アッセイ
本開示は、前立腺がんの診断／予後判定アッセイに関し、これには、前記アッセイに用いられるキットが含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がんの診断／予後判定アッセイに関し、これには、前記アッセイに用いるキットが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、１つまたは複数の細胞集団の制御されない増殖が正常な生物学的機能に干渉する異常な疾患状態である。増殖の変化は、あまり組織的でない状態への逆戻りを含む、細胞特性のその他の変化を通常伴う。がん細胞は、典型的には、「形質転換している」といわれる。形質転換している細胞は、全般的に、以下の特性のいくつかを示す：球状の形態、胎児性抗原の発現、増殖因子非依存性、接触阻害の欠如、足場非依存性および高い密度までの増殖。がん細胞は腫瘍を形成し、「原発」または「続発」腫瘍とよばれる。原発腫瘍は、元の形質転換している細胞が発達する臓器におけるがん細胞増殖をもたらす。続発腫瘍は、原発腫瘍からのがん細胞の逸脱および別の臓器での続発腫瘍の確立に起因する。この過程は、転移とよばれ、この過程は、例えば肝細胞がんまたは肺がんでの場合のように侵襲性であり得る。前立腺がんは、比較的有害でないかまたは非常に侵襲性であることがある。いくつかの前立腺腫瘍は、緩慢に成長し、ほとんど臨床症状を引き起こさない。侵襲性前立腺腫瘍は、リンパ節およびその他の臓器、特に骨に迅速に広がる。前立腺がんの成長は、テストステロンのような男性ホルモンの供給を遮断することにより阻害できることが知られている。しかし、前立腺がんは、結局は発達し、男性ホルモンに非依存性になる（すなわち、これらは、アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞になる）。これらの細胞は、侵襲性で悪性の前立腺がんと関連する。前立腺がんに罹患するのは、イヌおよびヒトの２種だけである。
【０００３】
以前の研究は、上皮組織の細胞周期過程における重要な制御因子としてミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）を同定している（ＷＯ９９／２１０１４およびＧｏｎｚａｌｅｚら；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｎｃｅｒ、第５巻：１３５〜１４１頁、２００５年２月を参照されたい）。ＭＣＭは、「細胞周期状態」、すなわち細胞が、静止状態または老化しているよりもむしろ増殖できるかどうかの有用なバイオマーカーとして同定された。６つ全てのＭＣＭ（ＭＣＭ２〜７）の発現が、細胞周期の全ての段階にわたって見られ、細胞周期から出て静止状態、分化または老化へ入った後に下方制御される。アンドロゲン受容体［ＡＲ］は、アンドロゲンであるテストステロンおよびジヒドロテストステロンと結合する核タンパク質である。ＡＲは、転写因子であり、男性の性決定に関与する遺伝子の制御に関与する。ＡＲのクローニングおよび配列決定はＷＯ８９／０９７９１に開示され、これは、原核および真核の発現系におけるＡＲの発現と、モノクローナル抗体の開発におけるその使用とについて記載している。前立腺がんを検出するための診断試験としてのＰＳＡの検出は、よく確立されている。ＰＳＡは、前立腺の細胞により分泌されるプロテアーゼである。血液試料中のＰＳＡの検出は、対象における前立腺がんを示すとみなされる。これは、対象がさらなる調査を必要とするかどうかを明確に同定することに関連するかなりの問題を有する。ＰＳＡの高い血清レベルを示す対象の一部は、疾患を有さないことが結局は見出される。このことは、精神的ストレスと不必要な身体調査との両方を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々は、生体試料からの単離細胞試料中の前立腺がん細胞の検出の信頼できる検査を提供し、男性の対象の血清試料中の前立腺特異抗原の検出に関連する現在の問題点を取り除くアッセイを開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のある態様によると、生体試料中の前立腺がん細胞を検出するための診断または予後判定の方法であって、
ｉ）前記生体試料から単離細胞試料を得て、単離細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、
ｉｉ）単離細胞試料を、核受容体ポリペプチドと特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉｉ）単離細胞試料を、前立腺特異抗原［ＰＳＡ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）２つ以上の結合剤の結合を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、２つ以上の結合剤と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、生体試料中の前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含む方法が提供される。
【０００６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の核受容体ポリペプチドは、アンドロゲン受容体ポリペプチド（ＡＲ）である。
【０００７】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７ポリペプチドからなる群より選択される。
【０００８】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である。
【０００９】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２である。
【００１０】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ７である。
【００１１】
本発明のさらなる好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である。
【００１２】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の細胞試料を、ＡＲと特異的に結合する結合剤およびＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させる。
【００１３】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のアッセイは、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチド、ＡＲおよびＰＳＡを検出する。
【００１４】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のアッセイは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７、ＡＲならびにＰＳＡを検出する。
【００１５】
本発明の好ましいアッセイでは、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、逆である。
【００１６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の結合剤は、モノクローナル抗体またはその活性結合断片である。
【００１７】
このアッセイが、対象が前立腺がんに対する素因を有するか否かを決定するための診断ツールを提供することが明らかである。このアッセイは、診断され、療法、例えば化学療法または放射線療法を受ける対象が、治療に応答しているか、またはさらなるもしくは代替の治療計画を必要とするかを決定する手段も提供する。本発明は、よって、対象の疾患をよりよく管理するための対象のための治療計画を提供する。
【００１８】
本発明の好ましい方法では、上記の生体試料は、単離体液、例えば尿、精液または精漿の試料である。
【００１９】
生体試料は、典型的に、試料の分解を低減し、選択されたマーカーの発現の信頼できる尺度を提供するために、迅速に処理される。例えば、試料は冷却され［例えば４℃］、採取してから少なくとも１時間以内に処理される。
【００２０】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の生体試料は、ろ過され、上記のろ過された試料は、上記の単離細胞試料を提供する。
【００２１】
本発明の実行において有用なろ過デバイスの例は、参照により組み込まれているＷＯ２００９／０８７３７５において本出願人により開示されている。このろ過デバイスは、所定のサイズの細胞を回収するように適合されたフィルタと、フィルタへおよびフィルタから流体を伝達するように配置された流体経路と、流体経路に沿ってフィルタへ流体を送る陽圧および流体経路に沿ってフィルタから流体を引き出す陰圧をもたらすポンプとを含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様によると、対象における前立腺がんを決定するための診断または予後判定アッセイであって、
ｉ）第１単離生体試料を得て、試料を、ＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉ）上記の試料中のＰＳＡの存在を検出するステップと、
ｉｉｉ）対象から第２生体試料を得て、単離細胞試料を調製して、前記細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体ポリペプチドと特異的に結合する第１および第２の結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）前記ＭＣＭポリペプチド［複数可］およびアンドロゲン受容体の存在を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、ＭＣＭおよびアンドロゲン受容体の両方と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイが提供される。
【００２３】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の第１生体試料は、血清を含む。
【００２４】
本発明のさらなる好ましいアッセイでは、上記の第２生体試料は、尿または精液である。
【００２５】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である。
【００２６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２である。
【００２７】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ７である。
【００２８】
本発明の好ましいアッセイでは、結合剤の上記の検出は、蛍光放射による。
【００２９】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、結合剤の上記の検出は、酵素的手段による。
【００３０】
正常試料および試験試料に対する抗体などの特異的結合剤の結合は、任意の適当な手段により決定してよい。標識は、蛍光色素、燐光体、または分光的に孤立した吸収もしくは放射特徴を有するレーザ色素を含む。適切な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドを含む。適切な色素産生性色素は、ジアミノベンジジンを含む。その他の標識は、巨大分子コロイド粒子または着色、磁性もしくは常磁性であるラテックスビーズなどの微粒子物質、および視覚的に観察されるか、電気的に検出されるかもしくはそうでなければ記録される検出可能なシグナルを直接的または間接的に引き起こすことができる生物学的あるいは化学的に活性な物質を含む。これらの分子は、例えば、色を発生するかもしくは変化させるか、または電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってよい。これらは、分子的に励起して、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的な分光的吸収または放射をもたらすことができる。これらは、バイオセンサに関連して用いられる化学的実体を含んでよい。以下に記載する実施例では、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼを採用している。
【００３１】
本発明のさらなる態様によると、第１、第２および第３の結合剤を含むキットであって、前記結合剤が、それぞれＭＣＭポリペプチド、アンドロゲン受容体ポリペプチドおよび前立腺特異抗原ポリペプチドと結合するキットが提供される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、上記の結合剤は、モノクローナル抗体である。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記のキットは、上記の第１、第２および第３モノクローナル抗体と結合する２次抗体をさらに含み、上記の２次抗体のそれぞれは、上記のポリペプチドの検出を容易にする蛍光標識を有する。
【００３４】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する」ならびにこれらの語句の変形、例えば「含み」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、その他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（かつ除外しない）。
【００３５】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈がそうでないことを必要としない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞を用いる場合、本明細書は、文脈がそうでないことを必要としない限り、単数形とともに複数形を企図すると理解される。
【００３６】
本発明の具体的な態様、実施形態または実施例と関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、本明細書に記載する任意のその他の態様、実施形態または実施例に、それと非適合性でない限り、適合できると理解される。
【００３７】
定義
本明細書で用いる場合、「結合剤」は、互いに結合特異性を有する分子の対の物質である。特定の結合対のメンバーは、天然に由来するか、または全体的もしくは部分的に合成して生成されてよい。分子の対の一方のメンバーは、その表面上に、突出もしくは空隙であり得、分子の対の他方のメンバーの特定の空間的および極性的機構と特異的に結合し、よって相補的である領域を有する。よって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。
【００３８】
