスキューによるｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ融合体の表示を確認するものである。
【００４２】
【図１８】ベクターｐＡＢＭＣ１２の概略図である。ベクターｐＡＢＭＣ６のヌクレオチド配列に加えて、ベクターｐＡＢＭＣ１２は、ＧＲ２−Ｍｙｃコーディング配列に融合された遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分についてのコーディング配列、及び遺伝子ＩＩＩ配列に融合されたリボソーム結合配列（ＲＢＳ）−ＯｍｐＡリーダー配列を含む、ＤＮＡフラグメントを含有している。
【００４３】
【図１９Ａ】ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターの概略図である。
【図１９Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸を描く図である。該ベクターは、ＫＯ７ｋｐｎファージベクター内のＭｙｃ−タグ及びアダプタＧＲ２に融合された改変遺伝子ＩＩＩの追加的コピーをコードするヌクレオチド配列、及びＫＯ７遺伝子ＩＩＩ配列に隣接するリボソーム結合配列−ＯｍｐＡリーダー配列を含有している。
【００４４】
【図２０】ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージ又は対照Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ融合体の発現のためｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミド及びＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖの表示を実証する（レーン２−５）。感染多重度（ＭＩＯ）１〜１００の範囲でｓｃＦｖ表示レベルにおける大きな変化は無かった。ライン１は、ＫＯ７ヘルパーファージの重複感染によりｓｃＦｖが表示されなかった負の対照を表わす。
【００４５】
【図２１】図２１の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミドをレスキューするためにＫＯ７ファージを用いた負の対照を表わす。レーン２は、ファージミドｐＡＢＭＸ１４により発現されたｓｃＦｖ抗体がＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージによる重複感染によって良好に表示されたファージクローンを表わす。レーン３は、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージを単独で用いたもう１つの負の対照を表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン２においてのみ、ＧＲ１とＧＲ２とのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＧＲ１／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ＣＴ（ＩＩＩ）複合体に対応するバンドを検出する。この結果は、ＫＯ７ヘルパーファージによってではなくＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージによってファージミドがレスキューされた場合にのみｓｃＦｖ−ＧＲ１の表示が生じることを示す。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図２１の右図参照）、対照レーン１又は３内ではなくレーン２内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＧＲ１／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ＣＴ（ＩＩＩ）複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージのレスキューによるｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ融合体の表示を確認するものである。
【００４６】
【図２２Ａ】ベクターｐＡＢＭＤ１及びｐＡＢＭＤ２の概略図である。
【図２２Ｂ】ｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１部位とＳａｌＩ部位にまたがるヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。
【００４７】
【図２３】ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のＣ末端配列を描く図である。該配列のＣ末端に「ＶａｌＧｌｙＧｌｙＣｙｓ」スペーサを付加することにより、外因性システイン残基が導入されている。
【００４８】
【図２４】様々な抗原結合単位を描く概略図である。
【００４９】
【図２５Ａ】細菌発現ベクターｐＡＢＭＸ２２の概略図である。
【図２５Ｂ】ｐＡＢＭＸ２２の完全ヌクレオチド配列を描く図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐ８Ｌ−ＧＲ１−ＨＡの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞上での表示のための外因性配列を挿入するために、ＭｌｕＩ／ＸｂａＩまたはＭｌｕＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００５０】
【図２６Ａ】細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１の概略図である。
【図２６Ｂ】ｐＡＢＭｂｄ−１の完全ヌクレオチド配列を描く図である。該ベクターは、抗生物質選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）及びｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐｅｌＢ−Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２の発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。
【００５１】
【図２７】最終パニングから無作為にピックアップされた個々のクローンからのＡＭ３ファージＥＬＩＳＡ結果を描く図である。各々の棒線は、特定のＡＭ３変異体のＯＤ４０５での読取り値を表わしている。位置Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ負の対照及び正の対照である。
【００５２】
【図２８】Ｎｉ−ＮＴＡカラムからの ＡＭ３ ｓｃＦｖ精製結果を描く図である。溶出画分のアリコート２５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、その後クーマシーブルー染色を行なった。Ｍ：タンパク質マーカー; １：ＷＴクローン＃１の画分＃２; ２：ＷＴクローン＃１の画分３; ３：ＷＴクローン＃２の画分＃２; ４：ＷＴクローン＃２の画分＃３。
【００５３】
【図２９】ゲルろ過クロマトグラフィを用いた ＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体の精製の結果を描く図である。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたｓｃＦｖ抗体を、Superdex75カラムを用いたクロマトグラフィにかけた。図に示されているように、単量体ｓｃＦｖが、混合物中のタンパク質の残留物から分離された。
【００５４】
【図３０】図３０は、BiaCoreを用いた野生型ＡＭ２との比較におけるＡＭ３変異体の結合動態分析を描く図である。センサーグラムは、野生型に比べて著しく低い解離速度およびより高い結合親和力をもったの全４つのＡＭ３変異体を示した。曲線の勾配は、選択された抗体がどれほど速く抗原と会合し（初期）抗原から解離したか（終期）を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本開示全体を通して、様々な刊行物、特許及び公示済み特許明細書は、識別のための引用により言及されている。これらの刊行物、特許及び公示済み特許明細書の開示は、ここで、本開示中に参考として内含される。
【００５６】
一般的技術：
本発明の実施は、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来の技術を利用する。例えば、「ペプチド及びタンパク質のファージ表示」(B.K. Kay et al., 1996);「ファージ表示、実験室マニュアル」(C.F. Barbas III et al., 2001) Sambrook, Fritsch及びManiatis,「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版 (1989);「分子生物学の現行プロトコル」(F.M. Ausubel, et al. eds., (1987));「酵素学方法」シリーズ (Academic Press, Inc.):「ＰＣＲ２：実践的アプローチ」(M.J. MacPherson, B.D. Hames 及び G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow 及び Lane, eds. (1988),「抗体、実験室マニュアル」及び「動物細胞培養」(R.I. Freshney, ed. (1987))を参照のこと。
【００５７】
明細書及び特許請求の範囲で使用される単数形態「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、前後関係から明らかに反しない限り、複数の言及も含まれる。例えば「細胞」という語には、その混合物も含め、複数の細胞が含まれる。
【００５８】
定義：
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という語は、本明細書では、いずれの長さのアミノ酸の重合体にも言及するべく、互換可能に使用される。重合体は、線状、環状又は分岐状のいずれでもよく、また修飾されたアミノ酸を含んでもよく、また非アミノ酸によって中断されてもよい。この語はまた、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、アルギニル化のようなタンパク質に対するアミノ酸のトランスファＲＮＡにより媒介される付加、ユビキチン化、又は標識成分との結合のような他の操作により、修飾されたアミノ酸重合体をも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体を包含する天然の及び／又は非天然の又は合成のアミノ酸、及びアミノ酸類似体、及びペプチド模倣体(peptidomimetics）をいう。
【００５９】
ある指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列というのは、そのポリペプチドの起源を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、配列中でコードされたポリペプチド又はその部分（なおここで該部分は少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸から成る）のアミノ酸配列と基本的に同一であるか、又は配列中にコードされたポリペプチドにより免疫学的に同定可能である、アミノ酸配列を有する。この用語には、ある指定された核酸配列から発現されたポリペプチドも含まれる。
【００６０】
「キメラ」タンパク質は、天然に発生するものとは異なる配列中の位置にある領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。この領域は、別のタンパク質に通常存在して融合ポリペプチド中で一緒になってもよく、或いは同じタンパク質内に存在はするものの融合ポリペプチド中で新たな配置に置かれていてもよい。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によって又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作製および翻訳することによって生成し得る。
【００６１】
本明細書で使用されている「多量体タンパク質」という語は、in vitro又は in vivoで単一の球状タンパク質を形成するべく互いに会合した複数の別々のポリペプチド又はタンパク質鎖を含む球状タンパク質を意味する。多量体タンパク質は、「ホモ多量体」を形成するように同じ種類の複数のポリペプチドで構成され得る。あるいは、多量体タンパク質は、「ヘテロ多量体」を形成するように異なる配列の複数のポリペプチドで構成され得る。かくして、「ヘテロ多量体」は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む分子であり、ここで第２のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基により第１のポリペプチドとアミノ酸配列が異なっている。ヘテロ多量体は、第１及び第２のポリペプチドによって形成された「ヘテロ二量体」を含むことができ、或いは２つ以上のポリペプチドが存在する高次三次構造を形成することができる。ヘテロ多量体のための構造例としては、ヘテロ二量体（例えばＦｖ及びＦａｂフラグメント、二重特異性抗体(diabody）、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２複合体）、三量体Ｇ−タンパク質、ヘテロ四量体（例えばＦ（ａｂ’）2 フラグメント）及びさらなるオリゴマー構造が含まれる。
【００６２】
「リガンド」とは、レセプタのリガンド結合ドメインによって結合される能力をもつ分子を意味する。この分子は、化学的に合成されるものでも又は天然に発生するものでもよい。
【００６３】
「アゴニスト」とは、例えばレセプタといったシグナル伝達分子の生物活性を刺激する能力をもつ分子である。
【００６４】
「アンタゴニスト」とは、レセプタの生物活性を阻害する能力をもつ分子である。
【００６５】
「ペアワイズ相互作用」（pairwise interaction）とは、２つのアダプタが安定な複合体を形成するように互いに相互作用し互いに結合することができることを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドをパッケージングできるようにするため充分に長く存続するものでなくてはならない。複合体又は二量体は、形成時点と表示されたポリペプチドの検出時点の間に存在するか又は導入されるあらゆる条件に耐えることができなくてはならず、これらの条件は、実行される反応又は検定の関数である。
【００６６】
「一価表示」とは、遺伝子パッケージあたり単一コピーの外因性ポリペプチドの発現を意味する。一価のファージ表示系において、ファージ粒子の集まりは、ファージ粒子あたり平均してゼロ〜１つの外因性ポリペプチドを担持する。これとは対照的に「多価表示」とは、遺伝子パッケージあたり１コピーよりも多くの外因性ポリペプチドの発現を意味する。かくして多価ファージ表示系において、ファージ粒子の集まりは、平均して１コピーよりも多くの外因性ポリペプチドを担持する。
【００６７】
本明細書で用いられる「抗体」という語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（「免疫反応する」）抗原結合部位を含有する分子を意味する。構造的には、最も単純な天然に発生する抗体（例えばＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んで成る。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥといったような幾つかのタイプの分子を包含する大きな分子ファミリーを表わす。「免疫グロブリン分子」という語は、例えば、ハイブリッド抗体、又は改変された抗体、及びそのフラグメントを包含する。天然に発生する抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能が行われ得るということが示されている。これらのフラグメントは、「抗原結合単位」（「Ａｂｕｓ」）と総称される。Ａｂｕｓは、その分子構造に基づいて「１本鎖」（「Ｓｃ」）タイプと「非１本鎖」（「Ｎｓｃ」）タイプとに広く分けられる。
【００６８】
同様に「抗体」及び「Ａｂｕｓ」という語の中に包含されるのは、無脊椎動物及び脊椎動物を含む様々な種の起源の免疫グロブリン分子である。抗体又はＡｂｕに適用される「ヒト」という語は、ヒト遺伝子又はそのフラグメントにより発現された免疫グロブリン分子を意味する。非ヒト（例えばゲッ歯類又は霊長類）抗体に適用される「ヒト化」という語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限配列を含有するハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントである。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和力及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は霊長類といったような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも、あるいは移入されたＣＤＲまたは枠組配列内にも見出されない残基を含んでいる可能性がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練しヒトの体内に導入されるときの免疫原性を最小限におさえるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しかつＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、一般にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。
【００６９】
「非１本鎖抗原結合単位」（「ＮｓｃＡｂｕｓ」）は、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドを含むヘテロ多量体である。ＮｓｃＡｂｕｓの例としては、（１）本明細書で開示されているヘテロ二量体化配列により安定化されたｃｃＦｖフラグメント（図２４）；（２）本明細書に記載されているような少なくとも１つのｃｃＦｖフラグメントを含む他のいずれかの１価及び多価分子；（３）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；（４）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（５）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（６）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）2 フラグメント；（７）二重特異性抗体(diabody）及び（８）Littleら(2000)「今日の免疫学」に記載されている他のいずれかのＮｓｃＡｂｕｓが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００７０】
上述のように、ＮｓｃＡｂｕｓは、「一価」でも「多価」でもあり得る。前者は、抗原結合単位あたり１つの結合部位を有する一方、後者は、同じ種類又は異なる種類の１つよりも多くの複数の抗原に結合する能力をもつ多数の結合部位を含む。結合部位の数に応じて、ＮｓｃＡｂｕｓは、２価（２つの抗原結合部位をもつ）、３価（３つの抗原結合部位をもつ）、４価（４つの抗原結合部位をもつ）等々であり得る。
【００７１】
多価のＮｓｃＡｂｕｓはさらに、その結合特異性に基づいて分類され得る。「単一特異性」ＮｓｃＡｂｕは、同じ種類の１以上の抗原に結合する能力をもつ分子である。「多重特異性」ＮｓｃＡｂｕは、少なくとも２種類の異なる抗原に対する結合特異性をもつ分子である。かかる分子は通常２種類の異なる抗原のみと結合する（すなわち二重特異性Ａｂｕｓ）ことになるものの、三重特異性抗体といったような追加的特異性をもつ抗体が本明細書で用いられる場合には、それらもこの表現に包含される。二重特異性抗原結合単位の例としては、一方のアームが腫瘍細胞抗原に対して特異的であり、もう一方のアームが細胞毒性トリガー分子に対して特異的であるもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐｌ８５HER2／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（ＩＤ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５HER2、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌腫、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌腫）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激性ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプタ／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３等；腫瘍抗原に特異的に結合する１本のアームと毒素に結合する１本のアームをもつ二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インタフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマ・イディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗−ビンカアルカロイド；酵素活性化プロドラッグを変換するためのＢｓＡｂｓ、例えば（リン酸マイトマイシンのマイトマイシンアルコールへの変換の触媒として作用する）抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ等；線維素溶解薬として使用可能な二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）等；細胞表面レセプタに対し免疫複合体をターゲティングするための二重特異性抗原結合単位、例えば抗低密度リポタンパク（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプタ（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃｒＲＩＩＩ）等；感染性疾患の治療に使用するための二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプタ：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ等；in vitro又はin vivo での腫瘍検出のための二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ＣＥＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５HER2／抗ハプテン等；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂｓ；及び、診断手段としての二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。三重特異性抗体の例としては、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれている。
【００７２】
「１本鎖抗原結合単位」（「ＳｃＡｂｕ」）とは、単量体Ａｂｕを意味する。Ｆｖフラグメントの２つのドメインは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法によりそれらを単一タンパク質鎖（すなわちBird et al. (1988) Science 242:423-426及びHuston et al. (1988) PNAS 85:5879-5883）に記載されているような１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として作ることができるようにする合成リンカーを作ることが可能である。
【００７３】
「抗原結合単位のレパートリ」とは、複数の抗原結合単位であってその少なくとも２つが異なる結合特異性を示すものを意味する。抗原結合単位の遺伝的に多様なレパートリとは、複数の抗原結合単位であってその全てではないとしても大部分が相互に特有の結合特異性を示すものを意味する。遺伝的に多様なレパートリは、一般には、少なくとも１０6 〜１０13、好ましくは１０7 〜１０9 、より好ましくは１０8 〜１０10、さらに一層好ましくは１０8 〜１０11の異なる抗原結合単位という複雑さを有する。
【００７４】
抗体またはＡｂｕは、それがポリペプチドまたは他の物質を含む他の基準抗原に結合するよりも大きい親和力（affinity）または結合力(avidity）で結合する場合に、抗原「に特異的に結合する」又は抗原「と免疫反応性をもつ」。
【００７５】
Ａｂｕが宿主細胞の外表面に提示されるときに、Ａｂｕが「宿主細胞の表面上に」表示される。表示されたＡｂｕは、宿主細胞の外表面に直接付着されてもよいし、そうでなければファージ粒子といったような宿主細胞に結合された遺伝子パッケージにより宿主細胞に間接的に付着されてもよい。
【００７６】
本明細書で使用される「外表面配列」とは、遺伝子パッケージの「外表面タンパク質」をコードするヌクレオチド配列を意味する。これらのタンパク質は、遺伝子パッケージのゲノムを被包するタンパク様の外皮を形成する。一般的には、外表面タンパク質は、例えばファージ又は細菌といったような遺伝子パッケージの外表面上に表示されるべきポリペプチドを組立てるように該パッケージを誘導する。
【００７７】
遺伝子またはタンパク質に適用される「野生型」という語は、「天然に発生する」、「未改変の」遺伝子又はタンパク質を意味する。これらの語には、細胞又は遺伝子パッケージ内に天然に見出される全長のプロセッシングされたポリヌクレオチド及びポリペプチドが含まれる。「野生型外表面タンパク質」という語は、ウイルス、細胞又は胞子のいずれであるかにかかわらず、天然に発生する遺伝子パッケージの外皮を形成するようなタンパク質を意味する。繊維状バクテリオファージの場合、野生型タンパク質は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）及び遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。
【００７８】
本明細書で使用される「抗原」とは、抗体により特異的に認識され結合される物質を意味する。抗原には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質；それらの部分及び組合せが含まれうる。
【００７９】
本明細書で使用される「表面抗原」という語は、細胞の原形質膜構成要素を意味する。これは、原形質膜を構成する内在性及び表在性膜タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質を包含する。「内在性膜タンパク質」というのは、細胞の原形質膜の脂質二重層を横断して延在する膜貫通タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質は、疎水性アミノ酸残基を一般に含んで成る少なくとも１つの「膜貫通セグメント」で構成されている。表在性タンパク質は、脂質二重層の疎水性内部には延在せず、他の膜タンパク質との非共有結合性相互作用により膜表面に結合される。
【００８０】
細胞タンパク質に対し適用される「膜」、「細胞質ゾル」、「核」及び「分泌」といった語は、細胞タンパク質が大部分として、優勢に又は優先的に局在化される細胞外及び／又は細胞内の場所を特定する。
【００８１】
「細胞表面レセプタ」は、そのそれぞれのリガンドに結合する能力をもつ膜タンパク質のサブセットを表わす。細胞表面レセプタは、細胞原形質膜上に固定（anchor）されるか又は細胞原形質膜の中に挿入された分子である。これらは、原形質膜の構造構成要素としての役割のみならず、調節要素すなわち様々な生物学的機能を調節するシグナル伝達分子としての役割もする、タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質の大きなファミリーを構成する。
【００８２】
「ヘテロ二量体レセプタ」は、リガンドに対する結合親和力を示す２つのタンパク様サブユニットを含んで成る細胞タンパク質を包含する。２つのタンパク様サブユニットは、少なくとも１つのアミノ酸残基によりアミノ酸配列が異なる別異の分子である。ヘテロ二量体レセプタの非限定的な例としては、増殖因子（例えばヘレグリン）、神経伝達物質（例えばγ−アミノ酪酸）及び他の有機又は無機の小分子（例えば、鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）に結合するものがある。好ましいヘテロ二量体レセプタは、核ホルモンレセプタ(Belshaw et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93(10):4604-4607)、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２レセプタ複合体、及び限定されることなくオピオイドを含むＧタンパク質結合レセプタ(Gomes et al. (2000) J. Neuroscience 20(22):RC110); Jordan et al. (1999) Nature 399:697-700)、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン、及びＧＡＢＡB レセプタファミリーである。
【００８３】
「ドメイン」とは、タンパク質又はペプチドの他の部分から物理的又は機能的に区別されるタンパク質の部分を意味する。物理的に定義づけされるドメインとしては、膜関連又は細胞質関連の配列といったような例外的に疎水性又は親水性のアミノ酸配列が含まれる。ドメインはまた、例えば遺伝子重複から発生する内部相同性によっても定義づけされうる。機能的に定義づけされるドメインは、異なる生物学的機能を有する。例えば、レセプタのリガンド結合ドメインは、リガンドと結合するドメインである。抗原結合ドメインは、抗原に結合する抗体又は抗原結合単位の部分を意味する。機能的に定義づけされるドメインは、接近するアミノ酸配列によりコードされる必要が無い。機能的に定義づけされるドメインは、１以上の物理的に定義づけされるドメインを含みうる。例えば、レセプタは一般に、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内エフェクタドメインに分けられる。「膜アンカードメイン」というのは、膜会合を媒介するタンパク質の部分を意味する。一般に、膜アンカードメインは、疎水性アミノ酸残基で構成されている。あるいは、膜アンカードメインは、修飾アミノ酸、例えば、該タンパク質を膜に固定させる脂肪酸鎖に付着されたアミノ酸を含みうる。
【００８４】
「宿主細胞」には、本発明のベクターのレシピエントでありうるか又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の後代が含まれる。後代は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異に起因して、もとの親細胞と必ずしも完全に同一（形態学又は合計ＤＮＡ補体のゲノミクスに関して）でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターによる in vivoのトランスフェクションを受けた細胞が含まれる。
【００８５】
「細胞系統」又は「細胞培養物」は、in vitroで増殖または維持された、細菌、植物、昆虫又は高等真核生物の細胞を表わす。ある細胞の子孫は親細胞と（形態学、遺伝子型、又は表現型のいずれかに関して）完全に同一でないことがある。
【００８６】
「ディファインド培地」とは、培地の成分がわかるように培地中の細胞の生存及び／又は増殖に必要な栄養及びホルモンの要求量を含む培地を意味する。従来、ディファインド培地は、増殖及び／又は生存にとって必要な栄養及び成長ホルモンの添加によって配合されてきた。典型的には、ディファインド培地は、以下のカテゴリーの１種以上からの少なくとも１種の成分を提供する：ａ）全ての必須アミノ酸、通常は２０種のアミノ酸＋システインという基本セット；ｂ）通常はグルコースといったような炭水化物の形をしている、エネルギー源；ｃ）低濃度で必要とされるビタミン及び／又は他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；及びｅ）微量元素（なおここで微量元素は、通常はマイクロモル範囲内の、非常に低い濃度で一般的に要求される天然に発生する元素又は無機化合物として定義づけされる）。ディファインド培地は、同様に、以下のカテゴリーのいずれかからの１種以上の成分で任意に補足されてもよい：ａ）１種以上の有糸分裂誘発剤；ｂ）例えばカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩といった塩及び緩衝液；ｃ）例えばアデノシン及びチミジン、ヒポキサンチンといったようなヌクレオシド及び塩基、及びｄ）タンパク質及び組織加水分解産物。
【００８７】
本明細書で使用される「単離された」という語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントが通常自然状態で結び合わされている細胞及びその他の形の成分から分離されることを意味している。当業者にとっては明らかであるように、天然に発生しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、それをその天然に発生する対応物と区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」又は「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、体積あたりの分子数又は濃度がその天然に発生する対応物に比べて「濃縮された」ものの方が大きいか又は「分離された」ものの方が小さいという点で、その天然に発生する対応物と区別することができる。
【００８８】
富化は、溶液の体積あたり重量といった絶対基準で測定することもできるし、又は、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉性の物質との関係において測定することもできる。本発明の実施形態の富化は、その程度が増大すればするほど好ましい。かくして、例えば２倍の富化が好ましく、１０倍の富化はさらに好ましく、１００倍の富化はさらに好ましく、１０００倍の富化はより一層好ましい。化学的合成又は組換え型発現といったような人工的組立てプロセスにより、単離された状態で物質を提供することも可能である。
【００８９】
「連結された」及び「融合された」又は「融合」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの語は、化学的結合又は組換え手段を含むあらゆる手段による、２つ以上の化学的要素又は構成要素の連結を意味する。「インフレーム融合」(in frame fusion）とは、もとのオープンリーディングフレームの正しいリーディングフレームを維持する形でより長い連続ＯＦＲを形成するための２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）の連結を意味する。かくして、結果として得られた組換え型融合タンパク質は、もとのＯＦＲによりコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは通常は自然状態でこのように連結されていない）を含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームはかくして、融合されたセグメント全体を通して連続した状態にされているが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列（例えば「フレクソン」）により物理的又は空間的に分離され得る。
【００９０】
本明細書で用いられる「フレクソン」というのは、典型的には小さい側鎖をもつアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン）を含む可とう性ポリペプチドリンカー（又はかかるポリペプチドをコードする核酸配列）を意味する。本発明の融合体の１以上の部位の間にフレクソンを取込むことにより、互いに比較的独立した立体配座をとることができるようにして機能性を促進することが可能である。
【００９１】
ポリペプチドに関して、「線状配列」又は「配列」は、その配列内で互いに隣接し合う残基がポリペプチドの一次構造において連続しているアミノからカルボキシ末端方向へのポリペプチドのアミノ酸の順序である。「部分配列」というのは、一方又は両方の方向に付加的な残基を含むものとして知られているポリペプチドの部分の線状配列である。
【００９２】
「非相同」（heterologous）とは、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、その未改変コーディング配列から除去されてその未改変配列以外のコーディング配列に作動的に連結されたプロモータが、非相同プロモータである。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「非相同」という語は、該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味している。例えば、非相同ポリヌクレオチド又は抗原は、異なる種の起源、異なる細胞型、及び異なる個体の同じ細胞型に由来し得る。
【００９３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換可能に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さを有するヌクレオチドの重合体形態を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造をもっていてよく、既知又は未知の任意の機能を行うことができる。以下に記すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコーディング又は非コーディング領域、連鎖分析から規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え型ポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体といったような修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それは、重合体の組立ての前後いずれでも付与できる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断され得る。ポリヌクレオチドを、標識構成要素との結合などによって、重合後にさらに修飾することが可能である。
【００９４】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え型」という語は、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限及び／又は連結の段階、及び天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構成体を結果としてもたらすその他の手順の様々な組合せの産物であることを意味している。
【００９５】
「遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」という語は、ここでは互換可能に使用されている。これらは、転写及び翻訳後に特定のタンパク質をコードする能力をもつ少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを意味する。遺伝子又は遺伝子フラグメントは、そのポリヌクレオチドが、コーディング領域全体又はそのセグメントを網羅しうる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでいるかぎりにおいて、ゲノム又はｃＤＮＡであり得る。
【００９６】
「作動可能な形で連結された」又は「作動的に連結された」という語は、このように記述される構成要素がその意図される形で機能できるようにする関係にある並置を意味する。例えば、プロモータ配列は、それがコーディング配列の転写を促進する場合に、コーディング配列に作動可能な形で連結されていることになる。
【００９７】
「融合遺伝子」というのは、一緒に連結されている少なくとも２つの非相同ポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子である。
【００９８】
遺伝子「データベース」というのは、生物学的参照材料の集まりを表わすヌクレオチド及びペプチド配列を包含する配列の集まりを表わす、保存されたデータ組を意味する。
【００９９】
本明細書で使用される「発現」という語は、ポリヌクレオチドをｍＲＮＡに転写するプロセス及び／又は転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）をその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質へと翻訳するプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１００】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を宿主細胞内に及び／又は宿主細胞間で移入する核酸分子、好ましくは自己複製性核酸分子である。この用語は、細胞内へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主として機能する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。同様に含まれるのは、上述の機能のうちの複数のものを提供するベクターである。
【０１０１】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入されたときにポリペプチドに転写され翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは通常、所望の発現産物を生成するべく機能しうる発現ベクターを含んで成る適切な宿主細胞を意味する。
【０１０２】
「レプリコン」というのは、適切な宿主細胞内でのポリヌクレオチドの複製を可能にする複製起点（一般にはｏｒｉ配列と呼ばれる）を含むポリヌクレオチドを意味する。レプリコンの例には、エピソーム（例えばプラスミド）、ならびに染色体（例えば核又はミトコンドリア染色体）が含まれる。
【０１０３】
「シグナル伝達」というのは、刺激性又は阻害性シグナルが細胞内へ及び細胞内で伝達されて細胞内応答を惹起するプロセスである。「シグナル伝達経路のモジュレータ」とは、同じ特異的シグナル伝達経路に位置付けられた１以上の細胞タンパク質の活性を調節する化合物を意味する。モジュレータは、シグナル伝達分子の活性を増大又は抑制しうる。
【０１０４】
本発明のアダプタ誘導型表示系
本発明の中心的態様は、ペプチド結合によりいずれの機能的外表面配列にも連結されていない無作為の又は予め定められたポリペプチドのライブラリ又は外因性ポリペプチドの遺伝子パッケージ上での表示を可能にする表示系の設計にある。本発明の系は、発現ベクターによる外表面タンパク質の発現に付随する全ての欠点を回避する。実験的設計は、ウイルス、細胞及び胞子といったような遺伝子パッケージにより提示される所望の特性をもつタンパク質を提示しかつ／又は選択するために特に有用である。
【０１０５】
本発明の表示系は、２つの構成要素を含んで成る。すなわち（１）遺伝子パッケージの外表面上に表示されるべきポリペプチドをコードする問題の外因性遺伝子を担持する発現ベクター、及び（２）特に問題のポリペプチドの表示を促進するヘルパーベクターである。以前に報告された表示系と異なり、本発明の系は以下の特有の特長を有する。まず第１に、発現ベクターは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示されるべき外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含む。第２に、発現ベクターは、遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如している。第３に、ヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要な全ての外表面配列を含み、その外表面配列の少なくとも１つが第２のアダプタ配列にインフレームで融合され、ここで外因性ポリペプチドの表示は第１アダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用によって媒介される。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、上述の特徴をもつファージヘルパーベクター及びファージミド発現ベクターを含んでなるファージ表示系を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、細菌発現ベクター及び細菌ヘルパーベクターが上記の特長を示す細菌表示系を提供する。該ファージ表示系及び細菌表示系の実験的設計は、哺乳動物細胞表示系といったような真核生物発現系の構築に拡張することができる。
【０１０７】
本発明のファージ表示系：
上述のように、以前に報告されたファージ表示系には、数多くの顕著な欠点があった。例えば、一般に利用される遺伝子ＩＩＩ系及び遺伝子ＶＩＩＩ系は、いくつかの固有の欠点をもつ。なかでも挙げられるのは、（１）遺伝子パッケージの或る種の外表面タンパク質との融合体として外因性ポリペプチドを発現する結果としての、宿主細胞に対する毒性；（２）遺伝子パッケージ上に外因性ポリペプチドをパッケージングするのに外表面タンパク質の或る領域が必要とされることを理由とする、表示すべき外因性ポリペプチドのサイズ及び配向に対する厳密な制限；及び（３）ヘルパーベクターによって一般的に提供される野生型外表面タンパク質と上記融合体との間の組換えに起因する、融合産物の不安定性。最近報告された「システインカップリングされた」表示系（ＷＯ０１／０５９５０）は、ペプチド結合を介した外表面タンパク質融合の発現を回避するものの、宿主細胞に対するこれらのタンパク質の毒性を最低限におさえることはなおもできていない。その上、１つの特定の設計、すなわちＷＯ０１／０５９５０に記載された２ベクター系は、ヘルパーファージの感染により、不可避的にミスパッケージングされたベクターを産生する。ミスパッケージングされたベクターは、外表面配列を含むものの外因性遺伝子を含まない。本発明のファージ表示系は、これらの欠点を回避し、その他の関連する利点を提供する。
【０１０８】
本発明の設計の中心的態様は、ファージパッケージングに必要とされる外表面タンパク質からの外因性ポリペプチドの分離である。かくして、外因性ポリペプチドを担持するファージミドベクター（発現ベクター）は、機能的外表面タンパク質をコードする配列を全く含有しない。ファージ粒子表面上への外因性ポリペプチドの提示は、２つのアダプタのペアワイズ相互作用によって媒介される。アダプタの一方は、ファージミドベクターによりコードされた外因性ポリペプチドとインフレームで融合され、もう一方は、ヘルパーベクターによりコードされた少なくとも１つの外表面タンパク質とインフレームで融合される。ファージミドベクターを担持する宿主細胞がヘルパーファージによる感染を受けた時に、コードされた外因性ポリペプチドは、それぞれのアダプタの間でのペアワイズ相互作用を介して外表面タンパク質との複合体を形成する。この複合体はこのとき、ファージの表面尾鞘内にパッケージングされ、外因性ポリペプチドをその外表面上に露出された状態に残す。
【０１０９】
本発明のファージミドベクターの一般的特徴：
いくつかの因子が、本発明のファージ表示系の構築に適用される。まず第１に、ファージミドベクターは、ポリペプチドが表示されるべき遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする配列も含まない。「機能的」というのは、遺伝子パッケージが問題のポリペプチドをその外表面上に組立てるのを促進するか又は誘導する能力を、コードされた外表面タンパク質が保持していることを意味する。発現ベクターから除外されるべき精確な外因性配列は、ファージパッケージの選択によって左右される。
【０１１０】
