エタノールの製造方法
【課題】
エタノールの発酵生産において発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造できるような方法を提供する。
【解決手段】
エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
エタノールの発酵生産において発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造できるような方法を提供する。
【解決手段】
エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵培養によるエタノールの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生可能資源であるセルロース含有バイオマス由来の糖分を発酵原料とした、エタノールなどの種々の化学品の製造が盛んに検討されている。しかしながら、セルロース含有バイオマス由来の糖分にはリグニン、酢酸、ギ酸、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、フルフラール、バニリンといった低分子成分が不純物として含まれ（非特許文献１または２）、これら低分子成分を多く含む糖分を炭素源としてエタノールなどの化学品を発酵生産する場合、微生物の増殖阻害、生産物の収率の低下を引き起こすことが課題となっており、これら低分子成分は発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
前述した発酵阻害物質に対して耐性を有する微生物の取得方法として、ＵＶ照射など物理的手法やエチルメタンスルホン酸処理など化学的手法で変異処理を行うことにより発酵阻害物質耐性微生物を取得する方法が知られている。具体的にはサッカロミセス・セルビシエに変異処理を施すことでバニリン耐性株を育種する方法が開示されている（特許文献１）。また、酢酸菌の酢酸耐性に関する遺伝子をクローニングし、該遺伝子を酢酸菌に導入することで酢酸耐性を向上させる方法が知られている（特許文献２）。
【０００４】
また、発酵阻害物質を含む発酵原料を利用した発酵技術として、浸透圧の耐性の強い酵母を利用することで発酵阻害物質を含む発酵原料でエタノール生産を行う方法が開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２２４６５３号公報
【特許文献２】特開２００５−１２４４７９号公報
【特許文献３】特開２００４−３３７０９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓ．Ｌａｒｓｏｎら、”Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｌｕｔｅ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｆｔｗｏｏｄ”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２４．１５１−１５９（１９９９）
【非特許文献２】ＨＢ．Ｋｌｉｎｋｌｅら、“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６．１０−２６（２００４）
【非特許文献３】Ｊ．Ｐ．Ｄｅｌｇｅｎｅｓら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９．２２０−２２５（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、エタノールの発酵生産において発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造できるような方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物を発酵培養することで上記課題が解決することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）から（８）の技術的手段から構成される。
（１）エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
（２）発酵阻害物質が含まれる発酵原料を使用して発酵培養することを特徴とする、（１）に記載のエタノールの製造方法。
（３）前記発酵阻害物質がリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする、（２）に記載のエタノールの製造方法。
（４）前記発酵原料がセルロース含有バイオマス由来の糖分であることを特徴とする、（２）または（３）に記載のエタノールの製造方法。
（５）前記微生物がアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有することを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（６）前記微生物がフルコナゾールに耐性を有することを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（７）前記微生物がキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）またはキャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）であることを特徴とする、（１）から（６）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（８）前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９８４またはＮＩＴＥ Ｐ−９８５で寄託される微生物であることを特徴とする、（１）から（７）のいずれかに記載のエタノール製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】取得した発酵阻害物質耐性株の２６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のエタノール製造方法は、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）微生物を発酵培養してエタノールを製造することを特徴とする。
【００１３】
キャンディダ属とは、真核生物・真菌界・子嚢菌目・サッカロミセス網・サッカロミセス目に属するアナモルフである。生理・生化学及び形態に特筆すべき共通性が認められない子嚢菌系の菌種がキャンディダ属であり、現在、約２００菌種が存在する。そして、キャンディダ属微生物の中にはエタノール生産能を有するものが存在する。
【００１４】
エタノール生産能を有するキャンディダ属微生物の具体例としては、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ソリコラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｌｉｃｏｌａ）、キャンディダ・ランビカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ）、キャンディダ・サンタマリア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｎｔａｍｏｒｉａｅ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、キャンディダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、キャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）などを例示することができる。これらは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＢＣＲＣ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＣＢＳ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、ＮＣＰＦ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｎｇｉ）、ＡＲＳ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）などに保有されており、所定の手続きにより購入することができる。
【００１５】
また、エタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は土壌より取得することもできる。
【００１６】
また、本発明で使用するエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は、本来エタノール生産能を有さないが、染色体上あるいはベクターとして異種遺伝子あるいは同種遺伝子が導入されることによってエタノール生産能が付与された遺伝子組換え株であってもよく、また、他属酵母との細胞融合、あるいはキャンディダ属同士の細胞融合によってエタノール生産能が付与された株であってもよい。こうした遺伝子組換え株、および細胞融合株は、公知の手法で得ることができる。
【００１７】
前述したエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物の中でも、本発明ではキャンディダ・グラブラータ、キャンディダ・ボイディーニ、キャンディダ・ディッデンシアエ、キャンディダ・ケフィール、キャンディダ・マルトーサ、キャンディダ・メタノソルボーサ、キャンディダ・パラプシロシス、キャンディダ・シビクルトリックス、キャンディダ・ソノレンシス、キャンディダ・タータリボランス、キャンディダ・トロピカリス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・ビスワナチイ、キャンディダ・ウィッカーハミイが好ましく使用される。
【００１８】
本発明で使用するエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は、エルゴステロール合成阻害剤耐性を有することを特徴としている。エルゴステロール合成阻害剤とは、真菌のエルゴステロール合成に関わる酵素あるいは酵素群に阻害的に作用し、そのエルゴステロール合成を阻害する作用を有する薬剤のことを指す。エルゴステロールは、酵母、糸状菌など真菌の細胞膜を構成する主成分の一つであり、この合成が阻害されると細胞の増殖あるいは生育ができなくなることが知られている。エルゴステロール合成阻害メカニズムと発酵阻害物質の発酵阻害メカニズムの因果関係は不明であるが、本発明者はエルゴステロール合成阻害剤耐性を有するキャンディダ属微生物は発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造することができることを新規に見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
エルゴステロール合成阻害剤として、アリルアミン系とチオカルバメート系、ベンジルアミン系、モルホミン系、アゾール系が例示されるが、本発明ではアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することが好ましい。
