イソフラボン発酵代謝産物の精製方法
【課題】セルロースエステルを用いることにより、従来よりも効果的にイソフラボン発酵代謝産物を精製する方法を提供することが本発明の課題である。
【解決手段】嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、イソフラボン発酵代謝産物の精製における好適な条件の検討を行った。
その結果、発酵液をセルロースエステル（例えば、酢酸セルロース）により処理することにより、エクオールがセルロースエステルに吸着することを見出し、本特性を用いて吸着精製を行うことにより、エクオールの精製効率が飛躍的に高まることが明らかとなった。
即ち、本発明者らは、本発明者らは、イソフラボン発酵代謝産物の好適な精製条件の確立に成功した。
【解決手段】嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、イソフラボン発酵代謝産物の精製における好適な条件の検討を行った。
その結果、発酵液をセルロースエステル（例えば、酢酸セルロース）により処理することにより、エクオールがセルロースエステルに吸着することを見出し、本特性を用いて吸着精製を行うことにより、エクオールの精製効率が飛躍的に高まることが明らかとなった。
即ち、本発明者らは、本発明者らは、イソフラボン発酵代謝産物の好適な精製条件の確立に成功した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。
【０００３】
イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitn）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA） 又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている（図１）。
【０００４】
エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。
【０００５】
これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜５）。しかしながら、どのような精製方法により、より効果的・実用的にエクオールの回収ができるかについては、明らかとなっていなかった。微生物を用いてエクオールを産生させる場合、発酵液には培地成分、界面活性剤、グルコースなど不純物が多く含まれるため、濃縮時に発砲トラブルを引き起こす要因となっていた。また、エクオールについては、食品用途への応用が考えられるため、酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を用いた精製プロセスを利用することは好ましくなく、さらに、単純に発酵液を乾燥させる場合には、製品におけるエクオール含量が低くなり、不必要な不純物が多く含まれるという問題点があった。製品中のイソフラボン発酵代謝産物（エクオール）含量を高くするために、培地成分などの不純物をより高率的に除去する精製方法の確立が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０４２９６
【特許文献２】特表２００６−５０４４０９
【特許文献３】特開２００８−６１５８４
【特許文献４】特開２０１０−１０４２４１
【特許文献５】ＷＯ２００８−１５３１５８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Adlercreutz, H., The Lancet Oncol., 3, 364-373 (2002)
【非特許文献２】Duncan, A. M. et al., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 17, 253-271 (2003)
【非特許文献３】Wu, A. H. et al., Carcinogenesis, 23, 1491-1496 (2002)
【非特許文献４】Yamamoto, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 95,906-913 (2003)
【非特許文献５】Onozawa, M. et al., Jpn. J. Cancer Res., 90, 393-398 (1999)
【非特許文献６】Ridges, L. et al., Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10, 204-211 (2001)
【非特許文献７】Schmitt, E. et al., Toxicol. In Vitro, 15, 433-439 (2001)
【非特許文献８】Sathyamoorthy, N. and Wang, T. T., Eur. J. Cancer, 33, 2384-2389 (1997)
【非特許文献９】Arai, Y. et al., J. Epidemiol., 10, 127-135 (2000)
【非特許文献１０】Setchell, K. D. et al., J. Nutr., 133, 1027-1035 (2003)
【非特許文献１１】Decroos、K. et al., Arch Microbiol., 183, 45-55 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、セルロースエステルを用いることにより、従来よりも効果的にイソフラボン発酵代謝産物を精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。
【００１０】
本発明者らは、嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、イソフラボン発酵代謝産物の精製における好適な条件の検討を行った。
【００１１】
具体的には、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株を、複数種類の混合ガスからなる気相存在下で培養し、ダイゼインをエクオールへ発酵させ、吸着精製法を用いたエクオールの好適な精製条件の検討を行った。
【００１２】
その結果、発酵液をセルロースエステル（例えば、酢酸セルロース）により処理することにより、エクオールがセルロースエステルに吸着することを見出し、本特性を用いて吸着精製を行うことにより、エクオールの精製効率が飛躍的に高まることが明らかとなった。
【００１３】
即ち、本発明者らは、イソフラボン発酵代謝産物の好適な精製条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。
〔２〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。
〔３〕前記セルロースエステルが、少なくとも１種類以上の脂肪族有機酸エステルであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔４〕前記脂肪族有機酸エステルが、酢酸セルロースであることを特徴とする、〔３〕に記載の精製方法。
〔５〕前記酢酸セルロースの酢化度が、５０〜６２％であることを特徴とする、〔４〕に記載の精製方法。
〔６〕前記セルロースエステルの平均重合度が、１０〜１０００であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔７〕前記セルロースエステルの形状が、粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔８〕前記セルロースエステルが、多孔性構造であることを特徴とする、〔７〕に記載の精製方法。
〔９〕前記イソフラボン発酵代謝産物が、エクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンのいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１０〕前記イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液が、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含むこと特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１１〕前記嫌気性微生物がコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１２〕前記嫌気性微生物が、コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、又はスラッキア（Slackia）属のいずれかに分類される菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１３〕前記嫌気性微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
