ウメの不定胚誘導法
【課題】迅速かつ簡単に、突然変異体を生じることなく、増殖能力を備えた不定胚を形成する、ウメの不定胚誘導法を提供する。
【解決手段】この発明にかかるウメ不定胚の誘導方法は、未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するものである。なお、オーキシンとサイトカイニンの濃度は実質的に同じであるのが好ましく、オーキシンとしては２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、サイトカイニンとしてはベンジルアデニン（ＢＡ）を使用するのが好ましい。
【解決手段】この発明にかかるウメ不定胚の誘導方法は、未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するものである。なお、オーキシンとサイトカイニンの濃度は実質的に同じであるのが好ましく、オーキシンとしては２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、サイトカイニンとしてはベンジルアデニン（ＢＡ）を使用するのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ウメの不定胚誘導法に関し、特にカルス形成を経由することなく、外植片上に直接不定胚を誘導するウメの不定胚誘導法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウメなどのサクラ属果樹類の繁殖は、品種の形質（特長）を安定させ、収穫までの期間を短縮するため、結実した種子から行う（種子繁殖）のではなく、接ぎ木（栄養繁殖）によって行うのが一般的である。なお、接ぎ木とは、有用形質を持った親の枝（穂木）を近縁種の台木に接着・再生させて新たな個体を得る繁殖方法である。
【０００３】
ところで、接ぎ木においては、使用する台木により耐干性・耐水性・耐凍性等の各種形質が左右されることが一般的に知られており、サクラ属果樹類においても、台木の選択によって果実の生産性やその品質が大きく変化することが知られている。なお、現在使用されている台木の多くは実生台木であり、遺伝的な性質が不揃いなため、優れた台木を見分けるのは難しかった。
【０００４】
そのため、以前から優れた性質を備えた台木を開発することが試みられてはいる。しかし、サクラ属果樹類には、台木として利用できる大きさまで成長するのに長い時間がかり、上記のように、種子繁殖では品種の形質が安定しにくいため、一般的な交雑育種を利用することは困難である。そこで、従来から、育種を効率化することを目的として、組織培養や遺伝子導入などのバイオテクノロジー技術を利用した研究がなされている。
【０００５】
ところで、サクラ属果樹類は、果樹の中ではゲノムサイズが小さく、また幼木期が短いため、遺伝解析が比較的容易である。しかし、サクラ属果樹類の組織培養からの再分化は困難であり、これが形質転換を行う上での障壁となっている。
【０００６】
このことはウメに関しても当てはまり、ウメについてはこれまで充分効率的な再分化系は確立されておらず、形質転換の成功例も報告されていない。なお、現在までに報告されているウメの再分化系としては、ウメ「紅サシ」の未熟子葉からの再分化系が挙げられるが、この再分化系では未熟子葉上にいったんカルスを誘導させ、そのカルスを組成の異なる培地に植え替えることにより、不定芽を誘導させたものである（非特許文献１を参照。）。
【０００７】
しかし、上記の再分化系は、組成の異なる培地に植え替えるため、不定芽を形成させるまでに時間と手間がかかり、カルス形成を経由しているため突然変異体が生じやすいという問題点があった。また、不定芽は不定胚とは異なり増殖能力を備えておらず、台木の生産には利用できないとの問題点もあった。
【非特許文献１】中川文雄ら 「ウメ未熟子葉由来カルスからの不定芽形成」 園芸学会雑誌 第６３巻 別冊１ １９９４年 ｐ８８−８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この発明は、迅速かつ簡単に、突然変異体を生じることなく、増殖能力を備えた不定胚を形成する、ウメの不定胚誘導法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明にかかるウメ不定胚の誘導法は、未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するものである。なお、オーキシンとサイトカイニンの濃度実質的に同じであるのが好ましく、オーキシンとしては２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、サイトカイニンとしてはベンジルアデニン（ＢＡ）を使用するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
