ウイルス検出方法
試料中のウイルス又はその抗原の濃度を決定する方法であって、ウイルス抗原又はウイルス抗原類似体を固定化したセンサー表面を用意する段階、試料をウイルス抗原に対する抗体の既知量と混合して、試料混合物中に抗原に対する抗体の所定濃度を得る段階、試料混合物をセンサー表面に接触させて、混合物中の遊離抗体をセンサー表面に結合させる段階、遊離抗体の結合に対するセンサー表面の応答を測定する段階、並びに所定濃度の抗体及び様々な濃度のウイルスを含む混合物に関して得られる応答を測定することで作成された校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定する段階を含んでなる方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを含む媒体又はウイルスから導かれる媒体中におけるウイルス又はウイルス抗原の検出及び定量、特にワクチン製造及びプロセス開発におけるウイルス抗原濃度の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは一般に、その核タンパク質及びマトリックスタンパク質抗原間における抗原性の差に基づいて３つのタイプ（Ａ、Ｂ及びＣ）に分類される。インフルエンザＡウイルスはさらに、ウイルス本体の表面上にスパイクとして現れる２種の主要表面糖タンパク質、即ち赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいてサブタイプに分類される。
【０００３】
宿主細胞の感染はウイルスＨＡが細胞上のシアル酸構造に結合することで開始され、これがウイルス粒子を細胞表面に付着させてウイルスの取込みを誘発する。ＲＮＡ及びウイルスタンパク質が複製されて新しいウイルス粒子に組み立てられ、これらが細胞から発芽する。子孫ウイルス粒子は、末端シアル酸残基を切断するウイルス上の酵素ＮＡによって細胞表面から放出される。
【０００４】
現在、１５種のＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）及び９種のＮＡサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が存在している。インフルエンザＡウイルスのサブタイプはそのＨＡ及びＮＡ表面タンパク質に従って命名され、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１のようにする。インフルエンザＢウイルス及びインフルエンザＡのサブタイプはさらに株として特徴づけられ、例えばＢ Ｍａｌａｙｓｉａ、Ｈ３Ｎ２ Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｈ１Ｎ１ Ｔａｉｗａｎのようにする。
【０００５】
ＨＡ及びＮＡはいずれも抗原エピトープを担持している。ＨＡ及びＮＡに対して高められた抗体は、ヒト及び動物における感染又は疾患のリスクを低下させる。最初のインフルエンザワクチンは不活化した全ウイルス粒子又は殺した全ウイルス粒子を含んでいたが、商業的に入手可能なインフルエンザワクチンは通常は２種のタイプのもの、即ち「スプリットワクチン」及び「サブユニットワクチン」である。
【０００６】
スプリットワクチンは、精製ウイルス粒子をエーテル又は界面活性剤で破壊し、次いで界面活性剤をウイルス脂質の大部分と共に除去することで製造される。したがって、スプリットワクチンは、全ウイルスワクチンと本質的に同じ要素を同じ比率で含んでいる。他方、サブユニットワクチンでは、表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡが個別に精製され、次いでワクチン中に合わされる。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、２種のやり方、即ち「抗原ドリフト」及び「抗原シフト」によって変化し得る。抗原ドリフトは生体の免疫系によって認識できない新しいウイルス株を生み出すのに対し、抗原シフトはインフルエンザＡウイルスにおける突然の大きな変化であって、新しい赤血球凝集素及びノイラミニダーゼタンパク質を生じて新しいインフルエンザＡサブユニットを生み出す。大抵の年には、インフルエンザワクチン中の３種のウイルス株のうちの１種又は２種が、循環するインフルエンザウイルスの変化についていくために更新される。
【０００８】
インフルエンザワクチンは、通常は多価である。即ち、ワクチンは同じウイルス種の２以上の株の培養物から製造される。現在、毎年のインフルエンザワクチン中にはインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株及びインフルエンザＢ株が含まれるのが通例である。
【０００９】
インフルエンザに対する予防接種の効力は、主としてワクチン中の免疫原性ＨＡの量により決定される。ワクチン中のＨＡ濃度は、通例、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイにより測定されてきた。ＳＲＩＤでは、インフルエンザビリオンが界面活性剤で破壊され、全ウイルス又は精製ウイルス抗原が特異性な抗赤血球凝集素（抗ＨＡ）抗体を含むアガロースゲル中への拡散に供される。得られた抗原／抗体反応物又はゾーン（染色によって可視化される）は、標本中のＨＡ抗原の量に正比例する。しかし、ＳＲＩＤアッセイはいくつかの欠点を有している。高い変動（約１０％）と共に高い検出限界（約２０μｇ／ｍｌ）を有することに加え、それは手間がかかり、低いスループットを有する。しかし、その欠点にもかかわらず、ＳＲＩＤはなお、欧州薬局方及びＷＨＯによって推奨されかつインフルエンザワクチンの評価のための取締り機関によって認可されている方法である。この方法の精度が悪いため、製造者はワクチン用量を「過剰充填」するのが普通である。
【００１０】
インフルエンザウイルスの定量のための他の方法には、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）がある。
【００１１】
また、インフルエンザウイルスを含むウイルスの検出のため、バイオセンサーに基づく方法も開発されてきた。
【００１２】
欧州特許出願公開第０２７６１４２号には、金被覆回折格子上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてインフルエンザＡウイルスを検出する方法が開示されている。インフルエンザＡウイルスの個別の決定基に対するモノクローナル抗体を金表面上に固定化し、ウイルスを適用してインキュベートした。次いで、インフルエンザＡウイルス決定基に対するモノクローナル抗体を表面と共にインキュベートし、第２の抗体がインフルエンザウイルス粒子に結合した場合に得られる増強応答を検出した。
【００１３】
特開平０３−０５４４６７号には、ウイルスの表面抗原に対する抗体で電極を被覆した圧電振動子によってウイルスの濃度を測定することが開示されている。抗原が電極に結合した場合、振動子の振動周波数が低くなる。
【００１４】
Ｓｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｄｉｍｍｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２（１９９６）３３−４２には、インフルエンザウイルスの検出のためにＳＰＲバイオセンサー計測器を使用することが開示されている。インフルエンザウイルスの捕捉のためのモノクローナル抗体を、カルボキシル化デキストランで被覆したセンサーチップに結合した。次いで、インフルエンザウイルスを計測器の流通系に注入してセンサーチップに接触させ、固定化抗体との結合親和性をモニターした。
【００１５】
Ｂｏｌｔｏｖｅｔｓ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１（２００４）１０１−１０６には、固定化プロテインＡを有するＳＰＲセンサー表面に対する、プレインキュベーション段階中に生成されるウイルス抗原と抗体との複合体の結合を検出することによる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた植物ウイルスの検出が開示されている。
【００１６】
Ｊｉｅ Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８９，４（２００７）１１９３−１１９９には、トリインフルエンザの検出のための干渉測定バイオセンサーイムノアッセイが開示されている。導波路表面上の抗原（赤血球凝集素）に特異的な抗体（ポリクローナル及びモノクローナルの両方）によって全ウイルス粒子を捕捉し、結合から生じた屈折変化を測定した。３種のインフルエンザウイルスサブタイプ（２種のＨ７及び１種のＨ８）を試験した。
【００１７】
しかし、これらの他の方法はいずれも実質的な欠点を有している。したがって、粗試料並びに精製試料中におけるインフルエンザウイルスの濃度（特にＨＡ濃度）を正確に決定するための改良された方法及び手段に対するニーズが存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
国際公開第２００６／０４１３９２号パンフレット
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的の１つは、ウイルス（特にインフルエンザウイルス）の検出及び定量のための方法であって、先行技術方法の欠点がなく、特に高い精度及び高い検出範囲を有すると共に標準のＳＲＩＤアッセイほど手間のかからない方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、ワクチン製造に際し、プロセス試料及び最終ワクチン試料の両方においてウイルス又はウイルス抗原を定量するのに適した方法を提供することである。
【００２１】
これらの目的並びに他の目的及び利点は、請求項１記載の方法によって達成される。
【００２２】
本発明に係る方法は、バイオセンサー技術及び阻害型アッセイフォーマットの使用に基づいている。
【００２３】
広義には、試料中のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定する方法は、
ウイルス抗原又はウイルス抗原類似体を固定化したセンサー表面を用意する段階、
試料をウイルス抗原に対する抗体の既知量と混合して、試料混合物中に抗原に対する抗体の所定（総）濃度を得る段階、
試料混合物をセンサー表面に接触させて、混合物中の遊離抗体をセンサー表面に結合させる段階、
遊離抗体の結合に対するセンサー表面の応答を測定する段階、並びに
所定濃度の抗体及び様々な濃度のウイルス又はウイルス抗原を含む混合物に関して得られる応答を測定することで作成された校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定する段階
を含んでなる。
【００２４】
好ましくは、中間で再生を行いながらセンサー表面に関して複数の分析サイクルが実施され、各分析サイクルに関して仮想校正曲線が計算される。これは、
曲線中の既知濃度の各々を、サイクル数をｘとしかつ応答をｙとする二重指数式に当てはめ、
これらの式を用いて各サイクルに関する仮想校正曲線を計算し、
特定のサイクルに関する仮想校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定することによって行うことができる。
【００２５】
ウイルス抗原は内部抗原であってもよいし、或いは好ましくはウイルスの表面抗原であってもよい。任意には、ウイルス抗原は全ウイルス粒子である。ウイルス抗原類似体は、例えば合成ペプチドであり得る。
【００２６】
好ましくは、試料は本方法によって同時に測定される複数種のウイルス又はウイルスタイプを含む。
【００２７】
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、天然のもの或いは部分的又は全体的に合成されたものであってよい免疫グロブリンをいい、Ｆａｂ抗原結合フラグメント、一価フラグメント及び二価フラグメントを含む活性フラグメントも包含する。この用語はまた、免疫グロブリンの結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質も包含する。かかるタンパク質は天然の供給源から導くことができるか、或いは部分的又は全体的に合成することができる。例示的な抗体は、免疫グロブリンのアイソタイプ並びにＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ及びＦｄフラグメントである。
【００２８】
通例、抗体はウイルス又はウイルス抗原に対する血清である。
【００２９】
一実施形態では、センサーチップが複数の感知領域を有していて、それぞれのウイルス又はウイルスタイプに対して特異的なウイルス抗原又は類似体が相異なる別々の感知領域上に固定化される。試料を１種のウイルスに対する抗体の一定量と混合し、次いで混合物を抗体に対して特異的な抗原を有する感知領域のみに接触させるか、或いは（抗体が他の抗原又は類似体と交差反応しなければ）すべての感知領域に接触させ、応答を検出する。これを他の抗体及び感知領域に関して順次に繰り返す。
