インターロイキン６リセプター抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤
【課題】新規な骨吸収抑制剤を提供する。
【解決手段】インターロイキン６リセプターに対する抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤。この骨吸収抑制剤は、インターロイキン６及びインターロイキン６リセプターの共存下での破骨細胞の形成を抑制するため骨吸収作用を効果的に抑制し、骨吸収が関与する種々の疾患の治療剤として有効である。
【解決手段】インターロイキン６リセプターに対する抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤。この骨吸収抑制剤は、インターロイキン６及びインターロイキン６リセプターの共存下での破骨細胞の形成を抑制するため骨吸収作用を効果的に抑制し、骨吸収が関与する種々の疾患の治療剤として有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターロイキン６リセプターに対する抗体（以下、インターロイキン６リセプター抗体と称する）を有効成分とする骨吸収抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とによって基本的形状を変えることなく、新生骨と置換される。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼ばれ、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。
しかしながら、一度、骨形成と骨吸収とのバランスが失われると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈することとなる。
【０００３】
骨吸収の主役を担う破骨細胞はマクロファージ系の細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介して破骨細胞へと分化することによって形成されるが、この過程を促進する因子は骨吸収因子と呼ばれ、これまでに活性型ビタミンＤ3 、副甲状腺ホルモン、インターロイキン１（１Ｌ−１）、プロスタグランディンなどが知られている。
これ等の骨吸収因子を過剰投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏで破骨細胞数を増加、活性化させ、骨吸収を亢進することが知られている（例えば医学のあゆみ165:572-576,1993を参照）。
【０００４】
インターロイキン６（ＩＬ−６）はＢリンパ球系細胞の増殖を促進させるサイトカインとして発見され、その後Ｔリンパ球細胞の成熟化をも誘導することによって免疫系に影響を及ぼすことがわかった（例えばＬｏｔｚ等；J. Exp. Immunol. 18:1253-1258, 1988 を参照）。さらにはＩＬ−６は造血系幹細胞の分化誘導にも関与している等、さまざまな細胞機能に関与していることおよびＩＬ−６は種々の細胞から分泌されることから骨に対する影響も示唆されている。
【０００５】
Ｉｓｈｉｍｉ等は骨吸収因子のＩＬ−１や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の刺激によってマウス骨芽細胞は多量のＩＬ−６を産生し、その結果ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨吸収が惹起されることを報告した（J. Immunol.,145:3297-3803, 1990 ）。またＩＬ−６はマウス頭頂骨に対し骨吸収活性を示すことも知られており（J. Immunol.,145:3297-3803, 1990 ）、さらにはＩＬ−６遺伝子を移入したＣＨＯ細胞をマウスに移植すると、高Ｃａ血症を呈すると報告されている（Endocrinology, 128:2657-2659, 1991）。
【０００６】
しかしながらＡｌ−ｈｕｍｉｄａｎ等やＢａｒｔｏｎ等はＩＬ−６添加によってもマウス頭頂骨の骨吸収作用は見られなかったと報告しており（J Bone Miner Res 6:3-8, 1991およびCytokine 2:217-220, 1990）、さらにはＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＴＮＦα、またはＩＬ−１によって刺激された骨芽細胞はＩＬ−６を産生するが、ＩＬ−６は骨芽細胞様細胞の分化増殖については何らの作用をも示さなかったことから、骨芽細胞から産生されたＩＬ−６は骨芽細胞の増殖や分化に影響しないと報告している（J Bone Miner Res 6:141-148, 1991）。
【０００７】
さらにＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等はＰＴＨ刺激により骨芽細胞のＩＬ−６産生は増加したものの、ＩＬ−６リセプター（ＩＬ−６Ｒ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）量は増加しなかったと述べている（Endocrinology, 129:1513-1520, 1991）。
従って、ＩＬ−６と骨吸収の関係については使用する材料や実験系によって相反する結果が報告されており、未だその関係は解明されていない（詳細はＲｏｏｄｍａｎの総説：J Bone Miner Res 7:475-478, 1992を参照）。
【０００８】
最近、Ｍａｎｏｌａｇａｓ等はｉｎ ｖｉｔｒｏでエストロゲンがＩＬ−６の産生を抑制する事（J.C.I. 89:883-891, 1992 ）、あるいは卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットの破骨細胞数の増加をエストロゲンや抗ＩＬ−６抗体が抑制する事（Science 257:88-91, 1992 ）を報告している。しかしながら、これ等の報告では増加した破骨細胞が骨吸収作用を有する程度に活性化（成熟細胞化）されているか否かについては何らのデータもなく、従ってＩＬ−６が生体内での骨吸収に直接関与しているかは依然として不明である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者等はＩＬ−６の骨吸収における役割を鋭意研究してきたがヒトＩＬ−６を強制発現させたトランスジェニックマウスでは高Ｃａ血症や破骨細胞形成の亢進が認められなかったことから、ＩＬ−６以外の因子の寄与について研究した結果、ＩＬ−６は単独では破骨細胞形成促進作用を殆ど示さないのに対しＩＬ−６Ｒの存在下では強力な破骨細胞形成作用を持つこと、さらにはこの破骨細胞形成作用が抗ＩＬ−６Ｒ抗体を添加することによって抑制されることを見い出し、発明を完成させた。