【発明の効果】
【００１５】
嫌気性微生物の代謝によってイソフラボン発酵代謝産物が製造されることは、学術的にはかねてより知られていたものの、微生物により発酵生産されたイソフラボン発酵代謝産物のより効率的な精製条件については、これまで確立されていなかった。
【００１６】
本発明によって、セルロースエステルを利用したイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）の効率的な精製方法が実現でき、イソフラボン発酵代謝産物の工業的な精製技術が提供された。本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物を、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールの構造式及び反応式を示す図である。
【図２】エクオールの酢酸セルロースへの吸着における、アセトニトリル濃度（％）の効果を示す図である。
【図３】エクオールの酢酸セルロースへの吸着における、酢酸セルロースの添加量（mg）の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。
【００１９】
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程
を少なくとも含むものである。
【００２０】
また、本発明の本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程
を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の精製方法において、従来分離精製が困難であったイソフラボン発酵代謝産物を精製回収することが可能となる。本発明において、イソフラボン発酵代謝産物は特に制限させるものではないが、好ましくはエクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンを、より好ましくはエクオールを例示することができる。
【００２２】
本発明においては、セルロースエステルを収容したカートリッジ（又はカラム）を用いて精製を行うことができる。例えば、少なくとも二個の開口を有する容器内に該セルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる方法により精製を行うことができる。イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で該セルロースエステルに通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができる。加圧は、好ましくは10〜200 kpa、より好ましくは40〜100 kpaの程度で行われる。
【００２３】
前記のセルロースエステルを収容するカートリッジを用いる場合は、以下の工程でイソフラボン発酵代謝産物を分離精製することができる。
(ａ) イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内にセルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に注入する工程、
(ｂ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジト内を加圧状態にし、注入したイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、セルロースエステルに通過させ、該カートリッジの他の開口より排出することによって、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
(ｃ)該カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステルを、イソフラボン発酵代謝産物が吸着した状態で、洗浄する工程、
(ｅ)該カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、及び
(ｆ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステル内からイソフラボン発酵代謝産物を脱離させ、該カートリッジ容器外に排出する工程。
【００２４】
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の分離精製方法における各工程（吸着工程、洗浄工程、及び回収工程）について詳細に説明する。
【００２５】
吸着工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、前述の通りイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる。
【００２６】
本発明においてセルロースエステルとしては、例えば、酢酸セルロース、セルロースプロピオネート、セルロースブチレートなどの脂肪族カルボン酸エステル、フタル酸半エステルなどの芳香族カルボン酸エステル；硝酸セルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロースなどの無機酸エステル；セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、硝酸酢酸セルロースなどの混酸エステル；およびポリカプロラクトングラフト化酢酸セルロースなどのセルロースエステル誘導体などが例示される。これらのセルロースエステルは、単独でまたは二種以上混合して使用できる。
【００２７】
セルロースエステルの平均置換度は特に制限させるものではないが、好ましくは平均置換度１〜３、より好ましくは１．５〜３程度を例示することができる。
【００２８】
本発明において、セルロースエステルは特に制限されるものではないが、好ましくは脂肪族有機酸エステル（例えば、炭素数２〜４程度の有機酸から選ばれた少なくとも一種の有機酸との単独エステル又は混酸エステル）、より好ましくは酢酸セルロースを例示することができる。
【００２９】
本発明において用いられる酢酸セルロースの酢化度は５０〜６２％程度の範囲で適当に選択でき、酢化度５３〜５８％程度の酢酸セルロースを用いることが好ましい。
【００３０】
セルロースエステルの平均重合度は、例えば１０〜１０００、好ましくは５０〜９００、さらに好ましくは２００〜８００程度である。
【００３１】
本発明のセルロースエステルの形状は特に制限されるものではないが、好ましくは粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれか、より好ましくは粒状を例示することができる。また、本発明のセルロースエステルは、多孔性構造であってもよい。
【００３２】
セルロースエステルに、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を接触させる場合、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることが好ましい。セルロースエステルが、粉末、粒状、又はチップ状等である場合には、試料溶液にセルロースエステルを添加し、均一となるよう攪拌させることにより、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることができる。また、セルロースエステルが繊維状、平膜状、又は中空糸膜状等である場合には、これら膜状のセルロースエステルに試料溶液を一方の面から他方の面へ通過させることにより、液を膜へ均一に接触させることができる。セルロースエステル膜中を、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液をセルロースエステル膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。
【００３３】
試料溶液にセルロースエステルを添加する場合の、セルロースエステルの添加量は特に制限されるものではないが、好ましくは試料溶液中に含まれるイソフラボン発酵代謝産物１ｇに対して、５０ｇ〜２００ｇのセルロースエステルを添加することが好ましい。