本明細書で使用される「ファージ」という語は、ウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムが中に被包されているタンパク質外皮を含んで成るウイルスを包含する。ウイルスゲノムは、１本鎖又は２本鎖、線状又は環状のＤＮＡ又はＲＮＡで構成されうる。ファージは、制限的な意味なく細菌細胞といったような原核生物を含む、広範囲の宿主細胞を感染させることができる。繊維状又は非線維状の数多くのファージのゲノムが配列決定されている。代表的な繊維状ファージとしては、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｉｆｌ、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３が含まれる。繊維状ファージのクラスの中では、Ｍ１３が最も良く特徴づけされた種である。その３次元構造は既知であり、その外皮タンパク質の機能は充分に理解されている。具体的には、Ｍ１３ゲノムは、５つの外皮タンパク質、すなわちｐＩＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸをコードする。本発明ファージ表示系のＭ１３ベースの発現ベクターを構築するためには、全ての外皮コーディング配列を欠失させるか又は改変させて、コードされたタンパク質産物がファージ粒子の外表面上での外因性ポリペプチドの提示をもたらすことができないようにしなければならない。機能的外表面タンパク質に対する適切な修飾は、次のような結果をもたらし得る：（１）シグナルペプチドが次に切断されて離れることになる細菌細胞のペリプラズムへの外表面タンパク質の細胞内移行を誘導する機能的シグナルペプチドの喪失；（２）細菌細胞膜及び／又はファージ外皮に成熟ポリペプチドを固定（anchor）する外皮タンパク質ドメインの機能の喪失；（３）ファージレセプタ、宿主細菌のＦ−線毛に特異的に結合する外皮タンパク質の機能の喪失；及び／又は（４）いかなる機能的外皮タンパク質の発現をも防ぐための内部停止コドンの導入。ｐＩＩＩといったような複数の外皮タンパク質内のこれらの及びその他のドメインは、すでに記述されてきた（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号参照）。ｆｌ及びｆｄの繊維状ファージといったようなその他の密に関連する構成員の外表面タンパク質も同様に、当該技術分野において充分知られている（例えばKay et al. (1996)、ペプチド及びタンパク質のファージ表示：実験室マニュアル、Academic Press., Inc. San Diego）。好ましくは、Ｍ１３ベースの発現ベクター内で提示される唯一のファージ配列は、ファージミド複製及びパッケージのために必要とされるｆｌ起点を含んでいる。Ｍ１３ベースの発現ベクターの構築についての段階的な例示は、例１〜４に詳述される。かくして、当業者であれば、過度の実験無く、請求の範囲に記載の特長をもつ発現ベクターを容易に構築することができる。
【０１１１】
他の繊維状ファージを用いて類似の構築を行うことも可能である。Ｐｆ３は、ＩｎｃＰ−１プラスミドを包含するシュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aerugenosa）細胞を感染させるもう１つの周知の繊維状ファージである。Ｐｆ３の全ゲノムが配列決定され、複製及び組立てに関与する遺伝子シグナルが特徴づけされてきた（Luiten et al. (1985) J. Virology 56(1):268-276）。Ｐｆ３の主要な外皮タンパク質は、その分泌を導くためのいかなるシグナルペプチドももたないという点で、普通ではない。配列は、露出されているアミノ末端と一貫性ある荷電残基ＡＳＰ7 、ＡＲＧ37、ＬＹＳ40及びＰＨＥ44−ＣＯＯ- を有する。Ｐｆ３ファージのための１３９ｂｐのＤＮＡのウイルスストランド複製起点も同様に同定された（Luiten et al. (199) J. Bacteriol 173(13):4007〜4012）。Ｐｆ３ベースの発現ベクターを構築するためには、いかなる機能的主要外皮タンパク質もコードされないような形でＰｆ３外皮コーディング配列を欠失又は改変させなくてはならない。好ましい発現ベクターは、その複製及びパッケージングのためのＰｆ３ファージ複製起点しか含まない。
【０１１２】
同じアプローチは、非繊維状ファージから誘導されたファージミドベクターの構築にもあてはまる。このクラスのファージの非限定的で代表的な構成員は、バクテリオファージφＸ１７４、λ、Ｔ４及びＴ７である。バクテリオファージφＸ１７４は、遺伝学、生化学及び電子顕微鏡法により徹底的に研究された非常に小さい二十面体ウイルスである。φＸ１７４の３つの遺伝子産物、すなわちＦ（カプシド）、Ｇ（主要スパイクタンパク質、１ビリオンあたり６０コピー）、及びＨ（非主要スパイクタンパク質、１ビリオンあたり１２コピー）が、成熟ビリオンの外側に存在する。タンパク質Ｇは、１７５個のアミノ酸を含む一方、Ｈは３２８個のアミノ酸を含む。タンパク質Ｆは、ウイルスの１本鎖ＤＮＡと相互作用する。タンパク質Ｆ、Ｇ及びＨは、ウイルス感染を受けた細胞内で単一のｍＲＮＡから翻訳される。かくして、このクラスの非繊維状ファージに基づく発現ベクター例には、Ｆ、Ｇ及びＨタンパク質のいずれのコーディング配列もが欠如している。他の代替的な発現ベクターは、機能的なタンパク質Ｆ、Ｇ及びＨを生じない改変されたＦ、Ｇ又はＨコーディング配列を含む。
【０１１３】
本発明のヘルパーファージベクターの一般的特徴：
本発明のファージ表示系の第２の構成要素は、いかなる機能的外表面配列もが欠如した発現ベクターを相補するべく機能するヘルパーベクターである。必要な外皮タンパク質コーディング配列の１つが欠如しているか又は遺伝子パッケージの欠損外皮タンパク質をコードする配列を含有する以前に記載されているヘルパーベクター（米国特許第５，９６９，１０８号）とは異なり、本発明のヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要とされる外表面配列の全てを提供する。利用される精確な外表面配列は、ここでもファージパッケージの選択によって左右される。
【０１１４】
上述のとおり、様々なファージについての豊富な構造的及び生化学的情報が、当該技術分野において利用可能である。数多くのタイプの遺伝子パッケージを複製しパッケージングするのに必要とされる構造的タンパク質及び酵素をコードする遺伝子配列が同定され、以前の表示系を構築するために広く用いられている（米国特許第６２４８５１６号、第５９６９１０８号、第５８８５７９３号、第５８３７５００号、第５５７１６９８号、第５２２３４０９号、第５５１４５４８号、ＷＯ９００５１４４、ＥＰ０３６８６８４、ＷＯ０９２０１０４７、ＷＯ０９３１１２３６及びＷＯ０９７０８３２０）。これらの配列は一般に、付加的な独特の特長を示す本発明のヘルパーベクターを構築するために一般に応用可能である。
【０１１５】
具体的には、本発明のヘルパーファージベクターは一般に、ヘルパーファージ及びファージミドベクターの両方を被包する役割を担う全ての外表面配列を含んで成る。１つの態様において、ヘルパーファージベクターは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｉｆｌ、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３のうちの１つの繊維状ファージの全ての外皮タンパク質をコードする外表面配列を含んで成る。Ｍ１３ベースのヘルパーファージベクターの好ましい外皮コーディング配列は、ｇＩＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＩＸ又はその機能的等価物である。もう１つの態様において、ヘルパーファージベクターは、バクテリオファージφＸ１７４、λ、Ｔ４及びＴ７から成るグループの中から選択された非繊維状ファージの外皮コーディング配列を含む。これらの構造的タンパク質に加えて、ヘルパーファージベクターは一般的に、ファージミドベクターの複製及びパッケージングを「助ける」ようにファージミドベクター及びヘルパーファージの両方の上に担持されたファージ複製起点に対してトランスに作用する他のファージ由来の酵素もコードする。本発明の好ましいＭ１３ヘルパーベクターは、ファージミドベクターの好ましいパッケージングを確保するべく複製欠損性である。好ましくは、パッケージングされたベクターの９０％以上がファージミドベクターである。さらに一層好ましくは、パッケージングされたベクターの９９％以上がファージミドベクターである。好ましいＭ１３ヘルパーファージベクターはさらに、タンパク質Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｘ又は機能的等価物をコードする配列を含む。本明細書で使用されているように、外表面タンパク質の機能的等価物には、野生型外表面タンパク質の機能性を保持する修飾された外表面タンパク質についてコードするものが含まれる。機能的に等価である外表面タンパク質には、対応する野生型タンパク質の特性を増強、減少させるか又はそれに対しわずかに影響を与えるものが含まれている。これらの等価物は、保存的アミノ酸置換をもつポリペプチドや、融合体及び突然変異体を含む類似体でありうる。好ましいＭ１３ヘルパーベクターは、干渉耐性を有している。干渉耐性ヘルパーベクターの例としては、Ｍ１３ＫＯ７（American Pharmacia Biotech）及びＶＣＳＭ１３（Stratagene）といったようなその誘導体である。これら２つの干渉耐性ヘルパーベクターは、ファージ粒子をパッケージングするために必要なファージ配列を提供する。
【０１１６】
本発明のヘルパーファージベクターは、ファージパッケージングに必要な外表面配列の全てが存在するかぎりにおいて、ある一定の外表面配列の１又はそれ以上のコピーを含むことができる。各々の必要な外表面配列の１コピーの使用は、一般的に、「多価」ファージ表示系を生じる。これとは対照的に、ある一定の外表面配列及びその機能的等価物の１よりも多くのコピーの取込みは、「１価」ファージ表示系を生み出す。１価表示は、中庸の親和力及び高い親和力で標的と結合する表示されるポリペプチドを互いに区別することを可能にする。１価表示はまた、低親和力の抗原の１よりも多くのコピーを発現するファージがより高い親和力の抗体の１コピーを発現するファージと同じ見かけの親和力を有することになる「結合力」(avidity）効果を回避することによって、親和力に基づき抗体などのポリペプチドの選択を助ける。しかしながら、多価表示は代替的な利点を提供する。多価表示は特に、結合ポリペプチドの選択の初期段階において特に有用である。スクリーニングの初期段階においては、単一の高親和力の候補を同定するよりも、潜在的なリードとして広範囲のスペクトルのポリペプチドを蓄積することが好ましいことが多い。初期スクリーニングを通して得られたポリペプチドは、次に、一価表示又は他の方法を用いてその親和力に関して順序づけされうる。本発明は、多価表示系のヘルパーファージベクター例（図５Ａ）を提供する。得られるヘルパーファージを細菌細胞に感染させることによって、パッケージングされたファージミド粒子は、遊離ｐＩＩＩよりも約２倍多い外因性ポリペプチド／ｐＩＩＩ複合体を示し、これは、パッケージングされたファージが１コピーよりも多くの結合価を有することを表わしている（例２、図１１を参照のこと）。さらに本発明で提供されるのは、ＫＯ７遺伝子ＩＩＩ外表面配列のコピー及び遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分のコピーを担持するＭ１３ヘルパーファージである（図１９Ａ及び例４）。後者の配列は、パッケージングのために野生型ｐＩＩＩと競合する能力をもつ機能的等価物をコードする。得られるヘルパーファージは、一価の表示系を生じるものと予想されている。
【０１１７】
特に好ましいヘルパーベクターは、一価及び多価の両方の表示を支持する。かかるヘルパーベクターは、例えばＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩといった外表面配列の第１及び第２のコピーの間に抑制可能な翻訳停止コドンを取込むことによって構築可能である。抑制可能なコドンは、抑制条件下でコドン（例えば遺伝子ＩＩＩ）の下流側のヌクレオチド配列の翻訳を可能にするが、非抑制条件下では翻訳は該コドンで終わる。ヘルパーファージを抑制条件下、例えばサプレッサー細菌菌株内で増殖させるときに、パッケージングのために第１のコピーと競合する外表面タンパク質の第２のコピーが発現される：すなわち一価のファージ表示が起こる。しかしながら、同じヘルパーファージを非抑制細菌菌株内で増殖させるときに、外表面配列の第２のコピーは発現されず、かくして多価表示系が生じる。かくして、抑制可能コドンは、２つの異なる条件に置かれるときにいずれかの表示形態を抑制する便利な「スイッチ」として機能する。抑制可能な翻訳停止コドンの例としては、アンバー、オーカー、及びオパールコドンがある。
【０１１８】
本発明のアダプタの一般的特徴：
ファージ表示系を構築する上でのさらなる考慮事項は、ペアワイズ相互作用の能力をもつ２つのアダプタをコードする一対のアダプタ配列を選択することである。アダプタ配列の一方はファージミドベクターにより担持された外因性配列とインフレームで挿入されるものであり、もう一方はヘルパーファージベクターの外表面タンパク質の少なくとも１つとインフレームで融合される。「ペアワイズ相互作用」というのは、２つのアダプタが互いに相互作用し結合して安定な複合体を形成できるということを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外表面上でのポリペプチドのパッケージングを可能にするべく充分長く存続しなくてはならない。この複合体又は二量体は、形成時点と表示されたポリペプチドの検出時点との間に存在するか又は導入される条件がいかなるものであっても、それに耐えることができなくてはならず、これらの条件は実行される反応又は検定の関数である。ペリプラズムで組立てられるファージ（例えばＭ１３）については、複合体又は二量体は、それがファージゲノムと共にパッケージングされる細菌ペリプラズム内に常駐する場合充分に安定でなければならない。安定な複合体又は二量体は、それがこの定義のその他の必要条件を満たすかぎり、不可逆的であっても可逆的であってもよい。かくして、過渡的な複合体又は二量体が反応混合物内で形成しうるが、それが自発的に解離して遺伝子パッケージの外表面上に表示される検出可能なポリペプチドを全く生成しない場合には安定な複合体を構成しない。
【０１１９】
第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用は、共有結合性相互作用であっても非共有結合性相互作用であってもよい。非共有結合性相互作用は、共有結合の形成を結果として生じない全ての既存の安定な結合を包含する。非共有結合性相互作用の非限定的な例としては、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチドの立体嵌合がある。これとは対照的に、共有結合性相互作用は、限定されないが、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合、２つの炭素含有分子間のＣ−Ｃ結合、炭素と酸素又は水素とを含有する分子間のＣ−Ｏ又はＣ−Ｈ、及び酸素とリン酸を含有する分子間のＯ−Ｐ結合を包含する、共有結合の形成を結果として生じる。
【０１２０】
本発明の表示系の発現ベクター及びヘルパーベクターを構築するために適用可能なアダプタ配列は、様々な供給源に由来することができる。一般的に、安定な多量体の形成に関与するあらゆるタンパク質配列が、アダプタ配列の候補である。かくして、これらの配列は、任意のホモ多量体又はヘテロ多量体のタンパク質複合体に由来し得る。代表的なホモ多量体タンパク質は、ホモ二量体レセプタ（例えば血小板由来の増殖因子ホモ二量体ＢＢ（ＰＤＧＦ））、ホモ二量体転写因子（例えばＭａｘホモ二量体、ＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）ホモ二量体）及び増殖因子（例えばニューロトロフィンホモ二量体）である。ヘテロ多量体タンパク質の非限定的な例は、プロテインキナーゼとＳＨ２ドメイン含有タンパク質の複合体（Cantley et al. (1993) Cell 72:767-778; Cantley et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(44): 26029-26032）、ヘテロ二量体転写因子、及びヘテロ二量体レセプタである。
【０１２１】
好ましいヘテロ二量体転写因子は、ａ−Ｐａｌ／Ｍａｘ複合体及びＨｏｘ／Ｐｂｘ複合体である。Ｈｏｘは、胚形成中の前−後軸のパターン化に関与する転写因子の大ファミリーを表わす。Ｈｏｘタンパク質は、保存された３つのαらせんホメオドメインをもつＤＮＡと結合する。特異的ＤＮＡ配列に結合するために、Ｈｏｘタンパク質は、Ｐｂｘホメオドメインといったようなヘテロ因子の存在を必要とする。Wolberger et al.は、Ｈｏｘ−Ｐｂｘ複合体の形成がどのようにして発生し、この複合体がＤＮＡにどのように結合するかを理解するため、ＨｏｘＢ１−Ｐｂｘ１−ＤＮＡ三元複合体の２．３５Åの結晶構造を解いた。この構造は、各タンパク質のホメオドメインがＤＮＡの相対する側で隣接する認識配列に結合することを示している。ヘテロ二量体化は、ＨｏｘＢ１のホメオドメインに対する６アミノ酸ヘキサペプチドＮ末端と、らせん３とらせん１及び２の間に形成されたＰｂｘ１内のポケットとの間で形成される接触を通して起こる。Ｐｂｘ１ホメオドメインのＣ末端伸長部は、さらに大きな４らせんホメオドメインを形成すべく、らせん１に対してパッキングするαらせんを形成する（Wolberger et al. (1999) Cell 96:587-597; Wolberger et al. J Mol Biol. 291:521-530）。
【０１２２】
多大な数のヘテロ二量体レセプタも同定されている。これらには、増殖因子（例えばヘレグリン）、神経伝達物質（例えばγ−アミノ酪酸）及び他の有機又は無機の小分子（例えば鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）に結合するものが含まれるが、それらに制限されるわけではない。好ましいヘテロ二量体レセプタは、限定されることなくオピオイド（Gomes et al. (2000) J. Neuroscience 20(22): RC110）; Jordan et al. (1999) Nature 399:697-700）、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン及びＧＡＢＡB レセプタファミリーを包含する、核ホルモンレセプタ（Belshaw et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93(10): 4604-4607）、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２レセプタ複合体、及びＧ−タンパク質結合レセプタである。既知のヘテロ二量体レセプタの大部分について、それらのＣ末端配列がヘテロ二量体形成を媒介することが見出されている。
【０１２３】
本発明の表示系の構築のためのアダプタとして、Ｌ及びＨ鎖の二量体化に関与する抗体鎖の配列を使用することもできる。これらの配列には、Ｌ鎖又はＨ鎖の定常領域配列が含まれるが、それらに制限されるわけではない。さらには、アダプタ配列は、抗原結合部位配列及びその結合抗原に由来することができる。このような場合に、対の一方のアダプタは、対応する抗原残基を含むもう一方のアダプタにより認識される（すなわちもう一方のアダプタと安定な形で会合できる）抗原結合部位アミノ酸残基を含有する。
【０１２４】
膨大な遺伝子ファミリーについての豊富な遺伝子及び生化学データに基づいて、当業者は、過度の実験無く、本発明の表示系を構築するために適切なアダプタ配列を選択し取得することができるだろう。
【０１２５】
望ましい場合、新規のヘテロ多量体タンパク質からの配列をアダプタとして利用することができる。かかる状況においては、ヘテロ多量体の形成に関与する配列候補の同定は、過度の実験無くあらゆる遺伝子又は生化学検定により見極めることができる。さらに、コンピュータモデリング及び探索技術により、関連する及び関連しない遺伝子内に現われた共通のドメインの配列相同性に基づいてヘテロ多量体配列の検出が容易になる。相同性探索を可能にするプログラムの非限定的な例は、Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), Fasta (Genetics Computing Group package, Madison, Wisconsin), DNA Star, Clustlaw, TOFFEE, COBLATH, Genthreader、及びMegAlignである。標的レセプタ又はそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含むあらゆる配列データベースを、配列分析のために使用することができる。一般に利用されているデータベースにはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、及びＨＴＧＳが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２６】
ヘテロ二量体化配列に由来する本発明のアダプタは、その物理的特性に基づいてさらに特徴づけすることができる。好ましいヘテロ二量体化配列は、ペアワイズ親和力を示し、ホモ二量体の実質的排除に至るまでのヘテロ二量体の優勢な形成を結果としてもたらす。好ましくは、この優勢な形成により、生理緩衝液条件及び／又は生理体温下で形成できる少なくとも６０％のヘテロ二量体、より好ましくは少なくとも８０％のヘテロ二量体、より好ましくは８５〜９０％のヘテロ二量体、さらに好ましくは９０〜９５％のヘテロ二量体、さらに一層好ましくは９６〜９９％のヘテロ二量体を含有するヘテロ多量体プールが生じる。本発明の或る種の実施形態においては、アダプタ対のヘテロ二量体化配列の少なくとも１つは、生理緩衝液及び／又は生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたない。「能力を基本的にもたない」というのは、選択されたヘテロ二量体化配列を単独でテストした場合に、Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）に詳述されている通りのin vitro沈降実験又はin vivo ２ハイブリッド酵母分析（例えばWhite et al. Nature (1998) 396:679-682参照）において、検出可能な量のホモ二量体が生成されないことを意味する。さらに、個々のヘテロ二量体化配列を宿主細胞内で発現させることができ、宿主細胞内のホモ二量体の不在は、限定されることなくＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及び免疫沈降法を包含する様々なタンパク質分析によって実証可能である。In vitro検定は、生理緩衝液条件及び／又は好ましくは生理体温下で行なわれなくてはならない。一般に、生理緩衝液は、生理濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲内の中性ｐＨに調整されている。様々な生理緩衝液がSambrook et al. (1989)（前出）の中で列挙されており、従って本明細書では詳述しない。好ましい生理的条件は、Kammerer et al.（前出）の中で記載されている。
【０１２７】
前述の物理的特性を示すアダプタ対の例は、ＧＡＢＡB−Ｒ１／ＧＡＢＡB−Ｒ２レセプタである。これら２つのレセプタは、生理的条件下（例えば in vivo）及び生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたない。Kuner et al. 及び white et al. (Science (1999) 283:74-77); Nature (1998) 396:679-682))の研究により、 in vivoでのＧＡＢＡB −Ｒ１及びＧＡＢＡB −Ｒ２のヘテロ二量体化の特異性が実証されている。実際、White et al.は、このヘテロ二量体レセプタ対の排他的な特異性に基づいて酵母細胞からＧＡＢＡB −Ｒ２をクローニングすることができた。Kammerer et al. （前出）によるIn vitro研究は、ＧＡＢＡB −Ｒ１又はＧＡＢＡB −Ｒ２のＣ末端配列のいずれも、生理体温下で検定した場合に生理緩衝液条件下でホモ二量体を形成する能力をもたないことを示している。具体的には、Kammerer et al. の沈降実験による実証によれば、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のヘテロ二量体化配列は、単独でテストされた場合には、生理的条件下で及び生理体温（例えば３７℃）下で単量体の分子質量で沈降する。等モル量で混合された場合には、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のヘテロ二量体化配列は、２つの配列のヘテロ二量体に対応する分子質量で沈降する(Kammerer et al.の表１参照）。しかしながら、ＧＡＢＡB −Ｒ１及びＧＡＢＡB −Ｒ２のＣ末端配列がシステイン残基に連結された場合、ジスルフィド結合の形成によりホモ二量体が生成し得る。
【０１２８】
アダプタはさらに、その二次構造に基づいて特徴づけ可能である。好ましいアダプタは、高次コイルらせん構造を採用する両親媒性ペプチドを含んで成る。この高次コイルらせんは、タンパク質中の主要サブユニットのオリゴマー化配列の１つである。一次配列分析により、全てのタンパク質残基の約２〜３％が高次コイルを形成することが明らかになっている（Wolf et al. (1997) Protein Sci. 6:1179-1189）。充分に特徴づけされた高次コイル含有タンパク質としては、細胞骨格タンパク質ファミリー（例えばα−ケラチン、ビメンチン）、細胞骨格モータータンパク質ファミリー（例えばミオシン、キネシン、及びダイニン）、ウイルス膜タンパク質（例えばエボラウイルス又はＨＩＶの膜タンパク質）、ＤＮＡ結合タンパク質及び細胞表面レセプタ（例えばＧＡＢＡB レセプタ１及び２）の構成員が含まれる。本発明の高次コイルアダプタは、２つの群すなわち左巻き及び右巻き高次コイルに大きく分類できる。左巻き高次コイルは、「ａｂｃｄｅｆｇ」と表記されるヘプタッド反復により特徴づけられ、第１（ａ）位及び第４（ｄ）位に優先的に位置される無極性残基の存在を伴う。これら２つの位置にある残基は一般的に、もう１つの鎖のものとインタロックする「ノブと穴」のジグザグパターンを構成して、ぴったりとフィットする疎水性コアを形成する。これとは対照的に、高次コイルの周辺を覆う第２（ｂ）位、第３（ｃ）位及び第６（ｆ）の位置は、好ましくは荷電残基である。荷電アミノ酸の例としては、限定されることなく、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性残基、及びアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミンといった酸性残基が含まれる。ヘテロ二量体高次コイルを設計するのに適している無荷電又は無極性アミノ酸としては、限定されることなく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びトレオニンが含まれる。無電荷残基は一般的に疎水性コアを形成するものの、コア位置においてでさえ電荷残基を含むらせん間及びらせん内の塩架橋を用いて、全体的らせん高次コイル構造を安定化させることがある（Burkhard et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 11672-11677）。様々な長さの高次コイルを用いてよいが、本発明の高次コイルアダプタは、好ましくは２〜１０個のヘプタッド反復を含有する。より好ましくは、アダプタは３〜８個のヘプタッド反復、さらに一層好ましくは４〜５個のヘプタッド反復を含有する。
【０１２９】
最適な高次コイルアダプタを設計する上では、ペプチドの二次構造を予測する様々な既存のコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。１つの例示的コンピュータ分析では、アミノ酸配列を既知の２本鎖高次コイルのデータベース内の配列と比較し高確率の高次コイル鎖を予測するＣＯＩＬＳアルゴリズムが用いられる（Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）。
【０１３０】
多量体形成に関与する様々な高次コイルを、本発明の表示系内でアダプタとして利用することができる。好ましい高次コイルは、ヘテロ二量体レセプタに由来する。従って、本発明は、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２に由来する高次コイルアダプタを包含する。１つの態様において、本発明の高次コイルは、ＧＡＢＡB レセプタ１とＧＡＢＡB レセプタ２のＣ末端配列を含む。もう１つの態様において、本発明のアダプタは、少なくとも３０個のアミノ酸残基の異なる２つのポリペプチドで構成されており、そのうちの一方は、図２３（ＧＲ１）で描かれている比較可能な長さの線状配列と基本的に同一であり、もう一方は、図２３（ＧＲ１）で描かれている匹敵する長さの線状ペプチド配列と基本的に同一である。
【０１３１】
好ましい高次コイルアダプタのもう１つのクラスは、ロイシンジッパーである。ロイシンジッパーは、６個のアミノ酸によって互いから分離された４〜５個のロイシン残基を含有する約３５個のアミノ酸の鎖として、当該技術分野では定義づけされている（Maniatis 及び Abel, (1989) Nature 341:24）、ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物といったような様々な真核生物ＤＮＡ結合タンパク質の中で存在することが発見されている。これらのタンパク質において、ロイシンジッパーは、それを含有するタンパク質が安定なホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成しうる二量体化境界部をつくる。２つの癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎによってコードされるタンパク質産物の分子分析により、このような優先的ヘテロ二量体形成のケースが明らかにされている（Gentz et al., (1989) Science 243:1695; Nakabeppu et al., (1988) Cell 55:907; Cohen et al., (1989) Genes Dev. 3:173）。Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域を含む合成ペプチドはヘテロ二量体形成を媒介することも示されてきており、この合成ペプチドのアミノ末端が各々分子間ジスルフィド結合を可能にするためのシステイン残基を含む場合に、ホモ二量体化を実質的に排除するまでヘテロ二量体形成が起こる。
【０１３２】
本発明のロイシンジッパーアダプタは、ヘプタッド反復（ロイシン−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6）nとして知られている一般構造式を有し、ここで、Ｘは従来の２０個のアミノ酸のうちのいずれかであり得るが、例えばアラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びリジンといったαらせん形成能をもつアミノ酸である確率が最も高く、ｎは２以上であるが、一般的には３〜１０、好ましくは４〜８、より好ましくは４〜５である。好ましい配列はＦｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパーである。
【０１３３】
本明細書で使用されているペプチドの線状配列は、両方の配列が実質的なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を示す場合に、他方の線状配列と「基本的に同一である」。一般に、基本的に同一である配列は、相同性領域のアライメント後、互いに少なくとも約６０％同一である。好ましくは、該配列は少なくとも約７０％同一であり、より好ましくは少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％同一であり、さらに一層好ましくは１００％同一である。
【０１３４】
ポリペプチド配列が基本的に同一であるか否かを決定するにあたっては、比較されるポリペプチドの機能性を保存している配列が特に好ましい。機能性は、対合するアダプタと安定な複合体を形能する能力や、アダプタとインフレームで融合されたポリペプチドの表示を促進する能力といったような異なる基準によって実証することができる。
【０１３５】
本発明のアダプタは、本明細書で例示されているポリペプチド配列と機能的に等価である修飾されたロイシンジッパー及びＧＡＢＡB ヘテロ二量体化配列を包含する。対合するアダプタに対する改善された安定性及び／又は表示効率を提供する修飾されたポリペプチドが好ましい。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、及びヘテロ二量体化特異性を著しく悪く改変することのないアミノ酸の１以上の欠失又は付加を伴うポリペプチドが含まれる。置換は、ペアワイズ相互作用が維持されるかぎりにおいて、１以上のアミノ酸残基の変更又は修飾から、１つの領域の完全な再設計にまで至る可能性がある。アミノ酸置換が存在する場合、それは、好ましくはペプチドのフォールディング又は機能的特性に悪影響を及ぼすことのない保存的置換である。その範囲内で保存的置換を行うことのできる機能関連アミノ酸の群は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。本発明のポリペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化形態をとることができ、翻訳後修飾（例えばアセチル化及びリン酸化）により、又は合成（例えば標識基の結合）により修飾され得る。
【０１３６】
本発明のアダプタ配列は、従来の組換えクローニング方法を用いて及び／又は化学合成により得ることができる。充分確立された制限及び連結技術を用いて、適切なアダプタ配列を様々なＤＮＡ供給源から切除し、外因性遺伝子配列及び外表面配列とインフレームで組込んでそれぞれ発現及びヘルパーベクターを生成することができる。
【０１３７】
好ましくは、第１のアダプタ配列は、結果としてもたらされる外因性融合ポリペプチド上に構造的干渉がある場合にそれを最小限におさえるような形で、発現ベクター内に挿入される。第１のアダプタは外因性遺伝子配列の５’側又は３’側に融合され得るが、図９Ａでは、アダプタ配列（すなわちＧＡＢＡB レセプタ１に由来するヘテロ二量体化配列）が外因性遺伝子配列の３’末端にインフレームで融合されている好ましいファージミドベクターが描かれている。
【０１３８】
同様にして、第２のアダプタ配列は、発現されたファージ外皮の無欠性が損われないような位置でヘルパーベクター中に挿入される。アダプタ配列は、コーディング領域を分断することなく、外表面配列の５’又は３’末端に融合可能である。図５及び図１９は、アダプタ配列（すなわちＧＡＢＡB レセプタ２に由来するヘテロ二量体化配列）が外表面配列、遺伝子ＩＩＩ又はその機能的部分の５’末端にインフレームで配置されている２つの好ましいヘルパーファージベクターを描いている。
【０１３９】
本発明の細菌表示系：
本発明は同様に、以下の２つの構成要素を含む細菌表示系をも提供する：すなわち、（１）細菌細胞又は細菌胞子の外表面上に表示されるべき外因性ポリペプチドをコードする問題の外因性遺伝子を担持する細菌発現ベクター、及び（２）特に問題のポリペプチドの表示を促進するヘルパーベクターである。外因性ポリペプチドが細菌外表面タンパク質との融合体として発現されるような以前に記載されている細菌系とは異なり、本発明の細菌系は以下の特有の特長を有する。まず第１に、細菌発現ベクターは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示されるべき外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含む。第２に、細菌発現ベクターは、細菌又は細菌胞子の機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列が欠如している。第３に、ヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要な全ての外表面配列を含み、その外表面配列の少なくとも１つが第２のアダプタ配列にインフレームで融合され、ここで外因性ポリペプチドの表示は第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用によって媒介される。
【０１４０】
本発明のファージ表示系を構築するための以上で概略説明した一般的原則及び実験的設計は、本発明の細菌表示系を生成するためにも同様に適用可能である。細菌発現ベクターは、いずれの機能的外表面タンパク質をコードする配列もが欠如している一方、ヘルパー細菌ベクターはその欠損を補うのに必要な外表面配列を含んでいる。
【０１４１】
ヘルパー細菌ベクターは一般的には、以下の２つのドメインをもつ外表面タンパク質をコードする外表面配列を含んで成る：すなわち（１）分泌されるべきタンパク質を脂質二層を通してペリプラズムまで誘導するシグナルペプチド；及び（２）外表面タンパク質を細菌細胞の外表面上に配置する能力をもつ膜移行ドメイン。発現された外表面タンパク質は最初にペリプラズムまで輸送され、ここでリーダーペプチドが切断されて離れる。外表面タンパク質がアダプタを含む融合体として発現される場合には、このアダプタは、外因性ポリペプチドに含まれる対合アダプタに結合することによって、ペリプラズムに同じく存在する外因性ポリペプチドが細菌外表面上に移行するのを促進する。
【０１４２】
これまでの研究により、ヘルパー細菌発現ベクターを構築するために使用することのできる多数の細菌表面タンパク質コーディング配列が明らかになっている。細菌表面タンパク質の非限定的な例としては、ＬａｍＢ（Bremer et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. (1984) 81:3830-34; Gene (1987) 52:165-73）；ＯｍｐＡ（Prog Biophys Molec Biol (1987) 49:89-115）；ＯｍｐＣ（Misra et al. (1988) J. Bacteriol 170:528-33；ＯｍｐＦ（Pages et al. Biochemimie (1990) 72:169-76）；ＰｈｏＥ（van der Ley et al. J. Biol. Chem. 261:12222-5）；ピリン（So et al. Curr Top in Microbiol & Immunol (1985) 118:13-28）；ｐｌｄＡ（de Geus et al. EMBO J. (1984) 3(8):1799-1802）；ＢｔｕＢ、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＩｕｔＡ、ＦｅｃＡ、及びＦｈｕＥ（Gudmundsdottir et al., (1989) J. Bacteriol 171(12):6526-33）；ＧＩＰ−アンカー型タンパク質ＩＮＰ（Kim et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29(5):292-297）及びβ−自己輸送体タンパク質ＡＩＤＡ（Veiga et al. (1999) Mol Microbiol 33:1232-1243）、及びＴｒａｔＴ、Ｐａｌ、Ｏｐｒｌ、ＯｓｍＢ、ＮｌｐＢ及びＢｌａＺ、といったようなその他の外膜リポタンパク質がある。細菌胞子の表面上に常駐する数多くの外皮タンパク質も同定されている。その後対応するその遺伝子配列が単離されている。例えば、Donovan et al.は、Bacillus subtilis胞子外皮ＣｏｔＤ及びＣｏｔＣ遺伝子の同定について報告した（Donovan et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:1-10）。これらの及びその他の表面タンパク質の特徴づけは、Pierre Cornelis et al. (2000) Curr. Opin. Biotech. 11(5):450-454; Lang et al. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290:579-585; Daugherty et al. (1999) Protein Engineering 12(7): 613-621; 米国特許第５，８３７，５００及び第５，３４８，８６７号ならびにその中で引用されている参考文献の中で詳述されている。
【０１４３】
シグナルペプチド及びこれらの及び他の細菌外表面タンパク質の膜移行ドメインは、当該技術分野において周知である。シグナルペプチドは、一般にタンパク質の最初の５〜３０個のＮ末端アミノ酸から成る。膜移行ドメインは一般的に、コンピュータ支援型の従来の配列分析により容易に同定可能である１以上の膜貫通セグメントを含んで成る。当業者であれば、従来の合成及び組換え技術を用いて、適切なポリペプチド及びヌクレオチド配列を容易に得ることができる。望ましい場合、１つの外表面タンパク質のシグナルペプチドを、もう１つの外表面タンパク質の膜移行ドメインに対しインフレームで結合させることができ、或いはその逆もあり得る。かかるキメラは細菌外表面上で発現させることができる、ということが示されている（米国特許第５，８３７，５００号）。かくして、上述の細菌外表面タンパク質のうちのいずれか１つのシグナルペプチドリーダーペプチドを、いずれかの未改変細菌外表面タンパク質の適当な長さの膜移行ドメインに対し、インフレームで連結させることが可能である。同様にして、上述の外表面タンパク質のいずれか１つの移行ドメインを、融合体を細菌ペリプラズムに誘導する能力をもつものとして知られている細菌又は他の起源のいずれかのタンパク質のシグナルペプチドに対し、インフレームで融合させることができる。
【０１４４】
本発明の細菌発現ベクターは、いずれの機能的細菌外表面タンパク質をコードする配列もが欠如している。上述の配列のいずれもが、本発明の発現ベクターを構築する間に排除されるべき配列の候補である。本明細書で使用されている「機能的」という語は、遺伝子パッケージがその外表面上に問題のポリペプチドを組立てるように、コードされた外表面タンパク質が促進するか又は誘導する能力を保持しているということを意味している。「機能」の喪失は、（１）シグナルペプチドが次に切断されて離れることになる細菌細胞の〔ペリプラズム〕への外表面タンパク質の細胞内移行を誘導する機能的シグナルペプチドの喪失；（２）細菌細胞膜上に成熟ポリペプチドを移行させる膜移行ドメインの機能の喪失；及び／又は（３）いかなる機能的外表面タンパク質の発現をも防ぐための内部停止コドンの導入、を結果としてもたらす修飾に起因しうる。
【０１４５】
発現ベクター及びヘルパーベクターに連結される該２つのアダプタ配列は、本発明のファージ表示系で利用されるものと同じ構造的及び機能的特徴を有する。ファージ表示系を構築するために適用可能ないずれのアダプタ配列も、細菌表示系を生成するために同様に適している。従って、対合アダプタを選択し調製するための基準及び手順については、この節で繰り返さない。
【０１４６】
適切な細菌遺伝子パッケージとしては、培養で増殖させることができ、そしてその外表面上で外因性ポリペプチドを表示するように改変することができ、そして親和力選択（affinity selection）に適合した全ての細菌菌株が含まれる。好ましい遺伝子パッケージはグラム陰性菌である。好ましい種の非限定的な例としては、サルモネラ・タイフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バシラス・サブティラス(Bacillus subtilis）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ビブリオ・コレレ(Vibrio cholerae）、クレブシェラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニングチデス（Neisseria meningitides）、バクテロイデス・ノドスス(Bacteroides nodosus）、モラクセラ・ボビス（Moraxella bovis）、そして特にエシャリキア・コリ（Escherichia coli）が含まれる。
【０１４７】
細菌胞子は、遺伝子パッケージとして望ましい特性を有する。胞子は、化学的及び物理的作用物質に対し、植物細菌細胞よりもはるかに大きな耐性を有する。例えば、バシラス属の細菌は、熱、放射線、乾燥及び毒性化学物質による損傷に対する耐性がきわめて高い内生胞子を形成する（Losick et al. Ann. Rev. Genet. (1986) 20:625-669により再考されている）。さらに、バシラス（Bacillus）属の胞子は、その表面上のタンパク質を活発に代謝又は改変することがない。この現象は、外皮タンパク質の広範な分子間架橋のせいである。遺伝子パッケージとして有用なその他の胞子は、ストレプトマイセス（Streptomyces）の胞子といったような外生胞子である。
【０１４８】
本発明のファージ及び細菌表示系を構築するためのその他の考慮事項：
本発明のベクターは一般に、外因性ポリペプチドを発現するために必要とされる転写又は翻訳制御配列を含む。適切な転写又は翻訳制御配列としては、限定されることなく、複製起点、プロモータ、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、並びに転写及び翻訳のための終結部位が含まれる。
【０１４９】
複製起点（一般にｏｒｉ配列と呼ばれる）は、適切な宿主細胞内でのベクターの複製を可能にする。ｏｒｉの選択は、宿主細胞のタイプ及び／又は利用される遺伝子パッケージにより左右されることになる。宿主細胞が原核生物であり、遺伝子パッケージがファージ粒子である場合、発現ベクターは一般的には２つのｏｒｉ配列を含み、１つは原核細胞内のベクターの自律的複製を導くものであり、もう一方のｏｒｉは、ファージ粒子のパッケージングを支持するものである。好ましい原核性ｏｒｉは、細菌細胞内でのベクター複製を導く能力をもつ。このクラスのｏｒｉの非限定的な例としては、ｐＭＢ１、ｐＵＣならびにその他のE. Coli起源が含まれる。ファージ粒子のパッケージングを支持する好ましいｏｒｉには、ｆｌｏｒｉ、Ｐｆ３ファージ複製ｏｒｉが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１５０】
本明細書で使用される「プロモータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、プロモータから下流側（３’方向に）にあるコーディング領域の転写を開始させる能力を或る種の条件下で有するＤＮＡ領域である。これは構成性のものであっても誘導性のものであってもよい。一般に、プロモータ配列はその３’末端において転写開始部位に結合し、上流側（５’方向）に、基準より高い検出可能レベルで転写を開始するのに必要な最少限の数の塩基又は要素を含むようになっている。プロモータ配列内には、転写開始部位ならびに、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインがある。真核性プロモータは、常にではないが往々にして「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含んでいる。
【０１５１】
プロモータの選択は、ベクターが導入される宿主細胞により大きく左右されることになる。原核細胞については、当該技術分野において多様で強力なプロモータが既知である。好ましいプロモータは、ｌａｃプロモータ、Ｔｒｃプロモータ、Ｔ７プロモータ及びｐＢＡＤプロモータである。
【０１５２】
その他の真核細胞のための適切なプロモータ配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼ等が含まれる。成長条件により転写が制御されるという付加的な利点を有する他のプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、及び前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用を担当する酵素のためのプロモータ領域である。
【０１５３】
本発明のベクターを構築する際には、ｍＲＮＡ及び／又は転写終結シグナルのポリアデニル化を与えるように転写されることが望まれる配列の３’末端に、当該外因性配列と会合した終結配列も挿入される。ターミネータ配列は好ましくは、１以上の転写終結配列（例えばポリアデニル化配列）を含み、転写読み過しをさらに分断するべく、付加的なＤＮＡ配列を含むことによっても延長されうる。本発明の好ましいターミネータ配列（又は終結部位）は、それ自身の終結配列又は非相同終結配列のいずれかである転写終結配列が後に続く遺伝子を有する。かかる終結配列の例には、広く入手可能であり以下で例示される、当該技術分野において既知の様々なポリアデニル化配列に連結された停止コドンが含まれる。該ターミネータに遺伝子を含む場合には、検出可能な又は選択可能なマーカーをコードする遺伝子を使用することが有利となり、それにより、ターミネータ配列の存在及び／又は不在（ひいては転写単位の対応する不活性化及び／又は活性化）を検出及び／又は選択することのできる手段が提供される。
【０１５４】
上述の要素に加えて、ベクターは選択可能なマーカー（例えば、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖にとって必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含有することができるが、かかるマーカー遺伝子は、宿主細胞内に同時導入される他のポリヌクレオチド配列上に担持され得る。選択可能な遺伝子が中に導入された宿主細胞のみが、選択的条件下で存続及び／又は成長することになる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキサートなどといった抗生物質又はその他の毒素に対する耐性を付与する；（ｂ）栄養素要求性欠損を補足する；又は（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞により左右されることになり、異なる宿主のための適切な遺伝子が当該技術分野において知られている。
