アッセイの内部補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）方法及びシステム
内部標準濃度が、特徴的な試薬を有するシステム及び確定アッセイデバイスにおける緩衝液コンダクタンスの測定を通じて、独立したパラメータとして補正（normalized）される。新鮮な（fresh）の内部標準溶液の伝導率は、単独で、又は蒸発や結露などの一様な変動を受けやすいシステムの一部として、測定される。収集されたコンダクタンス測定値は、蛍光アッセイシグナル測定値のような流体チャネル寸法に左右されるアッセイシグナルを補正（normalize）するのに使用してもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００６年１２月２８日に提出された米国特許出願Ｎｏ．６０／８８２、５１４の優先権を主張し、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、アッセイの内部標準化（standardization）方法及びそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
蛍光標識されたＤＮＡのような内部標準は、電気泳動アッセイ中のピークを揃える内部標準として、及び蛍光標識された検体ピークからのピークシグナルを補正する（ノーマライズ：normalize）定量的基準マーカーとしても使用できる。検体ピークの強度は、試験試料中の検体の濃度を定量化するために使用されたシグナルである。励起レーザー光強度、光焦点などにおける変動のように、導入試料の容量又は標識の検出感度に影響を与えるアッセイシステム中に変動が存在すると、検体用のシグナルが影響を受けて検体濃度の測定に誤差が生じる。内部標準に対してシグナルを補正する（ノーマライジング：normalizing）ことで、検出感度、試料容量の誤差、及びチップチャネル深度の変動による検出容量の変動のようなチップ変動におけるシステムの変動に対してシグナルをコントロールできる。
【０００４】
内部標準に関わる問題は、内部標準が試料緩衝液又は他の試薬に含まれており、そして例えば、数日間、数週間、又は数月間にも亘る連続操作を対象としたシステムに保管する時、内部標準の濃度を上昇させる又は減少させる蒸発又は結露のために内部標準が変動を受けるであろうことである。毎日、試料緩衝液を取り換えることで解決されるであろうが、利用者にとっては不便でかつ費用がかかる。別の可能な解決策は、試料として実施される外部キャリブレータを具備することである。これを使用することでシステムを較正し、また濃度対応曲線（concentration response curve）を調整することができるが、個々のチップ変動又は個々のアッセイ変動に対して各試験をコントロールすることはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本アッセイシステムは、マイクロ流体電気泳動アッセイシステムのようなシステムに対して内部標準を使用する問題に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本システムを用いることで、蒸発、結露、又はプローブ洗浄液のプローブキャリーオーバーのような要因のための内部標準濃度の変動をコントロールできる。検体シグナルの内部標準による較正（calibration）を補正（correct）するために、試薬が新鮮（fresh）な時の緩衝液伝導率（conductivity）が本システムで使用され得る。緩衝塩は緩衝液伝導率（conductivity）に対する主要な寄与因子であり、これらの塩の蒸発（evaporation）による濃縮又は結露（condensation）による希釈又はプローブキャリーオーバーが緩衝液の伝導率を変化させる。したがって、アッセイに先駆けたチップにおけるこの緩衝伝導率の測定によって、試料緩衝液を含めた、チップを満たすために使用される試薬の蒸発レベルの測定を可能にする。チップチャネル内の電極配置のため、試料緩衝液の伝導率を直接測定できない場合は、試薬成分の内の１つの蒸発レベルを測定し、蒸発の影響を試料緩衝液及び内部標準に外挿することができる。
【０００７】
コンダクタンス（conductance）の変化の測定は、チップ形状の測定としても使用できる。なぜならば、測定されたコンダクタンス（conductance）は緩衝液伝導率、チャネルの長さ及び断面積の関数であるためである。熱可塑性プラスチック材料のフォトリソグラフィー加工又は成形によって作製されたチップのチャネル形状の1つの主要な変数は、深度寸法にあるといえる。前記コンダクタンスを、機器上の基準チップに対する機器上の新しいチップの初期測定値に参照付けることによって、アッセイシグナルを補正して（normalize）、チップ形状のシグナル強度への影響を補正することが可能となり、このシグナル強度への影響は主にチップチャネルの深さと幅であり、そのうち深さは主要な変数となり得る。
【０００８】
このようにして、コンダクタンス測定値は、マイクロ流体電気泳動アッセイで使用される時の有用なパラメータであり、またこれらのアッセイの精度と再現性を向上できる。
【０００９】
本発明に従って、アッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法が提示され、この補正（normalization）方法は、アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；アッセイに先立って緩衝液の電気コンダクタンス（conductance）測定値を求め；電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいて緩衝液の濃度変化を求め；アッセイ結果を補正する（normalizing）ために緩衝液の濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する、ことを含む。
【００１０】
本方法の緩衝液が内部標準のために用意され、複数の成分を含有してもよく、その成分の1つが内部標準溶液である。緩衝液の電気伝導率（conductivity）はこの複数の成分の総電気伝導率である。内部標準溶液の濃度は、緩衝液の濃度変化を外挿することによって求めてもよい。緩衝液の電気伝導率は、緩衝液中の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する。
【００１１】
アッセイに先立って電気伝導率測定値を求める前に、緩衝液の初期濃度及び緩衝液の対応する電気伝導率測定値を求めてもよい。
【００１２】
本方法で述べられるシステムはマイクロ流体電気泳動アッセイシステムであってもよく、本アッセイシステムでは、アッセイ結果は蛍光内部標準シグナル及び内部標準溶液の濃度に基づいて補正（normalized）してもよい。
【００１３】
さらに、本発明は、アッセイシステム内に複数の緩衝液成分を具備し、その成分の内の１つが内部標準溶液を含有し；アッセイに先立って複数の緩衝液成分の電気伝導率測定値を求め；伝導率測定値に基づいて複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの濃度変化を求め；そして、アッセイ結果を補正する（normalizing）ために塩又はイオンの濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する工程を含む、アッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、緩衝液試薬を収容するウェルを有し、そのウェルの内の１つが内部標準溶液を収容するウェルを具備する基板；前記ウェルを連結するマイクロチャネル；緩衝液試薬を収容するウェル間で電気コンダクタンス（conductance）を測定するための回路部材；ウェル間で電気コンダクタンス（conductance）測定値から緩衝液試薬の塩濃度又はイオン濃度を測定するための制御部材；あらかじめ決められた情報を記憶及び取り出す記憶部材を含み；制御部材が記憶部材中のあらかじめ決められた情報に基づいて塩濃度又はイオン濃度から内部標準溶液の濃度を外挿する、アッセイシステムに関する。
【００１５】
本アッセイシステムはマイクロ流体電気泳動アッセイシステムであってもよく、また制御部材は内部標準溶液の濃度に基づいて、又は記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルを用いてアッセイ結果を補正する（normalize）ことができる。この制御部材は、電気コンダクタンス測定値を記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって本システムの形状寸法の変動（geometric dimensional variations）に対してアッセイ結果を補正する（normalize）こともできる。
【００１６】
あらかじめ決められた情報は、塩又はイオンの濃度情報を内部標準溶液の濃度と関連付けるデータであってもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；アッセイに先立って緩衝液の電気コンダクタンス（conductance）測定値を求め；そして、電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）こと、を含むアッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法に関する。