特異的結合剤の対の型の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ（例えばオリゴヌクレオチド）である。本発明は、全般的に、抗原−抗体型の反応に関するが、これは、本明細書で定義する抗原と結合する小分子にも関する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「抗体」との用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち天然でまたは部分的もしくは全体的に合成により生成されたいずれかの抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子のことをいう。この用語は、抗体結合ドメインであるかもしくはそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質もカバーする。これらは、天然の供給源に由来できるか、またはこれらは、部分的もしくは全体的に合成により生成できる。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；ならびに二価抗体である。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。
【００４０】
抗体は、いくつかの方法で改変できるので、「抗体」との用語は、要求される特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合剤または物質をカバーすると解釈される。つまり、この用語は、天然または全体的もしくは部分的に合成のいずれかの免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物および相同体、ヒト化抗体をカバーする。
【００４１】
ＭＣＭまたはＡＲまたはＰＳＡなどの興味対象の標的に特異的な抗体は、当該技術において標準的な技術を用いて得ることができる。抗体を生成する方法は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）を、タンパク質もしくはその断片あるいはタンパク質もしくは断片を発現する細胞またはウイルスで免疫することを含む。抗体は、免疫された動物から、当該技術において知られる様々な技術のいずれかを用いて得て、例えば興味対象の抗原との抗体の結合を用いてスクリーニングできる。
【００４２】
抗原結合ドメインは、抗原の部分もしくは全体に特異的に結合し相補的である領域を含む抗体の一部分である。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にだけ結合し、この部分をエピトープと称する。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメインによりもたらされることがある。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域とを含むことがある。
【００４３】
「特異的」は、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子といずれの著しい結合も示さない、例えば任意の他の分子と約３０％、好ましくは２０％、１０％または１％未満の交差反応性を有する状況のことをいうために、通常、用いられる。
【００４４】
本発明の特異的結合剤は、好ましくは、本発明に従って、「単離」形である。メンバーは、通常、それらがそれらの天然の環境またはそれらが調製される環境（例えば細胞培養）（そのような調製がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合に）で一緒に見出されるその他のポリペプチドなどのそれらが天然で関連する物質を含まないかまたは実質的に含まない。
【００４５】
つまり、本発明の特異的結合剤は、好ましくは、抗体またはその断片である。つまり、例えば特異的結合剤は、ＰＳＡまたはＡＲに特異的な抗原結合ドメインを有する抗体またはその断片であり得る。例えば、特異的結合剤は、ＭＣＭ、例えばＭＣＭ２またはＭＣＭ７に特異的な抗原結合ドメインを有する抗体またはその断片であり得る。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体または上記のいずれかの断片であり得る。好ましくは、特異的結合剤は、モノクローナル抗体である。ＭＣＭ、ＡＲおよびＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体は、当該技術において知られている。
【００４６】
本発明の実施形態を、ここで、例によってのみ、以下の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ａ）抗ＰＳＡ（茶色、細胞質）、ｂ）抗ＰＳＡ（茶色、細胞質）および抗ＭＣＭ２（赤色、核）を用いる培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系のＤＡＫＯ比色分析染色の図である。プレートａ）は、抗ＰＳＡ抗体が、前立腺細胞の細胞質（１）を標識し、核が大きく肥大している（青色ヘマトキシリン染色）ことを示す。プレートｂ）は、細胞の細胞質を抗ＰＳＡで茶色に（１）、そして核を抗ＭＣＭ２抗体で赤色に（２）する二重染色を示す。
【図２】Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いるＣ４−２ｂ細胞系の比色分析単一染色の図である。プレートは、次のようにして標識する：ａ）Ｎ末端特異的抗ＡＲ抗体を用いる核だけのＤＡＢ染色（１）と、対比染色された細胞質（２）；ｂ）Ｃ末端特的抗ＡＲ抗体を用いる細胞の非局在化ＤＡＢ染色；ｃ）抗ＰＳＡ抗体を用いる細胞質（矢印）のＤＡＢ染色；ｄ）抗ＭＣＭ２抗体を用いる核（矢印）のｎｏｖａＲＥＤ染色；およびｅ）抗ＭＣＭ２抗体を用いる核（矢印）のｎｏｖａＲＥＤ染色。
【図３】Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いるＣ４−２ｂ細胞系の比色分析二重染色の図である。プレートは、ＤＡＢ−Ｎｉ（灰色）標識抗ＰＳＡ細胞質（１）と、ｎｏｖａＲＥＤ（赤色）抗ＭＣＭ２抗体標識核（２）とを示す。
【図４】培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の蛍光（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）染色の図である。抗ＰＳＡ抗体（緑色、細胞質）を用いたプレートａ）；ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色、核）；ｃ）２つの細胞の場所の明らかに別々の染色を示す合成およびｄ）別々の局在化を示す、抗ＰＳＡ（緑色、細胞質）および抗ＭＣＭ２（赤色、核）抗体を用いる合成画像。
【図５】培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の蛍光（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）染色の図である。抗ＡＲ抗体（緑色、核）を用いたプレートａ）；ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色、核）；およびｃ）ＡＲおよびＭＣＭ７抗原の核での共局在化を示す合成。
【図６】確認された前立腺がんの患者からの尿臨床試料から単離されたＣ４−２ｂ前立腺がん細胞の、抗ＡＲ（緑色）および抗ＣＭ７（赤色）抗体を用いる二重蛍光染色の図である。
【図７】損傷細胞および細胞破片の除去の図である。ａ）Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖ ＤｅａｄＣｅｒｔ粒子で前処理しなかった尿試料、およびｂ）死滅したかもしくは死滅しかけている細胞およびその他の細胞破片を除去する処理の後の尿試料から単離した、ヘマトキシリン染色された膀胱内皮細胞。
【図８】尿中で４時間にわたる培養Ｃ４−２ｂ前立腺細胞の核の生存／健康の図である。はっきりした赤色の核染色は、細胞が良好な状態にあることを示す。より強度が弱い赤色の染色、染色が欠如していることおよび細胞質染色が増加していることは、細胞が生存性を喪失し、患者試料において、前立腺がん細胞として明確に同定されないことを示す。
【図９】確認された前立腺がんの患者からの尿臨床試料から単離された前立腺がん細胞の、（ａ）抗ＡＲ（緑色）および（ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色）抗体を用いる二重蛍光染色、ならびに（ｃ）ＡＲとＭＣＭとを用いる二重染色の合成画像の図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４８】
ＰＳＡおよびＭＣＭ抗原に対するＤＡＫＯ二重染色キットを用いる培養前立腺がん細胞の比色分析標識。
Ｃ４−２ｂ細胞を、Ｔ７５フラスコで、１０％ＦＢＳおよび２％ ｐｅｎｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中で、３７℃および５％ＣＯ２にて、９０％集密まで培養した。培地をピペット操作により除去し、細胞を、温めたＰＢＳで２回洗浄した。これらを、１０ｍｌトリプシン溶液で３７℃にて２〜３分インキュベートした後に、穏やかにかき混ぜることにより、フラスコ表面から剥した。細胞懸濁物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、存在する細胞数を、試料を血球計上で計数することにより決定した。これらを、次いで、遠心分離によりペレットにし、温めたＰＢＳに１×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁した。１５０μｌの分割量を、２０ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液を含有するバイアルに加え、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ−Ｔ２０００処理機に移した。これは、いずれの細胞破片も穏やかに砕き、細胞の均質な懸濁物を提供する。懸濁物を、細胞の均質な層を回収するフィルタを通して引き出した。流れ抵抗を監視することにより、この装置は、少なすぎるかまたは多すぎる細胞を含有する層を回収することを妨げる。捕捉された細胞を、１０ｍｍ直径の円のＵｒｏＣｙｔｅガラススライドに移した。次いで、スライドを、ｓｐｉｒｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈ Ｌｔｄ．ＥＧＫ−０１９５００Ａ）に浸し、排出し、１０ｃｍの距離からＳｕｒｇｉｐａｔｈコーティング固定溶液を１回噴霧し、平坦な表面において風乾した。
【００４９】
細胞染色：細胞を、ＤＡＫＯ Ｇ／２二重染色キット（Ｋ５６３１）を用いて、次のようにして染色した。
【００５０】
スライドを５０％メタノールに５分間浸し、蒸留水ですすいだ後に、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水、ＤＡＫＯ試薬）ですすいだ。これらを、次いで、蒸留水、その後でＤＡＫＯ洗浄緩衝液（Ｓ３００６）を用いてすすぎ、自動染色機（ＤＡＫＯ）に移した。スライドを、２００μｌのＤＡＫＯ二重内因性酵素ブロック（製品コード（Ｋ５３６１））で５分間ブロックし、次いで、ＴＢＳで２回すすいだ。２００μｌの１次抗体Ａ０５６２ウサギ抗ヒトＰＳＡポリクローナル抗体（または対照ウサギ抗体）を、０．３μｇ／ｍｌで加え、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、そうでないと示さない限り、室温にて行った。スライドをＴＢＳで２回すすぎ、２００μｌのＥｎｖｉｓｉｏｎ（抗ウサギ）ポリマーセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｋ５３６１）を加え、３０分間インキュベートした。スライドを、ＴＢＳで再び２回すすぎ、ＤＡＫＯ ＤＡＢ基質を加え、スライドを５分間インキュベートした。スライドを自動染色機から取り出し、水道水で３分間すすいだ。
【００５１】
次に、熱回復ステップを行って、ＭＣＭ抗原を抗体に近づくことができるようにした。
【００５２】
スライドを、１ｍＭ ＥＤＴＡ熱回復緩衝液、ｐＨ７．８（ＤＡＫＯ）に浸し、全出力でマイクロ波処理した（８００Ｗ、１０分）。熱回復緩衝液を補給し、マイクロ波処理を１０分間繰り返した。スライドを、このようにして、１０のバッチで調製した。より少数の試料を調製する場合、ブランクのスライドを含めて、熱処理の一貫性のために合計数を１０にした。スライドを５分間冷却し、自動染色機に戻した。
【００５３】
スライドを、ＤＡＫＯ二重染色ブロック（補助試薬）を用いて再び、３分間ブロックし、ＴＢＳ緩衝液で２回すすいだ。第２の１次抗体であるマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（ＭＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）または対照マウス抗体を加え（１μｇ／ｍｌにて２００μｌ）、６０分間インキュベートした。スライドをＴＢＳで２回すすぎ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎポリマー−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｋ５３６１）を１５分間加えた（２００μｌ）。ＴＢＳでさらに２回すすいだ後に、２００μｌの液体パーマネントレッドａｌｋ−ｐｈｏｓ基質（ｖｏｌ、ＤＡＫＡコード）を７分間加えた。この試薬は新しく調製し、使用３０分前に自動染色機に加えた。これに、１滴／ｍｌのＤＡＫＯ Ｘ３０２１レバミソール（ＤＡＫＯ Ｘ３０２１）を補って、内因性ａｌｋ−ｐｈｏｓ活性をブロックした。
【００５４】
染色の後に、スライドを蒸留水ですすぎ、ＣｕＳＯ４溶液（２Ｌの水に１０ｇ ＣｕＳＯ４、１７ｇ ＮａＣｌ）に５分間浸し、次いで、水で再びすすいだ。これらを、次いで、ヘマトキシリンで１０秒間対比染色し、水ですすいだ。最後に、スライドをキシレンに５分間浸し、風乾し、カバーガラスをかけて、分析の準備ができた。
【００５５】
抗体を、ストック溶液から、ＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ０８０９またはＳ２０２２）中で所望の濃度に希釈した。スライドを、白色光の下で、Ｐｒｏｇ Ｒｅｓ Ｃ１４カラーカメラを備えたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳＫＯＰ４０顕微鏡を用いて視覚化した。白色光での視覚化に加えて、ＭＣＭ抗原を標識するために用いたアルカリホスファターゼ基質は、蛍光を放射する。これは、白黒カメラＡｘｉｏｃａｍ ＭＲｍおよび赤色フィルタを有するＺｅｉｓｓ−Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２を用いて観察した。画像は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて分析した（図１）。
【００５６】
代替のアッセイフォーマットでは、０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２を、以下の１つで置換した：
ｉ）０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）
ｉｉ）１／５０希釈でのＧｅｎｅｔｅｘ抗ＰＳＧＲ抗体（ＧＴＸ７２７４９）
ｉｉｉ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍマウスモノクローナル抗ＰＳＡエピトープ３抗体ＰＳ２（ａｂ１０１８９）。
ｉｖ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍマウスモノクローナル抗ＰＳＡエピトープ４抗体５Ｇ６（ａｂ１０１８６）。
ｖ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体（ａｂ９５３７）。
【００５７】