【００３４】
本発明において使用できる試料溶液は、イソフラボン発酵代謝産物を含むものであれば特に制限されるものではないが、好ましい例としては、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含む試料溶液を挙げることができる。本発明の試料溶液には、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものが含まれていてもよい。
【００３５】
本発明において、イソフラボン発酵代謝産物の発酵生産に用いられる嫌気性微生物は、イソフラボン発酵代謝産物の生産能を有する嫌気性微生物であり、好ましい例として、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌を例示することができる。
【００３６】
また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、嫌気性微生物として例示することができる。
コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
アトポビウム（Atopobium）属
コリンゼラ（Collinsella）属
クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
エガセラ（Eggerthella）属
エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
ゴードニバクター（Gordonibacter）属
オルセネラ（Olsenella）属
パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
スラッキア（Slackia）属
【００３７】
したがって、これらの属に分類された微生物から選択され、嫌気発酵によってイソフラボン発酵代謝産物を生成する微生物は、本発明における好ましい嫌気性微生物である。中でも、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物は、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として好ましい。微生物がイソフラボン発酵代謝産物を生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。より具体的には、たとえば、以下の微生物を、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8 （DSM 22006）
Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729号
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asccharobacter celatus DSM 18785
【００３８】
特に以下に記載するアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。
【００３９】
上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM 特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
【００４０】
本発明において、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものを含む試料溶液を用いる場合には、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、又は、消泡剤により予め処理を行ってもよい。また、遠心分離によりイソフラボン発酵代謝産物のみを含む画分を単離することもできる。これらの処理により、不純物を取り除く効果が向上し、イソフラボン発酵代謝産物の回収率が向上するものと考えられる。
【００４１】
洗浄工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、次に、洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する。
【００４２】
洗浄を行うことにより、イソフラボン発酵代謝産物の回収量及び純度が向上させることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
【００４３】
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、該カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。
【００４４】
また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法の方が、より洗浄効率が優れている。
【００４５】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃ であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。洗浄工程において、セルロースエステルを機械的な振動や超音波による攪拌を与えながら洗浄を行うことができる。また、遠心分離を行うことにより洗浄してもよい。
【００４６】
本発明において、前述の試料溶液及び洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。また、イソフラボン発酵代謝産物の吸着効果が高め、不純物及び不要成分の選択的除去作用が向上させるために、水溶性塩を添加してもよい。
【００４７】
洗浄液に用いることができる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール、アセトン等を用いることができ、アセトニトリル又はアルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ − イソプロパノール、ブタノール等を挙げることができ、中でもエタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、0〜40質量％ であることが好ましく、5〜20質量％であることがより好ましい。
【００４８】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を例示することができる。
【００４９】
前述の試料溶液及び洗浄液のｐＨは、ｐＨ５〜９であることが好ましい。
【００５０】
回収工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、最後に、回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる。
【００５１】
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、セルロースエステルを装着したカートリッジへ供給される。回収液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れ、より好ましい。
【００５２】
回収液としては好ましくはアルコール（好ましくはエタノール）等が使用できる。
【００５３】
回収工程においては、イソフラボン発酵代謝産物の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。
【００５４】
回収液のｐＨは、ｐＨ６〜８であることが好ましい。
【００５５】
回収液の体積を当初のイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたイソフラボン発酵代謝産物を含む回収液を得ることができる。
【００５６】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量のイソフラボン発酵代謝産物を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【００５７】
また、回収工程において、イソフラボン発酵代謝産物の回収液に回収したイソフラボン発酵代謝産物の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。
【００５８】
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、280nmの吸収が無い素材で
