アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体
アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異体およびその製造方法を開示する。５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミン酸分解位置に突然変異を導入することにより、グルタミン分解能力を欠いており且つ外部のアンモニアと特異的に反応して５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させることが可能な５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異体を製造する。その結果、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異体は、野生型に比べて細胞内でより安定し、５’−キサンチル酸の５’−グアニル酸への転換に有用に活用できる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、向上した活性の５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびその変異体を用いて５’−グアニル酸（ＧＭＰ）を向上した収率で製造する方法に関し、さらに詳しくは、アンモニアに特異的に反応する５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびそのアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて高収率で５’−グアニル酸を製造する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
５’−グアニル酸（ＧＭＰ）は、５’−イノシン酸（ＩＭＰ）と共に食品調味添加剤として広く用いられている物質である。５’−グアニル酸は、そのままで茸の味を出すものと知られているが、主にグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化するものと知られている。このような性質は、特に５’−イノシン酸と共に使われるときに強く現れる。
【０００３】
これまで知られている５’−グアニル酸の製造方法としては、（１）酵母細胞から抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）を酵素学的に分解する方法、（２）微生物発酵法で５’−グアニル酸を直接発酵させる方法、（３）微生物発酵法で生産したグアノシンを化学的にリン酸化させる方法、（４）微生物発酵法で生産したグアノシンを酵素的方法でリン酸化させる方法、（５）微生物発酵法で生産した５’−キサンチル酸をコリネ型微生物を用いて５’−グアニル酸に転換する方法、または（６）微生物発酵法で生産した５’−キサンチル酸を大腸菌を用いて５’−グアニル酸に転換させる方法を挙げることができる。これらの中でも、（１）の方法は原料需給および経済性に問題があり、（２）の方法はＧＭＰの細胞膜透過性の問題によって収率が低いという欠点がある。このような理由で、これら以外の方法が工業的に主に用いられている。
【０００４】
前記（５）および（６）の方法でのように、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるときに５’−キサンチル酸アミナーゼという酵素が関与するが、この酵素のメカニズムは次の通りである(Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613)。
【０００５】
１）５’−キサンチル酸＋ＡＴＰ＋ＮＨ３ → ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
↑
５’−キサンチル酸アミナーゼ
２）５’−キサンチル酸＋ＡＴＰ＋Ｌ-グルタミン → ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋Ｌ-グルタミン ↑
５’−キサンチル酸アミナーゼ
５’−キサンチル酸アミナーゼは、グルタミンアミドトランスフェラーゼ(glutamine amidotrasnferase)の一種である。グルタミンアミドトランスフェラーゼは、グルタミンのγ−アミド部位を加水分解してアンモニアを発生させ、これをアミノ酸、核酸、糖、補酵素などに重合反応を経て導入する。グルタミンアミドトランスフェラーゼの対象物質は非常に多様であるが、グルタミンを加水分解してアンモニアを得る方式は進化的によく保存されてきた。グルタミンアミドトランスフェラーゼはさらにｃｌａｓｓIとｃｌａｓｓIIに分けられるが、ｃｌａｓｓIの場合はアントラニル酸シンダーゼ(anthranilate synthase)、カルバモイルリン酸シンテターゼ(carbamoyl phosphate synthetase)、ＣＴＰシンテターゼ、ホルミルグリシンアミジンシンテターゼ(formylglycinamidine synthetase)、５’−キサンチル酸アミナーゼ、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼ(Imidazole glycerol phosphate synthase)、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ(aminodeoxychorismate synthase)、ｐ−アミノベンゾ酸シンターゼ(p-aminobenzoate synthase)などを含む。これらは共にグルタミンの他に外部のアンモニアをアミン供与体(amine donor)として用いることができる(Cell MoI. Life Sci. 54, 205- 222, 1998)。この際、アンモニアは、グルタミンから遊離されたアンモニアが基質に伝達される方式とは異なり、トランスフェラーゼに直接伝達されるものと思われる。
【０００６】
タンパク質の構造という面において、５’−キサンチル酸アミナーゼは、グルタミンを分解するグルタミナーゼ活性を持つドメインと、トランスフェラーゼ活性を持つドメインによく区別されている(Nat. Str. Biol. 3(1), 74- 86, 1996)。グルタミナーゼの活性を持っているＮ−ターミナルドメインの場合は、よく研究されたカルバミルリン酸シンテターゼ(carbamyl phosphate synthetase)と構造的に類似である。また、グルタミナーゼの活性は主にシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸の活性トライアッド(catalytic traid)によって得られる。これはシステインプロテアーゼのメカニズムと類似である(Cell MoI. Life Sci. 54, 205-222, 1998)。特に、大腸菌では、アミノ酸配列８６番目のシステイン、１８１番目のヒスチジン、１８３番目のグルタミン酸が活性トライアッドを成す。グルタミナーゼとしてのメカニズムを詳細に考察すると、活性部位のシステインとグルタミンがγ−グルタミルチオエステル(g-glutamyl thioester)を形成し、ヒスチジン塩基として作用して加水分解することにより、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに分離する(Fukuyama et al. Biochemistry 3, 1448-1492, 1964; von der Saal et al. Biochemistry 24, 5343-5350, 1985)。得られたアンモニアは、酵素に形成されたチャネルを介して５’−キチサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる反応に参与する(Raushel et al. Biochemistry, 38(25), 7891-7899, 1999)。
【０００７】
アンモニアを用いた５’−キチサンチル酸アミナーゼの５’−キサンチル酸の５’−グアニル酸への転換反応は、Ｌ−グルタミンを用いた反応とはメカニズム的に同一であるが、現象的には多くの差異がある。両方の基質に対する５’−キサンチル酸アミナーゼの適正ｐＨは、８．３と同一であるが、Ｌ−グルタミンを用いる場合には２倍以上の活性を示す(Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613)。このような差異は反応ｐＨを中性に持っていくほどさらに大きく開けられるが、これは、実際細胞内における反応は溶液上のアンモニア（ＮＨ３）を使用することなくＬ−グルタミンを用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるという事実を示す。
【０００８】
一方、システインに反応するスルフヒドリル試薬(sulfhydryl reagent)としてのヨードアセトアミド(Iodoacetamide)とグルタミン誘導体としてのクロロケトンまたはアシビシン(acivicine)などを５’−キチサンチル酸アミナーゼに処理すると、Ｌ−グルタミンによる活性は減少する一方で、アンモニアによる活性は維持されることが分かる。これは、グルタミナーゼ活性部位のシステインがグルタミンを用いる５’−キサンチル酸アミナーゼの活性には必須的であるが、アンモニアを用いる５’−キサンチル酸アミナーゼの活性には必須的でないことを示唆する(Zalkin and Truitt, J. Biol. Sci. 252(15), 5431-5436, 1977; Massiere and Badet-Denisot, Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998)。
【０００９】
５’−キサンチル酸アミナーゼと同一のクラスであるアントラニル酸シンターゼの場合、保存されたシステインをグリシンで置換した場合、グルタミンを用いた活性を示さないが、アンモニアによる活性は影響を受けないことが報告された(Paluh et al., J. Biol. Chem. 260, 1889-8601, 1985)。また、ｐ−アミノベンゾ酸シンターゼの場合においても、保存されたシステインをセリンで置換した場合、γ−グルタミルチオエステルの生成が弱化し、ｐ−アミノベンゾ酸合成中間体であるアミノデオキシコリスミ酸の生成が減少することが報告された(Roux et al., Biochemistry, 32, 3763-3768, 1993)。カルバモイルリン酸シンテターゼの場合、保存されたシステインをセリンまたはグリシンで置換する場合、グルタミンを用いた活性を示していない(Rubino et al., J. Biol. Chem., 261, 11320-11327, 1986)。
【００１０】
通常、野生型の酵素は、細胞に適するように進化してきたため、実際産業的に利用される場合、活性が低くて適しない結果を示すことが多い。これを克服するために一般に使用する方法は、酵素の遺伝子をクローニングし、これを用いて過発現させる方法である。５’−キチサンチル酸アミナーゼの場合、最近の論文『Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997』によれば、野生の大腸菌から得られた５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子（ｇｕａＡ）を誘導発現プラスミドにクローニングして過発現させた後、これを用いて５’−キサンチル酸から５’−グアニル酸を生産することを発表した。
【００１１】
野生型菌株の発現を強化させる他の方法として、薬剤耐性を用いて当該遺伝子の発現を増大させる大腸菌野生株からデコイニン(decoyinine)耐性を持つ突然変異菌株を介して５’−キチサンチル酸アミナーゼの活性を増大させる方法も報告されたことがある（韓国特許公開第２０００−００４０８４０号）。
【００１２】
一般に用いられる誘導発現ベクターの場合、ＩＰＴＧなどの高価の発現誘導体を要求するため、産業的に大量のタンパク質が要求される場合に適しないことが多い。これを克服するために、常時発現ベクターシステム(constitutive expression system)が要求される。常時発現ベクターシステムは、多数が報告されており、特に核酸を発酵させる菌株として知られているコリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)においても新規の常時発現プロモータが開発された（韓国特許出願第２００４−１０７２１５号）。常時発現システムの場合は、発現誘導体の導入なしで、宿主の培養期間の間、導入されたタンパク質を持続的に発現させるので有用である。ところが、導入されたタンパク質の過発現が宿主細胞の生長に影響を及ぼす場合は、細胞の生長が中止されるか、或いは細胞に導入されたベクターが除去され、その結果として低い発現率を示す。５’−キサンチル酸アミナーゼの場合にもこのような現象が報告されている(Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997)。
【００１３】
本発明者らは、５’−キサンチル酸アミナーゼの常時的過発現において細胞の生長が中止されるか或いはベクターが除去される現象が常時的過発現による細胞の毒性に起因するものと判断し、これを効率よく減少させる方法として、５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼの活性を抑制する方法を考えた。前述したように、５’−キサンチル酸アミナーゼは細胞内でＬ−グルタミンを用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるため、Ｌ−グルタミナーゼの活性を抑制した５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、細胞内では活性を最小化して細胞に対する毒性を減少させることができる。この際、Ｌ−グルタミナーゼの活性が抑制されても、アンモニアに対する活性は変性されないため、産業的に５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に効率よく転換させることができる。本発明者らは、５’−キサンチル酸アミナーゼの生化学的メカニズムに対する綿密な検討を介して、グルタミナーゼの活性を抑制したアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを開発し、これにより培養液上の５’−キチサンチル酸アミナーゼの活性が増進されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
〔発明の開示〕
したがって、本発明の目的は、野生型または活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えることにより、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現させる核酸分子を含む発現ベクターを提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる方法を提供することにある。
【００２０】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供する。前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、好ましくは大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたはその活性が増進された変異体から製造できる。
【００２１】
具体的に、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼ、およびそのランダム突然変異によって活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体に、それぞれアンモニア特異的な性質を与えるための部位指定変異導入(site-directed mutagenesis)を行うことにより、アンモニア特異的な性質を有し且つ活性が増進された大腸菌由来のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造することができる。
【００２２】
このため、具体的な実施において、本発明者は、まず、大腸菌Ｋ１２由来の５’−キサンチル酸アミナーゼをコードする１５７８ｂｐの遺伝子（配列番号１）を含むベクターを製造した後、これを鋳型として突然変異誘発型重合酵素連鎖反応(error-prone PCR)を行った。これからランダムに突然変異が導入された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ＤＮＡを得た。その後、５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現させることに適した発現ベクターに前記変異体ＤＮＡを接合させた後、これを用いて５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子が欠乏している大腸菌を形質転換させて突然変異ライブラリを製作した。