すなわち本願発明はインターロイキン６リセプター抗体（ＩＬ−６Ｒ抗体）を有効成分として含有する骨吸収抑制剤に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞のＩＬ−６依存性増殖に対する抗体ＭＲ１６−１及びＲＳ１２の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＯＶＸ（２週）マウスからの骨髄液の骨吸収活性に対する、抗体の中和効果を示すグラフである。
【図３】図３は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又は可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）単独による効果を示すグラフである。
【図４】図４は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又はｓＲ３２４の併用の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）の共存下でのマウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養による破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＩＬ−６，可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）およびＩＬ−１αの共存下での45Ｃａ放出に対する、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願発明で使用される抗ＩＬ−６Ｒ抗体は骨吸収抑制効果を有する限り、抗原や抗体の由来（動物種の相異）を問わない。
抗ＩＬ−６Ｒ抗体は公知の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナルタイプの抗体として得ることができる。例えば抗ヒトＩＬ−６Ｒポリクローナル抗体の場合は欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞中で形質発現させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒ蛋白を精製し、次いでその蛋白を感作抗原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫させることによって得ることができる。
【００１２】
また抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体の場合は特開平３−１５５７９５号に開示された遺伝子配列を使って、上記と同様な方法を用いて得ることができる。
一方、ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものと、細胞表層より離脱している（以下、可溶性と呼ぶ）ものとの２種類があり、可溶性ＩＬ−６Ｒは細胞膜上のＩＬ−６Ｒ蛋白に於ける細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域のうち細胞内領域が欠損している点で構造的に相異する。
【００１３】
従って本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のための抗原はこのような可溶性ＩＬ−６Ｒを含むものであり、これ等の可溶性ＩＬ−６Ｒは公知の手段により得ることができる（例えば、特開平４−９８８００号を参照）。
モノクローナル抗体の場合は、ＩＬ−６Ｒ蛋白を感作抗原として哺乳動物を免疫した後、その形質細胞（免疫細胞）をマウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中からＩＬ−６Ｒの作用を中和させるクローンを選別し、これを培養して目的の抗体を回収することによって得ることができる。
【００１４】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター等が使用される。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔J. Immunol.,123:1548, 1978〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81:1-7, 1978〕、ＮＳ−１〔Eur. J. Immunol.,6: 511-519, 1976 〕、ＭＰＣ−１１〔Cell, 8:405-415, 1976 〕、ＳＰ２／０〔Nature, 276,269-270, 1978 〕、ＦＯ〔J. Immunol. Meth.,35:1-21, 1980 〕，Ｓ１９４〔J. Exp. Med.,148:313-323, 1978〕、Ｒ２１０〔Nature, 277:131-133, 1979 〕等が好適に使用される。
【００１５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Methods Enzymol.,73:3-46, 1981〕等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００１６】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００１７】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００１８】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローン化が実施される。
【００１９】
さらには得られた抗体がヒト以外の動物に由来する抗体である場合は、その抗原認識部位（ＣＤＲ）を残したまま、ＦＲ部分や定常領域部分をヒト由来の抗体に変えた再構成ヒト型抗体とすることができ、ＩＬ−６Ｒ抗体のヒト型抗体の例としてはＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ ９２／１９７５９を挙げることができる。
【００２０】
本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体は投与する対象の動物種によって抗原であるＩＬ−６Ｒと抗体産生細胞との間で種間の組合せを選択できる。一般的にはヒトに対してはヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト細胞由来の抗体が、またマウスに対してはマウスＩＬ−６Ｒに対するマウス細胞由来の抗体が望ましいが、臨床上許容される限り、異なる種間の組合せであってもよい。
【００２１】
本発明の骨吸収抑制剤の活性成分である抗ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例２の実験３に示されるごとく、マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６Ｒの共存下での破骨細胞の形成を抑制する。また、本発明の骨吸収抑制剤の活性成分である抗ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例３に示すごとく、マウスＩＬ−６、マウス可溶性ＩＬ−６ＲおよびヒトＩＬ−１αの共存下での骨吸収を抑制する。
