イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法
【課題】陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて血液中のＬｐ（ａ）を分離すること。
【解決の手段】塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌである、Ｌｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３、塩濃度が溶離液１と溶離液３との間である、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、血液中のＬｐ（ａ）量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームの同時分析が可能となった。
【解決の手段】塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌである、Ｌｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３、塩濃度が溶離液１と溶離液３との間である、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、を溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、血液中のＬｐ（ａ）量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームの同時分析が可能となった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いた血液中のＬｐ（ａ）の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のリポ蛋白には、健康な人においても、比較的多く量が存在するリポ蛋白として、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、及び超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）があり、健康な人では微量であるが、家族性高脂血症などの疾患患者の血液中に多く存在する中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、食後一過的に増加するリポ蛋白であるカイロミクロン（ＣＭ）がある。また、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる微量に存在するリポ蛋白もある。
【０００３】
Ｌｐ（ａ）は、冠動脈疾患や脳梗塞などの動脈硬化性疾患のリスクファクターとして良く知られている（非特許文献１から３）。また、Ｌｐ（ａ）に特徴的なアポ蛋白であるａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）には分子量の異なるアイソフォームがあり、非特許文献４では４００から７００ｋＤａにわたって、６種の分子量の異なるアイソフォームが、非特許文献５では４１９から８３８ｋＤａにわたって、１１種の分子量の異なるアイソフォームが、それぞれ報告されている。そして、アイソフォームのうち、低分子量のアイソフォームが結合したＬｐ（ａ）が動脈硬化性疾患に対して、より高いリスクファクターであることが知られている（非特許文献３、６及び７）。そのため、Ｌｐ（ａ）に基づく動脈硬化性疾患に対するリスクファクターの評価には、Ｌｐ（ａ）の量を測定するとともに、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量情報も得られることが望ましい。
【０００４】
Ｌｐ（ａ）の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法が一般的に用いられており（非特許文献２、６及び７）、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の測定は、一般的にウエスタンブロット法が用いられている（非特許文献４及び７）。また、超遠心分離法では、Ｌｐ（ａ）が比重１．０６から１．１２ｇ／ｍＬにかけて存在している。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、分子量のアイソフォームの情報は得られないし、ウエスタンブロット法では、Ｌｐ（ａ）の量を精度良く測定するのは分析手法の特性を考えると困難である。また、超遠心分離によって得られる、比重１．０６から１．１２ｇ／ｍＬの画分には、Ｌｐ（ａ）の他にも、比重の高い一部のＬＤＬとＨＤＬ２が含まれている（非特許文献８及び９）。そのため、Ｌｐ（ａ）の量、及びアイソフォームを同時に得られる測定法はまだ知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】Ｄａｎｉｋ ＪＳら，ＪＡＭＡ，２９６，１３６３，２００６．
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ ＧＴら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，５３，６７９，２００７．
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ Ｌら，Ａｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２４，２２１９，２００４．
【非特許文献４】Ｕｔｅｒｍａｎｎ Ｇら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，８０，４５８，１９８７．
【非特許文献５】Ｇａｕｂａｔｚ ＪＷら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，３１，６０３，１９９０．
【非特許文献６】Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ ＪＣら，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１６，１７９４，２００５．
【非特許文献７】Ｊｕｒｇｅｎｓ Ｇら，Ｓｔｏｋｅ，２６，１８４１，１９９５．
【非特許文献８】Ｇａｕｂａｔｚ ＪＷら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，２８，６９，１９８７．
【非特許文献９】Ｋｏｓｔｎｅｒ ＧＭら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，４０，２２５５，１９９９．
【非特許文献１０】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，１４０４，２００３．
【非特許文献１１】廣渡 祐史ら，第３９回日本動脈硬化学会総会・学術集会 プログラム・抄録集，６６，２２３，２００７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のようにＬｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームは、共に動脈硬化性疾患のリスクファクターとして知られているので、両方の情報が同時に得られる測定法は有用性が高いと考えられる。本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、Ｌｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームを同時に分析することができる簡便な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、陰イオン交換カラムを用いたリポ蛋白の分離条件を詳細に検討することにより、Ｌｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の異なるアイソフォームを分析する方法を確立した。
【０００８】
即ち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であり、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、Ｌｐ（ａ）を当該陰イオン交換カラムにより分離することからなる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であって、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が溶離液１の塩濃度と溶離液３の塩濃度との間であることを特徴とする、血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
（２）溶離液２の塩濃度を、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度まで段階的に高めることで、結合するａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の順にＬｐ（ａ）を溶出させることを特徴とする、（１）に記載の血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン、Ｌｐ（ａ））の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施することが可能である。分離後は、コレステロールと反応する市販の酵素液（例えば、総コレステロール測定用ＴＣＨＯ−Ｌ（商品名）（（株）セロテック製）と混合して反応させることで、可視光検出器で測定することができ、また簡便で定量性も良いことが知られている（非特許文献１０及び１１）。
【００１１】
陰イオン交換カラムに充填するゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基といった陰イオン交換基を結合したものが例示できる。また、当該ゲル表面は、１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）、孔がないもの（非多孔質）のどちらを用いても良いが、好ましくはリポ蛋白に対する分離性能の高い非多孔質のゲルであり、特に好ましい陰イオン交換カラムに充填するゲルの一例として、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名）（東ソー（株）製）があげられる。
【００１２】