作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収したイソフラボン発酵代謝産物溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。280nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
前記のセルロースエステルを収容したカートリッジと圧力発生装置を用いて、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液からイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、イソフラボン発酵代謝産物を得ることが可能になる。
【００６０】
本発明の精製方法により得られたエクオールは、医薬品又は飲食物として提供することが可能である。
【００６１】
エクオールを医薬品として提供する場合、その製剤化には、一般的に製剤化に用いられる物質（たとえば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等）を用いることができる。医薬品として提供する場合の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等を例示することができる。
【００６２】
エクオールを飲食物として提供する場合、その形態としては、健康食品、清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００６４】
［参考例１］エクオールの生産
AglyMax-30(イソフラボンアグリコンの抽出物、ニチモウバイオティックス株式会社製)25 g/L、GAM培地(日水製薬株式会社製、日本)59 g/L、L-Arg 10 g/LからなるpH 7.5に調整したエクオール生産培地を、40 mLずつ10本の200 mL容バイヤルビンに分注した。気相を炭酸ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密栓し、オートクレーブで115℃、15分間の殺菌処理を行った。ここに、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株の前培養液(0.4 mL)を接種した後、気相を水素/炭酸ガス=4/1の混合ガスで置換し、37℃で24時間、振とう培養した。得られた発酵液を混合し、105℃で1分間の加熱処理を行った後、遠心分離にて不溶物と菌体を除去した。遠心上清液には、2.3 g/Lのエクオールが含まれていた。なお、HPLCは以下の条件により行った。エクオールは、26分に溶出する。
カラム：WakosilII5C18 (4.6×250mm)
移動相A：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 15 / 85 / 0.1
移動相B：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 35 / 65 / 0.1
グラジェント条件：0 %B → 30 %B (15min) → 100 %B (15.1 → 30 min)
→ 30.1 min → 0 %B → 40 min 平衡化 → 次サンプル
カラム温度：35℃
検出：UV280nm
サンプル：70% エタノールで適宜希釈
【００６５】
［実施例１］酢酸セルロースへの吸着１
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルと50 mgの酢酸セルロース(和光純薬製、日本)を加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図２）。10% アセトニトリル濃度において最大となる40％の吸着率が得られた。
【００６６】
［実施例２］酢酸セルロースへの吸着２
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルを加え10% アセトニトリル溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを18〜200 mgの範囲で加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図３）。200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる84％の吸着率が得られた。なお、酢酸セルロースの微細化は、マルチビーズショッカー(安井器械製)にて行った。
【００６７】
［実施例３］酢酸セルロースへの吸着３
参考例１で得られた遠心上清液1mLにエタノールを加え10% エタノール溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを100 mgあるいは200 mg加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した。その結果、200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる87％の吸着率が得られた。
【００６８】
［実施例４］酢酸セルロースを用いたエクオールの精製
20 gの酢酸セルロースを微細化してカラムに詰め、10％エタノールを80 mL通液して平衡化した。平衡化したカラムに、参考例１で得られた遠心上清液の10％エタノール溶液100 mLを通過させ、次いで、10％ エタノールを120 mL通液して洗浄した。洗浄後、カラムにエタノールを120 mL通液してエクオールを含有する溶液を得た。これをエバポレーターにて濃縮乾燥して、509 mgの残渣を得た。 この残渣中におけるエクオール含量は45%であり、回収率は93％であった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の方法によって、イソフラボン発酵代謝産物（例えば、嫌気性微生物により発酵生産したエクオール）を高効率で精製することができる。
【００７０】
本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）は不純物が除去されていることから、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。
【０００３】
イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitn）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA） 又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている（図１）。
【０００４】
エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。
【０００５】
これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜５）。しかしながら、どのような精製方法により、より効果的・実用的にエクオールの回収ができるかについては、明らかとなっていなかった。微生物を用いてエクオールを産生させる場合、発酵液には培地成分、界面活性剤、グルコースなど不純物が多く含まれるため、濃縮時に発砲トラブルを引き起こす要因となっていた。また、エクオールについては、食品用途への応用が考えられるため、酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を用いた精製プロセスを利用することは好ましくなく、さらに、単純に発酵液を乾燥させる場合には、製品におけるエクオール含量が低くなり、不必要な不純物が多く含まれるという問題点があった。製品中のイソフラボン発酵代謝産物（エクオール）含量を高くするために、培地成分などの不純物をより高率的に除去する精製方法の確立が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０４２９６
【特許文献２】特表２００６−５０４４０９
【特許文献３】特開２００８−６１５８４
【特許文献４】特開２０１０−１０４２４１
【特許文献５】ＷＯ２００８−１５３１５８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Adlercreutz, H., The Lancet Oncol., 3, 364-373 (2002)