【００１８】
さらに、本方法は、電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいて緩衝液の濃度変化を求め；そしてアッセイ結果を補正する（normalizing）ために緩衝液の濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する工程を含んでもよい。
【００１９】
さらに、本補正（ノーマライゼーション：normalization）方法は、電気コンダクタンス（conductance）測定値をあらかじめ決められたデータと比較する工程と；この比較に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）工程を含んでもよい。
【００２０】
前述の一般説明も以下の詳細な説明も例示的なものであり、かつ説明だけを目的とし、請求の範囲に記載されている本発明に制限されるものではない。
【００２１】
添付図面は、本明細書に組み入れられ、その一部となるものであり、本発明の実施態様を示しており、明細書の記載とともに発明の原則を説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は伝導率とＮａＣｌ濃度との関係の例である。
【図２】図２は伝導率と内部標準濃度との関係の例である。
【図３】図３は伝導率対ＮａＣｌ濃度に関するデータの例示的グラフを示す。
【図４】図４は伝導率対ＨｉＬｙｔｅ ＩＳ濃度に関するデータの例示的グラフを示す。
【図５】図５はマイクロチャネルと連結されているウェルを具備するデバイスの例である。
【図６】図６は図５に示されたデバイスと同等の電気回路の例である。
【図７】図７はアッセイシステムの例である。
【図８】図８はＴＢ−ＬＢ電流を使用する補正（normalization）の実施例のグラフである。
【図９】図９はＨＯ−ＬＢ電流を使用する補正（normalization）の実施例のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の本実施態様を詳細に述べて、その実施例を添付図面に示す。可能な限り、同じ又は類似の部品を参照するため、図面全体を通じて同一の参照番号が使用されている。
【００２４】
マイクロ流体デバイス中の蛍光プローブについて測定されたシグナルの補正（normalization）のための蛍光内部標準の使用は、内部標準（ＩＳ）シグナルの安定性不足に苦しんでいる。試料希釈緩衝液や抗体試薬のような試薬又は分離緩衝液が、内部標準を含有する場合、その標準の濃度は、内部標準を保管するために使用される保管容器内での蒸発又は結露の程度に応じて変化する。アッセイを行っている日の間中に、この容器の蓋が外されていた場合、室温での蒸発の程度はきわめて大きく、１ないし２週間の使用で１０％から２０％のオーダーである。これにより、補正（normalization）のためにこの内部標準を使用したアッセイ結果に偏りが生じる。
【００２５】
電気伝導率の測定値又は電気伝導率と蛍光内部標準シグナルとの測定値の組み合せを用いることにより、機器及びチップの変動が試験結果に大きな偏りもたらさないようマイクロ流体アッセイからの蛍光シグナルを補正（normalized）できる。最初の測定値、つまり内部標準含有溶液の電気伝導率を、内部標準の変化を制御及び補正するために使用してもよい。
【００２６】
蒸発又は結露による内部標準溶液の濃度変化は、内部標準溶液の電気伝導率変化と相関している場合もある。ＩＳ溶液電気伝導率は、ＮａＣｌ又は他のイオン緩衝液などの溶液中の緩衝塩の濃度によって支配される。この電気伝導率はＮａＣｌの濃度と比例するため、初期電気伝導率が求まったら、安定電流計が、ＮａＣｌ濃度変化の程度を測定するのに使用できる。ＮａＣｌ濃度変化が分かっている場合、内部標準などの他の緩衝液成分での変化を外挿することが可能である。それによって、マイクロ流体システムの耐用年数の期間中、内部標準濃度を校正することができ、またこのＩＳはアッセイシグナルを補正（normalize）するのに信頼して使用できる。
【００２７】
図１は、この溶液の電気伝導率とＮａＣｌ濃度との関係の例を示す。Ｙ１は測定された伝導率を示し、Ｘ１は測定された伝導率から求めたＮａＣｌ濃度を示す。図２は溶液の伝導率と内部標準の濃度との関係の例を示す。Ｙ２は計算された伝導率を示し、Ｘ２は計算された伝導率から求めた内部標準濃度を示す。
【００２８】
緩衝塩としてＮａＣｌ及び内部標準としてＨｉＬｙｔｅ蛍光色素を使用する実測値を、それぞれ図１及び図２に示す。相対蛍光単位(ＲＦＵ)で測定された場合の様に、緩衝塩とＩＳ濃度との間に伝導率の相関が存在する。緩衝液の最高濃度は、１２５ｍＭ ＮａＣｌおよび８．７５μＭ ＨｉＬｙｔｅ色素を、非イオン界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％含有する水で希釈したものであった。陰性対照はＮａＣｌ及びＨｉＬｙｔｅ色素を含有していない、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する脱イオン水であった。蛍光分光計及び電気伝導率電極によって測定を行った。当該アッセイ濃度時の塩のこれらの濃度における電気伝導率及び蛍光色素は、線形比例であることが示されている。
【００２９】
いくつかの測定試薬の総伝導率を測定する場合、ＩＳ濃度の外挿は間接的となる可能性がある。例として、図５で示されるようなマイクロ流体デバイスを検討することができる。この図では、すべてのウェルは円で示されているが、点の印が付けられたそれぞれ３つのウェルだけが電極を含んでいる。このデバイスはトレーリング緩衝液(ＴＢ)ウェル、リーディング緩衝液(ＬＢ)ウェル、廃液ウェル（ＷＡ）１〜４、及び内部標準試料を収容するＢウェルを含むＡ〜Ｃウェルを具備している。また、ＷＡ４ウェルとＬＢウェルとの間に配置されたハンドオフ（ＨＯ）ウェルが存在する。
【００３０】
図６に示されたマイクロ流体デバイスの電気等価回路は、１つの共通内部ノードに３つの抵抗器が接続されている星形ネットワークの関係で表すことができる。電極を有する３つのウェルは、図６の電気等価回路中の各ノードに対応している。すなわち、ノード１はＴＢウェルに対応し、ノード２はＨＯウェルに対応し、ノード３はＬＢウェルに対応している。ノード１とノード２との間に電圧（Ｖ２−Ｖ１）を印加し、電流を測定することで、抵抗Ｒ１とＲ２の合計を測定できる。
【００３１】
【００３２】
ノード１及び３並びにノード２及び３との間の抵抗Ｒ１３及びＲ２３は、それぞれ同じ方法で測定することができる。３つの抵抗の合計が分かっていれば、抵抗Ｒ１〜Ｒ３の個々の値は以下のように計算できる。
【００３３】
【００３４】
図５に示されたマイクロ流体デバイスに関しては、なんらかの電気試験を行う前に、デバイスは廃液ウェルＷＡを同時に陰圧印加して満たされる、この時、他のウェルは大気圧であるけれども試薬又は緩衝溶液で満たされる。これによって図５に示された注入パターンが作り出される。個々のチャネルセグメントは、１つだけを例外として、ウェルの１つだけを起源とする溶液で満たされる。この例外はスタッキングゾーンと呼ばれるセグメントであり、最後の廃液チャネル交点とハンドオフ交点との間に位置している。そのセグメントは、これら２つの分岐の流体力学伝導率に比例して、ＨＯウェルから来る溶液とＬＢウェルから来る溶液との混合物で満たされる。
【００３５】
各チャネルにおいては、形状（geometry）と、各セグメントを満たす溶液の由来が既知である。ＨＯチャネル（ＨＯウェルとスタッキングゾーンとの間）及びＬＢチャネル（ＬＢウェルと分離ゾーンとの間）においては、これらチャネルの各々はチャネルの終端で個々のウェルから来る溶液で一杯に満たされる。上記の方法に基づいて、これらのチャネルの電気抵抗は以下によって求められる。
【００３６】
【００３７】
式中、Ｌはチャネル長、Ａはチャネルの断面積、σは電気伝導率（conductivity）、Ｒは電気抵抗、及びＧは電気コンダクタンス（conductance）である。チャネルの形状（geometry）が既知のため、ＨＯウェル及びＬＢウェルから来る溶液の実際の伝導率を推定できる。したがって、この測定値は、緩衝液の調製における変動、保管中のエージング、大気中からの二酸化炭素の吸収、及び溶液がウェルにある間の水の蒸発を由来とする伝導率の変動と関連している。
【００３８】
各々のウェルに由来する溶液がチャネルに存在するため、トレーリング緩衝液（ＴＢ）に連結されているチャネルの状況はさらに複雑である。スタッキングゾーンと呼ばれるＨＯ交点に最も近いこのチャネルの断面を検討する。陰圧印加中は、スタッキングゾーンは、以下に示される比率でＨＯウェル溶液とＬＢウェル溶液の混合物で満たされている。
【００３９】
【００４０】
式中、
【００４１】
【００４２】
はＨＯチャネルの流体力学伝導率であり、また
【００４３】
【００４４】
はＬＢチャネルの流体力学伝導率である。電気伝導率は、図３で示すデータのように、溶液のイオン濃度とほぼ比例し、またこれらの濃度は以下の式を求めるべくこれらの注入比に従って混合され、
【００４５】
【００４６】
そして、スタッキングゾーンの既知の形状（geometry）に加えて、この伝導率と共に、スタッキングゾーンの抵抗が以下のように求められる。
【００４７】
【００４８】
ＴＢウェルに連結されたチャネルの総抵抗Ｒ１からこの抵抗を差し引くことにより残りの抵抗の合計が求められる。