Ｌｐ（ａ）の分離は陰イオン交換カラムを使用し、溶離液の塩濃度の勾配を利用して行なうことが出来る。血液などリポ蛋白を含んだ試料を陰イオン交換カラムに供した後、溶離液１よりも塩濃度の低い溶離液で試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させ、分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１及び３と、塩濃度が溶離液１と３の間である溶離液２を、塩濃度の低い順に陰イオン交換カラムに流す。これらの溶離液の役割としては、溶離液１はＬｐ（ａ）をカラムに吸着させるとともにＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンを溶出させ、溶離液２は、分子量の低いａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出させ、溶離液３は残りのＬｐ（ａ）を全て溶出させることにある。なお、当該分離溶出条件において、溶離液２は、１種類の塩濃度の溶離液であっても良いし、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件（グラディエント）であっても良い。また、溶離液２で段階的に溶離液の塩濃度を高める方法としては、階段状に塩濃度を高めて（ステップグラディエント）も良いし、直線的に塩濃度を高めて（リニアグラディエント）も良い。
【００１３】
溶離液に添加する塩としては、リポ蛋白の分離能力の高い、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムといったカオトロピックイオンを含む塩が例示できるが、本発明の分離方法では、実施例で使用した過塩素酸ナトリウムを塩として使用するのが好ましい。また、溶離液の塩濃度とは、加えた試薬の解離しているイオン濃度のことである。過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、イオンの濃度がそのまま塩濃度となり、例えば過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約４０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１４】
使用する溶離液には、緩衝液を加えて、ｐＨを６から９に調整することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液といった、当業者において慣用のものが使用できる。
【００１５】
本発明における最も好ましい条件の一例として、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、当該カラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が２７５ｍｍｏｌ／Ｌから２８５ｍｍｏｌ／Ｌ、あるいは、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度との間で段階的に溶離液の塩濃度を高める条件（グラディエント）である。
【００１６】
また、分離するときのカラム温度は、リポ蛋白が凝集しない１５℃以上で、かつ、リポ蛋白が変性しない４０℃以下が好ましい。カラムに対する流速は、概ね、カラムサイズ；３．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍｍの場合には、０．３から２．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５から１．０ｍＬ／ｍｉｎが特に好ましい。試料の純度が分離に与える影響は少なく、一般的な血清であれば適用できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、動脈硬化性疾患のリスクファクターとして知られているＬｐ（ａ）及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームを同時に分析することができる簡便な方法を提供する。本発明の分離方法を用いることで動脈硬化性疾患に対するリスクファクターを評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
実施例に用いた装置を図１に示す。
【００１９】
溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウムである。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）は２台のＤＰ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。ＤＰ−８０２０ポンプは、互いを制御することにより、２つの溶離液のグラディエントが行なえるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名）（東ソー（株）製）（粒子径２．５μｍ、交換基容量０．１当量／Ｌ（ｇｅｌ）のポリマー系非多孔質ゲルを３．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍｍのカラムに充填したもの：東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（商品名）（（株）セロテック製）を使用し、ポンプ（１２）直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢ及びコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液（コレステロール反応液は、主要な成分としてコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム、４―アミノアンチピリンが含まれる）のラインに、抵抗管（１３）（０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍ）を２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。
【００２０】
測定の形態としては、まず、血液などのリポ蛋白を含んだ試料をオートサンプラー（６）から注入する。注入する配管はポンプ（４）とカラム（８）の間に設置されており、ポンプ（４）から溶離液を流すことにより試料はカラムに導入される。ポンプ（４）により比較的塩濃度の低い溶離液（溶離液Ｂの割合が低い）をカラム（８）に予め流すことにより、カラム（８）を平衡化しておいて、試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させる。続いて、溶離液Ａに対する溶離液Ｂの流す割合を高め、カラムに流す溶離液の塩濃度を高めることにより、吸着力の弱いリポ蛋白から順にカラム出口から溶出してくる。この溶出液とコレステロール反応液（１０）を混合し、反応コイル（１４）に導いて反応させる。反応液はコレステロールの量に依存して発色する試薬となっているので、その色を検出器（１５）で測定することでコレステロール量に依存するクロマトグラムを取得し、そのピーク面積により、各リポ蛋白のコレステロール含量を算出するものである。
【００２１】
実施例で用いたＬｐ（ａ）試料はインフォームドコンセントを得て採取した以下の各検体を、超遠心分離して取得した、比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分（本画分には比重の高いＬＤＬ、ＨＤＬ２及びＬｐ（ａ）が含まれる）である。なお、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量は、５％アクリルアミド−ＳＤＳ電気泳動ゲル、一次抗体としてヒトＬｐ（ａ）抗体（ヤギ抗体、ＣＯＲＴＥＸ ＢＩＯＣＨＥＭ社製）、二次抗体としてＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ヤギ抗体−抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）、検出試薬としてＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ， ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｆｏｒ ＡＰ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた、ウエスタンブロット法により求めた。
【００２２】
検体１：
脂質異常症患者（６２歳、男性）の血液試料
・総コレステロール：２９７ｍｇ／ｄＬ
・中性脂肪：７９ｍｇ／ｄＬ
・Ｌｐ（ａ）タンパク質量：９０ｍｇ／ｄＬ
・Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量：
５９０ｋＤａ（主成分）と６８７ｋＤａ（図２）
検体２：
脂質異常症患者（６３歳、男性）の血液試料
・総コレステロール：２５６ｍｇ／ｄＬ
・中性脂肪：１７８ｍｇ／ｄＬ
・Ｌｐ（ａ）タンパク質量：７５ｍｇ／ｄＬ
・Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量：
６２７ｋＤａ（主成分）と７０８ｋＤａ（図２）
カイロミクロン試料：
脂質異常症患者（４０歳、男性、総コレステロール：２４４ｍｇ／ｄＬ）の血清か
ら超遠心分離法（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）で分離し調製（カイロミクロンの含量
約８０％）。
【００２３】
溶離液による溶出パターンは、０．０分から５．０分はＡ７０．０％＋Ｂ３０．０％（塩濃度：１９０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、５．０分から３５．０分はＡ７０．０＋Ｂ３０．０％からＢ１００％へのリニアグラディエントとし、３５．０分から３８．０分はＢ１００％に固定し、３８．０分から４３．０分はＡ７０．０％＋Ｂ３０．０％に固定した。測定は４３分サイクルで実施した。
【００２４】
検体１及び２から得られたＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）、及びカイロミクロン試料を前記条件で、陰イオン交換クロマトグラフィーによる測定を実施したところ、カイロミクロン試料（図３）のピーク溶出時間が１０．５分であり、検体１及び２から得られたＬｐ（ａ）試料（図４及び５）のピーク溶出時間が、それぞれ１４．７分、１７．８分であったため、カイロミクロン、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（検体１）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（検体２）の溶出位置が異なり、かつ、これらの順番に溶出することを確認した。
（実施例２）
実施例１と同じ装置及び検体を用いて、Ｌｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１の塩濃度の検討を行なった。
【００２５】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＢの組成を３４．０から４９．０％（塩濃度：２１０から２８５ｍｍｏｌ／Ｌ）の間で条件を変えて、固定し、１７．５分から１８．５分はＢの組成を各溶出パターンで決めた１４．５分から１７．５分の条件の割合（％）から１００％へのリニアグラディエントとし、１８．５分から２１．５分はＢ１００％に固定し、２１．５分から２２．５分はＢ１００％からＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％へのリニアグラディエントとし、２１．５分から３１．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％に固定した。測定時間は３１分サイクルとした。