【００３０】
別の実施形態では、センサーチップがただ１つの感知領域を有するか、或いは複数の感知表面を有するセンサーチップのただ１つの感知領域のみが使用される。この場合には、ウイルス抗原又は類似体をただ１つの感知領域上に共固定化し、試料をそれぞれの抗体の一定量と一度に１種ずつ混合し、それぞれの混合物を感知領域に順次に接触させる。
【００３１】
しかし、好ましい実施形態では、抗体が選択的であって他のウイルス又は抗原との交差反応性を示さない場合、相異なる抗体のすべてを試料と混合し、次いで各々がそれぞれの固定化ウイルス抗原又は類似体を有する複数の感知領域をもったセンサーチップに混合物を接触させ、相異なる感知領域の応答を検出する。別法として、センサー表面は同一感知領域に固定化されたそれぞれの抗原の混合物を含んでいてもよい。このようによすれば、試料中のすべてのウイルス又はウイルス抗原をただ１回の分析サイクルで検出できる。
【００３２】
定量すべき試料中のウイルス又はウイルス抗原は、好ましくは相異なるインフルエンザウイルスタイプ又はその抗原（好ましくは赤血球凝集素）である。
【００３３】
固定化された赤血球凝集素は、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの数種の株に対して包括的なものであってもよいし、或いはインフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの２種以上の株から導かれたものであってもよい。
【００３４】
一般に、バイオセンサーアッセイにおいては、被検体（ここでは試料中の遊離抗体）がセンサー表面上の固定化リガンド（ここではウイルス抗原又は類似体）に結合した場合、適当な流体で処理することで結合抗体を遊離させて新しい試料との接触のために表面を準備することが行われるが、このプロセスを再生という。通常、センサー表面はかなり多数の分析サイクルに供することができる。しかし、（例えばウイルス抗原のような）多くのリガンドは低い安定性を有する場合が多く、表面の被検体結合能力はサイクル数と共に減少し、定量目的のためのリガンドの使用を妨げることがある。結合能力のわずかな減少は頻繁な校正によって補償できることが多いが、これはスループットを顕著に減少させる。
【００３５】
したがって、本発明の方法は、仮想校正曲線（即ち、各サイクルについて得られる固有の校正曲線）を用いて各分析サイクルを評価する基準化段階を含み、かくしてドリフト中における頻繁な校正の必要性を最小化すると共に定量測定の品質を顕著に向上させる。
【００３６】
本発明並びにその追加の特徴及び利点の一層完全な理解は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することで得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、試料中に相異なるウイルス濃度を有する３つの場合（ａ〜ｃ）に関し、センサー表面上での阻害型ウイルスアッセイを示す模式図である。
【図２】図２は、３種のウイルス抗原がセンサー表面上のそれぞれの個別スポットに固定化され、各抗原に対して特異的な３種の抗体が定量のために使用される場合を示す、図１と同様な模式図である。
【図３】図３は、センサー表面上に固定化したインフルエンザウイルス抗原を用いる阻害型アッセイにおいて、実測された相対応答／安定度を様々なインフルエンザウイルス／抗血清混合物の濃度に対して示す図である。
【図４】図４は、固定化されたインフルエンザウイルス抗原を有するセンサー表面に対する複数の相異なるインフルエンザウイルス抗血清の結合に関し、実測された相対応答を分析サイクル数に対して示す図である。
【図５】図５は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイ中の４回の通常校正時において、７種の濃度のウイルス対照試料に関してサイクル数をｘとしかつ実測応答をｙとする当てはめ基準化曲線を示す図である。これらの基準化曲線は、各サイクルに関する仮想濃度を予測するために使用される。次いで、これらの仮想濃度は、仮想濃度をｘとしかつ既知濃度をｙとするサイクル特有の校正曲線を作成するために使用される。
【図６】図６は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイにおいて相異なるサイクル数で４回の通常校正を行いながら、２種の対照試料濃度に関して計算濃度を分析サイクル数に対して示す図である。
【図７】図７は、２種の対照試料濃度に関し、各サイクルに関する（図５に基づく）仮想校正曲線を図６と同じ生データに適用した場合を示す図である。
【図８】図８は、対照試料に関する実測結合データ及び各サイクルに関する仮想校正曲線によって基準化された対応データを示す、図７と同様な図である。
【図９Ａ】図９Ａは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第１の校正曲線を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第２の校正曲線を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第３の校正曲線を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
上述の通り、本発明はバイオセンサー技術及び阻害型アッセイフォーマットを使用して試料媒質中の１種以上のウイルス又はウイルス抗原の検出及び定量を行うための方法に関する。
【００３９】
まず、バイオセンサー技術について述べれば、バイオセンサーは広義には、固体物理化学的トランスデューサーと直接に結合した状態で、或いはトランスデューサーと結合している可動担体ビーズ／粒子と共に分子認識用の構成成分（例えば、固定化抗体を有する層）を使用する装置として定義される。かかるセンサーは通例は固定化層に関する質量、屈折率又は厚さの変化を検出する無標識技法に基づいているが、何らかの種類の標識に依存するバイオセンサーも存在する。本発明の目的のための典型的なセンサーには、特に限定されないが、光学的方法及び圧電又は弾性波方法（例えば、表面弾性波（ＳＡＷ）法及び水晶微量てんびん（ＱＣＭ）法を含む）のような質量検出方法がある。代表的な光学的検出方法には、外部および内部反射法の両方を含む反射光学的方法のような質量表面濃度を検出する方法があり、これらは角分解、波長分解、偏光分解又は位相分解することができる。例えば、エバネセント波偏光解析法及びエバネセント波分光法（ＥＷＳ又は内部反射分光法）（これらはいすれも表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるエバネセント場の増強を含み得る）、ブルースター角屈折率測定、臨界角屈折率測定、フラストレーテッド全反射（ＦＴＲ）、散乱全内部反射（ＳＴＩＲ）（これは散乱を増強する標識を含み得る）、光導波路センサー、外部反射イメージング、エバネセント波に基づくイメージング（例えば、臨界角分解イメージング、ブルースター角分解イメージング、ＳＰＲ角分解イメージング）などがある。さらに、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネセント波蛍光発光法（ＴＩＲＦ）及びリン光発光法に基づく測光方法及びイメージング／顕微鏡検査方法（「それ自体」で又は反射方法と組み合わせて使用される）、並びに導波路干渉計、導波路リーキングモード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、透過干渉測定、ホログラフィー分光法及び原子間力顕微鏡検査法（ＡＦＲ）が挙げられる。
【００４０】
ＳＰＲに基づくバイオセンサー装置並びに例えばＱＣＭを含む他の検出技法に基づくバイオセンサー装置は、いずれも１以上のフローセルを有する流通型装置及びキュヘット型装置として商業的に入手できる。複数の感知表面及び流通系を有する例示的なＳＰＲバイオセンサーには、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）がある。これらのシステムは、結合リガンドと検査対象の被検体との間の表面結合相互作用をリアルタイムでモニターすることを可能にする。この文脈中では、「リガンド」は所定の被検体に対して既知又は未知の親和性を有する分子であって、表面上に固定化された任意の捕捉剤又はキャッチング剤を含む一方、「被検体」はそれに対する任意の特異的結合パートナーを含む。
【００４１】
ＳＰＲバイオセンサーに関して述べれば、ＳＰＲの現象は公知である。異なる屈折率を有する２種の媒体間の界面であって、通例は金又は銀の金属フィルムで被覆された界面において光がある条件下で反射された場合にＳＰＲが起こることを述べれば十分であろう。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは、媒体は試料及びミクロ流体流路系によって試料に接触させるセンサーチップのガラスである。金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角における反射光の強度を低下させる。この最小反射光強度の角度は、反射光の反対側（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは試料側）の表面付近の屈折率に応じて異なる。
【００４２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器の技術的側面及びＳＰＲの現象の詳細な論議は、米国特許第５,３１３,２６４号中に見出すことができる。バイオセンサーの感知表面のマトリックスコーティングに関する一層詳細な情報は、例えば、米国特許第５,２４２,８２８号及び同第５,４３６,１６１号に示されている。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器に関連して使用されるバイオセンサーチップに関する技術的側面の詳細な議論は、米国特許第５,４９２,８４０号中に見出すことができる。上述した米国特許の全開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００４３】
以下の実施例では、本発明はＳＰＲ分光法（さらに詳しくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム）に関連して例示されるが、本発明はこの検出方法に限定されないことを理解すべきである。それどころか、固定化リガンドに対する被検体の結合を定量的に表す感知表面での変化を測定できさえすれば、被検体が感知表面上に固定化されたリガンドに結合する任意の親和性に基づく検出方法が使用できる。
【００４４】
次に、検出及び定量アッセイについて述べよう。一般に、阻害型アッセイ（溶液競合アッセイともいう）では、既知量の検出分子（ここでは抗体）を試料（ここではウイルス）と混合し、混合物中の遊離検出分子の量を測定する。さらに詳しくは、本発明のバイオセンサーに関連した濃度測定のための阻害型アッセイは、通例、下記の段階を含み得る。
１．被検体又はその誘導体をセンサー表面にリガンドとして結合する。
２．（既知又は未知の）一定濃度の検出分子を様々な濃度の校正物質溶液（被検体）に添加する。
３．混合物をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
４．校正曲線を計算する。
５．次いで、試料（被検体）を一定濃度の検出分子と混合することで測定を行う。試料をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
６．校正曲線を用いて試料中の被検体濃度を計算する。遊離検出分子の量は、試料中の被検体濃度と逆の関係にある。
７．表面を再生し、新しい試料を注入することができる。
【００４５】
本発明の方法では、リガンドはウイルス抗原、好ましくは表面抗原（又は任意には全ウイルス）であるのに対し、被検体は抗原に対する抗体である。抗体はポリクローナル（例えば血清）又はモノクローナルであり得る。阻害型アッセイフォーマットのため、表面への大きいウイルス粒子の拡散効果は回避される。
【００４６】
以下、例示目的のため、試料中の１種以上のインフルエンザウイルスの濃度、さらに詳しくは三価インフルエンザワクチン中の３種のウイルスタイプの赤血球凝集素（ＨＡ）の濃度を決定することに関して本発明を説明するが、これに限定されるわけではない。添付の図面中の図１〜９を参照しながら説明を行う。
【００４７】
図１ａに模式的に示される通り、参照番号１で表される精製ウイルスＨＡをバイオセンサーのセンサー表面２上に固定化する。ウイルス粒子３と抗体４を含む抗血清との混合物をセンサー表面２上に液体流れとして通過させる。図１ａに示される通り、抗体４はウイルス粒子又は固定化ＨＡ抗原に結合していることもあれば、溶液中に遊離していることもある。センサー表面への結合は、センサー表面からの応答信号を増加させる。
【００４８】
図１ｂは、試料中にウイルスが存在しない場合を示している。この場合には、最大量の抗体４がセンサー表面上のＨＡ抗原１に結合し、高い応答信号を生じる。
