インジェクション装置およびインジェクション方法
【課題】インジェクションの効率を向上し、装置構成を簡易にすること。
【解決手段】画像配置部４０３は、撮影位置取得部４０２によって取得された撮影位置に従って画像取得部４０１から出力される複数の画像を配置し、合成画像を生成する。合成画像加工部４０５は、得られた合成画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。合成画像出力部４０７は、合成画像加工部４０５によって合成画像が加工されると、加工後の合成画像を制御部１１０へ出力する。中央画像加工部４０８は、画像取得部４０１から出力される観測用の画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。中央画像出力部４０９は、中央画像加工部４０８によって中央画像が加工されると、加工後の中央画像を制御部１１０へ出力する。モニタ１１１は、合成画像と中央画像を並べて表示する。
【解決手段】画像配置部４０３は、撮影位置取得部４０２によって取得された撮影位置に従って画像取得部４０１から出力される複数の画像を配置し、合成画像を生成する。合成画像加工部４０５は、得られた合成画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。合成画像出力部４０７は、合成画像加工部４０５によって合成画像が加工されると、加工後の合成画像を制御部１１０へ出力する。中央画像加工部４０８は、画像取得部４０１から出力される観測用の画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。中央画像出力部４０９は、中央画像加工部４０８によって中央画像が加工されると、加工後の中央画像を制御部１１０へ出力する。モニタ１１１は、合成画像と中央画像を並べて表示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、細胞を含む画像を表示するインジェクション装置およびインジェクション方法に関し、特に物質の注入の効率を向上し、装置構成を簡易にすることができるインジェクション装置およびインジェクション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内に遺伝子を直接注入することにより、細胞の遺伝情報を改変する研究が盛んに行われている。この研究が進めば、遺伝子の役割が解明されるとともに、例えば個人の遺伝的特性に適合した遺伝子治療を行うテーラメード医療が可能となる。細胞内に遺伝子を注入する方式としては、電気的な方法（エレクトロポレーション）、化学的な方法（リポフェクション）、生物的な方法（ベクター法）、機械的な方法（マイクロインジェクション）、および光学的な方法（レーザインジェクション）などが提案されている。しかし、電気的な方式は、大電流を流して細胞膜を破るため細胞へのダメジが大きく、化学的な方式は、導入可能な遺伝子に制限があるため効率が悪く、生物的な方法は、すべての材料を導入できずに安全性が確認できないなどの欠点がある。一方で、機械的な方法は、最も安全で効率が高い方法として注目されている。
【０００３】
機械的な方法（マイクロインジェクション）においては、例えば特許文献１に開示されているように、顕微鏡による細胞の拡大像がカメラによって撮影され、操作者が撮影された画像をモニタで確認しながらキャピラリと呼ばれる針の位置を決定し、キャピラリを細胞に穿刺することによって遺伝子を注入する。
【０００４】
図２４は、従来のマイクロインジェクション装置の構成を模式的に示す図である。同図に示すマイクロインジェクション装置においては、付着細胞が投入された培養液で満たされたシャーレ１が水平方向に移動自在な移動ステージ２の上に載置されている。光源３からの光が照射されたシャーレ１内の付着細胞は、対物レンズ部４のレボルバ４ｃに取り付けられた対物レンズ４ａまたは対物レンズ４ｂ（図２４においては対物レンズ４ｂ）によって拡大される。対物レンズ４ａまたは対物レンズ４ｂによって拡大された細胞の拡大像は、反射鏡６によってカメラ８が固定されている方向へ投影され、結像レンズ７によってカメラ８のレンズの位置に結像する。
【０００５】
結像した細胞の拡大像は、カメラ８によって撮影され、図示しないモニタなどに表示される。操作者は、図示しないモニタに表示された細胞の拡大像を確認しながら、キャピラリ５がシャーレ１内の細胞に穿刺されるように、移動ステージ２を移動させてシャーレ１の位置を調整し、位置が決定するとキャピラリ５を穿刺して遺伝子などの薬剤を細胞に注入する。
【０００６】
このようなマイクロインジェクション装置においては、インジェクションの目的に応じて細胞内の核や細胞質を区別してインジェクションする必要がある。そのためには、およそ数十μｍ（マイクロメートル）程度の大きさの細胞内において、各細胞小器官の位置を正確に確認してキャピラリ５の制御を行わなければならず、高倍率の対物レンズを使用する必要がある。このため、マイクロインジェクション装置においては、一般にレボルバ４ｃに倍率が異なる複数の対物レンズ４ａ、４ｂが取り付けられており、レボルバ４ｃを図２４における矢印方向に回転させて、所望の倍率の対物レンズで細胞を拡大するようになっている。
【０００７】
【特許文献１】特許第２５５３１５０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、通常、シャーレは細胞と比較して非常に大きいため、インジェクションを行う際には、インジェクション対象の細胞が存在する観測領域をシャーレ内から適切に定めなくてはならない。このとき、観測領域では、個々の細胞を区別して観測できる程度の細胞密度であることが要求される。すなわち、例えば図２５−１に示すように、細胞が密集しており個々の細胞が重なっている領域や、逆に図２５−２の枠１１のように細胞が存在していない領域を観測領域として定めることなく、図２５−２の枠１２のように適度な細胞密度の領域を探索する必要がある。適度な細胞密度の領域を探索するためには、高倍率の対物レンズでは視野が狭く効率が悪いため、レボルバを回転させて低倍率かつ広視野の対物レンズに切り替えられることになる。
【０００９】
しかしながら、適切な観測領域の探索とインジェクションとを交互に繰り返して複数の細胞に対してインジェクションを行う場合には、その都度高倍率の対物レンズと低倍率の対物レンズとを切り替えなくてはならず、手間がかかるという問題がある。その結果、インジェクションの効率が低下し、時間がかかってしまう。また、倍率が異なる複数の対物レンズが必要であるため、これらが取り付けられるレボルバも必要となり、装置の構成が複雑になる。
【００１０】
本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、インジェクションの効率を向上し、装置構成を簡易にすることができるインジェクション装置およびインジェクション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、前記第１生成手段によって生成された広視野画像および前記第２生成手段によって生成された狭視野画像を並べて表示する表示手段とを有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、上記発明において、前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段と、前記入力手段によって物質注入位置が入力されると、直後に前記微小針を用いて前記物質注入位置に物質を注入するインジェクション手段とをさらに有し、前記第２生成手段は、前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に所定のマークを合成することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は、上記発明において、物質注入前後に前記第２生成手段によって生成される狭視野画像の差分画像を生成する第３生成手段と、前記第３生成手段によって生成された差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定する判定手段とをさらに有し、前記第２生成手段は、前記判定手段による判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する加工を行うことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、上記発明において、１つの格子が前記狭視野画像１つに対応し、前記広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップであって、インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成する第４生成手段をさらに有し、前記表示手段は、前記第４生成手段によって生成されたマップを前記広視野画像および前記狭視野画像とともに表示することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、前記第１生成工程にて生成された広視野画像および前記第２生成工程にて生成された狭視野画像を並べて表示する表示工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、培地内の指定位置を撮影し、指定位置および指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成し、指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成し、生成された広視野画像および狭視野画像を並べて表示する。このため、操作者は、広視野画像を確認しながらインジェクションに適した細胞密度の観測領域を探索することができるとともに、狭視野画像を確認しながら詳細なインジェクション位置を決定することができ、インジェクションの効率を向上することができる。また、同じ倍率の画像を用いて広視野画像および狭視野画像を生成することができ、異なる倍率の対物レンズを不要にして、装置構成を簡易にすることができる。
【００１７】
また、本発明によれば、表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力し、物質注入位置が入力されると、直後に微小針を用いて物質注入位置に物質を注入し、狭視野画像の物質注入位置に所定のマークを合成するため、入力された物質注入位置の座標を記憶しておく必要がないとともに、狭視野画像において物質注入位置を確認することができる。
【００１８】
また、本発明によれば、物質注入前後に生成される狭視野画像の差分画像を生成し、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定し、判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する。このため、インジェクションによって大きく変形した細胞を他の細胞と区別して確認することができるため、容易にインジェクションの効果の有無を把握することができる。
【００１９】
また、本発明によれば、１つの格子が狭視野画像１つに対応し、広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップであって、インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成し、生成されたマップを広視野画像および狭視野画像とともに表示するため、広視野画像および狭視野画像に対応する観測領域の大まかな位置関係を把握するとともに、インジェクションが完了していない領域の位置を容易に確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係るインジェクション装置の概略構成を示す図である。同図に示すインジェクション装置は、シャーレ１０１が載置される移動ステージ１０２、光源１０３、対物レンズ１０４、キャピラリ１０５、反射鏡１０６、結像レンズ１０７、ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）カメラ１０８、画像処理部１０９、制御部１１０、モニタ１１１、および位置入力部１１２を有している。
【００２２】
移動ステージ１０２は、水平方向に移動自在に設けられており、制御部１１０の制御に従って、上面に載置されたシャーレ１０１の位置を調整する。光源１０３は、制御部１１０の制御に従ってシャーレ１０１へ光を照射し、シャーレ１０１内の細胞の観測に必要な光量を与える。
【００２３】
対物レンズ１０４は、シャーレ１０１内の細胞を拡大する高倍率かつ狭視野のレンズである。対物レンズ１０４の倍率は、例えば視野内に細胞が４〜５個程度含まれる程度であり、個々の細胞および細胞小器官が明確に観測可能な程度である。また、対物レンズ１０４は、制御部１１０の制御に従って、シャーレ１０１内の細胞を拡大する際の焦点を調節する。
【００２４】
キャピラリ１０５は、シャーレ１０１側の先端が針状になっており、制御部１１０の制御に従って、シャーレ１０１内の位置入力部１１２に入力された位置にある細胞へ遺伝子などの物質を注入する。反射鏡１０６は、対物レンズ１０４によって拡大されて得られた拡大像をＣＣＤカメラ１０８の方向へ投影する。結像レンズ１０７は、対物レンズ１０４によって拡大されて得られた拡大像をＣＣＤカメラ１０８のレンズの位置で結像する。ＣＣＤカメラ１０８は、結像レンズ１０７によって結像した拡大像を撮影し、撮影した画像を画像処理部１０９へ出力する。
【００２５】
画像処理部１０９は、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影された画像に対して画像処理を施し、得られた画像を制御部１１０へ出力する。具体的には、画像処理部１０９は、複数の画像をつなぎ合わせて得られた合成画像と合成画像の中央の画像とを出力したり、画像内の細胞において検出された周縁を強調する画像を生成したり、焦点が異なる複数の画像を合成したりする。画像処理部１０９によるさらに具体的な画像処理については、後に詳述する。