【００２６】
カイロミクロン試料について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３４．０、３５．０、３６．０、３７．０、３８．０、３９．０、４０．０、４２．０、４５．０％の条件で測定し、カイロミクロンの溶出条件を検討した。各条件でカイロミクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたカイロミクロン試料）のピークの面積比（％）と、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出しきれなかったカイロミクロン試料）のピーク面積比（％）を確認した（図６）。Ｂが３５．０％（塩濃度：２１５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時に、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比が４６．０％とカイロミクロンが概ね溶出していた。一方、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比は１５．５％と小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。そして、Ｂが３７．０％（塩濃度：２２５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比が５４．３％、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が８．１％と、さらに分離が明確となった。図６の結果から、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させ、その他のリポ蛋白を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、カイロミクロンを概ね溶出する塩濃度である２１５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３５．０％）以上であれば良く、好ましくは２２５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３７．０％）以上である。図７は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時のカイロミクロン試料のクロマトグラムである。図７よりＬｐ（ａ）が溶出する２０分までに、他のリポ蛋白（ＶＬＤＬ、カイロミクロン）のほとんどが溶出されていることがわかる。
【００２７】
次に、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３４．０、３５．０、３６．０、３７．０、３８．０、３９．０、４０．０、４１．０、４２．０、４３．０、４５．０、４７．０、４９．０％の条件で測定し、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出条件を検討した。各条件でＬｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）と、カイロミクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で本来の位置よりも先に溶出したＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）を確認した（図８）。Ｂが４１．０％（塩濃度：２４５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時に、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が７０．２％と概ねＬｐ（ａ）を溶出させる位置にピークが収束した。一方、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比は２９．８％と比較的小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。そして、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピークが８６．２％であり、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積は１３．８％と、さらに分離が明確となった。図８の結果から、血液中のＬｐ（ａ）画分を吸着させ、その他のリポ蛋白画分を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）を持つＬｐ（ａ）を概ね吸着させる塩濃度である２４５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが４１．０％）以下であれば良く、好ましくは２３５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３９．０％）以下である。図９は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時の、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラムである。図９より低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）と、他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
【００２８】
さらに、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３７．０、３９．０、４１．０、４３．０、４５．０、４７．０、４９．０％の条件で測定し、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出条件を検討した。各条件でＬｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）と、カイロマイクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で本来の位置よりも先に溶出したＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）を確認した（図１０）。検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料は、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料に比べ、吸着力が強いため、Ｂが４７．０％の時でも、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が７３．５％と概ねＬｐ（ａ）の位置にピークが収束した。一方、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比は２６．４％と比較的小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。図１１は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時の、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）のクロマトグラムである。図１１より高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）と、他のリポ蛋白画分（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
【００２９】
これらすべての結果から考えるに、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させ、その他のリポ蛋白を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、カイロミクロンを溶出する塩濃度である２１５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３５．０％）以上、かつ、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を吸着させる塩濃度である２４５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが４１．０％）以下が好ましい。さらに好ましくは、溶離液１の塩濃度が２２５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３７．０％）以上、かつ、２３５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３９．０％）以下である。
（実施例３）
実施例１と同じ装置及び検体を用いて、Ｌｐ（ａ）を全て溶出する溶離液３の塩濃度の検討を行なった。
【００３０】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から１８．５分はＢの組成を３８．０％から１８．５分から２１．５分の条件で決めた条件の割合（％）へのリニアグラディエントとし、１８．５分から２１．５分はＢの組成を４８．０％（塩濃度：２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）から１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に条件を変えて固定し、２１．５分から２２．５分はＢの組成を１８．５分から２１．５分の条件で決めた条件の割合（％）から２０．０％へのリニアグラディエントとし、２１．５分から３１．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％に固定した。測定時間は３１分サイクルとした。
【００３１】
測定試料は、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）を用いた。１８．５分から２１．５分はＢの組成を４８．０、５５．０、５０．０、６５．０、７０．０、７８．０、８５．０、１００％の条件で測定した（図１２、Ｂが１００％のときのＬｐ（ａ）試料のピーク面積を１００％として換算）。Ｂが６５．０％（塩濃度：３６５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は概ね溶出した（８６．３％）。更にＢが７０．０％（塩濃度：３９０ｍｍｏｌ／Ｌ）のときは、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）がほぼ全量溶出した（９５．３％）。
【００３２】