【００４９】
【００５０】
式中、右側の抵抗は、それぞれ、ＴＢウェル、ＤＮＡ−Ａｂウェル、試料ウェル、及び標識−Ａｂウェルからの溶液で満たされたチャネルセグメントに対応する。
【００５１】
より多くの電気的接触が欠如しているため、抵抗Ｒｎをさらに成分に細分することはできない。しかしながら、目指すことはチャネル形状（geometry）（特に深さ）による変動及びウェルにおける蒸発を補正することにある。これら両方の要因は、すべての試薬バイアル及びウェルにおいて同一と考えられる蒸発を含めて、チップ全体に共通しているが、その理由は、チップ全体は形状（geometry）が同一で、同一の外部条件に曝されるからである。補正（normalizing）要因として電気コンダクタンスＧｎ＝１／Ｒｎを使用することによってこれはなしうる。
【００５２】
以下の考察において、Ｇｎは試料プラグの実際のコンダクタンスによって最も影響を受けるものであるため、Ｇｎは補正（normalizing）コンダクタンスとしての使用が考えられる。しかしながら、蒸発はすべてのウェルで同様であり、また厚みの変動もデバイス全体を通じて同様であると仮定すると、いかなる測定コンダクタンスも使用可能であろう。たとえば、Ｇ２３＝１／Ｒ２３は上記で確立された意味合いにおいて使用可能であり、これによって構造体のそれぞれのアームの個々のコンダクタンスを引用する必要がなくなる。個々の特定の状況によって何が最善の選択かが分かる。
【００５３】
一般的に、蛍光光学的検出によって観測されるシグナルは、光学的検出容積中に存在する蛍光分子数に比例する。この数は検出容積を掛けた蛍光分子の濃度によって与えられるため、以下の式が得られる。
【００５４】
【００５５】
式中、Ｓはシグナル、f は関与する光ファクタ、入射光の強度、蛍光の効率などのすべてを考慮に入れている比例定数、Ｃは蛍光分子の濃度、及びＶdetectは検出容量である。検出容量Ｖdetectはチャネルの深さＤに比例するため、これは以下のように記述することもできる。
【００５６】
【００５７】
ウェル容量の画分εの蒸発であれば、すべての濃度はファクタ１／（１−ε）だけ増加し、この結果から以下の式が得られる。
【００５８】
【００５９】
式中、Ｃ０は蒸発前の蛍光分子の濃度である。上記のチャネル断面の電気コンダクタンスＧｎはチャネルの深さと蒸発の程度に応じて変化することがある。断面の幅が異なったり、注入される溶液が異なったりするチャネルについては、一般的に以下の式が与えられる。
【００６０】
【００６１】
しかしながら、伝導率は蒸発が起こる時の１／（１−ε）のファクタが掛けられる濃度に比例するため、これは、蒸発が存在する時、以下のように記述することができ、ここで、電気伝導率
【００６２】
【００６３】
は蒸発が起こる前の値である。
【００６４】
【００６５】
上記で示されたＳの式と共に、この式によって、両方の量はチャネルの深さＤと蒸発の程度εの関数として同様に変化することが明らかとなる。したがって、以下の式から、
【００６６】
【００６７】
蒸発前の蛍光分子の濃度と比例し（比例定数f"で示す）、また蒸発の程度及びチャネルの深さとは無関係である量が求められる。この比例定数を更なる分析、較正、標準曲線の確立などに使用することで、精度の向上がもたらされ、また蒸発又はチャネルの深さ変動のような外部の変動要因に依存しなくなる。
【００６８】
既知の検体濃度（Ｃ０）を有する開封直後のキャリブレータを、蛍光シグナル及びＧｎについて測定することでf"が求まる。次にf"は、測定された蛍光シグナル及び電気伝導率比から未知の試料の検体濃度(ＣＸ)を計算するのに使用される。
【００６９】
【００７０】
要約すると、蒸発することで増分だけ塩及び電気伝導率が高くなる場合は、蒸発の割合が、個々の容器とウェルとの間で一定であることが予測される。つまり、測定可能な電気抵抗値又はコンダクタンス値のいずれかが補正（normalization）目的に使用できるということである。これは、実際に試料を含有しないデバイスのセグメントのコンダクタンス値を含む。
【００７１】
本発明で記述された方法は、電流を測定するために電極を用いるマイクロ流体電気泳動アッセイ又は他のアッセイの補正（normalization）に使用してもよい。電流測定値は、蒸発を補正（correct）する目的で内部標準を標準化（standardize）又は補正（mormalize）するために使用できるだけでなく、この電流はチャネルの寸法（dimension）、深さ、及び幅の変動を補正（correct）するためにも使用できる。形状（geometry）におけるマイクロ流体デバイスの変動は、チャネルの深さと幅の変動によって主に起こる。微細加工はしばしば、チャネルを直接形成するためにガラス又はシリコンマスターをエッチングするか、又は熱可塑性高分子（プラスチック）基板にチャネルを生成するのに使用されるモールドを形成するという、シリコン加工技術を含む。これらの技術ではチャネルの形状（geometry）に微妙な変動が生じることもある。
【００７２】
付与されたマイクロ流体チャネルデザインの伝導率は、緩衝液電気伝導率及びチャネルの断面積の関数である。したがって、チャネルの深さ／形状（geometry）と緩衝液が満たされたチャネルネットワークのコンダクタンスとの間にきわめて直接的な関係が存在する。公称断面／伝導率が特定されている場合、その公称値からの偏差はコンダクタンスの測定によって計算することができる。その上、蛍光アッセイのようなチャネル断面に依存しているアッセイからのアッセイシグナルは、開封直後のボトルについて標準電気伝導率を有する標準化アッセイ緩衝液を用いて、チャネルのコンダクタンスを測定することによって補正（normalized）することができる。
【００７３】
本方法では、良く特徴付けられた試薬を含有するシステム及び明確なマイクロ流体デバイスにおける独立したパラメータ、緩衝液コンダクタンスを測定することにより内部標準を補正する（normalize）手段について説明する。新鮮な（fresh）内部標準溶液の伝導率は独自に、又は蒸発のような試薬濃度の均一な変動を受けるシステムの一部として測定してもよい。収集されたコンダクタンス測定値は、蛍光アッセイシグナル測定値のようなマイクロ流体チャネル寸法（dimension）に依存するアッセイシグナルを補正（normalize）するのに使用してもよい。
【００７４】
上記の例示的方法は、図７で概略的に示すようなアッセイシステム１００において実施することができる。例示的なアッセイシステムは、緩衝試薬を収容するためのウェル（その内の１つは内部標準溶液を収容するためのもの）及びこれらのウェルを連結するマイクロチャネルを有する基板１１０；緩衝試薬を含有するウェル間の電気コンダクタンスを測定するためのデバイスなどの回路部材１２０；ウェル間の電気コンダクタンス測定値から緩衝試薬の塩濃度又はイオン濃度を求めるためのＣＰＵなどの制御部材１３０；あらかじめ決められた情報を記憶及び取り出すためのＲＡＭ及びハードディスクなどの記憶部材１４０とを含む。制御部材１３０は、記憶部材１４０のあらかじめ決められた情報に基づいて塩濃度又はイオン濃度から内部標準溶液の濃度を外挿する。
【００７５】
本アッセイシステム１００はマイクロ流体電気泳動システムであってもよく、また制御システム１３０は、内部標準溶液の濃度に基づいて、又は記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルを用いてアッセイ結果を補正（normalize）してもよい。また、制御部材１３０は、電気コンダクタンス測定値を記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって本システムの形状寸法の変動（geometric dimensional variations）についてアッセイ結果を補正（normalize）してもよい。
あらかじめ決められた情報は、塩濃度又はイオン濃度の情報を内部標準溶液の濃度と関連付けるためのデータとしてもよい。
【実施例】
【００７６】
実施例
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）アッセイを、国際公開公報ＷＯ２００７／０２７４９５号の実施例１の記載に準じて、図５で示すマイクロ流体デバイスを使用することにより実施した。以下の実施例では、表１に示した組成の各アッセイ用緩衝液組成物を１００％緩衝濃度として用いた。蛍光末端標識２ｋｂ ＤＮＡを内部標準（ＩＳ）として用いた。
【００７７】
表１：緩衝液組成物
【００７８】
緩衝液組成物の蒸発及び結露の状態をシミュレートするため、各ウェルの緩衝液組成物の濃度を、１０％きざみで８０％から１２０％まで変化させた。実際のアッセイでは、緩衝液濃度は蒸発又は結露によって変化することもあるが、検体試料溶液は使用直前に供給されるため、ＡＦＰ濃度自体は変化しないであろう。したがって、この実験については、ＡＦＰ抗体試料を最終的に１００ｐＭの一定濃度となるように試料緩衝液と混合した。図５を参照すると、個々の実験では、ＩＳを含有する緩衝液組成物を「ＤＮＡ−Ａｂ」ウェルに注入し、ＡＦＰ−Ｌ１を含有する緩衝液組成物を「試料」ウェルに注入し、蛍光標識第２抗ＡＦＰ抗体を含有する緩衝液組成物を「標識−Ａｂ」ウェルに注入し、ＴＢウェル用の緩衝液組成物を「ＴＢ」ウェルに注入し、ＨＯ及びＬＢウェル用の緩衝液組成物を「ＨＯ」ウェル及び「ＬＢ」ウェルに注入し；そしてＷＡ１、ＷＡ２、ＷＡ３及びＷＡ４から陰圧を印加することにより各緩衝液をチャネルに導入した。個々の実験では、緩衝液をキャピラリーチャネルに注入した後、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を実施した。