【００２６】
制御部１１０は、画像処理部１０９から出力された画像をモニタ１１１に表示させる。また、制御部１１０は、画像処理部１０９および位置入力部１１２からの指示により、移動ステージ１０２を移動させたり、キャピラリ１０５によるインジェクションを行わせたり、対物レンズ１０４の焦点を調節させたり、光源１０３による光の照射・非照射を切り替えたりする。
【００２７】
モニタ１１１は、画像処理部１０９から制御部１１０へ出力された画像を表示する。このとき、モニタ１１１は、複数の画像がつなぎ合わされた合成画像と合成画像の中央に位置する中央画像とを並べて表示する。位置入力部１１２は、モニタ１１１を目視する操作者の操作を受け付け、操作者が指定する位置の撮影およびインジェクションなどが行われるような制御の実行を制御部１１０へ指示する。
【００２８】
図２−１は、シャーレ１０１および移動ステージ１０２を拡大して示す斜視図である。同図に示すように、シャーレ１０１は、シャーレホルダ２０１の中央に設けられた穴に嵌合された上で移動ステージ２０１の上面に載置される。このとき、シャーレホルダ２０１が移動ステージ１０２の上面に突設された位置合わせピン１０２ａに当接して載置されることで、シャーレ１０１の位置を常に固定することができる。さらに、シャーレホルダ２０１には、図２−２に示すように、図示しないバネによって中央の穴の中心方向へ加圧されたシャーレ押さえ２０１ａが形成されており、穴に嵌合されたシャーレ１０１の位置をさらに確実に固定することができる。
【００２９】
また、同一のシャーレ１０１を異なる装置の移動ステージ１０２に載置する場合には、例えば図２−３に示す位置合わせ部材２０２をシャーレホルダ２０１の中央の穴に設置し、位置合わせ部材２０２に穿設された透過孔２０２ａの座標が異なる装置間で再現されるよう調整することにより、常にシャーレ１０１の位置を固定することができる。なお、シャーレホルダ２０１の代わりに、図２−４に示すシャーレホルダ２０３を使用することにより、シャーレホルダ２０３に設けられた透過孔２０３ａの座標を調整すれば良く、位置合わせ部材が不要となる。さらに、移動ステージ１０２に押さえバネ１０２ｂを設けることにより、シャーレホルダ２０３が確実に位置合わせピン１０２ａに当接される。また、シャーレホルダ２０３にも押さえバネ２０３ｂを設けることにより、シャーレホルダ２０３におけるシャーレ１０１の位置も固定される。なお、位置合わせ部材２０２およびシャーレホルダ２０３の透過孔２０２ａおよび透過孔２０３ａの代わりに、例えば十字マークなどの所定のマークを用いても良い。
【００３０】
このように、シャーレ１０１の位置を常に同位置に固定することができるため、細胞のインジェクション後に一度シャーレ１０１を他所へ移動した場合でも、容易に移動ステージ１０２上での位置を再現して正確に効果の観測を行うことができる。
【００３１】
次に、上記のように構成されたインジェクション装置による一般的なインジェクションについて説明しておく。
【００３２】
図３に示すように、シャーレ１０１には培養液３０１が満たされており、培養液３０１に付着細胞が投入されると、一定時間後には細胞３０２がシャーレ１０１の上面に付着する。細胞３０２は、核３０２ａと様々な細胞小器官を含む細胞質３０２ｂとから構成されている。この細胞３０２の核３０２ａに、例えば遺伝子などの物質をインジェクションする際には、図４に示すようにキャピラリ１０５の先端が核３０２ａに穿刺され、物質が核３０２ａに注入される。なお、図４においては、培養液３０１の図示を省略している。
【００３３】
このとき、対物レンズ１０４によって拡大された拡大像は、例えば図５−１に示すようになっている。すなわち、キャピラリ１０５の先端の位置とインジェクション対象の細胞３０２の核３０２ａの位置とが合っていない。そこで、操作者は、位置入力部１１２を操作して、核３０２ａの位置をインジェクション位置として指定することにより、制御部１１０の制御によって移動ステージ１０２が移動し、図５−２に示すように、キャピラリ１０５の先端の位置と核３０２ａの位置とが同一直線上に並ぶ。その後、キャピラリ１０５が図５−２中の矢印方向へ動き、核３０２ａにキャピラリ１０５の先端が穿刺される。なお、ここでは、移動ステージ１０２が移動することにより、キャピラリ１０５の先端の位置と核３０２ａの位置とが同一直線上に並ぶものとしたが、キャピラリ１０５が移動するようにしても良い。このように、本実施の形態においては、インジェクションの位置指定後即座にインジェクションが実行されるため、指定されたインジェクション位置の座標を記憶しておく必要がない。
【００３４】
次いで、本実施の形態に係るインジェクション装置による画像処理について説明する。図６は、本実施の形態に係るインジェクション装置の画像処理部１０９の内部構成を示すブロック図である。同図に示すように、画像処理部１０９は、画像取得部４０１、撮影位置取得部４０２、画像配置部４０３、周縁検出部４０４、合成画像加工部４０５、再撮影位置指示部４０６、合成画像出力部４０７、中央画像加工部４０８、中央画像出力部４０９、インジェクション位置取得部４１０、マーキング部４１１、差分画像生成部４１２、および判定部４１３を有している。
【００３５】
画像取得部４０１は、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影された画像を取得し、画像配置部４０３または中央画像加工部４０８へ出力する。具体的には、画像取得部４０１は、移動ステージ１０２が一定時間内に移動しつつＣＣＤカメラ１０８によって撮影された観測領域探索用の画像を画像配置部４０３へ出力する一方、移動ステージ１０２が一定時間以上停止してＣＣＤカメラ１０８によって撮影された観測用の画像を中央画像加工部４０８へ出力する。
【００３６】
撮影位置取得部４０２は、制御部１１０からＣＣＤカメラ１０８が画像を撮影した撮影位置の情報を取得する。画像配置部４０３は、撮影位置取得部４０２によって取得された撮影位置に従って画像取得部４０１から出力される複数の画像を配置し、観測領域探索用の合成画像を生成する。本実施の形態においては、画像配置部４０３は、縦横に３枚ずつ並ぶ合計９枚の画像を配置して合成画像を生成する。ただし、画像配置部４０３によって配置される画像の数は、例えば縦横に５枚ずつ並ぶ２５枚でも良いし、縦横の画像数が一致していなくても良い。このように、複数の画像を並べて配置することにより、周辺の細胞密度などの状況の把握が可能となる。
【００３７】
周縁検出部４０４は、画像配置部４０３において得られた合成画像において、微分処理などを含むエッジ検出を行い、合成画像内の細胞の周縁を検出する。合成画像加工部４０５は、画像配置部４０３において得られた合成画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。具体的には、合成画像加工部４０５は、合成画像において、周縁検出部４０４によって検出された細胞の周縁を例えば太線でトレースするなどして強調表示する。また、合成画像加工部４０５は、合成画像における個々の画像間の境界に位置する細胞について、細胞単位で再撮影された画像を上書き合成する。さらに、合成画像加工部４０５は、インジェクション後の細胞をインジェクション前の細胞と区別するために、マーキング部４１１の指示に従って、合成画像においてインジェクション後の細胞にマーキングする。
【００３８】
再撮影指示部４０６は、周縁検出部４０４による周縁検出の結果、周縁が合成画像の個々の画像間の境界に交差する細胞を抽出し、抽出した細胞を再撮影するように制御部１１０へ指示する。すなわち、再撮影指示部４０６は、合成画像において複数の画像間にまたがっている細胞を抽出し、この細胞の再撮影を指示する。この指示を受けた制御部１１０は、移動ステージ１０２を移動させ、指示された位置をＣＣＤカメラ１０８に撮影させる。合成画像出力部４０７は、合成画像加工部４０５によって合成画像が加工されると、加工後の合成画像を制御部１１０へ出力する。出力された合成画像は、制御部１１０の制御によってモニタ１１１に表示される。
【００３９】
中央画像加工部４０８は、画像取得部４０１から出力される観測用の画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。なお、画像取得部４０１から出力される観測用の画像は、画像配置部４０３によって生成される合成画像の中央の画像に対応する位置の画像であるため、以後、観測用の画像を「中央画像」という。具体的は、中央画像加工部４０８は、焦点が異なる２枚の中央画像を合成し、細胞の細胞膜および細胞小器官の双方が明確になるように加工する。このとき、中央画像加工部４０８は、中央画像においてエッジ検出などを行い、細胞の周縁を強調表示しても良い。また、中央画像加工部４０８は、インジェクション後の細胞をインジェクション前の細胞と区別するために、マーキング部４１１の指示に従って、中央画像においてインジェクション後の細胞にマーキングする。さらに、中央画像加工部４０８は、判定部４１３からの指示に従い、インジェクションの効果が現れた細胞の色を変えるなどして区別可能にする。
【００４０】
中央画像出力部４０９は、中央画像加工部４０８によって中央画像が加工されると、加工後の中央画像を制御部１１０へ出力する。出力された中央画像は、制御部１１０の制御によって、合成画像とともにモニタ１１１に表示される。
【００４１】
インジェクション位置取得部４１０は、位置入力部１１２に入力されたインジェクション指定位置の情報、換言すれば、制御部１１０の制御によってキャピラリ１０５が穿刺されてインジェクションが実行された細胞の位置の情報を制御部１１０から取得する。マーキング部４１１は、合成画像加工部４０５および中央画像加工部４０８に指示をして、それぞれ合成画像および中央画像中のインジェクションが実行された細胞にマーキングをさせる。具体的には、マーキング部４１１は、合成画像中のインジェクションが実行された細胞を含む画像枠に着色させるとともに、中央画像中のインジェクションが実行された細胞の周縁に着色させたり細胞内の特定の位置に所定のマークを付加させたりする。
【００４２】
差分画像生成部４１２は、インジェクション前に中央画像中の細胞の画像を取得しておき、インジェクション後に同位置の中央画像が取得されると、同位置の細胞の画像を再び取得し、インジェクション前後の細胞の画像の差分の画像を生成する。すなわち、差分画像生成部４１２は、細胞中においてインジェクション前後で変化があった部分を示す差分画像を生成する。このとき、差分画像生成部４１２は、インジェクション前後の画像の濃淡の差分を求めて差分画像を生成しても良く、また、細胞の輪郭線の変化から形状の差分を求めて差分画像を生成しても良い。判定部４１３は、差分画像の大きさを所定のしきい値と比較し、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であれば、インジェクションが適切に行われたと判定する一方、差分画像の大きさが所定のしきい値未満であれば、インジェクションが適切に行われなかったと判定する。そして、判定部４１３は、インジェクションが適切に行われ、インジェクションの効果が現れた細胞を他の細胞と区別するように中央画像加工部４０８へ指示する。
【００４３】
次に、上記のように構成された画像処理部１０９による画像処理動作について、図７に示すフロー図を参照しながら説明する。
【００４４】
まず、操作者は、位置入力部１１２を操作して、移動ステージ１０２を所望の位置に移動させ、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影するシャーレ１０１内の位置を指定する（ステップＳ１０１）。撮影位置が指定されると、ＣＣＤカメラ１０８によってシャーレ１０１の拡大像が撮影され、観測領域探索用の合成画像生成処理が行われる（ステップＳ１０２）。
【００４５】
合成画像生成処理は、図８に示すフロー図の手順に従って実行される。すなわち、ＣＣＤカメラ１０８によって、例えば図９に示すように、指定された撮影位置を中心とした周辺の９画像が順次撮影される（ステップＳ２０１）。このとき、制御部１１０によって移動ステージ１０２の移動が制御され、例えば図９における右上の画像から左下の画像の領域が順次撮影され、撮影された画像は、画像取得部４０１によって取得され、画像配置部４０３へ出力される。また、撮影位置取得部４０２によって、制御部１１０から９画像それぞれの撮影位置が取得され、画像配置部４０３へ出力される。なお、上述したように、ここで撮影されるのは、必ずしも９画像でなくても良い。
【００４６】
そして、画像配置部４０３によって、９画像が撮影位置に応じて配置され（ステップＳ２０２）、得られた合成画像は、合成画像加工部４０５に保持されるとともに合成画像出力部４０７から出力され、制御部１１０を介してモニタ１１１に表示される。このとき、合成画像の画像サイズは、モニタ１１１に表示可能なように適宜縮小される。したがって、対物レンズ１０４の倍率は高倍率であっても、モニタ１１１に表示される合成画像の実質的な倍率は、対物レンズ１０４の倍率よりも低いものとなる。
【００４７】
このとき、モニタ１１１には、例えば図１０に示すように、合成画像の周囲に８方向の矢印が表示されるようにしておき、操作者がモニタ１１１を確認しながら合成画像の範囲を変更できるようにしても良い。すなわち、例えば図１０の左図において、位置入力部１１２の操作により操作者が下の矢印を指定すると、移動ステージ１０２が再度移動しながらＣＣＤカメラ１０８によって再び９画像が取得され、図１０の右図のように、１画像分だけ合成画像の範囲が下方へ変更される。
【００４８】