以上の結果から、Ｌｐ（ａ）を全て溶出する溶離液３の塩濃度は３６５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが６５．０％）以上であれば良く、更に好ましくは、塩濃度が３９０ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが７０．０％）以上である。図１３及び１４に、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）を持つＬｐ（ａ）試料のＢが６５．０％（塩濃度：３６５ｍｍｏｌ／Ｌ）及び８５．０％（塩濃度：４６５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時のクロマトグラムを示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と、他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
（実施例４）
実施例１と同じ装置を用いて、検討を行なった。
【００３３】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から２６．５分はＢの組成を３８．０％から８０．０％（塩濃度：４４０ｍｍｏｌ／Ｌ）へのリニアグラディエントとし、２６．５分から２９．５分はＢ１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２９．５分から３８．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定した。測定時間は３８分サイクルとした。
【００３４】
本条件において溶離液１はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液３はＢの組成１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液２はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）からＢの組成８０．０％（塩濃度：４４０ｍｍｏｌ／Ｌ）のリニアグラディエントに相当する。
【００３５】
図１５にカイロミクロン試料のクロマトグラムを示す。カイロミクロンが溶出する位置（溶出時間１８．２分）に主たるピークが確認された。図１６及び１８に、検体１及び２から取得した、低分子量及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）のクロマトグラムを示す。低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（溶出時間２２．７分）は、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（溶出時間２４．５分）よりも早く溶出していた。検体１及び２のクロマトグラムを、それぞれ図１７及び１９に示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン）とが明確に分離されており、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出時間も、Ｌｐ（ａ）試料を用いたとき（図１６及び１８）と同様な時間となった。また、当該クロマトグラムから求めた測定値を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（実施例５）
実施例１と同じ装置を用いて、検討を行なった。
【００３８】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から２１．０分はＡ５３．０％＋Ｂ４７．０％（塩濃度：２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２１．０分から２４．５分はＢ１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２４．５分から３３．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定した。測定時間は３３分サイクルとした。
【００３９】
本条件において溶離液１はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液３はＢの組成１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液２はＢの組成４７．０％（塩濃度：２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当する。
【００４０】
図２０にカイロミクロン試料のクロマトグラムを示す。カイロミクロンが溶出する位置（溶出時間１８．２分）に主たるピークが確認された。図２１及び２３に、検体１及び２から取得した、低分子量及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）のクロマトグラムを示す。低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は溶出時間２１．５分に主たるバンドが、やや小さなバンドが溶出時間２４．９分に見られる。高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は溶出時間２２．６分に小さなバンドが、主たるバンドが溶出時間２４．８分に見られる。このように、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）が高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）に比べ、早く溶出するＬｐ（ａ）のピークの割合が多くなることが確認された。検体１及び２のクロマトグラムを、それぞれ図２２及び２４に示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン）とが明確に分離されており、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出時間も、Ｌｐ（ａ）試料を用いたとき（図２１及び２３）と同様な時間となった。また、このクロマトグラムから求めた測定値を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例で用いた装置。
【図２】実施例１の結果（検体１及び２のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のウエスタンブロット解析）。
【図３】実施例１の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図４】実施例１の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図５】実施例１の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図６】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合のカイロミクロン試料の結果）。
【図７】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時のカイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図８】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図９】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時の検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１０】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図１１】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１２】実施例３の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図１３】実施例３の結果（溶離液Ｂが６５．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１４】実施例３の結果（溶離液Ｂが８５．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１５】実施例４の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図１６】実施例４の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１７】実施例４の結果（検体１のクロマトグラム）。
【図１８】実施例４の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１９】実施例４の結果（検体２のクロマトグラム）。
【図２０】実施例５の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図２１】実施例５の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図２２】実施例５の結果（検体１のクロマトグラム）。
【図２３】実施例５の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図２４】実施例５の結果（検体２のクロマトグラム）。
【符号の説明】
【００４３】
１ 溶離液Ａ
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いた血液中のＬｐ（ａ）の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のリポ蛋白には、健康な人においても、比較的多く量が存在するリポ蛋白として、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、及び超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）があり、健康な人では微量であるが、家族性高脂血症などの疾患患者の血液中に多く存在する中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、食後一過的に増加するリポ蛋白であるカイロミクロン（ＣＭ）がある。また、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる微量に存在するリポ蛋白もある。
【０００３】
Ｌｐ（ａ）は、冠動脈疾患や脳梗塞などの動脈硬化性疾患のリスクファクターとして良く知られている（非特許文献１から３）。また、Ｌｐ（ａ）に特徴的なアポ蛋白であるａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）には分子量の異なるアイソフォームがあり、非特許文献４では４００から７００ｋＤａにわたって、６種の分子量の異なるアイソフォームが、非特許文献５では４１９から８３８ｋＤａにわたって、１１種の分子量の異なるアイソフォームが、それぞれ報告されている。そして、アイソフォームのうち、低分子量のアイソフォームが結合したＬｐ（ａ）が動脈硬化性疾患に対して、より高いリスクファクターであることが知られている（非特許文献３、６及び７）。そのため、Ｌｐ（ａ）に基づく動脈硬化性疾患に対するリスクファクターの評価には、Ｌｐ（ａ）の量を測定するとともに、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量情報も得られることが望ましい。