【００２３】
５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子が欠乏している大腸菌の場合、５’−キサンチル酸アミナーゼの活性を持っている変異体を持つベクターによって形質転換された場合にのみ成長が可能であるため、突然変異ライブラリから活性のある５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異のみが得られる。
【００２４】
突然変異ライブラリから成長した大腸菌の中から、高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異を持っているベクターで形質転換された大腸菌を選別するために、９８ウェルマイクロプレートで５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる反応を行った。前記反応後の吸光度合いを比較して、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼを生産する大腸菌を選別した。
【００２５】
活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体遺伝子の塩基配列は、公知の方法によって決定した。これから由来した５’−キサンチル酸アミナーゼの塩基配列を野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼの塩基配列と比較した場合、それぞれ２個、２個、４個、４個、３個および６個のアミノ酸が変換された新規のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを確認し、これらをそれぞれ「５’−キサンチル酸アミナーゼＧ３」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ１２」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ６３」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＧ３−１」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ１２−１」、および「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ６３−１」と命名した。
【００２６】
各変異体のアミノ酸配列の変化を具体的に説明すると、Ｇ３の場合は５２番目および９１番目のアミノ酸配列がそれぞれシステインおよびトレオニンで置換された変異体（配列番号４）であり、Ｆ１２の場合は９３番目および１５２番目のアミノ酸配列がそれぞれバリンおよびプロリンで置換された変異体（配列番号６）であり、Ｆ６３の場合は９３番目、１１３番目、１９１番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、アラニン、トレオニンおよびグリシンで置換された変異体（配列番号８）であることを確認することができた。Ｇ３−１の場合は５２番目、１９１番目、２５３番目、および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれシステイン、トレオニン、アルギニン、およびイソロイシンで置換された変異体（配列番号１０）であり、Ｆ１２−１の場合は９３番目、１５２番目、および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、プロリン、およびイソロイシンで置換された変異体（配列番号１２）であり、Ｆ６３−１の場合は９３番目、１００番目、１１３番目、１９１番目、４５４番目、および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、イソロイシン、およびグリシンで置換された変異体（配列番号１４）であることを確認することができた。
【００２７】
続いて、本発明者らは、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを製造するために、前述した大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型およびこれから由来した前記活性が増進された突然変異体のうちＧ３−１、Ｆ１２−１、およびＦ６３−１にそれぞれ、グルタミナーゼ活性部位に存在する８６番目のシステインを部位指定変異導入によってアラニンで置換した。前記部位指定変異導入によって製造された突然変異体をそれぞれＧ１Ｃ（配列番号１６）、Ｇ３Ｃ（配列番号１８）、Ｆ１２Ｃ（配列番号２０）、およびＦ６３Ｃ（配列番号２２）と命名した。前記塩基変異は、通常の塩基配列決定法によって決定した。その結果、製造された変異体は、グルタミンはアミン供与体として効率的に利用することができず、外部のアンモニアのみをアミン供与体として利用することができることを確認した。
【００２８】
したがって、本発明は、好適な一様態として、配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つアンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体を提供する。
【００２９】
本発明の実施例では、配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法およびその活性のみを開示したが、これらの実施例に記載したものと同様の方法によって、前記配列番号４、６または８のアミノ酸配列を持つ、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼにもアンモニア特異的性質を与えることにより、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造することができることを、当業者であれば十分理解できるであろう。
【００３０】
一方、本実施例では、５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番位置のシステインをアラニンで置換した例のみを開示したが、公知の分子生物学的方法による部位指定変異を介して他のアミノ酸、例えばセリンまたはグリシンなどを導入する場合にもアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを得ることができるのは、当業者であれば十分分かるであろう。
【００３１】
ひいては、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、前述した配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、このような変異体タンパク質と機能的に同等な程度の活性を示すことが可能なその等価物を含む。本願において、用語「機能的等価物」とは、本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つが、同様にアンモニア特異的性質を有し且つ同等な程度の活性を有する５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性を示すタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。
【００３２】
後述するように、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、常時発現システムを用いて発現させたとき、反応液当りの活性が野生型に比べて５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃの活性は１．６倍、Ｇ３Ｃは１．４倍、Ｆ１２Ｃは１．６７倍、そしてＦ６３Ｃは１．４５倍の活性が増加することを確認することができるので、これらのアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は５’−グアニル酸の生成に効率よく利用できるであろう。
【００３３】
本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、合成(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963)またはＤＮＡ配列を基本とする組み換え方法によって製造できる(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2ndEd., 1989)。遺伝子組み換え技術を利用する場合、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを宿主細胞に軽質転換してアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞からアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を回収する過程によって収得することができる。
【００３４】
したがって、別の好適な様態として、本発明は、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造する方法を提供する。具体的に、本発明は、５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼ活性を抑制することにより、グルタミナーゼの活性が除去された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体が細胞内では活性を最小化して細胞に対する毒性が減少しながらも、アンモニアに対する活性は変性されないため、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に効率よく転換させることが可能なアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法を提供する。
【００３５】
好適な様態において、本発明は、大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼ活性部位に存在する８６番目のシステインを部位指定変異導入法(site-directed mutagenesis)によって相異なるアミノ酸で代替することにより、代替された８６番位置のアミノ酸と１８３番位置のグルタミン酸がγ−グルタミンチオエステルを形成しないためグルタミナーゼ活性が抑制され、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造する方法を提供する。さらに好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法は、大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のシステインをアラニンで置換することを含む。
【００３６】
特に好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法は、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたはその活性が増進された変異体から製造されることを特徴とする。
【００３７】
さらに特に好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたは本発明の具体的な実施例によって製造される配列番号４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を持つ大腸菌由来の活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の８６番のシステイン残基をアラニンで置換させることにより製造する方法を提供する。
【００３８】
別の様態において、本発明は、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子に関する。
【００３９】
好適な様態として、本発明の具体的な実施例によって製造される配列番号１６のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃは配列番号１５の核酸分子によってコードされ、配列番号１８のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ３Ｃは配列番号１７の核酸分子によってコードされ、配列番号２０のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｆ１２Ｃは配列番号１９の核酸分子によってコードされ、配列番号２２のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｆ６３Ｃは配列番号２１の核酸分子によってコードされる。このような核酸分子の配列は、単鎖または二重鎖であってもよく、ＤＮＡ分子または配列上のチミン（Ｔ）がウラシルで置換されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であってもよい。
【００４０】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸配列は、これを発現するベクターによって提供されてタンパク質として発現できる。
【００４１】
別の様態において、本発明は、前述したアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００４２】
本発明において、「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能なベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００４３】
本発明において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、一般的な機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的のタンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。例えば、プロモータと、タンパク質をコードする核酸配列とが作動可能に連結され、コードする核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる。組み換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを使用する。発現ベクターに用いられるプロモータとしては、例えば宿主が大腸菌の場合にはｔｒｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、λＰＬプロモータ、ｌｐｐプロモータ、Ｔ７プロモータなどが、宿主がバシラス属菌の場合にはＳＰ０１プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、ｐｅｎＰプロモータなどが好ましい。開始コドンおよび終結コドンは、遺伝子作製物が投与されたときに個体で必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)にあるべきである。発現ベクターはベクター含有の宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターは複製起源を含むことができる。
【００４４】
本発明の具体的な実施では、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１Ｃ、ｐＣＪ１−Ｇ３Ｃ、ｐＣＪ１−Ｆ１２Ｃ、およびｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃを製作した。これらの製作されたベクターの概要を図１３〜図１６に示した。これらの発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに導入し、最終的に形質転換された大腸菌を収得した。前記形質転換体をそれぞれ「Escherichia coli DH5α/pCJ1-G1C」、「Escherichia coli DH5α/pCJ1-G3C」、「Escherichia coliDH5α/pCJ1-F12C」、および「Escherichia coliDH5α/pCJ1-F63C」と命名し、これらの菌体を２００５年１２月２日付で韓国種菌協会にそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ−１０７１５Ｐ、ＫＣＣＭ−１０７１７Ｐ、ＫＣＣＭ−１０７２１ＰおよびＫＣＣＭ−１０７２０で寄託した。別の様態において、本発明は前述した発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００４５】
