アトピー性皮膚炎様皮膚炎に緩和活性を示す健康食品
【課題】
アトピー性皮膚炎は増悪と緩解を繰り返する強い掻痒を伴う湿疹性の皮膚疾患であり、近年患者は増加の傾向を示しており、時に起こる激しい掻痒により、若年層の学習活動に悪影響を及ぼすことがある、かかるアトピー性皮膚炎に対して長期間摂取しても安全で緩和効果のある健康食品を提供する。
【解決手段】
中国古来の神農本草経に記載された蜜蜂の子の薬能に着目し、蜜蜂の産卵後21日目の雄蜜蜂の子40を湿気の籠らない特製のかご20に入れて、架台30にのせ、密閉室内で除湿、殺菌処理した後、凍結乾燥し、粉砕し、規定品質のFD末を得るとともに、この粉末のアトピー性皮膚炎様皮膚炎モデルマウスに対する緩和効果を実験薬理学的手段によって証明し、雄蜜蜂の子粉末の蛋白質部分を構成する個々のアミノ酸含量が所定以上の品質を有するアトピー性皮膚炎様皮膚疾患に有効な蜂の子粉末を提供する。
アトピー性皮膚炎は増悪と緩解を繰り返する強い掻痒を伴う湿疹性の皮膚疾患であり、近年患者は増加の傾向を示しており、時に起こる激しい掻痒により、若年層の学習活動に悪影響を及ぼすことがある、かかるアトピー性皮膚炎に対して長期間摂取しても安全で緩和効果のある健康食品を提供する。
【解決手段】
中国古来の神農本草経に記載された蜜蜂の子の薬能に着目し、蜜蜂の産卵後21日目の雄蜜蜂の子40を湿気の籠らない特製のかご20に入れて、架台30にのせ、密閉室内で除湿、殺菌処理した後、凍結乾燥し、粉砕し、規定品質のFD末を得るとともに、この粉末のアトピー性皮膚炎様皮膚炎モデルマウスに対する緩和効果を実験薬理学的手段によって証明し、雄蜜蜂の子粉末の蛋白質部分を構成する個々のアミノ酸含量が所定以上の品質を有するアトピー性皮膚炎様皮膚疾患に有効な蜂の子粉末を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品等として有効に利用できるアトピー性皮膚炎モデルマウスに緩和活性を示す雄蜜蜂の子FD末に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は急性、悪急性、慢性、再発性の皮膚炎であり、強い掻痒を伴う湿疹を主病変とする疾患であり、通常生後2カ月~1年の間にアトピー性皮膚炎患者の60%が発症し、5才までに30%、6〜20才の間に10%が発症するといわれている。患者の多くは気管支喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎の家族歴、などの既往歴をもっており、幼小児期に発症した症状は成長に伴って緩解する疾患とされていたが、近年理由はよく分からないが、患者の総数が増大しており、なかでも成人重症例の患者の増加は社会問題にもなっている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は激しい掻痒を伴うため、睡眠が妨げられたり、学習活動に集中できなくなる学童や生徒も増加しつつある。羅患者の多くはまた掻痒により誘発される掻破行動によって皮膚バリアが傷害されて皮膚症状が増悪化し、それがさらに掻痒を誘発し、悪循環を形成し、慢性化への経過をたどることになる。すなわち、漿液性丘疹、落屑、痂皮を伴い、重症化すれば、びらん、浸潤などをきたすことになる。また傷害部位から黄色ブドウ球菌の二次感染を引き起こし結果的に重症になる例もある。よってアトピー性皮膚炎症状を緩和したり、掻痒を抑制する薬剤や健康食品の開発が望まれている。
【０００４】
アトピー性皮膚炎の薬物治療には、皮膚の乾燥に対して12%アンモニウム乳酸ローションや10%α-ヒドロキシ酸ローションが使用され、外用抗炎症剤としてステロイド剤、掻痒に対しては経口抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤が用いられている。しかしながら抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤は皮膚傷害が慢性化した患者や重症例の患者の激しい掻痒に対する効果は多くの場合期待できず、またステロイド剤は長期的に使用した場合、皮膚の委縮を生じる可能性があり、また過度に使用すると脳下垂体、副腎系の抑制、骨粗鬆症、成長発達遅延を起こす可能性もあるため使用に当たっては特別の注意が喚起されている。
【０００５】
人に有効な治療薬、予防薬、あるいは症状緩和に有効なサプリメントの開発や、有効性の作用様式を解明するためには、人と同様な動物の実験薬理学的病態モデルが不可欠となる。アトピー性皮膚炎の病態は複雑であり、その診断は掻痒、特徴的な湿疹としてその身体における分布や慢性化・反復性についての経過を観察したうえで実施される。アトピー性皮膚炎と診断された患者では、その80%が高い血中免疫グロブリン(IgE)値を示しており、多くの場合インターロイキン-4（IL-4）の血中濃度も高くなっていることから、これらの血中濃度は血液検査における診断基準のひとつとなっている。血中IgE、 IL-4値が高く、アトピー性皮膚炎に類似した皮膚症状を自然発症する動物モデルとしてNC/Ngaマウスが1997年に名古屋大学農学部の杉田（非特許文献1）らによって発見、系統化され、このモデルを応用してアトピー性皮膚炎の解明や改善薬の研究が実施されるようになった。