【００２２】
本願発明の骨吸収抑制剤はＩＬ−６Ｒによって惹起された骨吸収が抑制される限り、これ等の関与する各種骨代謝疾患の治療に有効である。それ等の疾患としては、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、腫瘍性高カルシウム血症、腎性骨異栄養症、ペーゼット症、骨転移、骨肉腫等を挙げることができる。
本願発明の骨吸収抑制剤は常用経路、例えば錠剤もしくはカプセル形態で経口的にまたは注射剤等の非経口的方法で全身または局所的に投与され得る。さらには少なくも１種の医薬用担体または希釈剤と共に医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００２３】
投与量は病態の程度や投与方法等によって異なり、適宜適当な量を選択することが必要であるが一般にヒトの場合、指示一日用量は約２５〜１００マイクログラムの範囲で４回以下の分割用量となっている。しかしながら本願の骨吸収抑制剤はこれ等の投与量に限定されるものではない。
なお、ＩＬ−６Ｒ抗体の毒性については現在まで、何らかの影響があるとの報告はなされていない。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明する。
参考例１ マウスＩＬ−６の調製
約１０8 個のＰ３８８Ｄ1 （ＩＬ−１）細胞（Nordan等、Science 233:566-569, 1986;Bazin 等、J. Immunol. 139:780-787, 1987 ）からＦａｓｔ ＴｒａｃｋTM（Invitrogen社製）ｋｉｔを用いたランダムプライミングにより二本鎖のＣＤＮＡを合成した。
【００２５】
さらにプライマーとして５′または３′末端に制限酵素ＢａｍＨ１の認識部位を持つマウスＩＬ−６遺伝子（J. Van Snick等、Eur. J. Immunol 18:193, 1988）の翻訳開始コドン（３４番目のＡＴＧ）を含む２１〜４３番目の配列及び終止コドン（６６７番目のＴＡＧ）を含む６５８〜６８３番目の配列に相補的なオリゴマーを合成した。
【００２６】
これ等のプライマーおよびＧｅｎｅ Ａｍｐ（宝酒造）ｋｉｔを用いて、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造）により、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間にて５０サイクルのＰＣＲを行なった。増幅された断片（０．６６ｋｂ）を低融点アガロースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨ１処理後、ＰＵＣ１９ベクターに導入し、サブクローニングした。マウスＩＬ６遺伝子をＢａｍＨ１で切り出した後、予めＢａｍＨ１処理したｐｄＲに組み込みＣＨＯ細胞に形質導入した。５０ｎＭ ＭＴＸ耐性のＣＨＯ細胞を選びその培養上清を実験に供した。
【００２７】
参考例２ マウス可溶性ＩＬ６リセプター抗体の調製
（１）Ｓａｉｔｏ等の方法（J. Immunol., 147:168-173 (1991))によって抗マウス可溶性ＩＬ−６リセプター抗体ＲＳ１２を得た。この抗体はＩｇＧ２ａサブクラスであった。
【００２８】
（２）上記Ｓａｉｔｏ等の文献に開示されたマウス可溶性ＩＬ−６リセプターを産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で培養し、その培養上清をＲＳ１２抗体とＡｆｆｉｇｅｌ １０ゲル（バイオラッド）に固定したアフィニティーカラムを用いて精製した。得られたマウス可溶性ＩＬ−６リセプター５０μｇをフロイント完全アジュバントと混合しウィスターラット（日本チャールズリバー）の腹部皮下に接種した。２週間後からはフロイント不完全アジュバントで追加免疫した。４５日目に屠殺し、その脾細胞約２×１０8 個を１×１０7 個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（ベーリンガーマンハイム）を用いて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ培地にてハイブリドーマを選択した。
【００２９】
ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（カッペル）をコートしたイミュノプレートにハイブリドーマ培養上清を加えた後、マウス可溶性ＩＬ−６Ｒを反応させ、次いでウサギ抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体およびアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体によるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６リセプターに対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。抗体の産生が確認されたものは２回のサブクローニングを行ない単一のクローン（ＭＲ１６−１）を得た。
【００３０】
このハイブリドーマが産生する抗体のマウスＩＬ−６に対する中和活性をＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞(Matsuda等、Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988)を用いた 3Ｈ−チミジンの取り込みで調べた。
９６穴プレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１×１０4 個／２００μｌ／ウエルとなるよう調製し、これにマウスＩＬ−６（１０pg／ml）とＭＲ１６−１抗体およびＲＳ１２抗体１２．３〜１０００ng／mlを加えて、３７℃、５％ＣＯ2 で４４時間培養した後、 3Ｈ−チミジン（ＩμＣｉ／ｗｅｌｌ）を加え４時間後の取り込みを測定した（図１）。
【００３１】
実施例１
８週齢の雌性ｄｄｙ系マウスに偽手術（ｓｈａｍ）または卵巣摘出術（ＯＶＸ）を行ない２週後に屠殺した。フェノールレッド不含αＭＥＭ培地を用い、脛骨および大腿骨より骨髄を採取し遠心分離により骨髄細胞を除いて骨髄液とした。骨髄液の骨吸収活性は45Ｃａでラベルしたマウス長管骨を用いた器官培養法により測定した。すなわち、母親マウスに45ＣａＣｌ2 を皮下投与することによって45Ｃａ標識された前腕骨を妊娠１７日令の胎児より採取し、フェノールレッド不含αＭＥＭ培地で５％ＣＯ2 ，３７℃にて器官培養した。
【００３２】
２４時間後、０．２％ＢＳＡを含むフェノールレッド不含αＭＥＭ培地と交換すると同時に骨髄液試料を４０％の割合で添加した。骨吸収活性はＳｈａｍ群では約２５％であったのに対し、ＯＶＸ群は約６０％であった。
そこで、この系を用いて、６６μｇ／mlのマウスＩＬ−６抗体およびＲＳ１２抗体で骨髄液試料を前処理（３７℃、２時間、５％ＣＯ2 ）して持続的添加を行った結果、両抗体ともＯＶＸ群に於いて骨吸収活性を阻害した（図２）。