【０１５５】
好ましい実施形態において、ベクターは、少なくとも２つの関連性のない発現系の中で複製する能力をもつシャトルベクターである。かかる複製を促進するため、ベクターは一般に、各々の発現系において１つずつ有効な少なくとも２つの複製起源を含んでいる。標準的には、シャトルベクターは、真核生物発現系及び原核生物発現系において複製する能力をもつ。これにより、真核生物宿主内でのタンパク質の発現（発現細胞型）及び原核生物宿主内でのベクターの増幅（増幅細胞型）の検出が可能になる。好ましくは、１つの複製起点はＳＶ４０に由来し１つはｐＢＲ３２２に由来するが、ベクターの複製を導くことを条件として当該技術分野において既知の適切ないずれの起点も使用することができる。ベクターがシャトルベクターである場合、そのベクターは好ましくは少なくとも２つの選択マーカーを含み、うち１つは発現細胞型用であり、１つは増幅細胞型用である。当該技術分野において既知のいずれの選択マーカー又は本明細書中で記載されているものも、利用されている発現系内でそれが機能することを条件として、使用することができる。
【０１５６】
本発明において具現化されるベクターは、組換えクローニング方法を用いて及び／又は化学合成により得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結といったような多数の組換えクローニング技術が当該技術分野において周知であり、ここで詳細に記載する必要はない。当業者であれば、同様に、当該技術分野において利用可能なあらゆる合成手段により所望のベクターを得るため、本明細書に提供されている配列データ又は公共の又は独自のデータベースを使用することもできる。付加的には、周知の制限及び連結技術を用いて、適切な配列を様々なＤＮＡ供給源から切除し、本発明に従って発現されるべき外因性配列と共に作動できるような関係で組込むことができる。
【０１５７】
本発明の表示系により発現される外因性配列は、任意の長さの非相同配列でありうる。「非相同」というのは、比較される実体の残りとは遺伝的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、非相同配列は、遺伝子パッケージ（例えば細菌細胞又はファージ粒子）の中で通常発現されない遺伝子でありうる。あるいは、非相同配列は、遺伝子パッケージに対し未改変であるがその遺伝子が天然に作動可能に連結された未改変配列以外のコーディング配列に連結されている遺伝子でありうる。さらに、非相同配列は、無作為の又は予め定められたポリペプチドでありうる。
【０１５８】
本発明の系により発現される外因性配列はまた、以下の特徴のうちの１つ以上のものに基づいて特徴づけされ得る：種の起源、発生上の起源、一次構造類似性、特定の生物学的プロセスへの関与、特定の疾病又は疾病期との関連性又はそれに対する耐性、組織、下位組織又は細胞特異的発現パターン及び発現された遺伝子産物の細胞内位置。
【０１５９】
１つの態様において、外因性配列は、植物細胞、動物細胞又は酵母細胞といったような遺伝子パッケージ以外の実体の中で発現されるいずれの配列であってもよい。
【０１６０】
もう１つの態様において、外因性配列は、多細胞動物体内での外胚葉、中胚葉又は内胚葉の形成中、又は葉、塊茎、植物の芽の発生中に、胚又は成体生物の中で発現されるものといったような、特異的発生起源をもつものである。
【０１６１】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、一次構造類似性を共有する遺伝子ファミリー又は遺伝子サブファミリーに属する。構造的類似性は、上述のコンピュータソフトウェアの支援により、見分けることができる。遺伝子ファミリーの非限定的な例には、プロティナーゼ、プロティナーゼ阻害物質、細胞表面レセプタ、プロテインキナーゼ（例えばチロシン、セリン／トレオニン又はヒスチジンキナーゼ）、三量体Ｇ−タンパク質、サイトカイン、ＰＨ−、ＳＨ２−、ＳＨ３−、ＰＤＺ−ドメイン含有タンパク質をコードするもの、及びthe Institute for Genomic Research (TIGR)、Incyte Pharmaceuticals、Inc.、Human Genome Sciences Inc.、Monsanto及びCeleraにより公表された遺伝子ファミリーのいずれかが含まれる。
【０１６２】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、限定されることなく細胞周期調節、細胞分化、走化性、アポトーシス、細胞運動性、細胞骨格再配列を包含する、特定の生物学的プロセスに関与する。さらにもう１つの態様において、本発明で具現化される外因性配列は、特定の疾病又は特定の疾病期と関連する。かかる配列には、自己免疫疾患、肥満、高血圧、糖尿病、神経及び／又は筋肉の退化性疾患、心臓病、内分泌障害、それらのいずれかの組合せに関連するものが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【０１６３】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、制限された発現パターンを示すものを包含する。このクラスの遺伝子転写物の非限定的な例には、遍在的に発現されるのではなく、むしろ葉、種、塊茎、葉柄、根及び芽を包含する１種以上の植物組織において分化して発現されるもの；あるいは、嚢胞性線維症又は多発性嚢胞腎を患う、種々のタイプの（悪性又は非転移性）癌に侵された選択された組織の中で及び心臓、肝臓、前立腺、肺、腎臓、骨髄、血液、皮膚、膀胱、脳、筋肉、神経を包含する動物体組織の中で発現されるものが含まれる。非遍在的に発現される配列の追加の例は、或る種の細胞内位置、すなわち、細胞外マトリックス、核、細胞質、細胞骨格、血漿、及び／又は、限定されることなく被覆小窩、ゴルジ体、小胞体、エンドソーム、リソソーム及びミトコンドリアを包含する細胞内膜構造に、そのタンパク質産物が局在化されるような配列である。
【０１６４】
本発明の表示系は、遺伝子パッケージの選択可能なライブラリを含み得る。パッケージは同じ又は異なる外因性配列を発現し得る。１つの態様においては、遺伝子パッケージのライブラリは、無作為の又は予め定められたポリペプチドの集団をコードする。もう１つの態様においては、ライブラリは、特定の宿主起源、組織起源、発生段階又は特定の疾病状態の細胞に由来するｃＤＮＡの集団をコードする。
【０１６５】
特に好ましいライブラリは、抗原結合単位をコードする。抗原結合単位は単量体又は多量体でありうる。単量体抗原結合単位は一般に、１本鎖抗原結合単位（Ｓｃ Ａｂｕｓ）と呼ばれる一方、多量体抗原結合単位はここでは非１本鎖抗原結合単位（Ｎｓｃ Ａｂｕｓ）と呼ばれる。
【０１６６】
本発明の系により表示され得るＮｓｃＡｂｕｓは、「一価」又は「多価」のいずれかでありうる。表示された多価Ａｂｕｓはさらに「単一特異性」又は「多重特異性」Ａｂｕｓとして特徴づけされ得る。多量体Ａｂｕｓを表示するためには、軽鎖（Ｌ）可変領域を含むものと重鎖（Ｈ）可変領域を含むものという２組の発現ベクターセットが利用されなくてはならない。発現された抗体領域は、好ましくは抗体領域とインフレームで融合されたヘテロ二量体化配列により二量体化するが、発現された抗体領域の１つはさらに、ヘルパーベクターにより提供される他のアダプタとペアワイズ相互作用する能力をもつアダプタを含んでいなくてはならない。
【０１６７】
既存の抗体のＬ鎖又はＨ鎖の様々な領域に対応するヌクレオチド配列は、限定されることなくハイブリダイゼーション、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定を包含する従来の技術を用いて容易に取得及び配列決定できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、抗体ヌクレオチド配列の好ましい供給源として役割をする。モノクローナル抗体のアレイを産生する莫大な数のハイブリドーマ細胞を、公共の又は私設のレポジトリから得ることができる。最大の寄託機関は、充分に特徴づけされたハイブリドーマ細胞系統の様々な収集物を提供する米国標準培養収集機構（American Type Culture Collection）（http://www.atcc.org）である。代替的には、抗体ヌクレオチドは、免疫化した又は免疫化していないゲッ歯類又はヒトから、そして脾臓及び末梢血リンパ球といった器官からも得ることができる。抗体ヌクレオチドを抽出し合成するために適用可能な特定の技術は、Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:3833-3837; Larrick et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250-1255; Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86:5728-5732；及び米国特許第５，９６９，１０８号に記載されている。
【０１６８】
抗体ヌクレオチド配列はまた、例えば、相同性非ヒト配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常領域のコーディング配列を置換することによって又はその逆によって修飾することもできる。この要領で、もとの抗体の結合特異性を保持するキメラ抗体が調製される。
【０１６９】
望ましい場合に、外因性配列は、タンパク質産物の発現及び精製の検出を容易にする部分をコードする配列を含んでよい。かかる部分の例は、当該技術分野において既知であり、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びそれらの誘導体といったようなリポータタンパク質をコードするものが含まれる。精製を容易にする他の配列は、Ｍｙｃ、（インフルエンザウイルスヘマグルチニンから誘導された）ＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧ、又は免疫グロブリンのＦｃ部分、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）といったようなエピトープをコードし得る。
【０１７０】
本発明の宿主細胞：
本発明は、上述の発現ベクター及び／又はヘルパーベクターを含む宿主細胞を提供する。発現ベクターは、電気穿孔、微粒子銃；リポフェクション、感染（ベクターは感染性作用物質に結合される）、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又はその他の物質を利用したトランスフェクションを含めた数多くの適切な手段のいずれかにより、適切な原核性又は真核性宿主細胞内に導入することができる。宿主細胞の特長に応じて、当業者は、当該技術分野において充分確立されている適切な手段の１種以上を容易に実施することができる。
【０１７１】
ひとたび適切な宿主細胞内に導入されると、外因性配列の発現は、当該技術分野において既知のいずれかの核酸又はタンパク質検定を用いて決定できる。例えば、外因性配列の転写されたｍＲＮＡの存在は、外因性配列のいずれかの領域に相補的なプローブを用いて、従来のハイブリダイゼーション検定（例えばノーザンブロット分析）、増幅手順（例えばＲＴ−ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）及びアレイに基づく技術（例えば米国特許第５，４０５，７８３号、５，４１２，０８７号及び５，４４５，９３４号）により検出及び／又は定量化可能である。
【０１７２】
外因性配列の発現は、発現されたタンパク質産物を検査することによっても決定可能である。タンパク質分析のためには、様々な技術が利用可能である。これらには、放射性免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射線測定法）、「サンドイッチ」免疫検定、免疫放射線測定法、in situ 免疫検定（例えばコロイド含、酵素又は放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降検定、免疫蛍光検定及びＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【０１７３】
本発明の宿主細胞は、なかんづく、本発明の外因性配列のレポジトリとして、ベクターとして又は、その結合特異性に基づきＡｂｕｓといったような所望のポリペプチドを産生しスクリーニングするためのビヒクルとして使用可能である。
【０１７４】
本発明のアダプタ誘導型表示系の使用：
本発明のアダプタ誘導型表示系には、いくつかの特異的用途がある。まず第１に、該系は、適切な宿主細胞内での可溶性単量体及び多量体外因性ポリペプチドの産生を可能にする。第２に、該系は、選択された遺伝子パッケージ上の単量体及び多量体ポリペプチドの表示を可能にする。本発明の表示系は同様に、様々な目的のため無作為の又は予め定められたポリペプチド、全長タンパク質及びタンパク質ドメインのライブラリを作成するために使用可能である。例えば、エピトープ及びミモトープをマッピングするため、様々な標的タンパク質のアンタゴニスト及びアゴニストを同定するため、抗体を改変するため、抗体特異性を最適化するため、そして新規の結合活性を作り出すために、表示されたライブラリを利用することが可能である。
【０１７５】
従って、本発明は、遺伝子パッケージ上に表示される外因性ポリペプチドとテスト物質との間の特異的相互作用の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）外因性ポリペプチドを提示する本発明の表示系の遺伝子パッケージを提供する段階；（ｂ）安定なポリペプチド−物質複合体を産生するのに適切な条件下でテスト物質と遺伝子パッケージを接触する段階；及び（ｃ）遺伝子パッケージ上の安定なポリペプチド−作用物質複合体の形成を検出し、それにより特異的相互作用の存在を検出する段階を含む。
【０１７６】
本発明の目的のために「テスト物質」とは、限定されることなく、単純な又は複雑な有機又は無機分子、タンパク質、炭水化物、脂質、ポリヌクレオチド又はそれらの組合せといったような生物学的又は化学的化合物を含むように意図されている。例えばオリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドといったようなオリゴマー、及び様々なコア構造に基づく合成有機化合物など、ありとあらゆる化合物を合成することができ、これらも同じく「物質」の語に含まれる。さらに、様々な天然供給源が、植物又は動物抽出物といったようにスクリーニング用の化合物を提供することができる。つねに明示的に述べられているわけではないものの、該物質は、本発明のスクリーニングにより同定される物質と同じ又は異なる生物活性をもつ他の物質と組合せた形で又は単独で使用されるということを理解すべきである。好ましい物質は、細胞のシグナル伝達経路を調節する能力をもつものといったような診断薬及び／又は治療薬の候補である。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明は、所望の特性をもつポリペプチドを取得する方法を提供する。該方法は、（ａ）本発明の表示系の選択可能なライブラリを提供する段階、及び（ｂ）選択可能なライブラリをスクリーニングすることにより、所望の特性をもつポリペプチドを表示する少なくとも１つの遺伝子パッケージを取得する段階、を含んで成る。該方法はさらに、所望の特性をもつポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを単離する段階を含むことができる。このような遺伝子パッケージの単離には、所望のポリペプチドをコードする遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を取得することを伴い得る。所望の特性には、問題の物質に対し特異的に結合するポリペプチドの能力が包含される。所望の特性をもつ選択されたポリペプチドは、以下の分子、すなわち、抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質、核タンパク質及びそれらの機能的モチーフといった分子の１つ以上のクラスに該当し得る。テストされるべき特異的物質及び表示されるべき外因性ポリペプチドのライブラリの選択は、スクリーニング検定の意図された目的により左右されることになる。
【０１７８】
所望の結合特異性又は親和性を示す抗体の単離：
ファージ及び細菌表示の最も強力な利用分野の１つは、抗体工学の分野におけるものである。ｓｃＦｖ抗原結合単位は、結合特異性及び親和力を見かけ上全く失なうことなく、ファージ粒子及び細菌細胞の両方の表面上で発現され得る、ということが示されている（MaCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Daugherty et al. (1999) Protein Engineering 12(7):613-621）。また、Ｆａｂフラグメントといったような機能的ＮｓｃＡｂｕｓがファージ表面上で発現され得る、ということも実証されている。今日、多種多様な抗原に対する抗体が、ファージ表示技術を用いて良好に単離されている。
【０１７９】
本発明のファージ表示系は、Ａｂｕｓの多種多様なレパートリの提示を可能にすることから、この利用分野に特に適している。数多くの点で、本発明のファージ表示系は、天然の免疫系を模倣している。Ａｂｕの抗原により駆動される刺激は、Ａｂｕｓのファージ表示ライブラリから高親和性結合剤についての選択を行うことによって達成できる。分化しつつあるＢ細胞におけるＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の組換え時に発生する多数の鎖置換は、ＤＮＡとしてのクローニングされたＨ鎖及びＬ鎖及びタンパク質をシャフリングすることによって及び部位特異的組換えを使用することによって、模倣することができる(Geoffory et al. (1994) Gene 151:109-113）。ファージ表示されたＡｂｕｓのＣＤＲ領域への突然変異導入によって体細胞突然変異を適合させることもができる。
【０１８０】
所望の結合特異性又は親和力をもつＡｂｕは、「パニング」(panning）として知られる親和力選択の一形態を用いて同定可能である（Parmley and Smith (1988) Gene 73:305-318）。Ａｂｕｓライブラリは、まず第１に問題の抗原でインキュベートされ、次に結合したファージを伴う抗原が捕捉される。このようにして回収されたファージは次に増幅され、抗原に対する結合について再び選択され、かくして問題の抗原を結合するファージについて富化することができる。通常、一週間で３〜４回の選択を達成でき、１〜１００の結合ファージの単離を導く。かくして、所望のＡｂｕを発現する希少なファージを、１回の実験において１０8 個以上の異なる個体から容易に選択できる。結合するＡｂｕの一次構造は、このとき、個々のファージクローンのヌクレオチド配列により推論される。表示されたＡｂｕにヒトＶH 及びびＶL 領域が利用される場合、本発明の表示系は、非ヒトＡｂｕを更に操作すること無く、ヒト抗体の選択を可能にする。
【０１８１】
改善された結合特異性又は親和力をもったＡｂｕを含む新規タンパク質の生成：
本発明の表示系を用いて、標的タンパク質に対する高い親和力及び特異性をもつ、Ａｂｕといったような、ポリペプチドを表示する複製可能な遺伝子パッケージを得ることできる。かかるパッケージは、結合産物をコードするポリヌクレオチド及び結合ポリペプチドのアミノ酸の両方を担持している。ポリヌクレオチドの存在は、結合タンパク質の組換え型発現及びその後の操作を容易にする。例えば、親ポリヌクレオチドに類似する改変された配列の洗練されたレパートリを生成するようにするシャッフリング、カセット突然変異誘発又は変異性ＰＣＲにより、結合タンパク質についてコードするポリヌクレオチドの突然変異誘発を行うことができる。新規結合タンパク質の洗練されたレパートリをスクリーニングすることにより、改善された結合特異性又は親和性を示す新規結合タンパク質を同定することができる。
【０１８２】
抗原エピトープのマッピング：
従来、抗原のエピトープマッピングは、物理化学的分析に依存するところが大きかった。これらのアプローチには、（１）精製された抗原を様々なプロテアーゼでフラグメント化し、反応性フラグメントを同定し、それらを配列決定すること；（２）抗原結合単位との残基相互作用が修飾から保護されている化学的修飾実験；（３）抗原の一次構造に対応する一連のペプチドの合成；及び（４）ＮＭＲ又はＸ線結晶構造解析を用いた直接的な物理的特徴づけ、が含まれる。これらの方法は全て労働集約的であり、一般にハイスループット分析に適していない。ファージ表示又は細菌表示は、抗原エピトープを局在化させるための高効率で強力な代替案を提供する。抗原の一部分をコードするＤＮＡのフラグメントは、本発明の発現ベクターにより外因性ポリペプチドとして発現することができる。このとき、どの表示されたフラグメントが抗体と反応するかを決定するために、遺伝子パッケージ（例えばファージ、細菌細胞又は胞子）を抗体とテストすることができる。表示技術のこの適用は、当該技術分野において広く用いられ、様々な分子の抗原エピトープを決定するために功を奏するものであることが示されてきた。
【０１８３】
モノクローナル及びポリクローナルＡｂｕｓの結合エピトープのマッピング：
本発明の表示系は同様に、抗原結合部位の特異性をマッピングするために無作為ペプチドライブラリを提示するためにも使用することができる。無作為ペプチドライブラリは、そこからエピトープ及びミモトープを機能的に確定させることができる配列の供給源である。このようなライブラリを用いて、抗原−抗体相互作用のための競争的ペプチドを同定および取得し、かくして数多くのＡｂｕｓのアクセス可能及び／又は機能的な部位をマッピングすることができる。
【０１８４】
レセプタのリガンドおよび他のシグナル伝達経路のモジュレータの同定：
本発明の表示系は同様に、レセプタに対するリガンドを同定するために利用することができる。このプロセスは一般に、テストリガンドを発現する遺伝子パッケージの集団をレセプタに適用し、次に該レセプタに結合されたパッケージを同定することで進められる。代替的には、レセプタが遺伝子パッケージに提示されてもよい。テストリガンドに結合したものが次に単離される。ペプチドリガンドの同定のためには、無作為ペプチドライブラリが、検定を行うための好ましい出発材料である。同アプローチは、細胞シグナル伝達経路の他のモジュレータを同定するために適用することができる。
【０１８５】
細胞の活性は、細胞内事象を刺激するか又は阻害する外部シグナルによって調節される。細胞内応答を惹起するため細胞に及び細胞内で刺激又は阻害シグナルを伝達するプロセスは、シグナル伝達と呼ばれる。適切な細胞機能のためには、適切なシグナル伝達が不可欠である。過去数十年にわたり、数多くの細胞シグナル伝達分子が同定され、クローニングされ特徴づけされてきた。シグナル伝達タンパク質の非限定的な例としては、細胞表面レセプタ、プロテインキナーゼ（例えばチロシン、セリン／トレオニン又はヒスチジンキナーゼ）、三量体Ｇ−タンパク質、サイトカイン、ＳＨ２−、ＳＨ３−、ＰＨ−、ＰＤＺ−、デス−ドメイン含有タンパク質、Human Genome Sciences Inc.，Celera，the Institute for Genomic Research (TIGR) 及びIncyte Pharmaceuticals, Inc.により公表された遺伝子又はタンパク質ファミリーのいずれもが含まれる。増大し続けるシグナル伝達タンパク質ファミリーにより媒介されるシグナル伝達事象のカスケードが解明され、様々な生物学的応答において中心的役割を果たすことがわかっている。その中に入るものとしては細胞周期調節、細胞分化、アポトーシス、走化性、細胞運動性及び細胞骨格再配置がある(Cantley et al. (1991) Cell 64:281-302）; Liscovitch et al. (1994) Cell 77:329-334）。シグナル伝達経路の様々な構成要素の欠陥が、数多くの形態の癌、血管系疾患及び神経系疾患を含め、莫大な数の疾患を説明するということもわかっている。実際、シグナル伝達経路を調節する能力をもつ作用物質（すなわちシグナル伝達経路モジュレータ）が長い間、潜在的な診断用物質及び／又は治療用物質として認められてきた。
【０１８６】
本発明のモジュレータは、該モジュレータの（１）本発明の遺伝子パッケージ上に提示された細胞内シグナル伝達タンパク質に結合する能力、又は（２）シグナル伝達タンパク質と通常関連する細胞タンパク質の存在下で、表示されたシグナル伝達タンパク質との結合のために競合する能力によって特徴づけされる。該モジュレータは、標的シグナルタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。
【０１８７】
ｃＤＮＡライブラリの発現：
本発明の表示系は、ｃＤＮＡライブラリの発現に特に適している。上述のように、遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩファージ表示系を含む以前に報告された融合系では、挿入点が外表面配列の５’末端に制限される。このため外因性ポリペプチドは、外表面タンパク質のＮ末端に連結されなくてはならない。結果として、内部停止コドンによるリーディングフレームの分断に起因して、全てのリーディングフレームのコーディング配列のフラグメントを含むｃＤＮＡライブラリをこれらの融合系により完全に発現させることができない。しかしながら、本発明の系では、外因性配列が外表面配列とインフレームで融合されていないことから、この一方向クローニングの欠点を被ることはない。
【０１８８】
ｃＤＮＡ表示は、タンパク質−タンパク質相互作用を確定するための有用な技術となり得る。ｃＤＮＡライブラリの発現及びスクリーニングは、特に問題の既知のタンパク質を結合する該発現された産物の能力に基づいて新規遺伝子の同定を大幅に容易化する。ｃＤＮＡでコードされるタンパク質を本発明の遺伝子パッケージの表面上で発現させることができ、これを次に、特定の固定化された標的に対しin vitroで以上に詳述したようなバイオパニング富化によりテストすることができる。
【０１８９】
表示された外因性ポリペプチド又は無作為又は予め定められたポリペプチドのライブラリがテスト物質に特異的に結合する能力は、当該技術分野において充分に確立された様々な手順によりテストすることができる。一般に、選択は、好ましくはアフィニティクロマトグラフィを用いて実施される。この方法は、一般的にはテスト物質をコーティングしたプレート、カラムマトリックス、細胞、又は溶液中のビオチン標識された物質に、遺伝子パッケージを結合させ、次に捕獲することで進められる。固相に結合された遺伝子パッケージは、洗浄され、その後、可溶性ハプテン、酸又はアルカリにより溶出させられる。代替的には、増大するテスト物質の濃度を用いて、アフィニティマトリックスから遺伝子パッケージも解離させることができる。テスト抗原に対して極めて高い親和力又は結合力をもつ或る種のＡｂｕｓについては、ＷＯ９２／０１０４７で記載されているように効率の良い溶出のために高いｐＨ又は穏やかな還元性の溶液が必要となることがある。
【０１９０】
所望の結合特異性をもつ結合されたポリペプチドを回収する上での潜在的困難性を回避するためには、アダプタと外因性ポリペプチドの間にプロテアーゼ切断部位を導入することができる。この目的で適用可能な切断部位としては、Ｘ因子、トリプシン及びトロンビン認識部位が含まれるが、これらに制限されるわけではない。親和性マトリックスに遺伝子パッケージを結合させ非特異的パッケージを洗浄した後に、切断部位での消化に適した条件下でプロテアーゼを伴う抗原親和性マトリックスを洗浄することにより、所望の親和力をもつ外因性ポリペプチドを表示する残りのパッケージを収集することができる。かかる消化は、ファージ粒子といったような遺伝子パッケージから外因性ポリペプチドを放出させることになる。
【０１９１】
上記手順に対する代替的手順は、強く結合されたファージ又は細菌粒子を保持した親和性マトリックスを取り出し、そして例えばＳＤＳ溶液を沸とうさせることなどにより、その核酸を抽出することである。抽出された核酸は、E. Coli 宿主細胞を直接形質転換するために使用することができ、あるいは代替的に、適切なプライマを用いたＰＣＲにより外因性配列を増幅させることもできる。
【０１９２】
選択効率は、洗浄時の解離動態を含めた複数の要因の組合せ、及び単一ファージ又は細菌上の外因性ポリペプチドの多重コピーが固体支持体上のテスト物質に同時に結合しうるか否かによって左右されやすい。例えば、短時間の洗浄、多価表示及び固体支持体における高い抗原コーティング密度の使用をすることにより、速い解離動態（及び弱い結合親和性）をもつ抗体が保持されるはずである。逆に、長時間の洗浄、１価ファージ及び低い抗原コーティング密度を用いることにより、低い解離動態（及び優れた結合親和力）を伴うＡｂｕｓの選択が有利になるはずである。
【０１９３】
代替的には、細胞選別(sorting）により、一定の与えられた物質に対する特異的結合を評価することが可能である。この技術には、選別されるべき宿主細胞に付着したファージ粒子などの遺伝子パッケージ上に外因性ポリペプチドを提示し、次に検出可能部分に結合されたテスト物質で標的細胞を標識化し、次に、細胞選別機中で非標識化細胞から標識化細胞を分離することを伴う。最新式の細胞分離方法が、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）である。細流の形で単一ファイル内を移動する細胞を、レーザービーム中に通過させ、られ、蛍光標識により結合された各々の細胞の蛍光を次に測定する。
【０１９４】
望ましい場合には、外因性ポリペプチドのレパートリを無関係のテスト物質に対し予備選択して、望ましくないポリペプチドを対抗選択することが可能である。例えば、Ａｂｕｓレパートリを無関係の抗原に対し対抗選択することができる。例えば抗イディタイプＡｂｕｓなどを単離するために、関係するテスト物質に対しレパートリを予備選択することもできる。本発明の表示系は、望ましい特異性をもつＡｂｕｓの急速な単離を可能にする。単離されるＡｂｕｓの多くは、従来のハイブリドーマ又はトランスジェニック動物技術を通して取得することが困難又は不可能であると予想されるものである。
【０１９５】
溶出したＡｂｕｓのその後の分析は、Ｌ鎖及びＨ鎖のアミノ酸配列を記述するためのタンパク質配列決定を伴うことがある。推論されたアミノ酸配列に基づき、次に、ＰＣＲライブラリスクリーニング、既存の核酸データベースにおける相同性探索又はそれらの任意の組合せを含めた組換えクローニング方法により、抗体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得ることができる。一般に利用されるデータベースには、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、及びＨＴＧＳが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１９６】
本発明のベクターを含むキット
本発明はまた、適切な包装(packaging）内に本発明の発現ベクター及びヘルパーベクターを含むキットを包含する。
【０１９７】
各々のキットには、宿主細胞内へのベクターの送達を可能にする試薬が必ず含む。ベクターの送達を促進する試薬の選択は、使用される特定のトランスフェクション又は感染方法に応じて異なりうる。キットはまた、外因性配列及びタンパク質産物の検出のための標識化されたポリヌクレオチドプローブ又はタンパク様プローブを生成するために有用である試薬を含んでもよい。各々の試薬は、在庫保管のため、及びその後、実験が行われる時に反応媒体に追加又は交換するために適した緩衝液中に溶解／懸濁させられているか、又は固体形態で供給され得る。適切な包装が提供される。キットは、当該手順に有用な追加的な構成要素を任意的に提供してよい。これらの任意の構成要素としては、緩衝液、捕捉試薬、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、対照サンプル、使用説明書及び解釈情報が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１９８】
本発明の表示系、宿主細胞及び遺伝子パッケージの開発及び使用についてのさらなる例示が、以下の「実施例」の欄で示されている。実施例は、当該技術分野において通常の技術をもった実施者に対する指針として提供されるものであって、いかなる形であれ制限的意味をもつものではない。
【実施例】
【０１９９】
例１：ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージの調製と使用
Ａ． ＫＯ７ｋｐｎベクターの構築：
充分に特徴づけされたベクターすなわちＭ１３ＫＯ７（Amersham Pharmaciaより入手）を以下で詳述する手順に従って修飾することによって、ＫＯ７ｋｐｎベクターを構築した。結果として得られたベクターは、遺伝子ＩＩＩコーディング領域を分断することなく遺伝子ＩＩＩリーダー配列にユニークなＫｐｎＩ制限部位が挿入されたという点を除いて、ＫＯ７と同一である（図３Ａ及び図３Ｂを参照のこと）。
【０２００】
ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発によりＫＯ７ヘルパーファージベクターの遺伝子ＩＩＩリーダー配列にＫｐｎＩ部位を導入した。ＫｐｎＩ部位を含む以下のプライマを用いて、ＰＣＲによりＫＯ７ゲノムを増幅した：ｐ３ＫＮ１：５’−ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧ−３’及びｐ３ＫＮ２：５’−ＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’。これらのプライマは、遺伝子ＩＩＩリーダー配列に対する部分配列相同性を共有している。
【０２０１】
ＰＣＲは、１００ｎｇのＫＯ７ベクターＤＮＡ、各々２０ｐｍｏｌのプライマ、２５０μＭのｄＮＴＰ及び１×ｐｆｕ緩衝液とｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stragagene）を含む１００μｌの反応混合物の形で実施した。反応混合物を最初約９６℃でインキュベートし、次に以下の要領でサーモサイクラー内において１５サイクルのＰＣＲにかけた：
変性 ９６℃、３０秒
アニーリング ５５℃、３０秒
伸長 ７２℃、１０分
【０２０２】
増幅後、産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで切断し連結して、電気穿孔法によりＴＧ１細菌細胞を形質転換した。この細菌細胞をカナマイシン耐性について選択した。具体的には、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地の中で９６ウェルのマイクロタイタープレート内でカナマイシン耐性（ＫａｎR ）コロニーを増殖させ、上清を用いてファージＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行うことにより、ＰＣＲエラーによりひき起こされた機能喪失突然変異体を排除した。簡単に言うと、ファージＥＬＩＳＡを、以下のように行った。すなわち、ファージ粒子を含有する上清１００μｌを用いて、４℃でＥＬＩＳＡプレートのウェルに一晩コーティングした。室温で３０分間ＰＢＳ緩衝液中の５％の牛乳で遮断した後、ＥＬＩＳＡプレート上に結合したファージ粒子を、１００μｌのＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体（Amersham Pharmacia）と共にさらに室温で１時間インキュベートした。遊離の抗Ｍ１３抗体を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ〔２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕を添加した。４０５ｎｍでの吸光度により、ＨＲＰ活性を決定した。図２は、カナマイシン耐性、ファージ陽性クローンのためのファージＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示している。ファージ生成のために、４８のクローンをスクリーニングした。クローンＣ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２は、ファージ陽性であった。クローンＢ７、Ｂ９及びＡ１２から抽出したＤＮＡを、ＴＧ１培養物から調製した。Ａｃｃ６５Ｉ（ＫｐｎＩのアイソシゾマー）及びＢａｍＨＩでのベクターＤＮＡの二重消化は、６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを示し、これは、３つのＫＯ７ｋｐｎベクタークローン全てにおけるＫｐｎＩ部位の存在を確認するものである。
【０２０３】
Ｂ． ＫＯ７ｋｐｎファージの生成：
Ｂ９クローンから生成されたＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージを含有するＫａｎR ＴＧ１上清を、２×ＹＴ寒天プレート上に線条接種した。０．５ｍｌのＴＧ１培養物（ＯＤ６００＝０．５）と混合した４ｍｌの軟寒天をプレート上に注ぎ込んだ。３７℃で一晩インキュベートした後、ファージプラークが形成された。単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら２時間３７℃でインキュベートした後、培養物を、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに移した。常時振とうさせながら培養物を一晩インキュベートした。上清中のファージを次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ファージ濃度をＯＤ268 測定によって決定した。一般に、ＯＤ268における１単位の読取値は、その上清が、およそ５×１０12 ファージ／ｍｌを含有することを示している。ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージについての記録されたファージ収量は約１〜２×１０12／ｍｌであり、これはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのものときわめて類似していた。
【０２０４】
Ｃ． ファージ表示のためのＫＯ７Ｋｐｎヘルパーファージの使用：
ｓｃＦｖ抗体ＡＭ２のコーディング配列を、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体を発現するファージ表示ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２）にサブクローニングした。この表示ベクターを保有するＴＧ１細胞をＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、ＭＯＩ＝１０でＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージにより重複感染させた。感染したＴＧ１細胞を３０℃で２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ中で一晩増殖させた。培養上清からＰＥＧ／ＮａＣｌによりファージミド粒子を２回沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁させた。ファージ上で表示されたｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体は、ファージＥＬＩＳＡ検定により検出した。簡単に言うと、０．２μｇのＡＭ２−抗原をまず４℃で９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に一晩コーティングした。５％の牛乳／ＰＢＳでの遮断の後、２％の牛乳／ＰＢＳ中のファージ溶液を１時間ＥＬＩＳＡプレート上に置いた。抗原に結合したファージをＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体とのインキュベーションにより検出した。ＨＲＰ活性の測定のために、基質ＡＢＴＳ〔２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕を使用した。ｐＡＢＭＤ１−ＡＭ２／ＫＯ７ｋｐｎベクターを保有するＴＧ１細胞から生成されたファージミドは、非常に強い抗原結合活性を示し、これはＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージによるｓｃＦｖ抗体ＡＭ２の機能的表示を表わしていた。この一連の実験は、本発明の表示系を構築および使用するために利用される試薬のための正の対照としての役割をする。
【０２０５】
例２：ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ． ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＸｂａＩ部位とＢｇＩＩＩ部位の間の配列を、Ｍｙｃ−タグ（図４）及びＧＲ２ドメイン（ヒトＧＡＢＡB レセプタ２の高次コイルドメイン）のコーディング配列、及びＫｐｎＩ部位を含む部分遺伝子ＩＩＩリーダー配列をコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することによって、ｐＡＢＭＣ６ベクターを構築した。ＧＲ２−Ｍｃｙドメインのための配列は、ｐＡＢＭＤ１ベクター内でｐＩＩＩコーディング配列と直接融合され、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【０２０６】
ＫＯ７Ｋｐｎヘルパーベクター中の部分ｐＩＩＩリーダー（アミノ酸残基１１−１９）及び部分ｐＩＩＩタンパク質（アミノ酸残基１−１９７）をコードするＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ６ベクターからのアダプタ２−ｐＩＩＩ融合タンパク質及び部分ｐＩＩＩリーダーをコードする対応フラグメントで置換することによって、ＧＭ−ウルトラヘルパー(UltraHelper）ファージベクターを構築した。結果として得られたＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクター（図５）は、ＧＲ２ドメイン及びＭｙｃ−タグ配列（改変ｐＩＩＩタンパク質の検出用）が遺伝子ＩＩＩとインフレームで融合された改変された遺伝子ＩＩＩ融合体（図５Ｂ）を含む。
【０２０７】
ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築するために、Ｂ９ ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージクローン（例１参照）を使用した。改変された遺伝子ＩＩＩフラグメントをＫＯ７ｋｐｎファージベクターにサブクローニングした後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地中、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、２０のカナマイシン耐性コロニーを増殖させた。上清を使用して、例１に記載されているようなＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行った。１９のクローンがファージ粒子を生成することができた。
【０２０８】
ＧＭ−ウルトラヘルパーファージがＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質と共にパッケージングされたことを確認するために、改変ｐＩＩＩ融合を検出するべく、抗Ｍｙｃ抗体（BD Pharmingen からの９Ｅ１０）を用いたウェスタンブロットを行った。簡単に言うと、４つのクローン（クローン６、９、１８及び２０）から１〜４×１０11のファージ粒子を１０分間ＳＤＳサンプル緩衝液（２％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール、０．６７ＭのＴｒｉｃｅ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中で加熱した。変性サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳゲル中のタンパク質を次にＰＶＤＦ膜に移し、この膜を次に５％の牛乳／ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌの９Ｅ１０抗体でプローブ探査した。抗マウス抗体−ＡＰコンジュゲート及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ ＡＰ基質（Sigma）により、Ｍｙｃ−タグ付きタンパク質を検出した。図６に示されているように、抗Ｍｙｃ抗体により４つのクローン全ての中で単一のタンパク質バンドを検出した。負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ中では、Ｍｙｃを含有するバンドは全く検出されなかった。この実験は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質がウルトラヘルパーファージ粒子内に組立てられたことを実証している。ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合の組立ては、ＥＬＩＳＡ検定によってさらに確認された（図７参照）。
【０２０９】
Ｍ１３ファージがトリプシンに対する耐性をもつことは周知であった。プロテアーゼ切断部位についてのスクリーニングにより、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージのＧＲ２−Ｍｙｃドメイン内には７つのトリプシン切断部位が存在することが明らかになった（図５Ｃ）。ＧＲ２−Ｍｙｃドメインがトリプシンによりファージ表面から切断され得るか否かをテストするため、クローン１８からのＧＭ−ウルトラヘルパーファージを３７℃で３０分間、異なる濃度のトリプシンにさらし、その後反応を停止するべくトリプシン阻害物質を添加した。図８は、５μｇ／ｍｌのトリプシンによりＭｙｃ−タグを完全に除去できたことを示している。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージは、負の対照としての役割をした。
【０２１０】
Ｂ．ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述のＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を含有する上清を用いて、ファージプラーク検定を行った。単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした後、培養物をファージ粒子の大規模生産のため、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに移した。上清中のファージを次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することによってファージ濃度を決定した。ＯＤ268 測定は、培養物が約２×１０11／ｍｌのＧＭ−ウルトラヘルパーヘルパーファージ粒子を含むことを表わしている。トリプシンによりファージ表面からＧＲ２−Ｍｙｃドメインを除去することで、ファージ感染力を１〜３倍増大させることができた。
【０２１１】
Ｃ．抗原結合単位を表示するためのＧＭ−ウルトラヘルパーファージの使用：
本発明のアダプタ誘導型表示系においては、問題の外因性ポリペプチドは、外表面タンパク質とインフレームで融合される対合アダプタ（「アダプタ２」と呼ばれる）と相互作用するアダプタ（アダプタ１と呼ばれる）との融合として発現される。２つのアダプタ間のペアワイズ相互作用は、外因性ポリペプチドの表示を促進する。ファージミドベクターｐＡＢＭＸ１４は、アダプタ１とインフレームで融合された外因性ポリペプチドを発現する発現ベクターの１つである。このベクターｐＡＢＭＸ１４（図９Ａ及び図９Ｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ細胞（＋）に由来した。１組のプライマ（ｐＢＳ−Ｓｋａ：５’−ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’及びｐＢＳ−ＳＫｂ：５’−ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いて、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発により、ｌａｃプロモータの直後にユニークなＡｇｅＩ制限部位を導入し、ＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位を、切断と平滑末端連結により欠失させた。リボソーム結合配列ＲＢＳと、ｐｅｌＢリーダーと、ＧＡＢＡB レセプタ１（ＧＲ１、アダプタ１として）及びＨＡ−（Ｈｉｓ）6−タグ（ＤＨ−タグと称する）に由来するアダプタのコーディング配列とを含む、５’でＡｇｅＩにより、３’でＳａｌＩ部位によりフランキングされた合成ＤＮＡフラグメントを、改変されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ細胞（＋）にクローニングした。ｌａｃＺプロモータは、ＧＲ１融合の発現を駆動し、したがって細菌細胞で発現される可溶性外因性ポリペプチドの産生を可能にする。
【０２１２】