【００２０】
アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の標的はＰ−４５０であり、アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の窒素原子が、Ｐ−４５０のヘム鉄に結合することによって、基質がＰ−４５０に結合できなくなり、その結果、エルゴステロールの合成阻害がおこり、細胞膜の障害をきたし真菌の発育が阻害される。
【００２１】
アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤は、イミダゾール系（化学式（１））と、トリアゾール系（化学式（２））に分類できる。
【００２２】
【化１】
【００２３】
（式中、Ｒは炭素原子を含む構造を有し、その中に窒素原子を２つ含む五員環を有してもよい。）。
【００２４】
【化２】
【００２５】
（式中、Ｒ’は炭素原子を含む構造を有し、その中に窒素原子を３つ含む五員環を有してもよい。）。
【００２６】
イミダゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の具体例としては硝酸イソコナゾール、硝酸エコナゾール、塩酸クロコナゾール、クロトリマゾール、硝酸スルコナゾール、ビホナゾール、塩酸ネチコナゾール、ケトコナゾール、硝酸ミコナゾール、ラノコナゾール、硝酸オキシコナゾールが例示される。トリアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の具体例としてはフルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾールが例示される。
【００２７】
本発明では、前記アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤のなかでもトリアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することがより好ましく、フルコナゾールに対して耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することがさらに好ましい。
【００２８】
また、本発明での「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」とは、０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含む液体培地において、キャンディダ・グラブラータ標準菌（ＮＢＲＣ０６２２）よりも増殖能が高いことをいう。
【００２９】
「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」ことを判断するための液体培地としてはキャンディダ属微生物が生育できる培地であれば特に制限はなく、ＹＰＤ培地、ＹＡＰＤ培地、ＹＭ培地、ＬＢ培地、ＳＣ培地、ＳＤ培地、ポテトスクロース培地、麦芽エキス培地、イーストスターチ培地などの公知の培地を例示することができ、さらにはこれらの公知の培地を基本として構成する培地成分を適宜改変したものを用いることもできる。培地の改変の例としては、ＳＣ培地に含有されるアミノ酸成分を各２倍量にするなどである。本発明で好ましく用いられるのは、キャンディダ属微生物の増殖性が優れるＹＰＤ培地、ＹＭ培地またはＳＣ培地の改変培地（以下、ＳＣ３培地という）である。表１にＳＣ３培地の糖以外の培地組成を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
前述の液体培地（０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含む）に対して、標準菌または被検対象のキャンディダ属微生物を植菌する。植菌量は、特に限定されないが、比較に使用する液体培地（０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含まない）と同じ培地を使用して６時間〜４８時間培養した前培養液でＯＤ６００が１０以上となった前培養液を０．１〜１０重量％範囲で液体培地に植菌して増殖能を比較する。その際、液体培地中の単糖濃度、好ましくはグルコース濃度を、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲で調整し、単糖を４８時間以内に消費される条件下で、植菌あるいは培養あるいは標準菌との比較を行う。
【００３２】
前述した培養条件において、被検対象のキャンディダ属微生物の濁度増加が標準菌に対して高い微生物を「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」微生物であると判断する。なお、本明細書において「標準菌」とはキャンディダ・グラブラータ標準菌（ＮＢＲＣ０６２２）のことであり、本明細書中で単に「標準菌」と表記した場合は該微生物を示すこととする。なお、本発明においては、前述した培養条件において標準菌よりも濁度増加が１．２〜２倍の数値を示す微生物が好ましく、２倍以上の数値を示す微生物がより好ましい。
【００３３】
エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物の取得方法は、土壌からの単離や、変異導入などの方法がある。土壌からの単離は、土壌サンプルを滅菌水で懸濁し、上清をエルゴステロール合成阻害剤含有の固体培地に塗布する。そこから生育したキャンディダ属微生物を単離する。また、変異導入はキャンディダ属微生物にUVや薬剤で変異を導入し、エルゴステロール合成阻害剤含有の固体培地に塗布する。そこから生育したキャンディダ属微生物を単離する。なお、エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有していれば既知のキャンディダ属微生物であってもよく、具体例として、ＢＣＲＣ２１４３２、ＢＣＲＣ２２５１７、ＢＣＲＣ２２５１８、ＢＣＲＣ２２５１９、ＢＣＲＣ２２５２０、ＢＣＲＣ２２５２１、ＢＣＲＣ２２５２３、ＢＣＲＣ２２５２４、ＢＣＲＣ２２５２７、ＢＣＲＣ２２５２８、ＢＣＲＣ２２５２９のキャンディダ・ボイディーニ、ＮＢＲＣ１９７１、ＮＢＲＣ１０４１６のキャンディダ・ディッデンシアエ、ＪＣＭ３７６０のキャンディダ・ケフィール、ＮＢＲＣ１９７５、ＮＢＲＣ１９７６、ＮＢＲＣ１９７７、ＮＢＲＣ１９７８のキャンディダ・マルトーサ、ＢＣＲＣ２１４８９、ＢＣＲＣ２２４５０のキャンディダ・メタノソルボーサ、ＮＢＲＣ１０３０５、ＢＣＲＣ２１２５３のキャンディダ・パラプシロシス、ＮＢＲＣ１０３１２のキャンディダ・シビクルトリックス、ＮＢＲＣ１００２７のキャンディダ・ソノレンシス、ＮＲＲＬ Ｙ２７２９１のキャンディダ・タータリボランス、ＮＢＲＣ０１９９、ＮＢＲＣ０６１８、ＮＢＲＣ１０２４１、ＮＢＲＣ１４０１、ＮＢＲＣ１４０２、ＮＢＲＣ１４０３、ＮＢＲＣ１４０４、ＮＢＲＣ２０５２０、ＮＢＲＣ２１４３６、ＮＢＲＣ２１４３７のキャンディダ・トロピカリス、ＮＲＲＬ Ｙ１５４２のキャンディダ・ユーティリス、ＮＢＲＣ１０３２１のキャンディダ・ビスワナチイ、ＮＢＲＣ１０３２２のキャンディダ・ウィッカーハミイが挙げられる。
【００３４】
前記微生物を発酵培養する際の発酵原料は、該微生物が資化可能な炭素源を含む発酵原料であれば特に制限はないが、前述の通りエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物は発酵阻害物質、好ましくはリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸に対して耐性を有することが本発明者によって新規に見出されたことから、発酵阻害物質、好ましくはリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１以上の化合物を含む発酵原料を使用することができる。
【００３５】
発酵阻害物質を含む発酵原料としては、セルロース含有バイオマス由来の糖分や廃糖蜜を例示することができる。
【００３６】
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム空殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを例示でき、こうしたセルロース含有バイオマスは公知の手法にて加水分解することにより糖分が得られ、不純物として発酵阻害物質が含まれる。具体的には、糖分はグルコースを主成分とし、その他キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースなどが含まれ、発酵阻害物質としては、リグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１以上の化合物が含まれる。
【００３７】
セルロース含有バイオマスの加水分解処理方法については特に制限はないが、好ましい加水分解処理方法として、水熱処理、希硫酸処理または酵素処理が例示され、それらの処理方法に関しては以下の通りである。
【００３８】
水熱処理の条件としては、セルロース含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃、好ましくは１８０〜３００℃の高圧熱水で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、キシラン含有バイオマス中の成分である、キシラン、セルロース、リグニンなどの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。また、該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００３９】
希硫酸処理の条件としては、硫酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、０．５〜５重量％であることがより好ましい。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができ、１２０〜２５０℃で設定することが好ましい。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００４０】
酵素処理の条件としては、酵素の濃度は０．１〜１０ｇ／Ｌであることが好ましく、０．５〜２重量％であることがより好ましく、また、セルロース含有バイオマスの濃度は０．１〜２０重量％であることが好ましく、５〜１５重量％であることがより好ましい。反応温度は２０〜６０℃の範囲で設定することができ、４０〜５０℃で設定することが好ましい。反応ｐＨはｐＨ３〜７の範囲で設定することができ、ｐＨ４〜５で設定することが好ましい。反応時間は１分〜７２時間の範囲で設定することができ、１２時間〜２４時間で設定することが好ましい。なお、酵素処理を行なう前に上記の水熱処理や希硫酸処理を行なうことが好ましい。希硫酸処理を行なった場合、処理セルロース系バイオマスは酸を含んでおり、酵素処理を行うため中和を行なう必要がある。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００４１】