【００３３】
実施例２
マウスの骨芽細胞と骨髄細胞との共存培養系〔Takahashi,等:Endocrinology 122:1373, 1988, Takahashi, 等:Endocrinology 123:2600, 1988 〕により形成される破骨細胞数を骨吸収の指標として用いた。
【００３４】
マウスの骨芽細胞は以下の方法により調製した。すなわち生後１または２日令のｄｄｙ系マウスから無菌的に取り出した頭蓋骨を０．１％コラゲナーゼ（細胞分散用、和光純薬）と０．２％ディスパーゼ（合同酒精）を含むＰＢＳに入れ３７℃の恒温槽にて１０分間振とうした。浮遊してきた細胞を集め、更に新しい酵素溶液を入れ１０分間酵素処理した。この酵素消化を５回繰返し、２〜５回目の消化で浮遊してきた細胞を骨芽細胞として回収した。
【００３５】
マウスの骨髄細胞は以下の方法により調製した。すなわち、６〜９週令のｄｄｙ系マウスからけい骨を無菌的に取りだし、その骨端を切り落とした。けい骨の遠位端より２５Ｇの針を付けたシリンジで１mlのα−最少必須培地（α−ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ社）を注入し、近位端より骨髄細胞を回収した。これらの細胞は共に１０％の牛胎児血清（Ｂｉｏｃｅｌｌ社）を含むα−ＭＥＭに懸濁して培養に用いた。
【００３６】
共存培養は、４８穴の培養プレートに１×１０4 細胞／０．５ｍ／ｗｅｌｌの骨芽細胞と２×１０5 細胞／ｗｅｌｌの骨髄細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 で６〜７日間培養した。形成された破骨細胞は破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）を染色することにより同定した〔Takahashi,等:Endocrinology 122:1373, 1988 〕。
【００３７】
これらの培養系にマウスＩＬ−６またはマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ〔ＩＬ−６ｓＲ（ｓＲ３２４）〕〔Saito,等 al.J Immunol,147:168-173 (1991)〕とマウスＩＬ−６Ｒ抗体（ＭＲ１６−１あるいはＲＳ１２）またはマウスＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ systems）を添加して以下の実験を行った。なお、マウスＩＬ−６とｓＲ３２４は、ＣＨＯ細胞にこれらの遺伝子を組み込んだ細胞の培養上清をそれぞれ用いた。培養上清中のマウスＩＬ−６およびＩＬ−６ｓＲ３２４はエンザイムイッムノアッセイによってそれぞれの濃度を測定し、α−ＭＥＭで適当な濃度に希釈して実験に供した。
【００３８】
実験１ マウスＩＬ−６又はマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ単独での破骨細胞形成実験
マウスＩＬ−６（０．２ng／ml〜２００ng／ml）とｓＲ３２４（０．５〜５００ng／ml）単独での破骨細胞形成能を調べたが、いずれも単独では破骨細胞形成能を示さなかった。なお、本実験系において陽性対象薬である活性型ビタミンＤ3 は有意な破骨細胞形成を示した（図３）。
【００３９】
実験２ マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ共存下での破骨細胞形成実験
２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に０．０５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた時の破骨細胞形成能を調べたところ、ｓＲ３２４の濃度に依存して著明な破骨細胞の形成が認められた（図４）。なお、形成された破骨細胞を象牙切片上で培養したところ多くの吸収窩が認められ、それらはカルシトニンの添加により抑制された。従って本実験系で形成された破骨細胞は骨吸収能とカルシトニンリセプターを有する成熟破骨細胞であると考えられた。
【００４０】
実験３ マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６リセプター共存下での破骨細胞形成に対するマウス抗ＩＬ−６リセプター抗体（ＭＲ１６−１もしくはＲＳ１２）またはマウス抗ＩＬ−６抗体の抑制効果
２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に６２．５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた時の破骨細胞形成能を調べたところ、実験２と同様にｓＲ３２４の濃度に依存して著明な破骨細胞の形成が認められた。２０ng／mlのマウスＩＬ−６と５００ng／mlのｓＲ３２４による破骨細胞形成に対してＭＲ１６−１は１ng／ml〜１００ng／mlの濃度範囲で濃度依存的な抑制作用を示した。ＲＳ１２およびマウス抗ＩＬ−６抗体は１０ng／mlと１００ng／mlで抑制作用を示した（図５）。
【００４１】
実施例３ マウスＩＬ−６、マウス可溶性ＩＬ−６リセプターおよびヒトＩＬ−１αの共存下で惹起される骨吸収に対する抗マウスＩＬ−６リセプター抗体（ＭＲ１６−１）の抑制効果
母親マウスに45ＣａＣｌ2 を皮下投与することによって45Ｃａ標識された頭蓋冠を妊娠１６日令の胎児より採取し、１mg／mlのＢＳＡを含むＢＧＪｂ培地で５％ＣＯ2 ，３７℃にて器官培養した。２４時間後、新たな培地に交換し、１００pg／mlのヒトＩＬ−１α，２０ng／mlのマウスＩＬ−６および５００ng／mlのマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）を添加して、３７℃，５％ＣＯ2 で５日間培養した。この場合、前記新たな培地に被験物質であるＭＲ１６−１を１０μｇ／ml添加した。この実験系で惹起される骨吸収を、１０μｇ／mlのＭＲ１６−１はほぼ完全に抑制した（図６）。
【００４２】
発明の効果
以上の通り、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする本発明の骨吸収抑制剤は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの共存下での破骨細胞の形成を抑制し、骨吸収阻害効果を有していることが証明される。従って、本発明の骨吸収抑制剤は、骨吸収が関与する各種骨代謝疾患、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、腫瘍性高カルシウム血症、腎性骨異栄養、ペーゼット症、骨転移、骨肉腫等の治療剤として期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターロイキン６リセプターに対する抗体（以下、インターロイキン６リセプター抗体と称する）を有効成分とする骨吸収抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とによって基本的形状を変えることなく、新生骨と置換される。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼ばれ、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。