形質転換は、核酸分子を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含み、当分野で公知になっているように宿主細胞に応じて適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンなどを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現する発現ベクターで形質転換される宿主細胞によってタンパク質の発現量と修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。宿主細胞としては原核細胞が好ましく、例えば大腸菌(Escherichia coli)、バシラスサブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタフィロコッカス(Staphylococcus)などの原核宿主細胞があるが、これらに限定されない。
【００４７】
また、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、酵母（例えば、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、アカパンカビ(Neurospora crassa)）などの下等真核細胞なども用いることができる。
【００４８】
別の様態において、本発明は、前述した形質転換体を培養した後、これから５’−キサンチル酸アミナーゼの変異タンパク質を分離する段階を含む、５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造する方法に関する。
【００４９】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現する発現ベクターで形質転換された宿主細胞（形質転換体）の培養は、目的タンパク質であるアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現を可能にする適切な条件の下で行う。このような条件は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【００５０】
宿主細胞で発現させたタンパク質は、通常の方式で精製することができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（例えばアセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーおよび限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせて適用し、本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体タンパク質を精製することができる。
【００５１】
以下、本発明の好適な実施例について説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
実施例１：５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異ライブラリの構築
５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子に突然変異誘発型重合酵素連鎖反応(error-prone PCR)を行ってランダムな突然変異を誘発することにより、多様な５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異を次のように製造した。
【００５３】
まず、大腸菌に由来した１，５７８ｂｐの５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子（配列番号１）を、ｔｒｃプロモータを有し且つ大腸菌で増幅可能な複製起源を持つ発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに作動可能に連結した組み換えプラスミドｐＧ１を製作し、これを突然変異誘発型重合酵素連鎖反応の鋳型として準備した。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応に使用されたプライマーは、配列番号２３のＮ末端プライマーと配列番号２４のＣ末端プライマーを使用した。これは大腸菌に由来した５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて合成した。
【００５４】
配列番号２３：５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＡＡ３’
配列番号２４：５’ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴ３’
ＰＣＲ反応液は、それぞれ０．４ｍＭの前記Ｎ−プライマーおよびＣ−プライマー、鋳型として前記組み換えプラスミドｐＧ１ ５ｎｇ、１０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰおよびＴａｑ重合酵素の５酵素単位を含むように５０ｍＬを調製した。ＰＣＲは、９４℃で１分、５０℃で１分および７２℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行い、最後に７２℃で７分の反応を行った。
【００５５】
前述したように増幅されたＰＣＲ産物は、寒天ゲル電気泳動法によって分離し、増幅分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIで切断した後、５’−キサンチル酸アミナーゼ発現ベクターとして有用なｐＴｒｃ９９ａに接合させて組み換えプラスミドを製作した。前記製作された突然変異遺伝子を含有するベクターを大腸菌ＢＷ（ｇｕａＡ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ菌株）に導入して５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ライブラリを製作した。ｇｕａＡ遺伝子が除去された菌株の大腸菌ＢＷは、通常の分子生物学的方法によって得られた(Datsenko KA, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97(12), 6640-6645)。
【００５６】
実施例２：５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体の探索
実施例１で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のライブラリを０．５％バクトトリプトン、１％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天および０．２ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ平板培地に塗抹した。次いで、成長した大腸菌コロニーをディープウェルマイクロプレート(deep well microplate)内のＬＢ培地で培養した後、細胞の成長度合いに応じて１００ｍＬに希釈した。各ウェルにキシレン５ｍＬを添加し、３７℃で３０分間処理した後、４２℃で予熱した基質混合物を１００ｍＬ添加し、４２℃で２０分間反応させた。基質混合物は３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を１６ｍＭのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした反応液である。３．５％の過塩素酸８００ｍＬを添加して反応を終了させた後、２００ｍＬをＵＶ測定用９６ウェルプレートに移して波長２９０ｎｍにおける吸光度を測定した。５’−グアニル酸の生成量を測定し、酵素活性を比較して、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を持つ大腸菌ＪＭ１０５形質転換体を獲得した。
【００５７】
前記探索過程によって得られた５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異遺伝子を持つプラスミドｐＧ３、および野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子を持つプラスミドｐＧ１に対して適切な制限酵素処理およびライゲーションを行い、実施例１と同様の条件で突然変異誘発型ＰＣＲを行った後、前記活性比較スクリーニング法によって、活性が親酵素に比べて増進された遺伝子を持つプラスミドｐＦ１２、ｐＦ６３、ｐＣＪ−Ｇ３−１、ｐＣＪ−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１を得た。
【００５８】
前記実施例１と実施例２に記述された、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造する過程を図１に概略的に示した。
【００５９】
実施例２で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のライブラリ規模および変異体に対する記述を表１にまとめた。
【００６０】
【表１】
【００６１】
実施例３：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を暗号化する遺伝子の塩基配列
実施例１および２で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＡＢＩ３７３０ｘｌを用いて決定した。それぞれの塩基配列は配列番号３（Ｇ３）、配列番号５（Ｆ１２）、配列番号７（Ｆ６３）、配列番号９（Ｇ３−１）、配列番号１１（Ｆ１２−１）、および配列番号１３（Ｆ６３−１）と確認されたところ、それぞれのアミノ酸配列を推定して配列番号４（Ｇ３）、配列番号６（Ｆ１２）、配列番号８（Ｆ６３）、配列番号１０（Ｇ３−１）、配列番号１２（Ｆ１２−１）および配列番号１４（Ｆ６３−１）で表した。また、前記Ｇ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１をそれぞれ含むプラスミド地図を図３〜図８にそれぞれ示した。
【００６２】
前記ｐＧ３に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３遺伝子の塩基配列からＧ３のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号４で表した。また、ｐＦ１２に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２遺伝子の塩基配列からＦ１２のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号６で表した。同様に、ｐＦ６３に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３遺伝子の塩基配列からＦ６３のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号８で表した。また、ｐＧ３−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子の塩基配列からＧ３−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１０で表した。また、ｐＣＪ−Ｆ１２−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子の塩基配列からＦ１２−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１２で表した。同様に、ｐＣＪ−Ｆ６３−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子の塩基配列からＦ６３−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１４で表した。
【００６３】
本発明の高活性５’−キサンチル酸アミナーゼであるＧ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１のアミノ酸配列を配列番号２の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼのアミノ酸配列と比較する場合、それぞれ２個、２個、４個、４個、３個および６個のアミノ酸が置換されて新規のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを確認することができた。
【００６４】
すなわち、Ｇ３の場合は５２番目および１９１番目のアミノ酸配列がそれぞれシステインおよびトレオニンで、Ｆ１２の場合は９３番目および１５２番目のアミノ酸配列がそれぞれバリンおよびプロリンで、Ｆ６３の場合は９３番目、１１３番目、１９１番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、アラニン、トレオニンおよびグリシンで置換されたことを確認することができ、Ｇ３−１の場合は５２番目、１９１番目、１５３番目および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれシステイン、トレオニン、アルギニンおよびイソロイシンで、Ｆ１２−１の場合は９３番目、１５２番目および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、プロリンおよびイソロイシンで、Ｆ６３−１の場合は９３番目、１００番目、１１３番目、１９１番目、４５４番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、イソロイシンおよびグリシンで置換されたことを確認することができた。
【００６５】
上述したアミノ酸配列および活性測定探索法によって、本発明のＧ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１は、アミノ酸配列が既存の大腸菌５’−キサンチル酸アミナーゼとは相異するうえ、高活性を持つ新規の５’−キサンチル酸アミナーゼと判断することができる。
【００６６】
実施例４：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の常時発現ベクターの製造
前記得られた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を常時発現ベクターを用いて発現させるために、下記の過程を行った。
【００６７】
５’−キサンチル酸アミナーゼ野生型および変異体の遺伝子を、ＣＪ１プロモータを有し、且つ大腸菌とコリネバクテリウムアンモニアゲネスで増幅可能な複製起源を有する常時発現ベクターｐＥＣＧ１１７−ＣＪ１に作動可能に連結した組み換えプラスミドを製作した。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応を行った。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応に使用されたプライマーは、配列番号２５のＮ−末端プライマー（ｇｕａＡ−ｆ）と配列番号２６のＣ−末端プライマー（ｇｕａＡ−ｒ）を使用した。これは大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて合成した。
【００６８】
配列番号２５：５’ＡＣＧＴＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＡＡＧＣ３’
配列番号２６：５’ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＡＧＣ３’
ＰＣＲ反応液は、それぞれ０．４ｍＭの前記Ｎ−プライマーおよびＣ−プライマー、鋳型としてｐＧ１、ｐＣＪ−Ｇ３−１、ｐＣＪ−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１それぞれ５ｎｇ、１０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰおよびＰｆｕ重合酵素の５酵素単位を含むように５０ｍＬを調製した。ＰＣＲは、９４℃で１分、５０℃で１分および７２℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行い、最後に７２℃で５分の反応を行った。
【００６９】