【０００４】
Ｌｐ（ａ）の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法が一般的に用いられており（非特許文献２、６及び７）、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の測定は、一般的にウエスタンブロット法が用いられている（非特許文献４及び７）。また、超遠心分離法では、Ｌｐ（ａ）が比重１．０６から１．１２ｇ／ｍＬにかけて存在している。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、分子量のアイソフォームの情報は得られないし、ウエスタンブロット法では、Ｌｐ（ａ）の量を精度良く測定するのは分析手法の特性を考えると困難である。また、超遠心分離によって得られる、比重１．０６から１．１２ｇ／ｍＬの画分には、Ｌｐ（ａ）の他にも、比重の高い一部のＬＤＬとＨＤＬ２が含まれている（非特許文献８及び９）。そのため、Ｌｐ（ａ）の量、及びアイソフォームを同時に得られる測定法はまだ知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】Ｄａｎｉｋ ＪＳら，ＪＡＭＡ，２９６，１３６３，２００６．
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ ＧＴら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，５３，６７９，２００７．
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ Ｌら，Ａｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２４，２２１９，２００４．
【非特許文献４】Ｕｔｅｒｍａｎｎ Ｇら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，８０，４５８，１９８７．
【非特許文献５】Ｇａｕｂａｔｚ ＪＷら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，３１，６０３，１９９０．
【非特許文献６】Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ ＪＣら，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１６，１７９４，２００５．
【非特許文献７】Ｊｕｒｇｅｎｓ Ｇら，Ｓｔｏｋｅ，２６，１８４１，１９９５．
【非特許文献８】Ｇａｕｂａｔｚ ＪＷら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，２８，６９，１９８７．
【非特許文献９】Ｋｏｓｔｎｅｒ ＧＭら，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，４０，２２５５，１９９９．
【非特許文献１０】Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，１４０４，２００３．
【非特許文献１１】廣渡 祐史ら，第３９回日本動脈硬化学会総会・学術集会 プログラム・抄録集，６６，２２３，２００７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のようにＬｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームは、共に動脈硬化性疾患のリスクファクターとして知られているので、両方の情報が同時に得られる測定法は有用性が高いと考えられる。本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、Ｌｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームを同時に分析することができる簡便な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、陰イオン交換カラムを用いたリポ蛋白の分離条件を詳細に検討することにより、Ｌｐ（ａ）の量、及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の異なるアイソフォームを分析する方法を確立した。
【０００８】
即ち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であり、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、Ｌｐ（ａ）を当該陰イオン交換カラムにより分離することからなる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であって、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が溶離液１の塩濃度と溶離液３の塩濃度との間であることを特徴とする、血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
（２）溶離液２の塩濃度を、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度まで段階的に高めることで、結合するａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の順にＬｐ（ａ）を溶出させることを特徴とする、（１）に記載の血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン、Ｌｐ（ａ））の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施することが可能である。分離後は、コレステロールと反応する市販の酵素液（例えば、総コレステロール測定用ＴＣＨＯ−Ｌ（商品名）（（株）セロテック製）と混合して反応させることで、可視光検出器で測定することができ、また簡便で定量性も良いことが知られている（非特許文献１０及び１１）。
【００１１】
陰イオン交換カラムに充填するゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基といった陰イオン交換基を結合したものが例示できる。また、当該ゲル表面は、１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）、孔がないもの（非多孔質）のどちらを用いても良いが、好ましくはリポ蛋白に対する分離性能の高い非多孔質のゲルであり、特に好ましい陰イオン交換カラムに充填するゲルの一例として、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名）（東ソー（株）製）があげられる。
【００１２】
Ｌｐ（ａ）の分離は陰イオン交換カラムを使用し、溶離液の塩濃度の勾配を利用して行なうことが出来る。血液などリポ蛋白を含んだ試料を陰イオン交換カラムに供した後、溶離液１よりも塩濃度の低い溶離液で試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させ、分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１及び３と、塩濃度が溶離液１と３の間である溶離液２を、塩濃度の低い順に陰イオン交換カラムに流す。これらの溶離液の役割としては、溶離液１はＬｐ（ａ）をカラムに吸着させるとともにＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンを溶出させ、溶離液２は、分子量の低いａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出させ、溶離液３は残りのＬｐ（ａ）を全て溶出させることにある。なお、当該分離溶出条件において、溶離液２は、１種類の塩濃度の溶離液であっても良いし、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件（グラディエント）であっても良い。また、溶離液２で段階的に溶離液の塩濃度を高める方法としては、階段状に塩濃度を高めて（ステップグラディエント）も良いし、直線的に塩濃度を高めて（リニアグラディエント）も良い。
【００１３】
溶離液に添加する塩としては、リポ蛋白の分離能力の高い、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムといったカオトロピックイオンを含む塩が例示できるが、本発明の分離方法では、実施例で使用した過塩素酸ナトリウムを塩として使用するのが好ましい。また、溶離液の塩濃度とは、加えた試薬の解離しているイオン濃度のことである。過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、イオンの濃度がそのまま塩濃度となり、例えば過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約４０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１４】
使用する溶離液には、緩衝液を加えて、ｐＨを６から９に調整することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液といった、当業者において慣用のものが使用できる。
【００１５】
本発明における最も好ましい条件の一例として、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、当該カラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が２７５ｍｍｏｌ／Ｌから２８５ｍｍｏｌ／Ｌ、あるいは、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度との間で段階的に溶離液の塩濃度を高める条件（グラディエント）である。
【００１６】
また、分離するときのカラム温度は、リポ蛋白が凝集しない１５℃以上で、かつ、リポ蛋白が変性しない４０℃以下が好ましい。カラムに対する流速は、概ね、カラムサイズ；３．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍｍの場合には、０．３から２．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５から１．０ｍＬ／ｍｉｎが特に好ましい。試料の純度が分離に与える影響は少なく、一般的な血清であれば適用できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、動脈硬化性疾患のリスクファクターとして知られているＬｐ（ａ）及びａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のアイソフォームを同時に分析することができる簡便な方法を提供する。本発明の分離方法を用いることで動脈硬化性疾患に対するリスクファクターを評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