しかしながら、一度、骨形成と骨吸収とのバランスが失われると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈することとなる。
【０００３】
骨吸収の主役を担う破骨細胞はマクロファージ系の細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介して破骨細胞へと分化することによって形成されるが、この過程を促進する因子は骨吸収因子と呼ばれ、これまでに活性型ビタミンＤ3 、副甲状腺ホルモン、インターロイキン１（１Ｌ−１）、プロスタグランディンなどが知られている。
これ等の骨吸収因子を過剰投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏで破骨細胞数を増加、活性化させ、骨吸収を亢進することが知られている（例えば医学のあゆみ165:572-576,1993を参照）。
【０００４】
インターロイキン６（ＩＬ−６）はＢリンパ球系細胞の増殖を促進させるサイトカインとして発見され、その後Ｔリンパ球細胞の成熟化をも誘導することによって免疫系に影響を及ぼすことがわかった（例えばＬｏｔｚ等；J. Exp. Immunol. 18:1253-1258, 1988 を参照）。さらにはＩＬ−６は造血系幹細胞の分化誘導にも関与している等、さまざまな細胞機能に関与していることおよびＩＬ−６は種々の細胞から分泌されることから骨に対する影響も示唆されている。
【０００５】
Ｉｓｈｉｍｉ等は骨吸収因子のＩＬ−１や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の刺激によってマウス骨芽細胞は多量のＩＬ−６を産生し、その結果ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨吸収が惹起されることを報告した（J. Immunol.,145:3297-3803, 1990 ）。またＩＬ−６はマウス頭頂骨に対し骨吸収活性を示すことも知られており（J. Immunol.,145:3297-3803, 1990 ）、さらにはＩＬ−６遺伝子を移入したＣＨＯ細胞をマウスに移植すると、高Ｃａ血症を呈すると報告されている（Endocrinology, 128:2657-2659, 1991）。
【０００６】
しかしながらＡｌ−ｈｕｍｉｄａｎ等やＢａｒｔｏｎ等はＩＬ−６添加によってもマウス頭頂骨の骨吸収作用は見られなかったと報告しており（J Bone Miner Res 6:3-8, 1991およびCytokine 2:217-220, 1990）、さらにはＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＴＮＦα、またはＩＬ−１によって刺激された骨芽細胞はＩＬ−６を産生するが、ＩＬ−６は骨芽細胞様細胞の分化増殖については何らの作用をも示さなかったことから、骨芽細胞から産生されたＩＬ−６は骨芽細胞の増殖や分化に影響しないと報告している（J Bone Miner Res 6:141-148, 1991）。
【０００７】
さらにＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等はＰＴＨ刺激により骨芽細胞のＩＬ−６産生は増加したものの、ＩＬ−６リセプター（ＩＬ−６Ｒ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）量は増加しなかったと述べている（Endocrinology, 129:1513-1520, 1991）。
従って、ＩＬ−６と骨吸収の関係については使用する材料や実験系によって相反する結果が報告されており、未だその関係は解明されていない（詳細はＲｏｏｄｍａｎの総説：J Bone Miner Res 7:475-478, 1992を参照）。
【０００８】
最近、Ｍａｎｏｌａｇａｓ等はｉｎ ｖｉｔｒｏでエストロゲンがＩＬ−６の産生を抑制する事（J.C.I. 89:883-891, 1992 ）、あるいは卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットの破骨細胞数の増加をエストロゲンや抗ＩＬ−６抗体が抑制する事（Science 257:88-91, 1992 ）を報告している。しかしながら、これ等の報告では増加した破骨細胞が骨吸収作用を有する程度に活性化（成熟細胞化）されているか否かについては何らのデータもなく、従ってＩＬ−６が生体内での骨吸収に直接関与しているかは依然として不明である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者等はＩＬ−６の骨吸収における役割を鋭意研究してきたがヒトＩＬ−６を強制発現させたトランスジェニックマウスでは高Ｃａ血症や破骨細胞形成の亢進が認められなかったことから、ＩＬ−６以外の因子の寄与について研究した結果、ＩＬ−６は単独では破骨細胞形成促進作用を殆ど示さないのに対しＩＬ−６Ｒの存在下では強力な破骨細胞形成作用を持つこと、さらにはこの破骨細胞形成作用が抗ＩＬ−６Ｒ抗体を添加することによって抑制されることを見い出し、発明を完成させた。
すなわち本願発明はインターロイキン６リセプター抗体（ＩＬ−６Ｒ抗体）を有効成分として含有する骨吸収抑制剤に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞のＩＬ−６依存性増殖に対する抗体ＭＲ１６−１及びＲＳ１２の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＯＶＸ（２週）マウスからの骨髄液の骨吸収活性に対する、抗体の中和効果を示すグラフである。
【図３】図３は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又は可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）単独による効果を示すグラフである。
【図４】図４は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又はｓＲ３２４の併用の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）の共存下でのマウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養による破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＩＬ−６，可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）およびＩＬ−１αの共存下での45Ｃａ放出に対する、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願発明で使用される抗ＩＬ−６Ｒ抗体は骨吸収抑制効果を有する限り、抗原や抗体の由来（動物種の相異）を問わない。
