エタノール産生のためのキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシリトール合成変異体
キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子への遺伝子改変により操作し、ＧＦＯＲ酵素活性の発現の減少を生じさせた。操作された株は、キシロース代謝の有害な副産物であるキシリトールの減産を示す。それはまた、プロセス関連条件下、混合糖発酵中により多くのキシロースを消費し、そしてより多くのエタノールを産生する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（すべての目的のために、その全体が本明細書の一部として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子の遺伝子改変を伴うキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を開発した。この株は、発酵およびエタノール産生中の、キシロース代謝の有害な副産物であるキシリトールの減産を示す。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料に代わるエネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グルコース、フルクトース、およびスクロース上で増殖する細菌性エタノロジェンであり、これらの糖を、エントナー−ドウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路を介してＣＯ２およびエタノールに代謝する。野生型株は、キシロースを炭素源として使用することができないが、この糖上で増殖することが可能なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組み換え株が操作されている（特許文献１、２、３、非特許文献１、２）。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース系材料における主要なペントースであり、従って、発酵に使用される多量の利用可能な低コストの炭素基質を提供することができる。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）が、キシロース代謝に必要な４つの酵素：１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼの発現のために操作されている（特許文献１、４、非特許文献２）。これらの４つの酵素の組み合わされた反応および細胞の通常の代謝機構を介して、３分子のキシロースが、２分子のグルコース６−リン酸および１分子のグリセルアルデヒド３−リン酸に変換され、続いて、これらは、経路のグルコース側においてエタノールおよびＣＯ２に変換される（図１を参照のこと）。
【０００５】
キシロース代謝を対象にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作することに成功はしているが、この株は、キシロース上では、グルコースほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。キシロース上で増殖が乏しくなる原因の１つは、キシリトールがキシロース代謝の副産物として産生されることである（非特許文献１、３）。キシリトールは、キシルロースキナーゼによってリン酸化されて、キシリトール５−リン酸を産生し、これは細胞に蓄積し、そして細菌の増殖を阻害する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株はキシリトールをエタノールに変換することができないため、キシリトール合成はまた、エタノールの収率を減少する。さらに、キシリトールは、操作されたキシロース代謝経路におけるキシロース資化の第１段階を触媒するキシロースイソメラーゼの強力なインヒビターである（非特許文献４）。キシリトールの合成および効果を示す図については、図２を参照のこと。
【０００６】
インビボでのキシリトール合成を担う生理学的経路および酵素は決定されていない。しかし、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）由来の無細胞抽出物は、それらをＮＡＤＰＨで補充する場合、キシロースをキシリトールに還元することが可能であること（非特許文献１）、およびこの反応は、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼによって触媒されることが実証されている。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物は、ＮＡＤＰＨ補充を伴わなくても少量のキシロースをキシリトールに変換することが可能であること、および精製されたキシロースイソメラーゼがさらに反応混合物に添加される場合、これらの条件下でのキシリトール産生は、３〜４倍に増加すること（非特許文献５）もまた、示されている。キシロースイソメラーゼはキシロースをキシルロースに変換することが可能であるため、後者の実験は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）が、キシロースを電子供与体として、およびキシルロースを電子受容体として使用して、キシリトールを生じさせることができることを明確に示唆しており、これについて以下に詳細に考察する。それ故、インビトロ実験に基づけば、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において、キシリトール産生のための少なくとも２つの経路が存在するが、しかし、それらが生理学的条件下でキシリトール形成に寄与する程度は未だ決定されていない。
【０００７】
エタノールの高レベル産生では、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、浸透圧ショックを生じ得る高濃度の発酵可能な炭素源において増殖させる。浸透圧ショックは、＞２００ｇ／Ｌのグルコースもしくはフルクトースまたは＞３６０ｇ／Ｌのスクロースを含有する液体培地に野生型株を移す場合の増殖開始前の長い停滞期間として出現する（非特許文献６）。さらに加えて、ソルビトールを増殖培地に添加すると、野生型株を高濃度のこれらの糖に移す場合の停滞期間が減少する（非特許文献７、非特許文献６）。
【０００８】
ペリプラズム酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）は、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をグルコースおよびフルクトースの濃縮混合物（非特許文献６）またはスクロースの濃縮液（−，非特許文献７、非特許文献６）において増殖させる場合の浸透圧バランスにおいて重要な役割を果たすこともまた、示されている。簡単に説明すると、ＧＦＯＲは、緊密に結合したそれの補因子を伴って、図Ｉに示すような古典的ピンポンＢｉ機構で、グルコースからグルコノラクトンへの酸化、およびそれ以後のフルクトースからソルビトールへの還元を触媒する。ペリプラズム空間に生じるソルビトールは、濃度勾配に対して細胞に輸送され、ここで、それは、さらに代謝されないため、高レベルで蓄積する。細胞内における高濃度のソルビトールは、形質膜を横切る浸透圧差をなくし、そして浸透圧バランスを回復する。
【０００９】
ソルビトールを生じることができない野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の自然突然変異体は、それを低濃度のスクロース（＜１５０ｇ／Ｌ）上で増殖させた場合、野生型細胞より高いレベルのエタノールを産生することが示されたが、この株は、高濃度のスクロース上で増殖することができなかった（非特許文献８）。この変異体は、その後、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）の発現を欠くことが示されたが、これは、スクロースから誘導されるフルクトースを、所望されない副産物のソルビトールに変換することができないことを説明する（非特許文献７）。高濃度のスクロースにおけるソルビトール欠損変異体の増殖は、ソルビトールを増殖培地に添加することによって回復され得ることによっても示された（非特許文献７）。それ故、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、グルコースおよびフルクトースの濃縮混合物か、または宿主細胞のインベルターゼによってグルコースおよびフルクトースに加水分解される高濃度のスクロースにおいて増殖させる場合、ＧＦＯＲは、ソルビトールを合成することによって、浸透圧バランスにおいて極めて重要な役割を果たす。
【数１】
【００１０】
特許文献５は、不活化されたＧＦＯＲ遺伝子を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の非キシロース資化性変異株、およびこの株を使用するエタノールの産生について開示している。グルコース、フルクトースまたはスクロースが炭素源であった場合、この株によるソルビトール産生の欠如は、より高いレベルのエタノールを生じた。
【００１１】
キシロースおよびグルコースの混合物上で（添加されるスクロースもしくはフルクトースの非存在下で）増殖するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の操作されたキシロース資化株においてグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ酵素活性を減少させるかまたはなくすことの効果については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５７１２１３３号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、
【特許文献４】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献５】中国特許公開第１６００８５０（Ａ）号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９２年、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら、（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３
【非特許文献３】Ｋｉｍら、（２０００年）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６６：１８６−１９３
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２７７：２５５−２６１
【非特許文献５】Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ、２００１年，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｍａｓｔｅｒｓ Ｔｈｅｓｉｓ
【非特許文献６】Ｌｏｏｓら、（１９９４年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７６：７６８８−７６９３
【非特許文献７】Ｗｉｅｇｅｒｔら、（１９９６年）Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１６６：３２−４１
【非特許文献８】ＫｉｒｋおよびＤｏｅｌｌｅ、（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１５：９８５−９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
キシロース含有培地上で増殖させる場合、増加した量のエタノールを産生することが可能なキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の必要性が依然としてある。本出願人らは、インビボでのキシリトール産生の主経路を決定し、そして遺伝子不活化を介してキシリトールの形成を担う酵素活性をなくし、それによって、改善されたエタノール産生を伴うＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を作製することによって、この課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、キシロースの存在下で増殖させる場合、キシリトールの減産およびエタノールの増産を有するザイモモナスザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株に関する。本出願人らは、キシロースを代謝するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール産生は、酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）によって優先的に仲介されることを発見した。ＧＦＯＲを発現しない遺伝子改変された株（ＧＦＯＲノックアウト変異体など）を構築し、そしてキシロース含有糖混合物上で増殖させる場合、低減した量のキシリトールを産生することを見出した。ＧＦＯＲノックアウト変異体はまた、ソルビトールの存在下で高度の糖混合物において増殖させた場合、ＧＦＯＲを発現する親株よりキシロースを消費し、そしてより高濃度のエタノールを産生した。さらに、エタノール収率（消費される糖１グラムあたりの産生されるエタノールの量）についても、ＧＦＯＲノックアウト株の方が有意に高かった。
【００１６】
従って、本発明は、炭水化物培地中での発酵により、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属の組み換え微生物を提供し、前記微生物は、より低いグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ酵素活性を生じる少なくとも１つの遺伝子改変を含んでなる。本発明は、ＧＦＯＲ遺伝子への遺伝子改変の結果として、低減したＧＦＯＲ活性を示す、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を含む。ＧＦＯＲ活性のいずれの減少も本発明の範囲内にあり、ＧＦＯＲ活性の遺伝子を完全に不活化する、および／またはＧＦＯＲ酵素活性を完全にノックアウトする変異を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、低減したＧＦＯＲ活性を伴うザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作製するための方法であって：
ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する工程と；
ｂ）（ａ）の組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、前記改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少する工程と
を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
図面の簡単な説明、生物学的寄託および配列表の説明
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】キシロース資化のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を操作するために使用されている４つの酵素（枠内）およびキシロースを使用するエタノール産生の生化学的経路の図を示す。
【図２】操作されたキシロース経路（枠内）の最初の２段階、キシリトール合成、キシリトール５−リン酸形成（デッドエンド毒性中間産物）、およびキシリトールによるキシロースイソメラーゼの阻害の図を示す。
【図３】トランスケトラーゼ（Ａ）、トランスアルドラーゼ（Ｂ）、キシロースイソメラーゼ（Ｃ）、およびキシルロキナーゼ（ｘｙｕｌｏｋｉｎａｓｅ）（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図４】ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍのプラスミド地図を示す。
【図５】ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍのプラスミド地図を示す。
【図６】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図７】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ｔｒａｎｓａｌｄｏｌｓｅ）（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性（ａｃｔｉｖａｔｉｅｓ）のグラフを示す。
【図８】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図９】５％グルコースを伴うＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）において５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを伴うＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図１０】ＲＭ＋１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）（Ａ、Ｂ）およびＲＭ＋８％キシロース（ＲＭＸ８％）（Ｃ、Ｄ）における選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースまたはキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図１１】ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースにおいて、酢酸塩を伴わない（Ａ、Ｂ）または０．６％酢酸塩を伴う（Ｃ、Ｄ）選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図１２】ＧＦＯＲ遺伝子の挿入不活化のための自殺構築物の構築中に作製されるプラスミド、および最終産物：ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷの地図を示す。
【図１３】キシロースイソメラーゼ発現プラスミドの構築のために作製されるプラスミド：ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡの地図、およびこの構築物に使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（枠内）の図を示す。
【図１４】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴うおよび伴わない、キシロースイソメラーゼ発現の存在および非存在下でのＺＷ１株によるキシリトールおよびキシルロース産生のグラフを示す。
【図１５】９７ｇ／Ｌ全キシロース＋グルコース上で増殖させた、ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う（Ａ）および伴わない（Ｂ）キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生のグラフを示す。
【図１６】１８８ｇ／Ｌ全キシロース＋グルコース上で増殖させた、ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う（Ａ）および伴わない（Ｂ）キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生のグラフを示す。
【図１７】異なる濃度のソルビトールの存在下におけるＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴うキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖のグラフを示す。
【図１８】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、１７４ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１９】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、２０３ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図２０】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、２０３ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおいて、緩衝能の増加のためのさらなる炭酸水素カリウムを伴う、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図２１】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う、酢酸塩の存在下、１８９ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコース、ｐＨ制御発酵稼動におけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロースおよびグルコース資化、エタノール産生、ならびにキシリトール産生のグラフを示す。
【図２２】ｐＺＢ１８８／ＫａｎおよびｐＺＢ１８８／ｋａｎ−Ｃｒｅ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるＣｒｅ発現ベクターのプラスミド地図を示す。
【図２３】Ａは、高グルコース＋キシロースにおける、酢酸塩を伴う、ｐＨ制御条件下のＺＷ８０１−４およびＺＷ８００の増殖の比較を示し、Ｂは、ＺＷ８０１−４のグルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生をＺＷ８００と比較したグラフを示す。
【図２４】ＺＷ８０１−４における翻訳された変異体配列と、野生型ＧＦＯＲタンパク質とのアラインメントを示す。
【００２０】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００２１】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００２２】
配列表は、コンパクトディスクによって提供される。配列表を含むコンパクトディスクの内容は、米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項に応従して、参照により本明細書に援用される。コンパクトディスクは、２枚提出され、これらは相互に同一である。ディスクには、「Ｃｏｐｙ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」および「Ｃｏｐｙ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ」のラベルが付されている。ディスクは、次のファイル：「ＣＬ３６０４ｓｅｑ ｌｉｓｔ．ＳＴ２５」を含有する。
【００２３】
配列番号１および２は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３および４は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号５および６は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号７および８は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号９は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１０および１１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１２は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１３および１４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１５および１６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．３ｋｂのｘｙｌＢ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１７および１８は、遺伝子の３’末端の部分、ｌｄｈ遺伝子、およびａｄｈｌ遺伝子の５’末端の部分を含有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｗ１ゲノムＤＮＡ由来の２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１９および２０は、ｐＡＣＹＣ１８４由来のテトラサイクリン耐性カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号２１および２２は、ｌｏｘＰ部位を作製するために使用されるオリゴヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２３および２４は、ｌｏｘＰ部位を作製するために使用されるオリゴヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号２５および２６は、ｐＨＰ１５５７８由来のＳｐｅｃｒ−カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２７および２８は、ＺＷ１ゲノムＤＮＡ由来の３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２９および３０は、ＺＷ１ゲノムＤＮＡ由来の５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号３１は、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号３２および３３は、ｐＥＴ−２４ａ由来のＫａｎｒ−カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号３４は、ｐＺＢ４から誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ発現カセットのヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号３５および３６は、Ｃｒｅ−発現カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号３７は、ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲコーディング領域（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）の完全なヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号３８は、野生型ＧＦＯＲコーディング領域（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）の完全なヌクレオチド配列である。
【００４５】
本出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州２０１１０−２２０９において、以下の生物学的寄託を行った：
【００４６】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、内因性グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）遺伝子の改変によってさらに操作されるキシロース資化性組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株、および改変されたＧＦＯＲザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作製するための方法について説明する。本明細書に記載の方法は、ＧＦＯＲ酵素活性をなくすかまたは減少し、その結果、キシロース代謝中のキシリトール産生の低減およびエタノール産生の増強を生じる任意の遺伝子改変を含む。一般的に、低減したＧＦＯＲ酵素活性を伴う改変されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、発酵からエタノールを産生させるプロセスにおいて使用してもよい。新規のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によって産生されるエタノールは、化石燃料に対する代替エネルギー源として使用してもよい。
【００４８】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００４９】
「グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ」は、ＧＦＯＲと略称する。
【００５０】
ＲＭはリッチ培地である。
【００５１】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋５％グルコースである。
【００５２】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋１０％グルコースである。
【００５３】
ＲＭＸ８％はＲＭ＋８％キシロースである。
【００５４】
ＲＭＸ２％はＲＭ＋２％キシロースである。
【００５５】
ＲＭＸ５％はＲＭ＋５％キシロースである。
【００５６】
ＲＭＧＸ１０％８％は、ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースである。
【００５７】
ＲＭＧＸ５％８％は、ＲＭ＋５％グルコースおよび８％キシロースである。
【００５８】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００５９】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００６０】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含んでなり得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００６１】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６２】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００６３】
本明細書において使用する用語「非機能性遺伝子」は、コードされるタンパク質を、遺伝子が内因性である野生型株において通常発現されるようには発現しない遺伝子を指す。非機能性遺伝子の発現は、転写、ＲＮＡプロセシング、または翻訳のような任意のレベルで破壊され得る。非機能性遺伝子では、典型的に、コードされるタンパク質の発現がほとんど認められないか、または全く認められない。しかし、それはまた、野生型タンパク質より低い酵素活性を有する改変されたタンパク質をコードし得る。
【００６４】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００６５】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組み換えられている。
【００６６】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００６７】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００６８】
用語「実質的になくされた」キシリトール産生および「実質的に認められない」副産物キシリトールは、典型的な実験分析を使用して検出されるキシリトールの量が０に近いか、またはほぼ０である場合を指す。
【００６９】
用語「高濃度の混合糖類」は、ＧＦＯＲ変異体キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖の阻害を生じる培地中の全糖濃度を指す。正確な濃度は、培地中の他の成分に依存して変動し得るが、これは、典型的に、約１００ｇ／Ｌより大きい。
【００７０】
用語「発酵可能な糖」は、発酵プロセスにおいて、微生物により炭素源として使用することができるオリゴ糖および単糖類を指す。
【００７１】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料もまた、ヘミセルロースを含んでなり得る。
【００７２】
用語「セルロース系」は、セルロース、およびヘミセルロースを含むさらなる成分を含んでなる組成物を指す。
【００７３】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵可能な糖類の生成を指す。
【００７４】
用語「前処置されたバイオマス」は、糖化前の前処置に供されているバイオマスを意味する。