電気泳動中にキャピラリーチャネルで抗原−抗体反応と分離が起こる。キャピラリーチャネル（分離ゾーン）の特定ポイントで、分離されたＩＳシグナル及び抗原−抗体複合体シグナルが検出された。電気泳動中は、ＴＢウェル−ＬＢウェル間の電流シグナル及びＨＯウェル−ＬＢウェル間の電流シグナルをモニタリングし、それらをＩＳピークを補正（normalize）するのに用いた。
ＩＳピークを以下の式によって補正（normalized）した。
【００７９】
【００８０】
式中、ＩＳSampleは結露又は蒸発が起こっていたと想定されるＩＳピークシグナルを表している。ＡSampleは結露又は蒸発が起こっていた電流を表している。ＡReferenceは結露または蒸発が起こっていない電流を表している。ＩＳNormalizedは測定された電流で補正（normalized）されたＩＳシグナルを表わしている。
【００８１】
ＡＦＰシグナルを以下の式によって補正した。
【００８２】
【００８３】
式中、ＡＦＰSampleは結露又は蒸発が起こっていたと想定されるＡＦＰピークシグナルを表している。ＩＳReferenceは結露又は蒸発が起こっていないＩＳシグナルを表している。ＡＦＰNormalizedはＡＦＰの補正（normalized）シグナルを表している。
【００８４】
様々な測定シグナル及びＴＢ−ＬＢ電流及びＨＯ−ＬＢ電流を使用した補正（normalization）の結果を、以下の表２及び表３に示す。
【００８５】
表２：ＴＢ-ＬＢ電流による補正（normalization）
【００８６】
表３：ＨＯ-ＬＢ電流による補正（normalization）
【００８７】
これらの表の結果がそれぞれ図８及び図９にプロットされている。いずれの場合でも、その対応するＩＳSampleシグナルによる補正（normalization）後のＡＦＰシグナルは、緩衝液のＩＳSample濃度がますます濃縮されるため、緩衝液濃度の上昇に伴って減少する。しかしながら、各緩衝液濃度について、それに対応するＩＳNormalizedシグナルによる補正（normalization）後のＡＦＰシグナルは、１００％緩衝液濃度時のＡＦＰシグナルに近い値である（濃縮又は結露は起こらない）。すなわち、対応する補正（normalized）ＩＳシグナルによって補正（normalized）されるＡＦＰシグナルは平面曲線（flat curve）を与える。実施例は、ＩＳが組み入れられている緩衝液濃度が、たとえば蒸発又は結露などによってたとえ変化しても、このＩＳピークシグナルを適切に補正（normalized）できることを示している。
【００８８】
本発明の他の実施態様は、ここに開示された本発明の明細書及び実施慣行を考察するれば当業者には明らかであろう。この明細書及び実施例は、例示的としてのみを考えたものを意図している。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００６年１２月２８日に提出された米国特許出願Ｎｏ．６０／８８２、５１４の優先権を主張し、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、アッセイの内部標準化（standardization）方法及びそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
蛍光標識されたＤＮＡのような内部標準は、電気泳動アッセイ中のピークを揃える内部標準として、及び蛍光標識された検体ピークからのピークシグナルを補正する（ノーマライズ：normalize）定量的基準マーカーとしても使用できる。検体ピークの強度は、試験試料中の検体の濃度を定量化するために使用されたシグナルである。励起レーザー光強度、光焦点などにおける変動のように、導入試料の容量又は標識の検出感度に影響を与えるアッセイシステム中に変動が存在すると、検体用のシグナルが影響を受けて検体濃度の測定に誤差が生じる。内部標準に対してシグナルを補正する（ノーマライジング：normalizing）ことで、検出感度、試料容量の誤差、及びチップチャネル深度の変動による検出容量の変動のようなチップ変動におけるシステムの変動に対してシグナルをコントロールできる。
【０００４】
内部標準に関わる問題は、内部標準が試料緩衝液又は他の試薬に含まれており、そして例えば、数日間、数週間、又は数月間にも亘る連続操作を対象としたシステムに保管する時、内部標準の濃度を上昇させる又は減少させる蒸発又は結露のために内部標準が変動を受けるであろうことである。毎日、試料緩衝液を取り換えることで解決されるであろうが、利用者にとっては不便でかつ費用がかかる。別の可能な解決策は、試料として実施される外部キャリブレータを具備することである。これを使用することでシステムを較正し、また濃度対応曲線（concentration response curve）を調整することができるが、個々のチップ変動又は個々のアッセイ変動に対して各試験をコントロールすることはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本アッセイシステムは、マイクロ流体電気泳動アッセイシステムのようなシステムに対して内部標準を使用する問題に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本システムを用いることで、蒸発、結露、又はプローブ洗浄液のプローブキャリーオーバーのような要因のための内部標準濃度の変動をコントロールできる。検体シグナルの内部標準による較正（calibration）を補正（correct）するために、試薬が新鮮（fresh）な時の緩衝液伝導率（conductivity）が本システムで使用され得る。緩衝塩は緩衝液伝導率（conductivity）に対する主要な寄与因子であり、これらの塩の蒸発（evaporation）による濃縮又は結露（condensation）による希釈又はプローブキャリーオーバーが緩衝液の伝導率を変化させる。したがって、アッセイに先駆けたチップにおけるこの緩衝伝導率の測定によって、試料緩衝液を含めた、チップを満たすために使用される試薬の蒸発レベルの測定を可能にする。チップチャネル内の電極配置のため、試料緩衝液の伝導率を直接測定できない場合は、試薬成分の内の１つの蒸発レベルを測定し、蒸発の影響を試料緩衝液及び内部標準に外挿することができる。
【０００７】
コンダクタンス（conductance）の変化の測定は、チップ形状の測定としても使用できる。なぜならば、測定されたコンダクタンス（conductance）は緩衝液伝導率、チャネルの長さ及び断面積の関数であるためである。熱可塑性プラスチック材料のフォトリソグラフィー加工又は成形によって作製されたチップのチャネル形状の1つの主要な変数は、深度寸法にあるといえる。前記コンダクタンスを、機器上の基準チップに対する機器上の新しいチップの初期測定値に参照付けることによって、アッセイシグナルを補正して（normalize）、チップ形状のシグナル強度への影響を補正することが可能となり、このシグナル強度への影響は主にチップチャネルの深さと幅であり、そのうち深さは主要な変数となり得る。
【０００８】
このようにして、コンダクタンス測定値は、マイクロ流体電気泳動アッセイで使用される時の有用なパラメータであり、またこれらのアッセイの精度と再現性を向上できる。
【０００９】
本発明に従って、アッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法が提示され、この補正（normalization）方法は、アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；アッセイに先立って緩衝液の電気コンダクタンス（conductance）測定値を求め；電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいて緩衝液の濃度変化を求め；アッセイ結果を補正する（normalizing）ために緩衝液の濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する、ことを含む。
【００１０】
本方法の緩衝液が内部標準のために用意され、複数の成分を含有してもよく、その成分の1つが内部標準溶液である。緩衝液の電気伝導率（conductivity）はこの複数の成分の総電気伝導率である。内部標準溶液の濃度は、緩衝液の濃度変化を外挿することによって求めてもよい。緩衝液の電気伝導率は、緩衝液中の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する。
【００１１】
アッセイに先立って電気伝導率測定値を求める前に、緩衝液の初期濃度及び緩衝液の対応する電気伝導率測定値を求めてもよい。
【００１２】
本方法で述べられるシステムはマイクロ流体電気泳動アッセイシステムであってもよく、本アッセイシステムでは、アッセイ結果は蛍光内部標準シグナル及び内部標準溶液の濃度に基づいて補正（normalized）してもよい。
【００１３】