抗ＩＬ−６Ｒ抗体は公知の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナルタイプの抗体として得ることができる。例えば抗ヒトＩＬ−６Ｒポリクローナル抗体の場合は欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞中で形質発現させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒ蛋白を精製し、次いでその蛋白を感作抗原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫させることによって得ることができる。
【００１２】
また抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体の場合は特開平３−１５５７９５号に開示された遺伝子配列を使って、上記と同様な方法を用いて得ることができる。
一方、ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものと、細胞表層より離脱している（以下、可溶性と呼ぶ）ものとの２種類があり、可溶性ＩＬ−６Ｒは細胞膜上のＩＬ−６Ｒ蛋白に於ける細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域のうち細胞内領域が欠損している点で構造的に相異する。
【００１３】
従って本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のための抗原はこのような可溶性ＩＬ−６Ｒを含むものであり、これ等の可溶性ＩＬ−６Ｒは公知の手段により得ることができる（例えば、特開平４−９８８００号を参照）。
モノクローナル抗体の場合は、ＩＬ−６Ｒ蛋白を感作抗原として哺乳動物を免疫した後、その形質細胞（免疫細胞）をマウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中からＩＬ−６Ｒの作用を中和させるクローンを選別し、これを培養して目的の抗体を回収することによって得ることができる。
【００１４】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター等が使用される。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔J. Immunol.,123:1548, 1978〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81:1-7, 1978〕、ＮＳ−１〔Eur. J. Immunol.,6: 511-519, 1976 〕、ＭＰＣ−１１〔Cell, 8:405-415, 1976 〕、ＳＰ２／０〔Nature, 276,269-270, 1978 〕、ＦＯ〔J. Immunol. Meth.,35:1-21, 1980 〕，Ｓ１９４〔J. Exp. Med.,148:313-323, 1978〕、Ｒ２１０〔Nature, 277:131-133, 1979 〕等が好適に使用される。
【００１５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Methods Enzymol.,73:3-46, 1981〕等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００１６】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００１７】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００１８】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローン化が実施される。
【００１９】
さらには得られた抗体がヒト以外の動物に由来する抗体である場合は、その抗原認識部位（ＣＤＲ）を残したまま、ＦＲ部分や定常領域部分をヒト由来の抗体に変えた再構成ヒト型抗体とすることができ、ＩＬ−６Ｒ抗体のヒト型抗体の例としてはＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ ９２／１９７５９を挙げることができる。
【００２０】
本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体は投与する対象の動物種によって抗原であるＩＬ−６Ｒと抗体産生細胞との間で種間の組合せを選択できる。一般的にはヒトに対してはヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト細胞由来の抗体が、またマウスに対してはマウスＩＬ−６Ｒに対するマウス細胞由来の抗体が望ましいが、臨床上許容される限り、異なる種間の組合せであってもよい。
【００２１】
本発明の骨吸収抑制剤の活性成分である抗ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例２の実験３に示されるごとく、マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６Ｒの共存下での破骨細胞の形成を抑制する。また、本発明の骨吸収抑制剤の活性成分である抗ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例３に示すごとく、マウスＩＬ−６、マウス可溶性ＩＬ−６ＲおよびヒトＩＬ−１αの共存下での骨吸収を抑制する。
【００２２】
本願発明の骨吸収抑制剤はＩＬ−６Ｒによって惹起された骨吸収が抑制される限り、これ等の関与する各種骨代謝疾患の治療に有効である。それ等の疾患としては、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、腫瘍性高カルシウム血症、腎性骨異栄養症、ペーゼット症、骨転移、骨肉腫等を挙げることができる。
本願発明の骨吸収抑制剤は常用経路、例えば錠剤もしくはカプセル形態で経口的にまたは注射剤等の非経口的方法で全身または局所的に投与され得る。さらには少なくも１種の医薬用担体または希釈剤と共に医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００２３】
投与量は病態の程度や投与方法等によって異なり、適宜適当な量を選択することが必要であるが一般にヒトの場合、指示一日用量は約２５〜１００マイクログラムの範囲で４回以下の分割用量となっている。しかしながら本願の骨吸収抑制剤はこれ等の投与量に限定されるものではない。
なお、ＩＬ−６Ｒ抗体の毒性については現在まで、何らかの影響があるとの報告はなされていない。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明する。
参考例１ マウスＩＬ−６の調製