前述したように増幅されたＰＣＲ産物は、寒天ゲル電気泳動法によって分離した。増幅分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮａｅIとＢａｍＨIで切断した後、５’−キサンチル酸アミナーゼ発現ベクターとして有用なｐＥＣＧ１１７−ＣＪ１に接合させて組み換えプラスミドを製作した（図２）。前記５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型および変異体を含む発現ベクターをそれぞれｐＣＪ１−Ｇ１（野生型）、ｐＣＪ１−Ｇ３−１、ｐＣＪ１−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１と命名し、前記製作されたベクターの概要を図９〜図１２に示した。
【００７０】
実施例５：アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの製造
５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型および前記実施例で得た高活性の５’−キサンチル酸突然変異体を用いてアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造するために、これらタンパク質の８６番目のシステインをアラニンに特異的に変異させるためのプライマーを製作し、これを配列番号２７および配列番号２８で表した。
【００７１】
配列番号２７：５’ＣＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＧ３’
配列番号２８：５’ＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＧ３’
前記プライマーの存在下で、部位指定変異導入を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅII ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、製造社から提供された手続によって行った。得られたコロニーからプラスミドを公知の方法によって抽出し、これを用いて塩基配列を決定した。これにより、５’−キサンチル酸アミナーゼ野生型および前記変異体の突然変異を維持し、さらに８６番目のシステインがアラニンで置換された新規の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を得た。これらをそれぞれＧ１Ｃ、Ｇ３Ｃ、Ｆ１２Ｃ、およびＦ６３Ｃと命名した。
【００７２】
所望の位置に正確な変異を獲得したかを評価するために、５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子の配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＡＢＩ３７３０ｘｌを用いて決定した。それぞれの塩基配列は配列番号１５（Ｇ１Ｃ）、配列番号１７（Ｇ３Ｃ）、配列番号１９（Ｆ１２Ｃ）、および配列番号２１（Ｆ６３Ｃ）と確認されたところ、それぞれのアミノ酸配列を推定して配列番号１６（Ｇ１Ｃ）、配列番号１８（Ｇ３Ｃ）、配列番号２０（Ｆ１２Ｃ）および配列番号２２（Ｆ６３Ｃ）で表した。前記５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を含む発現ベクターを製作し、これらをそれぞれｐＣＪ１−Ｇ１Ｃ、ｐＣＪ１−Ｇ３Ｃ、ｐＣＪ１−Ｆ１２ＣおよびｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃと命名し、前記製作されたベクターの概要を図１３〜図１６に示した。
【００７３】
実施例６：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性評価
５’−キサンチル酸アミナーゼの非活性増加を確認するために、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質発現量を濃度分析器によって確認した。この際、各変異体の発現量は互いに類似であると確認された。この点から、５’−キサンチル酸アミナーゼ活性の増加が非活性の増加によるものであることが分かった。
【００７４】
５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性を比較するために、下記の過程を行った。まず、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌとした２５ｍＬの培地に各変異体を接種し、３７℃で１２時間培養した。変異体を回収した後、１ｍＬの変異体培養液に２０ｍＬのキシレンを添加し、これを３７℃で２０分間２５０ｒｐｍにて放置した。これを１／１０で希釈し、アンモニアに対する反応活性を測定するために、３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした反応液８００ｍＬに２００ｍＬの酵素液を混ぜ、４２℃で１５分間反応を行った。Ｌ−グルタミンに対する活性を測定するために、試料２００ｍＬを０．１７５％ＴＣＡ溶液３．８ｍＬに混ぜて反応を中止させた。３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＭ Ｌ−グルタミンを２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした溶液８００ｍＬに、１／１０で希釈された酵素液２００ｍＬを混ぜ、４２℃で１５分間反応を行った。前記反応液はＨＰＬＣを用いてＧＭＰ量を比較した。この際、５’−キサンチル酸アミナーゼの酵素活性は１分当り１ｍｍｏｌの５’−グアニル酸が生成される条件を１単位活性とした。ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
【００７５】
Ｅｌｕｅｎｔ：Ａ：
０．０２％リン酸二水素テトラブチルアンモニム
０．２％リン酸二水素アンモニウム、ｐＨ２．４
Ｅｌｕｅｎｔ Ｂ：アセトニトリル
Ａ：Ｂ＝９７：３
測定波長＝２５４ｎｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
アンモニアを基質として用いた場合、酵素活性は次の通りである。反応液１ｍＬ当り野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼは１３．６１単位活性（Ｕ／ｍＬ）であり、変異体Ｇ３−１は１７．６２単位活性（Ｕ／ｍＬ）、変異体Ｆ１２−１は２０．８２単位活性（Ｕ／ｍＬ）、変異体Ｆ６３−１は1６．４７（Ｕ／ｍＬ）であった。アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃは２２．６４（Ｕ／ｍＬ）、Ｇ３Ｃは１９．３０（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ１２Ｃは２２．７６（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ６３Ｃは１９．６２（Ｕ／ｍＬ）であった。
【００７６】
これに対し、Ｌ−グルタミンを基質として用いた場合、酵素活性は次の通りである。野生型菌株は単位液当り８．３２Ｕ／ｍＬの活性を示し、変異体Ｇ３−１は１９．１５（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ１２−１は４．３１（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ６３−１は０．５４（Ｕ／ｍＬ）の活性を示す反面、アンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体Ｇ１Ｃは０．２１Ｕ／ｍＬ、Ｇ３Ｃは０．１６Ｕ／ｍＬ、Ｆ１２Ｃは０．２４Ｕ／ｍＬ、Ｆ６３は０．４０Ｕ／ｍＬであった。
【００７７】
前記結果より、アンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体は、Ｌ−グルタミンを基質とする場合には５’−キサンチル酸の５’−グアニル酸への転換特性を殆ど示さないが、アンモニアを基質とする場合には相応する野生型またはランダム突然変異体に比べて約１．４〜１．７倍増進された転換活性を示すことを確認することができた（図１７）。
【００７８】
実施例７：アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現ベクターの細胞内安定性
アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現ベクターの細胞内安定性を比較するために、培養後に残っている発現ベクターの量を比較した。
【００７９】
培養後の発現ベクターの維持量を比較するために、培養終結後に培養液を１０−５に希釈し、これを、カナマイシン５０ｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１％、ＮａＣｌ ０．５％）と抗生剤を含んでいないＬＢ培地に塗抹した後、３０℃で１６時間培養して形成されたコロニーの数を比較した。これを相対数値化して図１８に示した。
【００８０】
図１８に示すように、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のうちＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターの場合、５４．３％のコロニーが前記発現ベクターを含んでいるが、これに対し、野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼの場合、３６．０％のコロニーのみが前記遺伝子の発現ベクターを含んでいた。これは、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの場合、細胞内に発現ベクターをさらに安定的に維持しており、その結果活性の増進が生ずることを意味する。
【００８１】
〔産業上の利用可能性〕
以上説明および立証したように、本発明は、調味成分として有用な５’−グアニル酸を効果的に生産するために、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型およびその活性が増進されたランダム突然変異によって製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体およびその製造方法を提供する。したがって、本発明に係る５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、野生型に比べて活性が増進されるうえ、細胞毒性が減少して細胞内でより安定的に維持されることにより、５’−グアニル酸を生産する生物過程に有用に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の前記および他の目的、特徴およびその他の利点は、添付図面を参照する次の詳細な説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図１】ランダム突然変異導入を介して５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ライブラリを製造し、高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼをスクリーニングする方法を概略的に示す図である。
【図２】ランダム突然変異によって製造された高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼを常時発現させるために常時発現ベクターに導入する過程を概略的に示す図である。
【図３】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３遺伝子を含む発現ベクターｐＧ３を示す。
【図４】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２遺伝子を含む発現ベクターｐＦ１２を示す。
【図５】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３遺伝子を含む発現ベクターｐＦ６３を示す。
【図６】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｇ３−１を示す。
【図７】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｆ１２−１を示す。
【図８】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｆ６３−１を示す。
【図９】野生型５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子であるＧ１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１を示す。
【図１０】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ３−１を示す。
【図１１】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ１２−１を示す。
【図１２】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ６３−１を示す。
【図１３】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１Ｃを示す。
【図１４】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ３Ｃを示す。
【図１５】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ１２Ｃを示す。
【図１６】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃを示す。
【図１７】大腸菌の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼ（Ｇ１）、本発明の実施例によって製造された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼのランダム突然変異体（Ｇ３−１、Ｆ１２−１、Ｆ６３−１）、およびアンモニア特異的突然変異体（Ｇ１Ｃ、Ｇ３Ｃ、Ｆ１２Ｃ、Ｆ６３Ｃ）のアンモニアまたはＬ−グルタミンを基質とした場合の培養液当りの単位活性を示す図である。図面において、Ａｍｍｏはアンモニアを基質としたときの単位活性であり、Ｇｌｎはグルタミンを基質としたときの単位活性である。
【図１８】野生型５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子（Ｇ１）を含む発現ベクターと、前記Ｇ１遺伝子の８６番目のアミノ酸残基であるシステインをアラニンで置換したアンモニア特異的なＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターとの安定性を比較して示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、向上した活性の５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびその変異体を用いて５’−グアニル酸（ＧＭＰ）を向上した収率で製造する方法に関し、さらに詳しくは、アンモニアに特異的に反応する５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびそのアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて高収率で５’−グアニル酸を製造する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
５’−グアニル酸（ＧＭＰ）は、５’−イノシン酸（ＩＭＰ）と共に食品調味添加剤として広く用いられている物質である。５’−グアニル酸は、そのままで茸の味を出すものと知られているが、主にグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化するものと知られている。このような性質は、特に５’−イノシン酸と共に使われるときに強く現れる。
【０００３】
これまで知られている５’−グアニル酸の製造方法としては、（１）酵母細胞から抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）を酵素学的に分解する方法、（２）微生物発酵法で５’−グアニル酸を直接発酵させる方法、（３）微生物発酵法で生産したグアノシンを化学的にリン酸化させる方法、（４）微生物発酵法で生産したグアノシンを酵素的方法でリン酸化させる方法、（５）微生物発酵法で生産した５’−キサンチル酸をコリネ型微生物を用いて５’−グアニル酸に転換する方法、または（６）微生物発酵法で生産した５’−キサンチル酸を大腸菌を用いて５’−グアニル酸に転換させる方法を挙げることができる。これらの中でも、（１）の方法は原料需給および経済性に問題があり、（２）の方法はＧＭＰの細胞膜透過性の問題によって収率が低いという欠点がある。このような理由で、これら以外の方法が工業的に主に用いられている。