その後、周縁検出部４０４によって合成画像からエッジ検出が行われ、合成画像中の細胞の輪郭線が検出される。検出された輪郭線は、合成画像加工部４０５によって、例えば図１１に示すように太線にされるなど強調され（ステップＳ２０３）、改めてモニタ１１１に表示される。さらに、周縁検出部４０４によって細胞の輪郭線が検出されると、再撮影位置指示部４０６によって、例えば図１２−１において黒枠で囲まれた細胞のように、複数の画像の境界をまたがって表示される細胞があるか否かが判断される（ステップＳ２０４）。この判断は、例えば図１２−２の上部画面の図に例示されるように、白丸の注目点を細胞の輪郭線に沿って移動させ、この注目点が画像の境界と交差する場合は、細胞が複数の画像の境界にあると判断することによって行われる。この結果、複数の画像の境界に細胞がある場合は、再撮影位置指示部４０６によって、この細胞の位置を再撮影するように制御部１１０へ指示される。なお、細胞が画像の境界にあるか否かの判断は、操作者がモニタ１１１に表示された合成画像を目視で確認し、画像の境界にある細胞の位置を位置入力部１１２に入力するなどとしても良い。
【００４９】
制御部１１０が再撮影位置指示部４０６からの指示を受け、移動ステージ１０２の位置を調節すると、ＣＣＤカメラ１０８によって、画像の境界にあった細胞が再撮影され、得られた画像が画像取得部４０１によって再取得される（ステップＳ２０５）。つまり、図１２−２において、上部画面と下部画面との境界にあった細胞の画像が再取得され（図１２−２の中図参照）、画像配置部４０３によって、再取得された画像が撮影位置に配置される。さらに、合成画像加工部４０５によって、再取得された画像が細胞を含む最小のサイズに切り取られた上で（図１２−２の右図参照）、合成画像加工部４０５に保持されている合成画像に上書き合成される（ステップＳ２０６）。こうして得られた合成画像は、改めてモニタ１１１に表示される。これにより、９画像の取得時における移動ステージ１０２の移動の誤差などによって画像の境界でずれて表示された細胞を正確な形状で表示することができる。
【００５０】
以上のステップＳ２０１からステップＳ２０６の処理により、細胞の輪郭線が強調され、複数の画像の境界にある細胞も正確な形状で表示される合成画像が生成される。この合成画像は、細胞内の微小な細胞小器官などを確認するには適さないものの、観測領域に適した細胞密度の領域を探索するのに適している。
【００５１】
再び図７に戻って、合成画像生成処理が完了すると、観測用の中央画像生成処理が行われる（ステップＳ１０３）。
【００５２】
中央画像生成処理は、図１３に示すフロー図の手順に従って実行される。すなわち、ＣＣＤカメラ１０８によって、合成画像の中央に位置する中央画像が取得される（ステップＳ３０１）。ここで取得される中央画像は、図１４−１のＡに示すように、対物レンズ１０４の焦点をシャーレ１０１の上面と細胞３０２の下面との境界に合わせた拡大像の画像である。
【００５３】
そして、制御部１１０の制御に従って、図１４−１のＢに示すように、細胞３０２の細胞膜周辺に対物レンズ１０４の焦点が合うように調整される（ステップＳ３０２）。焦点の調整後、ＣＣＤカメラ１０８によって、再び中央画像が取得される（ステップＳ３０３）。
【００５４】
細胞３０２は、シャーレ１０１に密着しているが、外周がシャーレ１０１の上面から少し立ち上がった形状をしており、その厚さはおよそ５μｍ程度である。このとき、図１４−１のＡに示す位置に焦点が合っていると、例えば図１４−２のＡ画像のように、シャーレ１０１の上面に付着する細胞内の微小な細胞小器官が明確な画像が得られる。一方、対物レンズ１０４の焦点を２〜５μｍ程度上方に調整し、図１４−１のＢに示す位置に焦点が合っていると、例えば図１４−２のＢ画像のように、細胞３０２の細胞膜が明確な画像が得られる。そこで、焦点が異なる２つの画像が中央画像加工部４０８によって合成されることにより（ステップＳ３０４）、図１４−２のように、細胞の輪郭線と内部の細胞小器官との双方が明確な中央画像が得られる。
【００５５】
以上のステップＳ３０１からステップＳ３０４の処理により、細胞の輪郭線および内部の細胞小器官の双方が明確な中央画像が生成される。この中央画像は、細胞内の微小な細胞小器官などを確認するのに適している。
【００５６】
再び図７に戻って、合成画像生成処理および中央画像生成処理によって生成された合成画像および中央画像は、図１５に示すように、モニタ１１１に並べて表示される（ステップＳ１０４）。合成画像および中央画像がモニタ１１１に表示された後も、上述したように操作者によって合成画像の範囲が変更されれば、随時ステップＳ１０２の合成画像生成処理が行われ、これに伴って、ステップＳ１０３の中央画像生成処理が行われる。また、中央画像については、常に更新が繰り返されており、シャーレ１０１内の細胞の最新の状態がモニタ１１１に表示されることになる。
【００５７】
このように、モニタ１１１に合成画像および中央画像が並んで表示されるため、操作者は、合成画像を確認しながら細胞密度が適切な観測領域を探索しつつ、適切な観測領域を中央画像で確認してインジェクションを実行することができる。インジェクション実行の際には、操作者は、モニタ１１１の中央画像を確認しながら位置入力部１１２を操作し、例えば図１６に示すように、十字マークなどによって中央画像中のインジェクションを希望する位置を指定する（ステップＳ１０５）。この指定は、制御部１１０へ通知され、制御部１１０によって、移動ステージ１０２およびキャピラリ１０５が制御され、操作者の指定位置にインジェクションが実行される（ステップＳ１０６）。
【００５８】
インジェクション後、モニタ１１１に表示される合成画像および中央画像には、インジェクションが実行されたことを示すマーキングが施される（ステップＳ１０７）。すなわち、画像処理部１０９のインジェクション位置取得部４１０によって、制御部１１０からインジェクションされた位置の情報が取得され、マーキング部４１１によって、合成画像加工部４０５に保持された合成画像および中央画像加工部４０８に保持された中央画像にマーキングが施される。マーキングが施された合成画像および中央画像は、それぞれ合成画像出力部４０７および中央画像出力部４０９から制御部１１０へ出力され、モニタ１１１に表示される。マーキング部４１１によるマーキングは、例えば図１７に示すように、合成画像に関しては、インジェクションされた細胞を含む画像枠が強調表示され、中央画像に関しては、インジェクションされた細胞の輪郭線とインジェクション位置とが強調表示されるようにして行われる。このマーキングにより、操作者は、各画像枠および各細胞について既にインジェクションが行われたか否かを識別することができる。
【００５９】
以後、合成画像による観測領域の探索、中央画像によるインジェクション位置の指定、インジェクション、およびインジェクション位置のマーキングが繰り返され、所望数の細胞に対してインジェクションが実行される。所望数の細胞に対してインジェクションが実行されると、画像処理部１０９は、インジェクションの効果の判定を行う（ステップＳ１０８）。すなわち、差分画像生成部４１２によって、中央画像加工部４０８に保持されたインジェクション前後の中央画像から差分画像が生成され、判定部４１３によって、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かが判定される。
【００６０】
差分画像生成部４１２による差分画像の生成は、例えば図１８に示すように、インジェクション前の中央画像における細胞の形状とインジェクション後の中央画像における細胞の形状との差分が求められることにより行われる。図１８においては、下図の斜線部分が差分画像として求められることになる。そして、判定部４１３によって、斜線部分の面積が所定のしきい値以上であるか否かが判定され、所定のしきい値以上であれば、インジェクションが適切に行われ効果が現れたと判定される。判定結果は、中央画像加工部４０８へ通知され、インジェクションの効果が現れた細胞については、他の細胞と区別可能なように着色されるなどの加工が施される。そして、この中央画像は、中央画像出力部４０９から制御部１１０へ出力され、モニタ１１１に表示される。これにより、操作者は、インジェクションの効果が現れた細胞を容易に確認することができる。なお、判定部４１３による判定結果を合成画像加工部４０５にも通知し、マーキング部４１１によるマーキングと同様に、インジェクションの効果が現れた細胞を含む画像枠を他の画像枠と区別可能に着色しても良い。
【００６１】
以上のように、本実施の形態によれば、指定された撮影位置の周辺の画像を取得し、取得された画像を合成して得られた合成画像と指定された撮影位置に対応する合成画像の中央に配置された中央画像とを並べてモニタに表示する。このため、周辺の状況を把握可能な合成画像を確認しながらインジェクションに適した観測領域を探索すると同時に、細胞の微小な構造を把握可能な中央画像を確認してインジェクションを実行することができ、対物レンズの切り替えなどの手間がかからず、インジェクションの効率を向上することができる。また、合成画像と中央画像とは、同一の対物レンズで拡大された拡大像から生成されるため、倍率が異なる複数の対物レンズを必要とせず、装置構成を簡易にすることができる。
【００６２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２の特徴は、インジェクション可能領域、インジェクション済み領域、および細胞の移動可能領域などが示された広域な格子状のマップを合成画像および中央画像とともに表示する点である。
【００６３】
本実施の形態に係るインジェクション装置の概略構成は、実施の形態１（図１）と同様であるため、その説明を省略する。本実施の形態においては、画像処理部１０９の内部構成が実施の形態１と異なっている。図１９は、本実施の形態に係るインジェクション装置の画像処理部１０９の内部構成を示すブロック図である。同図に示すように、本実施の形態に係る画像処理部１０９は、実施の形態１の画像処理部１０９にマップ生成部５０１を追加した構成を有している。
【００６４】
マップ生成部５０１は、合成画像加工部４０５に保持される合成画像から１つの格子が１つの画像枠に対応する広域の格子状のマップを生成する。１つの画像枠は１辺が例えば１００μｍ程度に対応するのに対し、マップは１辺が例えば２ｍｍ程度に対応する。マップ生成部５０１は、合成画像を構成する各画像枠内の細胞数から求められるインジェクションに適した細胞密度の画像枠、インジェクションが完了した画像枠、および細胞が移動可能な範囲の画像枠などをマップ上に示してモニタ１１１に表示させる。
【００６５】
本実施の形態においては、例えばインジェクション装置の起動時などに、マップに表示される範囲全体をＣＣＤカメラ１０８によって順次撮影し、各画像を並べた広域画像を生成しておく。
【００６６】
そして、インジェクションの適不適をマップ上に示すには、広域画像における各画像が例えば図２０−１に示すようなものである場合、マップ生成部５０１は、まず各画像枠内の細胞数をカウント・記録する。図２０−１において、各画像枠内の数字は、細胞の数を示している。なお、画像枠の境界上の細胞については、画像処理の簡略化のため、カウントしないものとしている。そして、マップ生成部５０１は、細胞数が例えば３〜１０個の画像枠に対応する格子をインジェクションに適した領域とし、細胞数が例えば０〜２または１１個以上の画像枠に対応する格子をインジェクションに適さない領域として、色を変えるなどしてマップ上に示す。このマップの一例を図２０−２に示す。図２０−２においては、例えば横線で示す範囲６０１がインジェクションに適した領域であり、縦線で示す範囲６０２がインジェクションに適さない領域である。
【００６７】
操作者は、このようなマップをモニタ１１１上で確認することにより、インジェクションを実行する際の対象範囲を大まかに決定し、位置入力部１１２を操作して実施の形態１における合成画像生成処理および中央画像生成処理を行う位置を指定することができる。
【００６８】
また、インジェクションが完了した画像枠をマップ上に示すには、マップ生成部５０１は、マーキング部４１１によって合成画像上でマーキングされた画像枠に対応する格子を着色して、例えば図２１に示すようなマップを生成する。図２１においては、斜線で示した格子がインジェクション済みの細胞を含む画像枠に対応している。これにより、操作者は、インジェクションが完了した範囲を大まかに把握することができる。
【００６９】
なお、画像枠内においてインジェクションされた細胞数をカウントし、その数に応じて格子の色を変えることにより、より詳細にインジェクションの状況を把握し、重点的に効果の有無を観測すべき領域を決定することができる。同時に、例えば図２２に示すように、上述したインジェクションの適不適もマップ上に示しておくことにより、操作者は、インジェクションを進めるべき領域の指針を得ることができる。このようなマップにおいては、すべての画像枠について細胞数をカウントして示す必要はなく、一定間隔の画像枠について細胞数をカウントした上で、統計処理により細胞数に応じた格子の着色を行っても良い。
【００７０】
また、細胞が移動可能な範囲の画像枠をマップ上に示すには、細胞の活動度・移動速度に応じた範囲の格子を着色すれば良い。ここで、細胞は、移動する可能性があるため、インジェクション後に同位置を観測しても細胞が存在しないことがある。しかし、細胞の移動速度には限度があるため、例えば図２３−１のように、黒色で示す格子にある細胞は、最大でも図中矢印で示す距離程度しか移動することはない。そこで、図２３−１に斜線で示す範囲の格子を細胞の移動可能範囲として着色すれば、インジェクション後に効果を観測する際にも、インジェクション前後で観測対象の細胞数が異なってしまうことなどがなく、効率的な観測を行うことができる。このようにマップ上に細胞の移動可能範囲を示した例を図２３−２に示す。図２３−２においては、黒色の格子がインジェクション時に細胞が存在した領域に対応しており、斜線で示す格子が細胞の移動可能領域に対応している。
【００７１】
以上のように、本実施の形態によれば、より広域な格子状のマップにインジェクションの適不適、インジェクションの完了状況、および細胞の移動可能範囲などを示すため、さらにインジェクションの効率を向上することができる。