約１０8 個のＰ３８８Ｄ1 （ＩＬ−１）細胞（Nordan等、Science 233:566-569, 1986;Bazin 等、J. Immunol. 139:780-787, 1987 ）からＦａｓｔ ＴｒａｃｋTM（Invitrogen社製）ｋｉｔを用いたランダムプライミングにより二本鎖のＣＤＮＡを合成した。
【００２５】
さらにプライマーとして５′または３′末端に制限酵素ＢａｍＨ１の認識部位を持つマウスＩＬ−６遺伝子（J. Van Snick等、Eur. J. Immunol 18:193, 1988）の翻訳開始コドン（３４番目のＡＴＧ）を含む２１〜４３番目の配列及び終止コドン（６６７番目のＴＡＧ）を含む６５８〜６８３番目の配列に相補的なオリゴマーを合成した。
【００２６】
これ等のプライマーおよびＧｅｎｅ Ａｍｐ（宝酒造）ｋｉｔを用いて、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造）により、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間にて５０サイクルのＰＣＲを行なった。増幅された断片（０．６６ｋｂ）を低融点アガロースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨ１処理後、ＰＵＣ１９ベクターに導入し、サブクローニングした。マウスＩＬ６遺伝子をＢａｍＨ１で切り出した後、予めＢａｍＨ１処理したｐｄＲに組み込みＣＨＯ細胞に形質導入した。５０ｎＭ ＭＴＸ耐性のＣＨＯ細胞を選びその培養上清を実験に供した。
【００２７】
参考例２ マウス可溶性ＩＬ６リセプター抗体の調製
（１）Ｓａｉｔｏ等の方法（J. Immunol., 147:168-173 (1991))によって抗マウス可溶性ＩＬ−６リセプター抗体ＲＳ１２を得た。この抗体はＩｇＧ２ａサブクラスであった。
【００２８】
（２）上記Ｓａｉｔｏ等の文献に開示されたマウス可溶性ＩＬ−６リセプターを産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で培養し、その培養上清をＲＳ１２抗体とＡｆｆｉｇｅｌ １０ゲル（バイオラッド）に固定したアフィニティーカラムを用いて精製した。得られたマウス可溶性ＩＬ−６リセプター５０μｇをフロイント完全アジュバントと混合しウィスターラット（日本チャールズリバー）の腹部皮下に接種した。２週間後からはフロイント不完全アジュバントで追加免疫した。４５日目に屠殺し、その脾細胞約２×１０8 個を１×１０7 個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（ベーリンガーマンハイム）を用いて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ培地にてハイブリドーマを選択した。
【００２９】
ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（カッペル）をコートしたイミュノプレートにハイブリドーマ培養上清を加えた後、マウス可溶性ＩＬ−６Ｒを反応させ、次いでウサギ抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体およびアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体によるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６リセプターに対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。抗体の産生が確認されたものは２回のサブクローニングを行ない単一のクローン（ＭＲ１６−１）を得た。
【００３０】
このハイブリドーマが産生する抗体のマウスＩＬ−６に対する中和活性をＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞(Matsuda等、Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988)を用いた 3Ｈ−チミジンの取り込みで調べた。
９６穴プレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１×１０4 個／２００μｌ／ウエルとなるよう調製し、これにマウスＩＬ−６（１０pg／ml）とＭＲ１６−１抗体およびＲＳ１２抗体１２．３〜１０００ng／mlを加えて、３７℃、５％ＣＯ2 で４４時間培養した後、 3Ｈ−チミジン（ＩμＣｉ／ｗｅｌｌ）を加え４時間後の取り込みを測定した（図１）。
【００３１】
実施例１
８週齢の雌性ｄｄｙ系マウスに偽手術（ｓｈａｍ）または卵巣摘出術（ＯＶＸ）を行ない２週後に屠殺した。フェノールレッド不含αＭＥＭ培地を用い、脛骨および大腿骨より骨髄を採取し遠心分離により骨髄細胞を除いて骨髄液とした。骨髄液の骨吸収活性は45Ｃａでラベルしたマウス長管骨を用いた器官培養法により測定した。すなわち、母親マウスに45ＣａＣｌ2 を皮下投与することによって45Ｃａ標識された前腕骨を妊娠１７日令の胎児より採取し、フェノールレッド不含αＭＥＭ培地で５％ＣＯ2 ，３７℃にて器官培養した。
【００３２】
２４時間後、０．２％ＢＳＡを含むフェノールレッド不含αＭＥＭ培地と交換すると同時に骨髄液試料を４０％の割合で添加した。骨吸収活性はＳｈａｍ群では約２５％であったのに対し、ＯＶＸ群は約６０％であった。
そこで、この系を用いて、６６μｇ／mlのマウスＩＬ−６抗体およびＲＳ１２抗体で骨髄液試料を前処理（３７℃、２時間、５％ＣＯ2 ）して持続的添加を行った結果、両抗体ともＯＶＸ群に於いて骨吸収活性を阻害した（図２）。
【００３３】
実施例２
マウスの骨芽細胞と骨髄細胞との共存培養系〔Takahashi,等:Endocrinology 122:1373, 1988, Takahashi, 等:Endocrinology 123:2600, 1988 〕により形成される破骨細胞数を骨吸収の指標として用いた。
【００３４】
マウスの骨芽細胞は以下の方法により調製した。すなわち生後１または２日令のｄｄｙ系マウスから無菌的に取り出した頭蓋骨を０．１％コラゲナーゼ（細胞分散用、和光純薬）と０．２％ディスパーゼ（合同酒精）を含むＰＢＳに入れ３７℃の恒温槽にて１０分間振とうした。浮遊してきた細胞を集め、更に新しい酵素溶液を入れ１０分間酵素処理した。この酵素消化を５回繰返し、２〜５回目の消化で浮遊してきた細胞を骨芽細胞として回収した。
【００３５】
マウスの骨髄細胞は以下の方法により調製した。すなわち、６〜９週令のｄｄｙ系マウスからけい骨を無菌的に取りだし、その骨端を切り落とした。けい骨の遠位端より２５Ｇの針を付けたシリンジで１mlのα−最少必須培地（α−ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ社）を注入し、近位端より骨髄細胞を回収した。これらの細胞は共に１０％の牛胎児血清（Ｂｉｏｃｅｌｌ社）を含むα−ＭＥＭに懸濁して培養に用いた。
【００３６】