実施例に用いた装置を図１に示す。
【００１９】
溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウムである。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）は２台のＤＰ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。ＤＰ−８０２０ポンプは、互いを制御することにより、２つの溶離液のグラディエントが行なえるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（商品名）（東ソー（株）製）（粒子径２．５μｍ、交換基容量０．１当量／Ｌ（ｇｅｌ）のポリマー系非多孔質ゲルを３．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍｍのカラムに充填したもの：東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（商品名）（（株）セロテック製）を使用し、ポンプ（１２）直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（商品名）（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢ及びコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液（コレステロール反応液は、主要な成分としてコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム、４―アミノアンチピリンが含まれる）のラインに、抵抗管（１３）（０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍ）を２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。
【００２０】
測定の形態としては、まず、血液などのリポ蛋白を含んだ試料をオートサンプラー（６）から注入する。注入する配管はポンプ（４）とカラム（８）の間に設置されており、ポンプ（４）から溶離液を流すことにより試料はカラムに導入される。ポンプ（４）により比較的塩濃度の低い溶離液（溶離液Ｂの割合が低い）をカラム（８）に予め流すことにより、カラム（８）を平衡化しておいて、試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させる。続いて、溶離液Ａに対する溶離液Ｂの流す割合を高め、カラムに流す溶離液の塩濃度を高めることにより、吸着力の弱いリポ蛋白から順にカラム出口から溶出してくる。この溶出液とコレステロール反応液（１０）を混合し、反応コイル（１４）に導いて反応させる。反応液はコレステロールの量に依存して発色する試薬となっているので、その色を検出器（１５）で測定することでコレステロール量に依存するクロマトグラムを取得し、そのピーク面積により、各リポ蛋白のコレステロール含量を算出するものである。
【００２１】
実施例で用いたＬｐ（ａ）試料はインフォームドコンセントを得て採取した以下の各検体を、超遠心分離して取得した、比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分（本画分には比重の高いＬＤＬ、ＨＤＬ２及びＬｐ（ａ）が含まれる）である。なお、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量は、５％アクリルアミド−ＳＤＳ電気泳動ゲル、一次抗体としてヒトＬｐ（ａ）抗体（ヤギ抗体、ＣＯＲＴＥＸ ＢＩＯＣＨＥＭ社製）、二次抗体としてＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ヤギ抗体−抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）、検出試薬としてＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ， ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｆｏｒ ＡＰ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた、ウエスタンブロット法により求めた。
【００２２】
検体１：
脂質異常症患者（６２歳、男性）の血液試料
・総コレステロール：２９７ｍｇ／ｄＬ
・中性脂肪：７９ｍｇ／ｄＬ
・Ｌｐ（ａ）タンパク質量：９０ｍｇ／ｄＬ
・Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量：
５９０ｋＤａ（主成分）と６８７ｋＤａ（図２）
検体２：
脂質異常症患者（６３歳、男性）の血液試料
・総コレステロール：２５６ｍｇ／ｄＬ
・中性脂肪：１７８ｍｇ／ｄＬ
・Ｌｐ（ａ）タンパク質量：７５ｍｇ／ｄＬ
・Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量：
６２７ｋＤａ（主成分）と７０８ｋＤａ（図２）
カイロミクロン試料：
脂質異常症患者（４０歳、男性、総コレステロール：２４４ｍｇ／ｄＬ）の血清か
ら超遠心分離法（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）で分離し調製（カイロミクロンの含量
約８０％）。
【００２３】
溶離液による溶出パターンは、０．０分から５．０分はＡ７０．０％＋Ｂ３０．０％（塩濃度：１９０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、５．０分から３５．０分はＡ７０．０＋Ｂ３０．０％からＢ１００％へのリニアグラディエントとし、３５．０分から３８．０分はＢ１００％に固定し、３８．０分から４３．０分はＡ７０．０％＋Ｂ３０．０％に固定した。測定は４３分サイクルで実施した。
【００２４】
検体１及び２から得られたＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）、及びカイロミクロン試料を前記条件で、陰イオン交換クロマトグラフィーによる測定を実施したところ、カイロミクロン試料（図３）のピーク溶出時間が１０．５分であり、検体１及び２から得られたＬｐ（ａ）試料（図４及び５）のピーク溶出時間が、それぞれ１４．７分、１７．８分であったため、カイロミクロン、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（検体１）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（検体２）の溶出位置が異なり、かつ、これらの順番に溶出することを確認した。
（実施例２）
実施例１と同じ装置及び検体を用いて、Ｌｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１の塩濃度の検討を行なった。
【００２５】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＢの組成を３４．０から４９．０％（塩濃度：２１０から２８５ｍｍｏｌ／Ｌ）の間で条件を変えて、固定し、１７．５分から１８．５分はＢの組成を各溶出パターンで決めた１４．５分から１７．５分の条件の割合（％）から１００％へのリニアグラディエントとし、１８．５分から２１．５分はＢ１００％に固定し、２１．５分から２２．５分はＢ１００％からＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％へのリニアグラディエントとし、２１．５分から３１．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％に固定した。測定時間は３１分サイクルとした。
【００２６】
カイロミクロン試料について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３４．０、３５．０、３６．０、３７．０、３８．０、３９．０、４０．０、４２．０、４５．０％の条件で測定し、カイロミクロンの溶出条件を検討した。各条件でカイロミクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたカイロミクロン試料）のピークの面積比（％）と、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出しきれなかったカイロミクロン試料）のピーク面積比（％）を確認した（図６）。Ｂが３５．０％（塩濃度：２１５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時に、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比が４６．０％とカイロミクロンが概ね溶出していた。一方、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比は１５．５％と小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。そして、Ｂが３７．０％（塩濃度：２２５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比が５４．３％、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が８．１％と、さらに分離が明確となった。図６の結果から、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させ、その他のリポ蛋白を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、カイロミクロンを概ね溶出する塩濃度である２１５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３５．０％）以上であれば良く、好ましくは２２５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３７．０％）以上である。図７は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時のカイロミクロン試料のクロマトグラムである。図７よりＬｐ（ａ）が溶出する２０分までに、他のリポ蛋白（ＶＬＤＬ、カイロミクロン）のほとんどが溶出されていることがわかる。
【００２７】