この発明により、ウメでは初めて不定胚を誘導させることができた。また、この不定胚は、前記の不定芽とは異なって増殖が可能である。そのため、今後の研究によって、この不定胚を効率よく増殖させることができるようになれば、この不定胚を用いてウメの形質転換も行えるようになり、将来的には、形質転換により優良な形質をもったウメのクローン台木を大量に得ることができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この発明のウメの不定胚誘導法は、ウメの未熟果実をエタノールで滅菌し、滅菌したメス、ピンセット等で果実中の種子から胚を摘出し、この胚の子葉をＷＰ寒天培地に置床して培養することにより、カルスを経由させずに直接子葉表面に不定胚を誘導するものである。そこで、以下にこの発明の内容について詳説する。
【００１２】
（使用する未熟子葉）
未熟子葉を採取する果実としては未熟果実であり、具体的には、開花後８５日以内に採取された未熟果実であり、好ましくは７０日以内、さらに好ましくは６０日以内であるほうがよい。なお、ウメの品種としては、市場において取引されている品種、例えば、「紅サシ」、「古城」など通常栽培されている品種であれば特にこだわることなく使用できるが、穂木との親和性や果実の商品力を考えると、「南高」が好ましい。
【００１３】
（培地の組成）
使用する培地は有機、無機の栄養分を含んだＷＰ寒天培地に糖分としてソルビトール１〜１０重量％、好ましくは２〜４％を添加し、さらに植物ホルモンとしてオーキシン及びサイトカイニンをそれぞれ０．２〜４μＭずつ添加したものである。また、植物ホルモンの濃度は実質的に同じであることが好ましい。これは、サイトカイニンの濃度に比べてオーキシンの濃度が高い場合にはカルス形成する傾向が強く、細胞核中の染色体数がカルスを経由すると遺伝的な安定性に欠け、不定胚の培養によって得られる再生植物体に奇形が生じる不具合があり、反対に、オーキシンの濃度に比べてサイトカイニンの濃度が高い場合は、褐変する傾向が強くなるという不具合があるためである。
【００１４】
また、オーキシンとしては、インドール−３−酪酸、インドール酢酸、２，４−Ｄ、ナフタレン酪酸などの市販のものであれば特に制限なく使用することができるが、なかでも２，４−Ｄが好ましい。さらに、サイトカイニンとしては、ＢＡ、フォルクロルフェニュロンなどの市販のものであれば特に制限なく使用することができるが、なかでもＢＡが好ましい。
【００１５】
（培養方法）
以上の方法で調整した培地に子葉を置床して、温度は２５℃前後、飽和水蒸気量に対する湿度が７０％、暗黒に調製した環境で静置培養すると、約４０日後に子葉の表面に突起状の隆起が見られるようになり、２ヶ月後には１子葉当り約５〜１０個の不定胚が誘導された。
【００１６】
（不定胚からの誘導）
このようにして作られた不定胚からは、他の植物の不定胚と同様の方法により、再生植物体を得ることが予測できるし、増殖用培地に移して培養すれば、大量の二次不定胚を誘導することも予測できる。
【実施例１】
【００１７】
(未熟子葉からの不定胚形成)
２００４年５月６日（開花後約８０日）、１３日、２４日に採取（開花日：２月１５日）した「南高」(以下Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３)の未熟果実を７０％エタノールに１５分間浸漬し、滅菌水で３回洗浄した。この果実中の種子から無菌的に胚を摘出し、子葉を縦４つに切断して培養材料（未熟子葉切片）とした。
【００１８】
この培養材料を、ショ糖３重量％又はソルビトール３重量％を含み、２，４−Ｄ １μＭ及びＢＡ １μＭを加えたＭＳ又はＷＰ基本培地（成分は表１を参照。）からなる４種類の０．７％寒天培地（Ａ〜Ｄ、表２を参照。) に置床して、暗所２５℃で培養した。なお、培養容器にはプラスチックシャーレ(９０×２０ｍｍ)を使用し、各区１００果実ずつとなるよう、１シャーレに１種子由来の４つの子葉切片を置床した。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
置床６０日後に不定胚形成率を調査した。その結果を表２に示す。その結果、不定胚（図１を参照。）の形成率はＮ１のＤ区で高かった(２７．８％)が、それ以外ではほとんど認められなかった(０〜２．６％)。また、全ての実験区でカルス形成が認められ、特にＢ区でカルス形成率が高かった(データは省略する。)。
【００２２】
このように、ウメ未熟子葉を同じ濃度のオーキシン、サイトカイニンを含有するとともに、糖分としてソルビトールを含有するＷＰ培地を使用することにより、３０％近くの確率で不定胚を形成することが確認できた。また、培養条件が同じならば、開花してから未熟子葉をＷＰ培地に置床するまでの時間が短いほど、不定胚の形成率が高いことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】子葉上に形成された不定胚を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ウメの不定胚誘導法に関し、特にカルス形成を経由することなく、外植片上に直接不定胚を誘導するウメの不定胚誘導法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウメなどのサクラ属果樹類の繁殖は、品種の形質（特長）を安定させ、収穫までの期間を短縮するため、結実した種子から行う（種子繁殖）のではなく、接ぎ木（栄養繁殖）によって行うのが一般的である。なお、接ぎ木とは、有用形質を持った親の枝（穂木）を近縁種の台木に接着・再生させて新たな個体を得る繁殖方法である。