【非特許文献２】Duncan, A. M. et al., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 17, 253-271 (2003)
【非特許文献３】Wu, A. H. et al., Carcinogenesis, 23, 1491-1496 (2002)
【非特許文献４】Yamamoto, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 95,906-913 (2003)
【非特許文献５】Onozawa, M. et al., Jpn. J. Cancer Res., 90, 393-398 (1999)
【非特許文献６】Ridges, L. et al., Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10, 204-211 (2001)
【非特許文献７】Schmitt, E. et al., Toxicol. In Vitro, 15, 433-439 (2001)
【非特許文献８】Sathyamoorthy, N. and Wang, T. T., Eur. J. Cancer, 33, 2384-2389 (1997)
【非特許文献９】Arai, Y. et al., J. Epidemiol., 10, 127-135 (2000)
【非特許文献１０】Setchell, K. D. et al., J. Nutr., 133, 1027-1035 (2003)
【非特許文献１１】Decroos、K. et al., Arch Microbiol., 183, 45-55 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、セルロースエステルを用いることにより、従来よりも効果的にイソフラボン発酵代謝産物を精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。
【００１０】
本発明者らは、嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、イソフラボン発酵代謝産物の精製における好適な条件の検討を行った。
【００１１】
具体的には、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株を、複数種類の混合ガスからなる気相存在下で培養し、ダイゼインをエクオールへ発酵させ、吸着精製法を用いたエクオールの好適な精製条件の検討を行った。
【００１２】
その結果、発酵液をセルロースエステル（例えば、酢酸セルロース）により処理することにより、エクオールがセルロースエステルに吸着することを見出し、本特性を用いて吸着精製を行うことにより、エクオールの精製効率が飛躍的に高まることが明らかとなった。
【００１３】
即ち、本発明者らは、イソフラボン発酵代謝産物の好適な精製条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。
〔２〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。
〔３〕前記セルロースエステルが、少なくとも１種類以上の脂肪族有機酸エステルであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔４〕前記脂肪族有機酸エステルが、酢酸セルロースであることを特徴とする、〔３〕に記載の精製方法。
〔５〕前記酢酸セルロースの酢化度が、５０〜６２％であることを特徴とする、〔４〕に記載の精製方法。
〔６〕前記セルロースエステルの平均重合度が、１０〜１０００であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔７〕前記セルロースエステルの形状が、粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔８〕前記セルロースエステルが、多孔性構造であることを特徴とする、〔７〕に記載の精製方法。
〔９〕前記イソフラボン発酵代謝産物が、エクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンのいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１０〕前記イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液が、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含むこと特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１１〕前記嫌気性微生物がコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１２〕前記嫌気性微生物が、コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、又はスラッキア（Slackia）属のいずれかに分類される菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１３〕前記嫌気性微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
【発明の効果】
【００１５】
嫌気性微生物の代謝によってイソフラボン発酵代謝産物が製造されることは、学術的にはかねてより知られていたものの、微生物により発酵生産されたイソフラボン発酵代謝産物のより効率的な精製条件については、これまで確立されていなかった。
【００１６】
本発明によって、セルロースエステルを利用したイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）の効率的な精製方法が実現でき、イソフラボン発酵代謝産物の工業的な精製技術が提供された。本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物を、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールの構造式及び反応式を示す図である。
【図２】エクオールの酢酸セルロースへの吸着における、アセトニトリル濃度（％）の効果を示す図である。
【図３】エクオールの酢酸セルロースへの吸着における、酢酸セルロースの添加量（mg）の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。
【００１９】
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程
を少なくとも含むものである。
【００２０】
また、本発明の本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程
を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の精製方法において、従来分離精製が困難であったイソフラボン発酵代謝産物を精製回収することが可能となる。本発明において、イソフラボン発酵代謝産物は特に制限させるものではないが、好ましくはエクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンを、より好ましくはエクオールを例示することができる。
【００２２】
本発明においては、セルロースエステルを収容したカートリッジ（又はカラム）を用いて精製を行うことができる。例えば、少なくとも二個の開口を有する容器内に該セルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる方法により精製を行うことができる。イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で該セルロースエステルに通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができる。加圧は、好ましくは10〜200 kpa、より好ましくは40〜100 kpaの程度で行われる。
【００２３】
前記のセルロースエステルを収容するカートリッジを用いる場合は、以下の工程でイソフラボン発酵代謝産物を分離精製することができる。
(ａ) イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内にセルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に注入する工程、