【０００６】
NC/Ngaマウスを使用したアトピー性皮膚炎モデルに対するイソフラボンのゲニステイン（非特許文献2）およびローヤルゼリーの作用についての報告（非特許文献3）がなされているが、ゲニステインは血中IgE値に影響を及ぼさなかったことからアトピー性皮膚炎緩和効果については期待できないと考えられる。ローヤルゼリーはピクリルクロライド処理したNC/Ngaマウスに生じたアトピー性皮膚炎様の皮膚損傷を抑制することからサプリメントとして予防的利用が推奨されている。またイヌカラマツ抽出物（非特許文献4）、柿の葉抽出物（非特許文献5）、ハンゲシヨウの葉の抽出物（非特許文献6）、ホップ水抽出物(
非特許文献7)についても、上記モデルに有効性を示したことが報告されている。天然素材からなるこれらのエキスは長期連続投与によって依存性や副作用の面から安全であると考えられるが、加工、濃縮されたエキスという点で必ずしも安全性が保証されるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2006-197911号公報
【特許文献２】特開2002-17296号公報
【特許文献３】特開2006-211946号公報
【特許文献４】特開2009-254348号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】InternationalImmunology 9、 1997
【非特許文献２】大豆たんぱく質研究、7巻、 2004年
【非特許文献３】International Immunopharmacology 3、 2003
【非特許文献４】日本薬理学雑誌、 124巻、4号、2004年
【非特許文献５】日本栄養・食糧学会誌、 54巻、1号、2001年
【非特許文献６】BiolPharm Bull vol.31 No.1、 2008
【非特許文献７】BiosciBiotechnol Biochem vol.72、 No.4 2008
【非特許文献８】Int. Immunol.9、 461-466
【非特許文献９】J.Dermatol.Sci.36:1-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎は多くの場合、幼児期に発症し、成長につれ症状が緩解してゆく疾患とはいえ、中学、高校生になっても一向に緩解、緩和に至らず、激しい掻痒も止まらず、一時期治まったとしても、すぐに激しい掻痒症状が再発することも多く、特に学習に励む若年者にとって苦しい状態が強いられ、ステロイド剤の外用や抗ヒスタミン剤、抗炎症剤の服用で一時的に緩解もするが、やがて慢性化して、薬剤の効果も弱まり、逆に副作用が発現してくるといった現状に鑑み、長期に連用しても副作用の発現がなく、結果的にアトピー性皮膚炎緩和作用の強い健康食品の開発を希求し、これを広く天然素材に求めた。
【００１０】
蜂子（ほうし）は、中国最古の薬物書の神農本草経に、風頭（風が頭にあたって痛んだり、目まいがしたりする症状）、蟲毒（虫を用いたまじないの毒の毒気を取り除く）、虚羸（弱り衰えた病気）、傷中（内臓の機能が傷ついた病気）に応用し、これを久しく服用すれば皮膚に艶が出てくるとの記載あり、この蜂子がトウヨウバチApis cerana Fabricus(中華蜜蜂)の幼虫やさなぎであることに着目した。
【００１１】
本発明は、蜜蜂（トウヨウミツバチ、ニホンミツバチ）の生後20日あるいは21日目の雄のさなぎを乾燥、殺菌し、粉末を製し、アトピー性皮膚炎様の湿疹性皮膚炎を自然発症するNC/Ngaマウスを用いて、この粉末の該皮膚炎に対する効果を鋭意探求し、該皮膚症状および病理的検査値を明確に改善することを発見することによって完成された。すなわち生後20日あるいは21日目の雄蜜蜂の子から製した粉末の健康食品の提供に関する。
【００１２】
蜂の子を利用する加工食品としては、疲労回復効果を高めることを期待した蜂の子粉末とトレハロースの混合物（特許文献1）や蜂の子粉末と虫媒花粉、梅肉エキス、香酢の粉末の混合物からなる加工食品（特許文献2）が公示されているが、何れもアトピー性皮膚炎様皮膚症状については言及されておらず、天然素材から構成される加工食品だけに製品に
対する規格や基準も設定されていない。また蜂の子をプロテアーゼと反応させて産生した分解産物のペプタイドを熱処理した後、スプレードライなどした粉末が加工食品として提供されている（特許文献3、4）。しかしこれら分解産物は、元来天然の蜂の子のままで薬理効果が期待される構成成分の蛋白が分解あるいは変性されたものになっており、記載された更年期障害や自律神経失調症に対する有効性について実験薬理学的な有効性を示す証明は何らなされていない。加えて酵素分解反応に使用されたプロテアーゼの分解物や、反応時のpH調整に使用された酸性無機物は加工食品中に残されたままになっていることには問題がある。
【発明の効果】
【００１３】
