イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
【課題】 膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
【解決手段】 イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【解決手段】 イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。なかでも、近年では糖化ヘモグロビン類（以下、ヘモグロビンＡ１ｃともいう）の分析方法として注目されている。
ヘモグロビンＡ１ｃは、血液中の糖がヘモグロビンのα鎖Ｎ末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンＡ１ｃが占める割合、すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、１〜２ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンＡ１ｃが占める割合を示すヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、例えば、シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応して得られたもの（特許文献１等）、架橋性単量体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの（特許文献２、特許文献３等）等が知られている。
【０００４】
これらのイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基と基材とからなるが、基剤部分には、膨潤したり収縮したりしないことが求められている。このため、例えば、基材として樹脂を用いる場合には、架橋度の高い樹脂が用いられている。しかし、架橋度の高い樹脂は、親水性が低いことからタンパク質等の非特異吸着を引き起し、測定精度が低下するという問題があった。このような非特異吸着を抑制する方法として、基材樹脂に親水性単量体を多く含有させる方法等が検討されているが、親水性を高めると基材の膨潤や収縮が生じやすくなり、高流速下における分析ができなくなったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりし、測定の遅延を招くという問題があった。
【０００５】
これに対して特許文献４には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を親水化処理した、具体的には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面にタンパク質等の親水基を有する化合物を吸着して親水化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が開示されている。このようなイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、基材が膨潤したり収縮したりしない一方で、親水性表面によりタンパク質等の非特異吸着を効果的に防止することができる。しかしながら、このように物理吸着により親水性化合物が固定化されている場合、使用初期の段階では高い性能を発揮できるものの、長期間使用しているうちに充填剤粒子の表面から親水性化合物が脱離してしまい、保持時間や測定値が変動することがあるという問題があった。また、吸着させる親水化合物のロット間差によっても保持時間や測定値が変動するという問題点もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１−２６２４６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−５９４６３号公報
【特許文献３】特公平８−７１９７号公報
【特許文献４】特開２００１−９１５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を常圧プラズマ処理することにより親水化処理を施すイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、イオン交換基を有する充填剤粒子表面に常圧プラズマ処理を施すことにより、充填剤粒子の表面のみが親水化されることを見出し、本発明を完成するに至った。プラズマ処理とは、電極間に導いた気体に電圧を印加することにより励起させてプラズマ化ガスとし、このプラズマ化ガスにより被処理物の表面を処理するものである。このような方法により親水化処理を行った場合には、プラズマ処理が施された表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。
【００１０】
上記充填剤粒子としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィー法の充填剤粒子として用いられているものを用いることができ、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子からなる有機系粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子からなる有機系粒子等が挙げられる。なかでも、合成高分子からなる有機系粒子は、架橋度等を調整することにより高い耐圧性や耐膨潤性を得ることができることから好ましい。
【００１１】
上記イオン交換基としては特に限定されず、陽イオン交換基であっても、陰イオン交換基であってもよい。上記陽イオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、ヘモグロビンＡ１ｃの分析にも高い効果が得られることから好適である。
【００１２】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子は、粒子の表面にイオン交換基を導入したり、イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子としたりする方法により調製することができる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法としては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平８−７１９７号公報に記載された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法；（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル等の重合性エステル化合物を架橋性単量体等と混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオ
ン交換基に変換する方法等も用いることができる。
【００１３】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎ分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。