(ｂ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジト内を加圧状態にし、注入したイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、セルロースエステルに通過させ、該カートリッジの他の開口より排出することによって、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
(ｃ)該カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステルを、イソフラボン発酵代謝産物が吸着した状態で、洗浄する工程、
(ｅ)該カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、及び
(ｆ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステル内からイソフラボン発酵代謝産物を脱離させ、該カートリッジ容器外に排出する工程。
【００２４】
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の分離精製方法における各工程（吸着工程、洗浄工程、及び回収工程）について詳細に説明する。
【００２５】
吸着工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、前述の通りイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる。
【００２６】
本発明においてセルロースエステルとしては、例えば、酢酸セルロース、セルロースプロピオネート、セルロースブチレートなどの脂肪族カルボン酸エステル、フタル酸半エステルなどの芳香族カルボン酸エステル；硝酸セルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロースなどの無機酸エステル；セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、硝酸酢酸セルロースなどの混酸エステル；およびポリカプロラクトングラフト化酢酸セルロースなどのセルロースエステル誘導体などが例示される。これらのセルロースエステルは、単独でまたは二種以上混合して使用できる。
【００２７】
セルロースエステルの平均置換度は特に制限させるものではないが、好ましくは平均置換度１〜３、より好ましくは１．５〜３程度を例示することができる。
【００２８】
本発明において、セルロースエステルは特に制限されるものではないが、好ましくは脂肪族有機酸エステル（例えば、炭素数２〜４程度の有機酸から選ばれた少なくとも一種の有機酸との単独エステル又は混酸エステル）、より好ましくは酢酸セルロースを例示することができる。
【００２９】
本発明において用いられる酢酸セルロースの酢化度は５０〜６２％程度の範囲で適当に選択でき、酢化度５３〜５８％程度の酢酸セルロースを用いることが好ましい。
【００３０】
セルロースエステルの平均重合度は、例えば１０〜１０００、好ましくは５０〜９００、さらに好ましくは２００〜８００程度である。
【００３１】
本発明のセルロースエステルの形状は特に制限されるものではないが、好ましくは粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれか、より好ましくは粒状を例示することができる。また、本発明のセルロースエステルは、多孔性構造であってもよい。
【００３２】
セルロースエステルに、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を接触させる場合、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることが好ましい。セルロースエステルが、粉末、粒状、又はチップ状等である場合には、試料溶液にセルロースエステルを添加し、均一となるよう攪拌させることにより、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることができる。また、セルロースエステルが繊維状、平膜状、又は中空糸膜状等である場合には、これら膜状のセルロースエステルに試料溶液を一方の面から他方の面へ通過させることにより、液を膜へ均一に接触させることができる。セルロースエステル膜中を、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液をセルロースエステル膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。
【００３３】
試料溶液にセルロースエステルを添加する場合の、セルロースエステルの添加量は特に制限されるものではないが、好ましくは試料溶液中に含まれるイソフラボン発酵代謝産物１ｇに対して、５０ｇ〜２００ｇのセルロースエステルを添加することが好ましい。
【００３４】
本発明において使用できる試料溶液は、イソフラボン発酵代謝産物を含むものであれば特に制限されるものではないが、好ましい例としては、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含む試料溶液を挙げることができる。本発明の試料溶液には、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものが含まれていてもよい。
【００３５】
本発明において、イソフラボン発酵代謝産物の発酵生産に用いられる嫌気性微生物は、イソフラボン発酵代謝産物の生産能を有する嫌気性微生物であり、好ましい例として、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌を例示することができる。
【００３６】
また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、嫌気性微生物として例示することができる。
コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
アトポビウム（Atopobium）属
コリンゼラ（Collinsella）属
クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
エガセラ（Eggerthella）属
エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
ゴードニバクター（Gordonibacter）属
オルセネラ（Olsenella）属
パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
スラッキア（Slackia）属
【００３７】
したがって、これらの属に分類された微生物から選択され、嫌気発酵によってイソフラボン発酵代謝産物を生成する微生物は、本発明における好ましい嫌気性微生物である。中でも、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物は、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として好ましい。微生物がイソフラボン発酵代謝産物を生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。より具体的には、たとえば、以下の微生物を、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8 （DSM 22006）
Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729号
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asccharobacter celatus DSM 18785
【００３８】
特に以下に記載するアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。
【００３９】
上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM 特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
【００４０】