さらに、１．０μｇ／ｍｌでのＤ１．１２Ａ３マウス抗ヒトＭＣＭ２モノクローナル抗体を、以下の１つで置き換えた：
ｉ）３．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６（核よりもむしろ細胞質中のＮ末端またはＣ末端標識ＭＣＭ７のいずれかに対して特異的に産生され、よって比色分析アッセイにおいて抗ＡＲ抗体とともに用いるためだけに適切である抗体）、
ｉｉ）１／２００希釈での細胞系ＪＣＣ０７からのＶｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）マウス抗ヒトＭＣＭ３モノクローナル抗体（ＮＣＬ−ＭＣＭ３）、
ｉｉｉ）１／２０希釈での細胞系ＣＲＣＴ５．１からのＶｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）マウス抗ヒトＭＣＭ５モノクローナル抗体（ＮＣＬ−ＣＭ５）。
【００５８】
細胞質抗原（ＰＳＡ）を評価するための単一抗原染色アッセイのために、熱回復ステップおよび２次染色ステップを省略した。核染色抗原（ＡＲ、ＭＣＭの）を評価するための単一染色アッセイのために、１次染色ステップを省略した。
【００５９】
細胞質ＰＳＡを、培養前立腺細胞において、Ｄ１．１２．Ａ３抗体で標識できたことが見出された（図１ａ）。ＰＳＡは、「エピトープ」３および４に対する抗体を用いても検出されたが、「エピトープ」１に対する抗体を用いては検出されなかった（示さず）。同様に、前立腺特異的酸性ホスファターゼに対する抗体は前立腺細胞の細胞質を標識したが、前立腺特異的Ｇ共役型受容体（ＰＳＧＲ）に対する抗体は効果的でなかった。さらに、核抗原であるミニ染色体維持タンパク質ＭＣＭ２およびＭＣＭ７、ならびにアンドロゲン受容体（ＡＲ）は強い標識をもたらしたが、ＭＣＭ３およびＭＣＭ５は効果がより小さかった（示さず）。二重染色アッセイにおいて組み合わせて用いた場合に、ＰＳＡとＭＣＭ５（図１ｂ）およびＰＳＡとＭＣＭ７（示さず）はともに前立腺細胞を標識でき、ちょうどそれらの異なる細胞の位置で個別に同定できた。
【実施例２】
【００６０】
ＰＳＡアンドロゲン受容体（ＡＲ）およびＭＣＭ抗原に対するＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いる培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の比色分析標識。
スライドを、実施例１に記載するようにして、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００装置を用いて調製した。全ての標識および洗浄ステップは、手動で行った。スライドを、まず、５０％メタノールに５分間浸し、２００μｌのＤＡＫＯ二重内因性酵素ブロック（製品コード（Ｋ５３６１））を５分間加えた。スライドを、次いで、蒸留水で３回およびＤＡＫＯ洗浄緩衝液（Ｓ３００６）で５回すすいだ。すぐに使用できるＩｍｍＰＲＥＳＳ正常ウマ血清（ＮＨＳ）を２．５％でスライドに２０分間加えてブロックし、その後に２００μｌのＤＡＫＯ Ａ０５６２ウサギ抗ヒトＰＳＡポリクローナル抗体（または対照ウサギ抗体）を０．３μｇ／ｍｌで加え、１０分間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、そうでないと示さない限り、室温にて行った。スライドをＤＡＫＯ洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬（ユニバーサルＨＲＰ標識抗ウサギおよび抗マウス）を３０分間加えた。スライドをＤＡＫＯ洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を５分間加えた。用いた基質は、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ（ＳＫ−４６００、紫色）、ＤＡＢ（ＳＫ−４１００、茶色）、ＤＡＢ−Ｎｉ（ＳＫ−４１００、灰色／黒色）またはＶｅｃｔｏｒ ＮｏｖａＲＥＤ（ＳＫ−４８００、赤色）のいずれか１つであった。スライドを洗浄緩衝液で５回洗浄した。
【００６１】
次に、熱回復ステップを行って、ＭＣＭ抗原を抗体に近づくことができるようにした。
【００６２】
スライドを１ｍＭ ＥＤＴＡ熱回復緩衝液、ｐＨ７．８（ＤＡＫＯ）に浸し、全出力でマイクロ波処理した（８００Ｗ、１０分）。熱回復緩衝液を補給し、マイクロ波処理を１０分間繰り返した。スライドを、このようにして、１０のバッチで調製した。より少数の試料を調製する場合、ブランクのスライドを含めて、熱処理の一貫性のために合計数を１０にした。スライドを５分間冷却させた。
【００６３】
スライドを、２．５％正常ウマ血清で２０分間、再びブロックした。第２の１次抗体であるマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（ＭＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）または対照マウス抗体を加え（１μｇ／ｍｌにて２００μｌ）、１０分間インキュベートした。これらを洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬（上記のとおり）を３０分間加えた。洗浄緩衝液でさらに５回すすいだ後に、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を５分間加えた。基質は、上で列挙した４つのうちのいずれか１つであったが、前のステップで用いたものと同じではなかった。
【００６４】
染色の後に、スライドを蒸留水ですすぎ、ＣｕＳＯ４溶液（２Ｌの水に１０ｇ ＣｕＳＯ４、１７ｇ ＮａＣｌ）に５分間浸し、水で再びすすいだ。これらを、次いで、ヘマトキシリンまたはメチルグリーンで１０秒間対比染色し、水ですすいだ。最後に、スライドをキシレンに５分間浸し、風乾し、カバーガラスをかけて、分析の準備ができた。
【００６５】
抗体を、ストック溶液から、希釈２．５％ＮＨＳを含むＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ０８０９またはＳ２０２２）中で所望の濃度に希釈した。スライドを、白色光の下で、Ｐｒｏｇ Ｒｅｓ Ｃ１４カラーカメラを備えたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳＫＯＰ４０顕微鏡を用いて視覚化した。核染色抗原（ＡＲ、ＭＣＭの）を評価するための単一染色アッセイのために、１次染色ステップを省略した。細胞質抗原（ＰＳＡ）を評価するための単一抗原染色アッセイのために、熱回復ステップおよび２次染色ステップを省略した。
【００６６】
代替のアッセイフォーマットでは、０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２を、０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）または０．３μｇ／ｍｌでの抗アンドロゲン受容体Ｃ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１５）で置換した。１．０μｇ／ｍｌでのＤ１．１２Ａ３マウス抗ヒトＭＣＭ２モノクローナル抗体を、３．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６で置き換えた。染色は、以下のＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を様々に用いて達成した：単独または組み合わせて、かつ対比染色ありまたはなしでのＤＡＢ（茶色）、ＤＡＢ−Ｎｉ（灰色、黒色）、ｎｏｖａＲＥＤ（赤色）またはＶＩＰ（紫色）。
【００６７】
Ｎ末端に特異的なＡＲ抗体は、核をはっきりと標識できたが（図２ａ）、Ｃ末端特異的抗体は、いずれのはっきりした細胞の局在化も示さず、よって適切でないことが見出された（図２ｂ）。ＰＳＡ抗原も、細胞の細胞質で検出された（図２ｃ）。細胞周期抗原ＭＣＭ２およびＭＣＭ７に対する抗体はともに、核を標識できた（図２ｄおよびｅ）。全ての異なる基質は、単一染色のために用いた場合に、効果的であることが見出された（示さず）。二重染色について、いくつかの組合せは、それらの外観が類似するので、他のものよりもあまり適切でなかった。ＤＡＢ−ＮｉとｎｏｖａＲＥＤおよびＤＡＢとｖｅｃｔａ ＶＩＰは、良好な画像を生成することが見出された（図３）。このアッセイフォーマットでは、ＰＳＡは、１つまたは複数のＭＣＭ抗原と組み合わせた前立腺細胞特異的マーカーとして用いなければならない。その核局在性のために、ＡＲは、このフォーマットにおいて適切でない。
【実施例３】
【００６８】
前立腺細胞系Ｃ４−２ｂの蛍光標識。
前立腺がん細胞系Ｃ４−２ｂを培養し、「Ｔｈｉｎｐｒｅｐ」スライドを、上の実施例１に詳細に記載するようにして調製した。
【００６９】
細胞染色：
スライドを、５０％メタノールに５分間浸し、蒸留水で５分間洗浄し、ＤＡＫＯ洗浄緩衝液で１回すすいだ。２００マイクロリットルの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をスライドに５分間加えて、細胞を透過性にした。これらを、次いで、洗浄緩衝液で３回および水で１回すすいだ。１００マイクロリットルのＩｍａｇｅ−ＩＴ ＦＸシグナルエンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉ３６９３３）を加え、室温にて３０分間インキュベートした。スライドを洗浄緩衝液で３回すすいだ後に、蒸留水で１回すすいだ。
【００７０】
１次抗体ミックスまたは対照抗体（０．３μｇ／ｍｌでのウサギ抗ＰＳＡおよび１μｇ／ｍｌでのマウス抗ＭＣＭ２）をスライドに加え（各１００μｌ）、９０分間インキュベートした。ミックスは、以下の組合せの１つを含んだ：ｉ）ＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２（０．３μｇ／ｍｌ）およびマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（１．０μｇ／ｍｌ）；ｉｉ）ＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２およびＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６（１．０μｇ／ｍｌ）；ｉｉｉ）Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体ｓｃ８１６（０．３μｇ／ｍｌ）およびマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３；またはｉｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体ｓｃ８１６およびＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６。
【００７１】
スライドを、洗浄緩衝液で３回、および水で１回すすいだ。２００μｌの２種のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ２次抗体のミックス（１／１０００希釈）をスライドに加え、３０分間インキュベートした。用いたミックスは、上記の１次抗体ミックスと関連して次のとおりであった：ｉ）およびｉｉｉ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（緑色）抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１４５）；ｉｉ）およびｉｖ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（緑色）抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１２５）。
【実施例４】
【００７２】
患者の尿からの前立腺細胞の蛍光標識。
尿試料を、確認された前立腺がんの２名の患者から得て、次のようにして直ちに処理した。試料を、５０ｍｌファルコンチューブ中で６００ｇにて５分間遠心分離して、細胞をペレットにし、上清を処分した。細胞ペレットを、小容量のＣｙｔｏｌｙｔ（Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐ）に穏やかにかき混ぜることにより再懸濁し、チューブに３０ｍｌまでＣｙｔｏＬｙｔを足した。懸濁物を５分間ボルテックスし、再び遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液に再懸濁し、２０ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔを含有するバイアルに移した。バイアルをＴｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００に入れ、上の実施例３に記載するようにしてスライドを調製した。
【００７３】
細胞を、１．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６、および０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２または０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）のいずれかで標識した（図６）。前立腺細胞は、両方の試料中で同定された。これらは、尿への長期の曝露の後の細胞の乏しい状態のために、全て、不規則な形態のものであり、様々な程度の細胞質染色を示した。
【実施例５】
【００７４】
尿試料からの破片の除去の効果。
尿試料を６００ｇにて１０分間遠心分離して、細胞をペレットにした。細胞を、１ｍｌ ＰＢＳに再懸濁した。全細胞数を、血球計を用いて決定した。細胞懸濁物の容量を、１００μｌが５×１０６細胞を含有するように調整した（ＰＢＳの添加によるか、または再びペレットにして適当な容量のＰＢＳに再懸濁することのいずれかにより）。
【００７５】
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖ Ｄｅａｄ Ｃｅｒｔナノ粒子（Ｉｍｕｎｏｓｏｌｖ Ｌｔｄ．、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ）のストックバイアルを、３０秒間ボルテックスした。２５マイクロリットルのナノ粒子を、１ｍｌ ＰＢＳを含有するエッペンドルフチューブに移した。チューブを、付属する磁性分離器に３〜５分間、粒子が磁石に反発して集まるまで入れた。緩衝液をピペット操作により除去し、チューブを取り出した。粒子を、１００μｌのＰＢＳにボルテックスすることにより再懸濁した。１００マイクロリットルの細胞（５×１０６細胞）を粒子懸濁物に加え、混合物を４℃にて４０分間インキュベートした。このインキュベーションの間に、磁性ナノ粒子は、任意の死滅したまたは死滅しかけている細胞の表面上に選択的に発現される抗原と結合する。さらに８００μｌのＰＢＳをチューブに加え、穏やかに混合し、次いで、チューブを磁性分離器に５分間戻した。生存性の健常細胞を含有する上清をピペット操作により取り出し、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔのバイアル（２０ｍｌ）に加えた。ＤｅａｄＣｅｒｔ粒子を用いて予め枯渇させていない細胞の第２の１００μｌ分割量を、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔｅの別のバイアルに加えた。両方の試料を、次いで、実施例１に記載するようにしてＴｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２００中で処理した。スライドを、視覚化のためにヘマトキシリンで染色した（図７）。