廃糖蜜とはサトウキビや甜菜から砂糖を精製する際に分離される食品廃材であって、糖分とともに発酵阻害物質が含まれる。廃糖蜜の糖分は、スクロースを主成分とし、その他スクロースを構成するグルコースおよびフルクトースが含まれる。また、廃糖蜜には発酵阻害物質としてヒドロキシメチルフルフラールまたは酢酸が含まれる。
【００４２】
前記発酵阻害物質を含む発酵原料に含まれる糖分または発酵阻害物質の量は、公知の手法により定性定量を実施することができる。糖分はガスクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは酵素法で定量できる。また、発酵阻害物質については、リグニンはＫｌａｓｏｎ法またはアセチルブロミド法、チロシン法、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよびバニリンはガスクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィー、酢酸およびギ酸はガスクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは滴定法で定量できる。
【００４３】
前記微生物を発酵培養してエタノールを製造する際の発酵原料に含まれる糖分濃度は、培地総量に対して１〜２００ｇ／Ｌが好ましく、５０〜１００ｇ／Lがより好ましい。また、発酵原料には炭素源以外の栄養源として、硫安、硝安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、その他有機及び無機窒素化合物（好ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化合物）が含まれていてもよく、同様に、無機塩類としてリン酸カルシウム、鉄、マンガン、その他無機塩類を、ビタミン類としてチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンあるいはこれらを含有する酵母エキス、コーン・スチープ・リカーまたはその他天然物が含まれていてもよい。
【００４４】
その他、前記微生物を発酵培養してエタノールを製造する際の培養条件として、培地のｐHは好ましくはｐH２〜９、より好ましくはｐＨ３〜７である。また、培養温度は好ましくは５〜４５℃、より好ましくは２０〜３５℃である。また、発酵培養時間は好ましくは１分〜１２０時間、より好ましくは２４時間〜６０時間である。また、発酵培養時の通気量は好ましくは０．０１〜１０ｖｖｍ、より好ましくは０．１〜１ｖｖｍである。
【００４５】
エタノールは、培地を回収して分離・濃縮・精製する。培地よりエタノールを分離・濃縮する方法は特に限定されないが、蒸留法、浸透気化膜法、超音波霧化法等を例示できる。蒸留法とは、同じ温度でエタノールは水より高い蒸気圧を持っていることを利用し、エタノールを分離・濃縮する方法である。エタノールの希薄水溶液を蒸発させた時の蒸気のエタノール濃度は、エタノールが水より蒸発しやすいので、液体のエタノール濃度より高くなり、この蒸気を凝縮させることでエタノールを濃縮できる。また、浸透気化膜法とは、選択的にエタノールを透過する分離膜を介して、供給側に原料液を供給し、透過側に真空（減圧）気相を保持することで、膜を選択透過した成分は膜の透過側で気化することでエタノールを分離・濃縮する方法である。膜透過の駆動力は膜透過成分の供給側と透過側の蒸気圧の差である。超音波霧化法の原理に関し示す。液中から液界面に超音波を当てると超音波霧化が起こる。含水エタノールで超音波霧化を生起させると、発生した霧のエタノール濃度が高くなるためこれを回収することで、エタノールの分離・濃縮を行う。
【００４６】
次いで、分離・濃縮した含水エタノールをさらに精製（脱水）することによって、無水エタノールを得ることができる。エタノールを精製する方法は特に限定されないが、共沸蒸留法、抽出蒸留法、吸着法、膜分離法を例示できる。共沸蒸留法とは、水との混合液が最低沸点を示す共沸を形成し、かつ、水との溶解性が低く相分離する性質を有する溶剤を、共沸剤として含水エタノールに添加して蒸留することで、含水エタノールを脱水する方法である。共沸剤としては、ジクロヘキサン、ジエチルエーテル、ノルマルペンタンなどが一般的に用いられる。抽出蒸留法とは、沸点が高く、かつ、エタノール及び水とは共沸を形成しない溶剤を第３成分として添加し、水を溶剤に抽出しながら蒸留することで、エタノール／水の共沸をブレークして含水エタノールを脱水する方法である。抽出剤としてはグリセリンやエチレングリコールなどが一般的に用いられる。吸着法とは水を選択的に吸着する吸着剤、例えばコーングリッツ、シリカゲル、アルミナ、イオン交換樹脂、ゼオライトなどを用いて、水を吸着させ無水エタノールを製造する。膜分離法は、エタノール／水混合物を、膜を介して選択的に水を膜透過させる精製方法である。使用する膜は異なるが、原理は前述した浸透気化膜法と同様である。
【実施例】
【００４７】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
（参考例１）グルコース測定
グルコース濃度は、以下のＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
【００４９】
（参考例２）エタノールの測定
エタノール蓄積濃度の測定には、以下のガスクロマトグラフ法により定量した。
ガスクロマトグラフ：ＧＣ−２０１０（株式会社島津製作所製）
キャピラリー：ＴＣ−１（内径：０．５３ｍｍ、長さ：１５ｍ、膜厚：１．５μｍ、ジーエルサイエンス社製）
検出方法：水素塩イオン化検出器による検出。
【００５０】
（参考例３）培養液の濁度の測定
培養液の濁度（ＯＤ値）の測定は、サンプルと同倍率に蒸留水で希釈した培地でブランクを取り、サンプルの吸光度（６００ｎｍ）を測定し、濁度とした。希釈は、吸光度の値が０．０１〜０．９の範囲に収まるように行い、希釈倍率をかけた値を濁度とした。
【００５１】
（参考例５）発酵阻害物質濃度の分析方法
［ＨＭＦ、フルフラール、バニリン］
糖液に含まれるフラン系発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール）、およびフェノール系発酵阻害物質であるバニリンは下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：アセトニトリル−０．１％ リン酸（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
【００５２】
［酢酸、ギ酸］
糖液に含まれる有機酸系発酵阻害物質（酢酸、ギ酸）は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−ＨとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ １０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００５３】
［リグニン］
糖液に含まれるリグニンは、吸光光度方式水質測定器ＤＲ ２８００（ＨＡＣＨ社製）を用いてチロシン法による吸光度測定（７００ｎｍ）にて定量した。
【００５４】
（参考例６）セルロース系バイオマスの水熱処理および酵素による加水分解工程
工程（１）：セルロース系バイオマスより水熱処理物を得る工程
セルロース系バイオマスとして、稲藁を使用した。セルロース系バイオマスを約１００μｍとなるようカッターミルで細断した。その後、セルロース系バイオマスの固形分重量１５％となるように水を添加した。このセルロース系バイオマス混合溶液を２００℃で１５分オートクレーブ処理した。処理後、固液物を軽く沈降させた後、上澄み成分を水熱処理物として使用した。この水熱処理物の固形物濃度は、約５％であった。
【００５５】
工程（２）：水熱処理物に糖化酵素を添加し、セルロース系バイオマス糖化液を得る工程
工程（１）で調整した水熱処理物に糖化酵素セリックシーテック（ノボザイム社製）とセリックエイチテック（ノボザイム社製）を添加し、糖化を行った。糖化条件は以下の通りである。
水熱処理物：２Ｌ（工程（１）で調製）
ｐＨ：５．０
糖化酵素：セリックシーテックをタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬとなる様に添加。セリックエイチテックをセリックシーテックの１／１０ボリュームとなる様に添加。
反応温度および時間：５０℃、２４時間。
【００５６】
実施例２の水熱処理物糖化液に含まれる成分組成を参考例１および５の方法に準じて分析した。分析結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
（実施例１）エルゴステロール合成阻害剤（フルコナゾール）耐性微生物の土壌からの取得
採取した土壌サンプル０．１ｇを蒸留水１ｍｌに懸濁し、１分間静置することで固液分離した上清１００μLを、以下の０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＹＰＤ寒天培地にスプレッドし、２５℃で２４時間インキュベートした。
ＹＰＤ寒天培地：２％（ｗ／ｖ） グルコース、２％（ｗ／ｖ） ペプトン、１％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％（ｗ／ｖ） 寒天粉
培地へのフルコナゾール添加：培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、培地温度が５０℃以下になってから、フルコナゾールをジメチルスルホキシドに懸濁してフィルター滅菌（ミリポア社製 Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ）した溶液を最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）になるように培地に添加。
【００５９】
ＹＰＤ寒天培地上の分離株について、２６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の一部の塩基配列を解析後、データベース検索した（ビジョンバイオ株式会社に委託）。その結果、２株についてキャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列と９９％以上の配列同一性が見られたので（図１）、これら２株はキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）と同定した。
【００６０】
キャンディダ・グラブラータと同定された２株について、次のように命名し、これらを独立法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２０１０年１０月５日付で寄託した。それらの受託番号は、それぞれ、次のとおりである。
Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ Ｉ−１：ＮＩＴＥ Ｐ−９８４
Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ Ｉ−２：ＮＩＴＥ Ｐ−９８５。
【００６１】
（実施例２）寒天培地でのエルゴステロール合成阻害剤耐性試験
実施例１で得られた株（耐性株）を、キャンディダ・グラブラータ ＮＢＲＣ０６２２（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ ＮＢＲＣ０６２２、標準菌）と共に、以下の０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＳＣ３寒天培地にスポットし、２５℃、４８時間培養した。