雄蜜蜂の子中の構成蛋白が加熱による変性や、酵素分解をすることなく、所定の規格、基準が遵守された雄蜜蜂の子粉末（蜂の子FD末）を製し、用いることによって、抗ヒスタミン剤や抗炎症剤の連服による胃腸の潰瘍症状や中枢神経症状などの副作用の不安がなく、外用ステロイド剤と併用しても、ステロイド剤の外用を中止した後も連服できる有効性と安全性を有するアトピー性皮膚炎に対する緩和作用をもった健康食品の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】巣房と巣板から取出した雄蜜蜂の子と除湿かごを示す図である。
【図２】小室内で除湿殺菌処理する状態を示すステンレス製の架台とかごの図である。
【図３】アトピー性皮膚炎に対する蜂の子FD末の緩和効果を評価する実験のプロトコールを示す図である。
【図４】TNCB感作後日数に対応する皮膚炎スコアを示す図である。
【図５】TNCB感作後日数に対応する耳介の厚さを示す図である。
【図６】耳介皮膚の病理組織学的特徴の観察結果を示す図である。
【図７】試験群に対応する血清IL-4濃度を示す図である。
【図８】試験群に対応する血清IgE値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
請求項3にかかる所定の品質をもった蜂の子FD末の製造方法については、図1に示すような一般的によく利用される雄蜂用の人工巣板10のなかの巣房11に産卵させた卵を、さなぎの状態から羽化する3日あるいは4日前、好ましくは3日前、すなわち20日あるいは21日目、好ましくは21日目の蜂の子30を取り出し、ステンレス製の、湿気が籠らないように底部の4隅に足21のついた及び底部と4側面の半分に網目22のついた特製の平面かご20に蜂の子を一層状に入れ、これを図2に示すようなステンレス製の移動可能な、格子状棚のついた架台30に2セットずつを高さ50cmの間隔で三段の棚のうえに並べて、図示しない紫外線殺菌灯と除湿機を付設した小部屋に移動させ、密閉した状態で、蜂の子を3〜5時間、好ましくは4時間殺菌、除湿する。架台からかごを取りはずし、手動で揺り動かしながら扇風機で1〜3分風を送り、夾雑物などを取り除く。これらの操作を経ることにより、均一で良質な蜂の子FD末を得ることができる。部屋には複数の網棚を設置することによって大量処理が可能となる。除湿機は台数及びメーカーを特に指定しないが、除湿機能の高いものが好ましい。
例えばパナソニックF-VHFX-120、東芝PAD-C100PFX、シャープCV2100プラズマクラスターなどである。
乾燥蜂の子を-20〜-30℃、好ましくは-20℃に一旦冷凍し、ひきつづき、真空冷凍乾燥機（DGJ-100-24）で5〜10時間、好ましくは6時間冷凍乾燥した後、除湿機を設置した室で1時間放置し、粉砕機（CWF-40 ）にかけて、淡灰色の粉末を50〜80メッシュ、好ましくは60メッシュの篩にかけて所望の蜂の子FD末（雄由来）を得ることができる。かくして得られた蜂の子FD末を除湿室内で空気と攪拌混合した後、40〜45℃、７時間遠赤外線（毎ロット100kg、温度40-45℃ 7時間）を照射して滅菌したものは請求項1、2の健康食品として提供できる。
【００１６】
本発明の蜂の子FD末を摂取する場合は、消化管内に摂取できる方法であれば何でもよく、蜂の子FD末の一定量をそのまま飲料水とともに服用するかあるいは顆粒状、タブレット状、カプセル状に加工し、経口的に摂取することも可能である。またオリーブ油を含むドレッシングをかけた生野菜とともに食しても同様の効果が得られる。
【実施例】
【００１７】
以下に本発明に関する実施例として所定の規格・基準を有する蜂の子FD末の製造法およびアトピー性皮膚炎様皮膚炎緩和剤としての有効性の実験薬理学的詳細を実施例1に示したが、これらは何ら本発明を限定するものではない。また蜂の子FD末を得る原料としては蜜蜂であれば日本、南米、ロシア、朝鮮半島、アメリカ、中国産のものすべて利用することができる。
【実施例１】
【００１８】
巣板に産卵後21日目のトウヨウ蜜蜂の雄の子を、ステンレス製の網状の平面かご（60x40x4cm）にほぼ一層状になるように蜂の子2kgを並べ入れた。紫外線殺菌灯と除湿機を付設した部屋に、ステンレス製の移動式3段の棚付き格子状台を設置し、高さ50cm間隔に棚をセットし、蜂の子の入ったかごをそのうえに置いて、部屋を密閉した状態で4時間殺菌、除湿した。かごを棚から降ろし手動で揺り動かしながら扇風機で1分間風を送った。表面の湿気がとれた乾燥蜂の子を-20℃に冷凍し、そのまま真空冷凍乾燥機で6時間乾燥した。乾燥した蜂の子を除湿した室に1時間放置した後、粉砕機で粉末にして、60メッシュの篩を通過した粉末を集めて5kgごとに蓋付プラスチック容器に移し、手動で振とう攪拌して粉末を均一化させた。これを平底のバットに移し、遠赤外線照射装置を設置した室で40℃で7時間遠赤外線を照射した後、室温で1時間除湿を設置した室に静置し、蜂の子FD末を得た。本蜂の子FD末は下記の規格・基準を有している。
リジン≧3.0% 総タンパク質 ≧40%
ヒスチジン≧1.4% 水分 ≦10%
フェニルアラニン≧2.0% 灰分 ≦5%
ロイシン≧4.2% 一般生菌数≦3、000個/g
イソロイシン≧2.8%
メチオニン≧1.0%
バリン≧3.0%
スレオニン≧2.0%
トリプトファン≧0.6%