【０００４】
前記（５）および（６）の方法でのように、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるときに５’−キサンチル酸アミナーゼという酵素が関与するが、この酵素のメカニズムは次の通りである(Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613)。
【０００５】
１）５’−キサンチル酸＋ＡＴＰ＋ＮＨ３ → ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
↑
５’−キサンチル酸アミナーゼ
２）５’−キサンチル酸＋ＡＴＰ＋Ｌ-グルタミン → ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋Ｌ-グルタミン ↑
５’−キサンチル酸アミナーゼ
５’−キサンチル酸アミナーゼは、グルタミンアミドトランスフェラーゼ(glutamine amidotrasnferase)の一種である。グルタミンアミドトランスフェラーゼは、グルタミンのγ−アミド部位を加水分解してアンモニアを発生させ、これをアミノ酸、核酸、糖、補酵素などに重合反応を経て導入する。グルタミンアミドトランスフェラーゼの対象物質は非常に多様であるが、グルタミンを加水分解してアンモニアを得る方式は進化的によく保存されてきた。グルタミンアミドトランスフェラーゼはさらにｃｌａｓｓIとｃｌａｓｓIIに分けられるが、ｃｌａｓｓIの場合はアントラニル酸シンダーゼ(anthranilate synthase)、カルバモイルリン酸シンテターゼ(carbamoyl phosphate synthetase)、ＣＴＰシンテターゼ、ホルミルグリシンアミジンシンテターゼ(formylglycinamidine synthetase)、５’−キサンチル酸アミナーゼ、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼ(Imidazole glycerol phosphate synthase)、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ(aminodeoxychorismate synthase)、ｐ−アミノベンゾ酸シンターゼ(p-aminobenzoate synthase)などを含む。これらは共にグルタミンの他に外部のアンモニアをアミン供与体(amine donor)として用いることができる(Cell MoI. Life Sci. 54, 205- 222, 1998)。この際、アンモニアは、グルタミンから遊離されたアンモニアが基質に伝達される方式とは異なり、トランスフェラーゼに直接伝達されるものと思われる。
【０００６】
タンパク質の構造という面において、５’−キサンチル酸アミナーゼは、グルタミンを分解するグルタミナーゼ活性を持つドメインと、トランスフェラーゼ活性を持つドメインによく区別されている(Nat. Str. Biol. 3(1), 74- 86, 1996)。グルタミナーゼの活性を持っているＮ−ターミナルドメインの場合は、よく研究されたカルバミルリン酸シンテターゼ(carbamyl phosphate synthetase)と構造的に類似である。また、グルタミナーゼの活性は主にシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸の活性トライアッド(catalytic traid)によって得られる。これはシステインプロテアーゼのメカニズムと類似である(Cell MoI. Life Sci. 54, 205-222, 1998)。特に、大腸菌では、アミノ酸配列８６番目のシステイン、１８１番目のヒスチジン、１８３番目のグルタミン酸が活性トライアッドを成す。グルタミナーゼとしてのメカニズムを詳細に考察すると、活性部位のシステインとグルタミンがγ−グルタミルチオエステル(g-glutamyl thioester)を形成し、ヒスチジン塩基として作用して加水分解することにより、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに分離する(Fukuyama et al. Biochemistry 3, 1448-1492, 1964; von der Saal et al. Biochemistry 24, 5343-5350, 1985)。得られたアンモニアは、酵素に形成されたチャネルを介して５’−キチサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる反応に参与する(Raushel et al. Biochemistry, 38(25), 7891-7899, 1999)。
【０００７】
アンモニアを用いた５’−キチサンチル酸アミナーゼの５’−キサンチル酸の５’−グアニル酸への転換反応は、Ｌ−グルタミンを用いた反応とはメカニズム的に同一であるが、現象的には多くの差異がある。両方の基質に対する５’−キサンチル酸アミナーゼの適正ｐＨは、８．３と同一であるが、Ｌ−グルタミンを用いる場合には２倍以上の活性を示す(Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613)。このような差異は反応ｐＨを中性に持っていくほどさらに大きく開けられるが、これは、実際細胞内における反応は溶液上のアンモニア（ＮＨ３）を使用することなくＬ−グルタミンを用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるという事実を示す。
【０００８】
一方、システインに反応するスルフヒドリル試薬(sulfhydryl reagent)としてのヨードアセトアミド(Iodoacetamide)とグルタミン誘導体としてのクロロケトンまたはアシビシン(acivicine)などを５’−キチサンチル酸アミナーゼに処理すると、Ｌ−グルタミンによる活性は減少する一方で、アンモニアによる活性は維持されることが分かる。これは、グルタミナーゼ活性部位のシステインがグルタミンを用いる５’−キサンチル酸アミナーゼの活性には必須的であるが、アンモニアを用いる５’−キサンチル酸アミナーゼの活性には必須的でないことを示唆する(Zalkin and Truitt, J. Biol. Sci. 252(15), 5431-5436, 1977; Massiere and Badet-Denisot, Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998)。
【０００９】
５’−キサンチル酸アミナーゼと同一のクラスであるアントラニル酸シンターゼの場合、保存されたシステインをグリシンで置換した場合、グルタミンを用いた活性を示さないが、アンモニアによる活性は影響を受けないことが報告された(Paluh et al., J. Biol. Chem. 260, 1889-8601, 1985)。また、ｐ−アミノベンゾ酸シンターゼの場合においても、保存されたシステインをセリンで置換した場合、γ−グルタミルチオエステルの生成が弱化し、ｐ−アミノベンゾ酸合成中間体であるアミノデオキシコリスミ酸の生成が減少することが報告された(Roux et al., Biochemistry, 32, 3763-3768, 1993)。カルバモイルリン酸シンテターゼの場合、保存されたシステインをセリンまたはグリシンで置換する場合、グルタミンを用いた活性を示していない(Rubino et al., J. Biol. Chem., 261, 11320-11327, 1986)。
【００１０】
通常、野生型の酵素は、細胞に適するように進化してきたため、実際産業的に利用される場合、活性が低くて適しない結果を示すことが多い。これを克服するために一般に使用する方法は、酵素の遺伝子をクローニングし、これを用いて過発現させる方法である。５’−キチサンチル酸アミナーゼの場合、最近の論文『Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997』によれば、野生の大腸菌から得られた５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子（ｇｕａＡ）を誘導発現プラスミドにクローニングして過発現させた後、これを用いて５’−キサンチル酸から５’−グアニル酸を生産することを発表した。
【００１１】
野生型菌株の発現を強化させる他の方法として、薬剤耐性を用いて当該遺伝子の発現を増大させる大腸菌野生株からデコイニン(decoyinine)耐性を持つ突然変異菌株を介して５’−キチサンチル酸アミナーゼの活性を増大させる方法も報告されたことがある（韓国特許公開第２０００−００４０８４０号）。
【００１２】
一般に用いられる誘導発現ベクターの場合、ＩＰＴＧなどの高価の発現誘導体を要求するため、産業的に大量のタンパク質が要求される場合に適しないことが多い。これを克服するために、常時発現ベクターシステム(constitutive expression system)が要求される。常時発現ベクターシステムは、多数が報告されており、特に核酸を発酵させる菌株として知られているコリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)においても新規の常時発現プロモータが開発された（韓国特許出願第２００４−１０７２１５号）。常時発現システムの場合は、発現誘導体の導入なしで、宿主の培養期間の間、導入されたタンパク質を持続的に発現させるので有用である。ところが、導入されたタンパク質の過発現が宿主細胞の生長に影響を及ぼす場合は、細胞の生長が中止されるか、或いは細胞に導入されたベクターが除去され、その結果として低い発現率を示す。５’−キサンチル酸アミナーゼの場合にもこのような現象が報告されている(Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997)。
【００１３】
本発明者らは、５’−キサンチル酸アミナーゼの常時的過発現において細胞の生長が中止されるか或いはベクターが除去される現象が常時的過発現による細胞の毒性に起因するものと判断し、これを効率よく減少させる方法として、５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼの活性を抑制する方法を考えた。前述したように、５’−キサンチル酸アミナーゼは細胞内でＬ−グルタミンを用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるため、Ｌ−グルタミナーゼの活性を抑制した５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、細胞内では活性を最小化して細胞に対する毒性を減少させることができる。この際、Ｌ−グルタミナーゼの活性が抑制されても、アンモニアに対する活性は変性されないため、産業的に５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に効率よく転換させることができる。本発明者らは、５’−キサンチル酸アミナーゼの生化学的メカニズムに対する綿密な検討を介して、グルタミナーゼの活性を抑制したアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを開発し、これにより培養液上の５’−キチサンチル酸アミナーゼの活性が増進されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
〔発明の開示〕
したがって、本発明の目的は、野生型または活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えることにより、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現させる核酸分子を含む発現ベクターを提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる方法を提供することにある。
【００２０】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供する。前記アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、好ましくは大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたはその活性が増進された変異体から製造できる。
【００２１】
具体的に、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼ、およびそのランダム突然変異によって活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体に、それぞれアンモニア特異的な性質を与えるための部位指定変異導入(site-directed mutagenesis)を行うことにより、アンモニア特異的な性質を有し且つ活性が増進された大腸菌由来のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造することができる。
【００２２】
このため、具体的な実施において、本発明者は、まず、大腸菌Ｋ１２由来の５’−キサンチル酸アミナーゼをコードする１５７８ｂｐの遺伝子（配列番号１）を含むベクターを製造した後、これを鋳型として突然変異誘発型重合酵素連鎖反応(error-prone PCR)を行った。これからランダムに突然変異が導入された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ＤＮＡを得た。その後、５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現させることに適した発現ベクターに前記変異体ＤＮＡを接合させた後、これを用いて５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子が欠乏している大腸菌を形質転換させて突然変異ライブラリを製作した。
【００２３】
５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子が欠乏している大腸菌の場合、５’−キサンチル酸アミナーゼの活性を持っている変異体を持つベクターによって形質転換された場合にのみ成長が可能であるため、突然変異ライブラリから活性のある５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異のみが得られる。
【００２４】
突然変異ライブラリから成長した大腸菌の中から、高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異を持っているベクターで形質転換された大腸菌を選別するために、９８ウェルマイクロプレートで５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる反応を行った。前記反応後の吸光度合いを比較して、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼを生産する大腸菌を選別した。
【００２５】
活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体遺伝子の塩基配列は、公知の方法によって決定した。これから由来した５’−キサンチル酸アミナーゼの塩基配列を野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼの塩基配列と比較した場合、それぞれ２個、２個、４個、４個、３個および６個のアミノ酸が変換された新規のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを確認し、これらをそれぞれ「５’−キサンチル酸アミナーゼＧ３」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ１２」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ６３」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＧ３−１」、「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ１２−１」、および「５’−キサンチル酸アミナーゼＦ６３−１」と命名した。
【００２６】