【００７２】
（付記１）培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、
培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、
前記第１生成手段によって生成された広視野画像および前記第２生成手段によって生成された狭視野画像を並べて表示する表示手段と
を有することを特徴とするインジェクション装置。
【００７３】
（付記２）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に所定のマークを合成することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７４】
（付記３）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記入力手段によって物質注入位置が入力されると、直後に前記微小針を用いて前記物質注入位置に物質を注入することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７５】
（付記４）前記第１生成手段は、
広視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された細胞の周縁を前記広視野画像において強調表示する加工を行う加工手段と
を有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７６】
（付記５）前記第２生成手段は、
狭視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出して強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７７】
（付記６）前記第２生成手段は、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる複数の焦点が異なる画像を合成して狭視野画像を生成することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７８】
（付記７）前記第２生成手段は、
前記撮影手段によって得られる焦点が細胞の表面に合った画像と前記撮影手段によって得られる焦点が細胞の表面より細胞内側へ２〜５μｍずれた位置に合った画像とを合成して狭視野画像を生成することを特徴とする付記６に記載のインジェクション装置。
【００７９】
（付記８）前記第１生成手段は、
広視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された細胞の周縁が広視野画像を構成する画像の境界と交差する場合に、この細胞の位置を前記撮影手段に再撮影位置として指示する指示手段と、
前記撮影手段によって再撮影されて得られる画像を前記広視野画像の前記再撮影位置に上書き合成する加工手段と
を有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８０】
（付記９）前記加工手段は、
前記再撮影手段によって再撮影されて得られる画像から細胞を含む最小領域を切り取った上で前記広視野画像の前記再撮影位置に上書き合成することを特徴とする付記８に記載のインジェクション装置。
【００８１】
（付記１０）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に存在する細胞の周縁を強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８２】
（付記１１）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第１生成手段は、
前記入力手段によって物質注入位置が入力された時に前記表示手段に表示されている狭視野画像に対応する画像枠を前記広視野画像において強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８３】
（付記１２）物質注入前後に前記第２生成手段によって生成される狭視野画像の差分画像を生成する第３生成手段と、
前記第３生成手段によって生成された差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定する判定手段とをさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記判定手段による判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８４】
（付記１３）前記表示手段は、
前記広視野画像の周囲に指定位置の変更を誘導する所定の記号を表示し、
前記撮影手段は、
前記表示手段に表示された記号に応じて指定された指定位置を撮影することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８５】
（付記１４）１つの格子が前記狭視野画像１つに対応し、前記広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第４生成手段をさらに有し、
前記表示手段は、
前記第４生成手段によって生成されたマップを前記広視野画像および前記狭視野画像とともに表示することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８６】
（付記１５）前記第４生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞数に応じて各狭視野画像に対応する格子を区別してマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８７】
（付記１６）前記第４生成手段は、
インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８８】
（付記１７）前記第４生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞が移動可能な領域に対応する格子を他の格子と区別してマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８９】
（付記１８）前記培地の容器の位置を調整する調整手段をさらに有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００９０】
（付記１９）前記調整手段は、
前記容器を固定して保持する保持部材と、
前記保持部材に当接し、前記保持部材の位置を決定する突起と
を有することを特徴とする付記１８に記載のインジェクション装置。
【００９１】
（付記２０）前記調整手段は、
位置の基準となる所定のマークが形成された位置基準部材をさらに有し、前記所定のマークの位置を固定することを特徴とする付記１９に記載のインジェクション装置。
【００９２】
（付記２１）前記保持部材は、
位置の基準となる所定のマークを有し、前記所定のマークの位置を固定することを特徴とする付記１９に記載のインジェクション装置。
【００９３】
（付記２２）培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、
培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、
前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、
培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、
前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、
前記第１生成工程にて生成された広視野画像および前記第２生成工程にて生成された狭視野画像を並べて表示する表示工程と
を有することを特徴とするインジェクション方法。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、インジェクションの効率を向上し、装置構成を簡易にする場合に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施の形態１に係るインジェクション装置の概略構成を示す図である。
【図２−１】実施の形態１に係る移動ステージ周辺を拡大して示す斜視図である。
【図２−２】実施の形態１に係るシャーレホルダの構成を示す図である。
【図２−３】実施の形態１に係るシャーレの位置合わせを説明する図である。
【図２−４】実施の形態１に係るシャーレホルダの他の構成を示す図である。
【図３】シャーレ内の細胞の様子を示す図である。
【図４】インジェクションの概念を説明する図である。
【図５−１】インジェクションの基本動作を説明する図である。
【図５−２】図５−１に続く図である。
【図６】実施の形態１に係る画像処理部の内部構成を示すブロック図である。
【図７】実施の形態１に係る画像処理部の動作を示すフロー図である。
【図８】実施の形態１に係る合成画像生成処理を示すフロー図である。
【図９】実施の形態１に係る合成画像の生成過程を示す図である。
【図１０】実施の形態１に係る合成画像の範囲変更を説明する図である。
【図１１】実施の形態１に係る合成画像の周縁強調の例を示す図である。
【図１２−１】実施の形態１に係る画像の境界上にある細胞の例を示す図である。
【図１２−２】実施の形態１に係る画像の境界上にある細胞に対する処理を示す図である。
【図１３】実施の形態１に係る中央画像生成処理を示すフロー図である。
【図１４−１】実施の形態１に係る中央画像の生成動作を示す図である。
【図１４−２】実施の形態１に係る中央画像の生成過程を示す図である。
【図１５】実施の形態１に係るモニタの表示例を示す図である。
【図１６】実施の形態１に係るインジェクション位置の指定方法の例を示す図である。
【図１７】実施の形態１に係るマーキングの例を示す図である。
【図１８】実施の形態１に係る差分画像の生成過程を示す図である。
【図１９】実施の形態２に係る画像処理部の内部構成を示すブロック図である。
【図２０−１】実施の形態２に係るマップの生成過程の一例を示す図である。
【図２０−２】実施の形態２に係るマップの一例を示す図である。
【図２１】実施の形態２に係るマップの他の一例を示す図である。
【図２２】実施の形態２に係るマップのさらに他の一例を示す図である。
【図２３−１】細胞の移動可能範囲を説明する図である。
【図２３−２】実施の形態２に係るマップのさらに他の一例を示す図である。
【図２４】マイクロインジェクション装置の一例を示す模式図である。
【図２５−１】細胞密度が高い状態の一例を示す図である。
【図２５−２】インジェクションに適した細胞密度を説明する図である。
【符号の説明】
【００９６】
１０２ 移動ステージ
１０４ 対物レンズ
１０５ キャピラリ
１０８ ＣＣＤカメラ
１０９ 画像処理部
１１０ 制御部
１１１ モニタ
４０１ 画像取得部
４０２ 撮影位置取得部
４０３ 画像配置部
４０４ 周縁検出部
４０５ 合成画像加工部
４０６ 再撮影位置指示部
４０７ 合成画像出力部
４０８ 中央画像加工部
４０９ 中央画像出力部
４１０ インジェクション位置取得部
４１１ マーキング部
４１２ 差分画像生成部
４１３ 判定部
５０１ マップ生成部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、細胞を含む画像を表示するインジェクション装置およびインジェクション方法に関し、特に物質の注入の効率を向上し、装置構成を簡易にすることができるインジェクション装置およびインジェクション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内に遺伝子を直接注入することにより、細胞の遺伝情報を改変する研究が盛んに行われている。この研究が進めば、遺伝子の役割が解明されるとともに、例えば個人の遺伝的特性に適合した遺伝子治療を行うテーラメード医療が可能となる。細胞内に遺伝子を注入する方式としては、電気的な方法（エレクトロポレーション）、化学的な方法（リポフェクション）、生物的な方法（ベクター法）、機械的な方法（マイクロインジェクション）、および光学的な方法（レーザインジェクション）などが提案されている。しかし、電気的な方式は、大電流を流して細胞膜を破るため細胞へのダメジが大きく、化学的な方式は、導入可能な遺伝子に制限があるため効率が悪く、生物的な方法は、すべての材料を導入できずに安全性が確認できないなどの欠点がある。一方で、機械的な方法は、最も安全で効率が高い方法として注目されている。
【０００３】
機械的な方法（マイクロインジェクション）においては、例えば特許文献１に開示されているように、顕微鏡による細胞の拡大像がカメラによって撮影され、操作者が撮影された画像をモニタで確認しながらキャピラリと呼ばれる針の位置を決定し、キャピラリを細胞に穿刺することによって遺伝子を注入する。
【０００４】
図２４は、従来のマイクロインジェクション装置の構成を模式的に示す図である。同図に示すマイクロインジェクション装置においては、付着細胞が投入された培養液で満たされたシャーレ１が水平方向に移動自在な移動ステージ２の上に載置されている。光源３からの光が照射されたシャーレ１内の付着細胞は、対物レンズ部４のレボルバ４ｃに取り付けられた対物レンズ４ａまたは対物レンズ４ｂ（図２４においては対物レンズ４ｂ）によって拡大される。対物レンズ４ａまたは対物レンズ４ｂによって拡大された細胞の拡大像は、反射鏡６によってカメラ８が固定されている方向へ投影され、結像レンズ７によってカメラ８のレンズの位置に結像する。
【０００５】