【００１９】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎に対する蜂の子FD末の緩和効果を評価する実験は下記の方法で行った。
60匹のNC/Ngaマウスを、1群を10匹とする5つの試験群（1.陰性コントロール群、2.陽性コントロール群、3. 0.1%蜂の子FD末添加群、4. 0.5%添加群、5. 1%添加群）に分け、蜂の子FD末添加群にはそれぞれ蜂の子FD末が、標準飼料（CE-2、日本クレア、東京）中に0.1%、0.5%、1.0%の含有率になるように調整した飼料を準備した。2、4、6−trinitrochlorobenzene(TNCB)感作前7日から感作後47日まで、これら各群の飼料を、陰性のコントロール群、陽性のコントロール群には標準飼料のみを給餌した。
アトピー性皮膚炎様皮膚疾患の誘発：実験は図3に示したスケジュールで実施した。NC/Ngaマウス（雌、6週齢）をHarothaneで麻酔後、胸部・背部・腹部の毛をバリカンで刈った。0日目、陰性コントロールを除く総てのマウスに対し2%TNCB溶液（エタノール：アセトン=4:1）を胸部に50μl、腹部に50μl、後肢に50μlをそれぞれ皮膚に塗布して感作させた。これらのマウスに1%TNCB溶液の150μlを背部に、10μlずつを両耳に、1週間間隔で7回連続塗布してアトピー性皮皮膚病変を惹起させた。これら病変マウスに対して以下の検査項目について測定、観察を行った。
【００２０】
皮膚炎スコア：背部皮膚および耳介皮膚の病変の重篤度を次の基準
【非特許文献８】に従いスコア化した。皮膚における(1)発赤/出血、(2)水腫、(3)びらん/潰瘍、(4)乾皮症の各所見の程度を0（認めず）、1(軽微)、2（中等度）、3（重度）で評価し、その合計点数を皮膚炎スコア（最小0；最大12）とした
【非特許文献９】。耳介の厚さ：耳介の厚さはダイヤルシックネスゲージ（尾崎製作所、東京、日本）を用い、感作後0、4、11、18、25、32、39、46日目のTNCB塗布直前に測定した。病理組織学的検討：感作後47日目のマウスの耳介・背部皮膚を採材し、10%中性緩衝ホルマリン液にて固定後、定法に従いパラフィン包埋切片を作成し、ヘマトキシリン染色を施した。血清総IgEおよびサイトカイン濃度：TNCB感作後47日目の動物の心臓より血液を採取し、4℃条件下にて、3000 X g、5分間遠心分離を施し、血清を得た。市販ELISA測定キットを用い、血清総IgE、IL-4、IFN-γ濃度を測定した（IgE：Shibayagi、群馬、日本/IL-4・IFN-γ: Bender MedSystems、 Vienna、 Austria）。皮膚サイトカイン量：耳介皮膚を20mM Tris-buffer(pH7.5)に浸漬した後にホモジナイズし、10.000 X g、 5分間遠心分離を施し、上清を得た。当該上清をサンプルとし、市販ELISA測定キットを用い、IL-18、IL-12量を測定した（IL-18・IL-12: Bender MedSystems、 Vienna、 Austria）。
【００２１】
図4に示したごとく、TNCB感作後、蜂の子FD末を与えなかった陽性コントロールではアトピー性皮膚炎様皮膚病変はTNCB塗布を重ねるごとに発赤/出血、水腫、びらん/潰瘍、乾皮症を呈し、重篤度は増大したが、蜂の子FD末投与群では感作後32日目以降において、陽性コントロール群に比べて皮膚スコアが投与量依存的に下がることを見出した。図5に示したように耳介の肥厚も抑制されることを見出した。耳介皮膚の病理組織学的観察結果は図6に示したごとく、陽性コントロール群のマウスにおいて、表皮の肥厚・過角化、表皮と真皮の両組織で肥厚細胞、好酸球・リンパ球細胞の密な浸潤が認められた。蜂の子FD末投与群では用量依存的に当該病理学的所見を明らかに緩和することを見出した。
【００２２】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎患者において恒常的に観察される血清IgE値の上昇及びヘルパー細胞2（Th2）から産生されるサイトカインのひとつIL-4値の上昇が、図7、8に見られるごとく、蜂の子FD末投与群において用量依存的に抑制されることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
雄蜜蜂の子から製した蜂の子FD末は、アトピー性皮膚炎様皮膚疾患に対して、通常該疾患に使用される抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、ステロイド剤の長期連用によって危惧される副作用の恐れがなく、安心して長期服用できることから、明確な緩和効果をもった健康食品として、アトピー性皮膚炎様皮膚炎に苦しむ人達に対して有用性の高い素材の提供が可能となった。
【符号の説明】
【００２４】
10 巣板
11 巣房
20 平面かご
21 かごの足
22 かごの網目
30 架台