【００７６】
主に、未処理試料中の非生存細胞から多数の破片の粒子が生じた。これらは、しばしば、非特異的に標識されることがあり、頻繁に観察される真のがん細胞の様々な細胞形態のために、真のがん細胞からしばしば区別できない。これとは対照的に、処理した試料は、かなりより少ない破片の粒子を含有し、このことにより、患者のより正確で堅固な評価を行うことが可能になる。
【実施例６】
【００７７】
尿中での前立腺がん細胞の生存。
前立腺細胞系Ｃ４−２ｂを、実施例１に記載するようにして培養した。培養フラスコが８０％集密に到達したときに、細胞を遠心分離により採集し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）に再懸濁し、計数した。５ｍｌのＰＢＳ中のおよそ２×１０７細胞を、健常提供者から提供された２５ｍｌの尿に加え、４℃にて貯蔵した。試料を、冷蔵庫から１時間、２時間、３時間および４時間後に取り出し、実施例１に詳細に記載するようにして、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００装置を用いてスライドを調製した。スライドを、マウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３抗体およびＤＡＫＯ抗マウスアルカリホスファターゼ試薬を用いて、実施例１のようにして染色し、ともに白色光の下で観察した（図８）。１時間および２時間では、細胞は、強い強度のはっきりした核染色を示した。３時間までに、染色は核でよりはっきりしなくなり、強度がより低くなった。この点で、いくつかの細胞は、ＭＣＭについて陽性に染色されなかった。４時間までに、健常細胞の割合は、著しく低減した（データは示さず）。
【００７８】
ＭＣＭで染色される細胞が、核の完全性が４時間まで高いままであり、７２時間以降は徐々に劣化する（データは示さず）ことを示したことは、特に重要である。保護性の細胞膜の消失／解体が１時間目以降から始まり、前立腺特異的細胞の細胞質の細胞完全性染色の指針であるＰＳＡが、１時間目以降から急激に悪化したことが示された（データは示さず）。
【実施例７】
【００７９】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）およびミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）抗体を用いる前立腺がん細胞系の染色。
前立腺がんの患者についての以前の研究は、前立腺上皮細胞が、高い血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の値を示す患者の尿中に捕捉され得ることを示した。細胞は、数がほとんどなく、排尿から１時間以内に処理しなければならない。我々は、核マーカーとしてＭＣＭおよび細胞質マーカーとしてＰＳＡを用いる尿中の前立腺細胞検出のための方法を既に確立した。尿中でのこれらの細胞の迅速な劣化は、しかし、特に細胞膜であり、よって、細胞の細胞質は、より堅固な抗体マーカーを必要とした。
【００８０】
排尿後４時間まで、前立腺上皮細胞の核が無傷のままであることがわかった（実施例６を参照されたい）。前立腺組織に特異的親和性を有する核マーカーを選択して調査した。前立腺がん細胞系および前立腺がんの患者または血清ＰＳＡ値が高い患者の尿の両方を用いて、アンドロゲン受容体抗体を用いて前立腺細胞が良好に画定された。
【００８１】
樹立前立腺がん細胞系（Ｃ４２ｂ）をスパイクした正常尿を、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｔ２０００機械上でｕｒｏｃｙｔｅスライドを用いて実験室にて調製した。スライドを、５０％メタノールに５分間浸し、脱イオン水で洗浄し、２００ｕｌの０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を５分間加えて、細胞を透過性にした。ＤＡＫＯ緩衝液で３回および脱イオン水で１回さらにすすいだ後に、２滴（１００ｕｌ）のＩｍａｇｅ−ＩＴ Ｆｘシグナルエンハンサーまたは十分な容量を用いて各カバーガラスまたは区画を覆い、次いで、室温にて３０分間インキュベートした。緩衝液で３回および水で１回さらにすすいだ後に、２００ｕｌの１次抗体ＡＲ（０．３ｕｇ／ｍｌ ＡＲ−Ｎ２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ−８１６を供給源とする）および１．１５ｕｇ／ｍｌ ＭＣＭ（ＭＣＭ７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ９９６６を供給源とする）と、０．５％粉乳中で６０分間インキュベートする。スライドを、緩衝液で３回および脱イオン水で１回すすぎ、関連する２次Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ抗体（ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−１１０３４、およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ１（γ１）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−２１１２５）と、暗所にて３０分間インキュベートする。スライドを、緩衝液で３回および水で１回再びすすいだ後に、１滴のＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤を室温にて加え、その後、全てのスライドにカバーガラスをかける。スライドを、戴置された試料を平坦な乾燥面に置き、暗所で室温にて２４時間インキュベートすることにより硬化させる。蛍光を、異なる蛍光フィルタを有する蛍光顕微鏡を１０秒間用いて検出した（図９）。
【００８２】
実験は、アンドロゲン受容体およびミニ染色体維持タンパク質の両方について、はっきりと画定した核染色を示した。
【００８３】
同一の実験を、ＭＣＭ７（１：１００希釈）およびウサギモノクローナルアンドロゲン受容体抗体（ＡＲ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．を供給源とする）を用いて行った。さらに、１：５０希釈でのＭＣＭ２およびウサギモノクローナルアンドロゲン受容体抗体（ＡＲ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．を供給源とする）を用いて別の実験を行った。ＭＣＭ２またはＭＣＭ７とアンドロゲン受容体との組合せによる前立腺の核の特異性および固定化の評価のために、陰性対照としてＣ４２ｂ前立腺上皮細胞およびＥＪ２８膀胱がん細胞の混合集団を用いて、スライドを、２つの異なる組合せで染色した。採用した方法は、アンドロゲン受容体ポリクローナル抗体（上記）およびＭＣＭ７を組み込んだＣ４２ｂ細胞系において用いたものと同一であった。この実験では、Ｃ４２ｂ細胞を、１：５０希釈でのＭＣＭ２および１：１００希釈でのＲａｂＭＡｂ ＡＲを用いて染色した。個別の核染色要素は、１：１００希釈でのアンドロゲン受容体を有するＡＦ４８８−１／１０００、および１：５０希釈でのＭＣＭ２との組合せでのＡＦ５９４−１／１０００を用いて、蛍光顕微鏡の下で明確に同定された（データは示さず）。これらの状況で染色された前立腺細胞系の個別の画像は、同定された前立腺細胞の核における染色特性の明確な同定を示した。アンドロゲン受容体およびＭＣＭ２抗体を関連するＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ蛍光抗体と組み合わせた場合、はっきりと画定した核染色パターンの良好な証拠があり、このことにより、アンドロゲン受容体の緑色の着色が、ＭＣＭ２核染色の赤色の着色と一緒に、二重核染色特徴により、標準化された前立腺悪性細胞系から、前立腺上皮細胞を同定するオレンジ色の着色された組合せを生成した（データは示さず）。Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８のそれぞれ前立腺および膀胱悪性細胞系の混合集団をともに用いるさらなる研究は、アンドロゲン受容体およびＭＣＭ７と組み合わせた場合に、染色された黄色の核を有する前立腺細胞の良好な証拠を示した。ＥＪ２８膀胱がん細胞は、全く染色されなかった。同様に、Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８細胞系の混合集団は、１：１００でのアンドロゲン受容体および１：５０希釈でのＭＣＭ２で染色した場合に、Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８染色細胞の混合集団の合成画像を示し、ここでは、ＥＪ２８染色細胞は、アンドロゲン受容体染色の証拠を示さなかった。
【００８４】
これらの実験から、ＭＡｂ ＡＲ＋ＭＣＭ７の組合せを用いて核がはっきりと画定して染色され、同様に、ＭＡｂ ＡＲおよびＭＣＭ２の染色活性があることが確認される。これらのデータから、上皮前立腺がん細胞系を、核レベルにて、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７の両方を、アンドロゲン受容体抗体、この場合はＭＡｂ ＡＲとともに用いて染色できることが確認される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がんの診断／予後判定アッセイに関し、これには、前記アッセイに用いるキットが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、１つまたは複数の細胞集団の制御されない増殖が正常な生物学的機能に干渉する異常な疾患状態である。増殖の変化は、あまり組織的でない状態への逆戻りを含む、細胞特性のその他の変化を通常伴う。がん細胞は、典型的には、「形質転換している」といわれる。形質転換している細胞は、全般的に、以下の特性のいくつかを示す：球状の形態、胎児性抗原の発現、増殖因子非依存性、接触阻害の欠如、足場非依存性および高い密度までの増殖。がん細胞は腫瘍を形成し、「原発」または「続発」腫瘍とよばれる。原発腫瘍は、元の形質転換している細胞が発達する臓器におけるがん細胞増殖をもたらす。続発腫瘍は、原発腫瘍からのがん細胞の逸脱および別の臓器での続発腫瘍の確立に起因する。この過程は、転移とよばれ、この過程は、例えば肝細胞がんまたは肺がんでの場合のように侵襲性であり得る。前立腺がんは、比較的有害でないかまたは非常に侵襲性であることがある。いくつかの前立腺腫瘍は、緩慢に成長し、ほとんど臨床症状を引き起こさない。侵襲性前立腺腫瘍は、リンパ節およびその他の臓器、特に骨に迅速に広がる。前立腺がんの成長は、テストステロンのような男性ホルモンの供給を遮断することにより阻害できることが知られている。しかし、前立腺がんは、結局は発達し、男性ホルモンに非依存性になる（すなわち、これらは、アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞になる）。これらの細胞は、侵襲性で悪性の前立腺がんと関連する。前立腺がんに罹患するのは、イヌおよびヒトの２種だけである。
【０００３】
以前の研究は、上皮組織の細胞周期過程における重要な制御因子としてミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）を同定している（ＷＯ９９／２１０１４およびＧｏｎｚａｌｅｚら；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｎｃｅｒ、第５巻：１３５〜１４１頁、２００５年２月を参照されたい）。ＭＣＭは、「細胞周期状態」、すなわち細胞が、静止状態または老化しているよりもむしろ増殖できるかどうかの有用なバイオマーカーとして同定された。６つ全てのＭＣＭ（ＭＣＭ２〜７）の発現が、細胞周期の全ての段階にわたって見られ、細胞周期から出て静止状態、分化または老化へ入った後に下方制御される。アンドロゲン受容体［ＡＲ］は、アンドロゲンであるテストステロンおよびジヒドロテストステロンと結合する核タンパク質である。ＡＲは、転写因子であり、男性の性決定に関与する遺伝子の制御に関与する。ＡＲのクローニングおよび配列決定はＷＯ８９／０９７９１に開示され、これは、原核および真核の発現系におけるＡＲの発現と、モノクローナル抗体の開発におけるその使用とについて記載している。前立腺がんを検出するための診断試験としてのＰＳＡの検出は、よく確立されている。ＰＳＡは、前立腺の細胞により分泌されるプロテアーゼである。血液試料中のＰＳＡの検出は、対象における前立腺がんを示すとみなされる。これは、対象がさらなる調査を必要とするかどうかを明確に同定することに関連するかなりの問題を有する。ＰＳＡの高い血清レベルを示す対象の一部は、疾患を有さないことが結局は見出される。このことは、精神的ストレスと不必要な身体調査との両方を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々は、生体試料からの単離細胞試料中の前立腺がん細胞の検出の信頼できる検査を提供し、男性の対象の血清試料中の前立腺特異抗原の検出に関連する現在の問題点を取り除くアッセイを開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のある態様によると、生体試料中の前立腺がん細胞を検出するための診断または予後判定の方法であって、
ｉ）前記生体試料から単離細胞試料を得て、単離細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、
ｉｉ）単離細胞試料を、核受容体ポリペプチドと特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉｉ）単離細胞試料を、前立腺特異抗原［ＰＳＡ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）２つ以上の結合剤の結合を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、２つ以上の結合剤と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、生体試料中の前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含む方法が提供される。
【０００６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の核受容体ポリペプチドは、アンドロゲン受容体ポリペプチド（ＡＲ）である。
【０００７】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７ポリペプチドからなる群より選択される。
【０００８】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である。
【０００９】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２である。
【００１０】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ７である。
【００１１】
本発明のさらなる好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である。
【００１２】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の細胞試料を、ＡＲと特異的に結合する結合剤およびＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させる。