本発明を用いて、機能的タンパク質を表示できるということを実証するため、１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１４ベクターにサブクローニングした。結果として得られたｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ベクターでＴＧ１細胞を形質転換させ、この細胞を４又は４０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭ−ウルトラヘルパーファージにより重複感染させた。ファージ粒子を例１に記載されているように生成させ精製した。ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を、ＡＭ１−抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより検出した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果により、３つのＭＯＩ感染全てから生成されたファージ粒子が対応するＡＭ１−抗原に対する結合特異性を示すことが明らかになり、これは１本鎖抗体がファージ表面上で機能的に表示されたということを表わしていた（図１０）。用量依存性結合が観察された。結合は、ファージ濃度が１０12／ｍｏｌに達した時点で飽和した。ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、１０13／ｍｌといったような高い濃度でさえＡＭ−１抗原に結合しなかった。ファージ粒子を同様に、抗Ｍｙｃ及び抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析した。非還元性性条件下（例えばβ−メルカプトエタノール無し）で、ＳＤＳサンプル緩衝液の中での加熱によりファージ粒子を変性させた。図１１は、ｓｃＦｖ抗体がＧＭ−ウルトラヘルパーファージによる感染によってのみ表示され、対照のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージでは表示されなかったということを示している。抗Ｍｙｃブロットにより、ライン２内で、遊離ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩに比べほぼ２倍のｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体がファージ粒子中に組立てられたということも明らかにした。各ファージ粒子は、５コピーのｐＩＩＩ外皮タンパク質を含む。このことは、各ファージ粒子が平均して１コピーより多くのｓｃＦｖ−ＧＲ１融合体を担持していることを表わしている。
【０２１３】
例３：ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ．ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築：
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＸｂａＩ部位とＢｇＩＩＩ部位の間の配列を、５’から３’までの遺伝子ＩＩＩリーダー配列、ＫｐｎＩ部位、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのコーディング配列及びＭｙｃ−タグを含む合成ＤＮＡフラグメント（図１２）で置換することによって、ｐＡＢＭＣ１３ベクターを構築した。この合成配列は、ｐＡＢＭＤ１ベクター内で遺伝子ＩＩＩとインフレームで連結された。
【０２１４】
ＫＯ７Ｋｐｎヘルパーベクター内の（アミノ酸残基１１−１９）及び部分ｐＩＩＩタンパク質（アミノ酸残基１−１９７）をコードするＫｐｎＩ／Ｂａｍ ＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ１３ベクターからのアダプタ２−ｐＩＩＩ融合タンパク質及び部分ｐＩＩＩリーダーをコードする対応フラグメントで置換することによって、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築した。結果として得られたＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクター（図１３Ａ）は、ｐＩＩＩのＮ末端に配置されたＣｙｓ−ｍｙｃドメインと融合された改変ｐＩＩＩカプシドをコードする。さらに、アンバー停止コドンＴＡＧがＣｙｓ−Ｍｙｃコーディング配列と遺伝子ＩＩＩとの間に配置されている。かかる停止コドンは、サプレッサー細菌菌株内でファージ粒子全体の増殖を可能にするが、非サプレッサー菌株内ではこれを可能にしない。
【０２１５】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築するために、Ｂ９ ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージクローンを使用した。改変された遺伝子ＩＩＩフラグメントをＫＯ７ｋｐｎファージベクターにサブクローニングした後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地中、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、２４のカナマイシン耐性コロニーを増殖させ、上清を使用して、例１に記載されているようにＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行った。２３のクローンがファージ粒子を生成することがわかった。
【０２１６】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージが、発現されたＣｙｓ−Ｍｙｓ−ｐＩＩＩ融合体をファージ粒子内にパッケージングできるということを確認するため、抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定を行った。選択された５つのクローン由来のＣＭ−ウルトラヘルパーファージは全て、その表面上にＭｙｃ−タグを表示した。かかるＭｙｃ−タグは、負の対照のＫＯ７ヘルパーファージでは検出できなかった（図１４）。
【０２１７】
Ｂ．ＣＭ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述の手順に従ってＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を含有する上清を用いて、ファージプラーク形成を行った。簡単に言うと、単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした後、培養物を７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに加えて一晩インキュベートした。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて、ＴＧ１上清中のファージを沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することによってファージ濃度を決定した。ＣＭ−ウルトラヘルパー ヘルパーファージについてのファージ収量は培養１ｍｌあたり約１〜２×１０12 であり、これは、Ｍ１３ＫＯ７及びＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージのものときわめて類似している。トリプシンによりファージ表面からＭｙｃ−タグを除去することができる。改変された遺伝子ＩＩＩ内に配置されたアンバー停止コドンのために、非サプレッサー細菌菌株ＴＯＰ１０Ｆ’内では有意な量のＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を生成することができない。
【０２１８】
Ｃ．抗原結合単位を表示するためのＣＭ−ウルトラヘルパーファージの使用
ファージミドベクターｐＡＢＭＸ１５は、アダプタとインフレームで融合された外因性ポリペプチド（１本鎖抗体ＡＭ１）を発現するもう１つの例示的な発現ベクターである。（ＮｏｔＩ部位及びＳａｌＩ部位を用いて）ｐＡＢＭＤ２のｆｄ遺伝子ＩＩＩフラグメントを、ＨＡ−タグ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓをコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することにより、ｐＡＢＭＤ２（図２２）からベクターｐＡＢＭＸ１５（図１５Ａ及び図１５Ｂ）を構築した。
【０２１９】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いて、機能的タンパク質を表示できるということを実証するため、１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１５ベクターにサブクローニングした。結果として得られたｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１でＴＧ１細胞を形質転換させ、その細胞を１又は１０又は５０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＣＭ−ウルトラヘルパーファージにより重複感染させた。例１に記載されているようにファージ粒子を生成させ精製した。ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を、ＡＭ１抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより検出した。２×１０12のファージを各ウェルについて添加した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果から、４つのＭＯＩ感染の全てから生成されたファージミド粒子がＡＭ１抗原に対して特異的に結合する能力をもつことを明らかになり、これは機能的１本鎖抗体がファージ表面上で表示されたということを表わしていた（図１６）。ｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、ＡＭ１抗原に結合しなかった。ファージ粒子をウェスタンブロット法のためにも使用した。非還元性条件下（例えばβ−メルカプトエタノール無し）で、ＳＤＳサンプル緩衝液の中での加熱によりファージ粒子を変性させた。図１７に示されているように、ｓｃＦｖ抗体は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージによってのみ表示され、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージでは表示されなかった。
【０２２０】
図１７はまた、ＡＭ１ ｓｃＦｖよりも多くの遊離ｐＩＩＩがファージ粒子上に表示されていることを表わしている（左図のレーン４を参照）。これは１価表示を表わすものである。これとは対照的に、例２で記載されているＧＭ−ウルトラヘルパーファージ表示系は、遊離ｐＩＩＩよりも多くのＡＭ１ ｓｃＦｖを生成する（図１１、左図のレーン２を参照）。ｓｃＦｖ配列中にＧＡＢＡB レセプタ１のアダプタ配列を含むこと及びＧＭ−ウルトラヘルパーベクター内にアダプタ配列ＧＡＢＡB レセプタ２を取込むことは、ペアワイズ相互作用を増強する。
【０２２１】
例４：ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ．ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築：
Ｎｏｔ１−Ｂｇ／ＩＩフラグメントを、Ｍｙｃ−タグのコーディング配列、遺伝子ＩＩＩのＣＴドメイン（アミノ酸２１７−４０５）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＯｍｐＡリーダー配列（図２２Ａ及び図２２Ｂ）を含む合成ＤＮＡフラグメントで置換することにより、ベクターｐＡＢＭＣ６からｐＡＢＭＣ１２ベクターを構築した。
【０２２２】
ＫＯ７ｋｐｎヘルパーベクター内のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ１２ベクターからの対応フラグメントで置換することにより、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築した。結果として得られたＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクター（図１９Ａ）は改変されたｐＩＩＩカプシドの追加的なコピーをコードし、これはＧＲ２ドメイン、ｍｙｃ−タグ配列（改変ｐＩＩＩタンパク質の検出用）及びｐＩＩＩのＣＴドメインを含む。改変された遺伝子ＩＩＩの下流側では、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）及び細菌タンパク質ＯｍｐＡ由来のリーダー配列が、ｐＡＭＢＤ１に由来する遺伝子ＩＩＩ配列に融合された。遺伝子ＩＩＩ含有配列のこれら２つのコピーが（図１９Ｂに示されている）もとの遺伝子ＩＩＩプロモータの制御下に配置されている。例１に記載されたようにファージＥＬＩＳＡ検定を行ってファージ陽性クローンをスクリーニングした。１０クローンのうちの３つが、ファージ粒子を生成することがわかった。大規模ファージ調製のためにクローン３を使用した。
【０２２３】
Ｂ． ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述の手順に従って、ファージプラーク形成検定を実施した。ＧＭ−ウルトラヘルパーヘルパーファージについてのファージ収量は、培養１ｍｌあたり約８×１０11であり、これは、Ｍ１３Ｋ０７及びＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージのものと類似していた。トリプシンによりファージ表面からＧＲ２−Ｍｙｃドメインを除去することができる。
【０２２４】
Ｃ．抗原結合単位を発現するためのＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージの使用：
ＧＭＣＴウルトラヘルパーヘルパーファージと組合せた形でのファージ表示のために、プラスミドベクターｐＡＢＭＸ１４を使用した。１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１４ベクターにサブクローニングした（ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１と称する）。ＰＡＢＭＸ１４−ＡＭ１でＴＧ１細胞を形質転換させ、その細胞を１または１０又は５０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭ−ウルトラヘルパーファージと重複感染させた。例１に記載されているようにファージ粒子を生成させ精製した。ＡＭ１抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより、ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を検出した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果により、４つのＭＯＩ感染の全てから生成されたファージミド粒子がＡＭ１抗原に対して類似の結合活性を有することが実証され、これは機能的１本鎖抗体がファージ表面上で表示されたということを表わしていた（図２０）。ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、ＡＭ１抗原に対して検出可能な結合親和性を全く示さなかった。ファージ粒子をウェスタンブロット分析のためにも使用した。図２１に示されているように、ｓｃＦｖ抗体は、ＧＭＴＣ−ウルトラヘルパーファージによる感染によって表示されたが、対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージでは表示されなかった。
【０２２５】
例５：パニングによる所望のポリペプチドを表示するファージの富化
可溶性ポリペプチドを産生させるために、様々なＤＮＡ配列をｐＡＢＭＸ１４又はｐＡＢＭＸ１５ベクターのいずれかの中でクローニングすることができる。この発現ライブラリは、本発明のウルトラヘルパーファージによる感染によって、コードされたポリペプチドを表示するために使用することができる（ｐＡＢＭＸ１４についてはＧＭ及びＧＭＣＴ、ｐＡＢＭＸ１５についてはＣＭ）。ファージ上に表示された特異的タンパク質又はペプチドは、様々なライブラリから数回のパニングにより富化することができる。パニングプロセスは、以下のように記載される。簡単に言うと、９６ウェルのプレートに、４℃で１〜１０μｇ／ｍｌの濃度の特異的抗原を一晩コーティングする。ＰＢＳで洗浄し、５％の牛乳／ＰＢＳでの遮断の後、１０11-12 個のファージを添加し、２時間室温でインキュベートする。本発明のウルトラヘルパーファージは全てｐＩＩＩタンパク質に融合された切断可能なＭｙｃ−タグを有することから、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、結合したファージを１０μｇ／ｍｌのトリプシンで３０分間溶出させる。トリプシン溶出は、本発明者の実験においては（通常従来のファージパニングで使用される）１００ｍＭのトリエチルアミンよりも高い効率を示す。上記プロセスを数回反復することにより、所望のポリペプチドを表示するファージを富化させることができる。
【０２２６】
例６：細菌ヘルパーベクターの調製及び使用
Ａ． 発現ベクター及び細菌ヘルパーベクターの構築：
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位間の配列を、ＧＲ１アダプタ及びＨＡ−タグをコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することによって、発現ベクターｐＡＢＭＸ２２を構築する。図２５Ａに示されているように、該ベクターは、抗生物質選択用アンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）及び、下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐ８Ｌ−ＧＲ１−ＨＡ−タグの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含んでいる。細菌細胞中での可溶性タンパク質の表示又は産生のための外因性配列を挿入するためにＭｌｕＩ／ＸｂａＩまたはＭｌｕＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。図２５Ｂには完全ベクター配列が示されている。
【０２２７】
細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１（ベクターマップについては図２６Ａ、完全ベクター配列については図２６Ｂ）は、StratageneからのｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターに由来する。ｐＢＣ−ＫＳ（＋）内の２つのＢｓｓＨＩＩ部位間のマルチクローニングサイトの配列は、リボソーム結合配列ＲＢＳ、ｐｅｌＢリーダー配列、E. coli主要外膜リポタンパク質（Ｌｐｐ）の最初の９アミノ酸と外膜タンパク質ＯｐｍＡのアミノ酸４６−１５９とから成るキメラ外膜配列のコーディング配列、及びアダプタＧＲ２配列を含有する、５’でのＭｌｕＩ部位（ＢｓｓＨＩＩに対して適合した付着末端を伴う）により又３’でのＢｓｓＨＩＩ部位によりフランキングされている（flanked）合成ＤＮＡフラグメントによって置換されている。ｌａｃＺプロモータは、細菌細胞のペリプラスミドに分泌されることになるＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２融合体の発現を駆動する。ｐＡＢＭｂｄ−１ベクターは、抗生物質選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ）、プラスミド複製用 ColE1 ori起点、及びファージミドパッケージ用ｆｌファージ複製起点（fl ori）を含有する。
【０２２８】
Ｂ．細菌ヘルパーベクターを担持するファージミド粒子の生成
ｐＡＢＭｂｄ−１ヘルパーベクターで細菌ＴＧ１細胞を形質転換させる。単一のｐＡＢｂｄ−１コロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを伴う１５ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用する。ＯＤ600 が０．８に達した後、細菌細胞を３７℃で１時間、ＭＯＩ１０でＫＯ７Ｋｐｎヘルパーファージにより感染させる。感染したＴＧ１細胞を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコの中で一晩培養させる。その後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて上清中のファージミド粒子を沈降させ、リン酸緩衝液中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することにより、ファージミド濃度を決定する。ｐＡＢＭｂｄ−１ヘルパーベクターをパッケージングするファージミド粒子を次にアダプタ誘導型細菌表示のために使用する。
【０２２９】
Ｃ．抗原結合単位を表示するための細菌発現及びヘルパーベクターの使用
ｓｃＦｖ抗体遺伝子ＡＭ２をｐＡＢＭＸベクターにクローニングさせる。この発現ベクターを含有するＴＧ１細菌細胞をＯＤ600 ＝０．８まで増殖させ、細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１をパッケージングするファージミド粒子で感染させる。発現ベクター及びヘルパーベクターを保有するＴＧ１細胞を、３０℃でアンピシリン／Ｃａｍを伴う２×ＹＴの中で一晩増殖させ、収獲してＰＢＳで洗浄する。表示されたタンパク質はＨＡ−タグでタグ付けされていることから、細菌表面上で表示されたタンパク質を検出するために抗ＨＡタグ抗体を使用することができる。ＦＡＣＳ分析実験のため、ＰＢＳ中で再懸濁した細胞をまずは抗ＨＡタグ抗体と共にインキュベートし、次にフルオレセインＦＩＴＣ標識化抗マウス抗体と共にインキュベートする。ＰＢＳでの洗浄後、３〜５×１０7 ／ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した細胞を、ＦＡＣＳソータを用いてフルオレジン強度に基づいて計数する。細菌表面上に表示されたタンパク質を検出するために、ＥＬＩＳＡ検定も使用される。まず第１に、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃でＡＭ２抗原で一晩コーティングさせる。２時間抗原と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに結合した細胞を、上述の通り、抗ＨＡ抗体及びＨＲＰ結合型抗マウス抗体で検出する。
【０２３０】
可溶性抗体フラグメントの産生のために、様々な抗体配列をｐＡＢＭＸ２２ベクターにクローニングすることができる。この発現ライブラリは、細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１をパッケージングするファージミド粒子による感染によって、選択可能細菌表示ライブラリを生成するために使用することができる。抗体を表示する細菌細胞をＦＩＴＣ標識化抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳソータを用いてフルオレシン強度に基づいてソーティングする。ソーティング後、選択された細胞を、ＡＭＰを伴う２×ＹＴ培養液中で一晩増殖させる。その後、細胞を新鮮な培地中で継代培養し、表示のため細菌ヘルパーベクターに感染させる。表示された細胞は、次にＦＡＣＳソーティング選択を再度行うために使用される。
【０２３１】
例７：改善された親和力をもつＡｂｕｓの生成及び同定
上述のように、本発明の表示系は、改善された親和力又は特異性をもったＡｂｕｓの生成及び選択のために特に適している。開示された様々な系の中でも、アダプタ誘導型ファージ表示系は、改善された親和力をもつＡｂｕｓをスクリーニングするための強力なプラットフォームを提供する。
【０２３２】
本発明者は、その配列及び対応する抗原が以前に記述されているＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体という名称の既存のＡｂｕを改変することを選択した。このプロセス（以下「抗体親和力成熟」（antibody affinity maturation）と称する）は、ＧＭＣＴベクターのフォーマットでＡＭ３ ＳｃＦｖ抗体のライブラリを生成することで開始される。ＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体の枠組構造はＶＨ及びＶＬ領域から成るが、その各々を記載されている通りベクターｐＡＢＭＸ１４の対応する位置にサブクローニングした（図９Ａ参照）。ＡＭ３抗体結合親和力を改善するために、多数の位置でアミノ酸残基の様々な置換を含むライブラリとしてＶＨのＣＤＲ３を構築した。該ライブラリは、ＰＣＲ増幅及び制限消化の後にＡＭ３ ｓｃＦｖ遺伝子のその位置へのサブクローニングをもたらすべく両末端で制限部位をフランキングする変性ＤＮＡオリゴの標準的有機合成を通して調製された。該ライブラリは、およそ１０7 の多様性を有する（すなわち、約１０7 種のＡＭ３抗体変異体を含む）。ＤＮＡ連結の後、該ライブラリをＴＧ１コンピテント細胞内に電気穿孔させた。その後、形質転換体を収獲し、ＧＭＣＴウルトラヘルパーファージによりレスキュー（rescue）した。その後、以上の例で記載した通り、ファージ粒子を収集した。
【０２３３】
このように構築されたアダプタ表示ライブラリをスクリーニング又は「パニング」するために、本発明者は最初に、４℃で０．０５ＭのＮａＨＣＯ3 ｐＨ９．６緩衝液中でNunc Maxisorb 96ウェルプレート上に組換え型抗原を一晩固定化した。２％の牛乳を伴うＰＢＳ緩衝液中で希釈された１０12個のファージ粒子を含有するライブラリファージのアリコートを、上記抗原でコーティングされたウェルに添加した。２時間３７℃での結合後、ウェルを洗浄し、本明細書で記載した方法に従ってファージを溶出させた。溶出したファージを用いてＴＧ１細胞に感染させ、次にＧＭＣＴウルトラヘルパーファージでレスキューした。３０℃で一晩培養した後、ファージをＴＧ１細胞内で増幅させ、ファージは次回のパニングのために直ぐに収獲できる状態となった。ＧＭＣＴファージライブラリパニングを通して高親和性結合剤を選択するために、このライブラリを用いて、異なる解離条件で全体で多数連続回のパニングを行った。
【０２３４】
最終パニングの後、個々のクローンを無作為にピックアップし、同じ組換え型抗原を用いてＥＬＩＳＡによりさらに分析した。以上で記載した手順により９６ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットでＥＬＩＳＡを行った。図２７に示されているように、選択されたクローンは全て、抗原と陽性反応（すなわち抗原に結合）した。
【０２３５】
上述のＥＬＩＳＡで陽性反応性を示したクローンを次に配列決定のために無作為にピックアップし、ＶＨのＣＤＲ３上の残基をマッピングし、ここから一定数の代表的クローンをタンパク質の発現のために処理した。ＡＭ３抗体の場合、Invitrogen Life Technologiesにより記載されているように、Pichia発現系により全てのｓｃＦｖが発現された。Pichia培養物上清由来の可溶性のＨｉｓ−タグ付けされたｓｃＦｖｓを、Qiagenのマニュアルブックに従って、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（２ｍｌ）により直接精製した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから溶出された画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により分析した。図２８に示されているように、画分＃２及び＃３の両方の中で、主要タンパク質バンドとしての３０ＫＤのｓｃＦｖが検出された。ｓｃＦｖ及び他のあらゆるホモ二量体を除去するため、画分＃２及び＃３を組合せ、さらにゲルろ過クロマトグラフィ（HiLoad 16/60 Superdex 75カラム、Amersham-pharmacia biotech）にかけた。
【０２３６】
図２９は、３ＯＫＤの単量体ｓｃＦｖタンパク質が、ゲルろ過クロマトグラフィによりホモ二量体ｓｃＦｖ及びその他から充分分離されたことを示している。その後、精製された単量体ｓｃＦｖタンパク質を用いて、固定化されたタンパク質抗原に対するＡＭ３抗体の結合動態を BiaCore（表面プラスモン共鳴）により分析した。図３０に示されているように、ライブラリから選択された４つのＡＭ３変異体（Ｘ１０７、Ｘ１１０−１１２）は全て、野生型に比べ有意に低い解離速度（Ｋoff）とより高い結合親和力を示した。例えば、Ｘ１１２についてのＫoffは２．８８×１０-4Ｓ-1であり、野生型についてのＫoffは２．７７×１０-3Ｓ-1である。Ｘ１１２抗体は、野生型抗体よりもほぼ１０倍低い解離速度を有する。これらの結果はさらに、抗体工学における本発明のファージアダプタ誘導型表示系の利用可能性及び技術的優位性を実証している。
【技術分野】
【０００１】
本出願は係属中の２００１年１１月２日付け米国実用特許出願の一部継続出願であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は表示技術の分野にある。詳しくは、本発明は、遺伝子パッケージ上での外因性ポリペプチド表示のためのアダプタ誘導型表示系（adapter-directed display systems）の生成に関する。本発明で具現化される組成物及び方法は、膨大なポリペプチドのレパートリの中から所望の特性を示す個々の構成員を同定するために特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子パッケージの表面上でのポリペプチドの表示は、実験室において分子の進化を行うための強力な方法となっている。膨大な分子多様性をもつライブラリを構築し望ましい特性をもつ分子を選択する能力により、この技術は広範囲の問題に適用できるものとなってきた。ファージ表示の起源は、George Smithがファージ外皮タンパク質に外因性配列を融合することによってバクテリオファージＭ１３ウイルス粒子の表面上でタンパク質の外因性セグメントを初めて発現した１９８０年代中葉にさかのぼる（Science (1985) 228:1315-1317）。２つの画期的コンセプトが Smithの初期の実験から出現した。まず第１に、個々のファージ粒子が特有のポリペプチドを表示する、膨大で多様なポリペプチドのレパートリを構築することができる、ということが該実験から示唆された。第２に、表現型と遺伝子型との間の直接の物理的結付きが該実験から確認された。すなわち、所望のポリペプチドを表示するファージは同時にポリペプチドをコードするＤＮＡをも保有しており、これはその後の分析のために容易に単離することができる。MaCafferty及びLadnerはこれらのコンセプトを拡張して、ファージ粒子の表面上で表示される１本鎖抗体といったポリペプチドのレパートリをスクリーニングした（米国特許第５，９６９，１０８号及び第５，８３７，５００号）。そのとき以来、ファージ表示が、タンパク質工学に一般的に用いられる技術となった。
【０００４】
George Smithの発見事実に基づいて、一連の表示系が開発されてきた。これらの系は、２つのカテゴリーに大きく分類することができる。第１世代の系は１ベクター系である。この系のベクターは、全ファージゲノムを含有し、その中に外皮タンパク質遺伝子とインフレーム（in frame）で外因性配列を挿入する。結果として得られたファージ粒子は、ファージゲノム全体を担持することから、これらは比較的不安定で感染性が低い。第２世代の系は、一般にファージミド系と呼ばれ、次の２つの構成要素：すなわち、ファージ外皮タンパク質に融合させられた外因性配列を担持するファージミドベクター及びファージ粒子内へのファージミドのパッケージングを可能にするためのファージ由来の複製起点；及び（２）ファージパッケージングのために必要とされる他の全ての配列を担持するヘルパーファージベクター、を有する。ヘルパーベクターは、Amersham Pharmacia Biotechにより製造されるＭ１３Ｋ０７ヘルパーベクター及び Stratagenにより生産されるその誘導体ＶＣＳＭ１３といったように、一般的には複製欠損性のものである。ヘルパーファージによる細菌細胞の重複感染によって、ファージミドベクターを担持するとともに外因性配列を表示する新たにパッケージングされたファージが産生される。
【０００５】
かくして、先行技術のファージミド系では、ファージ外表面配列（すなわち外皮配列）の少なくとも一部分に対する外因性配列の融合が必要とされる。最も一般的に用いられる融合部位または表示部位は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩ内にあるが、遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸ融合も報告されている。しかしながら、これらの融合系には、数多くの顕著な制限がある。まず第１に、外皮タンパク質の発現は宿主細胞に対して毒性であり、そのため外皮融合体の緊縮した調節を監視することが必要である。たとえそうであっても、不可避的なプロモータ漏出により、多様なライブラリの構成員の喪失が起こり得る。ライブラリの安定性を維持することは、少なくとも１０9 の複雑さをもつ（抗原結合単位といったような）膨大かつ多様な分子のレパートリを生成するために、特に重要である。第２に、遺伝子ＩＩＩ産物（ｐＩＩＩ）といったような或る種の外皮タンパク質の発現は、後代ファージ粒子の産生のために必要とされるヘルパーファージによる感染に対する耐性を宿主細胞に付与し得る。第３に、遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩファージ表示系を含め、その融合形式は挿入点を外表面配列の５’末端に制限している。そのため外因性ポリペプチドは外表面タンパク質のＮ末端に連結されなくてはならない。その結果、リーディングフレームの内部停止コドンによる頻繁な分断に起因して、これらの融合系により、全リーディングフレームのコーディング配列のフラグメントを含有するｃＤＮＡライブラリを完全に表示させることはできない。その上、融合系は、ヘルパーベクターにより一般に供給される野生型外表面タンパク質と融合体との間の組換えに起因して不安定である。さらに、ファージミドベクターが外表面配列の少なくとも一部分を含有することから、大きなベクターの形質転換効率の低さゆえ、大きな外因性配列が効率的に発現されないことがある。しかしながら、複雑さの高いライブラリの生成にとって、形質転換効率は重要な要因である。
【０００６】
融合ファージミド系に対する様々な修飾が記載されてきた。ＷＯ９１／１７２７１は、外因性配列が「タグ」と「タグリガンド」との相互作用を介して表示されるファージ表示系の構築を提案している。この系は、タグ配列に連結された外因性配列を担持するファージゲノミックベクターを含有する。同ベクターは、外皮タンパク質遺伝子とインフレーム（in frame）で融合されたタグリガンド配列を担持する。該ベクターによる宿主細胞の感染によって、外因性配列を発現するファージ粒子が産生されることになる、ということが推測される。しかしながら、ＷＯ９１／１７２７１の開示は、その概念の実施を可能にする教示を提供していない。例えば、ＷＯ９１／１７２７１は「タグ」と「リガンド」の間の相互作用を介してファージ粒子の表面上にいずれかの配列が表示されたことを実証しておらず、又、タンパク質が発現された場合にそれが生物活性を保持するということも実証していない。その上、提案された系は、同ベクター内に全てのファージ外皮タンパク質遺伝子を担持するファージゲノミックベクターを利用することから、上述したような全ての制限及び欠点を不可避的に受け継いでいる。
【０００７】
Crameri らは、ファージミドベクター上に表示されるべき外因性配列に隣接してＦｏｓ腫瘍遺伝子が挿入され、同ベクター上の遺伝子ＩＩＩに隣接してＪｕｎ腫瘍遺伝子が挿入された、ｃＤＮＡ産物を表示するための系を考案している（Crameri et al. (1993) Gene 137:69-75参照）。これら２つの融合配列は、２つの別々のプロモータの制御下に置かれている。Crameri の手法は、Ｆｏｓタンパク質とＪｕｎタンパク質の間の好ましい相互作用を活用する。すなわち、Ｆｏｓ外因性ポリペプチドが発現されペリプラズム空間に分泌されるにつれて、それはｐＩＩＩ−Ｊｕｎと複合体を形成し、これが次にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージによる重複感染によってファージ粒子内にパッケージングされる。この系の外因性配列は外表面配列に直接には連結されないものの、同ベクターの別々のプロモータの下でのファージ外皮タンパク質ｐＩＩＩの構成性発現は、依然として宿主細胞に対する実質的な毒性をひき起こす。
【０００８】
Crameri 系に類似したもう１つの変異体は、ＷＯ０１／０５９５０に記載されている「システイン結合された」表示系である。外因性ポリペプチドの付着と表示は、外因性配列に含有されているシステイン残基及び外表面配列に挿入されているシステイン残基という２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成によって媒介される。ＷＯ０１／０５９５０に記載されている１ベクター系は、２つの別々のプロモータ制御された発現カセットを担持するファージミドベクターである。すなわちそのうちの１つは外因性配列を発現し、もう１つは外皮タンパク質ｐＩＩＩを発現する。ＷＯ０１／０５９５０に記載されている２ベクター系は、外因性配列を担持するファージミドベクター及び外皮タンパク質ｐＩＩＩを発現するプラスミドを含有する。２つのベクターは、 E. Coli細胞を同時トランスフェクションするために用いられる。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７による重複感染によって、結果として得られるファージ粒子内にファージミド及び／又はプラスミドがパッケージングされる。この系は外表面タンパク質に連結された外因性タンパク質を含む融合体の発現を回避するものの、ここでも１ベクター又は２ベクター系のいずれかにおいて外皮タンパク質ＰＩＩＩが構成性に発現されるため、宿主細胞に対する外皮タンパク質の毒性を少なくおさえることができない。その上、ＷＯ０１／０５９５０に記載されている２ベクター系は、ヘルパーファージによる感染によって外表面配列を担持するが外因性遺伝子を担持しないミスパッケージングされたベクターを伴うファージ粒子を不可避的に産生する。ミスパッケージングは、２ベクター系に付随する周知の問題である。ｐＩＩＩ−補足用プラスミドベクターがヘルパーファージ粒子内にミスパッケージングされることが示されている（Rondot et al. (2000) Nature 19:75-78）。
【０００９】
最終的に、上述の先行技術のファージ表示系は、細菌表示系といったような他の表示系との両立性をもたない。同ファージ表示された外因性配列を細菌細胞上に直接に提示するためには、外因性配列をまず細菌表示ベクターにサブクローニングしなければならない。
【００１０】
従って、遺伝子パッケージ上での外因性表示のための改善された組成物及び方法に対する相当の必要性がなおも存在している。理想的な系は以前に報告された系の欠点を回避するものとなるだろう。本発明は、これらの必要性を満たすとともに、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、ペプチド結合により遺伝子パッケージのいずれの外表面配列にも連結されていないポリペプチドの表示を可能にする系の設計にある。該実験的設計はファージ粒子といったような遺伝子パッケージ上での所望の特性をもつタンパク質の提示及び／又は選択のための前例のない柔軟性を提供する。本発明のファージ表示系の技術的利点は、多種多様である。まず第１に本発明の系は、発現ベクターによる外表面タンパク質の発現に付随する全ての欠点を回避する。上述のように、これらの欠点としては、（１）外表面配列の構成性発現の結果としての宿主細胞に対する高い毒性；（２）後代ファージ粒子の産生に必要とされるヘルパーファージの感染に対する宿主細胞の耐性；（３）Ｎ末端融合産物の一方向表示に起因する、表示されるべきタンパク質の配向に対する制限；及び（４）ヘルパーベクターによって一般に提供される野生型外表面配列と融合外表面配列との間の組換えに起因する、融合産物の不安定性、が含まれる。第２に、本発明の系は、ＷＯ０１／０５９５０で記載されている２ベクター系で使用されているプラスミドのような、外表面配列を担持するが問題の遺伝子を担持しないプラスミドのミスパッケージングの可能性を無くする。先行技術の表示系が有するこれら及び他の固有の欠点を回避する一方で、本発明の系はさらに、１つの遺伝子パッケージにつきポリペプチドの単数のコピー（一価表示）又は複数のコピー（多価表示）を提示する柔軟性をも提供する。本発明の系は、特に問題の分子（molecules of particular interest）を結合する固有の能力に基づいて、膨大かつ多様なポリペプチドのレパートリ（すなわち抗原結合単位）を発現およびスクリーニングするために特に有用である。本発明の系によって表示されるポリペプチドは機能的である。
【００１２】
従って、本発明は、遺伝子パッケージの外表面上に外因性ポリペプチドを表示するためのアダプタ誘導型表示系を提供する。本発明の系は、（ａ）第１のアダプタ配列にインフレーム（in frame）で融合された外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如している、発現ベクターと、（ｂ）該遺伝子パッケージをパッケージングするために必要な外表面タンパク質をコードする外表面配列を含み、該外表面タンパク質の少なくとも１つが第２のアダプタにインフレームで融合された、ヘルパーベクターとを含んで成り、前記第１のアダプタと第２のアダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、第１アダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用（pairwise interaction）を介して該ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。
【００１３】
利用される遺伝子パッケージは、ウイルス、細胞及び胞子であり得る。１つの実施形態において、本発明の系はファージ表示系である。外表面配列はファージの機能的外皮タンパク質をコードする。好ましい外表面配列は、繊維状ファージ等のファージの機能的外皮タンパク質をコードする。好ましい外表面配列は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ、遺伝子ＶＩ、遺伝子ＶＩＩ、遺伝子ＶＩＩＩ及び遺伝子ＩＸから成る群より選択される。
【００１４】
もう１つの実施形態において、本発明の系は細菌表示系である。発現ベクターでは除外されているものの細菌ヘルパーベクターに含まれている外表面配列が、細菌外表面タンパク質をコードする。好ましい外表面タンパク質は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ、ＴｒａＴ、Ｐａｌ、Ｏｐｒｌ、Ｉｎｐ及びＡＩＤＡ−Ｉから成る群より選択される。
【００１５】
本発明の表示系を構築するために、第１のアダプタと第２のアダプタは、ホモ二量体化配列又はヘテロ二量体化配列であり得る。好ましいホモ二量体化配列は、ジスルフィド結合を形成する能力をもつ２つの対合するシステイン残基である。好ましいヘテロ二量体化配列としては、ヘテロ二量体レセプタＧＡＢＡB レセプタ１及び２に由来するもののような、生理緩衝液条件下及び／又は生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたないものが含まれる。他の好ましいアダプタは高次コイル二次構造を採用するものであってよい。
【００１６】
本発明はまた、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドを表示するためのヘルパーベクターを提供する。該ベクターは、該遺伝子パッケージをパッケージングするために必要な外表面配列を含み、該表面提示配列の少なくとも１つがアダプタにインフレーム（in frame）で融合され、前記アダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、該ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。１つの態様において、本発明のヘルパーベクターは細菌ヘルパーベクターである（例えば図２６参照）。もう１つの態様において、ヘルパーベクターはファージヘルパーベクターである（本明細書において「ウルトラヘルパー(UltraHelper）ファージベクター」ともいう）。好ましいファージヘルパーベクターとしては、限定されないが、図５Ａに示されるＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクター、図１３Ａに示さるＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクター及び図１９Ａに示されるＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターが含まれる。
【００１７】
本発明はさらに、遺伝子パッケージの内部又はその外表面上でポリペプチドを産生するための発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、第１のアダプタにインフレーム（in frame）で融合された該ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該ベクターは該遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如しており、該遺伝子パッケージの外表面上での該ポリペプチドの表示は第１のアダプタと第２のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して媒介され、第２のアダプタは外表面配列に融合されている。１つの態様において、発現ベクターはファージミドである。本ファージ表示系のファージミドの例としては、図９Ａに示されるｐＡＢＭＸ１４、図１５Ａに示されるｐＡＢＭＸ１５、及び図２５Ａに示されるｐＡＭＢＸ２２がある。
【００１８】
同じく本発明に含まれるのは、本発明のアダプタ誘導型表示系を含んで成るキットであり、該系の個々の構成要素が発現ベクター及びヘルパーベクターを含む。本発明でさらに提供されるのは、本発明のベクターを含んで成る宿主細胞である。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、その外表面上に融合ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを提供する。該融合ポリペプチドは、第１のアダプタとインフレーム（in frame）で融合された表示されるべきポリペプチド配列を含んで成り、前記第１のアダプタは、適切な宿主細胞内で融合ポリペプチドが産生されるときに、外表面タンパク質に連結された第２のアダプタと第１のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して融合ポリペプチドの表示をひき起こすように作用する。遺伝子パッケージは、ウイルス、細胞及び胞子であり得る。
【００２０】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つが上記の遺伝子パッケージである複数の遺伝子パッケージを含んで成る、選択可能ライブラリを提供する。
【００２１】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、本発明のアダプタ誘導型表示系を適切な宿主細胞内で転写および翻訳させることにより、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドを表示するための方法を提供する。この方法により生成する選択可能ライブラリも同じく本発明に包含される。
【００２２】
本発明はさらに、遺伝子パッケージ上に表示される外因性ポリペプチドとテスト物質との間の特異的相互作用の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）上記の方法に従って調製される外因性ポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを提供する段階；（ｂ）安定なポリペプチド−物質複合体を形成するのに適切な条件下でテスト物質と遺伝子パッケージを接触させる段階；及び（ｃ）遺伝子パッケージ上の安定なポリペプチド−物質複合体の形成を検出し、それにより特異的相互作用の存在を検出する段階、を含んで成る。１つの態様において、外因性ポリペプチドは、抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質及び核タンパク質から成る群より選択される。好ましい態様において、外因性ポリペプチドは抗原結合単位である。テスト物質は、タンパク質、炭水化物、脂質及びこれらの組合せから構成され得る。好ましいテスト物質は、抗原又はリガンドである。
【００２３】