【０００３】
ところで、接ぎ木においては、使用する台木により耐干性・耐水性・耐凍性等の各種形質が左右されることが一般的に知られており、サクラ属果樹類においても、台木の選択によって果実の生産性やその品質が大きく変化することが知られている。なお、現在使用されている台木の多くは実生台木であり、遺伝的な性質が不揃いなため、優れた台木を見分けるのは難しかった。
【０００４】
そのため、以前から優れた性質を備えた台木を開発することが試みられてはいる。しかし、サクラ属果樹類には、台木として利用できる大きさまで成長するのに長い時間がかり、上記のように、種子繁殖では品種の形質が安定しにくいため、一般的な交雑育種を利用することは困難である。そこで、従来から、育種を効率化することを目的として、組織培養や遺伝子導入などのバイオテクノロジー技術を利用した研究がなされている。
【０００５】
ところで、サクラ属果樹類は、果樹の中ではゲノムサイズが小さく、また幼木期が短いため、遺伝解析が比較的容易である。しかし、サクラ属果樹類の組織培養からの再分化は困難であり、これが形質転換を行う上での障壁となっている。
【０００６】
このことはウメに関しても当てはまり、ウメについてはこれまで充分効率的な再分化系は確立されておらず、形質転換の成功例も報告されていない。なお、現在までに報告されているウメの再分化系としては、ウメ「紅サシ」の未熟子葉からの再分化系が挙げられるが、この再分化系では未熟子葉上にいったんカルスを誘導させ、そのカルスを組成の異なる培地に植え替えることにより、不定芽を誘導させたものである（非特許文献１を参照。）。
【０００７】
しかし、上記の再分化系は、組成の異なる培地に植え替えるため、不定芽を形成させるまでに時間と手間がかかり、カルス形成を経由しているため突然変異体が生じやすいという問題点があった。また、不定芽は不定胚とは異なり増殖能力を備えておらず、台木の生産には利用できないとの問題点もあった。
【非特許文献１】中川文雄ら 「ウメ未熟子葉由来カルスからの不定芽形成」 園芸学会雑誌 第６３巻 別冊１ １９９４年 ｐ８８−８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この発明は、迅速かつ簡単に、突然変異体を生じることなく、増殖能力を備えた不定胚を形成する、ウメの不定胚誘導法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明にかかるウメ不定胚の誘導法は、未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するものである。なお、オーキシンとサイトカイニンの濃度実質的に同じであるのが好ましく、オーキシンとしては２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、サイトカイニンとしてはベンジルアデニン（ＢＡ）を使用するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
この発明により、ウメでは初めて不定胚を誘導させることができた。また、この不定胚は、前記の不定芽とは異なって増殖が可能である。そのため、今後の研究によって、この不定胚を効率よく増殖させることができるようになれば、この不定胚を用いてウメの形質転換も行えるようになり、将来的には、形質転換により優良な形質をもったウメのクローン台木を大量に得ることができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この発明のウメの不定胚誘導法は、ウメの未熟果実をエタノールで滅菌し、滅菌したメス、ピンセット等で果実中の種子から胚を摘出し、この胚の子葉をＷＰ寒天培地に置床して培養することにより、カルスを経由させずに直接子葉表面に不定胚を誘導するものである。そこで、以下にこの発明の内容について詳説する。
【００１２】
（使用する未熟子葉）
未熟子葉を採取する果実としては未熟果実であり、具体的には、開花後８５日以内に採取された未熟果実であり、好ましくは７０日以内、さらに好ましくは６０日以内であるほうがよい。なお、ウメの品種としては、市場において取引されている品種、例えば、「紅サシ」、「古城」など通常栽培されている品種であれば特にこだわることなく使用できるが、穂木との親和性や果実の商品力を考えると、「南高」が好ましい。
【００１３】
（培地の組成）