ＳＣ３寒天培地組成：５％（ｗ／ｖ） グルコース、０．０１７％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．０３８４％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、０．００１６２％（ｗ／ｖ） Ｌ−トリプトファン、０．００７５％（ｗ／ｖ） 硫酸アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）寒天粉。
培地へのフルコナゾール添加：培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、培地温度が５０℃以下になってから、フルコナゾールをジメチルスルホキシドに懸濁してフィルター滅菌（ミリポア社製 Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ）した溶液を最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）になるように培地に添加。
【００６２】
培養後、耐性株は標準菌と比較してコロニーの大きさが２倍以上になることを確認し、耐性株は標準菌よりもエルゴステロール合成阻害剤耐性において優れることが確認できた。
【００６３】
（実施例３）液体培地でのエルゴステロール合成阻害剤耐性試験
フルコナゾールを含まないＳＣ３液体培地（フィルター滅菌）１０ｍＬに標準菌と耐性株を植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで前培養した。得られた前培養液を０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＳＣ３液体培地（フィルター滅菌）１０ｍＬに１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで６０時間培養した培養液の濁度（ＯＤ６００）を測定した（表３）。
【００６４】
測定の結果、耐性株の濁度は標準菌の２倍以上であり、耐性株は本発明で定義されるエルゴステロール合成阻害剤耐性の特徴を有していることを確認した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
また、耐性株と標準菌について、グルコース消費量、エタノール生産速度およびエタノール蓄積濃度を評価した。
【００６７】
耐性株２種と標準菌の耐性試験中のグルコース消費量を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がグルコース消費量は多く、培養開始から４０時間、６０時間の時点での耐性株のグルコース消費量は標準菌と比較し、２倍以上であった（表４）。
【００６８】
【表４】
【００６９】
また、耐性株２種と標準菌の耐性試験中のエタノール生産速度を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がエタノール生産速度が早く、培養開始から４０時間、６０時間の時点では標準菌と比較し、耐性株はエタノール生産速度が２倍以上であった（表５）。
【００７０】
【表５】
【００７１】
また、耐性株２種と標準菌の耐性試験中のエタノール蓄積濃度を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がエタノール蓄積濃度が多く、培養開始から４０時間、６０時間の時点で標準菌と比較し、選択した株はエタノール蓄積量が２倍以上であった（表６）。
【００７２】
【表６】
【００７３】
（実施例４）グルコースを発酵原料にしたエタノール製造
標準菌と耐性株２株について、実施例３のＳＣ３液体培地１０ｍＬに標準菌と耐性株を植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで前培養した。得られた前培養液を、前培養液と同じ培地組成の発酵試験培地に１％植菌して、２５℃、１８０ｒｐｍで発酵試験を行い、グルコース濃度（表７）、エタノール蓄積濃度（表８）および濁度（表９）を測定した。
【００７４】
測定の結果、グルコースを原料としたエタノール製造では実施例１で得られた耐性株はグルコース消費、エタノール製造および微生物の生育において標準菌と同程度であることを確認できた。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
（実施例５）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液での耐性試験
参考例６で作成した発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス糖化液を１Ｎ 水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整し、１．５％（ｗ／ｖ）となるよう寒天粉末を添加したものを１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、シャーレで固めて寒天培地を作成した。本寒天培地に耐性株と標準菌を上記寒天培地にスポットし、２５℃で４８時間培養を行なった。培養終了後にコロニーの大きさを比較すると、標準菌に比べ耐性株は２倍以上の大きさのコロニーを形成しており、耐性株は標準菌よりも発酵阻害物質に対して耐性を有することが確認できた。
【００７９】
（実施例６）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からのエタノール製造
耐性株と標準菌を実施例４の条件で前培養して得られた前培養液を、グルコース濃度が４５ｇ／Ｌになるようにグルコースを添加した参考例６のセルロース系バイオマス由来糖液（１Ｎ 水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌）１０ｍＬに１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで発酵試験を行い、グルコース消費量（表１０）とエタノール蓄積濃度（表１１）を測定した。
【００８０】
測定の結果、耐性株は発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液に含まれるグルコースを消費してエタノール発酵できるのに対して、標準菌は発酵阻害物質の存在によりエタノール発酵が顕著に阻害された。この結果から、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を利用することで、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノール製造ができることが分かった。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
【表１１】
【００８３】
（実施例７）既知のキャンディダ属微生物におけるエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物のスクリーニング
ＹＰＤプレートに生育させた既知のキャンディダ属微生物を、それぞれ２ｍＬのＹＰＤ培地の入った試験管に白金耳で植菌したものを一晩振とうして前培養を行った。この培養液を２ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＹＰＤ培地に各１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで４８時間培養を行った後、濁度（ＯＤ６００）を測定し、標準菌の２倍以上の増殖を示した微生物をエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物として選抜した（表１２）。また、標準菌の濁度未満となった微生物（表１３）についてはエルゴステロール合成阻害剤耐性を持たないと判断した。
【００８４】
【表１２】
【００８５】
【表１３】
【００８６】
（実施例８）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からのエタノール製造
実施例７でエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物として選抜した微生物に関して、実施例７の条件にて前培養を行った。前培養液を、実施例６で調製したセルロース系バイオマス由来糖液（グルコース濃度４５ｇ／Lに調整）５ｍＬに対して１％植菌した。２５℃、１８０ｒｐｍで４８時間培養した後に回収し、発酵生産したエタノールの分析を行った（表１３）。実施例７においてエルゴステロール合成阻害剤に耐性を示した微生物は、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノールを生産することを確認できた（表１４）。
【００８７】
【表１４】
【００８８】
以上の結果から、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を利用することで、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノールを製造できることが分かった。
【受託番号】
【００８９】
ＮＩＴＥ Ｐ−９８４
ＮＩＴＥ Ｐ−９８５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵培養によるエタノールの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生可能資源であるセルロース含有バイオマス由来の糖分を発酵原料とした、エタノールなどの種々の化学品の製造が盛んに検討されている。しかしながら、セルロース含有バイオマス由来の糖分にはリグニン、酢酸、ギ酸、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、フルフラール、バニリンといった低分子成分が不純物として含まれ（非特許文献１または２）、これら低分子成分を多く含む糖分を炭素源としてエタノールなどの化学品を発酵生産する場合、微生物の増殖阻害、生産物の収率の低下を引き起こすことが課題となっており、これら低分子成分は発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
前述した発酵阻害物質に対して耐性を有する微生物の取得方法として、ＵＶ照射など物理的手法やエチルメタンスルホン酸処理など化学的手法で変異処理を行うことにより発酵阻害物質耐性微生物を取得する方法が知られている。具体的にはサッカロミセス・セルビシエに変異処理を施すことでバニリン耐性株を育種する方法が開示されている（特許文献１）。また、酢酸菌の酢酸耐性に関する遺伝子をクローニングし、該遺伝子を酢酸菌に導入することで酢酸耐性を向上させる方法が知られている（特許文献２）。
【０００４】
また、発酵阻害物質を含む発酵原料を利用した発酵技術として、浸透圧の耐性の強い酵母を利用することで発酵阻害物質を含む発酵原料でエタノール生産を行う方法が開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２２４６５３号公報
【特許文献２】特開２００５−１２４４７９号公報