【００４９】
他方、図１ｃでは、高濃度のウイルス粒子３が少量の遊離抗体４を生み出し、したがって低い応答信号が測定される。このように、試料中のウイルスの濃度が高いほど、表面ＨＡに結合する抗体の量は少なくなり、低い応答レベルを生じる。
【００５０】
センサー表面が複数（例えば、３以上）の個別感知領域又は「スポット」を有するか、或いはそれを提供し得るならば、図２に示すように、例えば３種のＨＡを固定化することができる。この場合、（現行のインフルエンザワクチン中で通例使用される）ウイルスタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢに対して特異的なＨＡがセンサー表面上のそれぞれのスポットに固定化されている。
【００５１】
下記に実証されるように、ＨＡに対する異なるウイルス抗血清の結合は選択性である。即ち、異なるウイルスタイプ又はサブタイプ間の交差反応性は存在しない。このような選択性のため、多価ワクチンのような試料中の２種以上のウイルス成分は同時に測定できる。
【００５２】
次に、上述した３種のウイルスタイプ／サブタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢを含む試料に適用される本発明方法の例示的な実施形態を説明しよう。
【００５３】
３種のウイルスタイプからのＨＡを、センサー表面上の３つの異なるスポットに固定化する。
【００５４】
次いで、校正手続きを実施する。各ウイルスタイプに関する一定濃度の標準抗血清からなる校正物質を、測定すべき濃度範囲をカバーする様々な既知濃度のウイルス（又はウイルス抗原）と混合する。次いで、校正物質をセンサー表面のスポット上に（３種のタイプを別々に又は一緒に）注入し、応答を測定する。次いで、測定の結果から校正曲線を計算する。
【００５５】
次いで、各ウイルスを一定濃度の抗血清（一度に１種ずつ又は好ましくは３種の抗血清のすべてを用いる）と混合することで試料中のウイルスＨＡ含有量の測定を実施する。試料をセンサー表面上に注入し、遊離抗血清濃度を測定する。校正曲線を用いて試料中のウイルス抗原濃度を計算する。
【００５６】
次いで、表面を再生し（即ち、表面を適当な再生流体に接触させることで固定化ＨＡから結合抗体を解離させ）、新しい試料を表面上に流すことができる。
【００５７】
上述したように、好ましくは試料を３種の抗血清のすべてと混合し、試料をすべての３つのスポット上に注入することで、３種のウイルスタイプ／サブタイプからのＨＡの濃度をただ１つの分析サイクルで分析することができる。したがって、多価（例えば三価）インフルエンザワクチンのすべてのウイルス成分を同時に測定し得るアッセイを開発することができる。
【００５８】
下記に示されるように、インフルエンザウイルスサブタイプの様々な株と該サブタイプの１つの株の赤血球凝集素との間に実質的な交差反応性が存在することが判明した。したがって、常用ウイルス株の各々に関する包括的アッセイを開発できるように思われる。かくして、かかるアッセイは、毎年変化するインフルエンザワクチンのウイルス株の組合せに関係なく、インフルエンザワクチン中のウイルス抗原含有量を測定するため広く使用できよう。
【００５９】
上述したアッセイでは、高品質の分析結果を得るための必要条件は、センサー表面上に固定化されたリガンド（ＨＡ）が一定の結合能力を有すること、及び表面上に注入される校正物質が高い安定性を有することである。一般に、結合能力のわずかな減少は頻繁な校正によって補償できることが多い。しかし、頻繁な校正はスループットを減少させると共に、試薬の消費によるコストの増加をもたらす。
【００６０】
本発明に従えば、「仮想」校正曲線を用いて各分析サイクルを評価することで、ドリフト中における頻繁な校正の必要性を最小化すると共に、例えば上述したＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いた定量測定の品質を顕著に向上させる方法が案出された。かかる方法は基本的には任意のリガンドに対して広く適用可能であり、とりわけ直接結合アッセイ、阻害アッセイ及びサンドイッチアッセイを含む各種のアッセイフォーマットで使用できるものの、それは本発明のウイルス検出に関連して特別の重要性を有する。これは、ＨＡのようなウイルス抗原が通常はセンサー表面上でのドリフトを引き起こす顕著な不安定性を示すからである。
【００６１】
センサー表面の結合能力は減少する一方、対照品の測定／計算濃度は新しい校正作業が行われるまでに実施される分析サイクルの数（又はサイクル数）の関数として増加する。これは、阻害型アッセイフォーマットでは、校正曲線が結合能力の減少を試料中のＨＡ濃度の増加として解釈するからである。このようなドリフトは分析サイクル数の増加と共に増加し、しばしば指数関数的である。本発明の方法では、分析サイクルは、固定化ＨＡを有するセンサー表面上にウイルスと検出抗体との混合物を流す段階、次いで表面を再生して次の分析サイクルの準備を行う段階を含んでいる。
【００６２】
本発明に従えば、新しい校正ルーチンは様々なやり方で設計できる。
【００６３】
１つの変形例では、抗体作業からの生データを用いて各分析サイクルに関する仮想濃度を予測し、次いでサイクル特有の校正曲線の計算及び試料／対照品に関する濃度の予測を行う。
【００６４】
別の変形例では、現実の校正の各々に関して校正式を計算し、次いで各サイクルに関する校正係数を予測し、それを用いて試料／対照品の予測を行う。
【００６５】
上述した第１の方法は実施例４及び実施例５に一層詳しく記載され、第２の変形例は下記実施例６に一層詳しく記載される。
【００６６】
例えば多価インフルエンザワクチンの分析のために本発明の方法を実施するためのアッセイキットは、目標インフルエンザウイルスタイプ／サブタイプに関する赤血球凝集素（又は赤血球凝集素類似体）、該ウイルスタイプ／サブタイプに関する標準血清及びウイルス標準品、並びに任意にはセンサーチップを含み得る。
【００６７】
以下の実施例には、限定ではなく例示を目的として本発明の様々な態様を一層詳細に開示する。
【実施例】
【００６８】
計測機器
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。この計測器はセンサーチップ上の金表面での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出に基づくもので、試料及び操作用緩衝液を４つの個別に検出されるフローセル（Ｆｃ１〜Ｆｃ４と表示する）に１つずつ又は連続して通過させるための微小流体系（一体化微小流体カートリッジ−ＩＦＣ）を使用している。ＩＦＣは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００計測器内において合体機構によりセンサーチップに圧着されている。
【００６９】
センサーチップとしては、カルボキシメチル修飾デキストランポリマーの共有結合ヒドロゲルマトリックス（約１００ｎｍ）と共に金被覆（約５０ｎｍ）表面を有するシリーズＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。
【００７０】
計測器からの出力は、（「共鳴単位」（ＲＵ）で測定された）検出器の応答を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。１０００ＲＵの増加は、センサー表面上での約１ｎｇ／ｍｍ2の質量増加に相当している。
【００７１】
実施例１：インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＢ／Ｊｉｌｉｎのアッセイ
材料
赤血球凝集素（ＨＡ）Ａ／Ｈ３Ｎ２，Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（メリデン、米国）から入手した。
ＨＡ Ａ／Ｈ１Ｎ１，Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９は、ＰｒｏｓＰｅｃ社（レホヴォト、イスラエル）から入手した。
ＨＢ／Ｊｉｌｉｎは、ＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（サンディエゴ、米国）から入手した。
血清及びウイルス株は、ＮＩＢＳＣ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ポッターズバー、 英国ハートフォードシャー州）から入手した。
アッセイ用及び試料用緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
【００７２】
方法
下記のように、アミンカップリングを用いて、ＨＡ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１及びＢ）をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の３つのそれぞれのフローセル内のＣＭ５センサーチップに固定化する。
Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｂ／Ｊｉｌｉｎ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で５μｇ／ｍｌ、２０〜３０分間。
固定化レベルは５０００〜１００００ＲＵである。
それぞれのウイルス株に対する血清を、供給者によって推奨されるように、ＳＲＩＤ力価に基づく希釈率を用いて希釈する。例えば、ＳＲＩＤのため１ｍｌに希釈された７μｌの血清は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００中における２００倍の希釈度に相当している。（希釈は約５００〜１５００ＲＵが得られるように行われる。）注入時間は５分である。
血清を用いて３〜１０回の開始サイクルを実施する。
最初に供給者によって推奨されるようにＭＱで希釈され（この場合、ＨＡはアリコートに分けて凍結保存される）、次いでさらに血清で通例０．１〜１５μｇ／ｍｌに希釈されたウイルス抗原（ＨＡ）を用いて校正曲線を作成する。
標準品及び試料は４００秒の注入時間を有している。
再生は２０〜５０ｍＭ ＨＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０を用いて３０秒間実施し、次いで３０秒間の安定化を行う。
【００７３】
実施例２：同一ウイルスサブタイプの様々な株の検出の普遍性
Ｈ３Ｎ２株Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡをＣＭ５センサーチップに固定化し、その表面を様々なウイルス／抗血清の組合せに接触させた。かかる組合せは、Ｗｙｏｍｉｎｇからのウイルス／抗血清（Ｗ／Ｗ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋからのウイルス／抗血清（Ｎ．Ｙ．／Ｎ．Ｙ．）、Ｗｙｏｍｉｎｇウイルス及びＮｅｗ Ｙｏｒｋからの血清（Ｗ／Ｎ．Ｙ．）並びにＮｅｗ Ｙｏｒｋウイルス及びＷｙｏｍｉｎｇからの血清（Ｎ．Ｙ．／Ｗ）であった。それぞれの組合せを用いて校正曲線を作成した。結果を図３に示す。図から明らかな通り、異なるウイルス株間には交差反応性が存在する。したがって、Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ及びウイルス／抗血清はＮｅｗ Ｙｏｒｋ株の定量のために使用でき、その逆もまた正しい。
【００７４】
実施例３：様々なインフルエンザウイルスタイプ／サブタイプのＨＡに対する抗血清の結合の選択性
インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２、Ａ Ｈ１Ｎ１及びＢの様々な株に対する２７種の抗血清を固定化Ｈ３Ｎ２ Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ上に注入し、その結合を検出した。結果及び使用した株のリストを図４に示す。図から明らかな通り、すべてのＨ３Ｎ２抗血清は１００ＲＵより高い信号をもって結合する一方、すべてのＨ１Ｎ１及びＢ抗血清は５０ＲＵ未満の信号を有している。これは、数種のウイルス株を同時に定量できること、及びＨ３Ｎ２の測定のためには１種又は若干種のＨＡのみが必要であることを表している。
【００７５】
実施例４：仮想校正手続き
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００及びＣＭ５センサーチップ上で複数（約１００回）のアッセイサイクルを実施したが、その間に７種の濃度（０．１５６、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５及び１０μｇ／ｍｌ）の対照試料を用いて４回の通常校正を行った。７種の濃度の各々に関し、サイクル数をｘとし、応答をｙとし、かつａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅを当てはめパラメーターとする関数ｙ(ｘ)＝ａ*ｅｘｐ(−ｂ*ｘ)＋ｃ*ｅｘｐ(−ｄ*ｘ)＋ｅを当てはめた。結果を図５に示すが、最上部の曲線は最も低い濃度の対照品（即ち、阻害アッセイでは最も高い応答）を表し、最下部の曲線は最も高い濃度の対照品（即ち、最も低い応答）を表している。次いで、これらの式を用いて各サイクルに関する仮想応答を計算した。次いで、図６及び図７を参照しながら下記に説明されるように、これらの応答を用いて各サイクルに関する校正曲線を計算し、この校正曲線を用いて正にそのサイクルで試料及び対照品の予測を行った。