使用する培地は有機、無機の栄養分を含んだＷＰ寒天培地に糖分としてソルビトール１〜１０重量％、好ましくは２〜４％を添加し、さらに植物ホルモンとしてオーキシン及びサイトカイニンをそれぞれ０．２〜４μＭずつ添加したものである。また、植物ホルモンの濃度は実質的に同じであることが好ましい。これは、サイトカイニンの濃度に比べてオーキシンの濃度が高い場合にはカルス形成する傾向が強く、細胞核中の染色体数がカルスを経由すると遺伝的な安定性に欠け、不定胚の培養によって得られる再生植物体に奇形が生じる不具合があり、反対に、オーキシンの濃度に比べてサイトカイニンの濃度が高い場合は、褐変する傾向が強くなるという不具合があるためである。
【００１４】
また、オーキシンとしては、インドール−３−酪酸、インドール酢酸、２，４−Ｄ、ナフタレン酪酸などの市販のものであれば特に制限なく使用することができるが、なかでも２，４−Ｄが好ましい。さらに、サイトカイニンとしては、ＢＡ、フォルクロルフェニュロンなどの市販のものであれば特に制限なく使用することができるが、なかでもＢＡが好ましい。
【００１５】
（培養方法）
以上の方法で調整した培地に子葉を置床して、温度は２５℃前後、飽和水蒸気量に対する湿度が７０％、暗黒に調製した環境で静置培養すると、約４０日後に子葉の表面に突起状の隆起が見られるようになり、２ヶ月後には１子葉当り約５〜１０個の不定胚が誘導された。
【００１６】
（不定胚からの誘導）
このようにして作られた不定胚からは、他の植物の不定胚と同様の方法により、再生植物体を得ることが予測できるし、増殖用培地に移して培養すれば、大量の二次不定胚を誘導することも予測できる。
【実施例１】
【００１７】
(未熟子葉からの不定胚形成)
２００４年５月６日（開花後約８０日）、１３日、２４日に採取（開花日：２月１５日）した「南高」(以下Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３)の未熟果実を７０％エタノールに１５分間浸漬し、滅菌水で３回洗浄した。この果実中の種子から無菌的に胚を摘出し、子葉を縦４つに切断して培養材料（未熟子葉切片）とした。
【００１８】
この培養材料を、ショ糖３重量％又はソルビトール３重量％を含み、２，４−Ｄ １μＭ及びＢＡ １μＭを加えたＭＳ又はＷＰ基本培地（成分は表１を参照。）からなる４種類の０．７％寒天培地（Ａ〜Ｄ、表２を参照。) に置床して、暗所２５℃で培養した。なお、培養容器にはプラスチックシャーレ(９０×２０ｍｍ)を使用し、各区１００果実ずつとなるよう、１シャーレに１種子由来の４つの子葉切片を置床した。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
置床６０日後に不定胚形成率を調査した。その結果を表２に示す。その結果、不定胚（図１を参照。）の形成率はＮ１のＤ区で高かった(２７．８％)が、それ以外ではほとんど認められなかった(０〜２．６％)。また、全ての実験区でカルス形成が認められ、特にＢ区でカルス形成率が高かった(データは省略する。)。
【００２２】
このように、ウメ未熟子葉を同じ濃度のオーキシン、サイトカイニンを含有するとともに、糖分としてソルビトールを含有するＷＰ培地を使用することにより、３０％近くの確率で不定胚を形成することが確認できた。また、培養条件が同じならば、開花してから未熟子葉をＷＰ培地に置床するまでの時間が短いほど、不定胚の形成率が高いことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】子葉上に形成された不定胚を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウメの未熟果実から胚を摘出して未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するウメの不定胚誘導法。
【請求項２】
オーキシンの濃度とサイトカイニンの濃度が実質的に同じである請求項１に記載のウメの不定胚誘導法。
【請求項３】
オーキシンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であり、サイトカイニンがベンジルアデニンである請求項１又は２に記載のウメの不定胚誘導法。
【請求項１】
ウメの未熟果実から胚を摘出して未熟子葉切片を作成し、この未熟子葉切片をオーキシンと、サイトカイニンと、ソルビトールとを含むＷＰ寒天培地に置床して培養するウメの不定胚誘導法。
【請求項２】
オーキシンの濃度とサイトカイニンの濃度が実質的に同じである請求項１に記載のウメの不定胚誘導法。
【請求項３】
オーキシンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であり、サイトカイニンがベンジルアデニンである請求項１又は２に記載のウメの不定胚誘導法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２３０２７３（Ｐ２００６−２３０２７３Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４８７７２（Ｐ２００５−４８７７２）
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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