さらに、本発明は、アッセイシステム内に複数の緩衝液成分を具備し、その成分の内の１つが内部標準溶液を含有し；アッセイに先立って複数の緩衝液成分の電気伝導率測定値を求め；伝導率測定値に基づいて複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの濃度変化を求め；そして、アッセイ結果を補正する（normalizing）ために塩又はイオンの濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する工程を含む、アッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、緩衝液試薬を収容するウェルを有し、そのウェルの内の１つが内部標準溶液を収容するウェルを具備する基板；前記ウェルを連結するマイクロチャネル；緩衝液試薬を収容するウェル間で電気コンダクタンス（conductance）を測定するための回路部材；ウェル間で電気コンダクタンス（conductance）測定値から緩衝液試薬の塩濃度又はイオン濃度を測定するための制御部材；あらかじめ決められた情報を記憶及び取り出す記憶部材を含み；制御部材が記憶部材中のあらかじめ決められた情報に基づいて塩濃度又はイオン濃度から内部標準溶液の濃度を外挿する、アッセイシステムに関する。
【００１５】
本アッセイシステムはマイクロ流体電気泳動アッセイシステムであってもよく、また制御部材は内部標準溶液の濃度に基づいて、又は記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルを用いてアッセイ結果を補正する（normalize）ことができる。この制御部材は、電気コンダクタンス測定値を記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって本システムの形状寸法の変動（geometric dimensional variations）に対してアッセイ結果を補正する（normalize）こともできる。
【００１６】
あらかじめ決められた情報は、塩又はイオンの濃度情報を内部標準溶液の濃度と関連付けるデータであってもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；アッセイに先立って緩衝液の電気コンダクタンス（conductance）測定値を求め；そして、電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）こと、を含むアッセイシステムの補正（ノーマライゼーション：normalization）方法に関する。
【００１８】
さらに、本方法は、電気コンダクタンス（conductance）測定値に基づいて緩衝液の濃度変化を求め；そしてアッセイ結果を補正する（normalizing）ために緩衝液の濃度変化に基づいて内部標準溶液の濃度を決定する工程を含んでもよい。
【００１９】
さらに、本補正（ノーマライゼーション：normalization）方法は、電気コンダクタンス（conductance）測定値をあらかじめ決められたデータと比較する工程と；この比較に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）工程を含んでもよい。
【００２０】
前述の一般説明も以下の詳細な説明も例示的なものであり、かつ説明だけを目的とし、請求の範囲に記載されている本発明に制限されるものではない。
【００２１】
添付図面は、本明細書に組み入れられ、その一部となるものであり、本発明の実施態様を示しており、明細書の記載とともに発明の原則を説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は伝導率とＮａＣｌ濃度との関係の例である。
【図２】図２は伝導率と内部標準濃度との関係の例である。
【図３】図３は伝導率対ＮａＣｌ濃度に関するデータの例示的グラフを示す。
【図４】図４は伝導率対ＨｉＬｙｔｅ ＩＳ濃度に関するデータの例示的グラフを示す。
【図５】図５はマイクロチャネルと連結されているウェルを具備するデバイスの例である。
【図６】図６は図５に示されたデバイスと同等の電気回路の例である。
【図７】図７はアッセイシステムの例である。
【図８】図８はＴＢ−ＬＢ電流を使用する補正（normalization）の実施例のグラフである。
【図９】図９はＨＯ−ＬＢ電流を使用する補正（normalization）の実施例のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の本実施態様を詳細に述べて、その実施例を添付図面に示す。可能な限り、同じ又は類似の部品を参照するため、図面全体を通じて同一の参照番号が使用されている。
【００２４】
マイクロ流体デバイス中の蛍光プローブについて測定されたシグナルの補正（normalization）のための蛍光内部標準の使用は、内部標準（ＩＳ）シグナルの安定性不足に苦しんでいる。試料希釈緩衝液や抗体試薬のような試薬又は分離緩衝液が、内部標準を含有する場合、その標準の濃度は、内部標準を保管するために使用される保管容器内での蒸発又は結露の程度に応じて変化する。アッセイを行っている日の間中に、この容器の蓋が外されていた場合、室温での蒸発の程度はきわめて大きく、１ないし２週間の使用で１０％から２０％のオーダーである。これにより、補正（normalization）のためにこの内部標準を使用したアッセイ結果に偏りが生じる。
【００２５】
電気伝導率の測定値又は電気伝導率と蛍光内部標準シグナルとの測定値の組み合せを用いることにより、機器及びチップの変動が試験結果に大きな偏りもたらさないようマイクロ流体アッセイからの蛍光シグナルを補正（normalized）できる。最初の測定値、つまり内部標準含有溶液の電気伝導率を、内部標準の変化を制御及び補正するために使用してもよい。
【００２６】
蒸発又は結露による内部標準溶液の濃度変化は、内部標準溶液の電気伝導率変化と相関している場合もある。ＩＳ溶液電気伝導率は、ＮａＣｌ又は他のイオン緩衝液などの溶液中の緩衝塩の濃度によって支配される。この電気伝導率はＮａＣｌの濃度と比例するため、初期電気伝導率が求まったら、安定電流計が、ＮａＣｌ濃度変化の程度を測定するのに使用できる。ＮａＣｌ濃度変化が分かっている場合、内部標準などの他の緩衝液成分での変化を外挿することが可能である。それによって、マイクロ流体システムの耐用年数の期間中、内部標準濃度を校正することができ、またこのＩＳはアッセイシグナルを補正（normalize）するのに信頼して使用できる。
【００２７】
図１は、この溶液の電気伝導率とＮａＣｌ濃度との関係の例を示す。Ｙ１は測定された伝導率を示し、Ｘ１は測定された伝導率から求めたＮａＣｌ濃度を示す。図２は溶液の伝導率と内部標準の濃度との関係の例を示す。Ｙ２は計算された伝導率を示し、Ｘ２は計算された伝導率から求めた内部標準濃度を示す。
【００２８】
緩衝塩としてＮａＣｌ及び内部標準としてＨｉＬｙｔｅ蛍光色素を使用する実測値を、それぞれ図１及び図２に示す。相対蛍光単位(ＲＦＵ)で測定された場合の様に、緩衝塩とＩＳ濃度との間に伝導率の相関が存在する。緩衝液の最高濃度は、１２５ｍＭ ＮａＣｌおよび８．７５μＭ ＨｉＬｙｔｅ色素を、非イオン界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％含有する水で希釈したものであった。陰性対照はＮａＣｌ及びＨｉＬｙｔｅ色素を含有していない、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する脱イオン水であった。蛍光分光計及び電気伝導率電極によって測定を行った。当該アッセイ濃度時の塩のこれらの濃度における電気伝導率及び蛍光色素は、線形比例であることが示されている。
【００２９】
いくつかの測定試薬の総伝導率を測定する場合、ＩＳ濃度の外挿は間接的となる可能性がある。例として、図５で示されるようなマイクロ流体デバイスを検討することができる。この図では、すべてのウェルは円で示されているが、点の印が付けられたそれぞれ３つのウェルだけが電極を含んでいる。このデバイスはトレーリング緩衝液(ＴＢ)ウェル、リーディング緩衝液(ＬＢ)ウェル、廃液ウェル（ＷＡ）１〜４、及び内部標準試料を収容するＢウェルを含むＡ〜Ｃウェルを具備している。また、ＷＡ４ウェルとＬＢウェルとの間に配置されたハンドオフ（ＨＯ）ウェルが存在する。
【００３０】
図６に示されたマイクロ流体デバイスの電気等価回路は、１つの共通内部ノードに３つの抵抗器が接続されている星形ネットワークの関係で表すことができる。電極を有する３つのウェルは、図６の電気等価回路中の各ノードに対応している。すなわち、ノード１はＴＢウェルに対応し、ノード２はＨＯウェルに対応し、ノード３はＬＢウェルに対応している。ノード１とノード２との間に電圧（Ｖ２−Ｖ１）を印加し、電流を測定することで、抵抗Ｒ１とＲ２の合計を測定できる。
【００３１】
【００３２】
ノード１及び３並びにノード２及び３との間の抵抗Ｒ１３及びＲ２３は、それぞれ同じ方法で測定することができる。３つの抵抗の合計が分かっていれば、抵抗Ｒ１〜Ｒ３の個々の値は以下のように計算できる。
【００３３】
【００３４】
図５に示されたマイクロ流体デバイスに関しては、なんらかの電気試験を行う前に、デバイスは廃液ウェルＷＡを同時に陰圧印加して満たされる、この時、他のウェルは大気圧であるけれども試薬又は緩衝溶液で満たされる。これによって図５に示された注入パターンが作り出される。個々のチャネルセグメントは、１つだけを例外として、ウェルの１つだけを起源とする溶液で満たされる。この例外はスタッキングゾーンと呼ばれるセグメントであり、最後の廃液チャネル交点とハンドオフ交点との間に位置している。そのセグメントは、これら２つの分岐の流体力学伝導率に比例して、ＨＯウェルから来る溶液とＬＢウェルから来る溶液との混合物で満たされる。