40 雄蜜蜂の子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品等として有効に利用できるアトピー性皮膚炎モデルマウスに緩和活性を示す雄蜜蜂の子FD末に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は急性、悪急性、慢性、再発性の皮膚炎であり、強い掻痒を伴う湿疹を主病変とする疾患であり、通常生後2カ月~1年の間にアトピー性皮膚炎患者の60%が発症し、5才までに30%、6〜20才の間に10%が発症するといわれている。患者の多くは気管支喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎の家族歴、などの既往歴をもっており、幼小児期に発症した症状は成長に伴って緩解する疾患とされていたが、近年理由はよく分からないが、患者の総数が増大しており、なかでも成人重症例の患者の増加は社会問題にもなっている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は激しい掻痒を伴うため、睡眠が妨げられたり、学習活動に集中できなくなる学童や生徒も増加しつつある。羅患者の多くはまた掻痒により誘発される掻破行動によって皮膚バリアが傷害されて皮膚症状が増悪化し、それがさらに掻痒を誘発し、悪循環を形成し、慢性化への経過をたどることになる。すなわち、漿液性丘疹、落屑、痂皮を伴い、重症化すれば、びらん、浸潤などをきたすことになる。また傷害部位から黄色ブドウ球菌の二次感染を引き起こし結果的に重症になる例もある。よってアトピー性皮膚炎症状を緩和したり、掻痒を抑制する薬剤や健康食品の開発が望まれている。
【０００４】
アトピー性皮膚炎の薬物治療には、皮膚の乾燥に対して12%アンモニウム乳酸ローションや10%α-ヒドロキシ酸ローションが使用され、外用抗炎症剤としてステロイド剤、掻痒に対しては経口抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤が用いられている。しかしながら抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤は皮膚傷害が慢性化した患者や重症例の患者の激しい掻痒に対する効果は多くの場合期待できず、またステロイド剤は長期的に使用した場合、皮膚の委縮を生じる可能性があり、また過度に使用すると脳下垂体、副腎系の抑制、骨粗鬆症、成長発達遅延を起こす可能性もあるため使用に当たっては特別の注意が喚起されている。
【０００５】
人に有効な治療薬、予防薬、あるいは症状緩和に有効なサプリメントの開発や、有効性の作用様式を解明するためには、人と同様な動物の実験薬理学的病態モデルが不可欠となる。アトピー性皮膚炎の病態は複雑であり、その診断は掻痒、特徴的な湿疹としてその身体における分布や慢性化・反復性についての経過を観察したうえで実施される。アトピー性皮膚炎と診断された患者では、その80%が高い血中免疫グロブリン(IgE)値を示しており、多くの場合インターロイキン-4（IL-4）の血中濃度も高くなっていることから、これらの血中濃度は血液検査における診断基準のひとつとなっている。血中IgE、 IL-4値が高く、アトピー性皮膚炎に類似した皮膚症状を自然発症する動物モデルとしてNC/Ngaマウスが1997年に名古屋大学農学部の杉田（非特許文献1）らによって発見、系統化され、このモデルを応用してアトピー性皮膚炎の解明や改善薬の研究が実施されるようになった。
【０００６】
NC/Ngaマウスを使用したアトピー性皮膚炎モデルに対するイソフラボンのゲニステイン（非特許文献2）およびローヤルゼリーの作用についての報告（非特許文献3）がなされているが、ゲニステインは血中IgE値に影響を及ぼさなかったことからアトピー性皮膚炎緩和効果については期待できないと考えられる。ローヤルゼリーはピクリルクロライド処理したNC/Ngaマウスに生じたアトピー性皮膚炎様の皮膚損傷を抑制することからサプリメントとして予防的利用が推奨されている。またイヌカラマツ抽出物（非特許文献4）、柿の葉抽出物（非特許文献5）、ハンゲシヨウの葉の抽出物（非特許文献6）、ホップ水抽出物(
非特許文献7)についても、上記モデルに有効性を示したことが報告されている。天然素材からなるこれらのエキスは長期連続投与によって依存性や副作用の面から安全であると考えられるが、加工、濃縮されたエキスという点で必ずしも安全性が保証されるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2006-197911号公報
【特許文献２】特開2002-17296号公報
【特許文献３】特開2006-211946号公報
【特許文献４】特開2009-254348号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】InternationalImmunology 9、 1997
【非特許文献２】大豆たんぱく質研究、7巻、 2004年
【非特許文献３】International Immunopharmacology 3、 2003
【非特許文献４】日本薬理学雑誌、 124巻、4号、2004年
【非特許文献５】日本栄養・食糧学会誌、 54巻、1号、2001年
【非特許文献６】BiolPharm Bull vol.31 No.1、 2008