共存培養は、４８穴の培養プレートに１×１０4 細胞／０．５ｍ／ｗｅｌｌの骨芽細胞と２×１０5 細胞／ｗｅｌｌの骨髄細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 で６〜７日間培養した。形成された破骨細胞は破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）を染色することにより同定した〔Takahashi,等:Endocrinology 122:1373, 1988 〕。
【００３７】
これらの培養系にマウスＩＬ−６またはマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ〔ＩＬ−６ｓＲ（ｓＲ３２４）〕〔Saito,等 al.J Immunol,147:168-173 (1991)〕とマウスＩＬ−６Ｒ抗体（ＭＲ１６−１あるいはＲＳ１２）またはマウスＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ systems）を添加して以下の実験を行った。なお、マウスＩＬ−６とｓＲ３２４は、ＣＨＯ細胞にこれらの遺伝子を組み込んだ細胞の培養上清をそれぞれ用いた。培養上清中のマウスＩＬ−６およびＩＬ−６ｓＲ３２４はエンザイムイッムノアッセイによってそれぞれの濃度を測定し、α−ＭＥＭで適当な濃度に希釈して実験に供した。
【００３８】
実験１ マウスＩＬ−６又はマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ単独での破骨細胞形成実験
マウスＩＬ−６（０．２ng／ml〜２００ng／ml）とｓＲ３２４（０．５〜５００ng／ml）単独での破骨細胞形成能を調べたが、いずれも単独では破骨細胞形成能を示さなかった。なお、本実験系において陽性対象薬である活性型ビタミンＤ3 は有意な破骨細胞形成を示した（図３）。
【００３９】
実験２ マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ共存下での破骨細胞形成実験
２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に０．０５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた時の破骨細胞形成能を調べたところ、ｓＲ３２４の濃度に依存して著明な破骨細胞の形成が認められた（図４）。なお、形成された破骨細胞を象牙切片上で培養したところ多くの吸収窩が認められ、それらはカルシトニンの添加により抑制された。従って本実験系で形成された破骨細胞は骨吸収能とカルシトニンリセプターを有する成熟破骨細胞であると考えられた。
【００４０】
実験３ マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６リセプター共存下での破骨細胞形成に対するマウス抗ＩＬ−６リセプター抗体（ＭＲ１６−１もしくはＲＳ１２）またはマウス抗ＩＬ−６抗体の抑制効果
２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に６２．５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた時の破骨細胞形成能を調べたところ、実験２と同様にｓＲ３２４の濃度に依存して著明な破骨細胞の形成が認められた。２０ng／mlのマウスＩＬ−６と５００ng／mlのｓＲ３２４による破骨細胞形成に対してＭＲ１６−１は１ng／ml〜１００ng／mlの濃度範囲で濃度依存的な抑制作用を示した。ＲＳ１２およびマウス抗ＩＬ−６抗体は１０ng／mlと１００ng／mlで抑制作用を示した（図５）。
【００４１】
実施例３ マウスＩＬ−６、マウス可溶性ＩＬ−６リセプターおよびヒトＩＬ−１αの共存下で惹起される骨吸収に対する抗マウスＩＬ−６リセプター抗体（ＭＲ１６−１）の抑制効果
母親マウスに45ＣａＣｌ2 を皮下投与することによって45Ｃａ標識された頭蓋冠を妊娠１６日令の胎児より採取し、１mg／mlのＢＳＡを含むＢＧＪｂ培地で５％ＣＯ2 ，３７℃にて器官培養した。２４時間後、新たな培地に交換し、１００pg／mlのヒトＩＬ−１α，２０ng／mlのマウスＩＬ−６および５００ng／mlのマウス可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）を添加して、３７℃，５％ＣＯ2 で５日間培養した。この場合、前記新たな培地に被験物質であるＭＲ１６−１を１０μｇ／ml添加した。この実験系で惹起される骨吸収を、１０μｇ／mlのＭＲ１６−１はほぼ完全に抑制した（図６）。
【００４２】
発明の効果
以上の通り、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする本発明の骨吸収抑制剤は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの共存下での破骨細胞の形成を抑制し、骨吸収阻害効果を有していることが証明される。従って、本発明の骨吸収抑制剤は、骨吸収が関与する各種骨代謝疾患、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、腫瘍性高カルシウム血症、腎性骨異栄養、ペーゼット症、骨転移、骨肉腫等の治療剤として期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン６リセプターに対する抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤。
【請求項１】
インターロイキン６リセプターに対する抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１１１７０６（Ｐ２０１０−１１１７０６Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７５６３（Ｐ２０１０−２７５６３）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【分割の表示】特願２００６−１３８６３１（Ｐ２００６−１３８６３１）の分割
【原出願日】平成６年６月１６日（１９９４．６．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００１５７８６５）
【出願人】（５９３１３９７３２）
【出願人】（５９３１３９７４３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【分割の表示】特願２００６−１３８６３１（Ｐ２００６−１３８６３１）の分割
【原出願日】平成６年６月１６日（１９９４．６．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００１５７８６５）
【出願人】（５９３１３９７３２）
【出願人】（５９３１３９７４３）
【Ｆターム（参考）】
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