本発明において、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものを含む試料溶液を用いる場合には、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、又は、消泡剤により予め処理を行ってもよい。また、遠心分離によりイソフラボン発酵代謝産物のみを含む画分を単離することもできる。これらの処理により、不純物を取り除く効果が向上し、イソフラボン発酵代謝産物の回収率が向上するものと考えられる。
【００４１】
洗浄工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、次に、洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する。
【００４２】
洗浄を行うことにより、イソフラボン発酵代謝産物の回収量及び純度が向上させることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
【００４３】
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、該カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。
【００４４】
また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法の方が、より洗浄効率が優れている。
【００４５】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃ であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。洗浄工程において、セルロースエステルを機械的な振動や超音波による攪拌を与えながら洗浄を行うことができる。また、遠心分離を行うことにより洗浄してもよい。
【００４６】
本発明において、前述の試料溶液及び洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。また、イソフラボン発酵代謝産物の吸着効果が高め、不純物及び不要成分の選択的除去作用が向上させるために、水溶性塩を添加してもよい。
【００４７】
洗浄液に用いることができる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール、アセトン等を用いることができ、アセトニトリル又はアルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ − イソプロパノール、ブタノール等を挙げることができ、中でもエタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、0〜40質量％ であることが好ましく、5〜20質量％であることがより好ましい。
【００４８】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を例示することができる。
【００４９】
前述の試料溶液及び洗浄液のｐＨは、ｐＨ５〜９であることが好ましい。
【００５０】
回収工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、最後に、回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる。
【００５１】
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、セルロースエステルを装着したカートリッジへ供給される。回収液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れ、より好ましい。
【００５２】
回収液としては好ましくはアルコール（好ましくはエタノール）等が使用できる。
【００５３】
回収工程においては、イソフラボン発酵代謝産物の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。
【００５４】
回収液のｐＨは、ｐＨ６〜８であることが好ましい。
【００５５】
回収液の体積を当初のイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたイソフラボン発酵代謝産物を含む回収液を得ることができる。
【００５６】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量のイソフラボン発酵代謝産物を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【００５７】
また、回収工程において、イソフラボン発酵代謝産物の回収液に回収したイソフラボン発酵代謝産物の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。
【００５８】
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、280nmの吸収が無い素材で
作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収したイソフラボン発酵代謝産物溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。280nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
前記のセルロースエステルを収容したカートリッジと圧力発生装置を用いて、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液からイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、イソフラボン発酵代謝産物を得ることが可能になる。
【００６０】
本発明の精製方法により得られたエクオールは、医薬品又は飲食物として提供することが可能である。
【００６１】
エクオールを医薬品として提供する場合、その製剤化には、一般的に製剤化に用いられる物質（たとえば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等）を用いることができる。医薬品として提供する場合の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等を例示することができる。
【００６２】
エクオールを飲食物として提供する場合、その形態としては、健康食品、清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００６４】
［参考例１］エクオールの生産
AglyMax-30(イソフラボンアグリコンの抽出物、ニチモウバイオティックス株式会社製)25 g/L、GAM培地(日水製薬株式会社製、日本)59 g/L、L-Arg 10 g/LからなるpH 7.5に調整したエクオール生産培地を、40 mLずつ10本の200 mL容バイヤルビンに分注した。気相を炭酸ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密栓し、オートクレーブで115℃、15分間の殺菌処理を行った。ここに、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株の前培養液(0.4 mL)を接種した後、気相を水素/炭酸ガス=4/1の混合ガスで置換し、37℃で24時間、振とう培養した。得られた発酵液を混合し、105℃で1分間の加熱処理を行った後、遠心分離にて不溶物と菌体を除去した。遠心上清液には、2.3 g/Lのエクオールが含まれていた。なお、HPLCは以下の条件により行った。エクオールは、26分に溶出する。
カラム：WakosilII5C18 (4.6×250mm)
移動相A：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 15 / 85 / 0.1
移動相B：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 35 / 65 / 0.1
グラジェント条件：0 %B → 30 %B (15min) → 100 %B (15.1 → 30 min)
→ 30.1 min → 0 %B → 40 min 平衡化 → 次サンプル
カラム温度：35℃
検出：UV280nm
サンプル：70% エタノールで適宜希釈
【００６５】
［実施例１］酢酸セルロースへの吸着１