各変異体のアミノ酸配列の変化を具体的に説明すると、Ｇ３の場合は５２番目および９１番目のアミノ酸配列がそれぞれシステインおよびトレオニンで置換された変異体（配列番号４）であり、Ｆ１２の場合は９３番目および１５２番目のアミノ酸配列がそれぞれバリンおよびプロリンで置換された変異体（配列番号６）であり、Ｆ６３の場合は９３番目、１１３番目、１９１番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、アラニン、トレオニンおよびグリシンで置換された変異体（配列番号８）であることを確認することができた。Ｇ３−１の場合は５２番目、１９１番目、２５３番目、および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれシステイン、トレオニン、アルギニン、およびイソロイシンで置換された変異体（配列番号１０）であり、Ｆ１２−１の場合は９３番目、１５２番目、および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、プロリン、およびイソロイシンで置換された変異体（配列番号１２）であり、Ｆ６３−１の場合は９３番目、１００番目、１１３番目、１９１番目、４５４番目、および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、イソロイシン、およびグリシンで置換された変異体（配列番号１４）であることを確認することができた。
【００２７】
続いて、本発明者らは、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを製造するために、前述した大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型およびこれから由来した前記活性が増進された突然変異体のうちＧ３−１、Ｆ１２−１、およびＦ６３−１にそれぞれ、グルタミナーゼ活性部位に存在する８６番目のシステインを部位指定変異導入によってアラニンで置換した。前記部位指定変異導入によって製造された突然変異体をそれぞれＧ１Ｃ（配列番号１６）、Ｇ３Ｃ（配列番号１８）、Ｆ１２Ｃ（配列番号２０）、およびＦ６３Ｃ（配列番号２２）と命名した。前記塩基変異は、通常の塩基配列決定法によって決定した。その結果、製造された変異体は、グルタミンはアミン供与体として効率的に利用することができず、外部のアンモニアのみをアミン供与体として利用することができることを確認した。
【００２８】
したがって、本発明は、好適な一様態として、配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つアンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体を提供する。
【００２９】
本発明の実施例では、配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法およびその活性のみを開示したが、これらの実施例に記載したものと同様の方法によって、前記配列番号４、６または８のアミノ酸配列を持つ、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼにもアンモニア特異的性質を与えることにより、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造することができることを、当業者であれば十分理解できるであろう。
【００３０】
一方、本実施例では、５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番位置のシステインをアラニンで置換した例のみを開示したが、公知の分子生物学的方法による部位指定変異を介して他のアミノ酸、例えばセリンまたはグリシンなどを導入する場合にもアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼを得ることができるのは、当業者であれば十分分かるであろう。
【００３１】
ひいては、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、前述した配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、このような変異体タンパク質と機能的に同等な程度の活性を示すことが可能なその等価物を含む。本願において、用語「機能的等価物」とは、本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つが、同様にアンモニア特異的性質を有し且つ同等な程度の活性を有する５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性を示すタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。
【００３２】
後述するように、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、常時発現システムを用いて発現させたとき、反応液当りの活性が野生型に比べて５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃの活性は１．６倍、Ｇ３Ｃは１．４倍、Ｆ１２Ｃは１．６７倍、そしてＦ６３Ｃは１．４５倍の活性が増加することを確認することができるので、これらのアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は５’−グアニル酸の生成に効率よく利用できるであろう。
【００３３】
本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、合成(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963)またはＤＮＡ配列を基本とする組み換え方法によって製造できる(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2ndEd., 1989)。遺伝子組み換え技術を利用する場合、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを宿主細胞に軽質転換してアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞からアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を回収する過程によって収得することができる。
【００３４】
したがって、別の好適な様態として、本発明は、活性が増進されたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造する方法を提供する。具体的に、本発明は、５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼ活性を抑制することにより、グルタミナーゼの活性が除去された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体が細胞内では活性を最小化して細胞に対する毒性が減少しながらも、アンモニアに対する活性は変性されないため、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に効率よく転換させることが可能なアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法を提供する。
【００３５】
好適な様態において、本発明は、大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼのグルタミナーゼ活性部位に存在する８６番目のシステインを部位指定変異導入法(site-directed mutagenesis)によって相異なるアミノ酸で代替することにより、代替された８６番位置のアミノ酸と１８３番位置のグルタミン酸がγ−グルタミンチオエステルを形成しないためグルタミナーゼ活性が抑制され、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造する方法を提供する。さらに好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法は、大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のシステインをアラニンで置換することを含む。
【００３６】
特に好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法は、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたはその活性が増進された変異体から製造されることを特徴とする。
【００３７】
さらに特に好適な様態において、本発明に係るアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、大腸菌由来の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼまたは本発明の具体的な実施例によって製造される配列番号４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を持つ大腸菌由来の活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の８６番のシステイン残基をアラニンで置換させることにより製造する方法を提供する。
【００３８】
別の様態において、本発明は、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子に関する。
【００３９】
好適な様態として、本発明の具体的な実施例によって製造される配列番号１６のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃは配列番号１５の核酸分子によってコードされ、配列番号１８のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ３Ｃは配列番号１７の核酸分子によってコードされ、配列番号２０のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｆ１２Ｃは配列番号１９の核酸分子によってコードされ、配列番号２２のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｆ６３Ｃは配列番号２１の核酸分子によってコードされる。このような核酸分子の配列は、単鎖または二重鎖であってもよく、ＤＮＡ分子または配列上のチミン（Ｔ）がウラシルで置換されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であってもよい。
【００４０】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸配列は、これを発現するベクターによって提供されてタンパク質として発現できる。
【００４１】
別の様態において、本発明は、前述したアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００４２】
本発明において、「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能なベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００４３】
本発明において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、一般的な機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的のタンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。例えば、プロモータと、タンパク質をコードする核酸配列とが作動可能に連結され、コードする核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる。組み換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを使用する。発現ベクターに用いられるプロモータとしては、例えば宿主が大腸菌の場合にはｔｒｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、λＰＬプロモータ、ｌｐｐプロモータ、Ｔ７プロモータなどが、宿主がバシラス属菌の場合にはＳＰ０１プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、ｐｅｎＰプロモータなどが好ましい。開始コドンおよび終結コドンは、遺伝子作製物が投与されたときに個体で必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)にあるべきである。発現ベクターはベクター含有の宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターは複製起源を含むことができる。
【００４４】
本発明の具体的な実施では、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１Ｃ、ｐＣＪ１−Ｇ３Ｃ、ｐＣＪ１−Ｆ１２Ｃ、およびｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃを製作した。これらの製作されたベクターの概要を図１３〜図１６に示した。これらの発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに導入し、最終的に形質転換された大腸菌を収得した。前記形質転換体をそれぞれ「Escherichia coli DH5α/pCJ1-G1C」、「Escherichia coli DH5α/pCJ1-G3C」、「Escherichia coliDH5α/pCJ1-F12C」、および「Escherichia coliDH5α/pCJ1-F63C」と命名し、これらの菌体を２００５年１２月２日付で韓国種菌協会にそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ−１０７１５Ｐ、ＫＣＣＭ−１０７１７Ｐ、ＫＣＣＭ−１０７２１ＰおよびＫＣＣＭ−１０７２０で寄託した。別の様態において、本発明は前述した発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００４５】
形質転換は、核酸分子を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含み、当分野で公知になっているように宿主細胞に応じて適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンなどを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現する発現ベクターで形質転換される宿主細胞によってタンパク質の発現量と修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。宿主細胞としては原核細胞が好ましく、例えば大腸菌(Escherichia coli)、バシラスサブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタフィロコッカス(Staphylococcus)などの原核宿主細胞があるが、これらに限定されない。
【００４７】
また、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、酵母（例えば、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、アカパンカビ(Neurospora crassa)）などの下等真核細胞なども用いることができる。
【００４８】
別の様態において、本発明は、前述した形質転換体を培養した後、これから５’−キサンチル酸アミナーゼの変異タンパク質を分離する段階を含む、５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造する方法に関する。
【００４９】
本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を発現する発現ベクターで形質転換された宿主細胞（形質転換体）の培養は、目的タンパク質であるアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現を可能にする適切な条件の下で行う。このような条件は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【００５０】
宿主細胞で発現させたタンパク質は、通常の方式で精製することができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（例えばアセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーおよび限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせて適用し、本発明のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体タンパク質を精製することができる。