【００７６】
図６は、２種の対照品（１．０μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌ）の計算濃度に関するドリフトを示している。多数のアッセイサイクルを実施し、二重波線矢印で表されるサイクル数で４回の中間校正を行った。各校正後に３つ（又は２つ）の対照品の濃度を最も近い先行校正曲線に対して計算した。波線矢印によって表されるように、校正までの距離の増加に伴って計算濃度の系統的な増加が存在している。このような計算濃度の増加は、対照試料からの信号の減少に原因している。これはまた、表面の結合能力がサイクル数の関数として減少し、校正曲線がかかる減少を濃度の増加として解釈することに原因している。このような結合能力の減少はまた、図３及び図４に見ることができる。
【００７７】
上述した仮想校正方法を図６の生データに適用すれば、０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌの対照品に関して図７に示す濃度推定値が得られるが、これは対照試料の濃度の予測における再現性の顕著な向上である。
【００７８】
実施例５：仮想校正手続きによる結合データの基準化
ＨＡ組換えタンパク質ＨＢ／Ｊｉｌｉｎ、Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ及びＨ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇを固定化した。校正曲線を得た。試料を希釈し、０．５〜１．５μｇ／ｍｌの範囲内の濃度を測定して再計算した。応答のドリフトを回避するため、上記実施例４に概述した基準化手続きを用いて結果を基準化し、各サイクルは固有の校正曲線を得た。図８は、２５０ＲＵの応答及び１．２％のＣＶを与える対照試料（５μｇ／ｍｌのＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３）に関する基準化前及び基準化後の結果を示している。
【００７９】
実施例６：３種のウイルスタイプの同時検出
３つのフローセルに、３種の組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、即ちＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｊｉｌｉｎを固定化した。
【００８０】
３種のインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａからのウイルス標準品を、各標準品の最終濃度が１６μｇ／ｍｌとなるように希釈して混合した。次いで、１６μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌまでの２倍系列希釈液として校正曲線を作成した。
【００８１】
分析すべき３種のワクチンＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢを８倍、１６倍、３２倍及び６４倍に希釈した。
【００８２】
３種の血清（ＮＩＢＳＣからのＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ）を、５００〜７００ＲＵの応答を与える濃度に希釈して混合した。
【００８３】
製造者による事前混合物 最終希釈度
Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ ６０倍希釈度 １８０倍
Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ７０倍希釈度 ２１０倍
Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ ２０倍希釈度 ６０倍
ワクチンを分析するためには、標準品及びワクチンの複製物をまず血清溶液と混合し、次いで「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」で生み出された方法を用いてフローセル中に流した。
【００８４】
「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」からの一般的方法は下記の通りであった。
開始（試料の代わりに緩衝液を用いて７サイクル、次いで再生、２時間）
校正曲線１（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線２（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線３（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
次いで、３つの校正曲線について結果を基準化した。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによる濃度測定のために通常使用される４パラメーター回帰曲線（式１）に校正曲線の４パラメーター当てはめを実施して４つの係数を決定することで行った。
【００８５】
【数１】
式中、Ｒhighは低ウイルス濃度での応答であり、Ｒlowは低ウイルス濃度での応答であり、Ａ1（ＥＣ５０）及びＡ2（Ｈｉｌｌ勾配）は当てはめパラメーターであり、Ｘはウイルスの濃度である。
【００８６】
次いで、様々な濃度で４つの係数の各々に関して得られた値を分析サイクル数に対してプロットすることで、各係数に関する式を得た。上記の式１によって得られた係数を用いて、基準化濃度を計算した。
【００８７】
結果
【００８８】
【表１】
製造者によれば、ワクチン中の各株のＨＡ濃度は、ＳＲＩＤで分析して３０μｇ／ｍｌのはずである。
【００８９】
３つの校正曲線を図９に示す（上述した校正曲線１〜３を各図に示す）。
【００９０】
上記のことから、例示目的のために本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載してきたが、本発明の技術思想及び技術的範囲から逸脱せずに様々な変更を行い得ることが理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲以外によって限定されることはない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを含む媒体又はウイルスから導かれる媒体中におけるウイルス又はウイルス抗原の検出及び定量、特にワクチン製造及びプロセス開発におけるウイルス抗原濃度の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは一般に、その核タンパク質及びマトリックスタンパク質抗原間における抗原性の差に基づいて３つのタイプ（Ａ、Ｂ及びＣ）に分類される。インフルエンザＡウイルスはさらに、ウイルス本体の表面上にスパイクとして現れる２種の主要表面糖タンパク質、即ち赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいてサブタイプに分類される。
【０００３】
宿主細胞の感染はウイルスＨＡが細胞上のシアル酸構造に結合することで開始され、これがウイルス粒子を細胞表面に付着させてウイルスの取込みを誘発する。ＲＮＡ及びウイルスタンパク質が複製されて新しいウイルス粒子に組み立てられ、これらが細胞から発芽する。子孫ウイルス粒子は、末端シアル酸残基を切断するウイルス上の酵素ＮＡによって細胞表面から放出される。
【０００４】
現在、１５種のＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）及び９種のＮＡサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が存在している。インフルエンザＡウイルスのサブタイプはそのＨＡ及びＮＡ表面タンパク質に従って命名され、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１のようにする。インフルエンザＢウイルス及びインフルエンザＡのサブタイプはさらに株として特徴づけられ、例えばＢ Ｍａｌａｙｓｉａ、Ｈ３Ｎ２ Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｈ１Ｎ１ Ｔａｉｗａｎのようにする。
【０００５】
ＨＡ及びＮＡはいずれも抗原エピトープを担持している。ＨＡ及びＮＡに対して高められた抗体は、ヒト及び動物における感染又は疾患のリスクを低下させる。最初のインフルエンザワクチンは不活化した全ウイルス粒子又は殺した全ウイルス粒子を含んでいたが、商業的に入手可能なインフルエンザワクチンは通常は２種のタイプのもの、即ち「スプリットワクチン」及び「サブユニットワクチン」である。
【０００６】
スプリットワクチンは、精製ウイルス粒子をエーテル又は界面活性剤で破壊し、次いで界面活性剤をウイルス脂質の大部分と共に除去することで製造される。したがって、スプリットワクチンは、全ウイルスワクチンと本質的に同じ要素を同じ比率で含んでいる。他方、サブユニットワクチンでは、表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡが個別に精製され、次いでワクチン中に合わされる。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、２種のやり方、即ち「抗原ドリフト」及び「抗原シフト」によって変化し得る。抗原ドリフトは生体の免疫系によって認識できない新しいウイルス株を生み出すのに対し、抗原シフトはインフルエンザＡウイルスにおける突然の大きな変化であって、新しい赤血球凝集素及びノイラミニダーゼタンパク質を生じて新しいインフルエンザＡサブユニットを生み出す。大抵の年には、インフルエンザワクチン中の３種のウイルス株のうちの１種又は２種が、循環するインフルエンザウイルスの変化についていくために更新される。
【０００８】
インフルエンザワクチンは、通常は多価である。即ち、ワクチンは同じウイルス種の２以上の株の培養物から製造される。現在、毎年のインフルエンザワクチン中にはインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株及びインフルエンザＢ株が含まれるのが通例である。
【０００９】
インフルエンザに対する予防接種の効力は、主としてワクチン中の免疫原性ＨＡの量により決定される。ワクチン中のＨＡ濃度は、通例、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイにより測定されてきた。ＳＲＩＤでは、インフルエンザビリオンが界面活性剤で破壊され、全ウイルス又は精製ウイルス抗原が特異性な抗赤血球凝集素（抗ＨＡ）抗体を含むアガロースゲル中への拡散に供される。得られた抗原／抗体反応物又はゾーン（染色によって可視化される）は、標本中のＨＡ抗原の量に正比例する。しかし、ＳＲＩＤアッセイはいくつかの欠点を有している。高い変動（約１０％）と共に高い検出限界（約２０μｇ／ｍｌ）を有することに加え、それは手間がかかり、低いスループットを有する。しかし、その欠点にもかかわらず、ＳＲＩＤはなお、欧州薬局方及びＷＨＯによって推奨されかつインフルエンザワクチンの評価のための取締り機関によって認可されている方法である。この方法の精度が悪いため、製造者はワクチン用量を「過剰充填」するのが普通である。
【００１０】
インフルエンザウイルスの定量のための他の方法には、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）がある。
【００１１】
また、インフルエンザウイルスを含むウイルスの検出のため、バイオセンサーに基づく方法も開発されてきた。
【００１２】
欧州特許出願公開第０２７６１４２号には、金被覆回折格子上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてインフルエンザＡウイルスを検出する方法が開示されている。インフルエンザＡウイルスの個別の決定基に対するモノクローナル抗体を金表面上に固定化し、ウイルスを適用してインキュベートした。次いで、インフルエンザＡウイルス決定基に対するモノクローナル抗体を表面と共にインキュベートし、第２の抗体がインフルエンザウイルス粒子に結合した場合に得られる増強応答を検出した。
【００１３】
特開平０３−０５４４６７号には、ウイルスの表面抗原に対する抗体で電極を被覆した圧電振動子によってウイルスの濃度を測定することが開示されている。抗原が電極に結合した場合、振動子の振動周波数が低くなる。
【００１４】
Ｓｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｄｉｍｍｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２（１９９６）３３−４２には、インフルエンザウイルスの検出のためにＳＰＲバイオセンサー計測器を使用することが開示されている。インフルエンザウイルスの捕捉のためのモノクローナル抗体を、カルボキシル化デキストランで被覆したセンサーチップに結合した。次いで、インフルエンザウイルスを計測器の流通系に注入してセンサーチップに接触させ、固定化抗体との結合親和性をモニターした。
【００１５】
Ｂｏｌｔｏｖｅｔｓ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１（２００４）１０１−１０６には、固定化プロテインＡを有するＳＰＲセンサー表面に対する、プレインキュベーション段階中に生成されるウイルス抗原と抗体との複合体の結合を検出することによる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた植物ウイルスの検出が開示されている。
【００１６】
Ｊｉｅ Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８９，４（２００７）１１９３−１１９９には、トリインフルエンザの検出のための干渉測定バイオセンサーイムノアッセイが開示されている。導波路表面上の抗原（赤血球凝集素）に特異的な抗体（ポリクローナル及びモノクローナルの両方）によって全ウイルス粒子を捕捉し、結合から生じた屈折変化を測定した。３種のインフルエンザウイルスサブタイプ（２種のＨ７及び１種のＨ８）を試験した。
【００１７】
しかし、これらの他の方法はいずれも実質的な欠点を有している。したがって、粗試料並びに精製試料中におけるインフルエンザウイルスの濃度（特にＨＡ濃度）を正確に決定するための改良された方法及び手段に対するニーズが存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
国際公開第２００６／０４１３９２号パンフレット
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的の１つは、ウイルス（特にインフルエンザウイルス）の検出及び定量のための方法であって、先行技術方法の欠点がなく、特に高い精度及び高い検出範囲を有すると共に標準のＳＲＩＤアッセイほど手間のかからない方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、ワクチン製造に際し、プロセス試料及び最終ワクチン試料の両方においてウイルス又はウイルス抗原を定量するのに適した方法を提供することである。
【００２１】
これらの目的並びに他の目的及び利点は、請求項１記載の方法によって達成される。
【００２２】
本発明に係る方法は、バイオセンサー技術及び阻害型アッセイフォーマットの使用に基づいている。
【００２３】
広義には、試料中のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定する方法は、
ウイルス抗原又はウイルス抗原類似体を固定化したセンサー表面を用意する段階、
試料をウイルス抗原に対する抗体の既知量と混合して、試料混合物中に抗原に対する抗体の所定（総）濃度を得る段階、
試料混合物をセンサー表面に接触させて、混合物中の遊離抗体をセンサー表面に結合させる段階、
遊離抗体の結合に対するセンサー表面の応答を測定する段階、並びに
所定濃度の抗体及び様々な濃度のウイルス又はウイルス抗原を含む混合物に関して得られる応答を測定することで作成された校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定する段階
を含んでなる。
【００２４】
好ましくは、中間で再生を行いながらセンサー表面に関して複数の分析サイクルが実施され、各分析サイクルに関して仮想校正曲線が計算される。これは、
曲線中の既知濃度の各々を、サイクル数をｘとしかつ応答をｙとする二重指数式に当てはめ、
これらの式を用いて各サイクルに関する仮想校正曲線を計算し、
特定のサイクルに関する仮想校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定することによって行うことができる。
【００２５】
ウイルス抗原は内部抗原であってもよいし、或いは好ましくはウイルスの表面抗原であってもよい。任意には、ウイルス抗原は全ウイルス粒子である。ウイルス抗原類似体は、例えば合成ペプチドであり得る。
【００２６】
好ましくは、試料は本方法によって同時に測定される複数種のウイルス又はウイルスタイプを含む。
【００２７】
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、天然のもの或いは部分的又は全体的に合成されたものであってよい免疫グロブリンをいい、Ｆａｂ抗原結合フラグメント、一価フラグメント及び二価フラグメントを含む活性フラグメントも包含する。この用語はまた、免疫グロブリンの結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質も包含する。かかるタンパク質は天然の供給源から導くことができるか、或いは部分的又は全体的に合成することができる。例示的な抗体は、免疫グロブリンのアイソタイプ並びにＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ及びＦｄフラグメントである。
【００２８】
通例、抗体はウイルス又はウイルス抗原に対する血清である。
【００２９】
一実施形態では、センサーチップが複数の感知領域を有していて、それぞれのウイルス又はウイルスタイプに対して特異的なウイルス抗原又は類似体が相異なる別々の感知領域上に固定化される。試料を１種のウイルスに対する抗体の一定量と混合し、次いで混合物を抗体に対して特異的な抗原を有する感知領域のみに接触させるか、或いは（抗体が他の抗原又は類似体と交差反応しなければ）すべての感知領域に接触させ、応答を検出する。これを他の抗体及び感知領域に関して順次に繰り返す。
【００３０】
別の実施形態では、センサーチップがただ１つの感知領域を有するか、或いは複数の感知表面を有するセンサーチップのただ１つの感知領域のみが使用される。この場合には、ウイルス抗原又は類似体をただ１つの感知領域上に共固定化し、試料をそれぞれの抗体の一定量と一度に１種ずつ混合し、それぞれの混合物を感知領域に順次に接触させる。
【００３１】
しかし、好ましい実施形態では、抗体が選択的であって他のウイルス又は抗原との交差反応性を示さない場合、相異なる抗体のすべてを試料と混合し、次いで各々がそれぞれの固定化ウイルス抗原又は類似体を有する複数の感知領域をもったセンサーチップに混合物を接触させ、相異なる感知領域の応答を検出する。別法として、センサー表面は同一感知領域に固定化されたそれぞれの抗原の混合物を含んでいてもよい。このようによすれば、試料中のすべてのウイルス又はウイルス抗原をただ１回の分析サイクルで検出できる。
【００３２】
定量すべき試料中のウイルス又はウイルス抗原は、好ましくは相異なるインフルエンザウイルスタイプ又はその抗原（好ましくは赤血球凝集素）である。
【００３３】
固定化された赤血球凝集素は、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの数種の株に対して包括的なものであってもよいし、或いはインフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの２種以上の株から導かれたものであってもよい。
【００３４】
一般に、バイオセンサーアッセイにおいては、被検体（ここでは試料中の遊離抗体）がセンサー表面上の固定化リガンド（ここではウイルス抗原又は類似体）に結合した場合、適当な流体で処理することで結合抗体を遊離させて新しい試料との接触のために表面を準備することが行われるが、このプロセスを再生という。通常、センサー表面はかなり多数の分析サイクルに供することができる。しかし、（例えばウイルス抗原のような）多くのリガンドは低い安定性を有する場合が多く、表面の被検体結合能力はサイクル数と共に減少し、定量目的のためのリガンドの使用を妨げることがある。結合能力のわずかな減少は頻繁な校正によって補償できることが多いが、これはスループットを顕著に減少させる。
【００３５】
したがって、本発明の方法は、仮想校正曲線（即ち、各サイクルについて得られる固有の校正曲線）を用いて各分析サイクルを評価する基準化段階を含み、かくしてドリフト中における頻繁な校正の必要性を最小化すると共に定量測定の品質を顕著に向上させる。
【００３６】
本発明並びにその追加の特徴及び利点の一層完全な理解は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することで得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、試料中に相異なるウイルス濃度を有する３つの場合（ａ〜ｃ）に関し、センサー表面上での阻害型ウイルスアッセイを示す模式図である。
【図２】図２は、３種のウイルス抗原がセンサー表面上のそれぞれの個別スポットに固定化され、各抗原に対して特異的な３種の抗体が定量のために使用される場合を示す、図１と同様な模式図である。
【図３】図３は、センサー表面上に固定化したインフルエンザウイルス抗原を用いる阻害型アッセイにおいて、実測された相対応答／安定度を様々なインフルエンザウイルス／抗血清混合物の濃度に対して示す図である。
【図４】図４は、固定化されたインフルエンザウイルス抗原を有するセンサー表面に対する複数の相異なるインフルエンザウイルス抗血清の結合に関し、実測された相対応答を分析サイクル数に対して示す図である。
【図５】図５は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイ中の４回の通常校正時において、７種の濃度のウイルス対照試料に関してサイクル数をｘとしかつ実測応答をｙとする当てはめ基準化曲線を示す図である。これらの基準化曲線は、各サイクルに関する仮想濃度を予測するために使用される。次いで、これらの仮想濃度は、仮想濃度をｘとしかつ既知濃度をｙとするサイクル特有の校正曲線を作成するために使用される。
【図６】図６は、固定化ウイルス抗原を有するセンサー表面上で実施される阻害型アッセイにおいて相異なるサイクル数で４回の通常校正を行いながら、２種の対照試料濃度に関して計算濃度を分析サイクル数に対して示す図である。
【図７】図７は、２種の対照試料濃度に関し、各サイクルに関する（図５に基づく）仮想校正曲線を図６と同じ生データに適用した場合を示す図である。
【図８】図８は、対照試料に関する実測結合データ及び各サイクルに関する仮想校正曲線によって基準化された対応データを示す、図７と同様な図である。
【図９Ａ】図９Ａは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第１の校正曲線を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第２の校正曲線を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、３種のウイルスタイプの同時検出のためのアッセイにおいて作成した第３の校正曲線を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
上述の通り、本発明はバイオセンサー技術及び阻害型アッセイフォーマットを使用して試料媒質中の１種以上のウイルス又はウイルス抗原の検出及び定量を行うための方法に関する。
【００３９】
まず、バイオセンサー技術について述べれば、バイオセンサーは広義には、固体物理化学的トランスデューサーと直接に結合した状態で、或いはトランスデューサーと結合している可動担体ビーズ／粒子と共に分子認識用の構成成分（例えば、固定化抗体を有する層）を使用する装置として定義される。かかるセンサーは通例は固定化層に関する質量、屈折率又は厚さの変化を検出する無標識技法に基づいているが、何らかの種類の標識に依存するバイオセンサーも存在する。本発明の目的のための典型的なセンサーには、特に限定されないが、光学的方法及び圧電又は弾性波方法（例えば、表面弾性波（ＳＡＷ）法及び水晶微量てんびん（ＱＣＭ）法を含む）のような質量検出方法がある。代表的な光学的検出方法には、外部および内部反射法の両方を含む反射光学的方法のような質量表面濃度を検出する方法があり、これらは角分解、波長分解、偏光分解又は位相分解することができる。例えば、エバネセント波偏光解析法及びエバネセント波分光法（ＥＷＳ又は内部反射分光法）（これらはいすれも表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるエバネセント場の増強を含み得る）、ブルースター角屈折率測定、臨界角屈折率測定、フラストレーテッド全反射（ＦＴＲ）、散乱全内部反射（ＳＴＩＲ）（これは散乱を増強する標識を含み得る）、光導波路センサー、外部反射イメージング、エバネセント波に基づくイメージング（例えば、臨界角分解イメージング、ブルースター角分解イメージング、ＳＰＲ角分解イメージング）などがある。さらに、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネセント波蛍光発光法（ＴＩＲＦ）及びリン光発光法に基づく測光方法及びイメージング／顕微鏡検査方法（「それ自体」で又は反射方法と組み合わせて使用される）、並びに導波路干渉計、導波路リーキングモード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、透過干渉測定、ホログラフィー分光法及び原子間力顕微鏡検査法（ＡＦＲ）が挙げられる。