【００１３】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のアッセイは、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチド、ＡＲおよびＰＳＡを検出する。
【００１４】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のアッセイは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７、ＡＲならびにＰＳＡを検出する。
【００１５】
本発明の好ましいアッセイでは、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、逆である。
【００１６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の結合剤は、モノクローナル抗体またはその活性結合断片である。
【００１７】
このアッセイが、対象が前立腺がんに対する素因を有するか否かを決定するための診断ツールを提供することが明らかである。このアッセイは、診断され、療法、例えば化学療法または放射線療法を受ける対象が、治療に応答しているか、またはさらなるもしくは代替の治療計画を必要とするかを決定する手段も提供する。本発明は、よって、対象の疾患をよりよく管理するための対象のための治療計画を提供する。
【００１８】
本発明の好ましい方法では、上記の生体試料は、単離体液、例えば尿、精液または精漿の試料である。
【００１９】
生体試料は、典型的に、試料の分解を低減し、選択されたマーカーの発現の信頼できる尺度を提供するために、迅速に処理される。例えば、試料は冷却され［例えば４℃］、採取してから少なくとも１時間以内に処理される。
【００２０】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の生体試料は、ろ過され、上記のろ過された試料は、上記の単離細胞試料を提供する。
【００２１】
本発明の実行において有用なろ過デバイスの例は、参照により組み込まれているＷＯ２００９／０８７３７５において本出願人により開示されている。このろ過デバイスは、所定のサイズの細胞を回収するように適合されたフィルタと、フィルタへおよびフィルタから流体を伝達するように配置された流体経路と、流体経路に沿ってフィルタへ流体を送る陽圧および流体経路に沿ってフィルタから流体を引き出す陰圧をもたらすポンプとを含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様によると、対象における前立腺がんを決定するための診断または予後判定アッセイであって、
ｉ）第１単離生体試料を得て、試料を、ＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉ）上記の試料中のＰＳＡの存在を検出するステップと、
ｉｉｉ）対象から第２生体試料を得て、単離細胞試料を調製して、前記細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体ポリペプチドと特異的に結合する第１および第２の結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）前記ＭＣＭポリペプチド［複数可］およびアンドロゲン受容体の存在を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、ＭＣＭおよびアンドロゲン受容体の両方と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイが提供される。
【００２３】
本発明の好ましいアッセイでは、上記の第１生体試料は、血清を含む。
【００２４】
本発明のさらなる好ましいアッセイでは、上記の第２生体試料は、尿または精液である。
【００２５】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である。
【００２６】
本発明の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ２である。
【００２７】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、上記のＭＣＭポリペプチドは、ＭＣＭ７である。
【００２８】
本発明の好ましいアッセイでは、結合剤の上記の検出は、蛍光放射による。
【００２９】
本発明の代替の好ましいアッセイでは、結合剤の上記の検出は、酵素的手段による。
【００３０】
正常試料および試験試料に対する抗体などの特異的結合剤の結合は、任意の適当な手段により決定してよい。標識は、蛍光色素、燐光体、または分光的に孤立した吸収もしくは放射特徴を有するレーザ色素を含む。適切な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドを含む。適切な色素産生性色素は、ジアミノベンジジンを含む。その他の標識は、巨大分子コロイド粒子または着色、磁性もしくは常磁性であるラテックスビーズなどの微粒子物質、および視覚的に観察されるか、電気的に検出されるかもしくはそうでなければ記録される検出可能なシグナルを直接的または間接的に引き起こすことができる生物学的あるいは化学的に活性な物質を含む。これらの分子は、例えば、色を発生するかもしくは変化させるか、または電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってよい。これらは、分子的に励起して、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的な分光的吸収または放射をもたらすことができる。これらは、バイオセンサに関連して用いられる化学的実体を含んでよい。以下に記載する実施例では、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼを採用している。
【００３１】
本発明のさらなる態様によると、第１、第２および第３の結合剤を含むキットであって、前記結合剤が、それぞれＭＣＭポリペプチド、アンドロゲン受容体ポリペプチドおよび前立腺特異抗原ポリペプチドと結合するキットが提供される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、上記の結合剤は、モノクローナル抗体である。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記のキットは、上記の第１、第２および第３モノクローナル抗体と結合する２次抗体をさらに含み、上記の２次抗体のそれぞれは、上記のポリペプチドの検出を容易にする蛍光標識を有する。
【００３４】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する」ならびにこれらの語句の変形、例えば「含み」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、その他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（かつ除外しない）。
【００３５】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈がそうでないことを必要としない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞を用いる場合、本明細書は、文脈がそうでないことを必要としない限り、単数形とともに複数形を企図すると理解される。
【００３６】
本発明の具体的な態様、実施形態または実施例と関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、本明細書に記載する任意のその他の態様、実施形態または実施例に、それと非適合性でない限り、適合できると理解される。
【００３７】
定義
本明細書で用いる場合、「結合剤」は、互いに結合特異性を有する分子の対の物質である。特定の結合対のメンバーは、天然に由来するか、または全体的もしくは部分的に合成して生成されてよい。分子の対の一方のメンバーは、その表面上に、突出もしくは空隙であり得、分子の対の他方のメンバーの特定の空間的および極性的機構と特異的に結合し、よって相補的である領域を有する。よって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。
【００３８】
特異的結合剤の対の型の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ（例えばオリゴヌクレオチド）である。本発明は、全般的に、抗原−抗体型の反応に関するが、これは、本明細書で定義する抗原と結合する小分子にも関する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「抗体」との用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち天然でまたは部分的もしくは全体的に合成により生成されたいずれかの抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子のことをいう。この用語は、抗体結合ドメインであるかもしくはそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質もカバーする。これらは、天然の供給源に由来できるか、またはこれらは、部分的もしくは全体的に合成により生成できる。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；ならびに二価抗体である。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。
【００４０】
抗体は、いくつかの方法で改変できるので、「抗体」との用語は、要求される特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合剤または物質をカバーすると解釈される。つまり、この用語は、天然または全体的もしくは部分的に合成のいずれかの免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物および相同体、ヒト化抗体をカバーする。
【００４１】
ＭＣＭまたはＡＲまたはＰＳＡなどの興味対象の標的に特異的な抗体は、当該技術において標準的な技術を用いて得ることができる。抗体を生成する方法は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）を、タンパク質もしくはその断片あるいはタンパク質もしくは断片を発現する細胞またはウイルスで免疫することを含む。抗体は、免疫された動物から、当該技術において知られる様々な技術のいずれかを用いて得て、例えば興味対象の抗原との抗体の結合を用いてスクリーニングできる。
【００４２】
抗原結合ドメインは、抗原の部分もしくは全体に特異的に結合し相補的である領域を含む抗体の一部分である。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にだけ結合し、この部分をエピトープと称する。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメインによりもたらされることがある。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域とを含むことがある。
【００４３】
「特異的」は、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子といずれの著しい結合も示さない、例えば任意の他の分子と約３０％、好ましくは２０％、１０％または１％未満の交差反応性を有する状況のことをいうために、通常、用いられる。
【００４４】
本発明の特異的結合剤は、好ましくは、本発明に従って、「単離」形である。メンバーは、通常、それらがそれらの天然の環境またはそれらが調製される環境（例えば細胞培養）（そのような調製がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合に）で一緒に見出されるその他のポリペプチドなどのそれらが天然で関連する物質を含まないかまたは実質的に含まない。
【００４５】
つまり、本発明の特異的結合剤は、好ましくは、抗体またはその断片である。つまり、例えば特異的結合剤は、ＰＳＡまたはＡＲに特異的な抗原結合ドメインを有する抗体またはその断片であり得る。例えば、特異的結合剤は、ＭＣＭ、例えばＭＣＭ２またはＭＣＭ７に特異的な抗原結合ドメインを有する抗体またはその断片であり得る。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体または上記のいずれかの断片であり得る。好ましくは、特異的結合剤は、モノクローナル抗体である。ＭＣＭ、ＡＲおよびＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体は、当該技術において知られている。
【００４６】
本発明の実施形態を、ここで、例によってのみ、以下の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ａ）抗ＰＳＡ（茶色、細胞質）、ｂ）抗ＰＳＡ（茶色、細胞質）および抗ＭＣＭ２（赤色、核）を用いる培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系のＤＡＫＯ比色分析染色の図である。プレートａ）は、抗ＰＳＡ抗体が、前立腺細胞の細胞質（１）を標識し、核が大きく肥大している（青色ヘマトキシリン染色）ことを示す。プレートｂ）は、細胞の細胞質を抗ＰＳＡで茶色に（１）、そして核を抗ＭＣＭ２抗体で赤色に（２）する二重染色を示す。
【図２】Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いるＣ４−２ｂ細胞系の比色分析単一染色の図である。プレートは、次のようにして標識する：ａ）Ｎ末端特異的抗ＡＲ抗体を用いる核だけのＤＡＢ染色（１）と、対比染色された細胞質（２）；ｂ）Ｃ末端特的抗ＡＲ抗体を用いる細胞の非局在化ＤＡＢ染色；ｃ）抗ＰＳＡ抗体を用いる細胞質（矢印）のＤＡＢ染色；ｄ）抗ＭＣＭ２抗体を用いる核（矢印）のｎｏｖａＲＥＤ染色；およびｅ）抗ＭＣＭ２抗体を用いる核（矢印）のｎｏｖａＲＥＤ染色。
【図３】Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いるＣ４−２ｂ細胞系の比色分析二重染色の図である。プレートは、ＤＡＢ−Ｎｉ（灰色）標識抗ＰＳＡ細胞質（１）と、ｎｏｖａＲＥＤ（赤色）抗ＭＣＭ２抗体標識核（２）とを示す。
【図４】培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の蛍光（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）染色の図である。抗ＰＳＡ抗体（緑色、細胞質）を用いたプレートａ）；ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色、核）；ｃ）２つの細胞の場所の明らかに別々の染色を示す合成およびｄ）別々の局在化を示す、抗ＰＳＡ（緑色、細胞質）および抗ＭＣＭ２（赤色、核）抗体を用いる合成画像。