【００５１】
以下、本発明の好適な実施例について説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
実施例１：５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異ライブラリの構築
５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子に突然変異誘発型重合酵素連鎖反応(error-prone PCR)を行ってランダムな突然変異を誘発することにより、多様な５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異を次のように製造した。
【００５３】
まず、大腸菌に由来した１，５７８ｂｐの５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子（配列番号１）を、ｔｒｃプロモータを有し且つ大腸菌で増幅可能な複製起源を持つ発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに作動可能に連結した組み換えプラスミドｐＧ１を製作し、これを突然変異誘発型重合酵素連鎖反応の鋳型として準備した。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応に使用されたプライマーは、配列番号２３のＮ末端プライマーと配列番号２４のＣ末端プライマーを使用した。これは大腸菌に由来した５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて合成した。
【００５４】
配列番号２３：５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＡＡ３’
配列番号２４：５’ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴ３’
ＰＣＲ反応液は、それぞれ０．４ｍＭの前記Ｎ−プライマーおよびＣ−プライマー、鋳型として前記組み換えプラスミドｐＧ１ ５ｎｇ、１０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰおよびＴａｑ重合酵素の５酵素単位を含むように５０ｍＬを調製した。ＰＣＲは、９４℃で１分、５０℃で１分および７２℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行い、最後に７２℃で７分の反応を行った。
【００５５】
前述したように増幅されたＰＣＲ産物は、寒天ゲル電気泳動法によって分離し、増幅分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIで切断した後、５’−キサンチル酸アミナーゼ発現ベクターとして有用なｐＴｒｃ９９ａに接合させて組み換えプラスミドを製作した。前記製作された突然変異遺伝子を含有するベクターを大腸菌ＢＷ（ｇｕａＡ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ菌株）に導入して５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ライブラリを製作した。ｇｕａＡ遺伝子が除去された菌株の大腸菌ＢＷは、通常の分子生物学的方法によって得られた(Datsenko KA, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97(12), 6640-6645)。
【００５６】
実施例２：５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体の探索
実施例１で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のライブラリを０．５％バクトトリプトン、１％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天および０．２ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ平板培地に塗抹した。次いで、成長した大腸菌コロニーをディープウェルマイクロプレート(deep well microplate)内のＬＢ培地で培養した後、細胞の成長度合いに応じて１００ｍＬに希釈した。各ウェルにキシレン５ｍＬを添加し、３７℃で３０分間処理した後、４２℃で予熱した基質混合物を１００ｍＬ添加し、４２℃で２０分間反応させた。基質混合物は３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を１６ｍＭのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした反応液である。３．５％の過塩素酸８００ｍＬを添加して反応を終了させた後、２００ｍＬをＵＶ測定用９６ウェルプレートに移して波長２９０ｎｍにおける吸光度を測定した。５’−グアニル酸の生成量を測定し、酵素活性を比較して、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を持つ大腸菌ＪＭ１０５形質転換体を獲得した。
【００５７】
前記探索過程によって得られた５’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異遺伝子を持つプラスミドｐＧ３、および野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子を持つプラスミドｐＧ１に対して適切な制限酵素処理およびライゲーションを行い、実施例１と同様の条件で突然変異誘発型ＰＣＲを行った後、前記活性比較スクリーニング法によって、活性が親酵素に比べて増進された遺伝子を持つプラスミドｐＦ１２、ｐＦ６３、ｐＣＪ−Ｇ３−１、ｐＣＪ−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１を得た。
【００５８】
前記実施例１と実施例２に記述された、活性が増進された５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を製造する過程を図１に概略的に示した。
【００５９】
実施例２で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のライブラリ規模および変異体に対する記述を表１にまとめた。
【００６０】
【表１】
【００６１】
実施例３：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を暗号化する遺伝子の塩基配列
実施例１および２で製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＡＢＩ３７３０ｘｌを用いて決定した。それぞれの塩基配列は配列番号３（Ｇ３）、配列番号５（Ｆ１２）、配列番号７（Ｆ６３）、配列番号９（Ｇ３−１）、配列番号１１（Ｆ１２−１）、および配列番号１３（Ｆ６３−１）と確認されたところ、それぞれのアミノ酸配列を推定して配列番号４（Ｇ３）、配列番号６（Ｆ１２）、配列番号８（Ｆ６３）、配列番号１０（Ｇ３−１）、配列番号１２（Ｆ１２−１）および配列番号１４（Ｆ６３−１）で表した。また、前記Ｇ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１をそれぞれ含むプラスミド地図を図３〜図８にそれぞれ示した。
【００６２】
前記ｐＧ３に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３遺伝子の塩基配列からＧ３のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号４で表した。また、ｐＦ１２に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２遺伝子の塩基配列からＦ１２のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号６で表した。同様に、ｐＦ６３に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３遺伝子の塩基配列からＦ６３のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号８で表した。また、ｐＧ３−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子の塩基配列からＧ３−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１０で表した。また、ｐＣＪ−Ｆ１２−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子の塩基配列からＦ１２−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１２で表した。同様に、ｐＣＪ−Ｆ６３−１に含まれた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子の塩基配列からＦ６３−１のアミノ酸配列を推定し、これを配列番号１４で表した。
【００６３】
本発明の高活性５’−キサンチル酸アミナーゼであるＧ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１のアミノ酸配列を配列番号２の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼのアミノ酸配列と比較する場合、それぞれ２個、２個、４個、４個、３個および６個のアミノ酸が置換されて新規のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを確認することができた。
【００６４】
すなわち、Ｇ３の場合は５２番目および１９１番目のアミノ酸配列がそれぞれシステインおよびトレオニンで、Ｆ１２の場合は９３番目および１５２番目のアミノ酸配列がそれぞれバリンおよびプロリンで、Ｆ６３の場合は９３番目、１１３番目、１９１番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、アラニン、トレオニンおよびグリシンで置換されたことを確認することができ、Ｇ３−１の場合は５２番目、１９１番目、１５３番目および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれシステイン、トレオニン、アルギニンおよびイソロイシンで、Ｆ１２−１の場合は９３番目、１５２番目および４５４番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、プロリンおよびイソロイシンで、Ｆ６３−１の場合は９３番目、１００番目、１１３番目、１９１番目、４５４番目および４６７番目のアミノ酸配列がそれぞれバリン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、イソロイシンおよびグリシンで置換されたことを確認することができた。
【００６５】
上述したアミノ酸配列および活性測定探索法によって、本発明のＧ３、Ｆ１２、Ｆ６３、Ｇ３−１、Ｆ１２−１およびＦ６３−１は、アミノ酸配列が既存の大腸菌５’−キサンチル酸アミナーゼとは相異するうえ、高活性を持つ新規の５’−キサンチル酸アミナーゼと判断することができる。
【００６６】
実施例４：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の常時発現ベクターの製造
前記得られた高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を常時発現ベクターを用いて発現させるために、下記の過程を行った。
【００６７】
５’−キサンチル酸アミナーゼ野生型および変異体の遺伝子を、ＣＪ１プロモータを有し、且つ大腸菌とコリネバクテリウムアンモニアゲネスで増幅可能な複製起源を有する常時発現ベクターｐＥＣＧ１１７−ＣＪ１に作動可能に連結した組み換えプラスミドを製作した。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応を行った。突然変異誘発型重合酵素連鎖反応に使用されたプライマーは、配列番号２５のＮ−末端プライマー（ｇｕａＡ−ｆ）と配列番号２６のＣ−末端プライマー（ｇｕａＡ−ｒ）を使用した。これは大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて合成した。
【００６８】
配列番号２５：５’ＡＣＧＴＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＡＡＧＣ３’
配列番号２６：５’ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＡＧＣ３’
ＰＣＲ反応液は、それぞれ０．４ｍＭの前記Ｎ−プライマーおよびＣ−プライマー、鋳型としてｐＧ１、ｐＣＪ−Ｇ３−１、ｐＣＪ−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１それぞれ５ｎｇ、１０ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰおよびＰｆｕ重合酵素の５酵素単位を含むように５０ｍＬを調製した。ＰＣＲは、９４℃で１分、５０℃で１分および７２℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行い、最後に７２℃で５分の反応を行った。
【００６９】
前述したように増幅されたＰＣＲ産物は、寒天ゲル電気泳動法によって分離した。増幅分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮａｅIとＢａｍＨIで切断した後、５’−キサンチル酸アミナーゼ発現ベクターとして有用なｐＥＣＧ１１７−ＣＪ１に接合させて組み換えプラスミドを製作した（図２）。前記５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型および変異体を含む発現ベクターをそれぞれｐＣＪ１−Ｇ１（野生型）、ｐＣＪ１−Ｇ３−１、ｐＣＪ１−Ｆ１２−１およびｐＣＪ−Ｆ６３−１と命名し、前記製作されたベクターの概要を図９〜図１２に示した。
【００７０】
実施例５：アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの製造
５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型および前記実施例で得た高活性の５’−キサンチル酸突然変異体を用いてアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造するために、これらタンパク質の８６番目のシステインをアラニンに特異的に変異させるためのプライマーを製作し、これを配列番号２７および配列番号２８で表した。
【００７１】
配列番号２７：５’ＣＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＧ３’
配列番号２８：５’ＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＧ３’
前記プライマーの存在下で、部位指定変異導入を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅII ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、製造社から提供された手続によって行った。得られたコロニーからプラスミドを公知の方法によって抽出し、これを用いて塩基配列を決定した。これにより、５’−キサンチル酸アミナーゼ野生型および前記変異体の突然変異を維持し、さらに８６番目のシステインがアラニンで置換された新規の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を得た。これらをそれぞれＧ１Ｃ、Ｇ３Ｃ、Ｆ１２Ｃ、およびＦ６３Ｃと命名した。
【００７２】
所望の位置に正確な変異を獲得したかを評価するために、５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子の配列をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＡＢＩ３７３０ｘｌを用いて決定した。それぞれの塩基配列は配列番号１５（Ｇ１Ｃ）、配列番号１７（Ｇ３Ｃ）、配列番号１９（Ｆ１２Ｃ）、および配列番号２１（Ｆ６３Ｃ）と確認されたところ、それぞれのアミノ酸配列を推定して配列番号１６（Ｇ１Ｃ）、配列番号１８（Ｇ３Ｃ）、配列番号２０（Ｆ１２Ｃ）および配列番号２２（Ｆ６３Ｃ）で表した。前記５’−キサンチル酸アミナーゼの変異体を含む発現ベクターを製作し、これらをそれぞれｐＣＪ１−Ｇ１Ｃ、ｐＣＪ１−Ｇ３Ｃ、ｐＣＪ１−Ｆ１２ＣおよびｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃと命名し、前記製作されたベクターの概要を図１３〜図１６に示した。