最後に本発明は、所望の特性をもったポリペプチドを取得する方法を提供する。該方法は（ａ）本発明の方法によって作成された選択可能ライブラリを提供する段階；及び（ｂ）選択可能ライブラリをスクリーニングすることにより、所望の特性をもったポリペプチドを表示する少なくとも１つの遺伝子パッケージを取得する段階、を含んで成る。１つの態様において、所望の特性は、問題の物質に対する結合特異性である。もう１つの態様において、選択可能ライブラリをスクリーニングする段階は、所望の特性をもったポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを単離する段階をさらに含む。かかる段階は、所望の特性をもつポリペプチドをコードする遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を取得する段階をさらに含んでよい。所望の特性をもつポリペプチドは、以下のタイプのタンパク質：すなわち抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質及び核タンパク質、の１つであり得る。
【００２４】
本明細書で使用される略記の説明
１．Ｎｓｃ：非１本鎖
２．Ｓｃ：１本鎖
３．Ａｂｕ：抗原結合単位（単数）
４．Ａｂｕｓ：抗原結合単位（複数）
５．Ｌ鎖：軽鎖
６．Ｈ鎖：重鎖
７．ＶＬ：軽鎖可変領域
８．ＶＨ：重鎖可変領域
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のアダプタ誘導型表示系の実験的設計の概略図である。描かれている表示系は、適切な宿主細胞内での可溶性外因性ポリペプチドの発現を可能にするばかりでなく、遺伝子パッケージの外表面上での外因性配列の表示をも可能にする。該系は、発現ベクター及びヘルパーベクターといった２つの構成要素を有する。 E. Coli細菌といったような宿主細胞内に発現ベクターを単独で導入することにより、アダプタ（「アダプタ１」と称する、図１の中央図を参照）とインフレームで融合された外因性ポリペプチドの発現および細菌ペリプラズムへの分泌が導かれる。第２のアダプタ（「アダプタ２」と称する、左図参照）とインフレームで融合されたファージ外表面配列を担持するヘルパーファージベクターによる細菌細胞の重複感染によって、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介してファージ粒子上での外因性ポリペプチドの表示が可能となる。発現ライブラリを構築するために、この発現ベクター内に多様なＤＮＡ配列を挿入することができる。ヘルパーファージの重複感染によって、多様なファージ表示ライブラリが生じる。同様にして、第２のアダプタ（「アダプタ２」と称する、右図参照）とインフレームで融合された細菌外表面配列を担持するヘルパー細菌ベクターをパッケージングするファージミド粒子による細菌細胞の感染によって、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介して細菌上での外因性ポリペプチドの表示が可能となる。同様にして、選択可能細菌表示ライブラリを構築することもできる。
【００２６】
【図２】カナマイシン耐性ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ陽性クローンについてのファージＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示す図である。４８のクローンが、ファージ生成についてスクリーニングされた。Ｃ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２が、ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージ陽性クローンを表わす。Ｆ１及びＦ２は、親Ｍ１３ＫＯ７ファージの２つの正の対照を表わす。
【００２７】
【図３Ａ】ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージベクターの概略図である。
【図３Ｂ】ヘルパーファージベクター中に含まれる遺伝子ＩＩＩリーダー配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。遺伝子ＩＩＩのコーディング領域を改変することなく、ＫｐｎＩ制限部位がリーダー配列の下流側に導入されている。
【００２８】
【図４】ベクターｐＡＢＭＣ６の概略図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩ配列の５’側に配置されたＫｐｎＩ部位、部分的遺伝子ＩＩＩリーダー配列、ＧＲ２コーディング配列およびＭｙｃ−タグを含んでいる。
【００２９】
【図５Ａ】ＧＭ−ウルトラヘルパー ファージの概略図である。
【図５Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。
【図５Ｃ】ＧＲ２−Ｍｙｃドメイン内のトリプシン切断部位（Ｔｒｙｐ）を描く図である。
【００３０】
【図６】ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。これらの結果はＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子の組立てを示している。レーン１及び７は、ｋＤａで表わした分子量マーカーを示す。レーン２−５は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合を発現するＧＭ−ウルトラヘルパーファージの４つのクローンを示す。レーン６は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合配列を担持しないＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージの負の対照を示す。
【００３１】
【図７】ＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子に組立てられるＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を検出するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。図６に示すファージクローン６、１８及び２０がテストされた。負の対照としてＫＯ７ヘルパーファージが含まれた。
【００３２】
【図８】増大する量のトリプシンを用いたウルトラヘルパーファージ由来のＧＲ２−Ｍｙｃドメインの良好な切断を実証するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージは負の対照としての役割をした。
【００３３】
【図９Ａ】ベクターｐＡＢＭＸ１４の概略図である。
【図９Ｂ】ｐＡＢＭＸ１４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、および下流側配列ｐｌａｃ―ＲＢＳ―ｐｅｌＢ―ＧＲ１−ＤＨ（ＨＡ及び６×His tag ）の発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞での可溶性タンパク質の表示または産生のための外因性配列を挿入するために、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００３４】
【図１０】ＧＭ−ウルトラヘルパーファージ又はＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。細菌ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−アダプタ１融合体の発現のためのｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。それぞれの抗原に対する用量依存性ファージ結合が、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの感染によってのみ観察され、負の対照Ｍ１３ＫＯ７ファージによっては観察されなかった。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミド及びＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖ表示を実証する。
【００３５】
【図１１】図１１の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージによる重複感染を受けたファージミドベクターｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１を保有するＴＧ１細胞内でファージ粒子が生成された負の対照を表わす。レーン２は、ファージミドｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ベクター及びＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターにより生成されたファージ粒子を表わす。外因性配列ｓｃＦｖが検出された。レーン３は、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージを単独で用いた負の対照を表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン２においてのみ、ＧＲ１とＧＲ２とのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドを検出する。レーン２内の遊離ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩと比べた場合、約２倍ものｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体が表示された。これは、各ファージ粒子が平均して１よりも多くのｓｃＦｖ−ＧＲ１融合体のコピーを担持しているということを表わす。ｐＩＩＩ−Ｍｙｃ−ＧＲ２二量体に対応するバンドがレーン３内で検出された。ｐＩＩＩ−Ｍｙｃ−ＧＲ２二量体の形成は、ＧＡＢＡB レセプタ２アダプタ配列の下流側で導入されたシステイン残基対に起因していた。ＧＡＢＡB レセプタ２のアダプタ配列はそれ自体、生理体温の条件下で及び／又は生理緩衝液の条件下でホモ二量体を形成する傾向をもたない（Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図１１の右図参照）、レーン２内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの重複感染によるｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ融合体の表示を確認するものである。
【００３６】
【図１２】ベクターｐＡＢＭＣ１３の概略図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩの５’側に配置されたＫｐｎＩ部位を有する部分的ｇＩＩＩリーダー配列、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙコーディング配列、及びＭｙｃ−タグを含む、ＤＮＡフラグメントを含有している。
【００３７】
【図１３Ａ】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの概略図である。
【図１３Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。該ベクターは、遺伝子ＩＩＩ配列の５’側に配置されたＭｙｃ−タグと融合されたＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードするヌクレオチド配列を含有している。さらに、該ベクターは、遺伝子ＩＩＩリーダー配列とＣｙｓ−Ｍｙｃコーディング領域によりフランキングされた(flanked）アンバー停止コドンを含む。アンバーコドンの導入は、サプレッサー細菌菌株内のみでファージ産生を可能にする。
【００３８】
【図１４】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子に組立てられるＣｙｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合体を検出するために抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定の結果を描く図である。レーン１は、負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを表わす。レーン２−６は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージの５つのクローンを表わす。レーン７は、正の対照であるＧＭ−ウルトラヘルパーファージを表わす。
【００３９】
【図１５Ａ】ベクターｐＡＢＭＸ１５の概略図である。
【図１５Ｂ】ｐＡＢＭＸ１５の完全ヌクレオチド配列を示す図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐｅｌＢ−ＨＡ−Ｃｙｓの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞での可溶性タンパク質の表示または産生のための外因性配列を挿入するために、ＮｃｏI／ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ又はＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００４０】
【図１６】ＣＭ−ウルトラヘルパーファージ又はＭ１３ＫＯ７（「ＫＯ７」とも表記される）ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。細菌ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体の発現のためｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１５ファージミド及びＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖ表示を実証する。ライン３−６に示される感染多重度（ＭＩＯ）１〜１００の範囲でｓｃＦｖ表示レベルにおける大きな変化は無かった。ライン１及び２は、ＫＯ７ヘルパーファージの２つの負の対照を表わす。レーン２により示されるように、負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いた場合、ｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓが全く検出されなかった。
【００４１】
【図１７】図１７の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、ＫＯ７ファージを単独で用いた負の対照を表わす。レーン２は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを単独で用いた負の対照を表わす。レーン３は、ファージミドｐＡＢＭＸ１５により発現されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体がＫＯ７ファージによる重複感染によって検出されなかった負の対照を表わしている。レーン４は、ファージミドｐＡＢＭＸ１５により発現されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓ融合体がＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターによる重複感染によって良好に表示されたファージクローンを表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン４においてのみ、対合するシステインのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ−Ｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドを検出する。この結果は、ファージミドが、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージによってではなくＣＭ−ウルトラヘルパーファージによってレスキュー（rescue）された場合にのみｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｃｙｓの表示が生じることを示す。ｐＩＩＩ配列の５’末端で導入された２つのシステイン残基の間で確立されたジスルフィド結合に起因して、ライン２及びライン４でｐＩＩＩ−Ｍｙｃ二量体が検出された。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図１７の右図参照）、対照レーン１−３内ではなくレーン４内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ−Ｓ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージのレスキューによるｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ融合体の表示を確認するものである。
【００４２】
【図１８】ベクターｐＡＢＭＣ１２の概略図である。ベクターｐＡＢＭＣ６のヌクレオチド配列に加えて、ベクターｐＡＢＭＣ１２は、ＧＲ２−Ｍｙｃコーディング配列に融合された遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分についてのコーディング配列、及び遺伝子ＩＩＩ配列に融合されたリボソーム結合配列（ＲＢＳ）−ＯｍｐＡリーダー配列を含む、ＤＮＡフラグメントを含有している。
【００４３】
【図１９Ａ】ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターの概略図である。
【図１９Ｂ】ＫｐｎＩ部位とＢｇＩＩＩ部位にまたがるセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸を描く図である。該ベクターは、ＫＯ７ｋｐｎファージベクター内のＭｙｃ−タグ及びアダプタＧＲ２に融合された改変遺伝子ＩＩＩの追加的コピーをコードするヌクレオチド配列、及びＫＯ７遺伝子ＩＩＩ配列に隣接するリボソーム結合配列−ＯｍｐＡリーダー配列を含有している。
【００４４】
【図２０】ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージ又は対照Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージのいずれかによる細菌ＴＧ１細胞の重複感染によってファージ粒子が生成された、ファージ結合検定の結果を描く図である。ＴＧ１細胞は、ｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ融合体の発現のためｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ファージミドベクターを保有している。これらの結果は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミド及びＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いたファージ粒子上での機能的ｓｃＦｖの表示を実証する（レーン２−５）。感染多重度（ＭＩＯ）１〜１００の範囲でｓｃＦｖ表示レベルにおける大きな変化は無かった。ライン１は、ＫＯ７ヘルパーファージの重複感染によりｓｃＦｖが表示されなかった負の対照を表わす。
【００４５】
【図２１】図２１の左図は、ファージ外皮タンパク質の抗Ｍｙｃ免疫ブロットの再現図である。レーン１は、ｐＡＢＭＸ１４ファージミドをレスキューするためにＫＯ７ファージを用いた負の対照を表わす。レーン２は、ファージミドｐＡＢＭＸ１４により発現されたｓｃＦｖ抗体がＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージによる重複感染によって良好に表示されたファージクローンを表わす。レーン３は、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージを単独で用いたもう１つの負の対照を表わす。抗Ｍｙｃ抗体は、レーン２においてのみ、ＧＲ１とＧＲ２とのペアワイズ相互作用を介して形成されたｓｃＦｖ−ＧＲ１／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ＣＴ（ＩＩＩ）複合体に対応するバンドを検出する。この結果は、ＫＯ７ヘルパーファージによってではなくＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージによってファージミドがレスキューされた場合にのみｓｃＦｖ−ＧＲ１の表示が生じることを示す。 同じブロットを抗ＨＡ抗体により再プローブ探査した場合（図２１の右図参照）、対照レーン１又は３内ではなくレーン２内で抗ＨＡ抗体によりｓｃＦｖ−ＧＲ１／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ＣＴ（ＩＩＩ）複合体に対応するバンドが検出された。これは、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージのレスキューによるｓｃＦｖ−ＨＡ−Ｓ融合体の表示を確認するものである。
【００４６】
【図２２Ａ】ベクターｐＡＢＭＤ１及びｐＡＢＭＤ２の概略図である。
【図２２Ｂ】ｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１部位とＳａｌＩ部位にまたがるヌクレオチド及びアミノ酸配列を描く図である。
【００４７】
【図２３】ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のＣ末端配列を描く図である。該配列のＣ末端に「ＶａｌＧｌｙＧｌｙＣｙｓ」スペーサを付加することにより、外因性システイン残基が導入されている。
【００４８】
【図２４】様々な抗原結合単位を描く概略図である。
【００４９】
【図２５Ａ】細菌発現ベクターｐＡＢＭＸ２２の概略図である。
【図２５Ｂ】ｐＡＢＭＸ２２の完全ヌクレオチド配列を描く図である。該ベクターは、抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐ８Ｌ−ＧＲ１−ＨＡの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。細菌細胞上での表示のための外因性配列を挿入するために、ＭｌｕＩ／ＸｂａＩまたはＭｌｕＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。
【００５０】
【図２６Ａ】細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１の概略図である。
【図２６Ｂ】ｐＡＢＭｂｄ−１の完全ヌクレオチド配列を描く図である。該ベクターは、抗生物質選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）及びｆｌファージ複製起点（fl ori）、及び下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐｅｌＢ−Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２の発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含有する。
【００５１】
【図２７】最終パニングから無作為にピックアップされた個々のクローンからのＡＭ３ファージＥＬＩＳＡ結果を描く図である。各々の棒線は、特定のＡＭ３変異体のＯＤ４０５での読取り値を表わしている。位置Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ負の対照及び正の対照である。
【００５２】
【図２８】Ｎｉ−ＮＴＡカラムからの ＡＭ３ ｓｃＦｖ精製結果を描く図である。溶出画分のアリコート２５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、その後クーマシーブルー染色を行なった。Ｍ：タンパク質マーカー; １：ＷＴクローン＃１の画分＃２; ２：ＷＴクローン＃１の画分３; ３：ＷＴクローン＃２の画分＃２; ４：ＷＴクローン＃２の画分＃３。
【００５３】
【図２９】ゲルろ過クロマトグラフィを用いた ＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体の精製の結果を描く図である。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたｓｃＦｖ抗体を、Superdex75カラムを用いたクロマトグラフィにかけた。図に示されているように、単量体ｓｃＦｖが、混合物中のタンパク質の残留物から分離された。
【００５４】
【図３０】図３０は、BiaCoreを用いた野生型ＡＭ２との比較におけるＡＭ３変異体の結合動態分析を描く図である。センサーグラムは、野生型に比べて著しく低い解離速度およびより高い結合親和力をもったの全４つのＡＭ３変異体を示した。曲線の勾配は、選択された抗体がどれほど速く抗原と会合し（初期）抗原から解離したか（終期）を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本開示全体を通して、様々な刊行物、特許及び公示済み特許明細書は、識別のための引用により言及されている。これらの刊行物、特許及び公示済み特許明細書の開示は、ここで、本開示中に参考として内含される。
【００５６】
一般的技術：
本発明の実施は、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来の技術を利用する。例えば、「ペプチド及びタンパク質のファージ表示」(B.K. Kay et al., 1996);「ファージ表示、実験室マニュアル」(C.F. Barbas III et al., 2001) Sambrook, Fritsch及びManiatis,「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版 (1989);「分子生物学の現行プロトコル」(F.M. Ausubel, et al. eds., (1987));「酵素学方法」シリーズ (Academic Press, Inc.):「ＰＣＲ２：実践的アプローチ」(M.J. MacPherson, B.D. Hames 及び G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow 及び Lane, eds. (1988),「抗体、実験室マニュアル」及び「動物細胞培養」(R.I. Freshney, ed. (1987))を参照のこと。
【００５７】
明細書及び特許請求の範囲で使用される単数形態「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、前後関係から明らかに反しない限り、複数の言及も含まれる。例えば「細胞」という語には、その混合物も含め、複数の細胞が含まれる。
【００５８】
定義：
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という語は、本明細書では、いずれの長さのアミノ酸の重合体にも言及するべく、互換可能に使用される。重合体は、線状、環状又は分岐状のいずれでもよく、また修飾されたアミノ酸を含んでもよく、また非アミノ酸によって中断されてもよい。この語はまた、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、アルギニル化のようなタンパク質に対するアミノ酸のトランスファＲＮＡにより媒介される付加、ユビキチン化、又は標識成分との結合のような他の操作により、修飾されたアミノ酸重合体をも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体を包含する天然の及び／又は非天然の又は合成のアミノ酸、及びアミノ酸類似体、及びペプチド模倣体(peptidomimetics）をいう。
【００５９】
ある指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列というのは、そのポリペプチドの起源を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、配列中でコードされたポリペプチド又はその部分（なおここで該部分は少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸から成る）のアミノ酸配列と基本的に同一であるか、又は配列中にコードされたポリペプチドにより免疫学的に同定可能である、アミノ酸配列を有する。この用語には、ある指定された核酸配列から発現されたポリペプチドも含まれる。
【００６０】
「キメラ」タンパク質は、天然に発生するものとは異なる配列中の位置にある領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。この領域は、別のタンパク質に通常存在して融合ポリペプチド中で一緒になってもよく、或いは同じタンパク質内に存在はするものの融合ポリペプチド中で新たな配置に置かれていてもよい。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によって又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作製および翻訳することによって生成し得る。
【００６１】
本明細書で使用されている「多量体タンパク質」という語は、in vitro又は in vivoで単一の球状タンパク質を形成するべく互いに会合した複数の別々のポリペプチド又はタンパク質鎖を含む球状タンパク質を意味する。多量体タンパク質は、「ホモ多量体」を形成するように同じ種類の複数のポリペプチドで構成され得る。あるいは、多量体タンパク質は、「ヘテロ多量体」を形成するように異なる配列の複数のポリペプチドで構成され得る。かくして、「ヘテロ多量体」は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む分子であり、ここで第２のポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基により第１のポリペプチドとアミノ酸配列が異なっている。ヘテロ多量体は、第１及び第２のポリペプチドによって形成された「ヘテロ二量体」を含むことができ、或いは２つ以上のポリペプチドが存在する高次三次構造を形成することができる。ヘテロ多量体のための構造例としては、ヘテロ二量体（例えばＦｖ及びＦａｂフラグメント、二重特異性抗体(diabody）、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２複合体）、三量体Ｇ−タンパク質、ヘテロ四量体（例えばＦ（ａｂ’）2 フラグメント）及びさらなるオリゴマー構造が含まれる。
【００６２】
「リガンド」とは、レセプタのリガンド結合ドメインによって結合される能力をもつ分子を意味する。この分子は、化学的に合成されるものでも又は天然に発生するものでもよい。
【００６３】
「アゴニスト」とは、例えばレセプタといったシグナル伝達分子の生物活性を刺激する能力をもつ分子である。
【００６４】
「アンタゴニスト」とは、レセプタの生物活性を阻害する能力をもつ分子である。
【００６５】
「ペアワイズ相互作用」（pairwise interaction）とは、２つのアダプタが安定な複合体を形成するように互いに相互作用し互いに結合することができることを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外表面上にポリペプチドをパッケージングできるようにするため充分に長く存続するものでなくてはならない。複合体又は二量体は、形成時点と表示されたポリペプチドの検出時点の間に存在するか又は導入されるあらゆる条件に耐えることができなくてはならず、これらの条件は、実行される反応又は検定の関数である。
【００６６】
「一価表示」とは、遺伝子パッケージあたり単一コピーの外因性ポリペプチドの発現を意味する。一価のファージ表示系において、ファージ粒子の集まりは、ファージ粒子あたり平均してゼロ〜１つの外因性ポリペプチドを担持する。これとは対照的に「多価表示」とは、遺伝子パッケージあたり１コピーよりも多くの外因性ポリペプチドの発現を意味する。かくして多価ファージ表示系において、ファージ粒子の集まりは、平均して１コピーよりも多くの外因性ポリペプチドを担持する。
【００６７】
本明細書で用いられる「抗体」という語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（「免疫反応する」）抗原結合部位を含有する分子を意味する。構造的には、最も単純な天然に発生する抗体（例えばＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んで成る。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥといったような幾つかのタイプの分子を包含する大きな分子ファミリーを表わす。「免疫グロブリン分子」という語は、例えば、ハイブリッド抗体、又は改変された抗体、及びそのフラグメントを包含する。天然に発生する抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能が行われ得るということが示されている。これらのフラグメントは、「抗原結合単位」（「Ａｂｕｓ」）と総称される。Ａｂｕｓは、その分子構造に基づいて「１本鎖」（「Ｓｃ」）タイプと「非１本鎖」（「Ｎｓｃ」）タイプとに広く分けられる。
【００６８】
同様に「抗体」及び「Ａｂｕｓ」という語の中に包含されるのは、無脊椎動物及び脊椎動物を含む様々な種の起源の免疫グロブリン分子である。抗体又はＡｂｕに適用される「ヒト」という語は、ヒト遺伝子又はそのフラグメントにより発現された免疫グロブリン分子を意味する。非ヒト（例えばゲッ歯類又は霊長類）抗体に適用される「ヒト化」という語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限配列を含有するハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントである。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和力及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は霊長類といったような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも、あるいは移入されたＣＤＲまたは枠組配列内にも見出されない残基を含んでいる可能性がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練しヒトの体内に導入されるときの免疫原性を最小限におさえるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しかつＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、一般にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。
【００６９】
「非１本鎖抗原結合単位」（「ＮｓｃＡｂｕｓ」）は、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドを含むヘテロ多量体である。ＮｓｃＡｂｕｓの例としては、（１）本明細書で開示されているヘテロ二量体化配列により安定化されたｃｃＦｖフラグメント（図２４）；（２）本明細書に記載されているような少なくとも１つのｃｃＦｖフラグメントを含む他のいずれかの１価及び多価分子；（３）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；（４）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（５）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（６）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）2 フラグメント；（７）二重特異性抗体(diabody）及び（８）Littleら(2000)「今日の免疫学」に記載されている他のいずれかのＮｓｃＡｂｕｓが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００７０】
上述のように、ＮｓｃＡｂｕｓは、「一価」でも「多価」でもあり得る。前者は、抗原結合単位あたり１つの結合部位を有する一方、後者は、同じ種類又は異なる種類の１つよりも多くの複数の抗原に結合する能力をもつ多数の結合部位を含む。結合部位の数に応じて、ＮｓｃＡｂｕｓは、２価（２つの抗原結合部位をもつ）、３価（３つの抗原結合部位をもつ）、４価（４つの抗原結合部位をもつ）等々であり得る。
【００７１】
多価のＮｓｃＡｂｕｓはさらに、その結合特異性に基づいて分類され得る。「単一特異性」ＮｓｃＡｂｕは、同じ種類の１以上の抗原に結合する能力をもつ分子である。「多重特異性」ＮｓｃＡｂｕは、少なくとも２種類の異なる抗原に対する結合特異性をもつ分子である。かかる分子は通常２種類の異なる抗原のみと結合する（すなわち二重特異性Ａｂｕｓ）ことになるものの、三重特異性抗体といったような追加的特異性をもつ抗体が本明細書で用いられる場合には、それらもこの表現に包含される。二重特異性抗原結合単位の例としては、一方のアームが腫瘍細胞抗原に対して特異的であり、もう一方のアームが細胞毒性トリガー分子に対して特異的であるもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐｌ８５HER2／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（ＩＤ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５HER2、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌腫、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌腫）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激性ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプタ／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３等；腫瘍抗原に特異的に結合する１本のアームと毒素に結合する１本のアームをもつ二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インタフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマ・イディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗−ビンカアルカロイド；酵素活性化プロドラッグを変換するためのＢｓＡｂｓ、例えば（リン酸マイトマイシンのマイトマイシンアルコールへの変換の触媒として作用する）抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ等；線維素溶解薬として使用可能な二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）等；細胞表面レセプタに対し免疫複合体をターゲティングするための二重特異性抗原結合単位、例えば抗低密度リポタンパク（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプタ（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃｒＲＩＩＩ）等；感染性疾患の治療に使用するための二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプタ：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ等；in vitro又はin vivo での腫瘍検出のための二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ＣＥＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５HER2／抗ハプテン等；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂｓ；及び、診断手段としての二重特異性Ａｂｕｓ、例えば抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。三重特異性抗体の例としては、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれている。
【００７２】
「１本鎖抗原結合単位」（「ＳｃＡｂｕ」）とは、単量体Ａｂｕを意味する。Ｆｖフラグメントの２つのドメインは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法によりそれらを単一タンパク質鎖（すなわちBird et al. (1988) Science 242:423-426及びHuston et al. (1988) PNAS 85:5879-5883）に記載されているような１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として作ることができるようにする合成リンカーを作ることが可能である。
【００７３】
「抗原結合単位のレパートリ」とは、複数の抗原結合単位であってその少なくとも２つが異なる結合特異性を示すものを意味する。抗原結合単位の遺伝的に多様なレパートリとは、複数の抗原結合単位であってその全てではないとしても大部分が相互に特有の結合特異性を示すものを意味する。遺伝的に多様なレパートリは、一般には、少なくとも１０6 〜１０13、好ましくは１０7 〜１０9 、より好ましくは１０8 〜１０10、さらに一層好ましくは１０8 〜１０11の異なる抗原結合単位という複雑さを有する。
【００７４】
抗体またはＡｂｕは、それがポリペプチドまたは他の物質を含む他の基準抗原に結合するよりも大きい親和力（affinity）または結合力(avidity）で結合する場合に、抗原「に特異的に結合する」又は抗原「と免疫反応性をもつ」。
【００７５】
Ａｂｕが宿主細胞の外表面に提示されるときに、Ａｂｕが「宿主細胞の表面上に」表示される。表示されたＡｂｕは、宿主細胞の外表面に直接付着されてもよいし、そうでなければファージ粒子といったような宿主細胞に結合された遺伝子パッケージにより宿主細胞に間接的に付着されてもよい。
【００７６】
本明細書で使用される「外表面配列」とは、遺伝子パッケージの「外表面タンパク質」をコードするヌクレオチド配列を意味する。これらのタンパク質は、遺伝子パッケージのゲノムを被包するタンパク様の外皮を形成する。一般的には、外表面タンパク質は、例えばファージ又は細菌といったような遺伝子パッケージの外表面上に表示されるべきポリペプチドを組立てるように該パッケージを誘導する。
【００７７】
遺伝子またはタンパク質に適用される「野生型」という語は、「天然に発生する」、「未改変の」遺伝子又はタンパク質を意味する。これらの語には、細胞又は遺伝子パッケージ内に天然に見出される全長のプロセッシングされたポリヌクレオチド及びポリペプチドが含まれる。「野生型外表面タンパク質」という語は、ウイルス、細胞又は胞子のいずれであるかにかかわらず、天然に発生する遺伝子パッケージの外皮を形成するようなタンパク質を意味する。繊維状バクテリオファージの場合、野生型タンパク質は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）及び遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。
【００７８】
本明細書で使用される「抗原」とは、抗体により特異的に認識され結合される物質を意味する。抗原には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質；それらの部分及び組合せが含まれうる。
【００７９】
本明細書で使用される「表面抗原」という語は、細胞の原形質膜構成要素を意味する。これは、原形質膜を構成する内在性及び表在性膜タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質を包含する。「内在性膜タンパク質」というのは、細胞の原形質膜の脂質二重層を横断して延在する膜貫通タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質は、疎水性アミノ酸残基を一般に含んで成る少なくとも１つの「膜貫通セグメント」で構成されている。表在性タンパク質は、脂質二重層の疎水性内部には延在せず、他の膜タンパク質との非共有結合性相互作用により膜表面に結合される。
【００８０】
細胞タンパク質に対し適用される「膜」、「細胞質ゾル」、「核」及び「分泌」といった語は、細胞タンパク質が大部分として、優勢に又は優先的に局在化される細胞外及び／又は細胞内の場所を特定する。
【００８１】
「細胞表面レセプタ」は、そのそれぞれのリガンドに結合する能力をもつ膜タンパク質のサブセットを表わす。細胞表面レセプタは、細胞原形質膜上に固定（anchor）されるか又は細胞原形質膜の中に挿入された分子である。これらは、原形質膜の構造構成要素としての役割のみならず、調節要素すなわち様々な生物学的機能を調節するシグナル伝達分子としての役割もする、タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質の大きなファミリーを構成する。
【００８２】
「ヘテロ二量体レセプタ」は、リガンドに対する結合親和力を示す２つのタンパク様サブユニットを含んで成る細胞タンパク質を包含する。２つのタンパク様サブユニットは、少なくとも１つのアミノ酸残基によりアミノ酸配列が異なる別異の分子である。ヘテロ二量体レセプタの非限定的な例としては、増殖因子（例えばヘレグリン）、神経伝達物質（例えばγ−アミノ酪酸）及び他の有機又は無機の小分子（例えば、鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）に結合するものがある。好ましいヘテロ二量体レセプタは、核ホルモンレセプタ(Belshaw et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93(10):4604-4607)、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２レセプタ複合体、及び限定されることなくオピオイドを含むＧタンパク質結合レセプタ(Gomes et al. (2000) J. Neuroscience 20(22):RC110); Jordan et al. (1999) Nature 399:697-700)、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン、及びＧＡＢＡB レセプタファミリーである。
【００８３】
「ドメイン」とは、タンパク質又はペプチドの他の部分から物理的又は機能的に区別されるタンパク質の部分を意味する。物理的に定義づけされるドメインとしては、膜関連又は細胞質関連の配列といったような例外的に疎水性又は親水性のアミノ酸配列が含まれる。ドメインはまた、例えば遺伝子重複から発生する内部相同性によっても定義づけされうる。機能的に定義づけされるドメインは、異なる生物学的機能を有する。例えば、レセプタのリガンド結合ドメインは、リガンドと結合するドメインである。抗原結合ドメインは、抗原に結合する抗体又は抗原結合単位の部分を意味する。機能的に定義づけされるドメインは、接近するアミノ酸配列によりコードされる必要が無い。機能的に定義づけされるドメインは、１以上の物理的に定義づけされるドメインを含みうる。例えば、レセプタは一般に、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内エフェクタドメインに分けられる。「膜アンカードメイン」というのは、膜会合を媒介するタンパク質の部分を意味する。一般に、膜アンカードメインは、疎水性アミノ酸残基で構成されている。あるいは、膜アンカードメインは、修飾アミノ酸、例えば、該タンパク質を膜に固定させる脂肪酸鎖に付着されたアミノ酸を含みうる。
【００８４】
「宿主細胞」には、本発明のベクターのレシピエントでありうるか又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の後代が含まれる。後代は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異に起因して、もとの親細胞と必ずしも完全に同一（形態学又は合計ＤＮＡ補体のゲノミクスに関して）でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターによる in vivoのトランスフェクションを受けた細胞が含まれる。
【００８５】
「細胞系統」又は「細胞培養物」は、in vitroで増殖または維持された、細菌、植物、昆虫又は高等真核生物の細胞を表わす。ある細胞の子孫は親細胞と（形態学、遺伝子型、又は表現型のいずれかに関して）完全に同一でないことがある。
【００８６】