【００３５】
各チャネルにおいては、形状（geometry）と、各セグメントを満たす溶液の由来が既知である。ＨＯチャネル（ＨＯウェルとスタッキングゾーンとの間）及びＬＢチャネル（ＬＢウェルと分離ゾーンとの間）においては、これらチャネルの各々はチャネルの終端で個々のウェルから来る溶液で一杯に満たされる。上記の方法に基づいて、これらのチャネルの電気抵抗は以下によって求められる。
【００３６】
【００３７】
式中、Ｌはチャネル長、Ａはチャネルの断面積、σは電気伝導率（conductivity）、Ｒは電気抵抗、及びＧは電気コンダクタンス（conductance）である。チャネルの形状（geometry）が既知のため、ＨＯウェル及びＬＢウェルから来る溶液の実際の伝導率を推定できる。したがって、この測定値は、緩衝液の調製における変動、保管中のエージング、大気中からの二酸化炭素の吸収、及び溶液がウェルにある間の水の蒸発を由来とする伝導率の変動と関連している。
【００３８】
各々のウェルに由来する溶液がチャネルに存在するため、トレーリング緩衝液（ＴＢ）に連結されているチャネルの状況はさらに複雑である。スタッキングゾーンと呼ばれるＨＯ交点に最も近いこのチャネルの断面を検討する。陰圧印加中は、スタッキングゾーンは、以下に示される比率でＨＯウェル溶液とＬＢウェル溶液の混合物で満たされている。
【００３９】
【００４０】
式中、
【００４１】
【００４２】
はＨＯチャネルの流体力学伝導率であり、また
【００４３】
【００４４】
はＬＢチャネルの流体力学伝導率である。電気伝導率は、図３で示すデータのように、溶液のイオン濃度とほぼ比例し、またこれらの濃度は以下の式を求めるべくこれらの注入比に従って混合され、
【００４５】
【００４６】
そして、スタッキングゾーンの既知の形状（geometry）に加えて、この伝導率と共に、スタッキングゾーンの抵抗が以下のように求められる。
【００４７】
【００４８】
ＴＢウェルに連結されたチャネルの総抵抗Ｒ１からこの抵抗を差し引くことにより残りの抵抗の合計が求められる。
【００４９】
【００５０】
式中、右側の抵抗は、それぞれ、ＴＢウェル、ＤＮＡ−Ａｂウェル、試料ウェル、及び標識−Ａｂウェルからの溶液で満たされたチャネルセグメントに対応する。
【００５１】
より多くの電気的接触が欠如しているため、抵抗Ｒｎをさらに成分に細分することはできない。しかしながら、目指すことはチャネル形状（geometry）（特に深さ）による変動及びウェルにおける蒸発を補正することにある。これら両方の要因は、すべての試薬バイアル及びウェルにおいて同一と考えられる蒸発を含めて、チップ全体に共通しているが、その理由は、チップ全体は形状（geometry）が同一で、同一の外部条件に曝されるからである。補正（normalizing）要因として電気コンダクタンスＧｎ＝１／Ｒｎを使用することによってこれはなしうる。
【００５２】
以下の考察において、Ｇｎは試料プラグの実際のコンダクタンスによって最も影響を受けるものであるため、Ｇｎは補正（normalizing）コンダクタンスとしての使用が考えられる。しかしながら、蒸発はすべてのウェルで同様であり、また厚みの変動もデバイス全体を通じて同様であると仮定すると、いかなる測定コンダクタンスも使用可能であろう。たとえば、Ｇ２３＝１／Ｒ２３は上記で確立された意味合いにおいて使用可能であり、これによって構造体のそれぞれのアームの個々のコンダクタンスを引用する必要がなくなる。個々の特定の状況によって何が最善の選択かが分かる。
【００５３】
一般的に、蛍光光学的検出によって観測されるシグナルは、光学的検出容積中に存在する蛍光分子数に比例する。この数は検出容積を掛けた蛍光分子の濃度によって与えられるため、以下の式が得られる。
【００５４】
【００５５】
式中、Ｓはシグナル、f は関与する光ファクタ、入射光の強度、蛍光の効率などのすべてを考慮に入れている比例定数、Ｃは蛍光分子の濃度、及びＶdetectは検出容量である。検出容量Ｖdetectはチャネルの深さＤに比例するため、これは以下のように記述することもできる。
【００５６】
【００５７】
ウェル容量の画分εの蒸発であれば、すべての濃度はファクタ１／（１−ε）だけ増加し、この結果から以下の式が得られる。
【００５８】
【００５９】
式中、Ｃ０は蒸発前の蛍光分子の濃度である。上記のチャネル断面の電気コンダクタンスＧｎはチャネルの深さと蒸発の程度に応じて変化することがある。断面の幅が異なったり、注入される溶液が異なったりするチャネルについては、一般的に以下の式が与えられる。
【００６０】
【００６１】
しかしながら、伝導率は蒸発が起こる時の１／（１−ε）のファクタが掛けられる濃度に比例するため、これは、蒸発が存在する時、以下のように記述することができ、ここで、電気伝導率
【００６２】
【００６３】
は蒸発が起こる前の値である。
【００６４】
【００６５】
上記で示されたＳの式と共に、この式によって、両方の量はチャネルの深さＤと蒸発の程度εの関数として同様に変化することが明らかとなる。したがって、以下の式から、
【００６６】
【００６７】
蒸発前の蛍光分子の濃度と比例し（比例定数f"で示す）、また蒸発の程度及びチャネルの深さとは無関係である量が求められる。この比例定数を更なる分析、較正、標準曲線の確立などに使用することで、精度の向上がもたらされ、また蒸発又はチャネルの深さ変動のような外部の変動要因に依存しなくなる。
【００６８】
既知の検体濃度（Ｃ０）を有する開封直後のキャリブレータを、蛍光シグナル及びＧｎについて測定することでf"が求まる。次にf"は、測定された蛍光シグナル及び電気伝導率比から未知の試料の検体濃度(ＣＸ)を計算するのに使用される。
【００６９】
【００７０】
要約すると、蒸発することで増分だけ塩及び電気伝導率が高くなる場合は、蒸発の割合が、個々の容器とウェルとの間で一定であることが予測される。つまり、測定可能な電気抵抗値又はコンダクタンス値のいずれかが補正（normalization）目的に使用できるということである。これは、実際に試料を含有しないデバイスのセグメントのコンダクタンス値を含む。
【００７１】
本発明で記述された方法は、電流を測定するために電極を用いるマイクロ流体電気泳動アッセイ又は他のアッセイの補正（normalization）に使用してもよい。電流測定値は、蒸発を補正（correct）する目的で内部標準を標準化（standardize）又は補正（mormalize）するために使用できるだけでなく、この電流はチャネルの寸法（dimension）、深さ、及び幅の変動を補正（correct）するためにも使用できる。形状（geometry）におけるマイクロ流体デバイスの変動は、チャネルの深さと幅の変動によって主に起こる。微細加工はしばしば、チャネルを直接形成するためにガラス又はシリコンマスターをエッチングするか、又は熱可塑性高分子（プラスチック）基板にチャネルを生成するのに使用されるモールドを形成するという、シリコン加工技術を含む。これらの技術ではチャネルの形状（geometry）に微妙な変動が生じることもある。
【００７２】
付与されたマイクロ流体チャネルデザインの伝導率は、緩衝液電気伝導率及びチャネルの断面積の関数である。したがって、チャネルの深さ／形状（geometry）と緩衝液が満たされたチャネルネットワークのコンダクタンスとの間にきわめて直接的な関係が存在する。公称断面／伝導率が特定されている場合、その公称値からの偏差はコンダクタンスの測定によって計算することができる。その上、蛍光アッセイのようなチャネル断面に依存しているアッセイからのアッセイシグナルは、開封直後のボトルについて標準電気伝導率を有する標準化アッセイ緩衝液を用いて、チャネルのコンダクタンスを測定することによって補正（normalized）することができる。
【００７３】
本方法では、良く特徴付けられた試薬を含有するシステム及び明確なマイクロ流体デバイスにおける独立したパラメータ、緩衝液コンダクタンスを測定することにより内部標準を補正する（normalize）手段について説明する。新鮮な（fresh）内部標準溶液の伝導率は独自に、又は蒸発のような試薬濃度の均一な変動を受けるシステムの一部として測定してもよい。収集されたコンダクタンス測定値は、蛍光アッセイシグナル測定値のようなマイクロ流体チャネル寸法（dimension）に依存するアッセイシグナルを補正（normalize）するのに使用してもよい。
【００７４】
上記の例示的方法は、図７で概略的に示すようなアッセイシステム１００において実施することができる。例示的なアッセイシステムは、緩衝試薬を収容するためのウェル（その内の１つは内部標準溶液を収容するためのもの）及びこれらのウェルを連結するマイクロチャネルを有する基板１１０；緩衝試薬を含有するウェル間の電気コンダクタンスを測定するためのデバイスなどの回路部材１２０；ウェル間の電気コンダクタンス測定値から緩衝試薬の塩濃度又はイオン濃度を求めるためのＣＰＵなどの制御部材１３０；あらかじめ決められた情報を記憶及び取り出すためのＲＡＭ及びハードディスクなどの記憶部材１４０とを含む。制御部材１３０は、記憶部材１４０のあらかじめ決められた情報に基づいて塩濃度又はイオン濃度から内部標準溶液の濃度を外挿する。
【００７５】