【非特許文献７】BiosciBiotechnol Biochem vol.72、 No.4 2008
【非特許文献８】Int. Immunol.9、 461-466
【非特許文献９】J.Dermatol.Sci.36:1-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎は多くの場合、幼児期に発症し、成長につれ症状が緩解してゆく疾患とはいえ、中学、高校生になっても一向に緩解、緩和に至らず、激しい掻痒も止まらず、一時期治まったとしても、すぐに激しい掻痒症状が再発することも多く、特に学習に励む若年者にとって苦しい状態が強いられ、ステロイド剤の外用や抗ヒスタミン剤、抗炎症剤の服用で一時的に緩解もするが、やがて慢性化して、薬剤の効果も弱まり、逆に副作用が発現してくるといった現状に鑑み、長期に連用しても副作用の発現がなく、結果的にアトピー性皮膚炎緩和作用の強い健康食品の開発を希求し、これを広く天然素材に求めた。
【００１０】
蜂子（ほうし）は、中国最古の薬物書の神農本草経に、風頭（風が頭にあたって痛んだり、目まいがしたりする症状）、蟲毒（虫を用いたまじないの毒の毒気を取り除く）、虚羸（弱り衰えた病気）、傷中（内臓の機能が傷ついた病気）に応用し、これを久しく服用すれば皮膚に艶が出てくるとの記載あり、この蜂子がトウヨウバチApis cerana Fabricus(中華蜜蜂)の幼虫やさなぎであることに着目した。
【００１１】
本発明は、蜜蜂（トウヨウミツバチ、ニホンミツバチ）の生後20日あるいは21日目の雄のさなぎを乾燥、殺菌し、粉末を製し、アトピー性皮膚炎様の湿疹性皮膚炎を自然発症するNC/Ngaマウスを用いて、この粉末の該皮膚炎に対する効果を鋭意探求し、該皮膚症状および病理的検査値を明確に改善することを発見することによって完成された。すなわち生後20日あるいは21日目の雄蜜蜂の子から製した粉末の健康食品の提供に関する。
【００１２】
蜂の子を利用する加工食品としては、疲労回復効果を高めることを期待した蜂の子粉末とトレハロースの混合物（特許文献1）や蜂の子粉末と虫媒花粉、梅肉エキス、香酢の粉末の混合物からなる加工食品（特許文献2）が公示されているが、何れもアトピー性皮膚炎様皮膚症状については言及されておらず、天然素材から構成される加工食品だけに製品に
対する規格や基準も設定されていない。また蜂の子をプロテアーゼと反応させて産生した分解産物のペプタイドを熱処理した後、スプレードライなどした粉末が加工食品として提供されている（特許文献3、4）。しかしこれら分解産物は、元来天然の蜂の子のままで薬理効果が期待される構成成分の蛋白が分解あるいは変性されたものになっており、記載された更年期障害や自律神経失調症に対する有効性について実験薬理学的な有効性を示す証明は何らなされていない。加えて酵素分解反応に使用されたプロテアーゼの分解物や、反応時のpH調整に使用された酸性無機物は加工食品中に残されたままになっていることには問題がある。
【発明の効果】
【００１３】
雄蜜蜂の子中の構成蛋白が加熱による変性や、酵素分解をすることなく、所定の規格、基準が遵守された雄蜜蜂の子粉末（蜂の子FD末）を製し、用いることによって、抗ヒスタミン剤や抗炎症剤の連服による胃腸の潰瘍症状や中枢神経症状などの副作用の不安がなく、外用ステロイド剤と併用しても、ステロイド剤の外用を中止した後も連服できる有効性と安全性を有するアトピー性皮膚炎に対する緩和作用をもった健康食品の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】巣房と巣板から取出した雄蜜蜂の子と除湿かごを示す図である。
【図２】小室内で除湿殺菌処理する状態を示すステンレス製の架台とかごの図である。
【図３】アトピー性皮膚炎に対する蜂の子FD末の緩和効果を評価する実験のプロトコールを示す図である。
【図４】TNCB感作後日数に対応する皮膚炎スコアを示す図である。
【図５】TNCB感作後日数に対応する耳介の厚さを示す図である。
【図６】耳介皮膚の病理組織学的特徴の観察結果を示す図である。
【図７】試験群に対応する血清IL-4濃度を示す図である。
【図８】試験群に対応する血清IgE値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
請求項3にかかる所定の品質をもった蜂の子FD末の製造方法については、図1に示すような一般的によく利用される雄蜂用の人工巣板10のなかの巣房11に産卵させた卵を、さなぎの状態から羽化する3日あるいは4日前、好ましくは3日前、すなわち20日あるいは21日目、好ましくは21日目の蜂の子30を取り出し、ステンレス製の、湿気が籠らないように底部の4隅に足21のついた及び底部と4側面の半分に網目22のついた特製の平面かご20に蜂の子を一層状に入れ、これを図2に示すようなステンレス製の移動可能な、格子状棚のついた架台30に2セットずつを高さ50cmの間隔で三段の棚のうえに並べて、図示しない紫外線殺菌灯と除湿機を付設した小部屋に移動させ、密閉した状態で、蜂の子を3〜5時間、好ましくは4時間殺菌、除湿する。架台からかごを取りはずし、手動で揺り動かしながら扇風機で1〜3分風を送り、夾雑物などを取り除く。これらの操作を経ることにより、均一で良質な蜂の子FD末を得ることができる。部屋には複数の網棚を設置することによって大量処理が可能となる。除湿機は台数及びメーカーを特に指定しないが、除湿機能の高いものが好ましい。