【００１４】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の粒度分布について、粒子径のＣＶ値の好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。
【００１５】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法においては、上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化する。
プラズマ処理の方法としては特に限定されないが、装置及び操作を簡便化できることから常圧プラズマ処理が好適である。
なお、本明細書において常圧とは、大気圧近傍の圧力下のことを意味し、具体的には１．３３３×１０４〜１０．６６４×１０４Ｐａの圧力下のことを意味する。なかでも、圧力調整が容易で、装置が簡便になる９．３３１×１０４〜１０．３９７×１０４Ｐａの範囲における常圧プラズマ処理が好適である。
【００１６】
上記常圧プラズマ処理時に用いる処理ガスとしては特に限定されないが、例えば、アンモニアガスが好適である。アンモニアガスを用いることにより、充填剤粒子の表面に親水性基としてアミノ基を導入することができる。
また、経済性及び安全性の観点から、処理ガス単独雰囲気よりも、ヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン等の希ガスや窒素ガス等の希釈ガスを併用することが好ましい。これらの希釈ガスは単独でも用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、併用によりプラズマ密度を高め高速処理を可能とすることができ、また、入手が容易で安価でもあることから、アルゴンガス、窒素ガスが好適である。
【００１７】
希釈ガスを併用する場合には、ガス全体に占める処理ガスの割合の好ましい下限は１体積％、好ましい上限は２０体積％である。１体積％未満であると、プラズマ処理に時間がかかったり、充分な親水化効果が得られなかったりすることがある。２０体積％を超えると、反応に使用されずに排出される処理ガスが増え、経済性及び安全性の点で好ましくない。
【００１８】
このような処理ガスを対向する電極間に供給しながら、高周波、パルス波、マイクロ波等の電界を印加してグロー放電プラズマを発生させることによりプラズマ化したガスが生成させることができる。
この場合の電界としては、パルス電界が好ましく、特に、電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間が１０μｓ以下であるパルス電界が好適である。パルス電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間が１０μｓを超えると、放電状態がアーク放電に移行しやすく不安定なものとなり、高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。より好ましくは５μｓ以下である。電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間は、短いほどプラズマ発生の際のガスの電離が効率よく行われ、効率よくプラズマ化したガスを得ることができるが、現時点では４０ｎｓ未満の立ち上がり時間のパルス電界を実現することは困難である。
なお、本明細書において電解の立ち上がり時間とは、電圧（絶対値）が連続して増加する時間を意味し、立ち下がり時間とは、電圧（絶対値）が連続して減少する時間を意味する。
【００１９】
上記電界の電界強度の好ましい下限は１０ｋＶ／ｃｍ、好ましい上限は１０００ｋＶ／ｃｍである。１０ｋＶ／ｃｍ未満であると、プラズマ化したガスの生成に時間がかかりすぎることがあり、１０００ｋＶ／ｃｍを超えると、アーク放電が発生しやすくなり、高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。
【００２０】
上記電界の周波数の好ましい下限は０．５ｋＨｚである。０．５ｋＨｚ未満であるとプラズマ密度が低いためプラズマ化したガスの生成に時間がかかりすぎることがある。上限は特に限定されず、常用されている１３．５６ＭＨｚ、試験的に使用されている５０ＭＨｚといった高周波帯であってもよいが、負荷との整合のとり易さや取り扱い性を考慮すると５００ｋＨｚ以下であることが好ましい。
【００２１】
また、上記パルス電界におけるひとつのパルス継続時間の好ましい下限は０．５μｓ、好ましい上限は２００μｓである。２００μｓを超えると、アーク放電に移行しやすくなる。
なお、本明細書においてひとつのパルス継続時間とは、ＯＮとＯＦＦとの繰り返しからなるパルス電界における、ひとつのパルスの連続するＯＮ時間を意味する。
また、このときのＯＦＦ時間の好ましい下限は０．５μｓ、好ましい上限は１０００μｓであり、より好ましい上限は５００μｓである。
【００２２】
また、上記ガスを対向する電極間に供給する速度としては特に限定されず、プラズマの状態や処理条件等により適宜調整すればよいが、好ましい下限は１ｍ／ｓ、好ましい上限は５０ｍ／ｓである。１ｍ／ｓ未満であると、電流パスができやすく、放電が不安定になることがある。より好ましい下限は２ｍ／ｓ、より好ましい上限は２０ｍ／ｓｅｃである。
【００２３】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理する方法としては、イオン交換基を有する充填剤粒子を電極間に置き、そのまま処理ガスとともに電圧を印加する直接法であってもよいし、電極間で発生したプラズマガスを電極間の外部に設置したイオン交換基を有する充填剤粒子に吹き付けるリモート法であってもよい。なかでも、容器型の電極内でイオン交換基を有する充填剤粒子を処理ガス注入により分散させ、そこに、プラズマを発生させる方法が、イオン交換基を有する充填剤粒子の表面を均一に処理することができることから好適である。
【００２４】
上記電極の形状としては、特に限定されないが、電界集中によるアーク放電の発生を避けるために、対向電極間の距離が一定になる構造であることが好ましく、例えば、平行平板型、円筒対向平板型、球対向平板型、双曲対向平板型、同軸円筒型構造等が挙げられる。上記電極間の距離は、固体誘電体の厚さ、印加電圧の大きさ、プラズマを利用する目的等を考慮して適宜決定されるが、１〜５０ｍｍであることが好ましい。１ｍｍ未満では、電極間の間隔を置いて設置するのに充分でないことがある。５０ｍｍを超えると、均一なプラズマを発生させにくい。
【００２５】
また、上記電極の対向面は固体誘電体で被覆されていることが好ましい。この場合、固体誘電体と電極とが密着し、かつ、接する電極の対向面を完全に覆うようにすることが好ましい。固体誘電体によって覆われずに電極同士が直接対向する部位があると、そこから異常放電が生じて高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。
【００２６】
上記条件下で実施される常圧プラズマ処理の処理時間の好ましい下限は１秒間、好ましい上限は１２００秒間である。１秒未満であると、充填剤粒子表面のアミノ基導入量が少なく、タンパク質等の非特異吸着を充分に防止できないことがあり、１２００秒を超えると、充填剤粒子が劣化してその強度が不充分となることがある。より好ましい下限は１０秒間、より好ましい上限は６００秒間である。