結像した細胞の拡大像は、カメラ８によって撮影され、図示しないモニタなどに表示される。操作者は、図示しないモニタに表示された細胞の拡大像を確認しながら、キャピラリ５がシャーレ１内の細胞に穿刺されるように、移動ステージ２を移動させてシャーレ１の位置を調整し、位置が決定するとキャピラリ５を穿刺して遺伝子などの薬剤を細胞に注入する。
【０００６】
このようなマイクロインジェクション装置においては、インジェクションの目的に応じて細胞内の核や細胞質を区別してインジェクションする必要がある。そのためには、およそ数十μｍ（マイクロメートル）程度の大きさの細胞内において、各細胞小器官の位置を正確に確認してキャピラリ５の制御を行わなければならず、高倍率の対物レンズを使用する必要がある。このため、マイクロインジェクション装置においては、一般にレボルバ４ｃに倍率が異なる複数の対物レンズ４ａ、４ｂが取り付けられており、レボルバ４ｃを図２４における矢印方向に回転させて、所望の倍率の対物レンズで細胞を拡大するようになっている。
【０００７】
【特許文献１】特許第２５５３１５０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、通常、シャーレは細胞と比較して非常に大きいため、インジェクションを行う際には、インジェクション対象の細胞が存在する観測領域をシャーレ内から適切に定めなくてはならない。このとき、観測領域では、個々の細胞を区別して観測できる程度の細胞密度であることが要求される。すなわち、例えば図２５−１に示すように、細胞が密集しており個々の細胞が重なっている領域や、逆に図２５−２の枠１１のように細胞が存在していない領域を観測領域として定めることなく、図２５−２の枠１２のように適度な細胞密度の領域を探索する必要がある。適度な細胞密度の領域を探索するためには、高倍率の対物レンズでは視野が狭く効率が悪いため、レボルバを回転させて低倍率かつ広視野の対物レンズに切り替えられることになる。
【０００９】
しかしながら、適切な観測領域の探索とインジェクションとを交互に繰り返して複数の細胞に対してインジェクションを行う場合には、その都度高倍率の対物レンズと低倍率の対物レンズとを切り替えなくてはならず、手間がかかるという問題がある。その結果、インジェクションの効率が低下し、時間がかかってしまう。また、倍率が異なる複数の対物レンズが必要であるため、これらが取り付けられるレボルバも必要となり、装置の構成が複雑になる。
【００１０】
本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、インジェクションの効率を向上し、装置構成を簡易にすることができるインジェクション装置およびインジェクション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、前記第１生成手段によって生成された広視野画像および前記第２生成手段によって生成された狭視野画像を並べて表示する表示手段とを有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、上記発明において、前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段と、前記入力手段によって物質注入位置が入力されると、直後に前記微小針を用いて前記物質注入位置に物質を注入するインジェクション手段とをさらに有し、前記第２生成手段は、前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に所定のマークを合成することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は、上記発明において、物質注入前後に前記第２生成手段によって生成される狭視野画像の差分画像を生成する第３生成手段と、前記第３生成手段によって生成された差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定する判定手段とをさらに有し、前記第２生成手段は、前記判定手段による判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する加工を行うことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、上記発明において、１つの格子が前記狭視野画像１つに対応し、前記広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップであって、インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成する第４生成手段をさらに有し、前記表示手段は、前記第４生成手段によって生成されたマップを前記広視野画像および前記狭視野画像とともに表示することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明は、培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、前記第１生成工程にて生成された広視野画像および前記第２生成工程にて生成された狭視野画像を並べて表示する表示工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、培地内の指定位置を撮影し、指定位置および指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成し、指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成し、生成された広視野画像および狭視野画像を並べて表示する。このため、操作者は、広視野画像を確認しながらインジェクションに適した細胞密度の観測領域を探索することができるとともに、狭視野画像を確認しながら詳細なインジェクション位置を決定することができ、インジェクションの効率を向上することができる。また、同じ倍率の画像を用いて広視野画像および狭視野画像を生成することができ、異なる倍率の対物レンズを不要にして、装置構成を簡易にすることができる。
【００１７】
また、本発明によれば、表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力し、物質注入位置が入力されると、直後に微小針を用いて物質注入位置に物質を注入し、狭視野画像の物質注入位置に所定のマークを合成するため、入力された物質注入位置の座標を記憶しておく必要がないとともに、狭視野画像において物質注入位置を確認することができる。
【００１８】
また、本発明によれば、物質注入前後に生成される狭視野画像の差分画像を生成し、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定し、判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する。このため、インジェクションによって大きく変形した細胞を他の細胞と区別して確認することができるため、容易にインジェクションの効果の有無を把握することができる。
【００１９】
また、本発明によれば、１つの格子が狭視野画像１つに対応し、広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップであって、インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成し、生成されたマップを広視野画像および狭視野画像とともに表示するため、広視野画像および狭視野画像に対応する観測領域の大まかな位置関係を把握するとともに、インジェクションが完了していない領域の位置を容易に確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係るインジェクション装置の概略構成を示す図である。同図に示すインジェクション装置は、シャーレ１０１が載置される移動ステージ１０２、光源１０３、対物レンズ１０４、キャピラリ１０５、反射鏡１０６、結像レンズ１０７、ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）カメラ１０８、画像処理部１０９、制御部１１０、モニタ１１１、および位置入力部１１２を有している。
【００２２】
移動ステージ１０２は、水平方向に移動自在に設けられており、制御部１１０の制御に従って、上面に載置されたシャーレ１０１の位置を調整する。光源１０３は、制御部１１０の制御に従ってシャーレ１０１へ光を照射し、シャーレ１０１内の細胞の観測に必要な光量を与える。
【００２３】
対物レンズ１０４は、シャーレ１０１内の細胞を拡大する高倍率かつ狭視野のレンズである。対物レンズ１０４の倍率は、例えば視野内に細胞が４〜５個程度含まれる程度であり、個々の細胞および細胞小器官が明確に観測可能な程度である。また、対物レンズ１０４は、制御部１１０の制御に従って、シャーレ１０１内の細胞を拡大する際の焦点を調節する。
【００２４】
キャピラリ１０５は、シャーレ１０１側の先端が針状になっており、制御部１１０の制御に従って、シャーレ１０１内の位置入力部１１２に入力された位置にある細胞へ遺伝子などの物質を注入する。反射鏡１０６は、対物レンズ１０４によって拡大されて得られた拡大像をＣＣＤカメラ１０８の方向へ投影する。結像レンズ１０７は、対物レンズ１０４によって拡大されて得られた拡大像をＣＣＤカメラ１０８のレンズの位置で結像する。ＣＣＤカメラ１０８は、結像レンズ１０７によって結像した拡大像を撮影し、撮影した画像を画像処理部１０９へ出力する。
【００２５】
画像処理部１０９は、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影された画像に対して画像処理を施し、得られた画像を制御部１１０へ出力する。具体的には、画像処理部１０９は、複数の画像をつなぎ合わせて得られた合成画像と合成画像の中央の画像とを出力したり、画像内の細胞において検出された周縁を強調する画像を生成したり、焦点が異なる複数の画像を合成したりする。画像処理部１０９によるさらに具体的な画像処理については、後に詳述する。
【００２６】
制御部１１０は、画像処理部１０９から出力された画像をモニタ１１１に表示させる。また、制御部１１０は、画像処理部１０９および位置入力部１１２からの指示により、移動ステージ１０２を移動させたり、キャピラリ１０５によるインジェクションを行わせたり、対物レンズ１０４の焦点を調節させたり、光源１０３による光の照射・非照射を切り替えたりする。
【００２７】
モニタ１１１は、画像処理部１０９から制御部１１０へ出力された画像を表示する。このとき、モニタ１１１は、複数の画像がつなぎ合わされた合成画像と合成画像の中央に位置する中央画像とを並べて表示する。位置入力部１１２は、モニタ１１１を目視する操作者の操作を受け付け、操作者が指定する位置の撮影およびインジェクションなどが行われるような制御の実行を制御部１１０へ指示する。
【００２８】
図２−１は、シャーレ１０１および移動ステージ１０２を拡大して示す斜視図である。同図に示すように、シャーレ１０１は、シャーレホルダ２０１の中央に設けられた穴に嵌合された上で移動ステージ２０１の上面に載置される。このとき、シャーレホルダ２０１が移動ステージ１０２の上面に突設された位置合わせピン１０２ａに当接して載置されることで、シャーレ１０１の位置を常に固定することができる。さらに、シャーレホルダ２０１には、図２−２に示すように、図示しないバネによって中央の穴の中心方向へ加圧されたシャーレ押さえ２０１ａが形成されており、穴に嵌合されたシャーレ１０１の位置をさらに確実に固定することができる。
【００２９】
また、同一のシャーレ１０１を異なる装置の移動ステージ１０２に載置する場合には、例えば図２−３に示す位置合わせ部材２０２をシャーレホルダ２０１の中央の穴に設置し、位置合わせ部材２０２に穿設された透過孔２０２ａの座標が異なる装置間で再現されるよう調整することにより、常にシャーレ１０１の位置を固定することができる。なお、シャーレホルダ２０１の代わりに、図２−４に示すシャーレホルダ２０３を使用することにより、シャーレホルダ２０３に設けられた透過孔２０３ａの座標を調整すれば良く、位置合わせ部材が不要となる。さらに、移動ステージ１０２に押さえバネ１０２ｂを設けることにより、シャーレホルダ２０３が確実に位置合わせピン１０２ａに当接される。また、シャーレホルダ２０３にも押さえバネ２０３ｂを設けることにより、シャーレホルダ２０３におけるシャーレ１０１の位置も固定される。なお、位置合わせ部材２０２およびシャーレホルダ２０３の透過孔２０２ａおよび透過孔２０３ａの代わりに、例えば十字マークなどの所定のマークを用いても良い。
【００３０】
このように、シャーレ１０１の位置を常に同位置に固定することができるため、細胞のインジェクション後に一度シャーレ１０１を他所へ移動した場合でも、容易に移動ステージ１０２上での位置を再現して正確に効果の観測を行うことができる。
【００３１】
次に、上記のように構成されたインジェクション装置による一般的なインジェクションについて説明しておく。
【００３２】
図３に示すように、シャーレ１０１には培養液３０１が満たされており、培養液３０１に付着細胞が投入されると、一定時間後には細胞３０２がシャーレ１０１の上面に付着する。細胞３０２は、核３０２ａと様々な細胞小器官を含む細胞質３０２ｂとから構成されている。この細胞３０２の核３０２ａに、例えば遺伝子などの物質をインジェクションする際には、図４に示すようにキャピラリ１０５の先端が核３０２ａに穿刺され、物質が核３０２ａに注入される。なお、図４においては、培養液３０１の図示を省略している。
【００３３】