【図５】培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の蛍光（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）染色の図である。抗ＡＲ抗体（緑色、核）を用いたプレートａ）；ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色、核）；およびｃ）ＡＲおよびＭＣＭ７抗原の核での共局在化を示す合成。
【図６】確認された前立腺がんの患者からの尿臨床試料から単離されたＣ４−２ｂ前立腺がん細胞の、抗ＡＲ（緑色）および抗ＣＭ７（赤色）抗体を用いる二重蛍光染色の図である。
【図７】損傷細胞および細胞破片の除去の図である。ａ）Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖ ＤｅａｄＣｅｒｔ粒子で前処理しなかった尿試料、およびｂ）死滅したかもしくは死滅しかけている細胞およびその他の細胞破片を除去する処理の後の尿試料から単離した、ヘマトキシリン染色された膀胱内皮細胞。
【図８】尿中で４時間にわたる培養Ｃ４−２ｂ前立腺細胞の核の生存／健康の図である。はっきりした赤色の核染色は、細胞が良好な状態にあることを示す。より強度が弱い赤色の染色、染色が欠如していることおよび細胞質染色が増加していることは、細胞が生存性を喪失し、患者試料において、前立腺がん細胞として明確に同定されないことを示す。
【図９】確認された前立腺がんの患者からの尿臨床試料から単離された前立腺がん細胞の、（ａ）抗ＡＲ（緑色）および（ｂ）抗ＭＣＭ７（赤色）抗体を用いる二重蛍光染色、ならびに（ｃ）ＡＲとＭＣＭとを用いる二重染色の合成画像の図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４８】
ＰＳＡおよびＭＣＭ抗原に対するＤＡＫＯ二重染色キットを用いる培養前立腺がん細胞の比色分析標識。
Ｃ４−２ｂ細胞を、Ｔ７５フラスコで、１０％ＦＢＳおよび２％ ｐｅｎｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中で、３７℃および５％ＣＯ２にて、９０％集密まで培養した。培地をピペット操作により除去し、細胞を、温めたＰＢＳで２回洗浄した。これらを、１０ｍｌトリプシン溶液で３７℃にて２〜３分インキュベートした後に、穏やかにかき混ぜることにより、フラスコ表面から剥した。細胞懸濁物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、存在する細胞数を、試料を血球計上で計数することにより決定した。これらを、次いで、遠心分離によりペレットにし、温めたＰＢＳに１×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁した。１５０μｌの分割量を、２０ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液を含有するバイアルに加え、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ−Ｔ２０００処理機に移した。これは、いずれの細胞破片も穏やかに砕き、細胞の均質な懸濁物を提供する。懸濁物を、細胞の均質な層を回収するフィルタを通して引き出した。流れ抵抗を監視することにより、この装置は、少なすぎるかまたは多すぎる細胞を含有する層を回収することを妨げる。捕捉された細胞を、１０ｍｍ直径の円のＵｒｏＣｙｔｅガラススライドに移した。次いで、スライドを、ｓｐｉｒｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈ Ｌｔｄ．ＥＧＫ−０１９５００Ａ）に浸し、排出し、１０ｃｍの距離からＳｕｒｇｉｐａｔｈコーティング固定溶液を１回噴霧し、平坦な表面において風乾した。
【００４９】
細胞染色：細胞を、ＤＡＫＯ Ｇ／２二重染色キット（Ｋ５６３１）を用いて、次のようにして染色した。
【００５０】
スライドを５０％メタノールに５分間浸し、蒸留水ですすいだ後に、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水、ＤＡＫＯ試薬）ですすいだ。これらを、次いで、蒸留水、その後でＤＡＫＯ洗浄緩衝液（Ｓ３００６）を用いてすすぎ、自動染色機（ＤＡＫＯ）に移した。スライドを、２００μｌのＤＡＫＯ二重内因性酵素ブロック（製品コード（Ｋ５３６１））で５分間ブロックし、次いで、ＴＢＳで２回すすいだ。２００μｌの１次抗体Ａ０５６２ウサギ抗ヒトＰＳＡポリクローナル抗体（または対照ウサギ抗体）を、０．３μｇ／ｍｌで加え、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、そうでないと示さない限り、室温にて行った。スライドをＴＢＳで２回すすぎ、２００μｌのＥｎｖｉｓｉｏｎ（抗ウサギ）ポリマーセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｋ５３６１）を加え、３０分間インキュベートした。スライドを、ＴＢＳで再び２回すすぎ、ＤＡＫＯ ＤＡＢ基質を加え、スライドを５分間インキュベートした。スライドを自動染色機から取り出し、水道水で３分間すすいだ。
【００５１】
次に、熱回復ステップを行って、ＭＣＭ抗原を抗体に近づくことができるようにした。
【００５２】
スライドを、１ｍＭ ＥＤＴＡ熱回復緩衝液、ｐＨ７．８（ＤＡＫＯ）に浸し、全出力でマイクロ波処理した（８００Ｗ、１０分）。熱回復緩衝液を補給し、マイクロ波処理を１０分間繰り返した。スライドを、このようにして、１０のバッチで調製した。より少数の試料を調製する場合、ブランクのスライドを含めて、熱処理の一貫性のために合計数を１０にした。スライドを５分間冷却し、自動染色機に戻した。
【００５３】
スライドを、ＤＡＫＯ二重染色ブロック（補助試薬）を用いて再び、３分間ブロックし、ＴＢＳ緩衝液で２回すすいだ。第２の１次抗体であるマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（ＭＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）または対照マウス抗体を加え（１μｇ／ｍｌにて２００μｌ）、６０分間インキュベートした。スライドをＴＢＳで２回すすぎ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎポリマー−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｋ５３６１）を１５分間加えた（２００μｌ）。ＴＢＳでさらに２回すすいだ後に、２００μｌの液体パーマネントレッドａｌｋ−ｐｈｏｓ基質（ｖｏｌ、ＤＡＫＡコード）を７分間加えた。この試薬は新しく調製し、使用３０分前に自動染色機に加えた。これに、１滴／ｍｌのＤＡＫＯ Ｘ３０２１レバミソール（ＤＡＫＯ Ｘ３０２１）を補って、内因性ａｌｋ−ｐｈｏｓ活性をブロックした。
【００５４】
染色の後に、スライドを蒸留水ですすぎ、ＣｕＳＯ４溶液（２Ｌの水に１０ｇ ＣｕＳＯ４、１７ｇ ＮａＣｌ）に５分間浸し、次いで、水で再びすすいだ。これらを、次いで、ヘマトキシリンで１０秒間対比染色し、水ですすいだ。最後に、スライドをキシレンに５分間浸し、風乾し、カバーガラスをかけて、分析の準備ができた。
【００５５】
抗体を、ストック溶液から、ＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ０８０９またはＳ２０２２）中で所望の濃度に希釈した。スライドを、白色光の下で、Ｐｒｏｇ Ｒｅｓ Ｃ１４カラーカメラを備えたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳＫＯＰ４０顕微鏡を用いて視覚化した。白色光での視覚化に加えて、ＭＣＭ抗原を標識するために用いたアルカリホスファターゼ基質は、蛍光を放射する。これは、白黒カメラＡｘｉｏｃａｍ ＭＲｍおよび赤色フィルタを有するＺｅｉｓｓ−Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２を用いて観察した。画像は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて分析した（図１）。
【００５６】
代替のアッセイフォーマットでは、０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２を、以下の１つで置換した：
ｉ）０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）
ｉｉ）１／５０希釈でのＧｅｎｅｔｅｘ抗ＰＳＧＲ抗体（ＧＴＸ７２７４９）
ｉｉｉ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍマウスモノクローナル抗ＰＳＡエピトープ３抗体ＰＳ２（ａｂ１０１８９）。
ｉｖ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍマウスモノクローナル抗ＰＳＡエピトープ４抗体５Ｇ６（ａｂ１０１８６）。
ｖ）０．３μｇ／ｍｌでのＡｂｃａｍウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体（ａｂ９５３７）。
【００５７】
さらに、１．０μｇ／ｍｌでのＤ１．１２Ａ３マウス抗ヒトＭＣＭ２モノクローナル抗体を、以下の１つで置き換えた：
ｉ）３．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６（核よりもむしろ細胞質中のＮ末端またはＣ末端標識ＭＣＭ７のいずれかに対して特異的に産生され、よって比色分析アッセイにおいて抗ＡＲ抗体とともに用いるためだけに適切である抗体）、
ｉｉ）１／２００希釈での細胞系ＪＣＣ０７からのＶｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）マウス抗ヒトＭＣＭ３モノクローナル抗体（ＮＣＬ−ＭＣＭ３）、
ｉｉｉ）１／２０希釈での細胞系ＣＲＣＴ５．１からのＶｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）マウス抗ヒトＭＣＭ５モノクローナル抗体（ＮＣＬ−ＣＭ５）。
【００５８】
細胞質抗原（ＰＳＡ）を評価するための単一抗原染色アッセイのために、熱回復ステップおよび２次染色ステップを省略した。核染色抗原（ＡＲ、ＭＣＭの）を評価するための単一染色アッセイのために、１次染色ステップを省略した。
【００５９】
細胞質ＰＳＡを、培養前立腺細胞において、Ｄ１．１２．Ａ３抗体で標識できたことが見出された（図１ａ）。ＰＳＡは、「エピトープ」３および４に対する抗体を用いても検出されたが、「エピトープ」１に対する抗体を用いては検出されなかった（示さず）。同様に、前立腺特異的酸性ホスファターゼに対する抗体は前立腺細胞の細胞質を標識したが、前立腺特異的Ｇ共役型受容体（ＰＳＧＲ）に対する抗体は効果的でなかった。さらに、核抗原であるミニ染色体維持タンパク質ＭＣＭ２およびＭＣＭ７、ならびにアンドロゲン受容体（ＡＲ）は強い標識をもたらしたが、ＭＣＭ３およびＭＣＭ５は効果がより小さかった（示さず）。二重染色アッセイにおいて組み合わせて用いた場合に、ＰＳＡとＭＣＭ５（図１ｂ）およびＰＳＡとＭＣＭ７（示さず）はともに前立腺細胞を標識でき、ちょうどそれらの異なる細胞の位置で個別に同定できた。
【実施例２】
【００６０】
ＰＳＡアンドロゲン受容体（ＡＲ）およびＭＣＭ抗原に対するＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬を用いる培養Ｃ４−２ｂ前立腺がん細胞系の比色分析標識。
スライドを、実施例１に記載するようにして、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００装置を用いて調製した。全ての標識および洗浄ステップは、手動で行った。スライドを、まず、５０％メタノールに５分間浸し、２００μｌのＤＡＫＯ二重内因性酵素ブロック（製品コード（Ｋ５３６１））を５分間加えた。スライドを、次いで、蒸留水で３回およびＤＡＫＯ洗浄緩衝液（Ｓ３００６）で５回すすいだ。すぐに使用できるＩｍｍＰＲＥＳＳ正常ウマ血清（ＮＨＳ）を２．５％でスライドに２０分間加えてブロックし、その後に２００μｌのＤＡＫＯ Ａ０５６２ウサギ抗ヒトＰＳＡポリクローナル抗体（または対照ウサギ抗体）を０．３μｇ／ｍｌで加え、１０分間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、そうでないと示さない限り、室温にて行った。スライドをＤＡＫＯ洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬（ユニバーサルＨＲＰ標識抗ウサギおよび抗マウス）を３０分間加えた。スライドをＤＡＫＯ洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を５分間加えた。用いた基質は、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ（ＳＫ−４６００、紫色）、ＤＡＢ（ＳＫ−４１００、茶色）、ＤＡＢ−Ｎｉ（ＳＫ−４１００、灰色／黒色）またはＶｅｃｔｏｒ ＮｏｖａＲＥＤ（ＳＫ−４８００、赤色）のいずれか１つであった。スライドを洗浄緩衝液で５回洗浄した。
【００６１】
次に、熱回復ステップを行って、ＭＣＭ抗原を抗体に近づくことができるようにした。
【００６２】
スライドを１ｍＭ ＥＤＴＡ熱回復緩衝液、ｐＨ７．８（ＤＡＫＯ）に浸し、全出力でマイクロ波処理した（８００Ｗ、１０分）。熱回復緩衝液を補給し、マイクロ波処理を１０分間繰り返した。スライドを、このようにして、１０のバッチで調製した。より少数の試料を調製する場合、ブランクのスライドを含めて、熱処理の一貫性のために合計数を１０にした。スライドを５分間冷却させた。
【００６３】
スライドを、２．５％正常ウマ血清で２０分間、再びブロックした。第２の１次抗体であるマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（ＭＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）または対照マウス抗体を加え（１μｇ／ｍｌにて２００μｌ）、１０分間インキュベートした。これらを洗浄緩衝液で５回すすぎ、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬（上記のとおり）を３０分間加えた。洗浄緩衝液でさらに５回すすいだ後に、２００μｌのＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を５分間加えた。基質は、上で列挙した４つのうちのいずれか１つであったが、前のステップで用いたものと同じではなかった。
【００６４】
染色の後に、スライドを蒸留水ですすぎ、ＣｕＳＯ４溶液（２Ｌの水に１０ｇ ＣｕＳＯ４、１７ｇ ＮａＣｌ）に５分間浸し、水で再びすすいだ。これらを、次いで、ヘマトキシリンまたはメチルグリーンで１０秒間対比染色し、水ですすいだ。最後に、スライドをキシレンに５分間浸し、風乾し、カバーガラスをかけて、分析の準備ができた。
【００６５】
抗体を、ストック溶液から、希釈２．５％ＮＨＳを含むＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ０８０９またはＳ２０２２）中で所望の濃度に希釈した。スライドを、白色光の下で、Ｐｒｏｇ Ｒｅｓ Ｃ１４カラーカメラを備えたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳＫＯＰ４０顕微鏡を用いて視覚化した。核染色抗原（ＡＲ、ＭＣＭの）を評価するための単一染色アッセイのために、１次染色ステップを省略した。細胞質抗原（ＰＳＡ）を評価するための単一抗原染色アッセイのために、熱回復ステップおよび２次染色ステップを省略した。