【００７５】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、そしてセルロースを含んでなり、そして場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質のようなさらなる成分を含んでなり得る。バイオマスは、単一の供給源から誘導されてもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源から誘導される混合物を含んでなり得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバの混合物、または草および葉の混合物を含んでなり得る。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、穀物残渣、例えば、トウモロコシ皮、コーンストーバ、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、乾草、イネわら、スイッチグラス、廃紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および潅木の粉砕から得られる成分、野菜、果物、花および動物性肥料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生じる産物を指す。バイオマスはまた、糖化の前に前処置してもよい。
【００７７】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８４年ならびにグリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版されたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより記載されている。
【００７８】
本発明は、増強されたエタノール産生を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の操作された株に関する。キシロース資化性Ｚモビリス（Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓ）によってエタノール産生を改善するための課題は、（ａ）付加価値のない炭素貯蔵を呈し；（ｂ）キシロース資化の第１段階を阻害し；そして（ｃ）細菌増殖を阻害するデッドエンドの毒性中間産物にリン酸化されるキシリトールの合成を減少させるかまたはなくすことである。本出願人らは、内因性酵素ＧＦＯＲがインビボでのキシリトール合成を主に担うことおよびＧＦＯＲ酵素活性を減少させるかまたはなくすことによって、キシロースからのエタノール産生（速度、収率および力価）が改善されることを発見した。
【００７９】
キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主株
キシロースを炭素源として資化することが可能であるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の任意の株を、本発明の株を調製するための宿主として使用してもよい。エタノールへのキシロースの発酵のために操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株が特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の部分を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性を伴うタンパク質を提供するための任意の既知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内因性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路を作製するときに他の誘導された酵素活性を補い得る。典型的に、米国特許第５５１４５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、キシロース代謝（図１）に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺモビリス（Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入されている。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の２つの酵素は、キシルロース５−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路にペントース代謝を結合する中間体に変換する。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。コーディング領域の供給源として、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコーディング領域が特に有用である。
【００８０】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において発現されるプロモーターに作動可能に連結される。コーディング領域は、プロモーターから個々に発現されてもよく、または２つ以上のコーディング領域が、同じプロモーターからの発現を伴う１つのオペロン内で接続されていてもよい。得られるキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に導入し、そしてプラスミド上で維持してもよく、または例えば、相同組み換え、部位特異的組込み、もしくはランダム組込みを使用して、ゲノムに組込んでもよい。特に有用なキシロース資化株として、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書；モハゲギ（Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ）ら、（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（本明細書において記載されている；ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８で寄託されている）が挙げられる。
【００８１】
また、天然の物質ではないキシロースのような他の糖類を資化するためにさらに操作されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、本方法に使用してもよい。例としては、米国特許第５８４３７６０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のようなアラビノース資化のために操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株がある。
【００８２】
ＧＦＯＲによるキシリトール合成の発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化株による所望されない副産物キシリトールの合成は、エタノールの回収率を減少し、そして細菌増殖を阻害する毒性化合物であるキシリトール５−リン酸の形成を生じる（図２を参照のこと）。さらに、キシリトールは、キシロースイソメラーゼ、キシロース資化のために操作された経路における第１の酵素の強力なインヒビターであり、そしてその合成は、細胞がキシロースを代謝する能力を減少する。インビトロ実験は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール形成のための少なくとも２つの経路が存在することを確立している（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲、ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）ら、上掲）が、本出願人らは、生理学的に産生されるキシリトールの大部分がＧＦＯＲ酵素活性の結果であることを発見している。本明細書に記載されるとおり、ここで、キシロース含有培地上で増殖するキシロースを資化することができるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（または野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシルロース合成誘導体）によって合成されるキシリトールの量は、ＧＦＯＲ酵素活性の非存在下で顕著に減少することが見出されている。本出願人らはまた、キシロースからキシルロースへの変換が、インビボでのＧＦＯＲ仲介キシリトール産生の必須条件であること、およびこの反応は、キシロースイソメラーゼを発現するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のみにおいて生じ得ることを見出している。それ故、キシロース上で増殖するように操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株におけるキシリトールの主な生理学的供給源は、図ＩＩおよびＩＩＩに依存する反応のうちの１つまたは両方を介してＧＦＯＲによって合成されることが提唱される。
【数２】
【数３】
【００８３】
両方のスキームにおいて、キシルロースは、ＧＦＯＲに不可欠な電子受容体としての役割を果たすこと、およびソルビトール産生を生じるフルクトースとの既知の反応（図Ｉ）とは対照的に、この化合物はキシリトールに還元されることに留意すること。ＧＦＯＲは、グルコースおよびフルクトースにかなり特異的であるが、それは、不十分ではあるものの、他の糖類を電子供与体および電子受容体として使用することができることが示されている（ザカライオウ（Ｚａｃｈａｒｉｏｕ）およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９８６年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６７：８６３−８６９）。それ故、キシロースおよびフルクトースを精製されたタンパク質と共にインキュベートした場合、ソルビトール産生が観察されたが、しかし、グルコースとのコントロール反応と比較して、ＧＦＯＲ酵素活性が約１２倍減少した。同論文において、キシルロースが、フルクトースの代わりに電子受容体として作用することができること、およびこの反応は、図ＩＩＩに示すキシリトールを生じることが示された。しかし、このような基質の組み合わせにより、ＧＦＯＲ酵素活性が約１４倍減少した。これらの観察に加えて、精製されたキシロースイソメラーゼを反応混合物に添加して、キシルロースの供給源を提供する場合、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）から調製される無細胞抽出物は、キシロースからキシリトールを生じることが可能であることも示されており（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）、それ故、ＧＦＯＲは、図ＩＩに示される反応を触媒することができることが実証される。しかし、これらのＧＦＯＲ仲介反応が生細胞において生じるかどうかについて、およびもしそうである場合、それらはどの程度キシリトール形成にインビボで寄与するかについては、本出願人らの発見前まで決定されていなかった。同じ不確定要素が、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物にも存在し、キシロースからキシリトールへ直接変換することが可能であるＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼ活性にも認められた（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）。実際、プロセス関連条件下において、インビボは言うまでもなく、インビトロでのキシリトール形成に対するＧＦＯＲおよびＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼの相対的寄与について、何らかの見識を提供する上記の無細胞抽出物による実験は行われなかった。それ故、ＧＦＯＲが、原則として、生理学的条件下、キシロース含有培地において、キシロース上で増殖するように操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株におけるキシリトール産生を担うという本出願人らの所見は、意外であり、先行技術から予想することはできなかった。
【００８４】
ＧＦＯＲ遺伝子発現の変更
本発明のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、キシリトール合成が減少するほどに、ＧＦＯＲをコードする遺伝子の発現が減少しているかまたは認められないように操作される。機能性酵素の存在を減少するための当業者に既知の任意の遺伝子改変を使用して、ＧＦＯＲ発現を改変してもよい。方法として、ＧＦＯＲをコードする遺伝子全体または遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないかまたはより低いレベルで発現されるように（プロモーターもしくはコーディング領域のいずれかにおいて）ＧＦＯＲ遺伝子にＤＮＡフラグメントを挿入すること、ＧＦＯＲコーディング領域に変異を導入して、機能性タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを付加すること、およびＧＦＯＲコーディング領域に１つ以上の変異を導入して、非機能性であるかまたはそれほど活性ではないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってＧＦＯＲ発現を阻止してもよく、そして共抑制を生じる構築物を挿入してもよい。これらの方法のすべては、ＧＦＯＲ酵素をコードする既知の配列（配列番号３８）を利用する当業者によって容易に実践することができる。ＧＦＯＲコード配列の周囲のＤＮＡ配列はまた、いくつかの改変手順において有用であり、そして完全なゲノム配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２）の形でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に利用可能である。
【００８５】
本明細書の実施例３および５において例示されるように、遺伝子改変されたＧＦＯＲ株を作製するための特に適切な方法は、スペクチノマイシン耐性遺伝子または他の選択マーカーに結合するＧＦＯＲフランキングＤＮＡ配列によって仲介される相同組み換えを使用して、機能性ＧＦＯＲ酵素が発現されないようなＧＦＯＲコーディング領域への選択マーカーの挿入をもたらすことである。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子をＧＦＯＲ遺伝子から切り出すが、後者の活性化は伴わないように、選択マーカーを部位特異的組み換え部位に結合させてもよい。部位特異的組み換えは、後に組み換え部位を残し、これがＧＦＯＲ酵素の発現を破壊する。相同組み換えベクターを構築して、選択マーカーの切り出し後にＧＦＯＲ遺伝子に欠失部を残してもよく、これは当業者に周知である。
【００８６】
ＧＦＯＲの発現を完全になくすことが好ましいが、しかし、顕著に減少したＧＦＯＲの発現もまた、本発明の実施形態である。この場合、非機能性ＧＦＯＲ遺伝子とは、通常より低いレベルのＧＦＯＲ酵素が存在するように、通常の様式では機能しないことを指す。遺伝子不活化のいくつかの方法は、共抑制のようないくらか低いレベルで保持されている発現を生じ得る。本明細書において、改変されたＧＦＯＲ株は、ＧＦＯＲ酵素活性が減少しているかまたは認められない遺伝子改変された株を指す。
【００８７】
ＧＦＯＲ改変株の増殖およびエタノール産生
本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、キシロースを含有する培地において、他の糖類（「混合糖類」）の非存在または存在下で増殖させる。混合糖類は、キシロースに加えて少なくとも１つの糖を含む。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から生成される糖類上でＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願第６０／６７０４３７号明細書に記載のように、前処置され、次いで、リンド，Ｌ．Ｒ．（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７）によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。キシロースおよびグルコースを含む混合糖類組成物が好ましく、ここで、さらなる糖類が存在してもよい。
【００８８】
多様な糖類の割合は、混合物において変動し得、キシロースでは、典型的に、糖類の全量の少なくとも約１０％である。好ましくは、キシロースは約４０％〜約６０％の間である。フルクトースは、サトウキビバガスのようないくつかのバイオマスの糖化によって生成される糖類に存在し、そしてキシロースが糖混合物の少なくとも約１０％を保持するように、キシロースまたはグルコースの一部をフルクトースに置き換えてもよい。さらに、アラビノースは、ヘミセルロースから誘導され、それ故、ヘミセルロースを含有する糖化バイオマスから誘導される混合糖類の典型的な成分である。
【００８９】
ＧＦＯＲ改変株ではないキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ではキシリトールが産生されない発酵条件下で、本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は増殖し、そして非ＧＦＯＲ改変株に匹敵するほどエタノールを産生する。例えば、５：４のグルコース対キシロース比を伴う約１００ｇ／Ｌ混合糖のような低糖培地において、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、非ＧＦＯＲ改変株と同様に作動する。
【００９０】
最大限のエタノール産生および発酵効率のために、キシロースを含む高レベルの糖類を含有する培地において、キシロース資化性エタノロジェンを増殖させることが望ましい。混合糖類は、本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖のための培地において高濃度で使用され得る。これは、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用を可能にし、それによって、商業的規模のエタノール産生に所望される発酵容積が縮小される。より大きな濃度のエタノールが産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地における混合糖類濃度は、典型的に、少なくとも約１２０ｇ／Ｌおよび約３００ｇ／Ｌまでである。約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間にある高濃度の混合糖類が特に有用である。
【００９１】
エタノールの産生に所望される高濃度混合糖類条件において、ソルビトールは、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の発酵培地に含まれる。本出願人らは、意外にも、ソルビトールを高混合糖類培地に添加すると、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の良好な増殖を可能にしたが、ソルビトールが含まれていなければ、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、ほとんどまたは増殖しなかったことを見出した。このことは、１２〜３６時間の停滞期間後にソルビトール添加を伴わずに濃縮糖混合物に順応することが可能であるＧＦＯＲ産生株とは極めて対照的である。フルクトースまたは（フルクトースの供給源としての）スクロースを欠く培地において、ＧＦＯＲがソルビトールを合成するか、または浸透圧適応において役割を果たすことは予想されなかった。増殖培地にフルクトースが存在しなければ、図Ｉに示されるソルビトール合成のためのＧＦＯＲの既知の反応は、進行し得ない。通常のＧＦＯＲ酵素活性を伴うキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、長い停滞期間を伴うものの、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物において増殖することが可能であることから、フルクトースを伴わなければ、ＧＦＯＲがソルビトールを合成しないことが予想されるため、ＧＦＯＲによるソルビトール合成が浸透圧適応に必要でないことが示唆された。それ故、ＧＦＯＲ酵素活性をなくすことが、フルクトースを欠く増殖培地においてソルビトール産生のレベルに対して効果を有することは予想しておらず、そしてグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖にソルビトールが必要であることも、全く予想外であった。
【００９２】
ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、約２ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度で培地に存在し得る。培地におけるより適切な最終濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度であり、５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度が好ましい。マンニトールを、ソルビトールの代わりに、またはソルビトールとの組み合わせで、培地において使用してもよい。マンニトールは、共有および同時係属中の米国仮特許出願第６０／８４７９９７号明細書（参照により本明細書に援用される）におけるソルビトールに類似の効果を有することが分かった。さらに、ガラクチトールおよび／またはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせて使用することができることが分かった。ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの組み合わせは、すべて、ソルビトールについて記載の濃度と同じ濃度で使用される。
【００９３】
酢酸塩のようなインヒビターの存在または非存在下における高度の糖培地におけるような、ＧＦＯＲ改変株ではないキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によってキシリトールが産生される発酵条件下では、本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、非ＧＦＯＲ改変株より優れている。本出願人らは、消費されるキシロースの全量および最終的なエタノール力価の両方について、ＧＦＯＲ改変株の方が非改変株より大きいことを見出した。さらに加えて、プロセス関連条件下では、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）による発酵においてキシリトールは産生されないが、本明細書の実施例６において示されるように、所定の環境下では、非ＧＦＯＲ機構によって少量が合成され得る。
【００９４】
キシロース資化およびエタノール産生における改善は、異なる発酵条件下で変動する。ＧＦＯＲ非改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によって高レベルのキシリトールが産生される条件下では、キシリトール合成を欠如させると、ＧＦＯＲ変異の効果がさらに大きくなる。例えば、酢酸塩のようなインヒビターが培地に存在する場合、より多量のキシリトールがＧＦＯＲ非改変株によって産生される。このキシリトール産生は、ＧＦＯＲ変異によって完全になくされ、ＧＦＯＲ変異を伴わずに少量のキシリトールが産生される条件におけるよりも、キシロース資化およびエタノール産生が増加することを可能にする。酢酸塩は、典型的に、処置されたセルロース系バイオマスに存在するため、処置されたセルロース系バイオマスから誘導される炭素源上において増殖させようとするエタノロジェンでは、酢酸塩に対して低減した感受性が所望される。それ故、発酵においてバイオマス加水分解物を使用する場合、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を使用する発酵が特に有益である。
【００９５】
エタノール産生のための発酵
エタノールの産生のため、組み換えＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロースを含む混合糖類を含有する培地と接触させる。増殖が阻害されるほど混合糖類の濃度が高い場合、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでいる。ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに使用するか、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間行うが、３０時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の間の温度、約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。
【００９６】
ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において増殖させることができる。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって、産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な対数期を通過して高増殖対数期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００９７】
標準的なバッチ系の１つの変形例は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ２のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該技術分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、およびブロック（Ｂｒｏｃｋ）、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、またはデスパンデ，ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７（１９９２年）（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００９８】
エタノールの商業的産生はまた、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【００９９】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【０１００】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望されるＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）において増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ６００が３〜６の間になるまで、種培養物を、種発酵槽において嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、もしくは水酸化ナトリウムのような）苛性溶液および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０で制御する。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御する。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。汚染を最小限にするために、場合により、カナマイシンのような株において抗生物質耐性マーカーが存在する抗生物質を使用してもよい。
【０１０１】
上記の条件の任意の組、および当業者に周知であるこれらの条件におけるさらなる変形例は、キシロース資化性組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【０１０２】
本発明を、以下の実施例においてさらに規定する。これらの実施例は、好適な実施形態を示す一方、あくまで例示として示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１０３】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）（１９８７年）から出版されたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより記載されている。
【０１０４】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【０１０５】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で、１晩、１．０〜１．２のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、４５００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを、２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを、２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μｌアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μｌを残して、ペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで−８０℃で貯蔵した。アッセイの前に、細胞を融解し、そして５００μｌの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）ソニファイアー４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、音波処理の間隔の間、サンプルを約３〜５分間冷やしながら、２回音波処理した。サンプルを、１４，０００ｒｐｍで６０分間、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を、新しいチューブに移し、そして４℃で保持した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを、タンパク質濃度を決定するために使用した。
【０１０６】
この酵素は他の酵素要素より不安定であるため、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイは、通常、最初に実施した。ＴＫＴアッセイの図を図３Ａに示す。
【０１０７】
マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１０８】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図３Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ３４０を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５
５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【０１０９】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図３Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１０】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図３Ｄに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅ））。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１１】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を伴うＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ１２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
流速：０．６ｍＬ／分
溶媒：０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
停止時間：２５分
注入容積：５μＬ
オ−トサンプラ−：温度管理（１０℃または４℃）
カラム温度：５５℃
検出器：外部標準検量線を伴う屈折率（４０℃）
【０１１２】
実施例１
ＺＷ６５８、キシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