例えばパナソニックF-VHFX-120、東芝PAD-C100PFX、シャープCV2100プラズマクラスターなどである。
乾燥蜂の子を-20〜-30℃、好ましくは-20℃に一旦冷凍し、ひきつづき、真空冷凍乾燥機（DGJ-100-24）で5〜10時間、好ましくは6時間冷凍乾燥した後、除湿機を設置した室で1時間放置し、粉砕機（CWF-40 ）にかけて、淡灰色の粉末を50〜80メッシュ、好ましくは60メッシュの篩にかけて所望の蜂の子FD末（雄由来）を得ることができる。かくして得られた蜂の子FD末を除湿室内で空気と攪拌混合した後、40〜45℃、７時間遠赤外線（毎ロット100kg、温度40-45℃ 7時間）を照射して滅菌したものは請求項1、2の健康食品として提供できる。
【００１６】
本発明の蜂の子FD末を摂取する場合は、消化管内に摂取できる方法であれば何でもよく、蜂の子FD末の一定量をそのまま飲料水とともに服用するかあるいは顆粒状、タブレット状、カプセル状に加工し、経口的に摂取することも可能である。またオリーブ油を含むドレッシングをかけた生野菜とともに食しても同様の効果が得られる。
【実施例】
【００１７】
以下に本発明に関する実施例として所定の規格・基準を有する蜂の子FD末の製造法およびアトピー性皮膚炎様皮膚炎緩和剤としての有効性の実験薬理学的詳細を実施例1に示したが、これらは何ら本発明を限定するものではない。また蜂の子FD末を得る原料としては蜜蜂であれば日本、南米、ロシア、朝鮮半島、アメリカ、中国産のものすべて利用することができる。
【実施例１】
【００１８】
巣板に産卵後21日目のトウヨウ蜜蜂の雄の子を、ステンレス製の網状の平面かご（60x40x4cm）にほぼ一層状になるように蜂の子2kgを並べ入れた。紫外線殺菌灯と除湿機を付設した部屋に、ステンレス製の移動式3段の棚付き格子状台を設置し、高さ50cm間隔に棚をセットし、蜂の子の入ったかごをそのうえに置いて、部屋を密閉した状態で4時間殺菌、除湿した。かごを棚から降ろし手動で揺り動かしながら扇風機で1分間風を送った。表面の湿気がとれた乾燥蜂の子を-20℃に冷凍し、そのまま真空冷凍乾燥機で6時間乾燥した。乾燥した蜂の子を除湿した室に1時間放置した後、粉砕機で粉末にして、60メッシュの篩を通過した粉末を集めて5kgごとに蓋付プラスチック容器に移し、手動で振とう攪拌して粉末を均一化させた。これを平底のバットに移し、遠赤外線照射装置を設置した室で40℃で7時間遠赤外線を照射した後、室温で1時間除湿を設置した室に静置し、蜂の子FD末を得た。本蜂の子FD末は下記の規格・基準を有している。
リジン≧3.0% 総タンパク質 ≧40%
ヒスチジン≧1.4% 水分 ≦10%
フェニルアラニン≧2.0% 灰分 ≦5%
ロイシン≧4.2% 一般生菌数≦3、000個/g
イソロイシン≧2.8%
メチオニン≧1.0%
バリン≧3.0%
スレオニン≧2.0%
トリプトファン≧0.6%
【００１９】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎に対する蜂の子FD末の緩和効果を評価する実験は下記の方法で行った。
60匹のNC/Ngaマウスを、1群を10匹とする5つの試験群（1.陰性コントロール群、2.陽性コントロール群、3. 0.1%蜂の子FD末添加群、4. 0.5%添加群、5. 1%添加群）に分け、蜂の子FD末添加群にはそれぞれ蜂の子FD末が、標準飼料（CE-2、日本クレア、東京）中に0.1%、0.5%、1.0%の含有率になるように調整した飼料を準備した。2、4、6−trinitrochlorobenzene(TNCB)感作前7日から感作後47日まで、これら各群の飼料を、陰性のコントロール群、陽性のコントロール群には標準飼料のみを給餌した。
アトピー性皮膚炎様皮膚疾患の誘発：実験は図3に示したスケジュールで実施した。NC/Ngaマウス（雌、6週齢）をHarothaneで麻酔後、胸部・背部・腹部の毛をバリカンで刈った。0日目、陰性コントロールを除く総てのマウスに対し2%TNCB溶液（エタノール：アセトン=4:1）を胸部に50μl、腹部に50μl、後肢に50μlをそれぞれ皮膚に塗布して感作させた。これらのマウスに1%TNCB溶液の150μlを背部に、10μlずつを両耳に、1週間間隔で7回連続塗布してアトピー性皮皮膚病変を惹起させた。これら病変マウスに対して以下の検査項目について測定、観察を行った。
【００２０】
皮膚炎スコア：背部皮膚および耳介皮膚の病変の重篤度を次の基準
【非特許文献８】に従いスコア化した。皮膚における(1)発赤/出血、(2)水腫、(3)びらん/潰瘍、(4)乾皮症の各所見の程度を0（認めず）、1(軽微)、2（中等度）、3（重度）で評価し、その合計点数を皮膚炎スコア（最小0；最大12）とした