【特許文献３】特開２００４−３３７０９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓ．Ｌａｒｓｏｎら、”Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｌｕｔｅ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｆｔｗｏｏｄ”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２４．１５１−１５９（１９９９）
【非特許文献２】ＨＢ．Ｋｌｉｎｋｌｅら、“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６．１０−２６（２００４）
【非特許文献３】Ｊ．Ｐ．Ｄｅｌｇｅｎｅｓら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９．２２０−２２５（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、エタノールの発酵生産において発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造できるような方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物を発酵培養することで上記課題が解決することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）から（８）の技術的手段から構成される。
（１）エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
（２）発酵阻害物質が含まれる発酵原料を使用して発酵培養することを特徴とする、（１）に記載のエタノールの製造方法。
（３）前記発酵阻害物質がリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする、（２）に記載のエタノールの製造方法。
（４）前記発酵原料がセルロース含有バイオマス由来の糖分であることを特徴とする、（２）または（３）に記載のエタノールの製造方法。
（５）前記微生物がアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有することを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（６）前記微生物がフルコナゾールに耐性を有することを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（７）前記微生物がキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）またはキャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）であることを特徴とする、（１）から（６）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（８）前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９８４またはＮＩＴＥ Ｐ−９８５で寄託される微生物であることを特徴とする、（１）から（７）のいずれかに記載のエタノール製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】取得した発酵阻害物質耐性株の２６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のエタノール製造方法は、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）微生物を発酵培養してエタノールを製造することを特徴とする。
【００１３】
キャンディダ属とは、真核生物・真菌界・子嚢菌目・サッカロミセス網・サッカロミセス目に属するアナモルフである。生理・生化学及び形態に特筆すべき共通性が認められない子嚢菌系の菌種がキャンディダ属であり、現在、約２００菌種が存在する。そして、キャンディダ属微生物の中にはエタノール生産能を有するものが存在する。
【００１４】
エタノール生産能を有するキャンディダ属微生物の具体例としては、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ソリコラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｌｉｃｏｌａ）、キャンディダ・ランビカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ）、キャンディダ・サンタマリア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｎｔａｍｏｒｉａｅ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、キャンディダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、キャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）などを例示することができる。これらは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＢＣＲＣ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＣＢＳ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、ＮＣＰＦ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｎｇｉ）、ＡＲＳ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）などに保有されており、所定の手続きにより購入することができる。
【００１５】
また、エタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は土壌より取得することもできる。
【００１６】
また、本発明で使用するエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は、本来エタノール生産能を有さないが、染色体上あるいはベクターとして異種遺伝子あるいは同種遺伝子が導入されることによってエタノール生産能が付与された遺伝子組換え株であってもよく、また、他属酵母との細胞融合、あるいはキャンディダ属同士の細胞融合によってエタノール生産能が付与された株であってもよい。こうした遺伝子組換え株、および細胞融合株は、公知の手法で得ることができる。
【００１７】
前述したエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物の中でも、本発明ではキャンディダ・グラブラータ、キャンディダ・ボイディーニ、キャンディダ・ディッデンシアエ、キャンディダ・ケフィール、キャンディダ・マルトーサ、キャンディダ・メタノソルボーサ、キャンディダ・パラプシロシス、キャンディダ・シビクルトリックス、キャンディダ・ソノレンシス、キャンディダ・タータリボランス、キャンディダ・トロピカリス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・ビスワナチイ、キャンディダ・ウィッカーハミイが好ましく使用される。
【００１８】
本発明で使用するエタノール生産能を有するキャンディダ属微生物は、エルゴステロール合成阻害剤耐性を有することを特徴としている。エルゴステロール合成阻害剤とは、真菌のエルゴステロール合成に関わる酵素あるいは酵素群に阻害的に作用し、そのエルゴステロール合成を阻害する作用を有する薬剤のことを指す。エルゴステロールは、酵母、糸状菌など真菌の細胞膜を構成する主成分の一つであり、この合成が阻害されると細胞の増殖あるいは生育ができなくなることが知られている。エルゴステロール合成阻害メカニズムと発酵阻害物質の発酵阻害メカニズムの因果関係は不明であるが、本発明者はエルゴステロール合成阻害剤耐性を有するキャンディダ属微生物は発酵阻害物質を含む発酵原料からでもエタノールを製造することができることを新規に見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
エルゴステロール合成阻害剤として、アリルアミン系とチオカルバメート系、ベンジルアミン系、モルホミン系、アゾール系が例示されるが、本発明ではアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することが好ましい。
【００２０】
アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の標的はＰ−４５０であり、アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の窒素原子が、Ｐ−４５０のヘム鉄に結合することによって、基質がＰ−４５０に結合できなくなり、その結果、エルゴステロールの合成阻害がおこり、細胞膜の障害をきたし真菌の発育が阻害される。
【００２１】
アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤は、イミダゾール系（化学式（１））と、トリアゾール系（化学式（２））に分類できる。
【００２２】
【化１】
【００２３】
（式中、Ｒは炭素原子を含む構造を有し、その中に窒素原子を２つ含む五員環を有してもよい。）。
【００２４】
【化２】
【００２５】
（式中、Ｒ’は炭素原子を含む構造を有し、その中に窒素原子を３つ含む五員環を有してもよい。）。
【００２６】
イミダゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の具体例としては硝酸イソコナゾール、硝酸エコナゾール、塩酸クロコナゾール、クロトリマゾール、硝酸スルコナゾール、ビホナゾール、塩酸ネチコナゾール、ケトコナゾール、硝酸ミコナゾール、ラノコナゾール、硝酸オキシコナゾールが例示される。トリアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤の具体例としてはフルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾールが例示される。
【００２７】
本発明では、前記アゾール系のエルゴステロール合成阻害剤のなかでもトリアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することがより好ましく、フルコナゾールに対して耐性を有するキャンディダ属微生物を使用することがさらに好ましい。
【００２８】
また、本発明での「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」とは、０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含む液体培地において、キャンディダ・グラブラータ標準菌（ＮＢＲＣ０６２２）よりも増殖能が高いことをいう。
【００２９】