このとき、対物レンズ１０４によって拡大された拡大像は、例えば図５−１に示すようになっている。すなわち、キャピラリ１０５の先端の位置とインジェクション対象の細胞３０２の核３０２ａの位置とが合っていない。そこで、操作者は、位置入力部１１２を操作して、核３０２ａの位置をインジェクション位置として指定することにより、制御部１１０の制御によって移動ステージ１０２が移動し、図５−２に示すように、キャピラリ１０５の先端の位置と核３０２ａの位置とが同一直線上に並ぶ。その後、キャピラリ１０５が図５−２中の矢印方向へ動き、核３０２ａにキャピラリ１０５の先端が穿刺される。なお、ここでは、移動ステージ１０２が移動することにより、キャピラリ１０５の先端の位置と核３０２ａの位置とが同一直線上に並ぶものとしたが、キャピラリ１０５が移動するようにしても良い。このように、本実施の形態においては、インジェクションの位置指定後即座にインジェクションが実行されるため、指定されたインジェクション位置の座標を記憶しておく必要がない。
【００３４】
次いで、本実施の形態に係るインジェクション装置による画像処理について説明する。図６は、本実施の形態に係るインジェクション装置の画像処理部１０９の内部構成を示すブロック図である。同図に示すように、画像処理部１０９は、画像取得部４０１、撮影位置取得部４０２、画像配置部４０３、周縁検出部４０４、合成画像加工部４０５、再撮影位置指示部４０６、合成画像出力部４０７、中央画像加工部４０８、中央画像出力部４０９、インジェクション位置取得部４１０、マーキング部４１１、差分画像生成部４１２、および判定部４１３を有している。
【００３５】
画像取得部４０１は、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影された画像を取得し、画像配置部４０３または中央画像加工部４０８へ出力する。具体的には、画像取得部４０１は、移動ステージ１０２が一定時間内に移動しつつＣＣＤカメラ１０８によって撮影された観測領域探索用の画像を画像配置部４０３へ出力する一方、移動ステージ１０２が一定時間以上停止してＣＣＤカメラ１０８によって撮影された観測用の画像を中央画像加工部４０８へ出力する。
【００３６】
撮影位置取得部４０２は、制御部１１０からＣＣＤカメラ１０８が画像を撮影した撮影位置の情報を取得する。画像配置部４０３は、撮影位置取得部４０２によって取得された撮影位置に従って画像取得部４０１から出力される複数の画像を配置し、観測領域探索用の合成画像を生成する。本実施の形態においては、画像配置部４０３は、縦横に３枚ずつ並ぶ合計９枚の画像を配置して合成画像を生成する。ただし、画像配置部４０３によって配置される画像の数は、例えば縦横に５枚ずつ並ぶ２５枚でも良いし、縦横の画像数が一致していなくても良い。このように、複数の画像を並べて配置することにより、周辺の細胞密度などの状況の把握が可能となる。
【００３７】
周縁検出部４０４は、画像配置部４０３において得られた合成画像において、微分処理などを含むエッジ検出を行い、合成画像内の細胞の周縁を検出する。合成画像加工部４０５は、画像配置部４０３において得られた合成画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。具体的には、合成画像加工部４０５は、合成画像において、周縁検出部４０４によって検出された細胞の周縁を例えば太線でトレースするなどして強調表示する。また、合成画像加工部４０５は、合成画像における個々の画像間の境界に位置する細胞について、細胞単位で再撮影された画像を上書き合成する。さらに、合成画像加工部４０５は、インジェクション後の細胞をインジェクション前の細胞と区別するために、マーキング部４１１の指示に従って、合成画像においてインジェクション後の細胞にマーキングする。
【００３８】
再撮影指示部４０６は、周縁検出部４０４による周縁検出の結果、周縁が合成画像の個々の画像間の境界に交差する細胞を抽出し、抽出した細胞を再撮影するように制御部１１０へ指示する。すなわち、再撮影指示部４０６は、合成画像において複数の画像間にまたがっている細胞を抽出し、この細胞の再撮影を指示する。この指示を受けた制御部１１０は、移動ステージ１０２を移動させ、指示された位置をＣＣＤカメラ１０８に撮影させる。合成画像出力部４０７は、合成画像加工部４０５によって合成画像が加工されると、加工後の合成画像を制御部１１０へ出力する。出力された合成画像は、制御部１１０の制御によってモニタ１１１に表示される。
【００３９】
中央画像加工部４０８は、画像取得部４０１から出力される観測用の画像をモニタ１１１に表示させるに際して、種々の加工を行う。なお、画像取得部４０１から出力される観測用の画像は、画像配置部４０３によって生成される合成画像の中央の画像に対応する位置の画像であるため、以後、観測用の画像を「中央画像」という。具体的は、中央画像加工部４０８は、焦点が異なる２枚の中央画像を合成し、細胞の細胞膜および細胞小器官の双方が明確になるように加工する。このとき、中央画像加工部４０８は、中央画像においてエッジ検出などを行い、細胞の周縁を強調表示しても良い。また、中央画像加工部４０８は、インジェクション後の細胞をインジェクション前の細胞と区別するために、マーキング部４１１の指示に従って、中央画像においてインジェクション後の細胞にマーキングする。さらに、中央画像加工部４０８は、判定部４１３からの指示に従い、インジェクションの効果が現れた細胞の色を変えるなどして区別可能にする。
【００４０】
中央画像出力部４０９は、中央画像加工部４０８によって中央画像が加工されると、加工後の中央画像を制御部１１０へ出力する。出力された中央画像は、制御部１１０の制御によって、合成画像とともにモニタ１１１に表示される。
【００４１】
インジェクション位置取得部４１０は、位置入力部１１２に入力されたインジェクション指定位置の情報、換言すれば、制御部１１０の制御によってキャピラリ１０５が穿刺されてインジェクションが実行された細胞の位置の情報を制御部１１０から取得する。マーキング部４１１は、合成画像加工部４０５および中央画像加工部４０８に指示をして、それぞれ合成画像および中央画像中のインジェクションが実行された細胞にマーキングをさせる。具体的には、マーキング部４１１は、合成画像中のインジェクションが実行された細胞を含む画像枠に着色させるとともに、中央画像中のインジェクションが実行された細胞の周縁に着色させたり細胞内の特定の位置に所定のマークを付加させたりする。
【００４２】
差分画像生成部４１２は、インジェクション前に中央画像中の細胞の画像を取得しておき、インジェクション後に同位置の中央画像が取得されると、同位置の細胞の画像を再び取得し、インジェクション前後の細胞の画像の差分の画像を生成する。すなわち、差分画像生成部４１２は、細胞中においてインジェクション前後で変化があった部分を示す差分画像を生成する。このとき、差分画像生成部４１２は、インジェクション前後の画像の濃淡の差分を求めて差分画像を生成しても良く、また、細胞の輪郭線の変化から形状の差分を求めて差分画像を生成しても良い。判定部４１３は、差分画像の大きさを所定のしきい値と比較し、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であれば、インジェクションが適切に行われたと判定する一方、差分画像の大きさが所定のしきい値未満であれば、インジェクションが適切に行われなかったと判定する。そして、判定部４１３は、インジェクションが適切に行われ、インジェクションの効果が現れた細胞を他の細胞と区別するように中央画像加工部４０８へ指示する。
【００４３】
次に、上記のように構成された画像処理部１０９による画像処理動作について、図７に示すフロー図を参照しながら説明する。
【００４４】
まず、操作者は、位置入力部１１２を操作して、移動ステージ１０２を所望の位置に移動させ、ＣＣＤカメラ１０８によって撮影するシャーレ１０１内の位置を指定する（ステップＳ１０１）。撮影位置が指定されると、ＣＣＤカメラ１０８によってシャーレ１０１の拡大像が撮影され、観測領域探索用の合成画像生成処理が行われる（ステップＳ１０２）。
【００４５】
合成画像生成処理は、図８に示すフロー図の手順に従って実行される。すなわち、ＣＣＤカメラ１０８によって、例えば図９に示すように、指定された撮影位置を中心とした周辺の９画像が順次撮影される（ステップＳ２０１）。このとき、制御部１１０によって移動ステージ１０２の移動が制御され、例えば図９における右上の画像から左下の画像の領域が順次撮影され、撮影された画像は、画像取得部４０１によって取得され、画像配置部４０３へ出力される。また、撮影位置取得部４０２によって、制御部１１０から９画像それぞれの撮影位置が取得され、画像配置部４０３へ出力される。なお、上述したように、ここで撮影されるのは、必ずしも９画像でなくても良い。
【００４６】
そして、画像配置部４０３によって、９画像が撮影位置に応じて配置され（ステップＳ２０２）、得られた合成画像は、合成画像加工部４０５に保持されるとともに合成画像出力部４０７から出力され、制御部１１０を介してモニタ１１１に表示される。このとき、合成画像の画像サイズは、モニタ１１１に表示可能なように適宜縮小される。したがって、対物レンズ１０４の倍率は高倍率であっても、モニタ１１１に表示される合成画像の実質的な倍率は、対物レンズ１０４の倍率よりも低いものとなる。
【００４７】
このとき、モニタ１１１には、例えば図１０に示すように、合成画像の周囲に８方向の矢印が表示されるようにしておき、操作者がモニタ１１１を確認しながら合成画像の範囲を変更できるようにしても良い。すなわち、例えば図１０の左図において、位置入力部１１２の操作により操作者が下の矢印を指定すると、移動ステージ１０２が再度移動しながらＣＣＤカメラ１０８によって再び９画像が取得され、図１０の右図のように、１画像分だけ合成画像の範囲が下方へ変更される。
【００４８】
その後、周縁検出部４０４によって合成画像からエッジ検出が行われ、合成画像中の細胞の輪郭線が検出される。検出された輪郭線は、合成画像加工部４０５によって、例えば図１１に示すように太線にされるなど強調され（ステップＳ２０３）、改めてモニタ１１１に表示される。さらに、周縁検出部４０４によって細胞の輪郭線が検出されると、再撮影位置指示部４０６によって、例えば図１２−１において黒枠で囲まれた細胞のように、複数の画像の境界をまたがって表示される細胞があるか否かが判断される（ステップＳ２０４）。この判断は、例えば図１２−２の上部画面の図に例示されるように、白丸の注目点を細胞の輪郭線に沿って移動させ、この注目点が画像の境界と交差する場合は、細胞が複数の画像の境界にあると判断することによって行われる。この結果、複数の画像の境界に細胞がある場合は、再撮影位置指示部４０６によって、この細胞の位置を再撮影するように制御部１１０へ指示される。なお、細胞が画像の境界にあるか否かの判断は、操作者がモニタ１１１に表示された合成画像を目視で確認し、画像の境界にある細胞の位置を位置入力部１１２に入力するなどとしても良い。
【００４９】
制御部１１０が再撮影位置指示部４０６からの指示を受け、移動ステージ１０２の位置を調節すると、ＣＣＤカメラ１０８によって、画像の境界にあった細胞が再撮影され、得られた画像が画像取得部４０１によって再取得される（ステップＳ２０５）。つまり、図１２−２において、上部画面と下部画面との境界にあった細胞の画像が再取得され（図１２−２の中図参照）、画像配置部４０３によって、再取得された画像が撮影位置に配置される。さらに、合成画像加工部４０５によって、再取得された画像が細胞を含む最小のサイズに切り取られた上で（図１２−２の右図参照）、合成画像加工部４０５に保持されている合成画像に上書き合成される（ステップＳ２０６）。こうして得られた合成画像は、改めてモニタ１１１に表示される。これにより、９画像の取得時における移動ステージ１０２の移動の誤差などによって画像の境界でずれて表示された細胞を正確な形状で表示することができる。
【００５０】
以上のステップＳ２０１からステップＳ２０６の処理により、細胞の輪郭線が強調され、複数の画像の境界にある細胞も正確な形状で表示される合成画像が生成される。この合成画像は、細胞内の微小な細胞小器官などを確認するには適さないものの、観測領域に適した細胞密度の領域を探索するのに適している。
【００５１】
再び図７に戻って、合成画像生成処理が完了すると、観測用の中央画像生成処理が行われる（ステップＳ１０３）。
【００５２】
中央画像生成処理は、図１３に示すフロー図の手順に従って実行される。すなわち、ＣＣＤカメラ１０８によって、合成画像の中央に位置する中央画像が取得される（ステップＳ３０１）。ここで取得される中央画像は、図１４−１のＡに示すように、対物レンズ１０４の焦点をシャーレ１０１の上面と細胞３０２の下面との境界に合わせた拡大像の画像である。
【００５３】
そして、制御部１１０の制御に従って、図１４−１のＢに示すように、細胞３０２の細胞膜周辺に対物レンズ１０４の焦点が合うように調整される（ステップＳ３０２）。焦点の調整後、ＣＣＤカメラ１０８によって、再び中央画像が取得される（ステップＳ３０３）。
【００５４】
細胞３０２は、シャーレ１０１に密着しているが、外周がシャーレ１０１の上面から少し立ち上がった形状をしており、その厚さはおよそ５μｍ程度である。このとき、図１４−１のＡに示す位置に焦点が合っていると、例えば図１４−２のＡ画像のように、シャーレ１０１の上面に付着する細胞内の微小な細胞小器官が明確な画像が得られる。一方、対物レンズ１０４の焦点を２〜５μｍ程度上方に調整し、図１４−１のＢに示す位置に焦点が合っていると、例えば図１４−２のＢ画像のように、細胞３０２の細胞膜が明確な画像が得られる。そこで、焦点が異なる２つの画像が中央画像加工部４０８によって合成されることにより（ステップＳ３０４）、図１４−２のように、細胞の輪郭線と内部の細胞小器官との双方が明確な中央画像が得られる。
【００５５】
以上のステップＳ３０１からステップＳ３０４の処理により、細胞の輪郭線および内部の細胞小器官の双方が明確な中央画像が生成される。この中央画像は、細胞内の微小な細胞小器官などを確認するのに適している。
【００５６】
再び図７に戻って、合成画像生成処理および中央画像生成処理によって生成された合成画像および中央画像は、図１５に示すように、モニタ１１１に並べて表示される（ステップＳ１０４）。合成画像および中央画像がモニタ１１１に表示された後も、上述したように操作者によって合成画像の範囲が変更されれば、随時ステップＳ１０２の合成画像生成処理が行われ、これに伴って、ステップＳ１０３の中央画像生成処理が行われる。また、中央画像については、常に更新が繰り返されており、シャーレ１０１内の細胞の最新の状態がモニタ１１１に表示されることになる。