ＺＷ６５８を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組み換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組込むことによって、構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。このアプローチは利点として組込み部位の多数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するため、ＺＷ６５８の調製では、部位特異的相同組み換えとは対照的に、転位（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）社製ＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を使用した。キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を配列し、そして組込みのための２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとしてクローニングした。２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）遺伝子を、組込み体の選択のための各オペロンに付着させた。２つのオペロンの組込みを、２段階の連続様式：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢで達成した。Ｃｍ耐性選択は、プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、続いて、各組込み後のプラスミドのキュアリングによって、取り出されるため、両方の組込みにおいて使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組込みの選択のために誘導される抗生物質マーカーの取り出しを可能にした。このプロセスにより、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子の悪影響がなくされた。
【０１１３】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コーディング領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（エピセンターバイオテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコーディング領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１および２を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰＥＮＯ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号３および４を伴うプライマーを使用して、ｔａｌコーディング領域フラグメントを、ｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号５および６を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＯＤｔｋｔのｔｋｔコーディング領域の上流にクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号７および８）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら（（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図４）を形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポナーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号９として示す。
【０１１４】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤは、ｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ２＋の存在下、室温で１時間、トランスポゼースで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したバイオラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）を使用する）エレクトロポレーションによって、ＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ４を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／Ｌバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天を含有する寒天プレート上でプレート化し、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０１／μｇのＤＮＡであった。
【０１１５】
合計で３９個のＣｍｒ形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号１０および１１を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組み換え体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組込み体を、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイを、タンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管において３０℃で増殖させた。酵素アッセイでは、コントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ６００が１．０に到達した場合、細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位をμモル／分−ｍｇとして示す。１つを除いて、すべてのサンプルは、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性を有した。
【０１１６】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組込み体のゲノムおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡは、ｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間において予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂ以上）のバンドは、各系統において個別のゲノム組込み部位を示す独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で独特であった。興味深いことに、プラスミドおよびＴ５のゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔもまた、生来のプラスミド上のＴ５に組込まれた可能性があることを示した。Ｃｍｒマーカーを取り出すためのさらなるＣｒｅ処置について、これらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【０１１７】
ｔａｌｔｋｔ組込み体からＣｍｒマーカーを取り出すためのＣｒｅ処置
染色体からＣｍｒマーカーを取り出すため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Ｓｐｒ耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。拾い出したコロニーの１００％がＣｍｓであったことから、ＣｒｅによるＣｍｒの高い効率の切り出しが示された。ＳｐｒＣｍｓ形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレート化した。ＰＣＲによってＳｐｓコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレート化した。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーは、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１および１１）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１回目および１０回目の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬおよびＴＫＴ活性の両方について類似のレベルを有したことから、これらの組込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【０１１８】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図４）に基づいて、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（図５）を構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、連結によって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号１２として示す。
【０１１９】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポナーゼで処置した（上記の）ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍで形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号１３、および１４、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号１３および１４を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【０１２０】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図６および７において示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図６）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が作製され、そして機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは、株８ｂより低かった。
【０１２１】
ｘｙｌＡＢオペロンの組込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｅｎｉｎ）標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクターベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は、同じ組込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は、同じ組込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ、個別の組込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組込み体は、そのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【０１２２】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）では、組込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【０１２３】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み株を、（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇ／ｌまた
は２％（ｗ／ｖ）キシロースならびにＲＭＧＸ（０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコース、４％（ｗ／ｖ）キシロースを伴うＲＭを含有する）ＲＭＸを含有する試験管およびプレートに播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応についての少なくとも５つの試みのうちの１つが、成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレート化したＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【０１２４】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ６００を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で定期的にモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを、７継代、連続した。増殖速度および最終ＯＤ（非線形読み取り）が、継代の間に改善された。
【０１２５】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称した。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ６００＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて、他の培養物より遅く増殖し、そして６．５時間後に再度、播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図８は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）において増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では、株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍｒマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍｒを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【０１２６】
ＲＭＸ（５％）中３７℃での連続継代によるキシロース培地における組込み体の適応
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、ＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株を、ＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために、３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上への画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【０１２７】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧにおいて、３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を、第１の評価のために、試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で、静置状態で播種した。増殖（ＯＤ６００、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を、第２の評価のために選択した。
【０１２８】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を、安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して、３７℃で５０代連続的に継代培養させた後に、それらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物を、ＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計において、試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図９にプロットした。結果は、ほとんどの株が、ＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が裏付けられた。
【０１２９】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）、ならびに高度の糖類におけるおよび酢酸塩の存在下でより良好な資化増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、および酢酸塩を伴うグルコースおよびキシロースの混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づけば、ＺＷ６５８と称される株番号２６が全体的に最も良好な性能を示した。
【０１３０】
実施例２
最上位の改善されたキシロース資化株の３７℃における発酵の評価
以下の実施例は、バイオマス加水分解物において予想される糖濃度および酢酸レベルを模倣する発酵条件下の改善されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株ＺＷ６５８の発酵性能を例示する。株ＺＷ６５８を、それぞれ、１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）、８％キシロース（ＲＭＸ８％）、１０％グルコース＋８％キシロース（ＲＭＧＸ１０％８％）および１０％グルコース＋８％キシロース＋０．６％酢酸（ＲＭＧＸＡｃ１０％８％０．６％）を補充したＲＭ培地を含有する発酵槽に播種した。すべての発酵は、３００ｍｌ培地を伴うシックスフォース（Ｓｉｘｆｏｒｓ）中、１５０ｒｐｍ、ｐＨ５．５および３７℃で行った。窒素を、発酵槽中の培地に１晩パージし、そして播種直前に停止した。発酵中は、窒素をパージしなかった。ＲＭＧ５％においてワーキングストックから起こした後の振盪フラスコ（１５０ｒｐｍ）中３７℃でのＲＭＧＸ（１０％、４％）によって、発酵のための播種物を調製した。株８ｂを、同じ条件下のコントロールとして使用した。図１０に示すように、ＺＷ６５８は、ＲＭＧ１０％上で８ｂと比較して、より緩徐に増殖し（ＡおよびＢ）、そしてＲＭＸ８％上では８ｂに類似の速度で増殖した（ＣおよびＤ）。より緩徐な増殖速度にもかかわらず、図１０は、グルコース培地での発酵の終了時にＺＷ６５８のエタノール収率（９３％）が８ｂに類似したことを示す。ＲＭＸ８％培地では、エタノール収率は、８ｂ（０．４４ｇエタノール／ｇ糖）と比較するとＺＷ６５８（０．４６ｇエタノール／ｇ糖）の方が高かった。ＺＷ６５８は、ＲＭＸ８％において８ｂと比較して、約４ｇ／ｌ多いエタノールを産生した。興味深いことに、ＺＷ６５８は、何らキシリトールを産生しなかった一方、８ｂは、ＲＭＸ８％における発酵の終了時に低レベルのキシリトール（０．７ｇ／ｌ）を産生した。図１１に示すデータは、酢酸塩を伴って（Ｃ、Ｄ）または伴わずに（Ａ、Ｂ）１０％グルコース＋８％キシロースを発酵する際に、ＺＷ６５８が、８ｂと比較してより良好に作動したことを示し、より多いグルコースおよびキシロース消費、より少ないキシリトール産生、およびより多いエタノール産生によって示される。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％における両方の株の発酵の終了時に、グルコースのほとんどが使用され、そして実質的な残留キシロースが保持されたが、ＺＷ６５８は、８ｂより約８ｇ／ｌ多いキシロースを使用した。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％中ＺＷ６５８における発酵の終了時のキシリトール産生（４．９ｇ／ｌ）は、８ｂのキシリトール産生（８．２ｇ／ｌ）より有意に低かった。酢酸塩（６ｇ／ｌ）の存在下において、両方の株の細胞増殖は、有意に減少し、グルコースおよびキシロースの両方の貧弱な発酵性能を生じたが、ＺＷ６５８は、より多いグルコースおよびキシロース産生、より少ないキシリトール産生およびより多いエタノール産生について、僅かにより良好な発酵性能を示した。ＲＭＸ８％とは異なり、酢酸塩を伴うまたは伴わないＲＭＧ１０％Ｘ８％では、両方の株とも副産物キシリトールを産生したが、８ｂと比較してＺＷ６５８ではキシリトールがより少なく産生された。２つの株の発酵性能を表１に要約する。全体として、ＺＷ６５８は、純粋な糖発酵において８ｂより良好に作動した。実施例１に記載のように、ＺＷ６５８は、抗生物質選択マーカーを含まず、これは、商業的用途において発酵生物体に貴重な特性である。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
実施例３
ＺＷ１およびＺＷ６５８におけるグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）遺伝子の挿入不活化の自殺構築物の調製
ＺＷ１およびＺＷ６５８においてグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするために使用される自殺構築物（「ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷ」）を、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）においてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を挿入により不活化するために先に使用された別の自殺構築物（「ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ」）から誘導した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、先に作製された他の多くの構築物から誘導した。これらの構築物のすべての最初の前駆体は、プラスミドベクターｐＮＥＢ１９３（ＮＥＢ番号Ｎ３０５１Ｓ；ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））であった。それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製することができるが、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では複製することができないため、このプラスミドを選択した。ＧＦＯＲを作製するのに関与したすべての工程および中間体について、プラスミドｐＮＥＢ１９３から開始して、年代順に以下に説明する。
【０１３３】
ｐＬＤＨ１９３の構築
以下に説明するＤＮＡフラグメントの挿入のために、ｐＮＥＢ１９３をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで二重消化した。両方の制限部位は独特であり、そしてプラスミドのマルチクローニング領域に局在する。ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ−線状化ｐＮＥＢ１９３プラスミドＤＮＡフラグメントを、製造者のプロトコルに従い、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製ＱＩＡクイック・ピュリフィケーション・キット（ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（カタログ番号２８１０４）を使用して、精製した。ｐＮＥＢ１９３にクローニングされたＤＮＡフラグメントは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製ブラッド・アンド・セル・カルチャー・マキシ・キット（Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ）（カタログ番号１３３６２）を使用して、株ＺＷ１から単離されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された２２６８ｂｐフラグメントであった。このフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用した合成オリゴヌクレオチドは、プライマー１および２であった：
プライマー１（配列番号１７）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣ
プライマー２（配列番号１８）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＡＣ
【０１３４】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ホスホグリセロムターゼ（ｐｇｍ）をコードするオープンリーディングフレームの３’末端でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド１２６２７３９〜１２６２７２０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、アルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ（ａｄｈＩ）をコードするオープンリーディングフレームの直ぐ上流であるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド１２６０４９０〜１２６０４７２にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。従って、ＰＣＲ増幅の標的であった２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＳｂｆＩ部位から開始し、そしてＡｓｃＩ部位で終了する次のエレメントからなる：（ａ）ｐｇｍ遺伝子の３’末端、（ｂ）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子全体、および（ｃ）遺伝子の５’非翻訳領域。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、上記で説明したＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ線状化ｐＮＥＢ１９３ベクターに連結した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０を形質転換して、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを含有するアンピシリン耐性形質転換体を、はじめに、再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）ならびにプライマー１および２によって同定した。ポジティブクローンの以後の確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにアンピシリン耐性形質転換体によるコロニーＰＣＲによって作製した２２６８ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列解析によって行った。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、「ｐＬＤＨ１９３」と称する。
【０１３５】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７の構築
プラスミドｐＬＤＨ１９３は、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間付近に局在する独特なＮｃｏＩ部位を有する。この部位を使用して、テトラサイクリンに対して耐性を付与するＤＮＡフラグメントを挿入した。この操作のために使用したテトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃｒ−カセット）を、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０６４０３）、ならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー３および４を使用するＰＣＲによって作製した。
プライマー３（配列番号１９）：
ＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃａｔｇｇＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＴｇｃｇｇｃｃｇｃＡＡＴＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣ
プライマー４（配列番号２０）：
ＡＴＣＴＣＡＣＴｃｃａｔｇｇＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡｔｔａａｔｔａａＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧ
プライマー３（順方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターの直ぐ上流にハイブリダイズする。プライマー３はまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、およびＮｏｔＩ）を有する。ＮｃｏＩ部位を小文字で表す。ＡｓｉＳＩ部位には、細い下線が付されている。Ｎｏｔ Ｉ部位を斜体の小文字で表す。プライマー４（逆方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子の終止コドンの直ぐ上流にハイブリダイズし、そしてこのプライマーはまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩ）を有する。上記の標識化と同様に、ＮｃｏＩ部位を小文字で表し、ＦｓｅＩ部位に細い下線を付し、そしてＰａｃＩ部位を斜体の小文字で表す。プライマー３および４で作製した１４４８ｂｐのＴｃｒ−カセットを、ＮｃｏＩで切断し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、プラスミド、ｐＬＤＨ１９３のｌｄｈオープンリーディングフレームに存在する独特なＮｃｏＩ部位に連結した。挿入を伴わないベクターの再環状化の可能性を最小限にするために、連結の前に、ＮｃｏＩ消化ｐＮＥＢ１９３を仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。連結反応混合物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入し、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確な挿入を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてＴｃｒ−カセットの配向を、適切なプライマーを使用するＰＣＲ分析によって確認した。さらなる操作のために選択したプラスミド（ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７）の環状図を、図１２に示す。ここに記載されていない実験では、この自殺構築物を使用し、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択としてテトラサイクリン上での増殖を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を、挿入により不活化（即ち、「破壊」または「ノックアウト」）した。
【０１３６】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を「ノックアウト」し得ることを実証したことから、次の工程は、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して、遺伝子破壊後の染色体から選択マーカーを取り出すことが可能であるように、この構築物を改変することであった。この目的を達成するために、Ｔｃｒ−カセットにフランキングする４つの独特な制限部位、即ち、５’末端におけるＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩならびに３’末端におけるＰａｃＩおよびＦｓｅＩを利用して、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、１９９８年）をｐＬＤＨＴｃ１３９＃７に付加した。構築物を両方の酵素で切断し、そして得られる大きなＤＮＡフラグメントを精製した後、第１のｌｏｘＰ部位を、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位は、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド５および６（配列番号２１および２２）から作製した。
オリゴヌクレオチド５（配列番号２１）：
ｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃ
オリゴヌクレオチド６（配列番号２２）：
ｇｇｃｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃｇａｔ
これらのオリゴヌクレオチドは相互に相補的であり、そして共にアニールする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。オリゴヌクレオチド中の大文字は、完全長の野生型ｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位に連結するために使用したヌクレオチドを示す。