【００４０】
ＳＰＲに基づくバイオセンサー装置並びに例えばＱＣＭを含む他の検出技法に基づくバイオセンサー装置は、いずれも１以上のフローセルを有する流通型装置及びキュヘット型装置として商業的に入手できる。複数の感知表面及び流通系を有する例示的なＳＰＲバイオセンサーには、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）がある。これらのシステムは、結合リガンドと検査対象の被検体との間の表面結合相互作用をリアルタイムでモニターすることを可能にする。この文脈中では、「リガンド」は所定の被検体に対して既知又は未知の親和性を有する分子であって、表面上に固定化された任意の捕捉剤又はキャッチング剤を含む一方、「被検体」はそれに対する任意の特異的結合パートナーを含む。
【００４１】
ＳＰＲバイオセンサーに関して述べれば、ＳＰＲの現象は公知である。異なる屈折率を有する２種の媒体間の界面であって、通例は金又は銀の金属フィルムで被覆された界面において光がある条件下で反射された場合にＳＰＲが起こることを述べれば十分であろう。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは、媒体は試料及びミクロ流体流路系によって試料に接触させるセンサーチップのガラスである。金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角における反射光の強度を低下させる。この最小反射光強度の角度は、反射光の反対側（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムでは試料側）の表面付近の屈折率に応じて異なる。
【００４２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器の技術的側面及びＳＰＲの現象の詳細な論議は、米国特許第５,３１３,２６４号中に見出すことができる。バイオセンサーの感知表面のマトリックスコーティングに関する一層詳細な情報は、例えば、米国特許第５,２４２,８２８号及び同第５,４３６,１６１号に示されている。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器に関連して使用されるバイオセンサーチップに関する技術的側面の詳細な議論は、米国特許第５,４９２,８４０号中に見出すことができる。上述した米国特許の全開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００４３】
以下の実施例では、本発明はＳＰＲ分光法（さらに詳しくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム）に関連して例示されるが、本発明はこの検出方法に限定されないことを理解すべきである。それどころか、固定化リガンドに対する被検体の結合を定量的に表す感知表面での変化を測定できさえすれば、被検体が感知表面上に固定化されたリガンドに結合する任意の親和性に基づく検出方法が使用できる。
【００４４】
次に、検出及び定量アッセイについて述べよう。一般に、阻害型アッセイ（溶液競合アッセイともいう）では、既知量の検出分子（ここでは抗体）を試料（ここではウイルス）と混合し、混合物中の遊離検出分子の量を測定する。さらに詳しくは、本発明のバイオセンサーに関連した濃度測定のための阻害型アッセイは、通例、下記の段階を含み得る。
１．被検体又はその誘導体をセンサー表面にリガンドとして結合する。
２．（既知又は未知の）一定濃度の検出分子を様々な濃度の校正物質溶液（被検体）に添加する。
３．混合物をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
４．校正曲線を計算する。
５．次いで、試料（被検体）を一定濃度の検出分子と混合することで測定を行う。試料をセンサー表面に接触させ（流路系内の表面上に注入し）、応答を測定する。
６．校正曲線を用いて試料中の被検体濃度を計算する。遊離検出分子の量は、試料中の被検体濃度と逆の関係にある。
７．表面を再生し、新しい試料を注入することができる。
【００４５】
本発明の方法では、リガンドはウイルス抗原、好ましくは表面抗原（又は任意には全ウイルス）であるのに対し、被検体は抗原に対する抗体である。抗体はポリクローナル（例えば血清）又はモノクローナルであり得る。阻害型アッセイフォーマットのため、表面への大きいウイルス粒子の拡散効果は回避される。
【００４６】
以下、例示目的のため、試料中の１種以上のインフルエンザウイルスの濃度、さらに詳しくは三価インフルエンザワクチン中の３種のウイルスタイプの赤血球凝集素（ＨＡ）の濃度を決定することに関して本発明を説明するが、これに限定されるわけではない。添付の図面中の図１〜９を参照しながら説明を行う。
【００４７】
図１ａに模式的に示される通り、参照番号１で表される精製ウイルスＨＡをバイオセンサーのセンサー表面２上に固定化する。ウイルス粒子３と抗体４を含む抗血清との混合物をセンサー表面２上に液体流れとして通過させる。図１ａに示される通り、抗体４はウイルス粒子又は固定化ＨＡ抗原に結合していることもあれば、溶液中に遊離していることもある。センサー表面への結合は、センサー表面からの応答信号を増加させる。
【００４８】
図１ｂは、試料中にウイルスが存在しない場合を示している。この場合には、最大量の抗体４がセンサー表面上のＨＡ抗原１に結合し、高い応答信号を生じる。
【００４９】
他方、図１ｃでは、高濃度のウイルス粒子３が少量の遊離抗体４を生み出し、したがって低い応答信号が測定される。このように、試料中のウイルスの濃度が高いほど、表面ＨＡに結合する抗体の量は少なくなり、低い応答レベルを生じる。
【００５０】
センサー表面が複数（例えば、３以上）の個別感知領域又は「スポット」を有するか、或いはそれを提供し得るならば、図２に示すように、例えば３種のＨＡを固定化することができる。この場合、（現行のインフルエンザワクチン中で通例使用される）ウイルスタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢに対して特異的なＨＡがセンサー表面上のそれぞれのスポットに固定化されている。
【００５１】
下記に実証されるように、ＨＡに対する異なるウイルス抗血清の結合は選択性である。即ち、異なるウイルスタイプ又はサブタイプ間の交差反応性は存在しない。このような選択性のため、多価ワクチンのような試料中の２種以上のウイルス成分は同時に測定できる。
【００５２】
次に、上述した３種のウイルスタイプ／サブタイプＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢを含む試料に適用される本発明方法の例示的な実施形態を説明しよう。
【００５３】
３種のウイルスタイプからのＨＡを、センサー表面上の３つの異なるスポットに固定化する。
【００５４】
次いで、校正手続きを実施する。各ウイルスタイプに関する一定濃度の標準抗血清からなる校正物質を、測定すべき濃度範囲をカバーする様々な既知濃度のウイルス（又はウイルス抗原）と混合する。次いで、校正物質をセンサー表面のスポット上に（３種のタイプを別々に又は一緒に）注入し、応答を測定する。次いで、測定の結果から校正曲線を計算する。
【００５５】
次いで、各ウイルスを一定濃度の抗血清（一度に１種ずつ又は好ましくは３種の抗血清のすべてを用いる）と混合することで試料中のウイルスＨＡ含有量の測定を実施する。試料をセンサー表面上に注入し、遊離抗血清濃度を測定する。校正曲線を用いて試料中のウイルス抗原濃度を計算する。
【００５６】
次いで、表面を再生し（即ち、表面を適当な再生流体に接触させることで固定化ＨＡから結合抗体を解離させ）、新しい試料を表面上に流すことができる。
【００５７】
上述したように、好ましくは試料を３種の抗血清のすべてと混合し、試料をすべての３つのスポット上に注入することで、３種のウイルスタイプ／サブタイプからのＨＡの濃度をただ１つの分析サイクルで分析することができる。したがって、多価（例えば三価）インフルエンザワクチンのすべてのウイルス成分を同時に測定し得るアッセイを開発することができる。
【００５８】
下記に示されるように、インフルエンザウイルスサブタイプの様々な株と該サブタイプの１つの株の赤血球凝集素との間に実質的な交差反応性が存在することが判明した。したがって、常用ウイルス株の各々に関する包括的アッセイを開発できるように思われる。かくして、かかるアッセイは、毎年変化するインフルエンザワクチンのウイルス株の組合せに関係なく、インフルエンザワクチン中のウイルス抗原含有量を測定するため広く使用できよう。
【００５９】
上述したアッセイでは、高品質の分析結果を得るための必要条件は、センサー表面上に固定化されたリガンド（ＨＡ）が一定の結合能力を有すること、及び表面上に注入される校正物質が高い安定性を有することである。一般に、結合能力のわずかな減少は頻繁な校正によって補償できることが多い。しかし、頻繁な校正はスループットを減少させると共に、試薬の消費によるコストの増加をもたらす。
【００６０】
本発明に従えば、「仮想」校正曲線を用いて各分析サイクルを評価することで、ドリフト中における頻繁な校正の必要性を最小化すると共に、例えば上述したＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いた定量測定の品質を顕著に向上させる方法が案出された。かかる方法は基本的には任意のリガンドに対して広く適用可能であり、とりわけ直接結合アッセイ、阻害アッセイ及びサンドイッチアッセイを含む各種のアッセイフォーマットで使用できるものの、それは本発明のウイルス検出に関連して特別の重要性を有する。これは、ＨＡのようなウイルス抗原が通常はセンサー表面上でのドリフトを引き起こす顕著な不安定性を示すからである。
【００６１】
センサー表面の結合能力は減少する一方、対照品の測定／計算濃度は新しい校正作業が行われるまでに実施される分析サイクルの数（又はサイクル数）の関数として増加する。これは、阻害型アッセイフォーマットでは、校正曲線が結合能力の減少を試料中のＨＡ濃度の増加として解釈するからである。このようなドリフトは分析サイクル数の増加と共に増加し、しばしば指数関数的である。本発明の方法では、分析サイクルは、固定化ＨＡを有するセンサー表面上にウイルスと検出抗体との混合物を流す段階、次いで表面を再生して次の分析サイクルの準備を行う段階を含んでいる。
【００６２】
本発明に従えば、新しい校正ルーチンは様々なやり方で設計できる。
【００６３】
１つの変形例では、抗体作業からの生データを用いて各分析サイクルに関する仮想濃度を予測し、次いでサイクル特有の校正曲線の計算及び試料／対照品に関する濃度の予測を行う。
【００６４】
別の変形例では、現実の校正の各々に関して校正式を計算し、次いで各サイクルに関する校正係数を予測し、それを用いて試料／対照品の予測を行う。
【００６５】
上述した第１の方法は実施例４及び実施例５に一層詳しく記載され、第２の変形例は下記実施例６に一層詳しく記載される。
【００６６】
例えば多価インフルエンザワクチンの分析のために本発明の方法を実施するためのアッセイキットは、目標インフルエンザウイルスタイプ／サブタイプに関する赤血球凝集素（又は赤血球凝集素類似体）、該ウイルスタイプ／サブタイプに関する標準血清及びウイルス標準品、並びに任意にはセンサーチップを含み得る。
【００６７】
以下の実施例には、限定ではなく例示を目的として本発明の様々な態様を一層詳細に開示する。
【実施例】
【００６８】
計測機器
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。この計測器はセンサーチップ上の金表面での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出に基づくもので、試料及び操作用緩衝液を４つの個別に検出されるフローセル（Ｆｃ１〜Ｆｃ４と表示する）に１つずつ又は連続して通過させるための微小流体系（一体化微小流体カートリッジ−ＩＦＣ）を使用している。ＩＦＣは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００計測器内において合体機構によりセンサーチップに圧着されている。
【００６９】
センサーチップとしては、カルボキシメチル修飾デキストランポリマーの共有結合ヒドロゲルマトリックス（約１００ｎｍ）と共に金被覆（約５０ｎｍ）表面を有するシリーズＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を使用した。
【００７０】