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルと50 mgの酢酸セルロース(和光純薬製、日本)を加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図２）。10% アセトニトリル濃度において最大となる40％の吸着率が得られた。
【００６６】
［実施例２］酢酸セルロースへの吸着２
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルを加え10% アセトニトリル溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを18〜200 mgの範囲で加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図３）。200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる84％の吸着率が得られた。なお、酢酸セルロースの微細化は、マルチビーズショッカー(安井器械製)にて行った。
【００６７】
［実施例３］酢酸セルロースへの吸着３
参考例１で得られた遠心上清液1mLにエタノールを加え10% エタノール溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを100 mgあるいは200 mg加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した。その結果、200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる87％の吸着率が得られた。
【００６８】
［実施例４］酢酸セルロースを用いたエクオールの精製
20 gの酢酸セルロースを微細化してカラムに詰め、10％エタノールを80 mL通液して平衡化した。平衡化したカラムに、参考例１で得られた遠心上清液の10％エタノール溶液100 mLを通過させ、次いで、10％ エタノールを120 mL通液して洗浄した。洗浄後、カラムにエタノールを120 mL通液してエクオールを含有する溶液を得た。これをエバポレーターにて濃縮乾燥して、509 mgの残渣を得た。 この残渣中におけるエクオール含量は45%であり、回収率は93％であった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の方法によって、イソフラボン発酵代謝産物（例えば、嫌気性微生物により発酵生産したエクオール）を高効率で精製することができる。
【００７０】
本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）は不純物が除去されていることから、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。
【請求項２】
次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。
【請求項３】
前記セルロースエステルが、少なくとも１種類以上の脂肪族有機酸エステルであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記脂肪族有機酸エステルが、酢酸セルロースであることを特徴とする、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
前記酢酸セルロースの酢化度が、５０〜６２％であることを特徴とする、請求項４に記載の精製方法。
【請求項６】
前記セルロースエステルの平均重合度が、１０〜１０００であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項７】
前記セルロースエステルの形状が、粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれかであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項８】
前記セルロースエステルが、多孔性構造であることを特徴とする、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
前記イソフラボン発酵代謝産物が、エクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンのいずれかであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液が、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含むこと特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項１１】
前記嫌気性微生物がコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１２】
前記嫌気性微生物が、コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、又はスラッキア（Slackia）属のいずれかに分類される菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１３】
前記嫌気性微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１】
次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。
【請求項２】
次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。
【請求項３】
前記セルロースエステルが、少なくとも１種類以上の脂肪族有機酸エステルであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記脂肪族有機酸エステルが、酢酸セルロースであることを特徴とする、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
前記酢酸セルロースの酢化度が、５０〜６２％であることを特徴とする、請求項４に記載の精製方法。
【請求項６】
前記セルロースエステルの平均重合度が、１０〜１０００であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項７】
前記セルロースエステルの形状が、粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれかであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項８】
前記セルロースエステルが、多孔性構造であることを特徴とする、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
前記イソフラボン発酵代謝産物が、エクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンのいずれかであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液が、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含むこと特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項１１】
前記嫌気性微生物がコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１２】
前記嫌気性微生物が、コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、又はスラッキア（Slackia）属のいずれかに分類される菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１３】
前記嫌気性微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株であることを特徴とする、請求項１０に記載の精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１５８５４５（Ｐ２０１２−１５８５４５Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８６２３（Ｐ２０１１−１８６２３）
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
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