【００２７】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、プラズマ処理が施された表面部分のみが親水化されていることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、また、タンパク質等が非特異吸着することもないことから極めて正確な測定を行うことができる。また、長期間にわたってこのような性能を維持することができ、長期間の使用後でも保持時間や測定値のバラツキが少ない。更に、ロット間差による保持時間や測定値のバラツキも極めて少ない。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
【００２８】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、とりわけ糖化ヘモグロビンの分析に好適に用いることができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものである糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（１）イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート４００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン８０ｇ、及び、ベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００３２】
（２）常圧プラズマ処理
得られた充填剤粒子１０ｇを常圧プラズマ処理装置（積水化学工業社製）を用いて、アルゴンガス：アンモニアガスを９０：１０の割合で混合したガスを装置内が１０．１００×１０４Ｐａになるまで導入し、電極間に電圧１４．０ｋＶ、周波数６．０ｋＨｚのパルス電界を印加してグロー放電プラズマを発生させ、３００秒間プラズマ処理を行った。
【００３３】
（比較例１）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、常温プラズマ処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
【００３４】
（比較例２）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子２０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍＬを加え、２分間超音波処理し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍＬ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍＬ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるＢＳＡが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３５】
（評価）
実施例１及び比較例１、２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。
【００３６】
（１）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における初期測定値の評価
実施例１及び比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体の平均値を測定値とした。
結果を表１に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００３７】
【表１】
表１より実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、極めて正確な測定ができたのに対して、比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤も用いた場合には、想定される値よりもかなり低いヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。これは、比較例１のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、タンパク質等の非特異吸着が起こっているためと考えられる。
【００３８】
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例１及び比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍
に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いて、１日に３００検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表２に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００３９】
【表２】
表２より、実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、４５００検体の負荷試験を行ったあとでも、ほとんどヘモグロビンＡ１ｃの保持時間に変化がなく、正確なヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が可能であることが判った。一方、
比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、負荷検体数が増えるに従ってヘモグロビンＡ１ｃの保持時間が変化する傾向があり、得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）も、実施例１の場合に比べてバラツキが大きいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。なかでも、近年では糖化ヘモグロビン類（以下、ヘモグロビンＡ１ｃともいう）の分析方法として注目されている。
ヘモグロビンＡ１ｃは、血液中の糖がヘモグロビンのα鎖Ｎ末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンＡ１ｃが占める割合、すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、１〜２ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンＡ１ｃが占める割合を示すヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、例えば、シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応して得られたもの（特許文献１等）、架橋性単量体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの（特許文献２、特許文献３等）等が知られている。
【０００４】
これらのイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基と基材とからなるが、基剤部分には、膨潤したり収縮したりしないことが求められている。このため、例えば、基材として樹脂を用いる場合には、架橋度の高い樹脂が用いられている。しかし、架橋度の高い樹脂は、親水性が低いことからタンパク質等の非特異吸着を引き起し、測定精度が低下するという問題があった。このような非特異吸着を抑制する方法として、基材樹脂に親水性単量体を多く含有させる方法等が検討されているが、親水性を高めると基材の膨潤や収縮が生じやすくなり、高流速下における分析ができなくなったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりし、測定の遅延を招くという問題があった。
【０００５】
これに対して特許文献４には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を親水化処理した、具体的には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面にタンパク質等の親水基を有する化合物を吸着して親水化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が開示されている。このようなイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、基材が膨潤したり収縮したりしない一方で、親水性表面によりタンパク質等の非特異吸着を効果的に防止することができる。しかしながら、このように物理吸着により親水性化合物が固定化されている場合、使用初期の段階では高い性能を発揮できるものの、長期間使用しているうちに充填剤粒子の表面から親水性化合物が脱離してしまい、保持時間や測定値が変動することがあるという問題があった。また、吸着させる親水化合物のロット間差によっても保持時間や測定値が変動するという問題点もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１−２６２４６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−５９４６３号公報
【特許文献３】特公平８−７１９７号公報
【特許文献４】特開２００１−９１５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を常圧プラズマ処理することにより親水化処理を施すイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、イオン交換基を有する充填剤粒子表面に常圧プラズマ処理を施すことにより、充填剤粒子の表面のみが親水化されることを見出し、本発明を完成するに至った。プラズマ処理とは、電極間に導いた気体に電圧を印加することにより励起させてプラズマ化ガスとし、このプラズマ化ガスにより被処理物の表面を処理するものである。このような方法により親水化処理を行った場合には、プラズマ処理が施された表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。
【００１０】
上記充填剤粒子としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィー法の充填剤粒子として用いられているものを用いることができ、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子からなる有機系粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子からなる有機系粒子等が挙げられる。なかでも、合成高分子からなる有機系粒子は、架橋度等を調整することにより高い耐圧性や耐膨潤性を得ることができることから好ましい。
【００１１】
上記イオン交換基としては特に限定されず、陽イオン交換基であっても、陰イオン交換基であってもよい。上記陽イオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、ヘモグロビンＡ１ｃの分析にも高い効果が得られることから好適である。
【００１２】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子は、粒子の表面にイオン交換基を導入したり、イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子としたりする方法により調製することができる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法としては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平８−７１９７号公報に記載された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法；（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル等の重合性エステル化合物を架橋性単量体等と混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオ
ン交換基に変換する方法等も用いることができる。
【００１３】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎ分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。
【００１４】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の粒度分布について、粒子径のＣＶ値の好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。
【００１５】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法においては、上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化する。
プラズマ処理の方法としては特に限定されないが、装置及び操作を簡便化できることから常圧プラズマ処理が好適である。
なお、本明細書において常圧とは、大気圧近傍の圧力下のことを意味し、具体的には１．３３３×１０４〜１０．６６４×１０４Ｐａの圧力下のことを意味する。なかでも、圧力調整が容易で、装置が簡便になる９．３３１×１０４〜１０．３９７×１０４Ｐａの範囲における常圧プラズマ処理が好適である。
【００１６】
上記常圧プラズマ処理時に用いる処理ガスとしては特に限定されないが、例えば、アンモニアガスが好適である。アンモニアガスを用いることにより、充填剤粒子の表面に親水性基としてアミノ基を導入することができる。
また、経済性及び安全性の観点から、処理ガス単独雰囲気よりも、ヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン等の希ガスや窒素ガス等の希釈ガスを併用することが好ましい。これらの希釈ガスは単独でも用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、併用によりプラズマ密度を高め高速処理を可能とすることができ、また、入手が容易で安価でもあることから、アルゴンガス、窒素ガスが好適である。