【０１３７】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳｉおよびＮｏｔＩ部位に正確に挿入されたｌｏｘＰ部位を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、コロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、「ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗ」と称する。
【０１３８】
次に、両方の酵素でプラスミドを切断し、そして得られる大きなベクターフラグメントを精製した後、第２の野生型ｌｏｘＰ部位を、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷにおけるＴｃｒ−カセットの他方の末端のＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位もまた、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド７および８（配列番号２３および２４）で作製した。
オリゴヌクレオチド７（配列番号２３）：
ｔａａＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｇｃｃｇｇ
オリゴヌクレオチド８（配列番号２４）：
ｃｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｔｔａａｔ
オリゴヌクレオチド７および８は相互に相補的であり、そしてハイブリダイズする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。オリゴヌクレオチド中の大文字は、完全長のｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に連結するために使用されるヌクレオチドを示す。
【０１３９】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に正確に挿入された野生型ｌｏｘＰ部位を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、コロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと称し、そしてこの構築物の環状図を図１２に示す。
【０１４０】
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷはｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと同一であるが、但し、後者の構築物のテトラサイクリン耐性カセットは、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃｒ−カセット）で置き換えられた。後者は、テンプレートとしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（カフーン（Ｃａｈｏｏｎ）ら、２００３年）ならびにプライマー９および１０を使用するＰＣＲによって作製した。ｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの完全なヌクレオチド配列およびそのプロモーターを含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４０３）の公開された配列に基づく。
プライマー９（配列番号２５）：
ＡＴＡＡＡＡｇｃｇｇｃｃｇｃＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡ
プライマー１０（配列番号２６）：
ＧＧＣＧｔｔａａｔｔａａＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧ
【０１４１】
プライマー９（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ６〜１７に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位に対応する。プライマー１０（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００６〜１０１９に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＰａｃＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された１０４０ｂｐのＳｐｅｃｒ−カセットを、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、Ｔｃｒ−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化し、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズの挿入を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷと称し；この構築物の環状図を図１２に示す。ここに記載されていない実験では、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを使用し、スペクチノマイシンに対する耐性を選択マーカーとして使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子をノックアウトした。自殺構築物による遺伝子不活化は、宿主経由、二重交差、相同組み換えを介して生じ（国際公開第０１／８３７８４Ａ２号パンフレット）、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間における２つの野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされる選択マーカー（Ｓｐｅｃｒ−カセット）の挿入を生じた。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのＳｐｅｃｒ−カセットにフランキングする２つのＤＮＡフラグメントによって、二重交差事象の標的をｌｄｈ遺伝子に定めた。これらのフラグメントの一方（以降、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの直ぐ上流にあり、そしてＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位の間に局在する。この約１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は、ｐｇｍ遺伝子の３’末端およびｌｄｈオープンリーディングフレームのはじめのおよそ半分をコードするＺＷ１染色体ＤＮＡと同一である。他方のＤＮＡフラグメント（以降、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間のＳｐｅｃｒ−カセットの対向末端に局在する。３’ｌｄｈフランキングＤＮＡのヌクレオチド配列（これもまた、約１１００ｂｐである）は、ｌｄｈ遺伝子の他方の半分およびａｄｈＩ遺伝子の５’非翻訳領域の部分をコードする染色体ＤＮＡと同一である。５’および３’ｌｄｈフランキングＤＮＡフラグメントの両方がそれらの染色体対応物と相互作用し、そして相同組み換えを経験する場合、二重交差事象を生じる。本質的に不可逆的であり、そしてもっぱら、宿主の酵素的機構によって仲介されるこの現象は、オープンリーディングフレームの中間にＳｐｅｃｒ−カセットを挿入することによって、染色体ｌｄｈ遺伝子を不活化する。構築物は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができず、このことがそれを自殺構築物にするため、（極めて低い頻度で生じる自然発生性の薬剤耐性変異体とは別の）ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを伴う安定なスペクチノマイシン耐性コロニーを作製するための唯一の方法は、相同組み換えを介する二重交差事象である。二重交差事象によって染色体に挿入されるＳｐｅｃｒ−カセットはなお、自殺構築物に存在する２つの野生型ｌｏｘＰ部位の間に挟まれていることに留意することが重要である。この配置のため、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクターを使用することによってそれを再活性化することを伴わずに、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選択マーカーを取り出すことが容易である。
【０１４２】
ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを、以下に記載の第２の工程手順におけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）の遺伝子不活化のための自殺構築物に変換した。第１の工程は、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてそれを、ＧＦＯＲをコードする染色体遺伝子をプラスミド構築物の標的にする類似のＤＮＡフラグメントで置き換えることであった。後者のＤＮＡフラグメント（以降、３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡと称する）は、テンプレートとしてＺＷ１ゲノムＤＮＡおよびＰＣＲプライマーとしてプライマー１１および１２を使用するＰＣＲによって作製した。
プライマー１１（配列番号２７）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＴＣＡＧＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣ
プライマー１２（配列番号２８）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＧＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＧ
【０１４３】
プライマー１１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームのおよそ中間にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８４３２４〜６８４３０５にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー１２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲ終止コドンから約６２５ｂｐ下流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８３１２４〜６８３１４３にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。１２３４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてこの操作から得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲにより作製された３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡを、ゲル精製した大きなベクターフラグメントのＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間で連結し、そして連結反応混合物のアリコートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートした。形質転換された細胞を、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレート化し、そしてプレートを３７℃でインキュベートした。正確な挿入物を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、コロニーＰＣＲならびにＦｓｅＩおよびＡｓｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷと称した。
【０１４４】
次の工程は、ｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷから５’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてそれを、５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡで置き換えることであったが、そのため、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの破壊のために選択した染色体標的において、二重交差事象が生じ得る。テンプレートとしてＺＷ１ゲノムＤＮＡならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー１３および１４を使用するＰＣＲによって、５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡフラグメントを作製した。
プライマー１３（配列番号２９）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴａｔｇｃａｔＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣ
プライマー１４（配列番号３０）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇａｔｃｇｃＴＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴ
【０１４５】
プライマー１３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲ開始コドンから約５２０ｂｐ上流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８５５８４〜６８５５６４にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｓｉＩ部位に対応する。プライマー１４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間近くにあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８４３９６〜６８４４１５にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｉＳＩ部位に対応する。１２１７ｂｐのＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＡｓｉＳＩで切断し、そしてｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷを、ＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩで二重消化して、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し；後者の操作から生じる大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲにより作製された５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡを、上記のゲル精製した大きなベクターフラグメントのＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位に連結し、そして連結反応混合物のアリコートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄｃｍ−およびｄａｍ−である）にエレクトロポレートして、ＺＷ１およびＺＷ６５８の以後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得た（実施例５および７において詳述する）。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から単離されるメチル化プラスミドＤＮＡは、ＤＨ１０Ｂと同様に、宿主の制限／改変系によって容易に破壊される（米国特許第６５６６１０７Ｂ１号明細書に記載されている）ため、ＺＭ４から誘導されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡの使用が、成功に極めて重要であることに留意すること。ＮｓｉＩおよびＳｂｆＩは適合性の粘着末端を有するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレート化し、そしてプレートを３７℃でインキュベートした。正確な挿入物を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、コロニーＰＣＲおよび制限消化分析によって同定した。ＺＷ１およびＺＷ６５８においてＧＦＯＲ遺伝子をノックアウトするために使用したこの得られる自殺構築物を、以降、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷと称する。このプラスミドの環状図を図１２に示し、そしてその完全なヌクレオチド配列を配列番号３１に開示する。この自殺構築物とＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体ＧＦＯＲ遺伝子との間の二重交差事象により、２つの野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされるＳｐｅｃｒ−カセットの挿入を生じ、ｐＬＤＨ−Ｓｐｅｃ−９ＷＷについて上記の状況に類似することに留意することが重要である。
【０１４６】
実施例４
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現のためのプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）を作製した（図１３）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、それぞれの細菌種に対して１つずつ有するため、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｔｃｒ−カセット）を含有する。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃｒ−カセットを取り出し、そしてそれを、カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｋａｎｒ−カセット）で置き換えることであった。ｐＺＢ１８８からＴｃｒ−カセットを切り出すために、プラスミドをＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。ＰＣＲ増幅のために、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））ならびにプライマー１５および１６を使用するＰＣＲによって、Ｋａｎｒ−カセットを作製した。ｐＥＴ−２４ａは、Ｋａｎｒ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームおよびその関連するプロモーターを含有する。
プライマー１５（配列番号３２）：
ＧＣｔｃｔａｇａＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣ
プライマー１６（配列番号３３）：
ＡＣＡＴＴＧｇｃｇｃｇｃＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣ
プライマー１５（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｐＥＴ−２４ａにおけるＫａｎｒ遺伝子の開始コドンから約１６０ｂｐ上流にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＸｂａＩ部位に対応する。プライマー１６（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｋａｎｒ遺伝子のオープンリーディングフレームの他方の末端でハイブリダイズし、そして終結コドンを含む一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＢｓｓＨＩＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された９９１ｂｐのＫａｎｒ−カセットを、ＸｂａＩおよびＢｓｓｈＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１４７】
次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、標準的な連結反応で、上記のｐＺＢ１８８ＤＮＡフラグメントのＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位の間に挿入した。エレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、そして細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡを、カナマイシン耐性形質転換体の１つから単離したが、得られた構築物を以降、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎと称し；このシャトルベクターの環状図を図１３に示す。
【０１４８】
次の工程では、後者を両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ＫａｎのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、後者の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製した後、プラスミドｐＺＢ４から誘導した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図１３の枠内の図に示す。
【０１４９】
ＮｃｏＩおよびＣｌａＩ部位を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットのそれぞれ５’および３’末端に局在させた。米国特許第５５１４５８３号明細書において記載のように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターを含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンが直ぐ後に続く小さなステムループ領域を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ＫａｎのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。次いで、連結反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）にエレクトロポレートして、以下の実施例６に記載のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを有するカナマイシン耐性形質転換体を、制限消化分析およびコロニーＰＣＲによって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼを発現させるために使用したプラスミドを、以降、「ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ」と称する；この構築物の環状図を図１３に示す。
【０１５０】
実施例５
ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体の作製
ＺＷ１（ＺＷ６５８が最初に誘導された野生型株）においてＧＦＯＲ酵素活性をなくすために、実施例３において詳述した自殺構築物ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷを使用した。米国特許第５５１４５８３号明細書に本質的に記載されているように、エレクトロポレーションを使用して、非複製プラスミドＤＮＡを細菌宿主に導入した。簡単に説明すると、５０μｌの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の約１０１０個の細胞／ｍｌおよび実施例３に記載のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離した約０．９μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを含有した。コントロール反応物も全く同様に処置したが、プラスミドＤＮＡを含まなかった。エレクトロポレーターの設定は、１６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で希釈し、そして細胞を約５時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り出した。細胞ペレットを、１５０μｌの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして５０および１００μｌアリコートの細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。プレートを、嫌気チャンバにおいて３０℃でインキュベートし、そして２〜３日後、５０〜１５０個のコロニーが実験プレート上に出現した。このとき、コントロールプレート上にスペクチノマイシン耐性コロニーは認められなかったが、さらに４８時間のインキュベーション期間後に若干出現した。以下に記載のさらなる操作のために、ＧＦＯＲノックアウト構築物による形質転換から生じたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち２個を選択した。
【０１５１】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷに類似する自殺構築物を伴う先の実験から、染色体とプラスミドＤＮＡとの間の初期の相互作用は２つの標的化遺伝子座のうちの１つにおける一重交差であること、および一重交差事象は最終的に二重交差事象を生じることが示されている。二重交差事象への移行は、通常、自殺構築物のための選択因子を含有する液体培地における若干の連続的継代後、極めて迅速に生じる。ＧＦＯＲノックアウト構築物から生じる２つの選択されたＺＷ１形質転換体のための二重交差事象を容易にするために、１００ｇ／Ｌのグルコースおよび２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する１０ｍｌのＲＭ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）に細胞を播種した。３０℃で２４時間のインキュベーション期間の後、両方の培養物とも、定常期に到達した。次に、１０μｌアリコートの第１代培養物を使用して、１０ｍｌの同じ増殖培地に播種し、そしてこれらの両方の培養物もまた、３０℃で２４時間後に定常期に到達した。最終的に、１０μｌアリコートの第２代培養物を１０ｍｌの同じ増殖培地に播種し、そして３０℃でさらに２４時間、増殖を促進させた。液体培地における最後の継代後、第３代培養物のアリコートを希釈し、そしてスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧ培地上でプレート化して、単一のコロニーを入手し、そしてプレートを、嫌気条件下、３０℃で４８時間、インキュベートした。
【０１５２】
３つの異なる対のプライマーを使用するコロニーＰＣＲ実験から、二重交差事象が実際に生じたことが確認された。自殺構築物における５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験している場合、ＰＣＲプライマーの第１の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。同様に、自殺構築物における３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を生じている場合、ＰＣＲプライマーの第２の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。最終的に、二重交差事象が生じており、そしてさらに、一重および二重交差事象の集団の混合の可能性がなくされる場合、ＰＣＲプライマーの第３の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。この分析に使用した２個のスペクチノマイシン耐性コロニーを、自殺構築物とのＺＷ１エレクトロポレーション反応由来の２つの異なる主な形質転換体（これは、液体培地において３回継代し、そして上記のようにプレート化して単一のコロニーを得た）から誘導し、そしてこの実験のコントロールを親株、ＺＷ１とした。両方の形質転換体とも３つの異なる組のＰＣＲプライマーによりポジティブな結果を呈したため、さらなる分析のために、それらのうちただ１つを選択した。この株（ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体）を、以降、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲと称する。
【０１５３】
実施例６
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼは、生理学的条件下でキシリトール形成に対する主な寄与物であり得る
ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体（ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ）を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株におけるキシリトール形成が、ペリプラズム酵素ＧＦＯＲか、または酵素的に活性でもあるそのより大きな分子量のサイトゾル前駆体によって少なくとも部分的に仲介されるという仮説（ロース（Ｌｏｏｓ）ら、上掲）を試験した。実施例２（図１１）に示されるように、キシリトールは、キシロース資化株８ｂおよびＺＷ６５８の主な副産物であるが、キシロースが増殖培地に存在する場合にのみ形成される。ＣＰ４のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の野生型株は、キシロースをキシリトールに直接還元することができるＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼを有する（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）が、図ＩＩおよびＩＩＩに示すように、増殖培地がキシロースまたはグルコースおよびキシロースの混合物を含有する場合、ＧＦＯＲはまた、インビボでのキシリトール形成に寄与し得ることが考えられる。しかし、インビトロでのＧＦＯＲ酵素特徴付けアッセイ（ザカライオウ（Ｚａｃｈａｒｉｏｕ）およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、上掲）および粗無細胞抽出物による実験（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）において示されるように、この化合物はＧＦＯＲ仲介キシリトール産生に不可欠な電子受容体であるため、これらの反応のいずれかが生じるためには、酵素がキシルロースにアクセスする必要がある。キシロース上での増殖のために操作されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株では、キシリトール合成に必要なキシルロースは、キシロース代謝（図１）の第１の工程を触媒し、ＺＷ１のような野生型株には存在しないキシロースイソメラーゼによって作製される。
【０１５４】
キシロースおよびグルコースの両方が増殖培地存在する場合にＧＦＯＲがキシリトールを作製することができる可能を試験するために、実施例４で説明した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）を、ＺＷ１およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲに導入した。ストラテジーは、これらの糖類のいずれかにおいて増殖することができない２つの株におけるキシロースからキシルロースへの経路を提供し、そしてＧＦＯＲがキシリトールを作製し得るかどうかを決定することであった。形質転換のために使用したエレクトロポレーション手順については本質的に実施例５に記載のとおりであったが、回復期間後、形質転換された細胞を、３００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。この実験のコントロールとして、ＺＷ１およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲもまた、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡと同一であるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くｐＺＢ１８８／Ｋａｎ（図１３）で形質転換した。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡまたはコントロールプラスミドを所有するカナマイシン耐性コロニーを、コロニーＰＣＲによって同定し、そして各形質転換反応由来のそれぞれのコロニーを、図１４に示す実験のために無作為に選択した。これらの４つのプラスミドを有する株を、以降、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）と称する。