計測器からの出力は、（「共鳴単位」（ＲＵ）で測定された）検出器の応答を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。１０００ＲＵの増加は、センサー表面上での約１ｎｇ／ｍｍ2の質量増加に相当している。
【００７１】
実施例１：インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＢ／Ｊｉｌｉｎのアッセイ
材料
赤血球凝集素（ＨＡ）Ａ／Ｈ３Ｎ２，Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（メリデン、米国）から入手した。
ＨＡ Ａ／Ｈ１Ｎ１，Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９は、ＰｒｏｓＰｅｃ社（レホヴォト、イスラエル）から入手した。
ＨＢ／Ｊｉｌｉｎは、ＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（サンディエゴ、米国）から入手した。
血清及びウイルス株は、ＮＩＢＳＣ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ポッターズバー、 英国ハートフォードシャー州）から入手した。
アッセイ用及び試料用緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
【００７２】
方法
下記のように、アミンカップリングを用いて、ＨＡ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１及びＢ）をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の３つのそれぞれのフローセル内のＣＭ５センサーチップに固定化する。
Ｈ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇ及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｈ３Ｎ２／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で１０μｇ／ｍｌ、７分間。
Ｂ／Ｊｉｌｉｎ：１０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．０５％界面活性剤Ｐ２０中で５μｇ／ｍｌ、２０〜３０分間。
固定化レベルは５０００〜１００００ＲＵである。
それぞれのウイルス株に対する血清を、供給者によって推奨されるように、ＳＲＩＤ力価に基づく希釈率を用いて希釈する。例えば、ＳＲＩＤのため１ｍｌに希釈された７μｌの血清は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００中における２００倍の希釈度に相当している。（希釈は約５００〜１５００ＲＵが得られるように行われる。）注入時間は５分である。
血清を用いて３〜１０回の開始サイクルを実施する。
最初に供給者によって推奨されるようにＭＱで希釈され（この場合、ＨＡはアリコートに分けて凍結保存される）、次いでさらに血清で通例０．１〜１５μｇ／ｍｌに希釈されたウイルス抗原（ＨＡ）を用いて校正曲線を作成する。
標準品及び試料は４００秒の注入時間を有している。
再生は２０〜５０ｍＭ ＨＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０を用いて３０秒間実施し、次いで３０秒間の安定化を行う。
【００７３】
実施例２：同一ウイルスサブタイプの様々な株の検出の普遍性
Ｈ３Ｎ２株Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡをＣＭ５センサーチップに固定化し、その表面を様々なウイルス／抗血清の組合せに接触させた。かかる組合せは、Ｗｙｏｍｉｎｇからのウイルス／抗血清（Ｗ／Ｗ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋからのウイルス／抗血清（Ｎ．Ｙ．／Ｎ．Ｙ．）、Ｗｙｏｍｉｎｇウイルス及びＮｅｗ Ｙｏｒｋからの血清（Ｗ／Ｎ．Ｙ．）並びにＮｅｗ Ｙｏｒｋウイルス及びＷｙｏｍｉｎｇからの血清（Ｎ．Ｙ．／Ｗ）であった。それぞれの組合せを用いて校正曲線を作成した。結果を図３に示す。図から明らかな通り、異なるウイルス株間には交差反応性が存在する。したがって、Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ及びウイルス／抗血清はＮｅｗ Ｙｏｒｋ株の定量のために使用でき、その逆もまた正しい。
【００７４】
実施例３：様々なインフルエンザウイルスタイプ／サブタイプのＨＡに対する抗血清の結合の選択性
インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２、Ａ Ｈ１Ｎ１及びＢの様々な株に対する２７種の抗血清を固定化Ｈ３Ｎ２ Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ上に注入し、その結合を検出した。結果及び使用した株のリストを図４に示す。図から明らかな通り、すべてのＨ３Ｎ２抗血清は１００ＲＵより高い信号をもって結合する一方、すべてのＨ１Ｎ１及びＢ抗血清は５０ＲＵ未満の信号を有している。これは、数種のウイルス株を同時に定量できること、及びＨ３Ｎ２の測定のためには１種又は若干種のＨＡのみが必要であることを表している。
【００７５】
実施例４：仮想校正手続き
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００及びＣＭ５センサーチップ上で複数（約１００回）のアッセイサイクルを実施したが、その間に７種の濃度（０．１５６、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５及び１０μｇ／ｍｌ）の対照試料を用いて４回の通常校正を行った。７種の濃度の各々に関し、サイクル数をｘとし、応答をｙとし、かつａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅを当てはめパラメーターとする関数ｙ(ｘ)＝ａ*ｅｘｐ(−ｂ*ｘ)＋ｃ*ｅｘｐ(−ｄ*ｘ)＋ｅを当てはめた。結果を図５に示すが、最上部の曲線は最も低い濃度の対照品（即ち、阻害アッセイでは最も高い応答）を表し、最下部の曲線は最も高い濃度の対照品（即ち、最も低い応答）を表している。次いで、これらの式を用いて各サイクルに関する仮想応答を計算した。次いで、図６及び図７を参照しながら下記に説明されるように、これらの応答を用いて各サイクルに関する校正曲線を計算し、この校正曲線を用いて正にそのサイクルで試料及び対照品の予測を行った。
【００７６】
図６は、２種の対照品（１．０μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌ）の計算濃度に関するドリフトを示している。多数のアッセイサイクルを実施し、二重波線矢印で表されるサイクル数で４回の中間校正を行った。各校正後に３つ（又は２つ）の対照品の濃度を最も近い先行校正曲線に対して計算した。波線矢印によって表されるように、校正までの距離の増加に伴って計算濃度の系統的な増加が存在している。このような計算濃度の増加は、対照試料からの信号の減少に原因している。これはまた、表面の結合能力がサイクル数の関数として減少し、校正曲線がかかる減少を濃度の増加として解釈することに原因している。このような結合能力の減少はまた、図３及び図４に見ることができる。
【００７７】
上述した仮想校正方法を図６の生データに適用すれば、０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌの対照品に関して図７に示す濃度推定値が得られるが、これは対照試料の濃度の予測における再現性の顕著な向上である。
【００７８】
実施例５：仮想校正手続きによる結合データの基準化
ＨＡ組換えタンパク質ＨＢ／Ｊｉｌｉｎ、Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ及びＨ３Ｎ２／Ｗｙｏｍｉｎｇを固定化した。校正曲線を得た。試料を希釈し、０．５〜１．５μｇ／ｍｌの範囲内の濃度を測定して再計算した。応答のドリフトを回避するため、上記実施例４に概述した基準化手続きを用いて結果を基準化し、各サイクルは固有の校正曲線を得た。図８は、２５０ＲＵの応答及び１．２％のＣＶを与える対照試料（５μｇ／ｍｌのＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３）に関する基準化前及び基準化後の結果を示している。
【００７９】
実施例６：３種のウイルスタイプの同時検出
３つのフローセルに、３種の組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、即ちＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｊｉｌｉｎを固定化した。
【００８０】
３種のインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａからのウイルス標準品を、各標準品の最終濃度が１６μｇ／ｍｌとなるように希釈して混合した。次いで、１６μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌまでの２倍系列希釈液として校正曲線を作成した。
【００８１】
分析すべき３種のワクチンＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢを８倍、１６倍、３２倍及び６４倍に希釈した。
【００８２】
３種の血清（ＮＩＢＳＣからのＨ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ）を、５００〜７００ＲＵの応答を与える濃度に希釈して混合した。
【００８３】
製造者による事前混合物 最終希釈度
Ｈ１Ｎ１／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ ６０倍希釈度 １８０倍
Ｈ３Ｎ２／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ７０倍希釈度 ２１０倍
Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ ２０倍希釈度 ６０倍
ワクチンを分析するためには、標準品及びワクチンの複製物をまず血清溶液と混合し、次いで「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」で生み出された方法を用いてフローセル中に流した。
【００８４】
「Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ」からの一般的方法は下記の通りであった。
開始（試料の代わりに緩衝液を用いて７サイクル、次いで再生、２時間）
校正曲線１（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線２（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
校正曲線３（１４サイクル）
試料（１２サイクル）
次いで、３つの校正曲線について結果を基準化した。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによる濃度測定のために通常使用される４パラメーター回帰曲線（式１）に校正曲線の４パラメーター当てはめを実施して４つの係数を決定することで行った。
【００８５】
【数１】
式中、Ｒhighは低ウイルス濃度での応答であり、Ｒlowは低ウイルス濃度での応答であり、Ａ1（ＥＣ５０）及びＡ2（Ｈｉｌｌ勾配）は当てはめパラメーターであり、Ｘはウイルスの濃度である。
【００８６】
次いで、様々な濃度で４つの係数の各々に関して得られた値を分析サイクル数に対してプロットすることで、各係数に関する式を得た。上記の式１によって得られた係数を用いて、基準化濃度を計算した。
【００８７】
結果
【００８８】
【表１】
製造者によれば、ワクチン中の各株のＨＡ濃度は、ＳＲＩＤで分析して３０μｇ／ｍｌのはずである。
【００８９】
３つの校正曲線を図９に示す（上述した校正曲線１〜３を各図に示す）。
【００９０】
上記のことから、例示目的のために本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載してきたが、本発明の技術思想及び技術的範囲から逸脱せずに様々な変更を行い得ることが理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲以外によって限定されることはない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のウイルス又はその抗原の濃度を決定する方法であって、
ウイルス抗原又はウイルス抗原類似体を固定化したセンサー表面を用意する段階、
試料をウイルス抗原に対する抗体の既知量と混合して、試料混合物中に抗原に対する抗体の所定濃度を得る段階、
試料混合物をセンサー表面に接触させて、混合物中の遊離抗体をセンサー表面に結合させる段階、