【００１７】
希釈ガスを併用する場合には、ガス全体に占める処理ガスの割合の好ましい下限は１体積％、好ましい上限は２０体積％である。１体積％未満であると、プラズマ処理に時間がかかったり、充分な親水化効果が得られなかったりすることがある。２０体積％を超えると、反応に使用されずに排出される処理ガスが増え、経済性及び安全性の点で好ましくない。
【００１８】
このような処理ガスを対向する電極間に供給しながら、高周波、パルス波、マイクロ波等の電界を印加してグロー放電プラズマを発生させることによりプラズマ化したガスが生成させることができる。
この場合の電界としては、パルス電界が好ましく、特に、電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間が１０μｓ以下であるパルス電界が好適である。パルス電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間が１０μｓを超えると、放電状態がアーク放電に移行しやすく不安定なものとなり、高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。より好ましくは５μｓ以下である。電界の立ち上がり及び／又は立ち下がり時間は、短いほどプラズマ発生の際のガスの電離が効率よく行われ、効率よくプラズマ化したガスを得ることができるが、現時点では４０ｎｓ未満の立ち上がり時間のパルス電界を実現することは困難である。
なお、本明細書において電解の立ち上がり時間とは、電圧（絶対値）が連続して増加する時間を意味し、立ち下がり時間とは、電圧（絶対値）が連続して減少する時間を意味する。
【００１９】
上記電界の電界強度の好ましい下限は１０ｋＶ／ｃｍ、好ましい上限は１０００ｋＶ／ｃｍである。１０ｋＶ／ｃｍ未満であると、プラズマ化したガスの生成に時間がかかりすぎることがあり、１０００ｋＶ／ｃｍを超えると、アーク放電が発生しやすくなり、高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。
【００２０】
上記電界の周波数の好ましい下限は０．５ｋＨｚである。０．５ｋＨｚ未満であるとプラズマ密度が低いためプラズマ化したガスの生成に時間がかかりすぎることがある。上限は特に限定されず、常用されている１３．５６ＭＨｚ、試験的に使用されている５０ＭＨｚといった高周波帯であってもよいが、負荷との整合のとり易さや取り扱い性を考慮すると５００ｋＨｚ以下であることが好ましい。
【００２１】
また、上記パルス電界におけるひとつのパルス継続時間の好ましい下限は０．５μｓ、好ましい上限は２００μｓである。２００μｓを超えると、アーク放電に移行しやすくなる。
なお、本明細書においてひとつのパルス継続時間とは、ＯＮとＯＦＦとの繰り返しからなるパルス電界における、ひとつのパルスの連続するＯＮ時間を意味する。
また、このときのＯＦＦ時間の好ましい下限は０．５μｓ、好ましい上限は１０００μｓであり、より好ましい上限は５００μｓである。
【００２２】
また、上記ガスを対向する電極間に供給する速度としては特に限定されず、プラズマの状態や処理条件等により適宜調整すればよいが、好ましい下限は１ｍ／ｓ、好ましい上限は５０ｍ／ｓである。１ｍ／ｓ未満であると、電流パスができやすく、放電が不安定になることがある。より好ましい下限は２ｍ／ｓ、より好ましい上限は２０ｍ／ｓｅｃである。
【００２３】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理する方法としては、イオン交換基を有する充填剤粒子を電極間に置き、そのまま処理ガスとともに電圧を印加する直接法であってもよいし、電極間で発生したプラズマガスを電極間の外部に設置したイオン交換基を有する充填剤粒子に吹き付けるリモート法であってもよい。なかでも、容器型の電極内でイオン交換基を有する充填剤粒子を処理ガス注入により分散させ、そこに、プラズマを発生させる方法が、イオン交換基を有する充填剤粒子の表面を均一に処理することができることから好適である。
【００２４】
上記電極の形状としては、特に限定されないが、電界集中によるアーク放電の発生を避けるために、対向電極間の距離が一定になる構造であることが好ましく、例えば、平行平板型、円筒対向平板型、球対向平板型、双曲対向平板型、同軸円筒型構造等が挙げられる。上記電極間の距離は、固体誘電体の厚さ、印加電圧の大きさ、プラズマを利用する目的等を考慮して適宜決定されるが、１〜５０ｍｍであることが好ましい。１ｍｍ未満では、電極間の間隔を置いて設置するのに充分でないことがある。５０ｍｍを超えると、均一なプラズマを発生させにくい。
【００２５】
また、上記電極の対向面は固体誘電体で被覆されていることが好ましい。この場合、固体誘電体と電極とが密着し、かつ、接する電極の対向面を完全に覆うようにすることが好ましい。固体誘電体によって覆われずに電極同士が直接対向する部位があると、そこから異常放電が生じて高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。
【００２６】
上記条件下で実施される常圧プラズマ処理の処理時間の好ましい下限は１秒間、好ましい上限は１２００秒間である。１秒未満であると、充填剤粒子表面のアミノ基導入量が少なく、タンパク質等の非特異吸着を充分に防止できないことがあり、１２００秒を超えると、充填剤粒子が劣化してその強度が不充分となることがある。より好ましい下限は１０秒間、より好ましい上限は６００秒間である。
【００２７】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、プラズマ処理が施された表面部分のみが親水化されていることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、また、タンパク質等が非特異吸着することもないことから極めて正確な測定を行うことができる。また、長期間にわたってこのような性能を維持することができ、長期間の使用後でも保持時間や測定値のバラツキが少ない。更に、ロット間差による保持時間や測定値のバラツキも極めて少ない。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
【００２８】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、とりわけ糖化ヘモグロビンの分析に好適に用いることができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものである糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（１）イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート４００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン８０ｇ、及び、ベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００３２】
（２）常圧プラズマ処理