次に、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３４．０、３５．０、３６．０、３７．０、３８．０、３９．０、４０．０、４１．０、４２．０、４３．０、４５．０、４７．０、４９．０％の条件で測定し、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出条件を検討した。各条件でＬｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）と、カイロミクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で本来の位置よりも先に溶出したＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）を確認した（図８）。Ｂが４１．０％（塩濃度：２４５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時に、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が７０．２％と概ねＬｐ（ａ）を溶出させる位置にピークが収束した。一方、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比は２９．８％と比較的小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。そして、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピークが８６．２％であり、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積は１３．８％と、さらに分離が明確となった。図８の結果から、血液中のＬｐ（ａ）画分を吸着させ、その他のリポ蛋白画分を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）を持つＬｐ（ａ）を概ね吸着させる塩濃度である２４５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが４１．０％）以下であれば良く、好ましくは２３５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３９．０％）以下である。図９は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時の、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラムである。図９より低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）と、他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
【００２８】
さらに、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）について、１４．５分から１７．５分のＢの組成を３７．０、３９．０、４１．０、４３．０、４５．０、４７．０、４９．０％の条件で測定し、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出条件を検討した。各条件でＬｐ（ａ）を溶出させる位置（設定したＢの組成条件で溶出できたＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）と、カイロマイクロンを溶出させる位置（設定したＢの組成条件で本来の位置よりも先に溶出したＬｐ（ａ）試料）のピーク面積比（％）を確認した（図１０）。検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料は、検体１から取得した低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料に比べ、吸着力が強いため、Ｂが４７．０％の時でも、Ｌｐ（ａ）を溶出させる位置のピーク面積比が７３．５％と概ねＬｐ（ａ）の位置にピークが収束した。一方、カイロミクロンを溶出させる位置のピーク面積比は２６．４％と比較的小さいため、前記溶離液の条件において、カイロミクロンとＬｐ（ａ）の分離が可能なことが示された。図１１は、Ｂが３９．０％（塩濃度：２３５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時の、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）のクロマトグラムである。図１１より高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）と、他のリポ蛋白画分（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
【００２９】
これらすべての結果から考えるに、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させ、その他のリポ蛋白を溶出させるための溶離液１の塩濃度は、カイロミクロンを溶出する塩濃度である２１５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３５．０％）以上、かつ、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を吸着させる塩濃度である２４５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが４１．０％）以下が好ましい。さらに好ましくは、溶離液１の塩濃度が２２５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３７．０％）以上、かつ、２３５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが３９．０％）以下である。
（実施例３）
実施例１と同じ装置及び検体を用いて、Ｌｐ（ａ）を全て溶出する溶離液３の塩濃度の検討を行なった。
【００３０】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から１８．５分はＢの組成を３８．０％から１８．５分から２１．５分の条件で決めた条件の割合（％）へのリニアグラディエントとし、１８．５分から２１．５分はＢの組成を４８．０％（塩濃度：２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）から１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に条件を変えて固定し、２１．５分から２２．５分はＢの組成を１８．５分から２１．５分の条件で決めた条件の割合（％）から２０．０％へのリニアグラディエントとし、２１．５分から３１．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％に固定した。測定時間は３１分サイクルとした。
【００３１】
測定試料は、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）を用いた。１８．５分から２１．５分はＢの組成を４８．０、５５．０、５０．０、６５．０、７０．０、７８．０、８５．０、１００％の条件で測定した（図１２、Ｂが１００％のときのＬｐ（ａ）試料のピーク面積を１００％として換算）。Ｂが６５．０％（塩濃度：３６５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時には、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は概ね溶出した（８６．３％）。更にＢが７０．０％（塩濃度：３９０ｍｍｏｌ／Ｌ）のときは、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）がほぼ全量溶出した（９５．３％）。
【００３２】
以上の結果から、Ｌｐ（ａ）を全て溶出する溶離液３の塩濃度は３６５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが６５．０％）以上であれば良く、更に好ましくは、塩濃度が３９０ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｂが７０．０％）以上である。図１３及び１４に、検体２から取得した高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）を持つＬｐ（ａ）試料のＢが６５．０％（塩濃度：３６５ｍｍｏｌ／Ｌ）及び８５．０％（塩濃度：４６５ｍｍｏｌ／Ｌ）の時のクロマトグラムを示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と、他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ）とが明確に分離されていることがわかる。
（実施例４）
実施例１と同じ装置を用いて、検討を行なった。
【００３３】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から２６．５分はＢの組成を３８．０％から８０．０％（塩濃度：４４０ｍｍｏｌ／Ｌ）へのリニアグラディエントとし、２６．５分から２９．５分はＢ１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２９．５分から３８．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定した。測定時間は３８分サイクルとした。
【００３４】
本条件において溶離液１はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液３はＢの組成１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液２はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）からＢの組成８０．０％（塩濃度：４４０ｍｍｏｌ／Ｌ）のリニアグラディエントに相当する。
【００３５】
図１５にカイロミクロン試料のクロマトグラムを示す。カイロミクロンが溶出する位置（溶出時間１８．２分）に主たるピークが確認された。図１６及び１８に、検体１及び２から取得した、低分子量及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）のクロマトグラムを示す。低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（溶出時間２２．７分）は、高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）（溶出時間２４．５分）よりも早く溶出していた。検体１及び２のクロマトグラムを、それぞれ図１７及び１９に示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン）とが明確に分離されており、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出時間も、Ｌｐ（ａ）試料を用いたとき（図１６及び１８）と同様な時間となった。また、当該クロマトグラムから求めた測定値を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（実施例５）