本アッセイシステム１００はマイクロ流体電気泳動システムであってもよく、また制御システム１３０は、内部標準溶液の濃度に基づいて、又は記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルを用いてアッセイ結果を補正（normalize）してもよい。また、制御部材１３０は、電気コンダクタンス測定値を記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって本システムの形状寸法の変動（geometric dimensional variations）についてアッセイ結果を補正（normalize）してもよい。
あらかじめ決められた情報は、塩濃度又はイオン濃度の情報を内部標準溶液の濃度と関連付けるためのデータとしてもよい。
【実施例】
【００７６】
実施例
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）アッセイを、国際公開公報ＷＯ２００７／０２７４９５号の実施例１の記載に準じて、図５で示すマイクロ流体デバイスを使用することにより実施した。以下の実施例では、表１に示した組成の各アッセイ用緩衝液組成物を１００％緩衝濃度として用いた。蛍光末端標識２ｋｂ ＤＮＡを内部標準（ＩＳ）として用いた。
【００７７】
表１：緩衝液組成物
【００７８】
緩衝液組成物の蒸発及び結露の状態をシミュレートするため、各ウェルの緩衝液組成物の濃度を、１０％きざみで８０％から１２０％まで変化させた。実際のアッセイでは、緩衝液濃度は蒸発又は結露によって変化することもあるが、検体試料溶液は使用直前に供給されるため、ＡＦＰ濃度自体は変化しないであろう。したがって、この実験については、ＡＦＰ抗体試料を最終的に１００ｐＭの一定濃度となるように試料緩衝液と混合した。図５を参照すると、個々の実験では、ＩＳを含有する緩衝液組成物を「ＤＮＡ−Ａｂ」ウェルに注入し、ＡＦＰ−Ｌ１を含有する緩衝液組成物を「試料」ウェルに注入し、蛍光標識第２抗ＡＦＰ抗体を含有する緩衝液組成物を「標識−Ａｂ」ウェルに注入し、ＴＢウェル用の緩衝液組成物を「ＴＢ」ウェルに注入し、ＨＯ及びＬＢウェル用の緩衝液組成物を「ＨＯ」ウェル及び「ＬＢ」ウェルに注入し；そしてＷＡ１、ＷＡ２、ＷＡ３及びＷＡ４から陰圧を印加することにより各緩衝液をチャネルに導入した。個々の実験では、緩衝液をキャピラリーチャネルに注入した後、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を実施した。
電気泳動中にキャピラリーチャネルで抗原−抗体反応と分離が起こる。キャピラリーチャネル（分離ゾーン）の特定ポイントで、分離されたＩＳシグナル及び抗原−抗体複合体シグナルが検出された。電気泳動中は、ＴＢウェル−ＬＢウェル間の電流シグナル及びＨＯウェル−ＬＢウェル間の電流シグナルをモニタリングし、それらをＩＳピークを補正（normalize）するのに用いた。
ＩＳピークを以下の式によって補正（normalized）した。
【００７９】
【００８０】
式中、ＩＳSampleは結露又は蒸発が起こっていたと想定されるＩＳピークシグナルを表している。ＡSampleは結露又は蒸発が起こっていた電流を表している。ＡReferenceは結露または蒸発が起こっていない電流を表している。ＩＳNormalizedは測定された電流で補正（normalized）されたＩＳシグナルを表わしている。
【００８１】
ＡＦＰシグナルを以下の式によって補正した。
【００８２】
【００８３】
式中、ＡＦＰSampleは結露又は蒸発が起こっていたと想定されるＡＦＰピークシグナルを表している。ＩＳReferenceは結露又は蒸発が起こっていないＩＳシグナルを表している。ＡＦＰNormalizedはＡＦＰの補正（normalized）シグナルを表している。
【００８４】
様々な測定シグナル及びＴＢ−ＬＢ電流及びＨＯ−ＬＢ電流を使用した補正（normalization）の結果を、以下の表２及び表３に示す。
【００８５】
表２：ＴＢ-ＬＢ電流による補正（normalization）
【００８６】
表３：ＨＯ-ＬＢ電流による補正（normalization）
【００８７】
これらの表の結果がそれぞれ図８及び図９にプロットされている。いずれの場合でも、その対応するＩＳSampleシグナルによる補正（normalization）後のＡＦＰシグナルは、緩衝液のＩＳSample濃度がますます濃縮されるため、緩衝液濃度の上昇に伴って減少する。しかしながら、各緩衝液濃度について、それに対応するＩＳNormalizedシグナルによる補正（normalization）後のＡＦＰシグナルは、１００％緩衝液濃度時のＡＦＰシグナルに近い値である（濃縮又は結露は起こらない）。すなわち、対応する補正（normalized）ＩＳシグナルによって補正（normalized）されるＡＦＰシグナルは平面曲線（flat curve）を与える。実施例は、ＩＳが組み入れられている緩衝液濃度が、たとえば蒸発又は結露などによってたとえ変化しても、このＩＳピークシグナルを適切に補正（normalized）できることを示している。
【００８８】
本発明の他の実施態様は、ここに開示された本発明の明細書及び実施慣行を考察するれば当業者には明らかであろう。この明細書及び実施例は、例示的としてのみを考えたものを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；
アッセイに先立って前記緩衝液の電気伝導率測定値を求め；
前記電気伝導率測定値に基づいて前記緩衝液の濃度変化を求め；
アッセイ結果を基準化するために前記緩衝液の前記濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定する。
【請求項２】
前記緩衝液が内部標準のために用意される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液は複数の成分を含み、その成分の内の１つが内部標準溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液は複数の成分を含み、その成分の内の１つが前記内部標準溶液であり；そして前記緩衝液の電気伝導率測定値は前記複数の成分の総電気伝導率である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内部標準溶液の濃度は前記緩衝液の前記濃度変化を外挿することによって求められる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝液の前記電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、アッセイに先立って前記電気伝導率測定値を求める前に、前記緩衝液の初期濃度及び対応する前記緩衝液の電気伝導率測定値を求めることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アッセイ結果は、蛍光内部標準シグナル及び前記内部標準溶液の濃度に基づいて補正される（normalized）、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
アッセイシステム内に複数の緩衝液成分を具備し、その成分の内の１つが内部標準溶液を含有し；
アッセイに先立って前記複数の緩衝液成分の電気伝導率測定値を求め；
前記電気伝導率測定値に基づいて前記複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの濃度変化を求め；
アッセイ結果を補正する（normalizing）ために塩又はイオンの前記濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定する。
【請求項１１】
前記緩衝液成分の前記電気伝導率測定値は、前記緩衝液成分の総電気伝導率測定値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記内部標準溶液の濃度は、前記複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの前記濃度変化を外挿することによって求められる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液の電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
さらに、アッセイに先立って前記電気伝導率測定値を求める前に、前記緩衝液成分の初期濃度及び前記緩衝液成分の対応する電気伝導率測定値をあらかじめ決めることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アッセイ結果は蛍光内部標準シグナル及び内部標準溶液の濃度に基づいて補正される（normalized）、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
以下の構成を有するアッセイシステム、
緩衝液試薬を収容するウェルを有し、そのウェルの内の１つが内部標準溶液を収容するウェルを具備する基板；
前記緩衝液試薬を収容する前記ウェル間で電気伝導率を測定するための回路部材；
前記ウェル間で電気伝導率測定値から前記緩衝液試薬の塩濃度又はイオン濃度を測定するための制御部材；
あらかじめ決められた情報を記憶する記憶部材を含み；
前記制御部材が前記記憶部材中のあらかじめ決められた情報に基づいて前記塩濃度又はイオン濃度から前記内部標準溶液の濃度を外挿する。
【請求項１８】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