【０１５５】
１晩培養物を、１５ｍｌキャップ付き試験管中、３０℃で、５ｍｌの６０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ２（７Ｈ２０）および３００μｇ／ｍｌのカナマイシンにおいて増殖させた。次いで、これらの１晩培養物のアリコートを使用して、２０ｇ／Ｌのキシロースを伴うまたは伴わない同じ増殖培地を含有する（５０ｍｌキャップ付き試験管中の）２０ｍｌ培養物に播種した。増殖は、３０℃において穏やかな撹拌を伴い、そして初期のＯＤ６００値は約０．１であった。０、２４、４８、および１２０時間の増殖後、ＨＰＬＣ分析のために、屈折率検出器を具備するＨＰ１１００（ヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を使用して、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出し、発酵ブロス中に存在するキシロース、キシルロースおよびキシリトールの濃度を決定した。ＨＰＬＣ分析の前に、遠心分離によって細胞を取り出し、そして０．２２μｍ酢酸セルローススピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ遠心管フィルター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、カタログ番号８１６０）を介して上清をろ過して、小さな粒子を取り出した。化合物を、０．６ｍｌ／分の流速および移動相として０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を使用する均一溶媒条件下、５５℃で稼動させたアミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））上で分離させた。既知濃度の標準物質を使用して、目的のピークを定量し、そしてすべての結果をｇ／Ｌで表した。
【０１５６】
結果は、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）、「空の」ベクターを伴うコントロール株をグルコースおよびキシロースの存在下で増殖させる場合、１２０時間のインキュベーション期間後、極少量のキシリトールが増殖培地に蓄積したことを示す（図１４Ａ）。この株で観察された最大量のキシリトールは、＜０．５ｇ／Ｌであった。対照的に、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）を同じ濃度のグルコースにおいて増殖させたが、キシロースを省いた場合、キシリトールは形成されず、そしてこれは他の３つの株についても同様であった。結果として、グルコースおよびキシロースの両方の存在下で実施した実験のみを、図１４に示す。意外にも、ＺＷ１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現は、発酵ブロスにおいて出現したキシリトールの量を顕著に増加し、そして１２０時間まで、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）は、この化合物を、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）より５倍多く作製した（図１４Ｂ）。キシロースイソメラーゼは、キシロースからキシルロースへの異性化を触媒するため、予想したとおり、ＺＷ１におけるキシロースイソメラーゼの発現もまた、キシルロースの産生を生じた。この実験において、増殖培地に添加された全キシロースのうち約１６％が、キシルロースまたはキシリトールに変換されたことに留意すること。また、これらの２つの化合物の間に明らかな前駆体／産物の関係（キシリトールが増加する時、キシルロースは減少する）が存在し、これは、グルコースおよびキシロースが両方とも増殖培地に存在する場合、生理学的条件下でＧＦＯＲはキシルロースをキシリトールに変換することが可能であるという仮説に一致することに留意すること。
【０１５７】
ＺＷ１と同様に、キシロースイソメラーゼ発現ベクターの非存在下では、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲによって作製されるキシリトールは極僅かであった（図１４Ｃ）。これらの条件下で形成された少量のキシリトールは、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼから生じ得、フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら（１９９２年、上掲）により示唆されている。特に、キシロースイソメラーゼをＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体において発現させた場合、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）で得られた結果とは対照的に、さらなるキシリトールは作製されなかった（図１４Ｄ）。実際、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）は大量のキシルロースを産生し、そして形成されたこの化合物の量は、対応するＺＷ１株（即ち、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ））によって作製されたキシルロースおよびキシリトールの全量に極めて類似した。これらの実験は、酵素がキシルロースにアクセスする場合、ＧＦＯＲがインビボにおけるキシリトール形成に実質的に寄与することができ、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株がグルコースおよびキシロースの混合物において増殖する場合に他ならないことを明確に実証する。これらの結果は、さらに、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組み換え株をキシロース含有培地において増殖させる場合、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼが、キシリトール産生においてあまり役割を果たしていないことを示し、文献（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲；キム（Ｋｉｍ）ら、上掲）の予想とは対照的である。
【０１５８】
実施例７
ＺＷ６５８ ＧＦＯＲノックアウト変異体の作製およびこの株が機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないことの実証
実施例６において示されるように、グルコースおよびキシルロースの両方が利用可能である場合、生理学的条件下で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール形成に寄与することができるＧＦＯＲをコードする遺伝子を、自殺構築物、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷ（実施例３に記載されている）を使用して、ＺＷ６５８において挿入により不活化した。この手順におけるすべての工程は、実施例５におけるＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体に記載の工程と同一であり、３つの組のＰＣＲプライマーによる二重交差事象の確認を含む。以下に記載の以後の実験のために選択したＺＷ６５８ノックアウト変異体を、ＺＷ８００と命名した。
【０１５９】
ＺＷ８００が、グルコースおよびフルクトースからソルビトールを作製すること（ＧＦＯＲによって触媒される生理学的反応である）ができる酵素を産生しないことを実証するために、以下の実験を実施した。ＺＷ８００および親株ＺＷ６５８の１．５ミリリットル培養液を、１０ｍｌキャップ付き試験管中、３０℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において、早期定常期まで増殖させた。培養物が約５．５のＯＤ６００に到達したら、遠心分離によって細胞を回収し、そして上清を注意深く取り出し、そして廃棄した。次に、細胞ペレットを、次の組成を有する５ｍｌの新鮮増殖培地に再懸濁した：１１０ｇ／Ｌグルコース、１１０ｇ／Ｌフルクトース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、および４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３。上記のすべての工程を滅菌条件下で実施し、そして細胞を再懸濁する前に、増殖培地の初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。次いで、得られた培養物を、３０℃で、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させ、そして表２に示された時間に、実施例６に記載したのと同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにサンプルを取り出した。この実験のための目的のピークは、グルコース、フルクトース、ソルビトールおよびエタノールであり、そして細胞を遠心分離によって回収した後、既知量の標準物質を使用して、発酵ブロスにおけるそれらの濃度を算出した；表２では、すべての濃度をｇ／Ｌで表す。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
表２に示されるように、ＺＷ６５８培養物は、２３時間後にほとんどすべてのグルコースおよびおよそ半分のフルクトースを消費し、そして主な産物として匹敵する量のソルビトールおよびエタノールを作製した；最初の時間ポイント中の２つの後者の化合物の値は、それぞれ、４５．９９ｇ／Ｌおよび４９．３６ｇ／Ｌであった。それ故、ＺＷ６５８培養物中のＧＦＯＲによって、はじめにあったフルクトースのうち４０％を超えるものがソルビトールに変換された。極めて対照的に、２３時間のインキュベーション期間後のＺＷ８００培養物由来の発酵ブロスでは、ソルビトールは検出されなかったが、その代わり、グルコースおよびフルクトースは、ほぼ定量的にエタノールに変換され、１グラムの消費された糖あたり理論値で０．５１グラムのエタノールに極めて近かった。さらに２４時間の増殖後、ＺＷ６５８培養物におけるソルビトールの量のさらなる増加は認められなかったことに留意すること。ほぼすべてのグルコースが早期に枯渇され、そしてフルクトースとのＧＦＯＲ反応のための電子供与体が存在しなかったため、これは予想されることであった。興味深いことに、４７時間時点のＺＷ８００培養物の発酵ブロスにおいて少量のソルビトール（１０．２１ｇ／Ｌ）が見出され、そしてこれは、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼ（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）または未だ解明されていない他のいくつかの酵素によって作製され得る。それにもかかわらず、上記の結果は、ＺＷ８００のＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間に挿入されたＳｐｅｃｒ−カセットは、全てではないにしても大部分がＧＦＯＲ酵素活性を廃止した証拠を提供する。
【０１６２】
さらに、この結論は、ＺＷ１、ＺＷ６５８およびＺＷ８００から調製された無細胞抽出物によるインビトロ実験によって支持される。目的は、他の物質または補因子を添加することなく、ＺＷ６５８がキシロースをキシリトールに変換することができるかどうかを決定すること、およびＧＦＯＲ不活化の結果として、ＺＷ８００がこの反応を行う能力を失っているかどうかを調べることであった。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物によるＧＦＯＲ仲介キシリトール産生には次の３つの要件が存在する：１）ＧＦＯＲの強固に結合した補因子を還元することが可能であるグルコースまたはキシロースのような糖電子供与体、２）電子受容体としてのキシルロース（何故なら、酵素が実際にキシリトールに還元するのはこの化合物であるからである）、および３）機能性ＧＦＯＲ酵素。キシルロースが反応混合物に添加されない場合、無細胞抽出物はまた、キシロースをキシルロースに変換するためのキシロースイソメラーゼを含有しなければならない。
【０１６３】
無細胞抽出物を、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および５０ｇ／Ｌグルコースを含有する２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて３３℃で増殖させた１００ｍｌ培養物から調製した。２〜３の間のＯＤ６００で遠心分離によって細胞を回収し、そして氷冷５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールで２回洗浄した。最終的なペレットを、１．０ｍｌの同じ緩衝液に再懸濁し、そして細胞を音波処理によって破砕した。細胞破砕物を４℃で遠心分離（１６，０００×ｇ、６０分間）によって取り出した後、以下に記載のように、無細胞抽出物を、キシリトール産生について直ちにアッセイした。５００μｌの反応を、ポリプロピレン微量遠心管において行い、そして最終濃度で次の組成を含有した：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、６６ｍＭキシロース、および０．３２〜０．３５ｍｇの無細胞抽出物タンパク質；タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用するＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））によって決定した。４０℃で１５時間のインキュベーション期間後、反応を、最終濃度で３０ｍＭのピバリン酸で終結させ、そして移動相として０．０１Ｎ硫酸を伴うＳＨ１０１１カラム（ショウデックス（Ｓｈｏｗｄｅｘ））を使用するＨＰＬＣによって、アリコートを分析した。カラム温度を５０℃に維持し、流速は１．０ｍｌ／分であった。この実験のためのコントロールは無細胞抽出物を含まなかったが、それ以外は全く同様に処置した。
【０１６４】
表３に示すように、ＺＷ１無細胞抽出物を反応混合物に添加する場合、１５時間のインキュベーション期間中、キシロースはキシルロースまたはキシリトールに変換されなかった。既に示したように、ＺＷ６５８およびＺＷ８００とは対照的に、ＺＷ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼを発現しない野生型株であるため、この結果は予想されることであった。対照的に、無細胞抽出物は、これらの２つの化合物の形成に必要な両方の酵素を含有したため、ＺＷ６５８無細胞抽出物を使用した場合、有意量のキシルロースおよびキシリトールを作製した。キシロースが、反応混合物に添加される唯一のＧＦＯＲ基質である場合、作製されるキシリトールの各分子について２分子のキシロースが消費されるため、この場合、はじめにあった６６ｍＭキシロースのうち８％近くがキシリトール産生に使用されたことに留意すること。最終的に、そして最も重要なことに、ＺＷ８００無細胞抽出物はキシロースイソメラーゼ活性を含有したが、それはＧＦＯＲ酵素活性を欠いたため、ＺＷ８００無細胞抽出物のみが、キシロースをキシルロースに変換することが可能であった。精製されたキシロースイソメラーゼでスパイクされた野生型無細胞抽出物で先に示されている（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）ように、これらの結果は、ＺＷ８００が機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないさらなる証拠を提供し、そしてこのタンパク質がキシロースを電子供与体として使用して、キシルロースをキシリトールに還元することが可能であることをさらに実証する。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
実施例８
ソルビトールはグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００の増殖に必要である
グルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００によるエタノールの産生のための発酵性能を試験した。実験は、ｐＨ制御された発酵槽において、９７ｇ／Ｌまたは１８８ｇ／Ｌの全糖において約５：４の一定のグルコース対キシロース比を使用して、行った。
【０１６７】
ＺＷ６５８およびＺＷ８００の種培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において増殖させた；初期ｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。ＯＤ６００が約５．０に到達したら、種培養物の５０ｍｌアリコートを使用して、４５０ｍｌの増殖培地を含有する１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム・インク．（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）、米国ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））に接種した。最終的な５００ｍｌ培養物は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４および低濃度の糖（５４ｇ／Ｌグルコース、４３ｇ／Ｌキシロース）または高濃度の糖（１０４ｇ／Ｌグルコース、８４ｇ／Ｌキシロース）のいずれか一方を含有する。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。多様な時間において、実施例６に記載したのと同じ手順および条件を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験のための目的の化合物はグルコース、キシロース、およびエタノールであり、そして既知濃度の標準物質を使用して、クロマトグラムのピークを定量した。また、６００ｎｍの光学密度に設定した分光光度計による濁度の変化を追跡することによって、細胞増殖をモニターし、そして得られるＯＤ６００値をプロットした。
【０１６８】
図１５に示すように、発酵槽が低濃度の糖（５４ｇ／Ｌグルコース、４３ｇ／Ｌキシロース）を含有した場合、ＧＦＯＲ不活化は、増殖、糖消費、またはエタノール力価に影響を及ぼさなかった。しかし、全糖濃度を図１６において認められる場合の約２倍に増加し
た場合、発酵性能において大きな差異が観察された。ＺＷ６５８は、約３０時間の停滞期間を経験したが、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株をグルコースおよびキシロースの希釈混合物から約１８０ｇ／Ｌの全糖を超える同じ糖類の濃縮混合物へ移す場合、それらに典型的である。停滞期間後、細胞は増殖を開始し、そして培地中の全てのグルコースおよび約７５％のキシロースを消費し、それ故、約７３ｇ／Ｌの最終エタノール力価を生じた（図１６Ａ）。対照的に、ＺＷ８００培養物は、１３０時間のインキュベーション期間後であっても、停滞期間から回復せず（図１６Ｂ）、そしてこの結果は２回の個別の施行において観察された。
【０１６９】
図１５に示すように、ＺＷ８００は、グルコースおよびキシロースの希釈混合物において良好に増殖したため、高い糖混合物においてこの株が回復できないことは、浸透圧ストレスにいくらか関係する可能性があるようであった。実際、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をグルコースおよびフルクトースの濃縮混合物または高濃度のスクロースに移す場合（これはまた、インベルターゼの作用を介してグルコースおよびフルクトースを上昇させる）、ＧＦＯＲは、ソルビトールを作製することによって、浸透圧バランスを維持することに極めて重要な役割を果たす（ロース（Ｌｏｏｓ）ら、上掲）。ペリプラズム空間においてＧＦＯＲによって産生されるソルビトールは、濃度勾配に対して細胞に輸送され、ここで、それは、さらに代謝されないため、高レベルで蓄積する。これは、形質膜を横切る浸透圧差をなくし、そして浸透圧バランスを回復する（ヴィーゲルト（Ｗｉｅｇｅｒｔ）ら、上掲）。しかし、ＧＦＯＲ仲介ソルビトール産生の前提条件は、グルコースおよびフルクトースが同時に存在することであり、そしてこの反応は、フルクトースを欠く増殖培地では生じるべきではない。それにもかかわらず、ソルビトールは、ＧＦＯＲの生理学的に重要な産物であり、そしてこの酵素は、ＺＷ８００において非活性であるため、ソルビトールをグルコースおよびキシロースの濃縮混合物に添加する効果を、下記の実験において試験した。
【０１７０】
高度の糖混合物における約７０時間後（図１６において垂直矢印で示した時点）、区画されたＺＷ８００培養物の５つの４．５ｍｌアリコートを発酵槽から取り出し、そして１５ｍｌキャップ付き試験管に移した。次いで、試験管のうち４つに、０〜２０ｍＭソルビトール（最終濃度）を補充し、そして全ての場合において、培養物の全容積を脱イオン水で５．０ｍｌに調整した；この実験に使用したソルビトールストック溶液もまた、水で作製した。水およびソルビトールを添加する場合、増殖培地の１０％希釈のためのコントロールに対し、第５の培養物に何も添加しなかった。次いで、培養物の全てを、３３℃で、穏やかに撹拌（２００ｒｐｍ）しながらインキュベートし、そして分光光度により増殖をモニターした。図１７に示すように、ソルビトールを増殖培地に添加すると、試験した最も低い濃度（５ｍＭ）であっても、細胞は、ほぼ直ちに増殖を開始した。ソルビトールを添加しなかったが、培養物を水で１０％希釈し、全糖濃度を１８８ｇ／Ｌから１６９ｇ／Ｌへ減少させた場合、増殖のいくつかの刺激が観察された。しかし、増殖に対するソルビトールの刺激効果は、希釈の効果よりもかなり大きかった。
【０１７１】
ＺＷ６５８は、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物において、フルクトースの既知の供給源を伴わずに、停滞期から回復し、そして良好に増殖したため、ソルビトールによるＺＷ８００増殖の救出は全く予想外であった。後者の化合物はＧＦＯＲ仲介ソルビトール産生に不可欠な電子受容体であるため、ソルビトールを合成し得ず、または高濃度のグルコースおよびキシロースを含有する培地における浸透圧バランスにおいて役割を果たし得ないようであった。それ故、ソルビトールが、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物においてＺＷ６５８またはＺＷ８００の増殖のための重要な因子であることを示すものはなかった。
【０１７２】
実施例９
ＧＦＯＲ不活化は、プロセス関連条件下でキシロースからのエタノール産生を改善する
プロセス関連条件下でのグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ６５８およびＺＷ８００の発酵性能を、並行する様式で比較して、ＧＦＯＲ不活化が有益または有害な代謝エンジニアリングストラテジーであるかどうかを決定した。高濃度のグルコースおよびキシロースをこれらの実験において使用したため、ソルビトールを培地に添加して、ＺＷ８００の増殖を可能にした。ここに記載されていない実験では、ソルビトールがＺＷ６５８の停滞期をなくすことも発見した。それ故、増殖培地のソルビトール補充は、これらの２つの株をプロセス関連条件下で比較するための理想的な方法を提供する。
【０１７３】
酢酸塩の存在および非存在下、全糖類の２つの濃度を使用して、６つの異なる条件下でＺＷ６５８ならびにＺＷ８００を比較し、そしてより濃縮された糖混合物について、２つの異なる緩衝能を調べた。これらの実験は、３０℃で、５０ｍｌ試験管中、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させた２０ｍｌ培養物で行った。ｐＨは制御しなかったが、種培養物の播種の前に、増殖培地の初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。基本増殖培地は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトールならびに４ｇ／Ｌ（図１８および１９）のＫＨＣＯ３または８ｇ／Ｌ（図２０）のＫＨＣＯ３のいずれか一方を含有した。上記および下記の全ての値は、種培養物を添加した後の最終濃度である。ＫＨＣＯ３を使用して、増殖培地の緩衝能を増加し、細菌増殖中に通常生じるｐＨの低下を最小限にした。これらのすべての実験の炭素源は、全糖の異なる２つの濃度で前処置したコーンストーバ加水分解物におけるこれらの２つの糖類の比に近似するグルコースおよびキシロースの混合物であった。グルコースおよびキシロースの初期濃度は、それぞれ９２ｇ／Ｌおよび８２ｇ／Ｌ（図１８）または１０７ｇ／Ｌおよび９６ｇ／Ｌ（図１９および２０）のいずれか一方であった。表示される場合は、６ｇ／Ｌの酢酸塩（前処置したコーンストーバ加水分解物に存在するインヒビター）もまた存在した。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において３０℃で約５．０のＯＤ６００まで増殖させ、そして１／１０容積を使用して、実験培養物に播種した。多様な時間において、実施例６において先に記載のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして全ての値をｇ／Ｌで報告する。最初の時間ポイントを採取する前に、事実上全てのグルコースが消費されたため、この糖の値はグラフにプロットしなかった。
【０１７４】
図１８〜２０に示す実験から、次の２つの異なる基準によって判定される試験した全ての条件下で、ＺＷ８００がＺＷ６５８より優れた性能を呈することが明らかである：（ａ）実験経過中に消費されたキシロースの全量、および（ｂ）到達した最大エタノール力価。また、このデータから、ＧＦＯＲ不活化の有益な効果は、最もストレスの多い条件に遭遇する場合（即ち、すべてのグルコースが枯渇し、そしてエタノール濃度が毒性レベルに接近し始めた後）に、発酵の後期段階中に主として生じたことが明らかである。実際、２つの株の最も顕著な差異は、増殖培地中にさらなるストレスに寄与する阻害濃度の酢酸塩が存在した場合に観察された。３組の実験条件について酢酸塩の存在下におけるＺＷ８００のエタノール力価の平均の増加は、１０．２％であり、値の範囲は４．４％〜１３．７％である。ＺＷ８００はまた、３つのすべての実験において酢酸塩の非存在下でＺＷ６５８より多くのエタノールを産生したが、この場合の平均の増加は３．２％であった。予想したとおり、ＺＷ６５８は、有意な量のキシロースを、所望されない副産物キシリトールに変換し、そして条件が最もストレスの多いものである場合（即ち、発酵の後期段階中および酢酸塩が増殖培地に存在した場合）、最も高いレベルのこの化合物が観察された。例えば、図１８〜２０に示す酢酸塩による実験では、ＺＷ６５８は、全キシロースの８．１％、８．３％および９．９％を変換し、これは消費されて、キシリトールになった。対照的に、ＺＷ８００培養物では、試験したいずれの条件下においても、キシリトールは見出されなかった。これらの結果は、プロセス関連条件下、特に、阻害濃度の酢酸塩の存在下で、ＧＦＯＲ不活化が、エタノール産生のためのキシロース代謝に有益であることを明確に示す。図１８および１９に示す試験管での実験を２回実施し、そして事実上、同一の結果を得た。
【０１７５】
ｐＨ制御された発酵槽を使用して、酢酸塩を伴うグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００およびＺＷ６５８による別の並行実験を実施した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によって産生される有機酸および二酸化炭素のような代謝の副産物は、酢酸対酢酸塩の比を増加する増殖培地のｐＨを低下することができ、そしてプロトン化種が、細菌増殖を実際に阻害する化合物であることは公知である（キム（Ｋｉｍ）ら、（２０００年）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８４−８６：３５７−３７０）。それ故、５．８から５．０へのｐＨの低下により、酢酸の濃度が５倍増加するため、ｐＨ制御は大規模発酵において極めて重要である。
【０１７６】
ＺＷ８００およびＺＷ６５８の種培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において増殖させた；初期ｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。ＯＤ６００が約５．０に到達したら、種培養物の５０ｍｌアリコートを使用して、４５０ｍｌの増殖培地を含有する１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム・インク．（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）、米国ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））に接種した。最終的な５００ｍｌ培養物は、９２ｇ／Ｌグルコース、９７ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭソルビトールおよび７．２ｇ／Ｌの酢酸塩を含有した。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した；混合速度は１５０ｒｐｍであった。多様な時間において、実施例６に記載されている同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして細胞増殖（ＯＤ６００）もまた、モニターした。図２１は、ＺＷ８００培養物によって稼動させた発酵槽のこれらのパラメータについての全ての時間経過を示し、そして表４は、両方の株についてのキシロース、エタノールおよびキシリトールのエンドポイント値についてまとめている。
【０１７７】
【表５】
【０１７８】
酢酸塩による試験管の結果（図１８〜２０）と同様に、ｐＨ制御された発酵槽において、ＺＷ８００は、ＺＷ６５８より１４％多いキシロースを消費し、そして９．６％多いエタノールを作製した（図２１）。この株は検出可能なキシリトールを何ら産生しなかったため、ＺＷ８００のエタノール収率もまた、約５％高かった。対照的に、ＺＷ６５８の発酵ブロスにおけるキシリトールの最終濃度は３．９２ｇ／Ｌであったが、実験の過程中に消費された全キシロースの約６．５％を示す。これらの実験は、キシリトール形成をなくすことによって、ＧＦＯＲ不活化がキシロースからのエタノール産生を改善するさらなる証拠を提供する。既に示したように、所望されない副産物キシリトールは、少なくとも２つの異なる方法でキシロース代謝を妨害し、そして細菌増殖を阻害して、より低いレベルのＡＴＰを生じる。それ故、ＧＦＯＲがキシリトールを作製する場合、それは、リグノセルロース系供給原料からのエタノール産生中にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）が通常遭遇する他の全てのエネルギー消費ストレスに対処するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の能力を減少する。ＺＷ８００は、ＺＷ６５８とは対照的に、キシリトール関連ストレスに取り組む必要がないため、それは、より多くのキシロースを消費し、より多くのＡＴＰを産生し、そして最も高いレベルのストレスに遭遇する場合、発酵の後期段階中により多くのエタノールを作製する。
【０１７９】
実施例１０
ＺＷ８００からの選択マーカーの取り出し、および得られた株、ＺＷ８０１−４の特徴付け
Ｃｒｅ発現構築物、ｐＺＢ１８８−Ｋａｎ／Ｃｒｅの作製
実施例３に記載のように、ＺＷ８００におけるＧＦＯＲオープンリーディングフレームに挿入されたＳｐｅｃｒ−カセットは、２つの野生型ｌｏｘＰ部位の間に挟まれている。この配置は、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用することによって、染色体から選択マーカーを取り出すことを容易にしている（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４６７−４８６；リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、上掲；トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら（２０００年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４４（２）：１８５−１９３）。しかし、これを行うために、第１に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるＣｒｅ発現ベクター（図２２）を作製する必要があった。Ｃｒｅ発現ベクターの前駆体はｐＺＢ１８８／Ｋａｎであり、実施例４において詳述した。簡単に説明すると、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎは両方の細菌種の複製開始点を有するため、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるシャトルベクターである。それはまた、カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｋａｎｒ−カセット）を含有する。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重消化し、そして大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次の工程は、Ｃｒｅ−発現カセットを作製することであり、そしてプライマー１７および１８を使用するＰＣＲによって、これを達成した。Ｃｒｅ−発現カセットの増幅のために使用したＤＮＡテンプレートは、そのプロモーターを含むバクテリオファージＰＩ Ｃｒｅリコンビナーゼの完全長の遺伝子を含有するプラスミド（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら（１９８６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７（２）：１９７−２１２）であった。