「ディファインド培地」とは、培地の成分がわかるように培地中の細胞の生存及び／又は増殖に必要な栄養及びホルモンの要求量を含む培地を意味する。従来、ディファインド培地は、増殖及び／又は生存にとって必要な栄養及び成長ホルモンの添加によって配合されてきた。典型的には、ディファインド培地は、以下のカテゴリーの１種以上からの少なくとも１種の成分を提供する：ａ）全ての必須アミノ酸、通常は２０種のアミノ酸＋システインという基本セット；ｂ）通常はグルコースといったような炭水化物の形をしている、エネルギー源；ｃ）低濃度で必要とされるビタミン及び／又は他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；及びｅ）微量元素（なおここで微量元素は、通常はマイクロモル範囲内の、非常に低い濃度で一般的に要求される天然に発生する元素又は無機化合物として定義づけされる）。ディファインド培地は、同様に、以下のカテゴリーのいずれかからの１種以上の成分で任意に補足されてもよい：ａ）１種以上の有糸分裂誘発剤；ｂ）例えばカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩といった塩及び緩衝液；ｃ）例えばアデノシン及びチミジン、ヒポキサンチンといったようなヌクレオシド及び塩基、及びｄ）タンパク質及び組織加水分解産物。
【００８７】
本明細書で使用される「単離された」という語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントが通常自然状態で結び合わされている細胞及びその他の形の成分から分離されることを意味している。当業者にとっては明らかであるように、天然に発生しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、それをその天然に発生する対応物と区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」又は「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、体積あたりの分子数又は濃度がその天然に発生する対応物に比べて「濃縮された」ものの方が大きいか又は「分離された」ものの方が小さいという点で、その天然に発生する対応物と区別することができる。
【００８８】
富化は、溶液の体積あたり重量といった絶対基準で測定することもできるし、又は、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉性の物質との関係において測定することもできる。本発明の実施形態の富化は、その程度が増大すればするほど好ましい。かくして、例えば２倍の富化が好ましく、１０倍の富化はさらに好ましく、１００倍の富化はさらに好ましく、１０００倍の富化はより一層好ましい。化学的合成又は組換え型発現といったような人工的組立てプロセスにより、単離された状態で物質を提供することも可能である。
【００８９】
「連結された」及び「融合された」又は「融合」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの語は、化学的結合又は組換え手段を含むあらゆる手段による、２つ以上の化学的要素又は構成要素の連結を意味する。「インフレーム融合」(in frame fusion）とは、もとのオープンリーディングフレームの正しいリーディングフレームを維持する形でより長い連続ＯＦＲを形成するための２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）の連結を意味する。かくして、結果として得られた組換え型融合タンパク質は、もとのＯＦＲによりコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは通常は自然状態でこのように連結されていない）を含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームはかくして、融合されたセグメント全体を通して連続した状態にされているが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列（例えば「フレクソン」）により物理的又は空間的に分離され得る。
【００９０】
本明細書で用いられる「フレクソン」というのは、典型的には小さい側鎖をもつアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン）を含む可とう性ポリペプチドリンカー（又はかかるポリペプチドをコードする核酸配列）を意味する。本発明の融合体の１以上の部位の間にフレクソンを取込むことにより、互いに比較的独立した立体配座をとることができるようにして機能性を促進することが可能である。
【００９１】
ポリペプチドに関して、「線状配列」又は「配列」は、その配列内で互いに隣接し合う残基がポリペプチドの一次構造において連続しているアミノからカルボキシ末端方向へのポリペプチドのアミノ酸の順序である。「部分配列」というのは、一方又は両方の方向に付加的な残基を含むものとして知られているポリペプチドの部分の線状配列である。
【００９２】
「非相同」（heterologous）とは、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、その未改変コーディング配列から除去されてその未改変配列以外のコーディング配列に作動的に連結されたプロモータが、非相同プロモータである。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「非相同」という語は、該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味している。例えば、非相同ポリヌクレオチド又は抗原は、異なる種の起源、異なる細胞型、及び異なる個体の同じ細胞型に由来し得る。
【００９３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換可能に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さを有するヌクレオチドの重合体形態を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造をもっていてよく、既知又は未知の任意の機能を行うことができる。以下に記すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコーディング又は非コーディング領域、連鎖分析から規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え型ポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体といったような修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それは、重合体の組立ての前後いずれでも付与できる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断され得る。ポリヌクレオチドを、標識構成要素との結合などによって、重合後にさらに修飾することが可能である。
【００９４】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え型」という語は、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限及び／又は連結の段階、及び天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構成体を結果としてもたらすその他の手順の様々な組合せの産物であることを意味している。
【００９５】
「遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」という語は、ここでは互換可能に使用されている。これらは、転写及び翻訳後に特定のタンパク質をコードする能力をもつ少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを意味する。遺伝子又は遺伝子フラグメントは、そのポリヌクレオチドが、コーディング領域全体又はそのセグメントを網羅しうる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでいるかぎりにおいて、ゲノム又はｃＤＮＡであり得る。
【００９６】
「作動可能な形で連結された」又は「作動的に連結された」という語は、このように記述される構成要素がその意図される形で機能できるようにする関係にある並置を意味する。例えば、プロモータ配列は、それがコーディング配列の転写を促進する場合に、コーディング配列に作動可能な形で連結されていることになる。
【００９７】
「融合遺伝子」というのは、一緒に連結されている少なくとも２つの非相同ポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子である。
【００９８】
遺伝子「データベース」というのは、生物学的参照材料の集まりを表わすヌクレオチド及びペプチド配列を包含する配列の集まりを表わす、保存されたデータ組を意味する。
【００９９】
本明細書で使用される「発現」という語は、ポリヌクレオチドをｍＲＮＡに転写するプロセス及び／又は転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）をその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質へと翻訳するプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１００】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を宿主細胞内に及び／又は宿主細胞間で移入する核酸分子、好ましくは自己複製性核酸分子である。この用語は、細胞内へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主として機能する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。同様に含まれるのは、上述の機能のうちの複数のものを提供するベクターである。
【０１０１】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入されたときにポリペプチドに転写され翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは通常、所望の発現産物を生成するべく機能しうる発現ベクターを含んで成る適切な宿主細胞を意味する。
【０１０２】
「レプリコン」というのは、適切な宿主細胞内でのポリヌクレオチドの複製を可能にする複製起点（一般にはｏｒｉ配列と呼ばれる）を含むポリヌクレオチドを意味する。レプリコンの例には、エピソーム（例えばプラスミド）、ならびに染色体（例えば核又はミトコンドリア染色体）が含まれる。
【０１０３】
「シグナル伝達」というのは、刺激性又は阻害性シグナルが細胞内へ及び細胞内で伝達されて細胞内応答を惹起するプロセスである。「シグナル伝達経路のモジュレータ」とは、同じ特異的シグナル伝達経路に位置付けられた１以上の細胞タンパク質の活性を調節する化合物を意味する。モジュレータは、シグナル伝達分子の活性を増大又は抑制しうる。
【０１０４】
本発明のアダプタ誘導型表示系
本発明の中心的態様は、ペプチド結合によりいずれの機能的外表面配列にも連結されていない無作為の又は予め定められたポリペプチドのライブラリ又は外因性ポリペプチドの遺伝子パッケージ上での表示を可能にする表示系の設計にある。本発明の系は、発現ベクターによる外表面タンパク質の発現に付随する全ての欠点を回避する。実験的設計は、ウイルス、細胞及び胞子といったような遺伝子パッケージにより提示される所望の特性をもつタンパク質を提示しかつ／又は選択するために特に有用である。
【０１０５】
本発明の表示系は、２つの構成要素を含んで成る。すなわち（１）遺伝子パッケージの外表面上に表示されるべきポリペプチドをコードする問題の外因性遺伝子を担持する発現ベクター、及び（２）特に問題のポリペプチドの表示を促進するヘルパーベクターである。以前に報告された表示系と異なり、本発明の系は以下の特有の特長を有する。まず第１に、発現ベクターは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示されるべき外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含む。第２に、発現ベクターは、遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列もが欠如している。第３に、ヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要な全ての外表面配列を含み、その外表面配列の少なくとも１つが第２のアダプタ配列にインフレームで融合され、ここで外因性ポリペプチドの表示は第１アダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用によって媒介される。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、上述の特徴をもつファージヘルパーベクター及びファージミド発現ベクターを含んでなるファージ表示系を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、細菌発現ベクター及び細菌ヘルパーベクターが上記の特長を示す細菌表示系を提供する。該ファージ表示系及び細菌表示系の実験的設計は、哺乳動物細胞表示系といったような真核生物発現系の構築に拡張することができる。
【０１０７】
本発明のファージ表示系：
上述のように、以前に報告されたファージ表示系には、数多くの顕著な欠点があった。例えば、一般に利用される遺伝子ＩＩＩ系及び遺伝子ＶＩＩＩ系は、いくつかの固有の欠点をもつ。なかでも挙げられるのは、（１）遺伝子パッケージの或る種の外表面タンパク質との融合体として外因性ポリペプチドを発現する結果としての、宿主細胞に対する毒性；（２）遺伝子パッケージ上に外因性ポリペプチドをパッケージングするのに外表面タンパク質の或る領域が必要とされることを理由とする、表示すべき外因性ポリペプチドのサイズ及び配向に対する厳密な制限；及び（３）ヘルパーベクターによって一般的に提供される野生型外表面タンパク質と上記融合体との間の組換えに起因する、融合産物の不安定性。最近報告された「システインカップリングされた」表示系（ＷＯ０１／０５９５０）は、ペプチド結合を介した外表面タンパク質融合の発現を回避するものの、宿主細胞に対するこれらのタンパク質の毒性を最低限におさえることはなおもできていない。その上、１つの特定の設計、すなわちＷＯ０１／０５９５０に記載された２ベクター系は、ヘルパーファージの感染により、不可避的にミスパッケージングされたベクターを産生する。ミスパッケージングされたベクターは、外表面配列を含むものの外因性遺伝子を含まない。本発明のファージ表示系は、これらの欠点を回避し、その他の関連する利点を提供する。
【０１０８】
本発明の設計の中心的態様は、ファージパッケージングに必要とされる外表面タンパク質からの外因性ポリペプチドの分離である。かくして、外因性ポリペプチドを担持するファージミドベクター（発現ベクター）は、機能的外表面タンパク質をコードする配列を全く含有しない。ファージ粒子表面上への外因性ポリペプチドの提示は、２つのアダプタのペアワイズ相互作用によって媒介される。アダプタの一方は、ファージミドベクターによりコードされた外因性ポリペプチドとインフレームで融合され、もう一方は、ヘルパーベクターによりコードされた少なくとも１つの外表面タンパク質とインフレームで融合される。ファージミドベクターを担持する宿主細胞がヘルパーファージによる感染を受けた時に、コードされた外因性ポリペプチドは、それぞれのアダプタの間でのペアワイズ相互作用を介して外表面タンパク質との複合体を形成する。この複合体はこのとき、ファージの表面尾鞘内にパッケージングされ、外因性ポリペプチドをその外表面上に露出された状態に残す。
【０１０９】
本発明のファージミドベクターの一般的特徴：
いくつかの因子が、本発明のファージ表示系の構築に適用される。まず第１に、ファージミドベクターは、ポリペプチドが表示されるべき遺伝子パッケージのいずれの機能的外表面タンパク質をコードする配列も含まない。「機能的」というのは、遺伝子パッケージが問題のポリペプチドをその外表面上に組立てるのを促進するか又は誘導する能力を、コードされた外表面タンパク質が保持していることを意味する。発現ベクターから除外されるべき精確な外因性配列は、ファージパッケージの選択によって左右される。
【０１１０】
本明細書で使用される「ファージ」という語は、ウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムが中に被包されているタンパク質外皮を含んで成るウイルスを包含する。ウイルスゲノムは、１本鎖又は２本鎖、線状又は環状のＤＮＡ又はＲＮＡで構成されうる。ファージは、制限的な意味なく細菌細胞といったような原核生物を含む、広範囲の宿主細胞を感染させることができる。繊維状又は非線維状の数多くのファージのゲノムが配列決定されている。代表的な繊維状ファージとしては、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｉｆｌ、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３が含まれる。繊維状ファージのクラスの中では、Ｍ１３が最も良く特徴づけされた種である。その３次元構造は既知であり、その外皮タンパク質の機能は充分に理解されている。具体的には、Ｍ１３ゲノムは、５つの外皮タンパク質、すなわちｐＩＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸをコードする。本発明ファージ表示系のＭ１３ベースの発現ベクターを構築するためには、全ての外皮コーディング配列を欠失させるか又は改変させて、コードされたタンパク質産物がファージ粒子の外表面上での外因性ポリペプチドの提示をもたらすことができないようにしなければならない。機能的外表面タンパク質に対する適切な修飾は、次のような結果をもたらし得る：（１）シグナルペプチドが次に切断されて離れることになる細菌細胞のペリプラズムへの外表面タンパク質の細胞内移行を誘導する機能的シグナルペプチドの喪失；（２）細菌細胞膜及び／又はファージ外皮に成熟ポリペプチドを固定（anchor）する外皮タンパク質ドメインの機能の喪失；（３）ファージレセプタ、宿主細菌のＦ−線毛に特異的に結合する外皮タンパク質の機能の喪失；及び／又は（４）いかなる機能的外皮タンパク質の発現をも防ぐための内部停止コドンの導入。ｐＩＩＩといったような複数の外皮タンパク質内のこれらの及びその他のドメインは、すでに記述されてきた（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号参照）。ｆｌ及びｆｄの繊維状ファージといったようなその他の密に関連する構成員の外表面タンパク質も同様に、当該技術分野において充分知られている（例えばKay et al. (1996)、ペプチド及びタンパク質のファージ表示：実験室マニュアル、Academic Press., Inc. San Diego）。好ましくは、Ｍ１３ベースの発現ベクター内で提示される唯一のファージ配列は、ファージミド複製及びパッケージのために必要とされるｆｌ起点を含んでいる。Ｍ１３ベースの発現ベクターの構築についての段階的な例示は、例１〜４に詳述される。かくして、当業者であれば、過度の実験無く、請求の範囲に記載の特長をもつ発現ベクターを容易に構築することができる。
【０１１１】
他の繊維状ファージを用いて類似の構築を行うことも可能である。Ｐｆ３は、ＩｎｃＰ−１プラスミドを包含するシュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aerugenosa）細胞を感染させるもう１つの周知の繊維状ファージである。Ｐｆ３の全ゲノムが配列決定され、複製及び組立てに関与する遺伝子シグナルが特徴づけされてきた（Luiten et al. (1985) J. Virology 56(1):268-276）。Ｐｆ３の主要な外皮タンパク質は、その分泌を導くためのいかなるシグナルペプチドももたないという点で、普通ではない。配列は、露出されているアミノ末端と一貫性ある荷電残基ＡＳＰ7 、ＡＲＧ37、ＬＹＳ40及びＰＨＥ44−ＣＯＯ- を有する。Ｐｆ３ファージのための１３９ｂｐのＤＮＡのウイルスストランド複製起点も同様に同定された（Luiten et al. (199) J. Bacteriol 173(13):4007〜4012）。Ｐｆ３ベースの発現ベクターを構築するためには、いかなる機能的主要外皮タンパク質もコードされないような形でＰｆ３外皮コーディング配列を欠失又は改変させなくてはならない。好ましい発現ベクターは、その複製及びパッケージングのためのＰｆ３ファージ複製起点しか含まない。
【０１１２】
同じアプローチは、非繊維状ファージから誘導されたファージミドベクターの構築にもあてはまる。このクラスのファージの非限定的で代表的な構成員は、バクテリオファージφＸ１７４、λ、Ｔ４及びＴ７である。バクテリオファージφＸ１７４は、遺伝学、生化学及び電子顕微鏡法により徹底的に研究された非常に小さい二十面体ウイルスである。φＸ１７４の３つの遺伝子産物、すなわちＦ（カプシド）、Ｇ（主要スパイクタンパク質、１ビリオンあたり６０コピー）、及びＨ（非主要スパイクタンパク質、１ビリオンあたり１２コピー）が、成熟ビリオンの外側に存在する。タンパク質Ｇは、１７５個のアミノ酸を含む一方、Ｈは３２８個のアミノ酸を含む。タンパク質Ｆは、ウイルスの１本鎖ＤＮＡと相互作用する。タンパク質Ｆ、Ｇ及びＨは、ウイルス感染を受けた細胞内で単一のｍＲＮＡから翻訳される。かくして、このクラスの非繊維状ファージに基づく発現ベクター例には、Ｆ、Ｇ及びＨタンパク質のいずれのコーディング配列もが欠如している。他の代替的な発現ベクターは、機能的なタンパク質Ｆ、Ｇ及びＨを生じない改変されたＦ、Ｇ又はＨコーディング配列を含む。
【０１１３】
本発明のヘルパーファージベクターの一般的特徴：
本発明のファージ表示系の第２の構成要素は、いかなる機能的外表面配列もが欠如した発現ベクターを相補するべく機能するヘルパーベクターである。必要な外皮タンパク質コーディング配列の１つが欠如しているか又は遺伝子パッケージの欠損外皮タンパク質をコードする配列を含有する以前に記載されているヘルパーベクター（米国特許第５，９６９，１０８号）とは異なり、本発明のヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要とされる外表面配列の全てを提供する。利用される精確な外表面配列は、ここでもファージパッケージの選択によって左右される。
【０１１４】
上述のとおり、様々なファージについての豊富な構造的及び生化学的情報が、当該技術分野において利用可能である。数多くのタイプの遺伝子パッケージを複製しパッケージングするのに必要とされる構造的タンパク質及び酵素をコードする遺伝子配列が同定され、以前の表示系を構築するために広く用いられている（米国特許第６２４８５１６号、第５９６９１０８号、第５８８５７９３号、第５８３７５００号、第５５７１６９８号、第５２２３４０９号、第５５１４５４８号、ＷＯ９００５１４４、ＥＰ０３６８６８４、ＷＯ０９２０１０４７、ＷＯ０９３１１２３６及びＷＯ０９７０８３２０）。これらの配列は一般に、付加的な独特の特長を示す本発明のヘルパーベクターを構築するために一般に応用可能である。
【０１１５】
具体的には、本発明のヘルパーファージベクターは一般に、ヘルパーファージ及びファージミドベクターの両方を被包する役割を担う全ての外表面配列を含んで成る。１つの態様において、ヘルパーファージベクターは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｉｆｌ、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３のうちの１つの繊維状ファージの全ての外皮タンパク質をコードする外表面配列を含んで成る。Ｍ１３ベースのヘルパーファージベクターの好ましい外皮コーディング配列は、ｇＩＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＩＸ又はその機能的等価物である。もう１つの態様において、ヘルパーファージベクターは、バクテリオファージφＸ１７４、λ、Ｔ４及びＴ７から成るグループの中から選択された非繊維状ファージの外皮コーディング配列を含む。これらの構造的タンパク質に加えて、ヘルパーファージベクターは一般的に、ファージミドベクターの複製及びパッケージングを「助ける」ようにファージミドベクター及びヘルパーファージの両方の上に担持されたファージ複製起点に対してトランスに作用する他のファージ由来の酵素もコードする。本発明の好ましいＭ１３ヘルパーベクターは、ファージミドベクターの好ましいパッケージングを確保するべく複製欠損性である。好ましくは、パッケージングされたベクターの９０％以上がファージミドベクターである。さらに一層好ましくは、パッケージングされたベクターの９９％以上がファージミドベクターである。好ましいＭ１３ヘルパーファージベクターはさらに、タンパク質Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｘ又は機能的等価物をコードする配列を含む。本明細書で使用されているように、外表面タンパク質の機能的等価物には、野生型外表面タンパク質の機能性を保持する修飾された外表面タンパク質についてコードするものが含まれる。機能的に等価である外表面タンパク質には、対応する野生型タンパク質の特性を増強、減少させるか又はそれに対しわずかに影響を与えるものが含まれている。これらの等価物は、保存的アミノ酸置換をもつポリペプチドや、融合体及び突然変異体を含む類似体でありうる。好ましいＭ１３ヘルパーベクターは、干渉耐性を有している。干渉耐性ヘルパーベクターの例としては、Ｍ１３ＫＯ７（American Pharmacia Biotech）及びＶＣＳＭ１３（Stratagene）といったようなその誘導体である。これら２つの干渉耐性ヘルパーベクターは、ファージ粒子をパッケージングするために必要なファージ配列を提供する。
【０１１６】
本発明のヘルパーファージベクターは、ファージパッケージングに必要な外表面配列の全てが存在するかぎりにおいて、ある一定の外表面配列の１又はそれ以上のコピーを含むことができる。各々の必要な外表面配列の１コピーの使用は、一般的に、「多価」ファージ表示系を生じる。これとは対照的に、ある一定の外表面配列及びその機能的等価物の１よりも多くのコピーの取込みは、「１価」ファージ表示系を生み出す。１価表示は、中庸の親和力及び高い親和力で標的と結合する表示されるポリペプチドを互いに区別することを可能にする。１価表示はまた、低親和力の抗原の１よりも多くのコピーを発現するファージがより高い親和力の抗体の１コピーを発現するファージと同じ見かけの親和力を有することになる「結合力」(avidity）効果を回避することによって、親和力に基づき抗体などのポリペプチドの選択を助ける。しかしながら、多価表示は代替的な利点を提供する。多価表示は特に、結合ポリペプチドの選択の初期段階において特に有用である。スクリーニングの初期段階においては、単一の高親和力の候補を同定するよりも、潜在的なリードとして広範囲のスペクトルのポリペプチドを蓄積することが好ましいことが多い。初期スクリーニングを通して得られたポリペプチドは、次に、一価表示又は他の方法を用いてその親和力に関して順序づけされうる。本発明は、多価表示系のヘルパーファージベクター例（図５Ａ）を提供する。得られるヘルパーファージを細菌細胞に感染させることによって、パッケージングされたファージミド粒子は、遊離ｐＩＩＩよりも約２倍多い外因性ポリペプチド／ｐＩＩＩ複合体を示し、これは、パッケージングされたファージが１コピーよりも多くの結合価を有することを表わしている（例２、図１１を参照のこと）。さらに本発明で提供されるのは、ＫＯ７遺伝子ＩＩＩ外表面配列のコピー及び遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分のコピーを担持するＭ１３ヘルパーファージである（図１９Ａ及び例４）。後者の配列は、パッケージングのために野生型ｐＩＩＩと競合する能力をもつ機能的等価物をコードする。得られるヘルパーファージは、一価の表示系を生じるものと予想されている。
【０１１７】
特に好ましいヘルパーベクターは、一価及び多価の両方の表示を支持する。かかるヘルパーベクターは、例えばＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩといった外表面配列の第１及び第２のコピーの間に抑制可能な翻訳停止コドンを取込むことによって構築可能である。抑制可能なコドンは、抑制条件下でコドン（例えば遺伝子ＩＩＩ）の下流側のヌクレオチド配列の翻訳を可能にするが、非抑制条件下では翻訳は該コドンで終わる。ヘルパーファージを抑制条件下、例えばサプレッサー細菌菌株内で増殖させるときに、パッケージングのために第１のコピーと競合する外表面タンパク質の第２のコピーが発現される：すなわち一価のファージ表示が起こる。しかしながら、同じヘルパーファージを非抑制細菌菌株内で増殖させるときに、外表面配列の第２のコピーは発現されず、かくして多価表示系が生じる。かくして、抑制可能コドンは、２つの異なる条件に置かれるときにいずれかの表示形態を抑制する便利な「スイッチ」として機能する。抑制可能な翻訳停止コドンの例としては、アンバー、オーカー、及びオパールコドンがある。
【０１１８】
本発明のアダプタの一般的特徴：
ファージ表示系を構築する上でのさらなる考慮事項は、ペアワイズ相互作用の能力をもつ２つのアダプタをコードする一対のアダプタ配列を選択することである。アダプタ配列の一方はファージミドベクターにより担持された外因性配列とインフレームで挿入されるものであり、もう一方はヘルパーファージベクターの外表面タンパク質の少なくとも１つとインフレームで融合される。「ペアワイズ相互作用」というのは、２つのアダプタが互いに相互作用し結合して安定な複合体を形成できるということを意味する。安定な複合体は、遺伝子パッケージの外表面上でのポリペプチドのパッケージングを可能にするべく充分長く存続しなくてはならない。この複合体又は二量体は、形成時点と表示されたポリペプチドの検出時点との間に存在するか又は導入される条件がいかなるものであっても、それに耐えることができなくてはならず、これらの条件は実行される反応又は検定の関数である。ペリプラズムで組立てられるファージ（例えばＭ１３）については、複合体又は二量体は、それがファージゲノムと共にパッケージングされる細菌ペリプラズム内に常駐する場合充分に安定でなければならない。安定な複合体又は二量体は、それがこの定義のその他の必要条件を満たすかぎり、不可逆的であっても可逆的であってもよい。かくして、過渡的な複合体又は二量体が反応混合物内で形成しうるが、それが自発的に解離して遺伝子パッケージの外表面上に表示される検出可能なポリペプチドを全く生成しない場合には安定な複合体を構成しない。
【０１１９】
第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用は、共有結合性相互作用であっても非共有結合性相互作用であってもよい。非共有結合性相互作用は、共有結合の形成を結果として生じない全ての既存の安定な結合を包含する。非共有結合性相互作用の非限定的な例としては、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチドの立体嵌合がある。これとは対照的に、共有結合性相互作用は、限定されないが、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合、２つの炭素含有分子間のＣ−Ｃ結合、炭素と酸素又は水素とを含有する分子間のＣ−Ｏ又はＣ−Ｈ、及び酸素とリン酸を含有する分子間のＯ−Ｐ結合を包含する、共有結合の形成を結果として生じる。
【０１２０】
本発明の表示系の発現ベクター及びヘルパーベクターを構築するために適用可能なアダプタ配列は、様々な供給源に由来することができる。一般的に、安定な多量体の形成に関与するあらゆるタンパク質配列が、アダプタ配列の候補である。かくして、これらの配列は、任意のホモ多量体又はヘテロ多量体のタンパク質複合体に由来し得る。代表的なホモ多量体タンパク質は、ホモ二量体レセプタ（例えば血小板由来の増殖因子ホモ二量体ＢＢ（ＰＤＧＦ））、ホモ二量体転写因子（例えばＭａｘホモ二量体、ＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）ホモ二量体）及び増殖因子（例えばニューロトロフィンホモ二量体）である。ヘテロ多量体タンパク質の非限定的な例は、プロテインキナーゼとＳＨ２ドメイン含有タンパク質の複合体（Cantley et al. (1993) Cell 72:767-778; Cantley et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(44): 26029-26032）、ヘテロ二量体転写因子、及びヘテロ二量体レセプタである。
【０１２１】
好ましいヘテロ二量体転写因子は、ａ−Ｐａｌ／Ｍａｘ複合体及びＨｏｘ／Ｐｂｘ複合体である。Ｈｏｘは、胚形成中の前−後軸のパターン化に関与する転写因子の大ファミリーを表わす。Ｈｏｘタンパク質は、保存された３つのαらせんホメオドメインをもつＤＮＡと結合する。特異的ＤＮＡ配列に結合するために、Ｈｏｘタンパク質は、Ｐｂｘホメオドメインといったようなヘテロ因子の存在を必要とする。Wolberger et al.は、Ｈｏｘ−Ｐｂｘ複合体の形成がどのようにして発生し、この複合体がＤＮＡにどのように結合するかを理解するため、ＨｏｘＢ１−Ｐｂｘ１−ＤＮＡ三元複合体の２．３５Åの結晶構造を解いた。この構造は、各タンパク質のホメオドメインがＤＮＡの相対する側で隣接する認識配列に結合することを示している。ヘテロ二量体化は、ＨｏｘＢ１のホメオドメインに対する６アミノ酸ヘキサペプチドＮ末端と、らせん３とらせん１及び２の間に形成されたＰｂｘ１内のポケットとの間で形成される接触を通して起こる。Ｐｂｘ１ホメオドメインのＣ末端伸長部は、さらに大きな４らせんホメオドメインを形成すべく、らせん１に対してパッキングするαらせんを形成する（Wolberger et al. (1999) Cell 96:587-597; Wolberger et al. J Mol Biol. 291:521-530）。
【０１２２】
多大な数のヘテロ二量体レセプタも同定されている。これらには、増殖因子（例えばヘレグリン）、神経伝達物質（例えばγ−アミノ酪酸）及び他の有機又は無機の小分子（例えば鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）に結合するものが含まれるが、それらに制限されるわけではない。好ましいヘテロ二量体レセプタは、限定されることなくオピオイド（Gomes et al. (2000) J. Neuroscience 20(22): RC110）; Jordan et al. (1999) Nature 399:697-700）、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン及びＧＡＢＡB レセプタファミリーを包含する、核ホルモンレセプタ（Belshaw et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93(10): 4604-4607）、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２レセプタ複合体、及びＧ−タンパク質結合レセプタである。既知のヘテロ二量体レセプタの大部分について、それらのＣ末端配列がヘテロ二量体形成を媒介することが見出されている。
【０１２３】
本発明の表示系の構築のためのアダプタとして、Ｌ及びＨ鎖の二量体化に関与する抗体鎖の配列を使用することもできる。これらの配列には、Ｌ鎖又はＨ鎖の定常領域配列が含まれるが、それらに制限されるわけではない。さらには、アダプタ配列は、抗原結合部位配列及びその結合抗原に由来することができる。このような場合に、対の一方のアダプタは、対応する抗原残基を含むもう一方のアダプタにより認識される（すなわちもう一方のアダプタと安定な形で会合できる）抗原結合部位アミノ酸残基を含有する。
【０１２４】
膨大な遺伝子ファミリーについての豊富な遺伝子及び生化学データに基づいて、当業者は、過度の実験無く、本発明の表示系を構築するために適切なアダプタ配列を選択し取得することができるだろう。
【０１２５】
望ましい場合、新規のヘテロ多量体タンパク質からの配列をアダプタとして利用することができる。かかる状況においては、ヘテロ多量体の形成に関与する配列候補の同定は、過度の実験無くあらゆる遺伝子又は生化学検定により見極めることができる。さらに、コンピュータモデリング及び探索技術により、関連する及び関連しない遺伝子内に現われた共通のドメインの配列相同性に基づいてヘテロ多量体配列の検出が容易になる。相同性探索を可能にするプログラムの非限定的な例は、Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), Fasta (Genetics Computing Group package, Madison, Wisconsin), DNA Star, Clustlaw, TOFFEE, COBLATH, Genthreader、及びMegAlignである。標的レセプタ又はそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含むあらゆる配列データベースを、配列分析のために使用することができる。一般に利用されているデータベースにはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、及びＨＴＧＳが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２６】
ヘテロ二量体化配列に由来する本発明のアダプタは、その物理的特性に基づいてさらに特徴づけすることができる。好ましいヘテロ二量体化配列は、ペアワイズ親和力を示し、ホモ二量体の実質的排除に至るまでのヘテロ二量体の優勢な形成を結果としてもたらす。好ましくは、この優勢な形成により、生理緩衝液条件及び／又は生理体温下で形成できる少なくとも６０％のヘテロ二量体、より好ましくは少なくとも８０％のヘテロ二量体、より好ましくは８５〜９０％のヘテロ二量体、さらに好ましくは９０〜９５％のヘテロ二量体、さらに一層好ましくは９６〜９９％のヘテロ二量体を含有するヘテロ多量体プールが生じる。本発明の或る種の実施形態においては、アダプタ対のヘテロ二量体化配列の少なくとも１つは、生理緩衝液及び／又は生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたない。「能力を基本的にもたない」というのは、選択されたヘテロ二量体化配列を単独でテストした場合に、Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）に詳述されている通りのin vitro沈降実験又はin vivo ２ハイブリッド酵母分析（例えばWhite et al. Nature (1998) 396:679-682参照）において、検出可能な量のホモ二量体が生成されないことを意味する。さらに、個々のヘテロ二量体化配列を宿主細胞内で発現させることができ、宿主細胞内のホモ二量体の不在は、限定されることなくＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及び免疫沈降法を包含する様々なタンパク質分析によって実証可能である。In vitro検定は、生理緩衝液条件及び／又は好ましくは生理体温下で行なわれなくてはならない。一般に、生理緩衝液は、生理濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲内の中性ｐＨに調整されている。様々な生理緩衝液がSambrook et al. (1989)（前出）の中で列挙されており、従って本明細書では詳述しない。好ましい生理的条件は、Kammerer et al.（前出）の中で記載されている。
【０１２７】
前述の物理的特性を示すアダプタ対の例は、ＧＡＢＡB−Ｒ１／ＧＡＢＡB−Ｒ２レセプタである。これら２つのレセプタは、生理的条件下（例えば in vivo）及び生理体温下でホモ二量体を形成する能力を基本的にもたない。Kuner et al. 及び white et al. (Science (1999) 283:74-77); Nature (1998) 396:679-682))の研究により、 in vivoでのＧＡＢＡB −Ｒ１及びＧＡＢＡB −Ｒ２のヘテロ二量体化の特異性が実証されている。実際、White et al.は、このヘテロ二量体レセプタ対の排他的な特異性に基づいて酵母細胞からＧＡＢＡB −Ｒ２をクローニングすることができた。Kammerer et al. （前出）によるIn vitro研究は、ＧＡＢＡB −Ｒ１又はＧＡＢＡB −Ｒ２のＣ末端配列のいずれも、生理体温下で検定した場合に生理緩衝液条件下でホモ二量体を形成する能力をもたないことを示している。具体的には、Kammerer et al. の沈降実験による実証によれば、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のヘテロ二量体化配列は、単独でテストされた場合には、生理的条件下で及び生理体温（例えば３７℃）下で単量体の分子質量で沈降する。等モル量で混合された場合には、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２のヘテロ二量体化配列は、２つの配列のヘテロ二量体に対応する分子質量で沈降する(Kammerer et al.の表１参照）。しかしながら、ＧＡＢＡB −Ｒ１及びＧＡＢＡB −Ｒ２のＣ末端配列がシステイン残基に連結された場合、ジスルフィド結合の形成によりホモ二量体が生成し得る。
【０１２８】
アダプタはさらに、その二次構造に基づいて特徴づけ可能である。好ましいアダプタは、高次コイルらせん構造を採用する両親媒性ペプチドを含んで成る。この高次コイルらせんは、タンパク質中の主要サブユニットのオリゴマー化配列の１つである。一次配列分析により、全てのタンパク質残基の約２〜３％が高次コイルを形成することが明らかになっている（Wolf et al. (1997) Protein Sci. 6:1179-1189）。充分に特徴づけされた高次コイル含有タンパク質としては、細胞骨格タンパク質ファミリー（例えばα−ケラチン、ビメンチン）、細胞骨格モータータンパク質ファミリー（例えばミオシン、キネシン、及びダイニン）、ウイルス膜タンパク質（例えばエボラウイルス又はＨＩＶの膜タンパク質）、ＤＮＡ結合タンパク質及び細胞表面レセプタ（例えばＧＡＢＡB レセプタ１及び２）の構成員が含まれる。本発明の高次コイルアダプタは、２つの群すなわち左巻き及び右巻き高次コイルに大きく分類できる。左巻き高次コイルは、「ａｂｃｄｅｆｇ」と表記されるヘプタッド反復により特徴づけられ、第１（ａ）位及び第４（ｄ）位に優先的に位置される無極性残基の存在を伴う。これら２つの位置にある残基は一般的に、もう１つの鎖のものとインタロックする「ノブと穴」のジグザグパターンを構成して、ぴったりとフィットする疎水性コアを形成する。これとは対照的に、高次コイルの周辺を覆う第２（ｂ）位、第３（ｃ）位及び第６（ｆ）の位置は、好ましくは荷電残基である。荷電アミノ酸の例としては、限定されることなく、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性残基、及びアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミンといった酸性残基が含まれる。ヘテロ二量体高次コイルを設計するのに適している無荷電又は無極性アミノ酸としては、限定されることなく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びトレオニンが含まれる。無電荷残基は一般的に疎水性コアを形成するものの、コア位置においてでさえ電荷残基を含むらせん間及びらせん内の塩架橋を用いて、全体的らせん高次コイル構造を安定化させることがある（Burkhard et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 11672-11677）。様々な長さの高次コイルを用いてよいが、本発明の高次コイルアダプタは、好ましくは２〜１０個のヘプタッド反復を含有する。より好ましくは、アダプタは３〜８個のヘプタッド反復、さらに一層好ましくは４〜５個のヘプタッド反復を含有する。
【０１２９】
最適な高次コイルアダプタを設計する上では、ペプチドの二次構造を予測する様々な既存のコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。１つの例示的コンピュータ分析では、アミノ酸配列を既知の２本鎖高次コイルのデータベース内の配列と比較し高確率の高次コイル鎖を予測するＣＯＩＬＳアルゴリズムが用いられる（Kammerer et al. (1999) Biochemistry 38:13263-13269）。
【０１３０】
多量体形成に関与する様々な高次コイルを、本発明の表示系内でアダプタとして利用することができる。好ましい高次コイルは、ヘテロ二量体レセプタに由来する。従って、本発明は、ＧＡＢＡB レセプタ１及び２に由来する高次コイルアダプタを包含する。１つの態様において、本発明の高次コイルは、ＧＡＢＡB レセプタ１とＧＡＢＡB レセプタ２のＣ末端配列を含む。もう１つの態様において、本発明のアダプタは、少なくとも３０個のアミノ酸残基の異なる２つのポリペプチドで構成されており、そのうちの一方は、図２３（ＧＲ１）で描かれている比較可能な長さの線状配列と基本的に同一であり、もう一方は、図２３（ＧＲ１）で描かれている匹敵する長さの線状ペプチド配列と基本的に同一である。
【０１３１】
好ましい高次コイルアダプタのもう１つのクラスは、ロイシンジッパーである。ロイシンジッパーは、６個のアミノ酸によって互いから分離された４〜５個のロイシン残基を含有する約３５個のアミノ酸の鎖として、当該技術分野では定義づけされている（Maniatis 及び Abel, (1989) Nature 341:24）、ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物といったような様々な真核生物ＤＮＡ結合タンパク質の中で存在することが発見されている。これらのタンパク質において、ロイシンジッパーは、それを含有するタンパク質が安定なホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成しうる二量体化境界部をつくる。２つの癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎによってコードされるタンパク質産物の分子分析により、このような優先的ヘテロ二量体形成のケースが明らかにされている（Gentz et al., (1989) Science 243:1695; Nakabeppu et al., (1988) Cell 55:907; Cohen et al., (1989) Genes Dev. 3:173）。Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域を含む合成ペプチドはヘテロ二量体形成を媒介することも示されてきており、この合成ペプチドのアミノ末端が各々分子間ジスルフィド結合を可能にするためのシステイン残基を含む場合に、ホモ二量体化を実質的に排除するまでヘテロ二量体形成が起こる。
【０１３２】
本発明のロイシンジッパーアダプタは、ヘプタッド反復（ロイシン−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6）nとして知られている一般構造式を有し、ここで、Ｘは従来の２０個のアミノ酸のうちのいずれかであり得るが、例えばアラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びリジンといったαらせん形成能をもつアミノ酸である確率が最も高く、ｎは２以上であるが、一般的には３〜１０、好ましくは４〜８、より好ましくは４〜５である。好ましい配列はＦｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパーである。
【０１３３】
本明細書で使用されているペプチドの線状配列は、両方の配列が実質的なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を示す場合に、他方の線状配列と「基本的に同一である」。一般に、基本的に同一である配列は、相同性領域のアライメント後、互いに少なくとも約６０％同一である。好ましくは、該配列は少なくとも約７０％同一であり、より好ましくは少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％同一であり、さらに一層好ましくは１００％同一である。
【０１３４】
ポリペプチド配列が基本的に同一であるか否かを決定するにあたっては、比較されるポリペプチドの機能性を保存している配列が特に好ましい。機能性は、対合するアダプタと安定な複合体を形能する能力や、アダプタとインフレームで融合されたポリペプチドの表示を促進する能力といったような異なる基準によって実証することができる。
【０１３５】
本発明のアダプタは、本明細書で例示されているポリペプチド配列と機能的に等価である修飾されたロイシンジッパー及びＧＡＢＡB ヘテロ二量体化配列を包含する。対合するアダプタに対する改善された安定性及び／又は表示効率を提供する修飾されたポリペプチドが好ましい。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、及びヘテロ二量体化特異性を著しく悪く改変することのないアミノ酸の１以上の欠失又は付加を伴うポリペプチドが含まれる。置換は、ペアワイズ相互作用が維持されるかぎりにおいて、１以上のアミノ酸残基の変更又は修飾から、１つの領域の完全な再設計にまで至る可能性がある。アミノ酸置換が存在する場合、それは、好ましくはペプチドのフォールディング又は機能的特性に悪影響を及ぼすことのない保存的置換である。その範囲内で保存的置換を行うことのできる機能関連アミノ酸の群は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。本発明のポリペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化形態をとることができ、翻訳後修飾（例えばアセチル化及びリン酸化）により、又は合成（例えば標識基の結合）により修飾され得る。