【００５７】
このように、モニタ１１１に合成画像および中央画像が並んで表示されるため、操作者は、合成画像を確認しながら細胞密度が適切な観測領域を探索しつつ、適切な観測領域を中央画像で確認してインジェクションを実行することができる。インジェクション実行の際には、操作者は、モニタ１１１の中央画像を確認しながら位置入力部１１２を操作し、例えば図１６に示すように、十字マークなどによって中央画像中のインジェクションを希望する位置を指定する（ステップＳ１０５）。この指定は、制御部１１０へ通知され、制御部１１０によって、移動ステージ１０２およびキャピラリ１０５が制御され、操作者の指定位置にインジェクションが実行される（ステップＳ１０６）。
【００５８】
インジェクション後、モニタ１１１に表示される合成画像および中央画像には、インジェクションが実行されたことを示すマーキングが施される（ステップＳ１０７）。すなわち、画像処理部１０９のインジェクション位置取得部４１０によって、制御部１１０からインジェクションされた位置の情報が取得され、マーキング部４１１によって、合成画像加工部４０５に保持された合成画像および中央画像加工部４０８に保持された中央画像にマーキングが施される。マーキングが施された合成画像および中央画像は、それぞれ合成画像出力部４０７および中央画像出力部４０９から制御部１１０へ出力され、モニタ１１１に表示される。マーキング部４１１によるマーキングは、例えば図１７に示すように、合成画像に関しては、インジェクションされた細胞を含む画像枠が強調表示され、中央画像に関しては、インジェクションされた細胞の輪郭線とインジェクション位置とが強調表示されるようにして行われる。このマーキングにより、操作者は、各画像枠および各細胞について既にインジェクションが行われたか否かを識別することができる。
【００５９】
以後、合成画像による観測領域の探索、中央画像によるインジェクション位置の指定、インジェクション、およびインジェクション位置のマーキングが繰り返され、所望数の細胞に対してインジェクションが実行される。所望数の細胞に対してインジェクションが実行されると、画像処理部１０９は、インジェクションの効果の判定を行う（ステップＳ１０８）。すなわち、差分画像生成部４１２によって、中央画像加工部４０８に保持されたインジェクション前後の中央画像から差分画像が生成され、判定部４１３によって、差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かが判定される。
【００６０】
差分画像生成部４１２による差分画像の生成は、例えば図１８に示すように、インジェクション前の中央画像における細胞の形状とインジェクション後の中央画像における細胞の形状との差分が求められることにより行われる。図１８においては、下図の斜線部分が差分画像として求められることになる。そして、判定部４１３によって、斜線部分の面積が所定のしきい値以上であるか否かが判定され、所定のしきい値以上であれば、インジェクションが適切に行われ効果が現れたと判定される。判定結果は、中央画像加工部４０８へ通知され、インジェクションの効果が現れた細胞については、他の細胞と区別可能なように着色されるなどの加工が施される。そして、この中央画像は、中央画像出力部４０９から制御部１１０へ出力され、モニタ１１１に表示される。これにより、操作者は、インジェクションの効果が現れた細胞を容易に確認することができる。なお、判定部４１３による判定結果を合成画像加工部４０５にも通知し、マーキング部４１１によるマーキングと同様に、インジェクションの効果が現れた細胞を含む画像枠を他の画像枠と区別可能に着色しても良い。
【００６１】
以上のように、本実施の形態によれば、指定された撮影位置の周辺の画像を取得し、取得された画像を合成して得られた合成画像と指定された撮影位置に対応する合成画像の中央に配置された中央画像とを並べてモニタに表示する。このため、周辺の状況を把握可能な合成画像を確認しながらインジェクションに適した観測領域を探索すると同時に、細胞の微小な構造を把握可能な中央画像を確認してインジェクションを実行することができ、対物レンズの切り替えなどの手間がかからず、インジェクションの効率を向上することができる。また、合成画像と中央画像とは、同一の対物レンズで拡大された拡大像から生成されるため、倍率が異なる複数の対物レンズを必要とせず、装置構成を簡易にすることができる。
【００６２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２の特徴は、インジェクション可能領域、インジェクション済み領域、および細胞の移動可能領域などが示された広域な格子状のマップを合成画像および中央画像とともに表示する点である。
【００６３】
本実施の形態に係るインジェクション装置の概略構成は、実施の形態１（図１）と同様であるため、その説明を省略する。本実施の形態においては、画像処理部１０９の内部構成が実施の形態１と異なっている。図１９は、本実施の形態に係るインジェクション装置の画像処理部１０９の内部構成を示すブロック図である。同図に示すように、本実施の形態に係る画像処理部１０９は、実施の形態１の画像処理部１０９にマップ生成部５０１を追加した構成を有している。
【００６４】
マップ生成部５０１は、合成画像加工部４０５に保持される合成画像から１つの格子が１つの画像枠に対応する広域の格子状のマップを生成する。１つの画像枠は１辺が例えば１００μｍ程度に対応するのに対し、マップは１辺が例えば２ｍｍ程度に対応する。マップ生成部５０１は、合成画像を構成する各画像枠内の細胞数から求められるインジェクションに適した細胞密度の画像枠、インジェクションが完了した画像枠、および細胞が移動可能な範囲の画像枠などをマップ上に示してモニタ１１１に表示させる。
【００６５】
本実施の形態においては、例えばインジェクション装置の起動時などに、マップに表示される範囲全体をＣＣＤカメラ１０８によって順次撮影し、各画像を並べた広域画像を生成しておく。
【００６６】
そして、インジェクションの適不適をマップ上に示すには、広域画像における各画像が例えば図２０−１に示すようなものである場合、マップ生成部５０１は、まず各画像枠内の細胞数をカウント・記録する。図２０−１において、各画像枠内の数字は、細胞の数を示している。なお、画像枠の境界上の細胞については、画像処理の簡略化のため、カウントしないものとしている。そして、マップ生成部５０１は、細胞数が例えば３〜１０個の画像枠に対応する格子をインジェクションに適した領域とし、細胞数が例えば０〜２または１１個以上の画像枠に対応する格子をインジェクションに適さない領域として、色を変えるなどしてマップ上に示す。このマップの一例を図２０−２に示す。図２０−２においては、例えば横線で示す範囲６０１がインジェクションに適した領域であり、縦線で示す範囲６０２がインジェクションに適さない領域である。
【００６７】
操作者は、このようなマップをモニタ１１１上で確認することにより、インジェクションを実行する際の対象範囲を大まかに決定し、位置入力部１１２を操作して実施の形態１における合成画像生成処理および中央画像生成処理を行う位置を指定することができる。
【００６８】
また、インジェクションが完了した画像枠をマップ上に示すには、マップ生成部５０１は、マーキング部４１１によって合成画像上でマーキングされた画像枠に対応する格子を着色して、例えば図２１に示すようなマップを生成する。図２１においては、斜線で示した格子がインジェクション済みの細胞を含む画像枠に対応している。これにより、操作者は、インジェクションが完了した範囲を大まかに把握することができる。
【００６９】
なお、画像枠内においてインジェクションされた細胞数をカウントし、その数に応じて格子の色を変えることにより、より詳細にインジェクションの状況を把握し、重点的に効果の有無を観測すべき領域を決定することができる。同時に、例えば図２２に示すように、上述したインジェクションの適不適もマップ上に示しておくことにより、操作者は、インジェクションを進めるべき領域の指針を得ることができる。このようなマップにおいては、すべての画像枠について細胞数をカウントして示す必要はなく、一定間隔の画像枠について細胞数をカウントした上で、統計処理により細胞数に応じた格子の着色を行っても良い。
【００７０】
また、細胞が移動可能な範囲の画像枠をマップ上に示すには、細胞の活動度・移動速度に応じた範囲の格子を着色すれば良い。ここで、細胞は、移動する可能性があるため、インジェクション後に同位置を観測しても細胞が存在しないことがある。しかし、細胞の移動速度には限度があるため、例えば図２３−１のように、黒色で示す格子にある細胞は、最大でも図中矢印で示す距離程度しか移動することはない。そこで、図２３−１に斜線で示す範囲の格子を細胞の移動可能範囲として着色すれば、インジェクション後に効果を観測する際にも、インジェクション前後で観測対象の細胞数が異なってしまうことなどがなく、効率的な観測を行うことができる。このようにマップ上に細胞の移動可能範囲を示した例を図２３−２に示す。図２３−２においては、黒色の格子がインジェクション時に細胞が存在した領域に対応しており、斜線で示す格子が細胞の移動可能領域に対応している。
【００７１】
以上のように、本実施の形態によれば、より広域な格子状のマップにインジェクションの適不適、インジェクションの完了状況、および細胞の移動可能範囲などを示すため、さらにインジェクションの効率を向上することができる。
【００７２】
（付記１）培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、
培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、
前記第１生成手段によって生成された広視野画像および前記第２生成手段によって生成された狭視野画像を並べて表示する表示手段と
を有することを特徴とするインジェクション装置。
【００７３】
（付記２）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に所定のマークを合成することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７４】
（付記３）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記入力手段によって物質注入位置が入力されると、直後に前記微小針を用いて前記物質注入位置に物質を注入することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７５】
（付記４）前記第１生成手段は、
広視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された細胞の周縁を前記広視野画像において強調表示する加工を行う加工手段と
を有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７６】
（付記５）前記第２生成手段は、
狭視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出して強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７７】
（付記６）前記第２生成手段は、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる複数の焦点が異なる画像を合成して狭視野画像を生成することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００７８】
（付記７）前記第２生成手段は、
前記撮影手段によって得られる焦点が細胞の表面に合った画像と前記撮影手段によって得られる焦点が細胞の表面より細胞内側へ２〜５μｍずれた位置に合った画像とを合成して狭視野画像を生成することを特徴とする付記６に記載のインジェクション装置。
【００７９】
（付記８）前記第１生成手段は、
広視野画像におけるエッジ検出により細胞の周縁を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された細胞の周縁が広視野画像を構成する画像の境界と交差する場合に、この細胞の位置を前記撮影手段に再撮影位置として指示する指示手段と、
前記撮影手段によって再撮影されて得られる画像を前記広視野画像の前記再撮影位置に上書き合成する加工手段と
を有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８０】
（付記９）前記加工手段は、
前記再撮影手段によって再撮影されて得られる画像から細胞を含む最小領域を切り取った上で前記広視野画像の前記再撮影位置に上書き合成することを特徴とする付記８に記載のインジェクション装置。
【００８１】
（付記１０）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記狭視野画像の前記入力手段に入力された位置に存在する細胞の周縁を強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８２】
（付記１１）前記表示手段に表示された狭視野画像において物質を注入する位置を入力する入力手段をさらに有し、
前記第１生成手段は、
前記入力手段によって物質注入位置が入力された時に前記表示手段に表示されている狭視野画像に対応する画像枠を前記広視野画像において強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８３】
（付記１２）物質注入前後に前記第２生成手段によって生成される狭視野画像の差分画像を生成する第３生成手段と、