「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」ことを判断するための液体培地としてはキャンディダ属微生物が生育できる培地であれば特に制限はなく、ＹＰＤ培地、ＹＡＰＤ培地、ＹＭ培地、ＬＢ培地、ＳＣ培地、ＳＤ培地、ポテトスクロース培地、麦芽エキス培地、イーストスターチ培地などの公知の培地を例示することができ、さらにはこれらの公知の培地を基本として構成する培地成分を適宜改変したものを用いることもできる。培地の改変の例としては、ＳＣ培地に含有されるアミノ酸成分を各２倍量にするなどである。本発明で好ましく用いられるのは、キャンディダ属微生物の増殖性が優れるＹＰＤ培地、ＹＭ培地またはＳＣ培地の改変培地（以下、ＳＣ３培地という）である。表１にＳＣ３培地の糖以外の培地組成を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
前述の液体培地（０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含む）に対して、標準菌または被検対象のキャンディダ属微生物を植菌する。植菌量は、特に限定されないが、比較に使用する液体培地（０．０５重量％のエルゴステロール合成阻害剤を含まない）と同じ培地を使用して６時間〜４８時間培養した前培養液でＯＤ６００が１０以上となった前培養液を０．１〜１０重量％範囲で液体培地に植菌して増殖能を比較する。その際、液体培地中の単糖濃度、好ましくはグルコース濃度を、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲で調整し、単糖を４８時間以内に消費される条件下で、植菌あるいは培養あるいは標準菌との比較を行う。
【００３２】
前述した培養条件において、被検対象のキャンディダ属微生物の濁度増加が標準菌に対して高い微生物を「エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有する」微生物であると判断する。なお、本明細書において「標準菌」とはキャンディダ・グラブラータ標準菌（ＮＢＲＣ０６２２）のことであり、本明細書中で単に「標準菌」と表記した場合は該微生物を示すこととする。なお、本発明においては、前述した培養条件において標準菌よりも濁度増加が１．２〜２倍の数値を示す微生物が好ましく、２倍以上の数値を示す微生物がより好ましい。
【００３３】
エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物の取得方法は、土壌からの単離や、変異導入などの方法がある。土壌からの単離は、土壌サンプルを滅菌水で懸濁し、上清をエルゴステロール合成阻害剤含有の固体培地に塗布する。そこから生育したキャンディダ属微生物を単離する。また、変異導入はキャンディダ属微生物にUVや薬剤で変異を導入し、エルゴステロール合成阻害剤含有の固体培地に塗布する。そこから生育したキャンディダ属微生物を単離する。なお、エルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有していれば既知のキャンディダ属微生物であってもよく、具体例として、ＢＣＲＣ２１４３２、ＢＣＲＣ２２５１７、ＢＣＲＣ２２５１８、ＢＣＲＣ２２５１９、ＢＣＲＣ２２５２０、ＢＣＲＣ２２５２１、ＢＣＲＣ２２５２３、ＢＣＲＣ２２５２４、ＢＣＲＣ２２５２７、ＢＣＲＣ２２５２８、ＢＣＲＣ２２５２９のキャンディダ・ボイディーニ、ＮＢＲＣ１９７１、ＮＢＲＣ１０４１６のキャンディダ・ディッデンシアエ、ＪＣＭ３７６０のキャンディダ・ケフィール、ＮＢＲＣ１９７５、ＮＢＲＣ１９７６、ＮＢＲＣ１９７７、ＮＢＲＣ１９７８のキャンディダ・マルトーサ、ＢＣＲＣ２１４８９、ＢＣＲＣ２２４５０のキャンディダ・メタノソルボーサ、ＮＢＲＣ１０３０５、ＢＣＲＣ２１２５３のキャンディダ・パラプシロシス、ＮＢＲＣ１０３１２のキャンディダ・シビクルトリックス、ＮＢＲＣ１００２７のキャンディダ・ソノレンシス、ＮＲＲＬ Ｙ２７２９１のキャンディダ・タータリボランス、ＮＢＲＣ０１９９、ＮＢＲＣ０６１８、ＮＢＲＣ１０２４１、ＮＢＲＣ１４０１、ＮＢＲＣ１４０２、ＮＢＲＣ１４０３、ＮＢＲＣ１４０４、ＮＢＲＣ２０５２０、ＮＢＲＣ２１４３６、ＮＢＲＣ２１４３７のキャンディダ・トロピカリス、ＮＲＲＬ Ｙ１５４２のキャンディダ・ユーティリス、ＮＢＲＣ１０３２１のキャンディダ・ビスワナチイ、ＮＢＲＣ１０３２２のキャンディダ・ウィッカーハミイが挙げられる。
【００３４】
前記微生物を発酵培養する際の発酵原料は、該微生物が資化可能な炭素源を含む発酵原料であれば特に制限はないが、前述の通りエルゴステロール合成阻害剤に対して耐性を有するキャンディダ属微生物は発酵阻害物質、好ましくはリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸に対して耐性を有することが本発明者によって新規に見出されたことから、発酵阻害物質、好ましくはリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１以上の化合物を含む発酵原料を使用することができる。
【００３５】
発酵阻害物質を含む発酵原料としては、セルロース含有バイオマス由来の糖分や廃糖蜜を例示することができる。
【００３６】
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム空殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを例示でき、こうしたセルロース含有バイオマスは公知の手法にて加水分解することにより糖分が得られ、不純物として発酵阻害物質が含まれる。具体的には、糖分はグルコースを主成分とし、その他キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースなどが含まれ、発酵阻害物質としては、リグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１以上の化合物が含まれる。
【００３７】
セルロース含有バイオマスの加水分解処理方法については特に制限はないが、好ましい加水分解処理方法として、水熱処理、希硫酸処理または酵素処理が例示され、それらの処理方法に関しては以下の通りである。
【００３８】
水熱処理の条件としては、セルロース含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃、好ましくは１８０〜３００℃の高圧熱水で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、キシラン含有バイオマス中の成分である、キシラン、セルロース、リグニンなどの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。また、該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００３９】
希硫酸処理の条件としては、硫酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、０．５〜５重量％であることがより好ましい。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができ、１２０〜２５０℃で設定することが好ましい。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００４０】
酵素処理の条件としては、酵素の濃度は０．１〜１０ｇ／Ｌであることが好ましく、０．５〜２重量％であることがより好ましく、また、セルロース含有バイオマスの濃度は０．１〜２０重量％であることが好ましく、５〜１５重量％であることがより好ましい。反応温度は２０〜６０℃の範囲で設定することができ、４０〜５０℃で設定することが好ましい。反応ｐＨはｐＨ３〜７の範囲で設定することができ、ｐＨ４〜５で設定することが好ましい。反応時間は１分〜７２時間の範囲で設定することができ、１２時間〜２４時間で設定することが好ましい。なお、酵素処理を行なう前に上記の水熱処理や希硫酸処理を行なうことが好ましい。希硫酸処理を行なった場合、処理セルロース系バイオマスは酸を含んでおり、酵素処理を行うため中和を行なう必要がある。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００４１】
廃糖蜜とはサトウキビや甜菜から砂糖を精製する際に分離される食品廃材であって、糖分とともに発酵阻害物質が含まれる。廃糖蜜の糖分は、スクロースを主成分とし、その他スクロースを構成するグルコースおよびフルクトースが含まれる。また、廃糖蜜には発酵阻害物質としてヒドロキシメチルフルフラールまたは酢酸が含まれる。
【００４２】
前記発酵阻害物質を含む発酵原料に含まれる糖分または発酵阻害物質の量は、公知の手法により定性定量を実施することができる。糖分はガスクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは酵素法で定量できる。また、発酵阻害物質については、リグニンはＫｌａｓｏｎ法またはアセチルブロミド法、チロシン法、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよびバニリンはガスクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィー、酢酸およびギ酸はガスクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは滴定法で定量できる。
【００４３】
前記微生物を発酵培養してエタノールを製造する際の発酵原料に含まれる糖分濃度は、培地総量に対して１〜２００ｇ／Ｌが好ましく、５０〜１００ｇ／Lがより好ましい。また、発酵原料には炭素源以外の栄養源として、硫安、硝安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、その他有機及び無機窒素化合物（好ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化合物）が含まれていてもよく、同様に、無機塩類としてリン酸カルシウム、鉄、マンガン、その他無機塩類を、ビタミン類としてチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンあるいはこれらを含有する酵母エキス、コーン・スチープ・リカーまたはその他天然物が含まれていてもよい。
【００４４】
その他、前記微生物を発酵培養してエタノールを製造する際の培養条件として、培地のｐHは好ましくはｐH２〜９、より好ましくはｐＨ３〜７である。また、培養温度は好ましくは５〜４５℃、より好ましくは２０〜３５℃である。また、発酵培養時間は好ましくは１分〜１２０時間、より好ましくは２４時間〜６０時間である。また、発酵培養時の通気量は好ましくは０．０１〜１０ｖｖｍ、より好ましくは０．１〜１ｖｖｍである。
【００４５】