プライマー１７（配列番号３５）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃａｔｇｇＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣ
プライマー１８（配列番号３６）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇｇｃｃｇｃＴＴＡＡＴＧＧＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣ
【０１８０】
プライマー１７（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｃｒｅ開始コドンから約２００ｂｐ上流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４５３配列のｎｔ２８６〜３０７にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｃｏＩ部位に対応する。プライマー１８（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｃｒｅオープンリーディングフレームの他方の末端で、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４５３配列のｎｔ１５２３〜１５０３に結合する一方、小文字は、このプライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位を示す。１２３８ｂｐのＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重消化し、そしてＣｒｅリコンビナーゼの完全なオープンリーディングフレームおよびその推定プロモーターを含有する、得られたＤＮＡフラグメント（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら、１９８６年、上掲）を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、Ｃｒｅ−発現カセットを、標準的な連結反応において上述したｐＺＢ１８８／Ｋａｎ ＤＮＡフラグメントのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。連結反応混合物のアリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートし、そして形質転換された細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをカナマイシン耐性形質転換体の１つから単離し、次いで、この調製物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）に導入して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の以後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得た（以降を参照のこと）。Ｃｒｅ発現ベクターｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅのプラスミド地図を図２２に示す。
【０１８１】
ＺＷ８００の染色体から選択マーカーを取り出すためのＣｒｅ処置およびＣｒｅ発現ベクターのキュアリング
バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）は、特定の３４ｂｐのＤＮＡ配列、８ｂｐの非対称コアにフランキングする２つの１３ｂｐの逆方向反復を含有する「ｌｏｘＰ部位」を認識することが可能である（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、１９８１年、上掲；リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、上掲；トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら、上掲）。Ｃｒｅはまた、２つの同一のｌｏｘＰ部位の間に配置される任意の介在ＤＮＡフラグメントを切り出すことが可能であり、そして切り出し反応は極めて迅速である。ＧＦＯＲオープンリーディングフレームからＳｐｅｃｒ−カセットを取り出すために、Ｃｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）をＺＷ８００に導入した。形質転換プロトコルは、本質的に実施例５に記載のとおりであったが、回収期間後、Ｃｒｅ発現ベクターの選択因子である３５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＭＭＧ培地上で、細胞をプレート化した。Ｃｒｅにより染色体から回収したＳｐｅｃｒ−カセットは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができないＤＮＡの環状片（ｃｉｒｃｌｕｌａｒ ｐｉｅｃｅ）であるため、このプロセスから回収した一次形質転換体は、スペクチノマイシンに対してもはや耐性ではなかった。３０℃、嫌気条件下で４８時間のインキュベーション期間後、Ｋａｎｒ／Ｓｐｅｃｓ一次形質転換体のうちの２つを、Ｃｒｅプラスミドキュアリングプロセスに供した。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるが、カナマイシンを含有しない培地で細胞を増殖させることによって、このプラスミドをキュアリングすることは比較的容易である。本発明においてＣｒｅ発現ベクターをキュアリングするために、細胞を、高温度（３７℃）で、カナマイシンを含有しない液体ＭＭＧ培地で増殖させた；細胞を、同じ組成を伴う新鮮増殖培地に、２４〜３６時間ごとに移した。少なくとも５０代が生じた後、単一のコロニーをＭＭＧプレート上で単離し、そして両方の本来の一次形質転換体由来の５個のコロニーを、さらなる特徴付けのために無作為に選択した。予想したとおり、これらのうち、カナマイシン（３５０μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧプレート上で増殖することが可能なコロニーは認められなかった。カナマイシン上で増殖することができないことは、プラスミドキュアリングプロセスが成功したことを良好に示すものであったが、この結果を、Ｃｒｅ−発現カセットにハイブリダイズするプライマーを使用するコロニーＰＣＲによって確認した。これらの実験に基づいて、Ｃｒｅ処置した、プラスミドがキュアリングされたＺＷ８００誘導体のうち３つを、さらなる特徴付けのために選択したが、これらの株を、以降、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−５およびＺＷ８０１−６と称する。
【０１８２】
これらの株が、阻害濃度の酢酸塩の存在下で、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物においてどの程度良好に作動するかを調べるために、振盪フラスコ実験を実施した。この分析には、ＺＷ６５８およびＺＷ８００も含めた。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において３０℃で約３．０のＯＤ６００まで増殖させ、そして１５ｍｌ実験培養のために１０％播種物を使用した。後者を、５０ｍｌ試験管において、３０℃で、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させた。増殖培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトール、４０ｍＭのＫＨＣＯ３、９５ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、および７．７ｇ／Ｌ酢酸塩を含有した；初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。多様な時間において、実施例６において先に記載のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、培養物のアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして全ての値をｇ／Ｌで報告する。
【０１８３】
表５に示すように、ＺＷ６５８は、６６．３５ｇ／Ｌのエタノールを産生し、そして後に４０．６ｇ／Ｌの残留キシロースを残した。また、ＺＷ６５８は機能性ＧＦＯＲ酵素を有したため、それは、３．１９ｇ／Ｌの所望されない副産物キシリトールを産生した。他の並行実験において先に観察されたものと同様に、ＺＷ８００は、ＺＷ６５８より１７％多いキシロースを消費し、そして６．２％多いエタノールを産生し、そしてそれは、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６では僅かに良好な結果が得られたが、これらの差異は、おそらく実験誤差の範囲内であり、そして統計的に有意ではない。この実験で観察されたＺＷ８０１−５の性能がそれほど良好ではなかったことについては、解明されていないが、それ以上調べなかった。これらの結果に基づいて、さらなる分析のために、株ＺＷ８０１−４を選択した。
【０１８４】
【表６】
【０１８５】
ＺＷ８０１−４が少なくともＺＷ８００と同様に作動したことを示唆した振盪フラスコ実験の結果を確認するために、これらの２つの株を、ｐＨ制御条件下で比較した。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する培地において、３０℃で増殖させた。ＯＤ６００が約４．６に到達したら、種培養物の１７ｍｌアリコートを使用して、１５３ｍｌの増殖培地を含有するｐＨ制御バイオリアクターに播種した。最終的な１７０ｍｌ培養物は、１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトールおよび７．２ｇ／Ｌの酢酸塩を含有した。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した；混合速度は約１５０ｒｐｍであった。多様な時間において、上記のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、バイオリアクターから培養物のアリコートを取り出し、そしてまた、ＯＤ６００もモニターした。これらの実験条件下では、ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の増殖曲線は、ほとんど重ね合わせることができた（図２３Ａ）。グルコースおよびキシロース消費の時間経過はまた、事実上同一であり、そして両方の株は、同様の動態で同じ量のエタノールを産生した（図２３Ｂ）。さらに加えて、これらの株のいずれも、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。これらの観察に基づいて、本発明者らは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームからＳｐｅｃｒ−カセットを取り出しても、ＧＦＯＲ酵素活性が回復または部分的に回復しなかったこと、およびこの操作は発酵性能に有害な影響を及ぼさなかったことを結論付けている。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４は両方とも機能性ＧＦＯＲ酵素を有する親株（ＺＷ６５８）より良好に作動したが、ＺＷ８０１−４は抗生物質に対する耐性を付与する外来遺伝子を含有しないため、商業的アプリケーションに好適な株は、ＺＷ８０１−４である。ＺＷ８０１−４由来のゲノムＤＮＡの配列解析は、正確なＣｒｅ切り出し事象が実際に生じた明白な証拠を提供した。ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲオープンリーディングの完全なヌクレオチド配列（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）を配列番号３７に示し、そして図２４は、翻訳された変異体配列と野生型ＧＦＯＲタンパク質とのアラインメントを示し；後者は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のｎｔ６８３７５１〜６８５０５２の逆相補鎖によってコードされる。予想したとおり、Ｓｐｅｃｒ−カセットのＣｒｅ切り出しは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型ｌｏｘＰ部位を残し、そしてこの挿入事象は、タンパク質を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じた；「ｌｏｘ ｓｃａｒ」の局在を、灰色で強調された残基によって示す。自殺構築物の設計の結果として、変異体ヌクレオチド配列もまた、同じ場所で生来の野生型ＧＦＯＲヌクレオチド配列のうち約７２ｂｐを失っている。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（すべての目的のために、その全体が本明細書の一部として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子の遺伝子改変を伴うキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を開発した。この株は、発酵およびエタノール産生中の、キシロース代謝の有害な副産物であるキシリトールの減産を示す。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料に代わるエネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グルコース、フルクトース、およびスクロース上で増殖する細菌性エタノロジェンであり、これらの糖を、エントナー−ドウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路を介してＣＯ２およびエタノールに代謝する。野生型株は、キシロースを炭素源として使用することができないが、この糖上で増殖することが可能なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組み換え株が操作されている（特許文献１、２、３、非特許文献１、２）。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース系材料における主要なペントースであり、従って、発酵に使用される多量の利用可能な低コストの炭素基質を提供することができる。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）が、キシロース代謝に必要な４つの酵素：１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼの発現のために操作されている（特許文献１、４、非特許文献２）。これらの４つの酵素の組み合わされた反応および細胞の通常の代謝機構を介して、３分子のキシロースが、２分子のグルコース６−リン酸および１分子のグリセルアルデヒド３−リン酸に変換され、続いて、これらは、経路のグルコース側においてエタノールおよびＣＯ２に変換される（図１を参照のこと）。
【０００５】
キシロース代謝を対象にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作することに成功はしているが、この株は、キシロース上では、グルコースほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。キシロース上で増殖が乏しくなる原因の１つは、キシリトールがキシロース代謝の副産物として産生されることである（非特許文献１、３）。キシリトールは、キシルロースキナーゼによってリン酸化されて、キシリトール５−リン酸を産生し、これは細胞に蓄積し、そして細菌の増殖を阻害する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株はキシリトールをエタノールに変換することができないため、キシリトール合成はまた、エタノールの収率を減少する。さらに、キシリトールは、操作されたキシロース代謝経路におけるキシロース資化の第１段階を触媒するキシロースイソメラーゼの強力なインヒビターである（非特許文献４）。キシリトールの合成および効果を示す図については、図２を参照のこと。
【０００６】
インビボでのキシリトール合成を担う生理学的経路および酵素は決定されていない。しかし、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）由来の無細胞抽出物は、それらをＮＡＤＰＨで補充する場合、キシロースをキシリトールに還元することが可能であること（非特許文献１）、およびこの反応は、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼによって触媒されることが実証されている。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物は、ＮＡＤＰＨ補充を伴わなくても少量のキシロースをキシリトールに変換することが可能であること、および精製されたキシロースイソメラーゼがさらに反応混合物に添加される場合、これらの条件下でのキシリトール産生は、３〜４倍に増加すること（非特許文献５）もまた、示されている。キシロースイソメラーゼはキシロースをキシルロースに変換することが可能であるため、後者の実験は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）が、キシロースを電子供与体として、およびキシルロースを電子受容体として使用して、キシリトールを生じさせることができることを明確に示唆しており、これについて以下に詳細に考察する。それ故、インビトロ実験に基づけば、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において、キシリトール産生のための少なくとも２つの経路が存在するが、しかし、それらが生理学的条件下でキシリトール形成に寄与する程度は未だ決定されていない。
【０００７】
エタノールの高レベル産生では、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、浸透圧ショックを生じ得る高濃度の発酵可能な炭素源において増殖させる。浸透圧ショックは、＞２００ｇ／Ｌのグルコースもしくはフルクトースまたは＞３６０ｇ／Ｌのスクロースを含有する液体培地に野生型株を移す場合の増殖開始前の長い停滞期間として出現する（非特許文献６）。さらに加えて、ソルビトールを増殖培地に添加すると、野生型株を高濃度のこれらの糖に移す場合の停滞期間が減少する（非特許文献７、非特許文献６）。
【０００８】
ペリプラズム酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）は、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をグルコースおよびフルクトースの濃縮混合物（非特許文献６）またはスクロースの濃縮液（−，非特許文献７、非特許文献６）において増殖させる場合の浸透圧バランスにおいて重要な役割を果たすこともまた、示されている。簡単に説明すると、ＧＦＯＲは、緊密に結合したそれの補因子を伴って、図Ｉに示すような古典的ピンポンＢｉ機構で、グルコースからグルコノラクトンへの酸化、およびそれ以後のフルクトースからソルビトールへの還元を触媒する。ペリプラズム空間に生じるソルビトールは、濃度勾配に対して細胞に輸送され、ここで、それは、さらに代謝されないため、高レベルで蓄積する。細胞内における高濃度のソルビトールは、形質膜を横切る浸透圧差をなくし、そして浸透圧バランスを回復する。
【０００９】
ソルビトールを生じることができない野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の自然突然変異体は、それを低濃度のスクロース（＜１５０ｇ／Ｌ）上で増殖させた場合、野生型細胞より高いレベルのエタノールを産生することが示されたが、この株は、高濃度のスクロース上で増殖することができなかった（非特許文献８）。この変異体は、その後、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）の発現を欠くことが示されたが、これは、スクロースから誘導されるフルクトースを、所望されない副産物のソルビトールに変換することができないことを説明する（非特許文献７）。高濃度のスクロースにおけるソルビトール欠損変異体の増殖は、ソルビトールを増殖培地に添加することによって回復され得ることによっても示された（非特許文献７）。それ故、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、グルコースおよびフルクトースの濃縮混合物か、または宿主細胞のインベルターゼによってグルコースおよびフルクトースに加水分解される高濃度のスクロースにおいて増殖させる場合、ＧＦＯＲは、ソルビトールを合成することによって、浸透圧バランスにおいて極めて重要な役割を果たす。
【数１】
【００１０】
特許文献５は、不活化されたＧＦＯＲ遺伝子を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の非キシロース資化性変異株、およびこの株を使用するエタノールの産生について開示している。グルコース、フルクトースまたはスクロースが炭素源であった場合、この株によるソルビトール産生の欠如は、より高いレベルのエタノールを生じた。
【００１１】
キシロースおよびグルコースの混合物上で（添加されるスクロースもしくはフルクトースの非存在下で）増殖するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の操作されたキシロース資化株においてグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ酵素活性を減少させるかまたはなくすことの効果については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５７１２１３３号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、
【特許文献４】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献５】中国特許公開第１６００８５０（Ａ）号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９２年、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら、（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３
【非特許文献３】Ｋｉｍら、（２０００年）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６６：１８６−１９３
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２７７：２５５−２６１
【非特許文献５】Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ、２００１年，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｍａｓｔｅｒｓ Ｔｈｅｓｉｓ
【非特許文献６】Ｌｏｏｓら、（１９９４年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７６：７６８８−７６９３
【非特許文献７】Ｗｉｅｇｅｒｔら、（１９９６年）Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１６６：３２−４１
【非特許文献８】ＫｉｒｋおよびＤｏｅｌｌｅ、（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１５：９８５−９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
キシロース含有培地上で増殖させる場合、増加した量のエタノールを産生することが可能なキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の必要性が依然としてある。本出願人らは、インビボでのキシリトール産生の主経路を決定し、そして遺伝子不活化を介してキシリトールの形成を担う酵素活性をなくし、それによって、改善されたエタノール産生を伴うＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を作製することによって、この課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、キシロースの存在下で増殖させる場合、キシリトールの減産およびエタノールの増産を有するザイモモナスザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株に関する。本出願人らは、キシロースを代謝するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール産生は、酵素グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）によって優先的に仲介されることを発見した。ＧＦＯＲを発現しない遺伝子改変された株（ＧＦＯＲノックアウト変異体など）を構築し、そしてキシロース含有糖混合物上で増殖させる場合、低減した量のキシリトールを産生することを見出した。ＧＦＯＲノックアウト変異体はまた、ソルビトールの存在下で高度の糖混合物において増殖させた場合、ＧＦＯＲを発現する親株よりキシロースを消費し、そしてより高濃度のエタノールを産生した。さらに、エタノール収率（消費される糖１グラムあたりの産生されるエタノールの量）についても、ＧＦＯＲノックアウト株の方が有意に高かった。
【００１６】
従って、本発明は、炭水化物培地中での発酵により、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属の組み換え微生物を提供し、前記微生物は、より低いグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ酵素活性を生じる少なくとも１つの遺伝子改変を含んでなる。本発明は、ＧＦＯＲ遺伝子への遺伝子改変の結果として、低減したＧＦＯＲ活性を示す、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を含む。ＧＦＯＲ活性のいずれの減少も本発明の範囲内にあり、ＧＦＯＲ活性の遺伝子を完全に不活化する、および／またはＧＦＯＲ酵素活性を完全にノックアウトする変異を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、低減したＧＦＯＲ活性を伴うザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作製するための方法であって：
ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する工程と；
ｂ）（ａ）の組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、前記改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少する工程と
を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
図面の簡単な説明、生物学的寄託および配列表の説明
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】キシロース資化のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を操作するために使用されている４つの酵素（枠内）およびキシロースを使用するエタノール産生の生化学的経路の図を示す。
【図２】操作されたキシロース経路（枠内）の最初の２段階、キシリトール合成、キシリトール５−リン酸形成（デッドエンド毒性中間産物）、およびキシリトールによるキシロースイソメラーゼの阻害の図を示す。
【図３】トランスケトラーゼ（Ａ）、トランスアルドラーゼ（Ｂ）、キシロースイソメラーゼ（Ｃ）、およびキシルロキナーゼ（ｘｙｕｌｏｋｉｎａｓｅ）（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図４】ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍのプラスミド地図を示す。
【図５】ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍのプラスミド地図を示す。
【図６】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図７】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ｔｒａｎｓａｌｄｏｌｓｅ）（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性（ａｃｔｉｖａｔｉｅｓ）のグラフを示す。
【図８】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図９】５％グルコースを伴うＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）において５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを伴うＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図１０】ＲＭ＋１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）（Ａ、Ｂ）およびＲＭ＋８％キシロース（ＲＭＸ８％）（Ｃ、Ｄ）における選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースまたはキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図１１】ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースにおいて、酢酸塩を伴わない（Ａ、Ｂ）または０．６％酢酸塩を伴う（Ｃ、Ｄ）選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図１２】ＧＦＯＲ遺伝子の挿入不活化のための自殺構築物の構築中に作製されるプラスミド、および最終産物：ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷの地図を示す。
【図１３】キシロースイソメラーゼ発現プラスミドの構築のために作製されるプラスミド：ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡの地図、およびこの構築物に使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（枠内）の図を示す。
【図１４】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴うおよび伴わない、キシロースイソメラーゼ発現の存在および非存在下でのＺＷ１株によるキシリトールおよびキシルロース産生のグラフを示す。
【図１５】９７ｇ／Ｌ全キシロース＋グルコース上で増殖させた、ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う（Ａ）および伴わない（Ｂ）キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生のグラフを示す。
【図１６】１８８ｇ／Ｌ全キシロース＋グルコース上で増殖させた、ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う（Ａ）および伴わない（Ｂ）キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生のグラフを示す。
【図１７】異なる濃度のソルビトールの存在下におけるＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴うキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖のグラフを示す。
【図１８】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、１７４ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１９】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、２０３ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図２０】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴わない（Ａ、Ｃ）および伴う（Ｂ、Ｄ）、酢酸塩の非存在（Ａ、Ｂ）および存在（Ｃ、Ｄ）下、２０３ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコースにおいて、緩衝能の増加のためのさらなる炭酸水素カリウムを伴う、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロース資化、エタノール産生、およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図２１】ＧＦＯＲ遺伝子不活化を伴う、酢酸塩の存在下、１８９ｇ／Ｌの全キシロース＋グルコース、ｐＨ制御発酵稼動におけるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のキシロースおよびグルコース資化、エタノール産生、ならびにキシリトール産生のグラフを示す。
【図２２】ｐＺＢ１８８／ＫａｎおよびｐＺＢ１８８／ｋａｎ−Ｃｒｅ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるＣｒｅ発現ベクターのプラスミド地図を示す。
【図２３】Ａは、高グルコース＋キシロースにおける、酢酸塩を伴う、ｐＨ制御条件下のＺＷ８０１−４およびＺＷ８００の増殖の比較を示し、Ｂは、ＺＷ８０１−４のグルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生をＺＷ８００と比較したグラフを示す。
【図２４】ＺＷ８０１−４における翻訳された変異体配列と、野生型ＧＦＯＲタンパク質とのアラインメントを示す。
【００２０】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００２１】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００２２】
配列表は、コンパクトディスクによって提供される。配列表を含むコンパクトディスクの内容は、米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項に応従して、参照により本明細書に援用される。コンパクトディスクは、２枚提出され、これらは相互に同一である。ディスクには、「Ｃｏｐｙ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」および「Ｃｏｐｙ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ」のラベルが付されている。ディスクは、次のファイル：「ＣＬ３６０４ｓｅｑ ｌｉｓｔ．ＳＴ２５」を含有する。
【００２３】
配列番号１および２は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３および４は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号５および６は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号７および８は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号９は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１０および１１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１２は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１３および１４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１５および１６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．３ｋｂのｘｙｌＢ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１７および１８は、遺伝子の３’末端の部分、ｌｄｈ遺伝子、およびａｄｈｌ遺伝子の５’末端の部分を含有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｗ１ゲノムＤＮＡ由来の２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１９および２０は、ｐＡＣＹＣ１８４由来のテトラサイクリン耐性カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号２１および２２は、ｌｏｘＰ部位を作製するために使用されるオリゴヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２３および２４は、ｌｏｘＰ部位を作製するために使用されるオリゴヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号２５および２６は、ｐＨＰ１５５７８由来のＳｐｅｃｒ−カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２７および２８は、ＺＷ１ゲノムＤＮＡ由来の３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２９および３０は、ＺＷ１ゲノムＤＮＡ由来の５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号３１は、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号３２および３３は、ｐＥＴ−２４ａ由来のＫａｎｒ−カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号３４は、ｐＺＢ４から誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ発現カセットのヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号３５および３６は、Ｃｒｅ−発現カセットの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号３７は、ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲコーディング領域（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）の完全なヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号３８は、野生型ＧＦＯＲコーディング領域（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）の完全なヌクレオチド配列である。
【００４５】
本出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州２０１１０−２２０９において、以下の生物学的寄託を行った：
【００４６】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、内因性グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）遺伝子の改変によってさらに操作されるキシロース資化性組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株、および改変されたＧＦＯＲザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作製するための方法について説明する。本明細書に記載の方法は、ＧＦＯＲ酵素活性をなくすかまたは減少し、その結果、キシロース代謝中のキシリトール産生の低減およびエタノール産生の増強を生じる任意の遺伝子改変を含む。一般的に、低減したＧＦＯＲ酵素活性を伴う改変されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、発酵からエタノールを産生させるプロセスにおいて使用してもよい。新規のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によって産生されるエタノールは、化石燃料に対する代替エネルギー源として使用してもよい。
【００４８】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００４９】
「グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ」は、ＧＦＯＲと略称する。
【００５０】
ＲＭはリッチ培地である。
【００５１】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋５％グルコースである。
【００５２】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋１０％グルコースである。
【００５３】
ＲＭＸ８％はＲＭ＋８％キシロースである。
【００５４】
ＲＭＸ２％はＲＭ＋２％キシロースである。
【００５５】
ＲＭＸ５％はＲＭ＋５％キシロースである。
【００５６】
ＲＭＧＸ１０％８％は、ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースである。
【００５７】
ＲＭＧＸ５％８％は、ＲＭ＋５％グルコースおよび８％キシロースである。
【００５８】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００５９】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００６０】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含んでなり得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００６１】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６２】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００６３】
本明細書において使用する用語「非機能性遺伝子」は、コードされるタンパク質を、遺伝子が内因性である野生型株において通常発現されるようには発現しない遺伝子を指す。非機能性遺伝子の発現は、転写、ＲＮＡプロセシング、または翻訳のような任意のレベルで破壊され得る。非機能性遺伝子では、典型的に、コードされるタンパク質の発現がほとんど認められないか、または全く認められない。しかし、それはまた、野生型タンパク質より低い酵素活性を有する改変されたタンパク質をコードし得る。
【００６４】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００６５】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組み換えられている。
【００６６】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００６７】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００６８】
用語「実質的になくされた」キシリトール産生および「実質的に認められない」副産物キシリトールは、典型的な実験分析を使用して検出されるキシリトールの量が０に近いか、またはほぼ０である場合を指す。
【００６９】
用語「高濃度の混合糖類」は、ＧＦＯＲ変異体キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖の阻害を生じる培地中の全糖濃度を指す。正確な濃度は、培地中の他の成分に依存して変動し得るが、これは、典型的に、約１００ｇ／Ｌより大きい。
【００７０】
用語「発酵可能な糖」は、発酵プロセスにおいて、微生物により炭素源として使用することができるオリゴ糖および単糖類を指す。
【００７１】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料もまた、ヘミセルロースを含んでなり得る。
【００７２】
用語「セルロース系」は、セルロース、およびヘミセルロースを含むさらなる成分を含んでなる組成物を指す。
【００７３】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵可能な糖類の生成を指す。
【００７４】
用語「前処置されたバイオマス」は、糖化前の前処置に供されているバイオマスを意味する。
【００７５】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、そしてセルロースを含んでなり、そして場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質のようなさらなる成分を含んでなり得る。バイオマスは、単一の供給源から誘導されてもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源から誘導される混合物を含んでなり得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバの混合物、または草および葉の混合物を含んでなり得る。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、穀物残渣、例えば、トウモロコシ皮、コーンストーバ、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、乾草、イネわら、スイッチグラス、廃紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および潅木の粉砕から得られる成分、野菜、果物、花および動物性肥料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生じる産物を指す。バイオマスはまた、糖化の前に前処置してもよい。
【００７７】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８４年ならびにグリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版されたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより記載されている。
【００７８】
本発明は、増強されたエタノール産生を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の操作された株に関する。キシロース資化性Ｚモビリス（Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓ）によってエタノール産生を改善するための課題は、（ａ）付加価値のない炭素貯蔵を呈し；（ｂ）キシロース資化の第１段階を阻害し；そして（ｃ）細菌増殖を阻害するデッドエンドの毒性中間産物にリン酸化されるキシリトールの合成を減少させるかまたはなくすことである。本出願人らは、内因性酵素ＧＦＯＲがインビボでのキシリトール合成を主に担うことおよびＧＦＯＲ酵素活性を減少させるかまたはなくすことによって、キシロースからのエタノール産生（速度、収率および力価）が改善されることを発見した。
【００７９】
キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主株
キシロースを炭素源として資化することが可能であるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の任意の株を、本発明の株を調製するための宿主として使用してもよい。エタノールへのキシロースの発酵のために操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株が特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の部分を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性を伴うタンパク質を提供するための任意の既知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内因性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路を作製するときに他の誘導された酵素活性を補い得る。典型的に、米国特許第５５１４５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、キシロース代謝（図１）に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺモビリス（Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入されている。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の２つの酵素は、キシルロース５−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路にペントース代謝を結合する中間体に変換する。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。コーディング領域の供給源として、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコーディング領域が特に有用である。
【００８０】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において発現されるプロモーターに作動可能に連結される。コーディング領域は、プロモーターから個々に発現されてもよく、または２つ以上のコーディング領域が、同じプロモーターからの発現を伴う１つのオペロン内で接続されていてもよい。得られるキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に導入し、そしてプラスミド上で維持してもよく、または例えば、相同組み換え、部位特異的組込み、もしくはランダム組込みを使用して、ゲノムに組込んでもよい。特に有用なキシロース資化株として、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書；モハゲギ（Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ）ら、（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（本明細書において記載されている；ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８で寄託されている）が挙げられる。
【００８１】
また、天然の物質ではないキシロースのような他の糖類を資化するためにさらに操作されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、本方法に使用してもよい。例としては、米国特許第５８４３７６０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のようなアラビノース資化のために操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株がある。
【００８２】
ＧＦＯＲによるキシリトール合成の発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化株による所望されない副産物キシリトールの合成は、エタノールの回収率を減少し、そして細菌増殖を阻害する毒性化合物であるキシリトール５−リン酸の形成を生じる（図２を参照のこと）。さらに、キシリトールは、キシロースイソメラーゼ、キシロース資化のために操作された経路における第１の酵素の強力なインヒビターであり、そしてその合成は、細胞がキシロースを代謝する能力を減少する。インビトロ実験は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール形成のための少なくとも２つの経路が存在することを確立している（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲、ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）ら、上掲）が、本出願人らは、生理学的に産生されるキシリトールの大部分がＧＦＯＲ酵素活性の結果であることを発見している。本明細書に記載されるとおり、ここで、キシロース含有培地上で増殖するキシロースを資化することができるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（または野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシルロース合成誘導体）によって合成されるキシリトールの量は、ＧＦＯＲ酵素活性の非存在下で顕著に減少することが見出されている。本出願人らはまた、キシロースからキシルロースへの変換が、インビボでのＧＦＯＲ仲介キシリトール産生の必須条件であること、およびこの反応は、キシロースイソメラーゼを発現するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株のみにおいて生じ得ることを見出している。それ故、キシロース上で増殖するように操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株におけるキシリトールの主な生理学的供給源は、図ＩＩおよびＩＩＩに依存する反応のうちの１つまたは両方を介してＧＦＯＲによって合成されることが提唱される。
【数２】
【数３】
【００８３】
両方のスキームにおいて、キシルロースは、ＧＦＯＲに不可欠な電子受容体としての役割を果たすこと、およびソルビトール産生を生じるフルクトースとの既知の反応（図Ｉ）とは対照的に、この化合物はキシリトールに還元されることに留意すること。ＧＦＯＲは、グルコースおよびフルクトースにかなり特異的であるが、それは、不十分ではあるものの、他の糖類を電子供与体および電子受容体として使用することができることが示されている（ザカライオウ（Ｚａｃｈａｒｉｏｕ）およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９８６年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６７：８６３−８６９）。それ故、キシロースおよびフルクトースを精製されたタンパク質と共にインキュベートした場合、ソルビトール産生が観察されたが、しかし、グルコースとのコントロール反応と比較して、ＧＦＯＲ酵素活性が約１２倍減少した。同論文において、キシルロースが、フルクトースの代わりに電子受容体として作用することができること、およびこの反応は、図ＩＩＩに示すキシリトールを生じることが示された。しかし、このような基質の組み合わせにより、ＧＦＯＲ酵素活性が約１４倍減少した。これらの観察に加えて、精製されたキシロースイソメラーゼを反応混合物に添加して、キシルロースの供給源を提供する場合、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）から調製される無細胞抽出物は、キシロースからキシリトールを生じることが可能であることも示されており（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）、それ故、ＧＦＯＲは、図ＩＩに示される反応を触媒することができることが実証される。しかし、これらのＧＦＯＲ仲介反応が生細胞において生じるかどうかについて、およびもしそうである場合、それらはどの程度キシリトール形成にインビボで寄与するかについては、本出願人らの発見前まで決定されていなかった。同じ不確定要素が、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物にも存在し、キシロースからキシリトールへ直接変換することが可能であるＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼ活性にも認められた（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）。実際、プロセス関連条件下において、インビボは言うまでもなく、インビトロでのキシリトール形成に対するＧＦＯＲおよびＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼの相対的寄与について、何らかの見識を提供する上記の無細胞抽出物による実験は行われなかった。それ故、ＧＦＯＲが、原則として、生理学的条件下、キシロース含有培地において、キシロース上で増殖するように操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株におけるキシリトール産生を担うという本出願人らの所見は、意外であり、先行技術から予想することはできなかった。
【００８４】
ＧＦＯＲ遺伝子発現の変更
本発明のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、キシリトール合成が減少するほどに、ＧＦＯＲをコードする遺伝子の発現が減少しているかまたは認められないように操作される。機能性酵素の存在を減少するための当業者に既知の任意の遺伝子改変を使用して、ＧＦＯＲ発現を改変してもよい。方法として、ＧＦＯＲをコードする遺伝子全体または遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないかまたはより低いレベルで発現されるように（プロモーターもしくはコーディング領域のいずれかにおいて）ＧＦＯＲ遺伝子にＤＮＡフラグメントを挿入すること、ＧＦＯＲコーディング領域に変異を導入して、機能性タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを付加すること、およびＧＦＯＲコーディング領域に１つ以上の変異を導入して、非機能性であるかまたはそれほど活性ではないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってＧＦＯＲ発現を阻止してもよく、そして共抑制を生じる構築物を挿入してもよい。これらの方法のすべては、ＧＦＯＲ酵素をコードする既知の配列（配列番号３８）を利用する当業者によって容易に実践することができる。ＧＦＯＲコード配列の周囲のＤＮＡ配列はまた、いくつかの改変手順において有用であり、そして完全なゲノム配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２）の形でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に利用可能である。
【００８５】
本明細書の実施例３および５において例示されるように、遺伝子改変されたＧＦＯＲ株を作製するための特に適切な方法は、スペクチノマイシン耐性遺伝子または他の選択マーカーに結合するＧＦＯＲフランキングＤＮＡ配列によって仲介される相同組み換えを使用して、機能性ＧＦＯＲ酵素が発現されないようなＧＦＯＲコーディング領域への選択マーカーの挿入をもたらすことである。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子をＧＦＯＲ遺伝子から切り出すが、後者の活性化は伴わないように、選択マーカーを部位特異的組み換え部位に結合させてもよい。部位特異的組み換えは、後に組み換え部位を残し、これがＧＦＯＲ酵素の発現を破壊する。相同組み換えベクターを構築して、選択マーカーの切り出し後にＧＦＯＲ遺伝子に欠失部を残してもよく、これは当業者に周知である。
【００８６】
ＧＦＯＲの発現を完全になくすことが好ましいが、しかし、顕著に減少したＧＦＯＲの発現もまた、本発明の実施形態である。この場合、非機能性ＧＦＯＲ遺伝子とは、通常より低いレベルのＧＦＯＲ酵素が存在するように、通常の様式では機能しないことを指す。遺伝子不活化のいくつかの方法は、共抑制のようないくらか低いレベルで保持されている発現を生じ得る。本明細書において、改変されたＧＦＯＲ株は、ＧＦＯＲ酵素活性が減少しているかまたは認められない遺伝子改変された株を指す。
【００８７】
ＧＦＯＲ改変株の増殖およびエタノール産生
本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、キシロースを含有する培地において、他の糖類（「混合糖類」）の非存在または存在下で増殖させる。混合糖類は、キシロースに加えて少なくとも１つの糖を含む。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から生成される糖類上でＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願第６０／６７０４３７号明細書に記載のように、前処置され、次いで、リンド，Ｌ．Ｒ．（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７）によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。キシロースおよびグルコースを含む混合糖類組成物が好ましく、ここで、さらなる糖類が存在してもよい。
【００８８】
多様な糖類の割合は、混合物において変動し得、キシロースでは、典型的に、糖類の全量の少なくとも約１０％である。好ましくは、キシロースは約４０％〜約６０％の間である。フルクトースは、サトウキビバガスのようないくつかのバイオマスの糖化によって生成される糖類に存在し、そしてキシロースが糖混合物の少なくとも約１０％を保持するように、キシロースまたはグルコースの一部をフルクトースに置き換えてもよい。さらに、アラビノースは、ヘミセルロースから誘導され、それ故、ヘミセルロースを含有する糖化バイオマスから誘導される混合糖類の典型的な成分である。
【００８９】
ＧＦＯＲ改変株ではないキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ではキシリトールが産生されない発酵条件下で、本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は増殖し、そして非ＧＦＯＲ改変株に匹敵するほどエタノールを産生する。例えば、５：４のグルコース対キシロース比を伴う約１００ｇ／Ｌ混合糖のような低糖培地において、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、非ＧＦＯＲ改変株と同様に作動する。
【００９０】
最大限のエタノール産生および発酵効率のために、キシロースを含む高レベルの糖類を含有する培地において、キシロース資化性エタノロジェンを増殖させることが望ましい。混合糖類は、本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖のための培地において高濃度で使用され得る。これは、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用を可能にし、それによって、商業的規模のエタノール産生に所望される発酵容積が縮小される。より大きな濃度のエタノールが産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地における混合糖類濃度は、典型的に、少なくとも約１２０ｇ／Ｌおよび約３００ｇ／Ｌまでである。約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間にある高濃度の混合糖類が特に有用である。
【００９１】
エタノールの産生に所望される高濃度混合糖類条件において、ソルビトールは、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の発酵培地に含まれる。本出願人らは、意外にも、ソルビトールを高混合糖類培地に添加すると、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の良好な増殖を可能にしたが、ソルビトールが含まれていなければ、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、ほとんどまたは増殖しなかったことを見出した。このことは、１２〜３６時間の停滞期間後にソルビトール添加を伴わずに濃縮糖混合物に順応することが可能であるＧＦＯＲ産生株とは極めて対照的である。フルクトースまたは（フルクトースの供給源としての）スクロースを欠く培地において、ＧＦＯＲがソルビトールを合成するか、または浸透圧適応において役割を果たすことは予想されなかった。増殖培地にフルクトースが存在しなければ、図Ｉに示されるソルビトール合成のためのＧＦＯＲの既知の反応は、進行し得ない。通常のＧＦＯＲ酵素活性を伴うキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、長い停滞期間を伴うものの、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物において増殖することが可能であることから、フルクトースを伴わなければ、ＧＦＯＲがソルビトールを合成しないことが予想されるため、ＧＦＯＲによるソルビトール合成が浸透圧適応に必要でないことが示唆された。それ故、ＧＦＯＲ酵素活性をなくすことが、フルクトースを欠く増殖培地においてソルビトール産生のレベルに対して効果を有することは予想しておらず、そしてグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖にソルビトールが必要であることも、全く予想外であった。