【０１３６】
本発明のアダプタ配列は、従来の組換えクローニング方法を用いて及び／又は化学合成により得ることができる。充分確立された制限及び連結技術を用いて、適切なアダプタ配列を様々なＤＮＡ供給源から切除し、外因性遺伝子配列及び外表面配列とインフレームで組込んでそれぞれ発現及びヘルパーベクターを生成することができる。
【０１３７】
好ましくは、第１のアダプタ配列は、結果としてもたらされる外因性融合ポリペプチド上に構造的干渉がある場合にそれを最小限におさえるような形で、発現ベクター内に挿入される。第１のアダプタは外因性遺伝子配列の５’側又は３’側に融合され得るが、図９Ａでは、アダプタ配列（すなわちＧＡＢＡB レセプタ１に由来するヘテロ二量体化配列）が外因性遺伝子配列の３’末端にインフレームで融合されている好ましいファージミドベクターが描かれている。
【０１３８】
同様にして、第２のアダプタ配列は、発現されたファージ外皮の無欠性が損われないような位置でヘルパーベクター中に挿入される。アダプタ配列は、コーディング領域を分断することなく、外表面配列の５’又は３’末端に融合可能である。図５及び図１９は、アダプタ配列（すなわちＧＡＢＡB レセプタ２に由来するヘテロ二量体化配列）が外表面配列、遺伝子ＩＩＩ又はその機能的部分の５’末端にインフレームで配置されている２つの好ましいヘルパーファージベクターを描いている。
【０１３９】
本発明の細菌表示系：
本発明は同様に、以下の２つの構成要素を含む細菌表示系をも提供する：すなわち、（１）細菌細胞又は細菌胞子の外表面上に表示されるべき外因性ポリペプチドをコードする問題の外因性遺伝子を担持する細菌発現ベクター、及び（２）特に問題のポリペプチドの表示を促進するヘルパーベクターである。外因性ポリペプチドが細菌外表面タンパク質との融合体として発現されるような以前に記載されている細菌系とは異なり、本発明の細菌系は以下の特有の特長を有する。まず第１に、細菌発現ベクターは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示されるべき外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含む。第２に、細菌発現ベクターは、細菌又は細菌胞子の機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列が欠如している。第３に、ヘルパーベクターは、遺伝子パッケージをパッケージングするのに必要な全ての外表面配列を含み、その外表面配列の少なくとも１つが第２のアダプタ配列にインフレームで融合され、ここで外因性ポリペプチドの表示は第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用によって媒介される。
【０１４０】
本発明のファージ表示系を構築するための以上で概略説明した一般的原則及び実験的設計は、本発明の細菌表示系を生成するためにも同様に適用可能である。細菌発現ベクターは、いずれの機能的外表面タンパク質をコードする配列もが欠如している一方、ヘルパー細菌ベクターはその欠損を補うのに必要な外表面配列を含んでいる。
【０１４１】
ヘルパー細菌ベクターは一般的には、以下の２つのドメインをもつ外表面タンパク質をコードする外表面配列を含んで成る：すなわち（１）分泌されるべきタンパク質を脂質二層を通してペリプラズムまで誘導するシグナルペプチド；及び（２）外表面タンパク質を細菌細胞の外表面上に配置する能力をもつ膜移行ドメイン。発現された外表面タンパク質は最初にペリプラズムまで輸送され、ここでリーダーペプチドが切断されて離れる。外表面タンパク質がアダプタを含む融合体として発現される場合には、このアダプタは、外因性ポリペプチドに含まれる対合アダプタに結合することによって、ペリプラズムに同じく存在する外因性ポリペプチドが細菌外表面上に移行するのを促進する。
【０１４２】
これまでの研究により、ヘルパー細菌発現ベクターを構築するために使用することのできる多数の細菌表面タンパク質コーディング配列が明らかになっている。細菌表面タンパク質の非限定的な例としては、ＬａｍＢ（Bremer et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. (1984) 81:3830-34; Gene (1987) 52:165-73）；ＯｍｐＡ（Prog Biophys Molec Biol (1987) 49:89-115）；ＯｍｐＣ（Misra et al. (1988) J. Bacteriol 170:528-33；ＯｍｐＦ（Pages et al. Biochemimie (1990) 72:169-76）；ＰｈｏＥ（van der Ley et al. J. Biol. Chem. 261:12222-5）；ピリン（So et al. Curr Top in Microbiol & Immunol (1985) 118:13-28）；ｐｌｄＡ（de Geus et al. EMBO J. (1984) 3(8):1799-1802）；ＢｔｕＢ、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＩｕｔＡ、ＦｅｃＡ、及びＦｈｕＥ（Gudmundsdottir et al., (1989) J. Bacteriol 171(12):6526-33）；ＧＩＰ−アンカー型タンパク質ＩＮＰ（Kim et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29(5):292-297）及びβ−自己輸送体タンパク質ＡＩＤＡ（Veiga et al. (1999) Mol Microbiol 33:1232-1243）、及びＴｒａｔＴ、Ｐａｌ、Ｏｐｒｌ、ＯｓｍＢ、ＮｌｐＢ及びＢｌａＺ、といったようなその他の外膜リポタンパク質がある。細菌胞子の表面上に常駐する数多くの外皮タンパク質も同定されている。その後対応するその遺伝子配列が単離されている。例えば、Donovan et al.は、Bacillus subtilis胞子外皮ＣｏｔＤ及びＣｏｔＣ遺伝子の同定について報告した（Donovan et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:1-10）。これらの及びその他の表面タンパク質の特徴づけは、Pierre Cornelis et al. (2000) Curr. Opin. Biotech. 11(5):450-454; Lang et al. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290:579-585; Daugherty et al. (1999) Protein Engineering 12(7): 613-621; 米国特許第５，８３７，５００及び第５，３４８，８６７号ならびにその中で引用されている参考文献の中で詳述されている。
【０１４３】
シグナルペプチド及びこれらの及び他の細菌外表面タンパク質の膜移行ドメインは、当該技術分野において周知である。シグナルペプチドは、一般にタンパク質の最初の５〜３０個のＮ末端アミノ酸から成る。膜移行ドメインは一般的に、コンピュータ支援型の従来の配列分析により容易に同定可能である１以上の膜貫通セグメントを含んで成る。当業者であれば、従来の合成及び組換え技術を用いて、適切なポリペプチド及びヌクレオチド配列を容易に得ることができる。望ましい場合、１つの外表面タンパク質のシグナルペプチドを、もう１つの外表面タンパク質の膜移行ドメインに対しインフレームで結合させることができ、或いはその逆もあり得る。かかるキメラは細菌外表面上で発現させることができる、ということが示されている（米国特許第５，８３７，５００号）。かくして、上述の細菌外表面タンパク質のうちのいずれか１つのシグナルペプチドリーダーペプチドを、いずれかの未改変細菌外表面タンパク質の適当な長さの膜移行ドメインに対し、インフレームで連結させることが可能である。同様にして、上述の外表面タンパク質のいずれか１つの移行ドメインを、融合体を細菌ペリプラズムに誘導する能力をもつものとして知られている細菌又は他の起源のいずれかのタンパク質のシグナルペプチドに対し、インフレームで融合させることができる。
【０１４４】
本発明の細菌発現ベクターは、いずれの機能的細菌外表面タンパク質をコードする配列もが欠如している。上述の配列のいずれもが、本発明の発現ベクターを構築する間に排除されるべき配列の候補である。本明細書で使用されている「機能的」という語は、遺伝子パッケージがその外表面上に問題のポリペプチドを組立てるように、コードされた外表面タンパク質が促進するか又は誘導する能力を保持しているということを意味している。「機能」の喪失は、（１）シグナルペプチドが次に切断されて離れることになる細菌細胞の〔ペリプラズム〕への外表面タンパク質の細胞内移行を誘導する機能的シグナルペプチドの喪失；（２）細菌細胞膜上に成熟ポリペプチドを移行させる膜移行ドメインの機能の喪失；及び／又は（３）いかなる機能的外表面タンパク質の発現をも防ぐための内部停止コドンの導入、を結果としてもたらす修飾に起因しうる。
【０１４５】
発現ベクター及びヘルパーベクターに連結される該２つのアダプタ配列は、本発明のファージ表示系で利用されるものと同じ構造的及び機能的特徴を有する。ファージ表示系を構築するために適用可能ないずれのアダプタ配列も、細菌表示系を生成するために同様に適している。従って、対合アダプタを選択し調製するための基準及び手順については、この節で繰り返さない。
【０１４６】
適切な細菌遺伝子パッケージとしては、培養で増殖させることができ、そしてその外表面上で外因性ポリペプチドを表示するように改変することができ、そして親和力選択（affinity selection）に適合した全ての細菌菌株が含まれる。好ましい遺伝子パッケージはグラム陰性菌である。好ましい種の非限定的な例としては、サルモネラ・タイフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バシラス・サブティラス(Bacillus subtilis）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ビブリオ・コレレ(Vibrio cholerae）、クレブシェラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニングチデス（Neisseria meningitides）、バクテロイデス・ノドスス(Bacteroides nodosus）、モラクセラ・ボビス（Moraxella bovis）、そして特にエシャリキア・コリ（Escherichia coli）が含まれる。
【０１４７】
細菌胞子は、遺伝子パッケージとして望ましい特性を有する。胞子は、化学的及び物理的作用物質に対し、植物細菌細胞よりもはるかに大きな耐性を有する。例えば、バシラス属の細菌は、熱、放射線、乾燥及び毒性化学物質による損傷に対する耐性がきわめて高い内生胞子を形成する（Losick et al. Ann. Rev. Genet. (1986) 20:625-669により再考されている）。さらに、バシラス（Bacillus）属の胞子は、その表面上のタンパク質を活発に代謝又は改変することがない。この現象は、外皮タンパク質の広範な分子間架橋のせいである。遺伝子パッケージとして有用なその他の胞子は、ストレプトマイセス（Streptomyces）の胞子といったような外生胞子である。
【０１４８】
本発明のファージ及び細菌表示系を構築するためのその他の考慮事項：
本発明のベクターは一般に、外因性ポリペプチドを発現するために必要とされる転写又は翻訳制御配列を含む。適切な転写又は翻訳制御配列としては、限定されることなく、複製起点、プロモータ、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、並びに転写及び翻訳のための終結部位が含まれる。
【０１４９】
複製起点（一般にｏｒｉ配列と呼ばれる）は、適切な宿主細胞内でのベクターの複製を可能にする。ｏｒｉの選択は、宿主細胞のタイプ及び／又は利用される遺伝子パッケージにより左右されることになる。宿主細胞が原核生物であり、遺伝子パッケージがファージ粒子である場合、発現ベクターは一般的には２つのｏｒｉ配列を含み、１つは原核細胞内のベクターの自律的複製を導くものであり、もう一方のｏｒｉは、ファージ粒子のパッケージングを支持するものである。好ましい原核性ｏｒｉは、細菌細胞内でのベクター複製を導く能力をもつ。このクラスのｏｒｉの非限定的な例としては、ｐＭＢ１、ｐＵＣならびにその他のE. Coli起源が含まれる。ファージ粒子のパッケージングを支持する好ましいｏｒｉには、ｆｌｏｒｉ、Ｐｆ３ファージ複製ｏｒｉが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１５０】
本明細書で使用される「プロモータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、プロモータから下流側（３’方向に）にあるコーディング領域の転写を開始させる能力を或る種の条件下で有するＤＮＡ領域である。これは構成性のものであっても誘導性のものであってもよい。一般に、プロモータ配列はその３’末端において転写開始部位に結合し、上流側（５’方向）に、基準より高い検出可能レベルで転写を開始するのに必要な最少限の数の塩基又は要素を含むようになっている。プロモータ配列内には、転写開始部位ならびに、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインがある。真核性プロモータは、常にではないが往々にして「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含んでいる。
【０１５１】
プロモータの選択は、ベクターが導入される宿主細胞により大きく左右されることになる。原核細胞については、当該技術分野において多様で強力なプロモータが既知である。好ましいプロモータは、ｌａｃプロモータ、Ｔｒｃプロモータ、Ｔ７プロモータ及びｐＢＡＤプロモータである。
【０１５２】
その他の真核細胞のための適切なプロモータ配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼ等が含まれる。成長条件により転写が制御されるという付加的な利点を有する他のプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、及び前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用を担当する酵素のためのプロモータ領域である。
【０１５３】
本発明のベクターを構築する際には、ｍＲＮＡ及び／又は転写終結シグナルのポリアデニル化を与えるように転写されることが望まれる配列の３’末端に、当該外因性配列と会合した終結配列も挿入される。ターミネータ配列は好ましくは、１以上の転写終結配列（例えばポリアデニル化配列）を含み、転写読み過しをさらに分断するべく、付加的なＤＮＡ配列を含むことによっても延長されうる。本発明の好ましいターミネータ配列（又は終結部位）は、それ自身の終結配列又は非相同終結配列のいずれかである転写終結配列が後に続く遺伝子を有する。かかる終結配列の例には、広く入手可能であり以下で例示される、当該技術分野において既知の様々なポリアデニル化配列に連結された停止コドンが含まれる。該ターミネータに遺伝子を含む場合には、検出可能な又は選択可能なマーカーをコードする遺伝子を使用することが有利となり、それにより、ターミネータ配列の存在及び／又は不在（ひいては転写単位の対応する不活性化及び／又は活性化）を検出及び／又は選択することのできる手段が提供される。
【０１５４】
上述の要素に加えて、ベクターは選択可能なマーカー（例えば、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖にとって必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含有することができるが、かかるマーカー遺伝子は、宿主細胞内に同時導入される他のポリヌクレオチド配列上に担持され得る。選択可能な遺伝子が中に導入された宿主細胞のみが、選択的条件下で存続及び／又は成長することになる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキサートなどといった抗生物質又はその他の毒素に対する耐性を付与する；（ｂ）栄養素要求性欠損を補足する；又は（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞により左右されることになり、異なる宿主のための適切な遺伝子が当該技術分野において知られている。
【０１５５】
好ましい実施形態において、ベクターは、少なくとも２つの関連性のない発現系の中で複製する能力をもつシャトルベクターである。かかる複製を促進するため、ベクターは一般に、各々の発現系において１つずつ有効な少なくとも２つの複製起源を含んでいる。標準的には、シャトルベクターは、真核生物発現系及び原核生物発現系において複製する能力をもつ。これにより、真核生物宿主内でのタンパク質の発現（発現細胞型）及び原核生物宿主内でのベクターの増幅（増幅細胞型）の検出が可能になる。好ましくは、１つの複製起点はＳＶ４０に由来し１つはｐＢＲ３２２に由来するが、ベクターの複製を導くことを条件として当該技術分野において既知の適切ないずれの起点も使用することができる。ベクターがシャトルベクターである場合、そのベクターは好ましくは少なくとも２つの選択マーカーを含み、うち１つは発現細胞型用であり、１つは増幅細胞型用である。当該技術分野において既知のいずれの選択マーカー又は本明細書中で記載されているものも、利用されている発現系内でそれが機能することを条件として、使用することができる。
【０１５６】
本発明において具現化されるベクターは、組換えクローニング方法を用いて及び／又は化学合成により得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結といったような多数の組換えクローニング技術が当該技術分野において周知であり、ここで詳細に記載する必要はない。当業者であれば、同様に、当該技術分野において利用可能なあらゆる合成手段により所望のベクターを得るため、本明細書に提供されている配列データ又は公共の又は独自のデータベースを使用することもできる。付加的には、周知の制限及び連結技術を用いて、適切な配列を様々なＤＮＡ供給源から切除し、本発明に従って発現されるべき外因性配列と共に作動できるような関係で組込むことができる。
【０１５７】
本発明の表示系により発現される外因性配列は、任意の長さの非相同配列でありうる。「非相同」というのは、比較される実体の残りとは遺伝的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、非相同配列は、遺伝子パッケージ（例えば細菌細胞又はファージ粒子）の中で通常発現されない遺伝子でありうる。あるいは、非相同配列は、遺伝子パッケージに対し未改変であるがその遺伝子が天然に作動可能に連結された未改変配列以外のコーディング配列に連結されている遺伝子でありうる。さらに、非相同配列は、無作為の又は予め定められたポリペプチドでありうる。
【０１５８】
本発明の系により発現される外因性配列はまた、以下の特徴のうちの１つ以上のものに基づいて特徴づけされ得る：種の起源、発生上の起源、一次構造類似性、特定の生物学的プロセスへの関与、特定の疾病又は疾病期との関連性又はそれに対する耐性、組織、下位組織又は細胞特異的発現パターン及び発現された遺伝子産物の細胞内位置。
【０１５９】
１つの態様において、外因性配列は、植物細胞、動物細胞又は酵母細胞といったような遺伝子パッケージ以外の実体の中で発現されるいずれの配列であってもよい。
【０１６０】
もう１つの態様において、外因性配列は、多細胞動物体内での外胚葉、中胚葉又は内胚葉の形成中、又は葉、塊茎、植物の芽の発生中に、胚又は成体生物の中で発現されるものといったような、特異的発生起源をもつものである。
【０１６１】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、一次構造類似性を共有する遺伝子ファミリー又は遺伝子サブファミリーに属する。構造的類似性は、上述のコンピュータソフトウェアの支援により、見分けることができる。遺伝子ファミリーの非限定的な例には、プロティナーゼ、プロティナーゼ阻害物質、細胞表面レセプタ、プロテインキナーゼ（例えばチロシン、セリン／トレオニン又はヒスチジンキナーゼ）、三量体Ｇ−タンパク質、サイトカイン、ＰＨ−、ＳＨ２−、ＳＨ３−、ＰＤＺ−ドメイン含有タンパク質をコードするもの、及びthe Institute for Genomic Research (TIGR)、Incyte Pharmaceuticals、Inc.、Human Genome Sciences Inc.、Monsanto及びCeleraにより公表された遺伝子ファミリーのいずれかが含まれる。
【０１６２】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、限定されることなく細胞周期調節、細胞分化、走化性、アポトーシス、細胞運動性、細胞骨格再配列を包含する、特定の生物学的プロセスに関与する。さらにもう１つの態様において、本発明で具現化される外因性配列は、特定の疾病又は特定の疾病期と関連する。かかる配列には、自己免疫疾患、肥満、高血圧、糖尿病、神経及び／又は筋肉の退化性疾患、心臓病、内分泌障害、それらのいずれかの組合せに関連するものが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【０１６３】
さらにもう１つの態様において、外因性配列は、制限された発現パターンを示すものを包含する。このクラスの遺伝子転写物の非限定的な例には、遍在的に発現されるのではなく、むしろ葉、種、塊茎、葉柄、根及び芽を包含する１種以上の植物組織において分化して発現されるもの；あるいは、嚢胞性線維症又は多発性嚢胞腎を患う、種々のタイプの（悪性又は非転移性）癌に侵された選択された組織の中で及び心臓、肝臓、前立腺、肺、腎臓、骨髄、血液、皮膚、膀胱、脳、筋肉、神経を包含する動物体組織の中で発現されるものが含まれる。非遍在的に発現される配列の追加の例は、或る種の細胞内位置、すなわち、細胞外マトリックス、核、細胞質、細胞骨格、血漿、及び／又は、限定されることなく被覆小窩、ゴルジ体、小胞体、エンドソーム、リソソーム及びミトコンドリアを包含する細胞内膜構造に、そのタンパク質産物が局在化されるような配列である。
【０１６４】
本発明の表示系は、遺伝子パッケージの選択可能なライブラリを含み得る。パッケージは同じ又は異なる外因性配列を発現し得る。１つの態様においては、遺伝子パッケージのライブラリは、無作為の又は予め定められたポリペプチドの集団をコードする。もう１つの態様においては、ライブラリは、特定の宿主起源、組織起源、発生段階又は特定の疾病状態の細胞に由来するｃＤＮＡの集団をコードする。
【０１６５】
特に好ましいライブラリは、抗原結合単位をコードする。抗原結合単位は単量体又は多量体でありうる。単量体抗原結合単位は一般に、１本鎖抗原結合単位（Ｓｃ Ａｂｕｓ）と呼ばれる一方、多量体抗原結合単位はここでは非１本鎖抗原結合単位（Ｎｓｃ Ａｂｕｓ）と呼ばれる。
【０１６６】
本発明の系により表示され得るＮｓｃＡｂｕｓは、「一価」又は「多価」のいずれかでありうる。表示された多価Ａｂｕｓはさらに「単一特異性」又は「多重特異性」Ａｂｕｓとして特徴づけされ得る。多量体Ａｂｕｓを表示するためには、軽鎖（Ｌ）可変領域を含むものと重鎖（Ｈ）可変領域を含むものという２組の発現ベクターセットが利用されなくてはならない。発現された抗体領域は、好ましくは抗体領域とインフレームで融合されたヘテロ二量体化配列により二量体化するが、発現された抗体領域の１つはさらに、ヘルパーベクターにより提供される他のアダプタとペアワイズ相互作用する能力をもつアダプタを含んでいなくてはならない。
【０１６７】
既存の抗体のＬ鎖又はＨ鎖の様々な領域に対応するヌクレオチド配列は、限定されることなくハイブリダイゼーション、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定を包含する従来の技術を用いて容易に取得及び配列決定できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、抗体ヌクレオチド配列の好ましい供給源として役割をする。モノクローナル抗体のアレイを産生する莫大な数のハイブリドーマ細胞を、公共の又は私設のレポジトリから得ることができる。最大の寄託機関は、充分に特徴づけされたハイブリドーマ細胞系統の様々な収集物を提供する米国標準培養収集機構（American Type Culture Collection）（http://www.atcc.org）である。代替的には、抗体ヌクレオチドは、免疫化した又は免疫化していないゲッ歯類又はヒトから、そして脾臓及び末梢血リンパ球といった器官からも得ることができる。抗体ヌクレオチドを抽出し合成するために適用可能な特定の技術は、Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:3833-3837; Larrick et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250-1255; Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86:5728-5732；及び米国特許第５，９６９，１０８号に記載されている。
【０１６８】
抗体ヌクレオチド配列はまた、例えば、相同性非ヒト配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常領域のコーディング配列を置換することによって又はその逆によって修飾することもできる。この要領で、もとの抗体の結合特異性を保持するキメラ抗体が調製される。
【０１６９】
望ましい場合に、外因性配列は、タンパク質産物の発現及び精製の検出を容易にする部分をコードする配列を含んでよい。かかる部分の例は、当該技術分野において既知であり、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びそれらの誘導体といったようなリポータタンパク質をコードするものが含まれる。精製を容易にする他の配列は、Ｍｙｃ、（インフルエンザウイルスヘマグルチニンから誘導された）ＨＡ、Ｈｉｓ−６、ＦＬＡＧ、又は免疫グロブリンのＦｃ部分、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）といったようなエピトープをコードし得る。
【０１７０】
本発明の宿主細胞：
本発明は、上述の発現ベクター及び／又はヘルパーベクターを含む宿主細胞を提供する。発現ベクターは、電気穿孔、微粒子銃；リポフェクション、感染（ベクターは感染性作用物質に結合される）、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又はその他の物質を利用したトランスフェクションを含めた数多くの適切な手段のいずれかにより、適切な原核性又は真核性宿主細胞内に導入することができる。宿主細胞の特長に応じて、当業者は、当該技術分野において充分確立されている適切な手段の１種以上を容易に実施することができる。
【０１７１】
ひとたび適切な宿主細胞内に導入されると、外因性配列の発現は、当該技術分野において既知のいずれかの核酸又はタンパク質検定を用いて決定できる。例えば、外因性配列の転写されたｍＲＮＡの存在は、外因性配列のいずれかの領域に相補的なプローブを用いて、従来のハイブリダイゼーション検定（例えばノーザンブロット分析）、増幅手順（例えばＲＴ−ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）及びアレイに基づく技術（例えば米国特許第５，４０５，７８３号、５，４１２，０８７号及び５，４４５，９３４号）により検出及び／又は定量化可能である。
【０１７２】
外因性配列の発現は、発現されたタンパク質産物を検査することによっても決定可能である。タンパク質分析のためには、様々な技術が利用可能である。これらには、放射性免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射線測定法）、「サンドイッチ」免疫検定、免疫放射線測定法、in situ 免疫検定（例えばコロイド含、酵素又は放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降検定、免疫蛍光検定及びＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【０１７３】
本発明の宿主細胞は、なかんづく、本発明の外因性配列のレポジトリとして、ベクターとして又は、その結合特異性に基づきＡｂｕｓといったような所望のポリペプチドを産生しスクリーニングするためのビヒクルとして使用可能である。
【０１７４】
本発明のアダプタ誘導型表示系の使用：
本発明のアダプタ誘導型表示系には、いくつかの特異的用途がある。まず第１に、該系は、適切な宿主細胞内での可溶性単量体及び多量体外因性ポリペプチドの産生を可能にする。第２に、該系は、選択された遺伝子パッケージ上の単量体及び多量体ポリペプチドの表示を可能にする。本発明の表示系は同様に、様々な目的のため無作為の又は予め定められたポリペプチド、全長タンパク質及びタンパク質ドメインのライブラリを作成するために使用可能である。例えば、エピトープ及びミモトープをマッピングするため、様々な標的タンパク質のアンタゴニスト及びアゴニストを同定するため、抗体を改変するため、抗体特異性を最適化するため、そして新規の結合活性を作り出すために、表示されたライブラリを利用することが可能である。
【０１７５】
従って、本発明は、遺伝子パッケージ上に表示される外因性ポリペプチドとテスト物質との間の特異的相互作用の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）外因性ポリペプチドを提示する本発明の表示系の遺伝子パッケージを提供する段階；（ｂ）安定なポリペプチド−物質複合体を産生するのに適切な条件下でテスト物質と遺伝子パッケージを接触する段階；及び（ｃ）遺伝子パッケージ上の安定なポリペプチド−作用物質複合体の形成を検出し、それにより特異的相互作用の存在を検出する段階を含む。
【０１７６】
本発明の目的のために「テスト物質」とは、限定されることなく、単純な又は複雑な有機又は無機分子、タンパク質、炭水化物、脂質、ポリヌクレオチド又はそれらの組合せといったような生物学的又は化学的化合物を含むように意図されている。例えばオリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドといったようなオリゴマー、及び様々なコア構造に基づく合成有機化合物など、ありとあらゆる化合物を合成することができ、これらも同じく「物質」の語に含まれる。さらに、様々な天然供給源が、植物又は動物抽出物といったようにスクリーニング用の化合物を提供することができる。つねに明示的に述べられているわけではないものの、該物質は、本発明のスクリーニングにより同定される物質と同じ又は異なる生物活性をもつ他の物質と組合せた形で又は単独で使用されるということを理解すべきである。好ましい物質は、細胞のシグナル伝達経路を調節する能力をもつものといったような診断薬及び／又は治療薬の候補である。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明は、所望の特性をもつポリペプチドを取得する方法を提供する。該方法は、（ａ）本発明の表示系の選択可能なライブラリを提供する段階、及び（ｂ）選択可能なライブラリをスクリーニングすることにより、所望の特性をもつポリペプチドを表示する少なくとも１つの遺伝子パッケージを取得する段階、を含んで成る。該方法はさらに、所望の特性をもつポリペプチドを表示する遺伝子パッケージを単離する段階を含むことができる。このような遺伝子パッケージの単離には、所望のポリペプチドをコードする遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を取得することを伴い得る。所望の特性には、問題の物質に対し特異的に結合するポリペプチドの能力が包含される。所望の特性をもつ選択されたポリペプチドは、以下の分子、すなわち、抗原結合単位、細胞表面レセプタ、レセプタリガンド、細胞質ゾルタンパク質、分泌タンパク質、核タンパク質及びそれらの機能的モチーフといった分子の１つ以上のクラスに該当し得る。テストされるべき特異的物質及び表示されるべき外因性ポリペプチドのライブラリの選択は、スクリーニング検定の意図された目的により左右されることになる。
【０１７８】
所望の結合特異性又は親和性を示す抗体の単離：
ファージ及び細菌表示の最も強力な利用分野の１つは、抗体工学の分野におけるものである。ｓｃＦｖ抗原結合単位は、結合特異性及び親和力を見かけ上全く失なうことなく、ファージ粒子及び細菌細胞の両方の表面上で発現され得る、ということが示されている（MaCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Daugherty et al. (1999) Protein Engineering 12(7):613-621）。また、Ｆａｂフラグメントといったような機能的ＮｓｃＡｂｕｓがファージ表面上で発現され得る、ということも実証されている。今日、多種多様な抗原に対する抗体が、ファージ表示技術を用いて良好に単離されている。
【０１７９】
本発明のファージ表示系は、Ａｂｕｓの多種多様なレパートリの提示を可能にすることから、この利用分野に特に適している。数多くの点で、本発明のファージ表示系は、天然の免疫系を模倣している。Ａｂｕの抗原により駆動される刺激は、Ａｂｕｓのファージ表示ライブラリから高親和性結合剤についての選択を行うことによって達成できる。分化しつつあるＢ細胞におけるＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の組換え時に発生する多数の鎖置換は、ＤＮＡとしてのクローニングされたＨ鎖及びＬ鎖及びタンパク質をシャフリングすることによって及び部位特異的組換えを使用することによって、模倣することができる(Geoffory et al. (1994) Gene 151:109-113）。ファージ表示されたＡｂｕｓのＣＤＲ領域への突然変異導入によって体細胞突然変異を適合させることもができる。
【０１８０】
所望の結合特異性又は親和力をもつＡｂｕは、「パニング」(panning）として知られる親和力選択の一形態を用いて同定可能である（Parmley and Smith (1988) Gene 73:305-318）。Ａｂｕｓライブラリは、まず第１に問題の抗原でインキュベートされ、次に結合したファージを伴う抗原が捕捉される。このようにして回収されたファージは次に増幅され、抗原に対する結合について再び選択され、かくして問題の抗原を結合するファージについて富化することができる。通常、一週間で３〜４回の選択を達成でき、１〜１００の結合ファージの単離を導く。かくして、所望のＡｂｕを発現する希少なファージを、１回の実験において１０8 個以上の異なる個体から容易に選択できる。結合するＡｂｕの一次構造は、このとき、個々のファージクローンのヌクレオチド配列により推論される。表示されたＡｂｕにヒトＶH 及びびＶL 領域が利用される場合、本発明の表示系は、非ヒトＡｂｕを更に操作すること無く、ヒト抗体の選択を可能にする。
【０１８１】
改善された結合特異性又は親和力をもったＡｂｕを含む新規タンパク質の生成：
本発明の表示系を用いて、標的タンパク質に対する高い親和力及び特異性をもつ、Ａｂｕといったような、ポリペプチドを表示する複製可能な遺伝子パッケージを得ることできる。かかるパッケージは、結合産物をコードするポリヌクレオチド及び結合ポリペプチドのアミノ酸の両方を担持している。ポリヌクレオチドの存在は、結合タンパク質の組換え型発現及びその後の操作を容易にする。例えば、親ポリヌクレオチドに類似する改変された配列の洗練されたレパートリを生成するようにするシャッフリング、カセット突然変異誘発又は変異性ＰＣＲにより、結合タンパク質についてコードするポリヌクレオチドの突然変異誘発を行うことができる。新規結合タンパク質の洗練されたレパートリをスクリーニングすることにより、改善された結合特異性又は親和性を示す新規結合タンパク質を同定することができる。
【０１８２】
抗原エピトープのマッピング：
従来、抗原のエピトープマッピングは、物理化学的分析に依存するところが大きかった。これらのアプローチには、（１）精製された抗原を様々なプロテアーゼでフラグメント化し、反応性フラグメントを同定し、それらを配列決定すること；（２）抗原結合単位との残基相互作用が修飾から保護されている化学的修飾実験；（３）抗原の一次構造に対応する一連のペプチドの合成；及び（４）ＮＭＲ又はＸ線結晶構造解析を用いた直接的な物理的特徴づけ、が含まれる。これらの方法は全て労働集約的であり、一般にハイスループット分析に適していない。ファージ表示又は細菌表示は、抗原エピトープを局在化させるための高効率で強力な代替案を提供する。抗原の一部分をコードするＤＮＡのフラグメントは、本発明の発現ベクターにより外因性ポリペプチドとして発現することができる。このとき、どの表示されたフラグメントが抗体と反応するかを決定するために、遺伝子パッケージ（例えばファージ、細菌細胞又は胞子）を抗体とテストすることができる。表示技術のこの適用は、当該技術分野において広く用いられ、様々な分子の抗原エピトープを決定するために功を奏するものであることが示されてきた。
【０１８３】
モノクローナル及びポリクローナルＡｂｕｓの結合エピトープのマッピング：
本発明の表示系は同様に、抗原結合部位の特異性をマッピングするために無作為ペプチドライブラリを提示するためにも使用することができる。無作為ペプチドライブラリは、そこからエピトープ及びミモトープを機能的に確定させることができる配列の供給源である。このようなライブラリを用いて、抗原−抗体相互作用のための競争的ペプチドを同定および取得し、かくして数多くのＡｂｕｓのアクセス可能及び／又は機能的な部位をマッピングすることができる。
【０１８４】
レセプタのリガンドおよび他のシグナル伝達経路のモジュレータの同定：
本発明の表示系は同様に、レセプタに対するリガンドを同定するために利用することができる。このプロセスは一般に、テストリガンドを発現する遺伝子パッケージの集団をレセプタに適用し、次に該レセプタに結合されたパッケージを同定することで進められる。代替的には、レセプタが遺伝子パッケージに提示されてもよい。テストリガンドに結合したものが次に単離される。ペプチドリガンドの同定のためには、無作為ペプチドライブラリが、検定を行うための好ましい出発材料である。同アプローチは、細胞シグナル伝達経路の他のモジュレータを同定するために適用することができる。
【０１８５】
細胞の活性は、細胞内事象を刺激するか又は阻害する外部シグナルによって調節される。細胞内応答を惹起するため細胞に及び細胞内で刺激又は阻害シグナルを伝達するプロセスは、シグナル伝達と呼ばれる。適切な細胞機能のためには、適切なシグナル伝達が不可欠である。過去数十年にわたり、数多くの細胞シグナル伝達分子が同定され、クローニングされ特徴づけされてきた。シグナル伝達タンパク質の非限定的な例としては、細胞表面レセプタ、プロテインキナーゼ（例えばチロシン、セリン／トレオニン又はヒスチジンキナーゼ）、三量体Ｇ−タンパク質、サイトカイン、ＳＨ２−、ＳＨ３−、ＰＨ−、ＰＤＺ−、デス−ドメイン含有タンパク質、Human Genome Sciences Inc.，Celera，the Institute for Genomic Research (TIGR) 及びIncyte Pharmaceuticals, Inc.により公表された遺伝子又はタンパク質ファミリーのいずれもが含まれる。増大し続けるシグナル伝達タンパク質ファミリーにより媒介されるシグナル伝達事象のカスケードが解明され、様々な生物学的応答において中心的役割を果たすことがわかっている。その中に入るものとしては細胞周期調節、細胞分化、アポトーシス、走化性、細胞運動性及び細胞骨格再配置がある(Cantley et al. (1991) Cell 64:281-302）; Liscovitch et al. (1994) Cell 77:329-334）。シグナル伝達経路の様々な構成要素の欠陥が、数多くの形態の癌、血管系疾患及び神経系疾患を含め、莫大な数の疾患を説明するということもわかっている。実際、シグナル伝達経路を調節する能力をもつ作用物質（すなわちシグナル伝達経路モジュレータ）が長い間、潜在的な診断用物質及び／又は治療用物質として認められてきた。
【０１８６】
本発明のモジュレータは、該モジュレータの（１）本発明の遺伝子パッケージ上に提示された細胞内シグナル伝達タンパク質に結合する能力、又は（２）シグナル伝達タンパク質と通常関連する細胞タンパク質の存在下で、表示されたシグナル伝達タンパク質との結合のために競合する能力によって特徴づけされる。該モジュレータは、標的シグナルタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。
【０１８７】
ｃＤＮＡライブラリの発現：
本発明の表示系は、ｃＤＮＡライブラリの発現に特に適している。上述のように、遺伝子ＩＩＩ及び遺伝子ＶＩＩＩファージ表示系を含む以前に報告された融合系では、挿入点が外表面配列の５’末端に制限される。このため外因性ポリペプチドは、外表面タンパク質のＮ末端に連結されなくてはならない。結果として、内部停止コドンによるリーディングフレームの分断に起因して、全てのリーディングフレームのコーディング配列のフラグメントを含むｃＤＮＡライブラリをこれらの融合系により完全に発現させることができない。しかしながら、本発明の系では、外因性配列が外表面配列とインフレームで融合されていないことから、この一方向クローニングの欠点を被ることはない。
【０１８８】
ｃＤＮＡ表示は、タンパク質−タンパク質相互作用を確定するための有用な技術となり得る。ｃＤＮＡライブラリの発現及びスクリーニングは、特に問題の既知のタンパク質を結合する該発現された産物の能力に基づいて新規遺伝子の同定を大幅に容易化する。ｃＤＮＡでコードされるタンパク質を本発明の遺伝子パッケージの表面上で発現させることができ、これを次に、特定の固定化された標的に対しin vitroで以上に詳述したようなバイオパニング富化によりテストすることができる。
【０１８９】
表示された外因性ポリペプチド又は無作為又は予め定められたポリペプチドのライブラリがテスト物質に特異的に結合する能力は、当該技術分野において充分に確立された様々な手順によりテストすることができる。一般に、選択は、好ましくはアフィニティクロマトグラフィを用いて実施される。この方法は、一般的にはテスト物質をコーティングしたプレート、カラムマトリックス、細胞、又は溶液中のビオチン標識された物質に、遺伝子パッケージを結合させ、次に捕獲することで進められる。固相に結合された遺伝子パッケージは、洗浄され、その後、可溶性ハプテン、酸又はアルカリにより溶出させられる。代替的には、増大するテスト物質の濃度を用いて、アフィニティマトリックスから遺伝子パッケージも解離させることができる。テスト抗原に対して極めて高い親和力又は結合力をもつ或る種のＡｂｕｓについては、ＷＯ９２／０１０４７で記載されているように効率の良い溶出のために高いｐＨ又は穏やかな還元性の溶液が必要となることがある。
【０１９０】
所望の結合特異性をもつ結合されたポリペプチドを回収する上での潜在的困難性を回避するためには、アダプタと外因性ポリペプチドの間にプロテアーゼ切断部位を導入することができる。この目的で適用可能な切断部位としては、Ｘ因子、トリプシン及びトロンビン認識部位が含まれるが、これらに制限されるわけではない。親和性マトリックスに遺伝子パッケージを結合させ非特異的パッケージを洗浄した後に、切断部位での消化に適した条件下でプロテアーゼを伴う抗原親和性マトリックスを洗浄することにより、所望の親和力をもつ外因性ポリペプチドを表示する残りのパッケージを収集することができる。かかる消化は、ファージ粒子といったような遺伝子パッケージから外因性ポリペプチドを放出させることになる。
【０１９１】
上記手順に対する代替的手順は、強く結合されたファージ又は細菌粒子を保持した親和性マトリックスを取り出し、そして例えばＳＤＳ溶液を沸とうさせることなどにより、その核酸を抽出することである。抽出された核酸は、E. Coli 宿主細胞を直接形質転換するために使用することができ、あるいは代替的に、適切なプライマを用いたＰＣＲにより外因性配列を増幅させることもできる。
【０１９２】
選択効率は、洗浄時の解離動態を含めた複数の要因の組合せ、及び単一ファージ又は細菌上の外因性ポリペプチドの多重コピーが固体支持体上のテスト物質に同時に結合しうるか否かによって左右されやすい。例えば、短時間の洗浄、多価表示及び固体支持体における高い抗原コーティング密度の使用をすることにより、速い解離動態（及び弱い結合親和性）をもつ抗体が保持されるはずである。逆に、長時間の洗浄、１価ファージ及び低い抗原コーティング密度を用いることにより、低い解離動態（及び優れた結合親和力）を伴うＡｂｕｓの選択が有利になるはずである。
【０１９３】
代替的には、細胞選別(sorting）により、一定の与えられた物質に対する特異的結合を評価することが可能である。この技術には、選別されるべき宿主細胞に付着したファージ粒子などの遺伝子パッケージ上に外因性ポリペプチドを提示し、次に検出可能部分に結合されたテスト物質で標的細胞を標識化し、次に、細胞選別機中で非標識化細胞から標識化細胞を分離することを伴う。最新式の細胞分離方法が、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）である。細流の形で単一ファイル内を移動する細胞を、レーザービーム中に通過させ、られ、蛍光標識により結合された各々の細胞の蛍光を次に測定する。
【０１９４】
望ましい場合には、外因性ポリペプチドのレパートリを無関係のテスト物質に対し予備選択して、望ましくないポリペプチドを対抗選択することが可能である。例えば、Ａｂｕｓレパートリを無関係の抗原に対し対抗選択することができる。例えば抗イディタイプＡｂｕｓなどを単離するために、関係するテスト物質に対しレパートリを予備選択することもできる。本発明の表示系は、望ましい特異性をもつＡｂｕｓの急速な単離を可能にする。単離されるＡｂｕｓの多くは、従来のハイブリドーマ又はトランスジェニック動物技術を通して取得することが困難又は不可能であると予想されるものである。
【０１９５】
溶出したＡｂｕｓのその後の分析は、Ｌ鎖及びＨ鎖のアミノ酸配列を記述するためのタンパク質配列決定を伴うことがある。推論されたアミノ酸配列に基づき、次に、ＰＣＲライブラリスクリーニング、既存の核酸データベースにおける相同性探索又はそれらの任意の組合せを含めた組換えクローニング方法により、抗体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得ることができる。一般に利用されるデータベースには、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、及びＨＴＧＳが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１９６】
本発明のベクターを含むキット
本発明はまた、適切な包装(packaging）内に本発明の発現ベクター及びヘルパーベクターを含むキットを包含する。
【０１９７】
各々のキットには、宿主細胞内へのベクターの送達を可能にする試薬が必ず含む。ベクターの送達を促進する試薬の選択は、使用される特定のトランスフェクション又は感染方法に応じて異なりうる。キットはまた、外因性配列及びタンパク質産物の検出のための標識化されたポリヌクレオチドプローブ又はタンパク様プローブを生成するために有用である試薬を含んでもよい。各々の試薬は、在庫保管のため、及びその後、実験が行われる時に反応媒体に追加又は交換するために適した緩衝液中に溶解／懸濁させられているか、又は固体形態で供給され得る。適切な包装が提供される。キットは、当該手順に有用な追加的な構成要素を任意的に提供してよい。これらの任意の構成要素としては、緩衝液、捕捉試薬、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、対照サンプル、使用説明書及び解釈情報が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１９８】
本発明の表示系、宿主細胞及び遺伝子パッケージの開発及び使用についてのさらなる例示が、以下の「実施例」の欄で示されている。実施例は、当該技術分野において通常の技術をもった実施者に対する指針として提供されるものであって、いかなる形であれ制限的意味をもつものではない。
【実施例】
【０１９９】
例１：ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージの調製と使用
Ａ． ＫＯ７ｋｐｎベクターの構築：
充分に特徴づけされたベクターすなわちＭ１３ＫＯ７（Amersham Pharmaciaより入手）を以下で詳述する手順に従って修飾することによって、ＫＯ７ｋｐｎベクターを構築した。結果として得られたベクターは、遺伝子ＩＩＩコーディング領域を分断することなく遺伝子ＩＩＩリーダー配列にユニークなＫｐｎＩ制限部位が挿入されたという点を除いて、ＫＯ７と同一である（図３Ａ及び図３Ｂを参照のこと）。
【０２００】
ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発によりＫＯ７ヘルパーファージベクターの遺伝子ＩＩＩリーダー配列にＫｐｎＩ部位を導入した。ＫｐｎＩ部位を含む以下のプライマを用いて、ＰＣＲによりＫＯ７ゲノムを増幅した：ｐ３ＫＮ１：５’−ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧ−３’及びｐ３ＫＮ２：５’−ＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’。これらのプライマは、遺伝子ＩＩＩリーダー配列に対する部分配列相同性を共有している。
【０２０１】
ＰＣＲは、１００ｎｇのＫＯ７ベクターＤＮＡ、各々２０ｐｍｏｌのプライマ、２５０μＭのｄＮＴＰ及び１×ｐｆｕ緩衝液とｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stragagene）を含む１００μｌの反応混合物の形で実施した。反応混合物を最初約９６℃でインキュベートし、次に以下の要領でサーモサイクラー内において１５サイクルのＰＣＲにかけた：
変性 ９６℃、３０秒
アニーリング ５５℃、３０秒
伸長 ７２℃、１０分
【０２０２】
増幅後、産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで切断し連結して、電気穿孔法によりＴＧ１細菌細胞を形質転換した。この細菌細胞をカナマイシン耐性について選択した。具体的には、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地の中で９６ウェルのマイクロタイタープレート内でカナマイシン耐性（ＫａｎR ）コロニーを増殖させ、上清を用いてファージＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行うことにより、ＰＣＲエラーによりひき起こされた機能喪失突然変異体を排除した。簡単に言うと、ファージＥＬＩＳＡを、以下のように行った。すなわち、ファージ粒子を含有する上清１００μｌを用いて、４℃でＥＬＩＳＡプレートのウェルに一晩コーティングした。室温で３０分間ＰＢＳ緩衝液中の５％の牛乳で遮断した後、ＥＬＩＳＡプレート上に結合したファージ粒子を、１００μｌのＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体（Amersham Pharmacia）と共にさらに室温で１時間インキュベートした。遊離の抗Ｍ１３抗体を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにより洗い流した。次に、基質ＡＢＴＳ〔２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕を添加した。４０５ｎｍでの吸光度により、ＨＲＰ活性を決定した。図２は、カナマイシン耐性、ファージ陽性クローンのためのファージＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示している。ファージ生成のために、４８のクローンをスクリーニングした。クローンＣ２、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ９、Ａ１２は、ファージ陽性であった。クローンＢ７、Ｂ９及びＡ１２から抽出したＤＮＡを、ＴＧ１培養物から調製した。Ａｃｃ６５Ｉ（ＫｐｎＩのアイソシゾマー）及びＢａｍＨＩでのベクターＤＮＡの二重消化は、６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを示し、これは、３つのＫＯ７ｋｐｎベクタークローン全てにおけるＫｐｎＩ部位の存在を確認するものである。
【０２０３】
Ｂ． ＫＯ７ｋｐｎファージの生成：
Ｂ９クローンから生成されたＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージを含有するＫａｎR ＴＧ１上清を、２×ＹＴ寒天プレート上に線条接種した。０．５ｍｌのＴＧ１培養物（ＯＤ６００＝０．５）と混合した４ｍｌの軟寒天をプレート上に注ぎ込んだ。３７℃で一晩インキュベートした後、ファージプラークが形成された。単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら２時間３７℃でインキュベートした後、培養物を、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに移した。常時振とうさせながら培養物を一晩インキュベートした。上清中のファージを次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ファージ濃度をＯＤ268 測定によって決定した。一般に、ＯＤ268における１単位の読取値は、その上清が、およそ５×１０12 ファージ／ｍｌを含有することを示している。ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージについての記録されたファージ収量は約１〜２×１０12／ｍｌであり、これはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのものときわめて類似していた。
【０２０４】
Ｃ． ファージ表示のためのＫＯ７Ｋｐｎヘルパーファージの使用：
ｓｃＦｖ抗体ＡＭ２のコーディング配列を、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体を発現するファージ表示ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２）にサブクローニングした。この表示ベクターを保有するＴＧ１細胞をＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、ＭＯＩ＝１０でＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージにより重複感染させた。感染したＴＧ１細胞を３０℃で２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ中で一晩増殖させた。培養上清からＰＥＧ／ＮａＣｌによりファージミド粒子を２回沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁させた。ファージ上で表示されたｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体は、ファージＥＬＩＳＡ検定により検出した。簡単に言うと、０．２μｇのＡＭ２−抗原をまず４℃で９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に一晩コーティングした。５％の牛乳／ＰＢＳでの遮断の後、２％の牛乳／ＰＢＳ中のファージ溶液を１時間ＥＬＩＳＡプレート上に置いた。抗原に結合したファージをＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体とのインキュベーションにより検出した。ＨＲＰ活性の測定のために、基質ＡＢＴＳ〔２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕を使用した。ｐＡＢＭＤ１−ＡＭ２／ＫＯ７ｋｐｎベクターを保有するＴＧ１細胞から生成されたファージミドは、非常に強い抗原結合活性を示し、これはＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージによるｓｃＦｖ抗体ＡＭ２の機能的表示を表わしていた。この一連の実験は、本発明の表示系を構築および使用するために利用される試薬のための正の対照としての役割をする。
【０２０５】
例２：ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ． ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＸｂａＩ部位とＢｇＩＩＩ部位の間の配列を、Ｍｙｃ−タグ（図４）及びＧＲ２ドメイン（ヒトＧＡＢＡB レセプタ２の高次コイルドメイン）のコーディング配列、及びＫｐｎＩ部位を含む部分遺伝子ＩＩＩリーダー配列をコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することによって、ｐＡＢＭＣ６ベクターを構築した。ＧＲ２−Ｍｃｙドメインのための配列は、ｐＡＢＭＤ１ベクター内でｐＩＩＩコーディング配列と直接融合され、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【０２０６】
ＫＯ７Ｋｐｎヘルパーベクター中の部分ｐＩＩＩリーダー（アミノ酸残基１１−１９）及び部分ｐＩＩＩタンパク質（アミノ酸残基１−１９７）をコードするＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ６ベクターからのアダプタ２−ｐＩＩＩ融合タンパク質及び部分ｐＩＩＩリーダーをコードする対応フラグメントで置換することによって、ＧＭ−ウルトラヘルパー(UltraHelper）ファージベクターを構築した。結果として得られたＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクター（図５）は、ＧＲ２ドメイン及びＭｙｃ−タグ配列（改変ｐＩＩＩタンパク質の検出用）が遺伝子ＩＩＩとインフレームで融合された改変された遺伝子ＩＩＩ融合体（図５Ｂ）を含む。
【０２０７】
ＧＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築するために、Ｂ９ ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージクローン（例１参照）を使用した。改変された遺伝子ＩＩＩフラグメントをＫＯ７ｋｐｎファージベクターにサブクローニングした後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地中、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、２０のカナマイシン耐性コロニーを増殖させた。上清を使用して、例１に記載されているようなＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行った。１９のクローンがファージ粒子を生成することができた。
【０２０８】
ＧＭ−ウルトラヘルパーファージがＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質と共にパッケージングされたことを確認するために、改変ｐＩＩＩ融合を検出するべく、抗Ｍｙｃ抗体（BD Pharmingen からの９Ｅ１０）を用いたウェスタンブロットを行った。簡単に言うと、４つのクローン（クローン６、９、１８及び２０）から１〜４×１０11のファージ粒子を１０分間ＳＤＳサンプル緩衝液（２％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール、０．６７ＭのＴｒｉｃｅ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中で加熱した。変性サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳゲル中のタンパク質を次にＰＶＤＦ膜に移し、この膜を次に５％の牛乳／ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌの９Ｅ１０抗体でプローブ探査した。抗マウス抗体−ＡＰコンジュゲート及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ ＡＰ基質（Sigma）により、Ｍｙｃ−タグ付きタンパク質を検出した。図６に示されているように、抗Ｍｙｃ抗体により４つのクローン全ての中で単一のタンパク質バンドを検出した。負の対照であるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ中では、Ｍｙｃを含有するバンドは全く検出されなかった。この実験は、ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合タンパク質がウルトラヘルパーファージ粒子内に組立てられたことを実証している。ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ融合の組立ては、ＥＬＩＳＡ検定によってさらに確認された（図７参照）。
【０２０９】
Ｍ１３ファージがトリプシンに対する耐性をもつことは周知であった。プロテアーゼ切断部位についてのスクリーニングにより、ＧＭ−ウルトラヘルパーファージのＧＲ２−Ｍｙｃドメイン内には７つのトリプシン切断部位が存在することが明らかになった（図５Ｃ）。ＧＲ２−Ｍｙｃドメインがトリプシンによりファージ表面から切断され得るか否かをテストするため、クローン１８からのＧＭ−ウルトラヘルパーファージを３７℃で３０分間、異なる濃度のトリプシンにさらし、その後反応を停止するべくトリプシン阻害物質を添加した。図８は、５μｇ／ｍｌのトリプシンによりＭｙｃ−タグを完全に除去できたことを示している。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージは、負の対照としての役割をした。
【０２１０】
Ｂ．ＧＭ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述のＧＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を含有する上清を用いて、ファージプラーク検定を行った。単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした後、培養物をファージ粒子の大規模生産のため、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに移した。上清中のファージを次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することによってファージ濃度を決定した。ＯＤ268 測定は、培養物が約２×１０11／ｍｌのＧＭ−ウルトラヘルパーヘルパーファージ粒子を含むことを表わしている。トリプシンによりファージ表面からＧＲ２−Ｍｙｃドメインを除去することで、ファージ感染力を１〜３倍増大させることができた。
【０２１１】
Ｃ．抗原結合単位を表示するためのＧＭ−ウルトラヘルパーファージの使用：
本発明のアダプタ誘導型表示系においては、問題の外因性ポリペプチドは、外表面タンパク質とインフレームで融合される対合アダプタ（「アダプタ２」と呼ばれる）と相互作用するアダプタ（アダプタ１と呼ばれる）との融合として発現される。２つのアダプタ間のペアワイズ相互作用は、外因性ポリペプチドの表示を促進する。ファージミドベクターｐＡＢＭＸ１４は、アダプタ１とインフレームで融合された外因性ポリペプチドを発現する発現ベクターの１つである。このベクターｐＡＢＭＸ１４（図９Ａ及び図９Ｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ細胞（＋）に由来した。１組のプライマ（ｐＢＳ−Ｓｋａ：５’−ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’及びｐＢＳ−ＳＫｂ：５’−ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いて、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発により、ｌａｃプロモータの直後にユニークなＡｇｅＩ制限部位を導入し、ＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位を、切断と平滑末端連結により欠失させた。リボソーム結合配列ＲＢＳと、ｐｅｌＢリーダーと、ＧＡＢＡB レセプタ１（ＧＲ１、アダプタ１として）及びＨＡ−（Ｈｉｓ）6−タグ（ＤＨ−タグと称する）に由来するアダプタのコーディング配列とを含む、５’でＡｇｅＩにより、３’でＳａｌＩ部位によりフランキングされた合成ＤＮＡフラグメントを、改変されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ細胞（＋）にクローニングした。ｌａｃＺプロモータは、ＧＲ１融合の発現を駆動し、したがって細菌細胞で発現される可溶性外因性ポリペプチドの産生を可能にする。
【０２１２】
本発明を用いて、機能的タンパク質を表示できるということを実証するため、１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１４ベクターにサブクローニングした。結果として得られたｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１ベクターでＴＧ１細胞を形質転換させ、この細胞を４又は４０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭ−ウルトラヘルパーファージにより重複感染させた。ファージ粒子を例１に記載されているように生成させ精製した。ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を、ＡＭ１−抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより検出した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果により、３つのＭＯＩ感染全てから生成されたファージ粒子が対応するＡＭ１−抗原に対する結合特異性を示すことが明らかになり、これは１本鎖抗体がファージ表面上で機能的に表示されたということを表わしていた（図１０）。用量依存性結合が観察された。結合は、ファージ濃度が１０12／ｍｏｌに達した時点で飽和した。ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、１０13／ｍｌといったような高い濃度でさえＡＭ−１抗原に結合しなかった。ファージ粒子を同様に、抗Ｍｙｃ及び抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析した。非還元性性条件下（例えばβ−メルカプトエタノール無し）で、ＳＤＳサンプル緩衝液の中での加熱によりファージ粒子を変性させた。図１１は、ｓｃＦｖ抗体がＧＭ−ウルトラヘルパーファージによる感染によってのみ表示され、対照のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージでは表示されなかったということを示している。抗Ｍｙｃブロットにより、ライン２内で、遊離ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩに比べほぼ２倍のｓｃＦｖ−ＧＲ１−ＤＨ／ＧＲ２−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩ複合体がファージ粒子中に組立てられたということも明らかにした。各ファージ粒子は、５コピーのｐＩＩＩ外皮タンパク質を含む。このことは、各ファージ粒子が平均して１コピーより多くのｓｃＦｖ−ＧＲ１融合体を担持していることを表わしている。
【０２１３】
例３：ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ．ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築：
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＸｂａＩ部位とＢｇＩＩＩ部位の間の配列を、５’から３’までの遺伝子ＩＩＩリーダー配列、ＫｐｎＩ部位、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのコーディング配列及びＭｙｃ−タグを含む合成ＤＮＡフラグメント（図１２）で置換することによって、ｐＡＢＭＣ１３ベクターを構築した。この合成配列は、ｐＡＢＭＤ１ベクター内で遺伝子ＩＩＩとインフレームで連結された。
【０２１４】
ＫＯ７Ｋｐｎヘルパーベクター内の（アミノ酸残基１１−１９）及び部分ｐＩＩＩタンパク質（アミノ酸残基１−１９７）をコードするＫｐｎＩ／Ｂａｍ ＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ１３ベクターからのアダプタ２−ｐＩＩＩ融合タンパク質及び部分ｐＩＩＩリーダーをコードする対応フラグメントで置換することによって、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築した。結果として得られたＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクター（図１３Ａ）は、ｐＩＩＩのＮ末端に配置されたＣｙｓ−ｍｙｃドメインと融合された改変ｐＩＩＩカプシドをコードする。さらに、アンバー停止コドンＴＡＧがＣｙｓ−Ｍｙｃコーディング配列と遺伝子ＩＩＩとの間に配置されている。かかる停止コドンは、サプレッサー細菌菌株内でファージ粒子全体の増殖を可能にするが、非サプレッサー菌株内ではこれを可能にしない。
【０２１５】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築するために、Ｂ９ ＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージクローンを使用した。改変された遺伝子ＩＩＩフラグメントをＫＯ７ｋｐｎファージベクターにサブクローニングした後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地中、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、２４のカナマイシン耐性コロニーを増殖させ、上清を使用して、例１に記載されているようにＥＬＩＳＡ検定によるファージスクリーニングを行った。２３のクローンがファージ粒子を生成することがわかった。
【０２１６】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージが、発現されたＣｙｓ−Ｍｙｓ−ｐＩＩＩ融合体をファージ粒子内にパッケージングできるということを確認するため、抗Ｍｙｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定を行った。選択された５つのクローン由来のＣＭ−ウルトラヘルパーファージは全て、その表面上にＭｙｃ−タグを表示した。かかるＭｙｃ−タグは、負の対照のＫＯ７ヘルパーファージでは検出できなかった（図１４）。
【０２１７】
Ｂ．ＣＭ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述の手順に従ってＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を含有する上清を用いて、ファージプラーク形成を行った。簡単に言うと、単一のファージプラークをピックアップし、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用した。２５０ｒｐｍで常時振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした後、培養物を７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコに加えて一晩インキュベートした。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて、ＴＧ１上清中のファージを沈降させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することによってファージ濃度を決定した。ＣＭ−ウルトラヘルパー ヘルパーファージについてのファージ収量は培養１ｍｌあたり約１〜２×１０12 であり、これは、Ｍ１３ＫＯ７及びＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージのものときわめて類似している。トリプシンによりファージ表面からＭｙｃ−タグを除去することができる。改変された遺伝子ＩＩＩ内に配置されたアンバー停止コドンのために、非サプレッサー細菌菌株ＴＯＰ１０Ｆ’内では有意な量のＣＭ−ウルトラヘルパーファージ粒子を生成することができない。
【０２１８】
Ｃ．抗原結合単位を表示するためのＣＭ−ウルトラヘルパーファージの使用
ファージミドベクターｐＡＢＭＸ１５は、アダプタとインフレームで融合された外因性ポリペプチド（１本鎖抗体ＡＭ１）を発現するもう１つの例示的な発現ベクターである。（ＮｏｔＩ部位及びＳａｌＩ部位を用いて）ｐＡＢＭＤ２のｆｄ遺伝子ＩＩＩフラグメントを、ＨＡ−タグ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓをコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することにより、ｐＡＢＭＤ２（図２２）からベクターｐＡＢＭＸ１５（図１５Ａ及び図１５Ｂ）を構築した。
【０２１９】
ＣＭ−ウルトラヘルパーファージベクターを用いて、機能的タンパク質を表示できるということを実証するため、１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１５ベクターにサブクローニングした。結果として得られたｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１でＴＧ１細胞を形質転換させ、その細胞を１又は１０又は５０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＣＭ−ウルトラヘルパーファージにより重複感染させた。例１に記載されているようにファージ粒子を生成させ精製した。ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を、ＡＭ１抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより検出した。２×１０12のファージを各ウェルについて添加した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果から、４つのＭＯＩ感染の全てから生成されたファージミド粒子がＡＭ１抗原に対して特異的に結合する能力をもつことを明らかになり、これは機能的１本鎖抗体がファージ表面上で表示されたということを表わしていた（図１６）。ｐＡＢＭＸ１５−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、ＡＭ１抗原に結合しなかった。ファージ粒子をウェスタンブロット法のためにも使用した。非還元性条件下（例えばβ−メルカプトエタノール無し）で、ＳＤＳサンプル緩衝液の中での加熱によりファージ粒子を変性させた。図１７に示されているように、ｓｃＦｖ抗体は、ＣＭ−ウルトラヘルパーファージによってのみ表示され、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージでは表示されなかった。
【０２２０】
図１７はまた、ＡＭ１ ｓｃＦｖよりも多くの遊離ｐＩＩＩがファージ粒子上に表示されていることを表わしている（左図のレーン４を参照）。これは１価表示を表わすものである。これとは対照的に、例２で記載されているＧＭ−ウルトラヘルパーファージ表示系は、遊離ｐＩＩＩよりも多くのＡＭ１ ｓｃＦｖを生成する（図１１、左図のレーン２を参照）。ｓｃＦｖ配列中にＧＡＢＡB レセプタ１のアダプタ配列を含むこと及びＧＭ−ウルトラヘルパーベクター内にアダプタ配列ＧＡＢＡB レセプタ２を取込むことは、ペアワイズ相互作用を増強する。
【０２２１】
例４：ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを含むアダプタ誘導型表示系の調製
Ａ．ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターの構築：
Ｎｏｔ１−Ｂｇ／ＩＩフラグメントを、Ｍｙｃ−タグのコーディング配列、遺伝子ＩＩＩのＣＴドメイン（アミノ酸２１７−４０５）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＯｍｐＡリーダー配列（図２２Ａ及び図２２Ｂ）を含む合成ＤＮＡフラグメントで置換することにより、ベクターｐＡＢＭＣ６からｐＡＢＭＣ１２ベクターを構築した。
【０２２２】
ＫＯ７ｋｐｎヘルパーベクター内のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＢＭＣ１２ベクターからの対応フラグメントで置換することにより、ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクターを構築した。結果として得られたＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージベクター（図１９Ａ）は改変されたｐＩＩＩカプシドの追加的なコピーをコードし、これはＧＲ２ドメイン、ｍｙｃ−タグ配列（改変ｐＩＩＩタンパク質の検出用）及びｐＩＩＩのＣＴドメインを含む。改変された遺伝子ＩＩＩの下流側では、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）及び細菌タンパク質ＯｍｐＡ由来のリーダー配列が、ｐＡＭＢＤ１に由来する遺伝子ＩＩＩ配列に融合された。遺伝子ＩＩＩ含有配列のこれら２つのコピーが（図１９Ｂに示されている）もとの遺伝子ＩＩＩプロモータの制御下に配置されている。例１に記載されたようにファージＥＬＩＳＡ検定を行ってファージ陽性クローンをスクリーニングした。１０クローンのうちの３つが、ファージ粒子を生成することがわかった。大規模ファージ調製のためにクローン３を使用した。
【０２２３】
Ｂ． ＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージの生成：
上述の手順に従って、ファージプラーク形成検定を実施した。ＧＭ−ウルトラヘルパーヘルパーファージについてのファージ収量は、培養１ｍｌあたり約８×１０11であり、これは、Ｍ１３Ｋ０７及びＫＯ７ｋｐｎヘルパーファージのものと類似していた。トリプシンによりファージ表面からＧＲ２−Ｍｙｃドメインを除去することができる。
【０２２４】
Ｃ．抗原結合単位を発現するためのＧＭＣＴ−ウルトラヘルパーファージの使用：
ＧＭＣＴウルトラヘルパーヘルパーファージと組合せた形でのファージ表示のために、プラスミドベクターｐＡＢＭＸ１４を使用した。１本鎖抗体ＡＭ１をｐＡＢＭＸ１４ベクターにサブクローニングした（ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１と称する）。ＰＡＢＭＸ１４−ＡＭ１でＴＧ１細胞を形質転換させ、その細胞を１または１０又は５０又は１００という感染多重度（ＭＯＩ）でＧＭ−ウルトラヘルパーファージと重複感染させた。例１に記載されているようにファージ粒子を生成させ精製した。ＡＭ１抗原でコーティングされたプレートを用いてファージＥＬＩＳＡにより、ファージ表面上で表示された１本鎖抗体を検出した。二次抗体は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３抗体であった。ＥＬＩＳＡの結果により、４つのＭＯＩ感染の全てから生成されたファージミド粒子がＡＭ１抗原に対して類似の結合活性を有することが実証され、これは機能的１本鎖抗体がファージ表面上で表示されたということを表わしていた（図２０）。ｐＡＢＭＸ１４−ＡＭ１／Ｍ１３ＫＯ７ベクターを担持するＴＧ１から生成された対照ファージミドは、ＡＭ１抗原に対して検出可能な結合親和性を全く示さなかった。ファージ粒子をウェスタンブロット分析のためにも使用した。図２１に示されているように、ｓｃＦｖ抗体は、ＧＭＴＣ−ウルトラヘルパーファージによる感染によって表示されたが、対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージでは表示されなかった。
【０２２５】
例５：パニングによる所望のポリペプチドを表示するファージの富化
可溶性ポリペプチドを産生させるために、様々なＤＮＡ配列をｐＡＢＭＸ１４又はｐＡＢＭＸ１５ベクターのいずれかの中でクローニングすることができる。この発現ライブラリは、本発明のウルトラヘルパーファージによる感染によって、コードされたポリペプチドを表示するために使用することができる（ｐＡＢＭＸ１４についてはＧＭ及びＧＭＣＴ、ｐＡＢＭＸ１５についてはＣＭ）。ファージ上に表示された特異的タンパク質又はペプチドは、様々なライブラリから数回のパニングにより富化することができる。パニングプロセスは、以下のように記載される。簡単に言うと、９６ウェルのプレートに、４℃で１〜１０μｇ／ｍｌの濃度の特異的抗原を一晩コーティングする。ＰＢＳで洗浄し、５％の牛乳／ＰＢＳでの遮断の後、１０11-12 個のファージを添加し、２時間室温でインキュベートする。本発明のウルトラヘルパーファージは全てｐＩＩＩタンパク質に融合された切断可能なＭｙｃ−タグを有することから、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで数回洗浄した後、結合したファージを１０μｇ／ｍｌのトリプシンで３０分間溶出させる。トリプシン溶出は、本発明者の実験においては（通常従来のファージパニングで使用される）１００ｍＭのトリエチルアミンよりも高い効率を示す。上記プロセスを数回反復することにより、所望のポリペプチドを表示するファージを富化させることができる。
【０２２６】
例６：細菌ヘルパーベクターの調製及び使用
Ａ． 発現ベクター及び細菌ヘルパーベクターの構築：
ベクターｐＡＢＭＤ１（図２２Ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位間の配列を、ＧＲ１アダプタ及びＨＡ−タグをコードする合成ＤＮＡフラグメントで置換することによって、発現ベクターｐＡＢＭＸ２２を構築する。図２５Ａに示されているように、該ベクターは、抗生物質選択用アンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）、プラスミド複製起点(ColE1 ori）、ｆｌファージ複製起点（fl ori）及び、下流側配列ｐｌａｃ−ＲＢＳ−ｐ８Ｌ−ＧＲ１−ＨＡ−タグの発現を駆動するｌａｃプロモータ／ｌａｃＯ１を含んでいる。細菌細胞中での可溶性タンパク質の表示又は産生のための外因性配列を挿入するためにＭｌｕＩ／ＸｂａＩまたはＭｌｕＩ／ＮｏｔＩまたはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用することができる。図２５Ｂには完全ベクター配列が示されている。
【０２２７】
細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１（ベクターマップについては図２６Ａ、完全ベクター配列については図２６Ｂ）は、StratageneからのｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターに由来する。ｐＢＣ−ＫＳ（＋）内の２つのＢｓｓＨＩＩ部位間のマルチクローニングサイトの配列は、リボソーム結合配列ＲＢＳ、ｐｅｌＢリーダー配列、E. coli主要外膜リポタンパク質（Ｌｐｐ）の最初の９アミノ酸と外膜タンパク質ＯｐｍＡのアミノ酸４６−１５９とから成るキメラ外膜配列のコーディング配列、及びアダプタＧＲ２配列を含有する、５’でのＭｌｕＩ部位（ＢｓｓＨＩＩに対して適合した付着末端を伴う）により又３’でのＢｓｓＨＩＩ部位によりフランキングされている（flanked）合成ＤＮＡフラグメントによって置換されている。ｌａｃＺプロモータは、細菌細胞のペリプラスミドに分泌されることになるＬｐｐ−ＯｍｐＡ−ＧＲ２融合体の発現を駆動する。ｐＡＢＭｂｄ−１ベクターは、抗生物質選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ）、プラスミド複製用 ColE1 ori起点、及びファージミドパッケージ用ｆｌファージ複製起点（fl ori）を含有する。
【０２２８】
Ｂ．細菌ヘルパーベクターを担持するファージミド粒子の生成
ｐＡＢＭｂｄ−１ヘルパーベクターで細菌ＴＧ１細胞を形質転換させる。単一のｐＡＢｂｄ−１コロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを伴う１５ｍｌの２×ＹＴ培養物に接種するために使用する。ＯＤ600 が０．８に達した後、細菌細胞を３７℃で１時間、ＭＯＩ１０でＫＯ７Ｋｐｎヘルパーファージにより感染させる。感染したＴＧ１細胞を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを伴う５００ｍｌの２×ＹＴの入った２リットル入りフラスコの中で一晩培養させる。その後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて上清中のファージミド粒子を沈降させ、リン酸緩衝液中で再懸濁させた。ＯＤ268 を測定することにより、ファージミド濃度を決定する。ｐＡＢＭｂｄ−１ヘルパーベクターをパッケージングするファージミド粒子を次にアダプタ誘導型細菌表示のために使用する。
【０２２９】
Ｃ．抗原結合単位を表示するための細菌発現及びヘルパーベクターの使用
ｓｃＦｖ抗体遺伝子ＡＭ２をｐＡＢＭＸベクターにクローニングさせる。この発現ベクターを含有するＴＧ１細菌細胞をＯＤ600 ＝０．８まで増殖させ、細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１をパッケージングするファージミド粒子で感染させる。発現ベクター及びヘルパーベクターを保有するＴＧ１細胞を、３０℃でアンピシリン／Ｃａｍを伴う２×ＹＴの中で一晩増殖させ、収獲してＰＢＳで洗浄する。表示されたタンパク質はＨＡ−タグでタグ付けされていることから、細菌表面上で表示されたタンパク質を検出するために抗ＨＡタグ抗体を使用することができる。ＦＡＣＳ分析実験のため、ＰＢＳ中で再懸濁した細胞をまずは抗ＨＡタグ抗体と共にインキュベートし、次にフルオレセインＦＩＴＣ標識化抗マウス抗体と共にインキュベートする。ＰＢＳでの洗浄後、３〜５×１０7 ／ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した細胞を、ＦＡＣＳソータを用いてフルオレジン強度に基づいて計数する。細菌表面上に表示されたタンパク質を検出するために、ＥＬＩＳＡ検定も使用される。まず第１に、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃でＡＭ２抗原で一晩コーティングさせる。２時間抗原と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに結合した細胞を、上述の通り、抗ＨＡ抗体及びＨＲＰ結合型抗マウス抗体で検出する。
【０２３０】
可溶性抗体フラグメントの産生のために、様々な抗体配列をｐＡＢＭＸ２２ベクターにクローニングすることができる。この発現ライブラリは、細菌ヘルパーベクターｐＡＢＭｂｄ−１をパッケージングするファージミド粒子による感染によって、選択可能細菌表示ライブラリを生成するために使用することができる。抗体を表示する細菌細胞をＦＩＴＣ標識化抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳソータを用いてフルオレシン強度に基づいてソーティングする。ソーティング後、選択された細胞を、ＡＭＰを伴う２×ＹＴ培養液中で一晩増殖させる。その後、細胞を新鮮な培地中で継代培養し、表示のため細菌ヘルパーベクターに感染させる。表示された細胞は、次にＦＡＣＳソーティング選択を再度行うために使用される。
【０２３１】
例７：改善された親和力をもつＡｂｕｓの生成及び同定
上述のように、本発明の表示系は、改善された親和力又は特異性をもったＡｂｕｓの生成及び選択のために特に適している。開示された様々な系の中でも、アダプタ誘導型ファージ表示系は、改善された親和力をもつＡｂｕｓをスクリーニングするための強力なプラットフォームを提供する。
【０２３２】
本発明者は、その配列及び対応する抗原が以前に記述されているＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体という名称の既存のＡｂｕを改変することを選択した。このプロセス（以下「抗体親和力成熟」（antibody affinity maturation）と称する）は、ＧＭＣＴベクターのフォーマットでＡＭ３ ＳｃＦｖ抗体のライブラリを生成することで開始される。ＡＭ３ ｓｃＦｖ抗体の枠組構造はＶＨ及びＶＬ領域から成るが、その各々を記載されている通りベクターｐＡＢＭＸ１４の対応する位置にサブクローニングした（図９Ａ参照）。ＡＭ３抗体結合親和力を改善するために、多数の位置でアミノ酸残基の様々な置換を含むライブラリとしてＶＨのＣＤＲ３を構築した。該ライブラリは、ＰＣＲ増幅及び制限消化の後にＡＭ３ ｓｃＦｖ遺伝子のその位置へのサブクローニングをもたらすべく両末端で制限部位をフランキングする変性ＤＮＡオリゴの標準的有機合成を通して調製された。該ライブラリは、およそ１０7 の多様性を有する（すなわち、約１０7 種のＡＭ３抗体変異体を含む）。ＤＮＡ連結の後、該ライブラリをＴＧ１コンピテント細胞内に電気穿孔させた。その後、形質転換体を収獲し、ＧＭＣＴウルトラヘルパーファージによりレスキュー（rescue）した。その後、以上の例で記載した通り、ファージ粒子を収集した。
【０２３３】
このように構築されたアダプタ表示ライブラリをスクリーニング又は「パニング」するために、本発明者は最初に、４℃で０．０５ＭのＮａＨＣＯ3 ｐＨ９．６緩衝液中でNunc Maxisorb 96ウェルプレート上に組換え型抗原を一晩固定化した。２％の牛乳を伴うＰＢＳ緩衝液中で希釈された１０12個のファージ粒子を含有するライブラリファージのアリコートを、上記抗原でコーティングされたウェルに添加した。２時間３７℃での結合後、ウェルを洗浄し、本明細書で記載した方法に従ってファージを溶出させた。溶出したファージを用いてＴＧ１細胞に感染させ、次にＧＭＣＴウルトラヘルパーファージでレスキューした。３０℃で一晩培養した後、ファージをＴＧ１細胞内で増幅させ、ファージは次回のパニングのために直ぐに収獲できる状態となった。ＧＭＣＴファージライブラリパニングを通して高親和性結合剤を選択するために、このライブラリを用いて、異なる解離条件で全体で多数連続回のパニングを行った。
【０２３４】
最終パニングの後、個々のクローンを無作為にピックアップし、同じ組換え型抗原を用いてＥＬＩＳＡによりさらに分析した。以上で記載した手順により９６ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットでＥＬＩＳＡを行った。図２７に示されているように、選択されたクローンは全て、抗原と陽性反応（すなわち抗原に結合）した。
【０２３５】
上述のＥＬＩＳＡで陽性反応性を示したクローンを次に配列決定のために無作為にピックアップし、ＶＨのＣＤＲ３上の残基をマッピングし、ここから一定数の代表的クローンをタンパク質の発現のために処理した。ＡＭ３抗体の場合、Invitrogen Life Technologiesにより記載されているように、Pichia発現系により全てのｓｃＦｖが発現された。Pichia培養物上清由来の可溶性のＨｉｓ−タグ付けされたｓｃＦｖｓを、Qiagenのマニュアルブックに従って、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（２ｍｌ）により直接精製した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから溶出された画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により分析した。図２８に示されているように、画分＃２及び＃３の両方の中で、主要タンパク質バンドとしての３０ＫＤのｓｃＦｖが検出された。ｓｃＦｖ及び他のあらゆるホモ二量体を除去するため、画分＃２及び＃３を組合せ、さらにゲルろ過クロマトグラフィ（HiLoad 16/60 Superdex 75カラム、Amersham-pharmacia biotech）にかけた。
【０２３６】
図２９は、３ＯＫＤの単量体ｓｃＦｖタンパク質が、ゲルろ過クロマトグラフィによりホモ二量体ｓｃＦｖ及びその他から充分分離されたことを示している。その後、精製された単量体ｓｃＦｖタンパク質を用いて、固定化されたタンパク質抗原に対するＡＭ３抗体の結合動態を BiaCore（表面プラスモン共鳴）により分析した。図３０に示されているように、ライブラリから選択された４つのＡＭ３変異体（Ｘ１０７、Ｘ１１０−１１２）は全て、野生型に比べ有意に低い解離速度（Ｋoff）とより高い結合親和力を示した。例えば、Ｘ１１２についてのＫoffは２．８８×１０-4Ｓ-1であり、野生型についてのＫoffは２．７７×１０-3Ｓ-1である。Ｘ１１２抗体は、野生型抗体よりもほぼ１０倍低い解離速度を有する。これらの結果はさらに、抗体工学における本発明のファージアダプタ誘導型表示系の利用可能性及び技術的優位性を実証している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のファージ粒子を含んで成り、その少なくとも１つが、その外表面上に融合ポリペプチドを表示するファージ粒子であって、前記融合ポリペプチドは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示される外因性ポリペプチド配列を含んで成り、前記第１のアダプタは、適切な宿主細胞内で融合ポリペプチドが産生されるときに、外表面タンパク質に連結された第２のアダプタと該第１のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して融合ポリペプチドの表示をひき起こすように作用するファージ粒子である、選択可能ライブラリ。
【請求項２】
複数のファージ粒子を含んで成り、前記複数のうちの少なくとも１つの構成員が、アダプタ誘導型表示体を単一の宿主細胞内で転写および翻訳させる段階を含んで成る、ファージ粒子の外表面上にポリペプチドを表示するための方法に従ってその外表面上にポリペプチドを表示し、ここで、前記アダプタ誘導型表示体は、
（ａ）第１のアダプタ配列にインフレームで融合された外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該ファージ粒子の機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列が欠如している、発現ベクターと、
（ｂ）該ファージ粒子をパッケージングするために必要な外表面タンパク質をコードする外表面配列を含み、該外表面タンパク質の少なくとも１つがインフレームで第２のアダプタに融合された、ヘルパーベクターとを含んで成り、
前記第１のアダプタと第２のアダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介して該ポリペプチドの表示をひき起こすべく作用する、選択可能ライブラリ。
【請求項１】
複数のファージ粒子を含んで成り、その少なくとも１つが、その外表面上に融合ポリペプチドを表示するファージ粒子であって、前記融合ポリペプチドは、第１のアダプタとインフレームで融合された表示される外因性ポリペプチド配列を含んで成り、前記第１のアダプタは、適切な宿主細胞内で融合ポリペプチドが産生されるときに、外表面タンパク質に連結された第２のアダプタと該第１のアダプタとの間の非共有結合性のペアワイズ相互作用を介して融合ポリペプチドの表示をひき起こすように作用するファージ粒子である、選択可能ライブラリ。
【請求項２】
複数のファージ粒子を含んで成り、前記複数のうちの少なくとも１つの構成員が、アダプタ誘導型表示体を単一の宿主細胞内で転写および翻訳させる段階を含んで成る、ファージ粒子の外表面上にポリペプチドを表示するための方法に従ってその外表面上にポリペプチドを表示し、ここで、前記アダプタ誘導型表示体は、
（ａ）第１のアダプタ配列にインフレームで融合された外因性ポリペプチドをコードするコーディング配列を含み、該ファージ粒子の機能的外表面タンパク質をコードする外表面配列が欠如している、発現ベクターと、
（ｂ）該ファージ粒子をパッケージングするために必要な外表面タンパク質をコードする外表面配列を含み、該外表面タンパク質の少なくとも１つがインフレームで第２のアダプタに融合された、ヘルパーベクターとを含んで成り、
前記第１のアダプタと第２のアダプタは、適切な宿主細胞内で該ポリペプチドが産生されるときに、第１のアダプタと第２のアダプタとの間のペアワイズ相互作用を介して該ポリペプチドの表示をひき起こすべく作用する、選択可能ライブラリ。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２０１１−７４０７８（Ｐ２０１１−７４０７８Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５５２３１（Ｐ２０１０−２５５２３１）
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【分割の表示】特願２００３−５６０１５２（Ｐ２００３−５６０１５２）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１日（２００２．１１．１）
【出願人】（５０４０４１３０９）アブマクシス，インコーポレイティド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【分割の表示】特願２００３−５６０１５２（Ｐ２００３−５６０１５２）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１日（２００２．１１．１）
【出願人】（５０４０４１３０９）アブマクシス，インコーポレイティド (3)
【Ｆターム（参考）】
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