【００７３】
実施例６：５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性評価
５’−キサンチル酸アミナーゼの非活性増加を確認するために、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質発現量を濃度分析器によって確認した。この際、各変異体の発現量は互いに類似であると確認された。この点から、５’−キサンチル酸アミナーゼ活性の増加が非活性の増加によるものであることが分かった。
【００７４】
５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の活性を比較するために、下記の過程を行った。まず、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌとした２５ｍＬの培地に各変異体を接種し、３７℃で１２時間培養した。変異体を回収した後、１ｍＬの変異体培養液に２０ｍＬのキシレンを添加し、これを３７℃で２０分間２５０ｒｐｍにて放置した。これを１／１０で希釈し、アンモニアに対する反応活性を測定するために、３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした反応液８００ｍＬに２００ｍＬの酵素液を混ぜ、４２℃で１５分間反応を行った。Ｌ−グルタミンに対する活性を測定するために、試料２００ｍＬを０．１７５％ＴＣＡ溶液３．８ｍＬに混ぜて反応を中止させた。３０ｍＭ ＸＭＰ、１３ｍＭ ＡＴＰ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＭ Ｌ−グルタミンを２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かした溶液８００ｍＬに、１／１０で希釈された酵素液２００ｍＬを混ぜ、４２℃で１５分間反応を行った。前記反応液はＨＰＬＣを用いてＧＭＰ量を比較した。この際、５’−キサンチル酸アミナーゼの酵素活性は１分当り１ｍｍｏｌの５’−グアニル酸が生成される条件を１単位活性とした。ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
【００７５】
Ｅｌｕｅｎｔ：Ａ：
０．０２％リン酸二水素テトラブチルアンモニム
０．２％リン酸二水素アンモニウム、ｐＨ２．４
Ｅｌｕｅｎｔ Ｂ：アセトニトリル
Ａ：Ｂ＝９７：３
測定波長＝２５４ｎｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
アンモニアを基質として用いた場合、酵素活性は次の通りである。反応液１ｍＬ当り野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼは１３．６１単位活性（Ｕ／ｍＬ）であり、変異体Ｇ３−１は１７．６２単位活性（Ｕ／ｍＬ）、変異体Ｆ１２−１は２０．８２単位活性（Ｕ／ｍＬ）、変異体Ｆ６３−１は1６．４７（Ｕ／ｍＬ）であった。アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体Ｇ１Ｃは２２．６４（Ｕ／ｍＬ）、Ｇ３Ｃは１９．３０（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ１２Ｃは２２．７６（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ６３Ｃは１９．６２（Ｕ／ｍＬ）であった。
【００７６】
これに対し、Ｌ−グルタミンを基質として用いた場合、酵素活性は次の通りである。野生型菌株は単位液当り８．３２Ｕ／ｍＬの活性を示し、変異体Ｇ３−１は１９．１５（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ１２−１は４．３１（Ｕ／ｍＬ）、Ｆ６３−１は０．５４（Ｕ／ｍＬ）の活性を示す反面、アンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体Ｇ１Ｃは０．２１Ｕ／ｍＬ、Ｇ３Ｃは０．１６Ｕ／ｍＬ、Ｆ１２Ｃは０．２４Ｕ／ｍＬ、Ｆ６３は０．４０Ｕ／ｍＬであった。
【００７７】
前記結果より、アンモニア特異的５’−キサンチル酸変異体は、Ｌ−グルタミンを基質とする場合には５’−キサンチル酸の５’−グアニル酸への転換特性を殆ど示さないが、アンモニアを基質とする場合には相応する野生型またはランダム突然変異体に比べて約１．４〜１．７倍増進された転換活性を示すことを確認することができた（図１７）。
【００７８】
実施例７：アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現ベクターの細胞内安定性
アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現ベクターの細胞内安定性を比較するために、培養後に残っている発現ベクターの量を比較した。
【００７９】
培養後の発現ベクターの維持量を比較するために、培養終結後に培養液を１０−５に希釈し、これを、カナマイシン５０ｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ１％、ＮａＣｌ ０．５％）と抗生剤を含んでいないＬＢ培地に塗抹した後、３０℃で１６時間培養して形成されたコロニーの数を比較した。これを相対数値化して図１８に示した。
【００８０】
図１８に示すように、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のうちＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターの場合、５４．３％のコロニーが前記発現ベクターを含んでいるが、これに対し、野生型の５’−キサンチル酸アミナーゼの場合、３６．０％のコロニーのみが前記遺伝子の発現ベクターを含んでいた。これは、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼの場合、細胞内に発現ベクターをさらに安定的に維持しており、その結果活性の増進が生ずることを意味する。
【００８１】
〔産業上の利用可能性〕
以上説明および立証したように、本発明は、調味成分として有用な５’−グアニル酸を効果的に生産するために、５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる５’−キサンチル酸アミナーゼの野生型およびその活性が増進されたランダム突然変異によって製造された５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えたアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体およびその製造方法を提供する。したがって、本発明に係る５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、野生型に比べて活性が増進されるうえ、細胞毒性が減少して細胞内でより安定的に維持されることにより、５’−グアニル酸を生産する生物過程に有用に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の前記および他の目的、特徴およびその他の利点は、添付図面を参照する次の詳細な説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図１】ランダム突然変異導入を介して５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体ライブラリを製造し、高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼをスクリーニングする方法を概略的に示す図である。
【図２】ランダム突然変異によって製造された高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼを常時発現させるために常時発現ベクターに導入する過程を概略的に示す図である。
【図３】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３遺伝子を含む発現ベクターｐＧ３を示す。
【図４】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２遺伝子を含む発現ベクターｐＦ１２を示す。
【図５】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３遺伝子を含む発現ベクターｐＦ６３を示す。
【図６】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｇ３−１を示す。
【図７】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｆ１２−１を示す。
【図８】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ−Ｆ６３−１を示す。
【図９】野生型５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子であるＧ１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１を示す。
【図１０】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ３−１を示す。
【図１１】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ１２−１を示す。
【図１２】高活性の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３−１遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ６３−１を示す。
【図１３】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ１Ｃを示す。
【図１４】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＧ３Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｇ３Ｃを示す。
【図１５】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ１２Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ１２Ｃを示す。
【図１６】アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体であるＦ６３Ｃ遺伝子を含む発現ベクターｐＣＪ１−Ｆ６３Ｃを示す。
【図１７】大腸菌の野生型５’−キサンチル酸アミナーゼ（Ｇ１）、本発明の実施例によって製造された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼのランダム突然変異体（Ｇ３−１、Ｆ１２−１、Ｆ６３−１）、およびアンモニア特異的突然変異体（Ｇ１Ｃ、Ｇ３Ｃ、Ｆ１２Ｃ、Ｆ６３Ｃ）のアンモニアまたはＬ−グルタミンを基質とした場合の培養液当りの単位活性を示す図である。図面において、Ａｍｍｏはアンモニアを基質としたときの単位活性であり、Ｇｌｎはグルタミンを基質としたときの単位活性である。
【図１８】野生型５’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子（Ｇ１）を含む発現ベクターと、前記Ｇ１遺伝子の８６番目のアミノ酸残基であるシステインをアラニンで置換したアンモニア特異的なＧ１Ｃ遺伝子を含む発現ベクターとの安定性を比較して示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型大腸菌、または増進された活性を持つように変異された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基を、アラニン、セリンおよびグリシンよりなる群から選ばれるアミノ酸で置換して製造される、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
【請求項２】
増進された活性を持つように変異された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基をアラニンで置換して製造されることを特徴とする、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つ、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
【請求項５】
請求項４に記載の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された原核細胞である形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる方法。
【請求項９】
大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基であるシステインを他のアミノ酸で置換することを含む、実質的にグルタミンには反応せず、アンモニアにのみ特異的に反応して増加した活性で５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法。
【請求項１０】
５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基を、アラニン、グリシンおよびセリンよりなる群から選ばれるアミノ酸で置換することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
野生型大腸菌、または増進された活性を持つように変異された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基を、アラニン、セリンおよびグリシンよりなる群から選ばれるアミノ酸で置換して製造される、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
【請求項２】
増進された活性を持つように変異された大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基をアラニンで置換して製造されることを特徴とする、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号１６、１８、２０または２２のアミノ酸配列を持つ、アンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
【請求項５】
請求項４に記載の５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された原核細胞である形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させる方法。
【請求項９】
大腸菌由来の５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基であるシステインを他のアミノ酸で置換することを含む、実質的にグルタミンには反応せず、アンモニアにのみ特異的に反応して増加した活性で５’−キサンチル酸を５’−グアニル酸に転換させるアンモニア特異的５’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法。
【請求項１０】
５’−キサンチル酸アミナーゼの８６番のアミノ酸残基を、アラニン、グリシンおよびセリンよりなる群から選ばれるアミノ酸で置換することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００９−５１９０３５（Ｐ２００９−５１９０３５Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５４９７（Ｐ２００８−５４５４９７）
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００５４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８６１
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００５４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８６１
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
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