前記制御部材は前記内部標準溶液の濃度に基づいてアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
前記制御部材は前記内部標準溶液の濃度及び前記記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルに基づいてアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
あらかじめ決められた情報は、塩濃度情報又はイオン濃度情報を前記内部標準溶液の濃度と関連付けるデータである、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２２】
前記制御部材は、電気伝導率測定値を前記記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって前記システムの形状寸法の変動に対してアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
前記アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；
アッセイに先立って前記緩衝液の電気伝導率測定値を求め；そして、
前記電気伝導率測定値に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）。
【請求項２４】
さらに、前記電気伝導率測定値に基づいて前記緩衝液の濃度変化を求め；
前記アッセイ結果を補正する（normalizing）ために前記緩衝液の濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定すること、を含む請求項２３に記載の補正（normalization）方法。
【請求項２５】
さらに、前記電気伝導率測定値をあらかじめ決められたデータと比較し；そして、
その比較に基づいて前記アッセイ結果を補正する（normalizing）ことを、含む請求項２３に記載の補正（normalization）方法。
【請求項１】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；
アッセイに先立って前記緩衝液の電気伝導率測定値を求め；
前記電気伝導率測定値に基づいて前記緩衝液の濃度変化を求め；
アッセイ結果を基準化するために前記緩衝液の前記濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定する。
【請求項２】
前記緩衝液が内部標準のために用意される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液は複数の成分を含み、その成分の内の１つが内部標準溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液は複数の成分を含み、その成分の内の１つが前記内部標準溶液であり；そして前記緩衝液の電気伝導率測定値は前記複数の成分の総電気伝導率である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内部標準溶液の濃度は前記緩衝液の前記濃度変化を外挿することによって求められる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝液の前記電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、アッセイに先立って前記電気伝導率測定値を求める前に、前記緩衝液の初期濃度及び対応する前記緩衝液の電気伝導率測定値を求めることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アッセイ結果は、蛍光内部標準シグナル及び前記内部標準溶液の濃度に基づいて補正される（normalized）、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
アッセイシステム内に複数の緩衝液成分を具備し、その成分の内の１つが内部標準溶液を含有し；
アッセイに先立って前記複数の緩衝液成分の電気伝導率測定値を求め；
前記電気伝導率測定値に基づいて前記複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの濃度変化を求め；
アッセイ結果を補正する（normalizing）ために塩又はイオンの前記濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定する。
【請求項１１】
前記緩衝液成分の前記電気伝導率測定値は、前記緩衝液成分の総電気伝導率測定値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記内部標準溶液の濃度は、前記複数の緩衝液成分内の塩又はイオンの前記濃度変化を外挿することによって求められる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液の電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
さらに、アッセイに先立って前記電気伝導率測定値を求める前に、前記緩衝液成分の初期濃度及び前記緩衝液成分の対応する電気伝導率測定値をあらかじめ決めることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アッセイ結果は蛍光内部標準シグナル及び内部標準溶液の濃度に基づいて補正される（normalized）、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
以下の構成を有するアッセイシステム、
緩衝液試薬を収容するウェルを有し、そのウェルの内の１つが内部標準溶液を収容するウェルを具備する基板；
前記緩衝液試薬を収容する前記ウェル間で電気伝導率を測定するための回路部材；
前記ウェル間で電気伝導率測定値から前記緩衝液試薬の塩濃度又はイオン濃度を測定するための制御部材；
あらかじめ決められた情報を記憶する記憶部材を含み；
前記制御部材が前記記憶部材中のあらかじめ決められた情報に基づいて前記塩濃度又はイオン濃度から前記内部標準溶液の濃度を外挿する。
【請求項１８】
前記システムがマイクロ流体電気泳動アッセイシステムである、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
前記制御部材は前記内部標準溶液の濃度に基づいてアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
前記制御部材は前記内部標準溶液の濃度及び前記記憶部材に記憶された蛍光内部標準シグナルに基づいてアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
あらかじめ決められた情報は、塩濃度情報又はイオン濃度情報を前記内部標準溶液の濃度と関連付けるデータである、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２２】
前記制御部材は、電気伝導率測定値を前記記憶部材に記憶された標準情報と比較することによって前記システムの形状寸法の変動に対してアッセイ結果を補正する（normalize）、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
以下の構成を有するアッセイシステムの補正（normalization）方法、
前記アッセイシステム内に内部標準溶液を含有する緩衝液を具備し；
アッセイに先立って前記緩衝液の電気伝導率測定値を求め；そして、
前記電気伝導率測定値に基づいてアッセイ結果を補正する（normalizing）。
【請求項２４】
さらに、前記電気伝導率測定値に基づいて前記緩衝液の濃度変化を求め；
前記アッセイ結果を補正する（normalizing）ために前記緩衝液の濃度変化に基づいて前記内部標準溶液の濃度を決定すること、を含む請求項２３に記載の補正（normalization）方法。
【請求項２５】
さらに、前記電気伝導率測定値をあらかじめ決められたデータと比較し；そして、
その比較に基づいて前記アッセイ結果を補正する（normalizing）ことを、含む請求項２３に記載の補正（normalization）方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５１５０５３（Ｐ２０１０−５１５０５３Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４１２４（Ｐ２００９−５４４１２４）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６５２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２６７０
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６５２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２６７０
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
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