遊離抗体の結合に対するセンサー表面の応答を測定する段階、並びに
所定濃度の抗体及び様々な濃度のウイルス又はウイルス抗原を含む混合物に関して得られる応答を測定することで作成された校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
中間で再生を行いながらセンサー表面に関して複数の分析サイクルが実施され、各分析サイクルに関して仮想校正曲線が計算される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
校正曲線の計算が、
曲線中の既知濃度の各々を、サイクル数をｘとしかつ応答をｙとする二重指数式に当てはめ、
これらの式を用いて各サイクルに関する仮想校正曲線を計算し、
特定のサイクルに関する仮想校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、別々の分析サイクルにおいて、抗原又は類似体の異なる１者を固定化したセンサー表面に順次に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又は抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、それぞれの抗原又は類似体を固定化した個別の感知領域を有するセンサー表面に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又は抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、同一感知領域に固定化されたそれぞれの抗原の混合物を含む感知領域に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、ただ１つの分析サイクルにおいて、それぞれの抗原又は類似体を固定化した個別の感知領域を有するセンサー表面に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ウイルスに対する抗体がウイルス又はウイルス抗原に対する血清からなる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
様々なウイルスがインフルエンザウイルスタイプ及びサブタイプから選択される、請求項４乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス抗原が赤血球凝集素からなる、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
試料がインフルエンザワクチン製造から導かれる、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
試料が多価インフルエンザワクチンから導かれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
固定化された赤血球凝集素が、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの複数種の株に対して包括的なものである、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
固定化された赤血球凝集素が、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの２種以上の株から導かれたものである、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
多価インフルエンザワクチンが三価であり、ウイルスＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢ株から導かれる、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
センサー表面上での結合相互作用が、質量感知、好ましくはエバネセント波感知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
多価インフルエンザワクチン中のウイルス又はウイルス抗原の含有量を決定する方法であって、
各ウイルスタイプ又はサブタイプに関する赤血球凝集素をバイオセンサー感知表面のそれぞれの個別感知領域上に固定化する段階、
ワクチンの試料をワクチン中のウイルスタイプ又はサブタイプの各々に対する一定濃度の抗血清と混合する段階、
ただ１つの分析サイクルにおいて、混合物をセンサー表面に接触させて遊離抗血清をそれぞれの感知領域に結合させ、各感知領域での結合に対する応答を測定する段階、並びに
試料中の各ウイルスタイプ又はサブタイプ或いはその抗原の含有量を相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関する校正曲線から決定する段階
を含んでなる方法。
【請求項１９】
校正曲線の作成が、
ａ）各ウイルスタイプ又はサブタイプに対する一定濃度の標準抗血清を相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関するウイルス又はウイルス抗原の所定量と混合することで校正物質混合物を調製する段階、
ｂ）センサー表面を混合物に接触させて遊離抗血清をそれぞれの感知領域に結合させ、各感知領域での応答を測定する段階、
ｃ）相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関するウイルス又はウイルス抗原の様々な量を含む混合物に関して段階ａ）及び段階ｂ）を繰り返す段階、並びに
ｄ）各ウイルスタイプ又はサブタイプに関して校正曲線を計算する段階
を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項１】
試料中のウイルス又はその抗原の濃度を決定する方法であって、
ウイルス抗原又はウイルス抗原類似体を固定化したセンサー表面を用意する段階、
試料をウイルス抗原に対する抗体の既知量と混合して、試料混合物中に抗原に対する抗体の所定濃度を得る段階、
試料混合物をセンサー表面に接触させて、混合物中の遊離抗体をセンサー表面に結合させる段階、
遊離抗体の結合に対するセンサー表面の応答を測定する段階、並びに
所定濃度の抗体及び様々な濃度のウイルス又はウイルス抗原を含む混合物に関して得られる応答を測定することで作成された校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
中間で再生を行いながらセンサー表面に関して複数の分析サイクルが実施され、各分析サイクルに関して仮想校正曲線が計算される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
校正曲線の計算が、
曲線中の既知濃度の各々を、サイクル数をｘとしかつ応答をｙとする二重指数式に当てはめ、
これらの式を用いて各サイクルに関する仮想校正曲線を計算し、
特定のサイクルに関する仮想校正曲線から試料中のウイルス又は抗原の濃度を決定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、別々の分析サイクルにおいて、抗原又は類似体の異なる１者を固定化したセンサー表面に順次に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又は抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、それぞれの抗原又は類似体を固定化した個別の感知領域を有するセンサー表面に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又は抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、同一感知領域に固定化されたそれぞれの抗原の混合物を含む感知領域に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
試料中の２種以上、好ましくは３種以上のウイルス又はウイルス抗原の濃度を決定するため、試料とそれぞれのウイルス抗原に対して選択的な抗体との混合物を、ただ１つの分析サイクルにおいて、それぞれの抗原又は類似体を固定化した個別の感知領域を有するセンサー表面に接触させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ウイルスに対する抗体がウイルス又はウイルス抗原に対する血清からなる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
様々なウイルスがインフルエンザウイルスタイプ及びサブタイプから選択される、請求項４乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス抗原が赤血球凝集素からなる、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
試料がインフルエンザワクチン製造から導かれる、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
試料が多価インフルエンザワクチンから導かれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
固定化された赤血球凝集素が、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの複数種の株に対して包括的なものである、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
固定化された赤血球凝集素が、インフルエンザウイルスタイプ又はサブタイプの２種以上の株から導かれたものである、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
多価インフルエンザワクチンが三価であり、ウイルスＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢ株から導かれる、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
センサー表面上での結合相互作用が、質量感知、好ましくはエバネセント波感知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
多価インフルエンザワクチン中のウイルス又はウイルス抗原の含有量を決定する方法であって、
各ウイルスタイプ又はサブタイプに関する赤血球凝集素をバイオセンサー感知表面のそれぞれの個別感知領域上に固定化する段階、
ワクチンの試料をワクチン中のウイルスタイプ又はサブタイプの各々に対する一定濃度の抗血清と混合する段階、
ただ１つの分析サイクルにおいて、混合物をセンサー表面に接触させて遊離抗血清をそれぞれの感知領域に結合させ、各感知領域での結合に対する応答を測定する段階、並びに
試料中の各ウイルスタイプ又はサブタイプ或いはその抗原の含有量を相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関する校正曲線から決定する段階
を含んでなる方法。
【請求項１９】
校正曲線の作成が、
ａ）各ウイルスタイプ又はサブタイプに対する一定濃度の標準抗血清を相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関するウイルス又はウイルス抗原の所定量と混合することで校正物質混合物を調製する段階、
ｂ）センサー表面を混合物に接触させて遊離抗血清をそれぞれの感知領域に結合させ、各感知領域での応答を測定する段階、
ｃ）相異なるウイルスタイプ又はサブタイプに関するウイルス又はウイルス抗原の様々な量を含む混合物に関して段階ａ）及び段階ｂ）を繰り返す段階、並びに
ｄ）各ウイルスタイプ又はサブタイプに関して校正曲線を計算する段階
を含む、請求項１８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５２２２４９（Ｐ２０１１−５２２２４９Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１５６９（Ｐ２０１１−５１１５６９）
【出願日】平成２１年６月１日（２００９．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５０６３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８３９５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１日（２００９．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５０６３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８３９５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
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