実施例１と同じ装置を用いて、検討を行なった。
【００３８】
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、３．５分から８．５分はＡ７６．０％＋Ｂ２４．０％（塩濃度：１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、８．５分から１１．０分はＡ７３．０％＋Ｂ２７．０％（塩濃度：１７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１１．０分から１４．５分はＡ６８．０％＋Ｂ３２．０％（塩濃度：２００ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１４．５分から１７．５分はＡ６２．０％＋Ｂ３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、１７．５分から２１．０分はＡ５３．０％＋Ｂ４７．０％（塩濃度：２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２１．０分から２４．５分はＢ１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定し、２４．５分から３３．０分はＡ８０．０％＋Ｂ２０．０％（塩濃度：１４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に固定した。測定時間は３３分サイクルとした。
【００３９】
本条件において溶離液１はＢの組成３８．０％（塩濃度：２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液３はＢの組成１００％（塩濃度：５４０ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当し、溶離液２はＢの組成４７．０％（塩濃度：２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）に相当する。
【００４０】
図２０にカイロミクロン試料のクロマトグラムを示す。カイロミクロンが溶出する位置（溶出時間１８．２分）に主たるピークが確認された。図２１及び２３に、検体１及び２から取得した、低分子量及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料（超遠心分離により取得した比重１．０６０から１．１２５ｇ／ｍＬの画分、ＨＤＬ２及び比重の高いＬＤＬを含む）のクロマトグラムを示す。低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は溶出時間２１．５分に主たるバンドが、やや小さなバンドが溶出時間２４．９分に見られる。高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）は溶出時間２２．６分に小さなバンドが、主たるバンドが溶出時間２４．８分に見られる。このように、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）が高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）に比べ、早く溶出するＬｐ（ａ）のピークの割合が多くなることが確認された。検体１及び２のクロマトグラムを、それぞれ図２２及び２４に示す。いずれの場合も、Ｌｐ（ａ）と他のリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン）とが明確に分離されており、低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）、及び高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）の溶出時間も、Ｌｐ（ａ）試料を用いたとき（図２１及び２３）と同様な時間となった。また、このクロマトグラムから求めた測定値を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例で用いた装置。
【図２】実施例１の結果（検体１及び２のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）のウエスタンブロット解析）。
【図３】実施例１の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図４】実施例１の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図５】実施例１の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図６】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合のカイロミクロン試料の結果）。
【図７】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時のカイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図８】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図９】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時の検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１０】実施例２の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図１１】実施例２の結果（溶離液Ｂが３９．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１２】実施例３の結果（溶離液Ｂの条件を変更した場合の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料の結果）。
【図１３】実施例３の結果（溶離液Ｂが６５．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１４】実施例３の結果（溶離液Ｂが８５．０％の時の検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１５】実施例４の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図１６】実施例４の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１７】実施例４の結果（検体１のクロマトグラム）。
【図１８】実施例４の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図１９】実施例４の結果（検体２のクロマトグラム）。
【図２０】実施例５の結果（カイロミクロン試料のクロマトグラム）。
【図２１】実施例５の結果（検体１から得られた低分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図２２】実施例５の結果（検体１のクロマトグラム）。
【図２３】実施例５の結果（検体２から得られた高分子量のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）試料のクロマトグラム）。
【図２４】実施例５の結果（検体２のクロマトグラム）。
【符号の説明】
【００４３】
１ 溶離液Ａ
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であり、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、Ｌｐ（ａ）を当該陰イオン交換カラムにより分離することからなる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であって、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が溶離液１の塩濃度と溶離液３の塩濃度との間であることを特徴とする、血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【請求項２】
溶離液２の塩濃度を、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度まで段階的に高めることで、結合するａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の順にＬｐ（ａ）を溶出させることを特徴とする、請求項１に記載の血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【請求項１】
イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であり、血液中のＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液１、分子量の小さいａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）が結合したＬｐ（ａ）を溶出するための溶離液２、Ｌｐ（ａ）を全て溶出するための溶離液３を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、Ｌｐ（ａ）を当該陰イオン交換カラムにより分離することからなる血液中のＬｐ（ａ）の分離方法であって、溶離液１の塩濃度が２１５ｍｍｏｌ／Ｌから２４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が３６５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、溶離液２の塩濃度が溶離液１の塩濃度と溶離液３の塩濃度との間であることを特徴とする、血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【請求項２】
溶離液２の塩濃度を、溶離液１の塩濃度から溶離液３の塩濃度まで段階的に高めることで、結合するａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）の分子量の順にＬｐ（ａ）を溶出させることを特徴とする、請求項１に記載の血液中のＬｐ（ａ）の分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公開番号】特開２００９−２０４４９３（Ｐ２００９−２０４４９３Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４７８０２（Ｐ２００８−４７８０２）
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
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