得られた充填剤粒子１０ｇを常圧プラズマ処理装置（積水化学工業社製）を用いて、アルゴンガス：アンモニアガスを９０：１０の割合で混合したガスを装置内が１０．１００×１０４Ｐａになるまで導入し、電極間に電圧１４．０ｋＶ、周波数６．０ｋＨｚのパルス電界を印加してグロー放電プラズマを発生させ、３００秒間プラズマ処理を行った。
【００３３】
（比較例１）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、常温プラズマ処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
【００３４】
（比較例２）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子２０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍＬを加え、２分間超音波処理し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍＬ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍＬ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるＢＳＡが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３５】
（評価）
実施例１及び比較例１、２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。
【００３６】
（１）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における初期測定値の評価
実施例１及び比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体の平均値を測定値とした。
結果を表１に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００３７】
【表１】
表１より実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、極めて正確な測定ができたのに対して、比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤も用いた場合には、想定される値よりもかなり低いヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。これは、比較例１のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、タンパク質等の非特異吸着が起こっているためと考えられる。
【００３８】
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例１及び比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍
に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いて、１日に３００検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表２に示した。
システム：送液ポンプ ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器 ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液 １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液 ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００３９】
【表２】
表２より、実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、４５００検体の負荷試験を行ったあとでも、ほとんどヘモグロビンＡ１ｃの保持時間に変化がなく、正確なヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が可能であることが判った。一方、
比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、負荷検体数が増えるに従ってヘモグロビンＡ１ｃの保持時間が変化する傾向があり、得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）も、実施例１の場合に比べてバラツキが大きいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２】
プラズマ処理は、常圧プラズマ処理であることを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項３】
処理ガスとしてアンモニアガスを用いることを特徴とする請求項１又は２記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項４】
イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１、２又は３記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
請求項１、２、３又は４記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項６記載の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
【請求項１】
イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２】
プラズマ処理は、常圧プラズマ処理であることを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項３】
処理ガスとしてアンモニアガスを用いることを特徴とする請求項１又は２記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項４】
イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１、２又は３記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
請求項１、２、３又は４記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項６記載の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
【公開番号】特開２００６−８８０７３（Ｐ２００６−８８０７３Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７８４９０（Ｐ２００４−２７８４９０）
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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