【００６６】
代替のアッセイフォーマットでは、０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２を、０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）または０．３μｇ／ｍｌでの抗アンドロゲン受容体Ｃ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１５）で置換した。１．０μｇ／ｍｌでのＤ１．１２Ａ３マウス抗ヒトＭＣＭ２モノクローナル抗体を、３．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６で置き換えた。染色は、以下のＩｍｍＰＲＥＳＳ基質を様々に用いて達成した：単独または組み合わせて、かつ対比染色ありまたはなしでのＤＡＢ（茶色）、ＤＡＢ−Ｎｉ（灰色、黒色）、ｎｏｖａＲＥＤ（赤色）またはＶＩＰ（紫色）。
【００６７】
Ｎ末端に特異的なＡＲ抗体は、核をはっきりと標識できたが（図２ａ）、Ｃ末端特異的抗体は、いずれのはっきりした細胞の局在化も示さず、よって適切でないことが見出された（図２ｂ）。ＰＳＡ抗原も、細胞の細胞質で検出された（図２ｃ）。細胞周期抗原ＭＣＭ２およびＭＣＭ７に対する抗体はともに、核を標識できた（図２ｄおよびｅ）。全ての異なる基質は、単一染色のために用いた場合に、効果的であることが見出された（示さず）。二重染色について、いくつかの組合せは、それらの外観が類似するので、他のものよりもあまり適切でなかった。ＤＡＢ−ＮｉとｎｏｖａＲＥＤおよびＤＡＢとｖｅｃｔａ ＶＩＰは、良好な画像を生成することが見出された（図３）。このアッセイフォーマットでは、ＰＳＡは、１つまたは複数のＭＣＭ抗原と組み合わせた前立腺細胞特異的マーカーとして用いなければならない。その核局在性のために、ＡＲは、このフォーマットにおいて適切でない。
【実施例３】
【００６８】
前立腺細胞系Ｃ４−２ｂの蛍光標識。
前立腺がん細胞系Ｃ４−２ｂを培養し、「Ｔｈｉｎｐｒｅｐ」スライドを、上の実施例１に詳細に記載するようにして調製した。
【００６９】
細胞染色：
スライドを、５０％メタノールに５分間浸し、蒸留水で５分間洗浄し、ＤＡＫＯ洗浄緩衝液で１回すすいだ。２００マイクロリットルの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をスライドに５分間加えて、細胞を透過性にした。これらを、次いで、洗浄緩衝液で３回および水で１回すすいだ。１００マイクロリットルのＩｍａｇｅ−ＩＴ ＦＸシグナルエンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉ３６９３３）を加え、室温にて３０分間インキュベートした。スライドを洗浄緩衝液で３回すすいだ後に、蒸留水で１回すすいだ。
【００７０】
１次抗体ミックスまたは対照抗体（０．３μｇ／ｍｌでのウサギ抗ＰＳＡおよび１μｇ／ｍｌでのマウス抗ＭＣＭ２）をスライドに加え（各１００μｌ）、９０分間インキュベートした。ミックスは、以下の組合せの１つを含んだ：ｉ）ＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２（０．３μｇ／ｍｌ）およびマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３（１．０μｇ／ｍｌ）；ｉｉ）ＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２およびＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６（１．０μｇ／ｍｌ）；ｉｉｉ）Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体ｓｃ８１６（０．３μｇ／ｍｌ）およびマウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３；またはｉｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体ｓｃ８１６およびＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６。
【００７１】
スライドを、洗浄緩衝液で３回、および水で１回すすいだ。２００μｌの２種のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ２次抗体のミックス（１／１０００希釈）をスライドに加え、３０分間インキュベートした。用いたミックスは、上記の１次抗体ミックスと関連して次のとおりであった：ｉ）およびｉｉｉ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（緑色）抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１４５）；ｉｉ）およびｉｖ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（緑色）抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１２５）。
【実施例４】
【００７２】
患者の尿からの前立腺細胞の蛍光標識。
尿試料を、確認された前立腺がんの２名の患者から得て、次のようにして直ちに処理した。試料を、５０ｍｌファルコンチューブ中で６００ｇにて５分間遠心分離して、細胞をペレットにし、上清を処分した。細胞ペレットを、小容量のＣｙｔｏｌｙｔ（Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐ）に穏やかにかき混ぜることにより再懸濁し、チューブに３０ｍｌまでＣｙｔｏＬｙｔを足した。懸濁物を５分間ボルテックスし、再び遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液に再懸濁し、２０ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔを含有するバイアルに移した。バイアルをＴｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００に入れ、上の実施例３に記載するようにしてスライドを調製した。
【００７３】
細胞を、１．０μｇ／ｍｌでのＳａｎｔａｃｒｕｚ１４１．２マウス抗ＭＣＭ７モノクローナル抗体ｓｃ−９９６６、および０．３μｇ／ｍｌでのＤＡＫＯウサギ抗ＰＳＡポリクローナル抗体Ａ０５６２または０．３μｇ／ｍｌでのＩｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ−２０ウサギ抗アンドロゲン受容体Ｎ末端特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ８１６）のいずれかで標識した（図６）。前立腺細胞は、両方の試料中で同定された。これらは、尿への長期の曝露の後の細胞の乏しい状態のために、全て、不規則な形態のものであり、様々な程度の細胞質染色を示した。
【実施例５】
【００７４】
尿試料からの破片の除去の効果。
尿試料を６００ｇにて１０分間遠心分離して、細胞をペレットにした。細胞を、１ｍｌ ＰＢＳに再懸濁した。全細胞数を、血球計を用いて決定した。細胞懸濁物の容量を、１００μｌが５×１０６細胞を含有するように調整した（ＰＢＳの添加によるか、または再びペレットにして適当な容量のＰＢＳに再懸濁することのいずれかにより）。
【００７５】
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖ Ｄｅａｄ Ｃｅｒｔナノ粒子（Ｉｍｕｎｏｓｏｌｖ Ｌｔｄ．、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ）のストックバイアルを、３０秒間ボルテックスした。２５マイクロリットルのナノ粒子を、１ｍｌ ＰＢＳを含有するエッペンドルフチューブに移した。チューブを、付属する磁性分離器に３〜５分間、粒子が磁石に反発して集まるまで入れた。緩衝液をピペット操作により除去し、チューブを取り出した。粒子を、１００μｌのＰＢＳにボルテックスすることにより再懸濁した。１００マイクロリットルの細胞（５×１０６細胞）を粒子懸濁物に加え、混合物を４℃にて４０分間インキュベートした。このインキュベーションの間に、磁性ナノ粒子は、任意の死滅したまたは死滅しかけている細胞の表面上に選択的に発現される抗原と結合する。さらに８００μｌのＰＢＳをチューブに加え、穏やかに混合し、次いで、チューブを磁性分離器に５分間戻した。生存性の健常細胞を含有する上清をピペット操作により取り出し、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔのバイアル（２０ｍｌ）に加えた。ＤｅａｄＣｅｒｔ粒子を用いて予め枯渇させていない細胞の第２の１００μｌ分割量を、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔｅの別のバイアルに加えた。両方の試料を、次いで、実施例１に記載するようにしてＴｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２００中で処理した。スライドを、視覚化のためにヘマトキシリンで染色した（図７）。
【００７６】
主に、未処理試料中の非生存細胞から多数の破片の粒子が生じた。これらは、しばしば、非特異的に標識されることがあり、頻繁に観察される真のがん細胞の様々な細胞形態のために、真のがん細胞からしばしば区別できない。これとは対照的に、処理した試料は、かなりより少ない破片の粒子を含有し、このことにより、患者のより正確で堅固な評価を行うことが可能になる。
【実施例６】
【００７７】
尿中での前立腺がん細胞の生存。
前立腺細胞系Ｃ４−２ｂを、実施例１に記載するようにして培養した。培養フラスコが８０％集密に到達したときに、細胞を遠心分離により採集し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）に再懸濁し、計数した。５ｍｌのＰＢＳ中のおよそ２×１０７細胞を、健常提供者から提供された２５ｍｌの尿に加え、４℃にて貯蔵した。試料を、冷蔵庫から１時間、２時間、３時間および４時間後に取り出し、実施例１に詳細に記載するようにして、Ｔｈｉｎｐｒｅｐ Ｔ２０００装置を用いてスライドを調製した。スライドを、マウス抗ＭＣＭ２ Ｄ１．１２Ａ３抗体およびＤＡＫＯ抗マウスアルカリホスファターゼ試薬を用いて、実施例１のようにして染色し、ともに白色光の下で観察した（図８）。１時間および２時間では、細胞は、強い強度のはっきりした核染色を示した。３時間までに、染色は核でよりはっきりしなくなり、強度がより低くなった。この点で、いくつかの細胞は、ＭＣＭについて陽性に染色されなかった。４時間までに、健常細胞の割合は、著しく低減した（データは示さず）。
【００７８】
ＭＣＭで染色される細胞が、核の完全性が４時間まで高いままであり、７２時間以降は徐々に劣化する（データは示さず）ことを示したことは、特に重要である。保護性の細胞膜の消失／解体が１時間目以降から始まり、前立腺特異的細胞の細胞質の細胞完全性染色の指針であるＰＳＡが、１時間目以降から急激に悪化したことが示された（データは示さず）。
【実施例７】
【００７９】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）およびミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭ）抗体を用いる前立腺がん細胞系の染色。
前立腺がんの患者についての以前の研究は、前立腺上皮細胞が、高い血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の値を示す患者の尿中に捕捉され得ることを示した。細胞は、数がほとんどなく、排尿から１時間以内に処理しなければならない。我々は、核マーカーとしてＭＣＭおよび細胞質マーカーとしてＰＳＡを用いる尿中の前立腺細胞検出のための方法を既に確立した。尿中でのこれらの細胞の迅速な劣化は、しかし、特に細胞膜であり、よって、細胞の細胞質は、より堅固な抗体マーカーを必要とした。
【００８０】
排尿後４時間まで、前立腺上皮細胞の核が無傷のままであることがわかった（実施例６を参照されたい）。前立腺組織に特異的親和性を有する核マーカーを選択して調査した。前立腺がん細胞系および前立腺がんの患者または血清ＰＳＡ値が高い患者の尿の両方を用いて、アンドロゲン受容体抗体を用いて前立腺細胞が良好に画定された。
【００８１】
樹立前立腺がん細胞系（Ｃ４２ｂ）をスパイクした正常尿を、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｔ２０００機械上でｕｒｏｃｙｔｅスライドを用いて実験室にて調製した。スライドを、５０％メタノールに５分間浸し、脱イオン水で洗浄し、２００ｕｌの０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を５分間加えて、細胞を透過性にした。ＤＡＫＯ緩衝液で３回および脱イオン水で１回さらにすすいだ後に、２滴（１００ｕｌ）のＩｍａｇｅ−ＩＴ Ｆｘシグナルエンハンサーまたは十分な容量を用いて各カバーガラスまたは区画を覆い、次いで、室温にて３０分間インキュベートした。緩衝液で３回および水で１回さらにすすいだ後に、２００ｕｌの１次抗体ＡＲ（０．３ｕｇ／ｍｌ ＡＲ−Ｎ２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ−８１６を供給源とする）および１．１５ｕｇ／ｍｌ ＭＣＭ（ＭＣＭ７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ｓｃ９９６６を供給源とする）と、０．５％粉乳中で６０分間インキュベートする。スライドを、緩衝液で３回および脱イオン水で１回すすぎ、関連する２次Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ抗体（ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−１１０３４、およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ１（γ１）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−２１１２５）と、暗所にて３０分間インキュベートする。スライドを、緩衝液で３回および水で１回再びすすいだ後に、１滴のＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤を室温にて加え、その後、全てのスライドにカバーガラスをかける。スライドを、戴置された試料を平坦な乾燥面に置き、暗所で室温にて２４時間インキュベートすることにより硬化させる。蛍光を、異なる蛍光フィルタを有する蛍光顕微鏡を１０秒間用いて検出した（図９）。
【００８２】
実験は、アンドロゲン受容体およびミニ染色体維持タンパク質の両方について、はっきりと画定した核染色を示した。
【００８３】