エタノールは、培地を回収して分離・濃縮・精製する。培地よりエタノールを分離・濃縮する方法は特に限定されないが、蒸留法、浸透気化膜法、超音波霧化法等を例示できる。蒸留法とは、同じ温度でエタノールは水より高い蒸気圧を持っていることを利用し、エタノールを分離・濃縮する方法である。エタノールの希薄水溶液を蒸発させた時の蒸気のエタノール濃度は、エタノールが水より蒸発しやすいので、液体のエタノール濃度より高くなり、この蒸気を凝縮させることでエタノールを濃縮できる。また、浸透気化膜法とは、選択的にエタノールを透過する分離膜を介して、供給側に原料液を供給し、透過側に真空（減圧）気相を保持することで、膜を選択透過した成分は膜の透過側で気化することでエタノールを分離・濃縮する方法である。膜透過の駆動力は膜透過成分の供給側と透過側の蒸気圧の差である。超音波霧化法の原理に関し示す。液中から液界面に超音波を当てると超音波霧化が起こる。含水エタノールで超音波霧化を生起させると、発生した霧のエタノール濃度が高くなるためこれを回収することで、エタノールの分離・濃縮を行う。
【００４６】
次いで、分離・濃縮した含水エタノールをさらに精製（脱水）することによって、無水エタノールを得ることができる。エタノールを精製する方法は特に限定されないが、共沸蒸留法、抽出蒸留法、吸着法、膜分離法を例示できる。共沸蒸留法とは、水との混合液が最低沸点を示す共沸を形成し、かつ、水との溶解性が低く相分離する性質を有する溶剤を、共沸剤として含水エタノールに添加して蒸留することで、含水エタノールを脱水する方法である。共沸剤としては、ジクロヘキサン、ジエチルエーテル、ノルマルペンタンなどが一般的に用いられる。抽出蒸留法とは、沸点が高く、かつ、エタノール及び水とは共沸を形成しない溶剤を第３成分として添加し、水を溶剤に抽出しながら蒸留することで、エタノール／水の共沸をブレークして含水エタノールを脱水する方法である。抽出剤としてはグリセリンやエチレングリコールなどが一般的に用いられる。吸着法とは水を選択的に吸着する吸着剤、例えばコーングリッツ、シリカゲル、アルミナ、イオン交換樹脂、ゼオライトなどを用いて、水を吸着させ無水エタノールを製造する。膜分離法は、エタノール／水混合物を、膜を介して選択的に水を膜透過させる精製方法である。使用する膜は異なるが、原理は前述した浸透気化膜法と同様である。
【実施例】
【００４７】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
（参考例１）グルコース測定
グルコース濃度は、以下のＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
【００４９】
（参考例２）エタノールの測定
エタノール蓄積濃度の測定には、以下のガスクロマトグラフ法により定量した。
ガスクロマトグラフ：ＧＣ−２０１０（株式会社島津製作所製）
キャピラリー：ＴＣ−１（内径：０．５３ｍｍ、長さ：１５ｍ、膜厚：１．５μｍ、ジーエルサイエンス社製）
検出方法：水素塩イオン化検出器による検出。
【００５０】
（参考例３）培養液の濁度の測定
培養液の濁度（ＯＤ値）の測定は、サンプルと同倍率に蒸留水で希釈した培地でブランクを取り、サンプルの吸光度（６００ｎｍ）を測定し、濁度とした。希釈は、吸光度の値が０．０１〜０．９の範囲に収まるように行い、希釈倍率をかけた値を濁度とした。
【００５１】
（参考例５）発酵阻害物質濃度の分析方法
［ＨＭＦ、フルフラール、バニリン］
糖液に含まれるフラン系発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール）、およびフェノール系発酵阻害物質であるバニリンは下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：アセトニトリル−０．１％ リン酸（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
【００５２】
［酢酸、ギ酸］
糖液に含まれる有機酸系発酵阻害物質（酢酸、ギ酸）は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−ＨとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ １０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００５３】
［リグニン］
糖液に含まれるリグニンは、吸光光度方式水質測定器ＤＲ ２８００（ＨＡＣＨ社製）を用いてチロシン法による吸光度測定（７００ｎｍ）にて定量した。
【００５４】
（参考例６）セルロース系バイオマスの水熱処理および酵素による加水分解工程
工程（１）：セルロース系バイオマスより水熱処理物を得る工程
セルロース系バイオマスとして、稲藁を使用した。セルロース系バイオマスを約１００μｍとなるようカッターミルで細断した。その後、セルロース系バイオマスの固形分重量１５％となるように水を添加した。このセルロース系バイオマス混合溶液を２００℃で１５分オートクレーブ処理した。処理後、固液物を軽く沈降させた後、上澄み成分を水熱処理物として使用した。この水熱処理物の固形物濃度は、約５％であった。
【００５５】
工程（２）：水熱処理物に糖化酵素を添加し、セルロース系バイオマス糖化液を得る工程
工程（１）で調整した水熱処理物に糖化酵素セリックシーテック（ノボザイム社製）とセリックエイチテック（ノボザイム社製）を添加し、糖化を行った。糖化条件は以下の通りである。
水熱処理物：２Ｌ（工程（１）で調製）
ｐＨ：５．０
糖化酵素：セリックシーテックをタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬとなる様に添加。セリックエイチテックをセリックシーテックの１／１０ボリュームとなる様に添加。
反応温度および時間：５０℃、２４時間。
【００５６】
実施例２の水熱処理物糖化液に含まれる成分組成を参考例１および５の方法に準じて分析した。分析結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
（実施例１）エルゴステロール合成阻害剤（フルコナゾール）耐性微生物の土壌からの取得
採取した土壌サンプル０．１ｇを蒸留水１ｍｌに懸濁し、１分間静置することで固液分離した上清１００μLを、以下の０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＹＰＤ寒天培地にスプレッドし、２５℃で２４時間インキュベートした。
ＹＰＤ寒天培地：２％（ｗ／ｖ） グルコース、２％（ｗ／ｖ） ペプトン、１％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％（ｗ／ｖ） 寒天粉
培地へのフルコナゾール添加：培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、培地温度が５０℃以下になってから、フルコナゾールをジメチルスルホキシドに懸濁してフィルター滅菌（ミリポア社製 Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ）した溶液を最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）になるように培地に添加。
【００５９】
ＹＰＤ寒天培地上の分離株について、２６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の一部の塩基配列を解析後、データベース検索した（ビジョンバイオ株式会社に委託）。その結果、２株についてキャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列と９９％以上の配列同一性が見られたので（図１）、これら２株はキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）と同定した。
【００６０】
キャンディダ・グラブラータと同定された２株について、次のように命名し、これらを独立法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２０１０年１０月５日付で寄託した。それらの受託番号は、それぞれ、次のとおりである。
Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ Ｉ−１：ＮＩＴＥ Ｐ−９８４
Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ Ｉ−２：ＮＩＴＥ Ｐ−９８５。
【００６１】
（実施例２）寒天培地でのエルゴステロール合成阻害剤耐性試験
実施例１で得られた株（耐性株）を、キャンディダ・グラブラータ ＮＢＲＣ０６２２（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ ＮＢＲＣ０６２２、標準菌）と共に、以下の０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＳＣ３寒天培地にスポットし、２５℃、４８時間培養した。
ＳＣ３寒天培地組成：５％（ｗ／ｖ） グルコース、０．０１７％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．０３８４％（ｗ／ｖ） Ｙｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、０．００１６２％（ｗ／ｖ） Ｌ−トリプトファン、０．００７５％（ｗ／ｖ） 硫酸アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）寒天粉。
培地へのフルコナゾール添加：培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、培地温度が５０℃以下になってから、フルコナゾールをジメチルスルホキシドに懸濁してフィルター滅菌（ミリポア社製 Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ）した溶液を最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）になるように培地に添加。
【００６２】
培養後、耐性株は標準菌と比較してコロニーの大きさが２倍以上になることを確認し、耐性株は標準菌よりもエルゴステロール合成阻害剤耐性において優れることが確認できた。
【００６３】
（実施例３）液体培地でのエルゴステロール合成阻害剤耐性試験
フルコナゾールを含まないＳＣ３液体培地（フィルター滅菌）１０ｍＬに標準菌と耐性株を植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで前培養した。得られた前培養液を０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＳＣ３液体培地（フィルター滅菌）１０ｍＬに１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで６０時間培養した培養液の濁度（ＯＤ６００）を測定した（表３）。
【００６４】
測定の結果、耐性株の濁度は標準菌の２倍以上であり、耐性株は本発明で定義されるエルゴステロール合成阻害剤耐性の特徴を有していることを確認した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
また、耐性株と標準菌について、グルコース消費量、エタノール生産速度およびエタノール蓄積濃度を評価した。
【００６７】
耐性株２種と標準菌の耐性試験中のグルコース消費量を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がグルコース消費量は多く、培養開始から４０時間、６０時間の時点での耐性株のグルコース消費量は標準菌と比較し、２倍以上であった（表４）。