【非特許文献９】。耳介の厚さ：耳介の厚さはダイヤルシックネスゲージ（尾崎製作所、東京、日本）を用い、感作後0、4、11、18、25、32、39、46日目のTNCB塗布直前に測定した。病理組織学的検討：感作後47日目のマウスの耳介・背部皮膚を採材し、10%中性緩衝ホルマリン液にて固定後、定法に従いパラフィン包埋切片を作成し、ヘマトキシリン染色を施した。血清総IgEおよびサイトカイン濃度：TNCB感作後47日目の動物の心臓より血液を採取し、4℃条件下にて、3000 X g、5分間遠心分離を施し、血清を得た。市販ELISA測定キットを用い、血清総IgE、IL-4、IFN-γ濃度を測定した（IgE：Shibayagi、群馬、日本/IL-4・IFN-γ: Bender MedSystems、 Vienna、 Austria）。皮膚サイトカイン量：耳介皮膚を20mM Tris-buffer(pH7.5)に浸漬した後にホモジナイズし、10.000 X g、 5分間遠心分離を施し、上清を得た。当該上清をサンプルとし、市販ELISA測定キットを用い、IL-18、IL-12量を測定した（IL-18・IL-12: Bender MedSystems、 Vienna、 Austria）。
【００２１】
図4に示したごとく、TNCB感作後、蜂の子FD末を与えなかった陽性コントロールではアトピー性皮膚炎様皮膚病変はTNCB塗布を重ねるごとに発赤/出血、水腫、びらん/潰瘍、乾皮症を呈し、重篤度は増大したが、蜂の子FD末投与群では感作後32日目以降において、陽性コントロール群に比べて皮膚スコアが投与量依存的に下がることを見出した。図5に示したように耳介の肥厚も抑制されることを見出した。耳介皮膚の病理組織学的観察結果は図6に示したごとく、陽性コントロール群のマウスにおいて、表皮の肥厚・過角化、表皮と真皮の両組織で肥厚細胞、好酸球・リンパ球細胞の密な浸潤が認められた。蜂の子FD末投与群では用量依存的に当該病理学的所見を明らかに緩和することを見出した。
【００２２】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎患者において恒常的に観察される血清IgE値の上昇及びヘルパー細胞2（Th2）から産生されるサイトカインのひとつIL-4値の上昇が、図7、8に見られるごとく、蜂の子FD末投与群において用量依存的に抑制されることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
雄蜜蜂の子から製した蜂の子FD末は、アトピー性皮膚炎様皮膚疾患に対して、通常該疾患に使用される抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、ステロイド剤の長期連用によって危惧される副作用の恐れがなく、安心して長期服用できることから、明確な緩和効果をもった健康食品として、アトピー性皮膚炎様皮膚炎に苦しむ人達に対して有用性の高い素材の提供が可能となった。
【符号の説明】
【００２４】
10 巣板
11 巣房
20 平面かご
21 かごの足
22 かごの網目
30 架台
40 雄蜜蜂の子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎に緩和活性を示す雄蜜蜂の子粉末由来の健康食品
【請求項２】
総蛋白質が40%以上であって、アミノ組成物がリジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、スレオニンが所定量以上含有することを特徴とする請求項1記載の健康食品
【請求項３】
産卵後20日ないし21日目の雄蜜蜂の子を用いた請求項1又は2記載の健康食品の製造法
【請求項４】
粉末、顆粒、カプセル、錠剤であることを特徴とする請求項1ないし2記載の健康食品の製造法
【請求項１】
アトピー性皮膚炎様皮膚炎に緩和活性を示す雄蜜蜂の子粉末由来の健康食品
【請求項２】
総蛋白質が40%以上であって、アミノ組成物がリジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、スレオニンが所定量以上含有することを特徴とする請求項1記載の健康食品
【請求項３】
産卵後20日ないし21日目の雄蜜蜂の子を用いた請求項1又は2記載の健康食品の製造法
【請求項４】
粉末、顆粒、カプセル、錠剤であることを特徴とする請求項1ないし2記載の健康食品の製造法
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１３９１０７（Ｐ２０１２−１３９１０７Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７９１８０（Ｐ２０１０−２７９１８０）
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【出願人】（７１０００９８７４）株式会社中原 (1)
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１５日（２０１０．１２．１５）
【出願人】（７１０００９８７４）株式会社中原 (1)
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
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