同一の実験を、ＭＣＭ７（１：１００希釈）およびウサギモノクローナルアンドロゲン受容体抗体（ＡＲ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．を供給源とする）を用いて行った。さらに、１：５０希釈でのＭＣＭ２およびウサギモノクローナルアンドロゲン受容体抗体（ＡＲ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．を供給源とする）を用いて別の実験を行った。ＭＣＭ２またはＭＣＭ７とアンドロゲン受容体との組合せによる前立腺の核の特異性および固定化の評価のために、陰性対照としてＣ４２ｂ前立腺上皮細胞およびＥＪ２８膀胱がん細胞の混合集団を用いて、スライドを、２つの異なる組合せで染色した。採用した方法は、アンドロゲン受容体ポリクローナル抗体（上記）およびＭＣＭ７を組み込んだＣ４２ｂ細胞系において用いたものと同一であった。この実験では、Ｃ４２ｂ細胞を、１：５０希釈でのＭＣＭ２および１：１００希釈でのＲａｂＭＡｂ ＡＲを用いて染色した。個別の核染色要素は、１：１００希釈でのアンドロゲン受容体を有するＡＦ４８８−１／１０００、および１：５０希釈でのＭＣＭ２との組合せでのＡＦ５９４−１／１０００を用いて、蛍光顕微鏡の下で明確に同定された（データは示さず）。これらの状況で染色された前立腺細胞系の個別の画像は、同定された前立腺細胞の核における染色特性の明確な同定を示した。アンドロゲン受容体およびＭＣＭ２抗体を関連するＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ蛍光抗体と組み合わせた場合、はっきりと画定した核染色パターンの良好な証拠があり、このことにより、アンドロゲン受容体の緑色の着色が、ＭＣＭ２核染色の赤色の着色と一緒に、二重核染色特徴により、標準化された前立腺悪性細胞系から、前立腺上皮細胞を同定するオレンジ色の着色された組合せを生成した（データは示さず）。Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８のそれぞれ前立腺および膀胱悪性細胞系の混合集団をともに用いるさらなる研究は、アンドロゲン受容体およびＭＣＭ７と組み合わせた場合に、染色された黄色の核を有する前立腺細胞の良好な証拠を示した。ＥＪ２８膀胱がん細胞は、全く染色されなかった。同様に、Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８細胞系の混合集団は、１：１００でのアンドロゲン受容体および１：５０希釈でのＭＣＭ２で染色した場合に、Ｃ４２ｂおよびＥＪ２８染色細胞の混合集団の合成画像を示し、ここでは、ＥＪ２８染色細胞は、アンドロゲン受容体染色の証拠を示さなかった。
【００８４】
これらの実験から、ＭＡｂ ＡＲ＋ＭＣＭ７の組合せを用いて核がはっきりと画定して染色され、同様に、ＭＡｂ ＡＲおよびＭＣＭ２の染色活性があることが確認される。これらのデータから、上皮前立腺がん細胞系を、核レベルにて、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７の両方を、アンドロゲン受容体抗体、この場合はＭＡｂ ＡＲとともに用いて染色できることが確認される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の前立腺がん細胞を検出するための診断または予後判定のアッセイであって、
ｉ）前記生体試料から単離細胞試料を得て、単離細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、
ｉｉ）単離細胞試料を、アンドロゲン受容体ポリペプチド［ＡＲ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉｉ）単離細胞試料を、前立腺特異抗原［ＰＳＡ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）２つ以上の結合剤の結合を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、２つ以上の結合剤と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、生体試料中の前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイ。
【請求項２】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２である、請求項２または３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ７である、請求項２または３に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ＭＣＭポリペプチドが、図１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列で表される、請求項１から６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
前記細胞試料を、ＡＲと特異的に結合する結合剤およびＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させる、請求項１から７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
少なくとも１つのＭＣＭポリペプチド、ＡＲおよびＰＳＡを検出する、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７、ＡＲならびにＰＳＡを検出する、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が逆である、請求項１から１０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記結合剤が、モノクローナル抗体またはその活性結合断片である、請求項１から１１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記生体試料が、単離体液の試料である、請求項１から１２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記体液が、尿、精液または精漿である、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記生体試料が、ろ過され、前記ろ過された試料が、前記単離細胞試料を提供する、請求項１３または１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
対象における前立腺がんを決定するための診断または予後判定アッセイであって、
ｉ）第１単離生体試料を得て、試料を、ＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉ）前記試料中のＰＳＡの存在を検出するステップと、
ｉｉｉ）対象から第２生体試料を得て、単離細胞試料を調製して、前記細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体ポリペプチドと特異的に結合する第１および第２の結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）前記ＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体の存在を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、ＭＣＭおよびアンドロゲン受容体の両方と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイ。
【請求項１７】
前記第１生体試料が、血清を含む、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記第２生体試料が、尿または精液である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である、請求項１６から１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ７である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２３】
結合剤の前記検出が、蛍光放射による、請求項１から２２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２４】
結合剤の前記検出が、酵素的手段による、請求項１から２２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２５】
第１、第２および第３の結合剤を含むキットであって、前記結合剤が、それぞれＭＣＭポリペプチド、アンドロゲン受容体ポリペプチドおよび前立腺特異抗原ポリペプチドと結合するキット。
【請求項２６】
前記結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項１】
生体試料中の前立腺がん細胞を検出するための診断または予後判定のアッセイであって、
ｉ）前記生体試料から単離細胞試料を得て、単離細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、
ｉｉ）単離細胞試料を、アンドロゲン受容体ポリペプチド［ＡＲ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉｉ）単離細胞試料を、前立腺特異抗原［ＰＳＡ］と特異的に結合するさらなる結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）２つ以上の結合剤の結合を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、２つ以上の結合剤と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、生体試料中の前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイ。
【請求項２】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２である、請求項２または３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ７である、請求項２または３に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ＭＣＭポリペプチドが、図１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列で表される、請求項１から６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
前記細胞試料を、ＡＲと特異的に結合する結合剤およびＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させる、請求項１から７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
少なくとも１つのＭＣＭポリペプチド、ＡＲおよびＰＳＡを検出する、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７、ＡＲならびにＰＳＡを検出する、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が逆である、請求項１から１０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記結合剤が、モノクローナル抗体またはその活性結合断片である、請求項１から１１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記生体試料が、単離体液の試料である、請求項１から１２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記体液が、尿、精液または精漿である、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記生体試料が、ろ過され、前記ろ過された試料が、前記単離細胞試料を提供する、請求項１３または１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
対象における前立腺がんを決定するための診断または予後判定アッセイであって、
ｉ）第１単離生体試料を得て、試料を、ＰＳＡと特異的に結合する結合剤と接触させるステップと、場合によって、
ｉｉ）前記試料中のＰＳＡの存在を検出するステップと、
ｉｉｉ）対象から第２生体試料を得て、単離細胞試料を調製して、前記細胞試料を、少なくとも１つのＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体ポリペプチドと特異的に結合する第１および第２の結合剤と接触させるステップと、
ｉｖ）前記ＭＣＭポリペプチドおよびアンドロゲン受容体の存在を検出するステップと、
ｖ）前記単離細胞試料中の、ＭＣＭおよびアンドロゲン受容体の両方と陽性に結合する細胞の数を決定するステップであって、陽性細胞の数が、前立腺がん細胞の存在の指標であるステップと
を含むアッセイ。
【請求項１７】
前記第１生体試料が、血清を含む、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記第２生体試料が、尿または精液である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２および／またはＭＣＭ７である、請求項１６から１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ７である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記ＭＣＭポリペプチドが、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７である、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２３】
結合剤の前記検出が、蛍光放射による、請求項１から２２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２４】
結合剤の前記検出が、酵素的手段による、請求項１から２２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２５】
第１、第２および第３の結合剤を含むキットであって、前記結合剤が、それぞれＭＣＭポリペプチド、アンドロゲン受容体ポリペプチドおよび前立腺特異抗原ポリペプチドと結合するキット。
【請求項２６】
前記結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１３８１２（Ｐ２０１３−５１３８１２Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３８９０（Ｐ２０１２−５４３８９０）
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２２７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３６１９
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１０１８８１４８）サイトシステムズ リミテッド (3)
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２２７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３６１９
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１０１８８１４８）サイトシステムズ リミテッド (3)
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