【００６８】
【表４】
【００６９】
また、耐性株２種と標準菌の耐性試験中のエタノール生産速度を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がエタノール生産速度が早く、培養開始から４０時間、６０時間の時点では標準菌と比較し、耐性株はエタノール生産速度が２倍以上であった（表５）。
【００７０】
【表５】
【００７１】
また、耐性株２種と標準菌の耐性試験中のエタノール蓄積濃度を比較したところ、標準菌よりも耐性株の方がエタノール蓄積濃度が多く、培養開始から４０時間、６０時間の時点で標準菌と比較し、選択した株はエタノール蓄積量が２倍以上であった（表６）。
【００７２】
【表６】
【００７３】
（実施例４）グルコースを発酵原料にしたエタノール製造
標準菌と耐性株２株について、実施例３のＳＣ３液体培地１０ｍＬに標準菌と耐性株を植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで前培養した。得られた前培養液を、前培養液と同じ培地組成の発酵試験培地に１％植菌して、２５℃、１８０ｒｐｍで発酵試験を行い、グルコース濃度（表７）、エタノール蓄積濃度（表８）および濁度（表９）を測定した。
【００７４】
測定の結果、グルコースを原料としたエタノール製造では実施例１で得られた耐性株はグルコース消費、エタノール製造および微生物の生育において標準菌と同程度であることを確認できた。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
（実施例５）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液での耐性試験
参考例６で作成した発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス糖化液を１Ｎ 水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整し、１．５％（ｗ／ｖ）となるよう寒天粉末を添加したものを１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、シャーレで固めて寒天培地を作成した。本寒天培地に耐性株と標準菌を上記寒天培地にスポットし、２５℃で４８時間培養を行なった。培養終了後にコロニーの大きさを比較すると、標準菌に比べ耐性株は２倍以上の大きさのコロニーを形成しており、耐性株は標準菌よりも発酵阻害物質に対して耐性を有することが確認できた。
【００７９】
（実施例６）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からのエタノール製造
耐性株と標準菌を実施例４の条件で前培養して得られた前培養液を、グルコース濃度が４５ｇ／Ｌになるようにグルコースを添加した参考例６のセルロース系バイオマス由来糖液（１Ｎ 水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌）１０ｍＬに１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで発酵試験を行い、グルコース消費量（表１０）とエタノール蓄積濃度（表１１）を測定した。
【００８０】
測定の結果、耐性株は発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液に含まれるグルコースを消費してエタノール発酵できるのに対して、標準菌は発酵阻害物質の存在によりエタノール発酵が顕著に阻害された。この結果から、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を利用することで、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノール製造ができることが分かった。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
【表１１】
【００８３】
（実施例７）既知のキャンディダ属微生物におけるエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物のスクリーニング
ＹＰＤプレートに生育させた既知のキャンディダ属微生物を、それぞれ２ｍＬのＹＰＤ培地の入った試験管に白金耳で植菌したものを一晩振とうして前培養を行った。この培養液を２ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）フルコナゾール含有ＹＰＤ培地に各１％植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで４８時間培養を行った後、濁度（ＯＤ６００）を測定し、標準菌の２倍以上の増殖を示した微生物をエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物として選抜した（表１２）。また、標準菌の濁度未満となった微生物（表１３）についてはエルゴステロール合成阻害剤耐性を持たないと判断した。
【００８４】
【表１２】
【００８５】
【表１３】
【００８６】
（実施例８）発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からのエタノール製造
実施例７でエルゴステロール合成阻害剤耐性微生物として選抜した微生物に関して、実施例７の条件にて前培養を行った。前培養液を、実施例６で調製したセルロース系バイオマス由来糖液（グルコース濃度４５ｇ／Lに調整）５ｍＬに対して１％植菌した。２５℃、１８０ｒｐｍで４８時間培養した後に回収し、発酵生産したエタノールの分析を行った（表１３）。実施例７においてエルゴステロール合成阻害剤に耐性を示した微生物は、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノールを生産することを確認できた（表１４）。
【００８７】
【表１４】
【００８８】
以上の結果から、エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ属微生物を利用することで、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス由来糖液からエタノールを製造できることが分かった。
【受託番号】
【００８９】
ＮＩＴＥ Ｐ−９８４
ＮＩＴＥ Ｐ−９８５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
【請求項２】
発酵阻害物質が含まれる発酵原料を使用して発酵培養することを特徴とする、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
前記発酵阻害物質がリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする、請求項２に記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料がセルロース含有バイオマス由来の糖分であることを特徴とする、請求項２または３に記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
前記微生物がアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
前記微生物がフルコナゾールに耐性を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
前記微生物がキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）またはキャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９８４またはＮＩＴＥ Ｐ−９８５で寄託される微生物であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のエタノール製造方法。
【請求項１】
エタノール生産能を有し、かつエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物を発酵培養することを特徴とする、エタノールの製造方法。
【請求項２】
発酵阻害物質が含まれる発酵原料を使用して発酵培養することを特徴とする、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
前記発酵阻害物質がリグニン、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、酢酸およびギ酸からなる群から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする、請求項２に記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料がセルロース含有バイオマス由来の糖分であることを特徴とする、請求項２または３に記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
前記微生物がアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤に耐性を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
前記微生物がフルコナゾールに耐性を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
前記微生物がキャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ディッデンシアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・シビクルトリックス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・タータリボランス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔａｒｔａｒｉｖｏｒａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）またはキャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９８４またはＮＩＴＥ Ｐ−９８５で寄託される微生物であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のエタノール製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１１０３２１（Ｐ２０１２−１１０３２１Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４０１９７（Ｐ２０１１−２４０１９７）
【出願日】平成２３年１１月１日（２０１１．１１．１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１日（２０１１．１１．１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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