前記第３生成手段によって生成された差分画像の大きさが所定のしきい値以上であるか否かを判定する判定手段とをさらに有し、
前記第２生成手段は、
前記判定手段による判定の結果、差分画像の大きさが所定のしきい値以上である狭視野画像中の細胞を物質注入の効果が現れた細胞として強調表示する加工を行うことを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８４】
（付記１３）前記表示手段は、
前記広視野画像の周囲に指定位置の変更を誘導する所定の記号を表示し、
前記撮影手段は、
前記表示手段に表示された記号に応じて指定された指定位置を撮影することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８５】
（付記１４）１つの格子が前記狭視野画像１つに対応し、前記広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第４生成手段をさらに有し、
前記表示手段は、
前記第４生成手段によって生成されたマップを前記広視野画像および前記狭視野画像とともに表示することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００８６】
（付記１５）前記第４生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞数に応じて各狭視野画像に対応する格子を区別してマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８７】
（付記１６）前記第４生成手段は、
インジェクションされた細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８８】
（付記１７）前記第４生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞が移動可能な領域に対応する格子を他の格子と区別してマップを生成することを特徴とする付記１４に記載のインジェクション装置。
【００８９】
（付記１８）前記培地の容器の位置を調整する調整手段をさらに有することを特徴とする付記１に記載のインジェクション装置。
【００９０】
（付記１９）前記調整手段は、
前記容器を固定して保持する保持部材と、
前記保持部材に当接し、前記保持部材の位置を決定する突起と
を有することを特徴とする付記１８に記載のインジェクション装置。
【００９１】
（付記２０）前記調整手段は、
位置の基準となる所定のマークが形成された位置基準部材をさらに有し、前記所定のマークの位置を固定することを特徴とする付記１９に記載のインジェクション装置。
【００９２】
（付記２１）前記保持部材は、
位置の基準となる所定のマークを有し、前記所定のマークの位置を固定することを特徴とする付記１９に記載のインジェクション装置。
【００９３】
（付記２２）培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、
培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、
前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、
培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、
前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、
前記第１生成工程にて生成された広視野画像および前記第２生成工程にて生成された狭視野画像を並べて表示する表示工程と
を有することを特徴とするインジェクション方法。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、インジェクションの効率を向上し、装置構成を簡易にする場合に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施の形態１に係るインジェクション装置の概略構成を示す図である。
【図２−１】実施の形態１に係る移動ステージ周辺を拡大して示す斜視図である。
【図２−２】実施の形態１に係るシャーレホルダの構成を示す図である。
【図２−３】実施の形態１に係るシャーレの位置合わせを説明する図である。
【図２−４】実施の形態１に係るシャーレホルダの他の構成を示す図である。
【図３】シャーレ内の細胞の様子を示す図である。
【図４】インジェクションの概念を説明する図である。
【図５−１】インジェクションの基本動作を説明する図である。
【図５−２】図５−１に続く図である。
【図６】実施の形態１に係る画像処理部の内部構成を示すブロック図である。
【図７】実施の形態１に係る画像処理部の動作を示すフロー図である。
【図８】実施の形態１に係る合成画像生成処理を示すフロー図である。
【図９】実施の形態１に係る合成画像の生成過程を示す図である。
【図１０】実施の形態１に係る合成画像の範囲変更を説明する図である。
【図１１】実施の形態１に係る合成画像の周縁強調の例を示す図である。
【図１２−１】実施の形態１に係る画像の境界上にある細胞の例を示す図である。
【図１２−２】実施の形態１に係る画像の境界上にある細胞に対する処理を示す図である。
【図１３】実施の形態１に係る中央画像生成処理を示すフロー図である。
【図１４−１】実施の形態１に係る中央画像の生成動作を示す図である。
【図１４−２】実施の形態１に係る中央画像の生成過程を示す図である。
【図１５】実施の形態１に係るモニタの表示例を示す図である。
【図１６】実施の形態１に係るインジェクション位置の指定方法の例を示す図である。
【図１７】実施の形態１に係るマーキングの例を示す図である。
【図１８】実施の形態１に係る差分画像の生成過程を示す図である。
【図１９】実施の形態２に係る画像処理部の内部構成を示すブロック図である。
【図２０−１】実施の形態２に係るマップの生成過程の一例を示す図である。
【図２０−２】実施の形態２に係るマップの一例を示す図である。
【図２１】実施の形態２に係るマップの他の一例を示す図である。
【図２２】実施の形態２に係るマップのさらに他の一例を示す図である。
【図２３−１】細胞の移動可能範囲を説明する図である。
【図２３−２】実施の形態２に係るマップのさらに他の一例を示す図である。
【図２４】マイクロインジェクション装置の一例を示す模式図である。
【図２５−１】細胞密度が高い状態の一例を示す図である。
【図２５−２】インジェクションに適した細胞密度を説明する図である。
【符号の説明】
【００９６】
１０２ 移動ステージ
１０４ 対物レンズ
１０５ キャピラリ
１０８ ＣＣＤカメラ
１０９ 画像処理部
１１０ 制御部
１１１ モニタ
４０１ 画像取得部
４０２ 撮影位置取得部
４０３ 画像配置部
４０４ 周縁検出部
４０５ 合成画像加工部
４０６ 再撮影位置指示部
４０７ 合成画像出力部
４０８ 中央画像加工部
４０９ 中央画像出力部
４１０ インジェクション位置取得部
４１１ マーキング部
４１２ 差分画像生成部
４１３ 判定部
５０１ マップ生成部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、
培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、
１つの格子が前記第２生成手段によって生成される狭視野画像１つに対応し、前記第１生成手段によって生成される広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第３生成手段と、
前記第１生成手段によって生成された広視野画像、前記第２生成手段によって生成された狭視野画像、および前記第３生成手段によって生成されたマップを並べて表示する表示手段と
を有することを特徴とするインジェクション装置。
【請求項２】
前記第３生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞数に応じて各狭視野画像に対応する格子を区別してマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項３】
前記第３生成手段は、
物質注入された細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項４】
前記第３生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞が移動可能な領域に対応する格子を他の格子と区別してマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項５】
培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、
培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、
前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、
培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、
前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、
１つの格子が前記第２生成工程にて生成される狭視野画像１つに対応し、前記第１生成工程にて生成される広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第３生成工程と、
前記第１生成工程にて生成された広視野画像、前記第２生成工程にて生成された狭視野画像、および前記第３生成工程にて生成されたマップを並べて表示する表示工程と
を有することを特徴とするインジェクション方法。
【請求項１】
培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション装置であって、
培地内の指定位置を撮影する撮影手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成手段と、
前記撮影手段によって前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成手段と、
１つの格子が前記第２生成手段によって生成される狭視野画像１つに対応し、前記第１生成手段によって生成される広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第３生成手段と、
前記第１生成手段によって生成された広視野画像、前記第２生成手段によって生成された狭視野画像、および前記第３生成手段によって生成されたマップを並べて表示する表示手段と
を有することを特徴とするインジェクション装置。
【請求項２】
前記第３生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞数に応じて各狭視野画像に対応する格子を区別してマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項３】
前記第３生成手段は、
物質注入された細胞が存在する狭視野画像対応の格子を他の格子と区別したマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項４】
前記第３生成手段は、
前記狭視野画像中に存在する細胞が移動可能な領域に対応する格子を他の格子と区別してマップを生成することを特徴とする請求項１記載のインジェクション装置。
【請求項５】
培地内の細胞に微小針を用いて物質を注入する際に、前記細胞を含む画像を表示するインジェクション方法であって、
培地内の指定位置および前記指定位置の周辺を撮影する第１撮影工程と、
前記第１撮影工程にて前記指定位置および前記指定位置の周辺が撮影されて得られる複数の画像を合成して広視野画像を生成する第１生成工程と、
培地内の前記指定位置を撮影する第２撮影工程と、
前記第２撮影工程にて前記指定位置が撮影されて得られる画像を用いて狭視野画像を生成する第２生成工程と、
１つの格子が前記第２生成工程にて生成される狭視野画像１つに対応し、前記第１生成工程にて生成される広視野画像に含まれる領域以上の領域に対応する格子状のマップを生成する第３生成工程と、
前記第１生成工程にて生成された広視野画像、前記第２生成工程にて生成された狭視野画像、および前記第３生成工程にて生成されたマップを並べて表示する表示工程と
を有することを特徴とするインジェクション方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１】
【図２２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４】
【図２５−１】
【図２５−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１】
【図２２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４】
【図２５−１】
【図２５−２】
【公開番号】特開２００７−１７５０４６（Ｐ２００７−１７５０４６Ａ）
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６６６０６（Ｐ２００６−６６６０６）
【出願日】平成１８年３月１０日（２００６．３．１０）
【分割の表示】特願２００５−３８００３９（Ｐ２００５−３８００３９）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１０日（２００６．３．１０）
【分割の表示】特願２００５−３８００３９（Ｐ２００５−３８００３９）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
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