【００９２】
ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、約２ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度で培地に存在し得る。培地におけるより適切な最終濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度であり、５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度が好ましい。マンニトールを、ソルビトールの代わりに、またはソルビトールとの組み合わせで、培地において使用してもよい。マンニトールは、共有および同時係属中の米国仮特許出願第６０／８４７９９７号明細書（参照により本明細書に援用される）におけるソルビトールに類似の効果を有することが分かった。さらに、ガラクチトールおよび／またはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせて使用することができることが分かった。ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの組み合わせは、すべて、ソルビトールについて記載の濃度と同じ濃度で使用される。
【００９３】
酢酸塩のようなインヒビターの存在または非存在下における高度の糖培地におけるような、ＧＦＯＲ改変株ではないキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によってキシリトールが産生される発酵条件下では、本発明のＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、非ＧＦＯＲ改変株より優れている。本出願人らは、消費されるキシロースの全量および最終的なエタノール力価の両方について、ＧＦＯＲ改変株の方が非改変株より大きいことを見出した。さらに加えて、プロセス関連条件下では、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）による発酵においてキシリトールは産生されないが、本明細書の実施例６において示されるように、所定の環境下では、非ＧＦＯＲ機構によって少量が合成され得る。
【００９４】
キシロース資化およびエタノール産生における改善は、異なる発酵条件下で変動する。ＧＦＯＲ非改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によって高レベルのキシリトールが産生される条件下では、キシリトール合成を欠如させると、ＧＦＯＲ変異の効果がさらに大きくなる。例えば、酢酸塩のようなインヒビターが培地に存在する場合、より多量のキシリトールがＧＦＯＲ非改変株によって産生される。このキシリトール産生は、ＧＦＯＲ変異によって完全になくされ、ＧＦＯＲ変異を伴わずに少量のキシリトールが産生される条件におけるよりも、キシロース資化およびエタノール産生が増加することを可能にする。酢酸塩は、典型的に、処置されたセルロース系バイオマスに存在するため、処置されたセルロース系バイオマスから誘導される炭素源上において増殖させようとするエタノロジェンでは、酢酸塩に対して低減した感受性が所望される。それ故、発酵においてバイオマス加水分解物を使用する場合、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を使用する発酵が特に有益である。
【００９５】
エタノール産生のための発酵
エタノールの産生のため、組み換えＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロースを含む混合糖類を含有する培地と接触させる。増殖が阻害されるほど混合糖類の濃度が高い場合、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでいる。ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに使用するか、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間行うが、３０時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の間の温度、約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。
【００９６】
ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において増殖させることができる。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって、産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な対数期を通過して高増殖対数期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００９７】
標準的なバッチ系の１つの変形例は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、ＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ２のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該技術分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、およびブロック（Ｂｒｏｃｋ）、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、またはデスパンデ，ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７（１９９２年）（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００９８】
エタノールの商業的産生はまた、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【００９９】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【０１００】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望されるＧＦＯＲ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）において増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ６００が３〜６の間になるまで、種培養物を、種発酵槽において嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、もしくは水酸化ナトリウムのような）苛性溶液および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０で制御する。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御する。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。汚染を最小限にするために、場合により、カナマイシンのような株において抗生物質耐性マーカーが存在する抗生物質を使用してもよい。
【０１０１】
上記の条件の任意の組、および当業者に周知であるこれらの条件におけるさらなる変形例は、キシロース資化性組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【０１０２】
本発明を、以下の実施例においてさらに規定する。これらの実施例は、好適な実施形態を示す一方、あくまで例示として示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１０３】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）（１９８７年）から出版されたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより記載されている。
【０１０４】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【０１０５】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で、１晩、１．０〜１．２のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、４５００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを、２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを、２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μｌアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μｌを残して、ペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで−８０℃で貯蔵した。アッセイの前に、細胞を融解し、そして５００μｌの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）ソニファイアー４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、音波処理の間隔の間、サンプルを約３〜５分間冷やしながら、２回音波処理した。サンプルを、１４，０００ｒｐｍで６０分間、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を、新しいチューブに移し、そして４℃で保持した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを、タンパク質濃度を決定するために使用した。
【０１０６】
この酵素は他の酵素要素より不安定であるため、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイは、通常、最初に実施した。ＴＫＴアッセイの図を図３Ａに示す。
【０１０７】
マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１０８】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図３Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ３４０を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５
５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【０１０９】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図３Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１０】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図３Ｄに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅ））。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１１】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を伴うＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ１２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
流速：０．６ｍＬ／分
溶媒：０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
停止時間：２５分
注入容積：５μＬ
オ−トサンプラ−：温度管理（１０℃または４℃）
カラム温度：５５℃
検出器：外部標準検量線を伴う屈折率（４０℃）
【０１１２】
実施例１
ＺＷ６５８、キシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
ＺＷ６５８を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組み換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組込むことによって、構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。このアプローチは利点として組込み部位の多数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するため、ＺＷ６５８の調製では、部位特異的相同組み換えとは対照的に、転位（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）社製ＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を使用した。キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を配列し、そして組込みのための２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとしてクローニングした。２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）遺伝子を、組込み体の選択のための各オペロンに付着させた。２つのオペロンの組込みを、２段階の連続様式：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢで達成した。Ｃｍ耐性選択は、プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、続いて、各組込み後のプラスミドのキュアリングによって、取り出されるため、両方の組込みにおいて使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組込みの選択のために誘導される抗生物質マーカーの取り出しを可能にした。このプロセスにより、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子の悪影響がなくされた。
【０１１３】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コーディング領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（エピセンターバイオテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコーディング領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１および２を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰＥＮＯ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号３および４を伴うプライマーを使用して、ｔａｌコーディング領域フラグメントを、ｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号５および６を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＯＤｔｋｔのｔｋｔコーディング領域の上流にクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号７および８）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら（（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図４）を形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポナーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号９として示す。
【０１１４】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤは、ｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ２＋の存在下、室温で１時間、トランスポゼースで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したバイオラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）を使用する）エレクトロポレーションによって、ＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ４を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／Ｌバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天を含有する寒天プレート上でプレート化し、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０１／μｇのＤＮＡであった。
【０１１５】
合計で３９個のＣｍｒ形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号１０および１１を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組み換え体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組込み体を、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイを、タンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管において３０℃で増殖させた。酵素アッセイでは、コントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ６００が１．０に到達した場合、細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位をμモル／分−ｍｇとして示す。１つを除いて、すべてのサンプルは、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性を有した。
【０１１６】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組込み体のゲノムおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡは、ｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間において予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂ以上）のバンドは、各系統において個別のゲノム組込み部位を示す独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で独特であった。興味深いことに、プラスミドおよびＴ５のゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔもまた、生来のプラスミド上のＴ５に組込まれた可能性があることを示した。Ｃｍｒマーカーを取り出すためのさらなるＣｒｅ処置について、これらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【０１１７】
ｔａｌｔｋｔ組込み体からＣｍｒマーカーを取り出すためのＣｒｅ処置
染色体からＣｍｒマーカーを取り出すため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Ｓｐｒ耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。拾い出したコロニーの１００％がＣｍｓであったことから、ＣｒｅによるＣｍｒの高い効率の切り出しが示された。ＳｐｒＣｍｓ形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレート化した。ＰＣＲによってＳｐｓコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレート化した。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーは、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１および１１）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１回目および１０回目の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬおよびＴＫＴ活性の両方について類似のレベルを有したことから、これらの組込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【０１１８】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図４）に基づいて、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（図５）を構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、連結によって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号１２として示す。
【０１１９】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポナーゼで処置した（上記の）ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍで形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号１３、および１４、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号１３および１４を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【０１２０】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図６および７において示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図６）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が作製され、そして機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは、株８ｂより低かった。
【０１２１】
ｘｙｌＡＢオペロンの組込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｅｎｉｎ）標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクターベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は、同じ組込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は、同じ組込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ、個別の組込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組込み体は、そのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【０１２２】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）では、組込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【０１２３】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み株を、（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇ／ｌまた
は２％（ｗ／ｖ）キシロースならびにＲＭＧＸ（０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコース、４％（ｗ／ｖ）キシロースを伴うＲＭを含有する）ＲＭＸを含有する試験管およびプレートに播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応についての少なくとも５つの試みのうちの１つが、成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレート化したＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【０１２４】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ６００を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で定期的にモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを、７継代、連続した。増殖速度および最終ＯＤ（非線形読み取り）が、継代の間に改善された。
【０１２５】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称した。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ６００＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて、他の培養物より遅く増殖し、そして６．５時間後に再度、播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図８は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）において増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では、株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍｒマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍｒを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【０１２６】
ＲＭＸ（５％）中３７℃での連続継代によるキシロース培地における組込み体の適応
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、ＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株を、ＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために、３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上への画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【０１２７】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧにおいて、３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を、第１の評価のために、試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で、静置状態で播種した。増殖（ＯＤ６００、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を、第２の評価のために選択した。
【０１２８】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を、安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して、３７℃で５０代連続的に継代培養させた後に、それらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物を、ＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計において、試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図９にプロットした。結果は、ほとんどの株が、ＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が裏付けられた。
【０１２９】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）、ならびに高度の糖類におけるおよび酢酸塩の存在下でより良好な資化増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、および酢酸塩を伴うグルコースおよびキシロースの混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づけば、ＺＷ６５８と称される株番号２６が全体的に最も良好な性能を示した。
【０１３０】
実施例２
最上位の改善されたキシロース資化株の３７℃における発酵の評価
以下の実施例は、バイオマス加水分解物において予想される糖濃度および酢酸レベルを模倣する発酵条件下の改善されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株ＺＷ６５８の発酵性能を例示する。株ＺＷ６５８を、それぞれ、１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）、８％キシロース（ＲＭＸ８％）、１０％グルコース＋８％キシロース（ＲＭＧＸ１０％８％）および１０％グルコース＋８％キシロース＋０．６％酢酸（ＲＭＧＸＡｃ１０％８％０．６％）を補充したＲＭ培地を含有する発酵槽に播種した。すべての発酵は、３００ｍｌ培地を伴うシックスフォース（Ｓｉｘｆｏｒｓ）中、１５０ｒｐｍ、ｐＨ５．５および３７℃で行った。窒素を、発酵槽中の培地に１晩パージし、そして播種直前に停止した。発酵中は、窒素をパージしなかった。ＲＭＧ５％においてワーキングストックから起こした後の振盪フラスコ（１５０ｒｐｍ）中３７℃でのＲＭＧＸ（１０％、４％）によって、発酵のための播種物を調製した。株８ｂを、同じ条件下のコントロールとして使用した。図１０に示すように、ＺＷ６５８は、ＲＭＧ１０％上で８ｂと比較して、より緩徐に増殖し（ＡおよびＢ）、そしてＲＭＸ８％上では８ｂに類似の速度で増殖した（ＣおよびＤ）。より緩徐な増殖速度にもかかわらず、図１０は、グルコース培地での発酵の終了時にＺＷ６５８のエタノール収率（９３％）が８ｂに類似したことを示す。ＲＭＸ８％培地では、エタノール収率は、８ｂ（０．４４ｇエタノール／ｇ糖）と比較するとＺＷ６５８（０．４６ｇエタノール／ｇ糖）の方が高かった。ＺＷ６５８は、ＲＭＸ８％において８ｂと比較して、約４ｇ／ｌ多いエタノールを産生した。興味深いことに、ＺＷ６５８は、何らキシリトールを産生しなかった一方、８ｂは、ＲＭＸ８％における発酵の終了時に低レベルのキシリトール（０．７ｇ／ｌ）を産生した。図１１に示すデータは、酢酸塩を伴って（Ｃ、Ｄ）または伴わずに（Ａ、Ｂ）１０％グルコース＋８％キシロースを発酵する際に、ＺＷ６５８が、８ｂと比較してより良好に作動したことを示し、より多いグルコースおよびキシロース消費、より少ないキシリトール産生、およびより多いエタノール産生によって示される。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％における両方の株の発酵の終了時に、グルコースのほとんどが使用され、そして実質的な残留キシロースが保持されたが、ＺＷ６５８は、８ｂより約８ｇ／ｌ多いキシロースを使用した。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％中ＺＷ６５８における発酵の終了時のキシリトール産生（４．９ｇ／ｌ）は、８ｂのキシリトール産生（８．２ｇ／ｌ）より有意に低かった。酢酸塩（６ｇ／ｌ）の存在下において、両方の株の細胞増殖は、有意に減少し、グルコースおよびキシロースの両方の貧弱な発酵性能を生じたが、ＺＷ６５８は、より多いグルコースおよびキシロース産生、より少ないキシリトール産生およびより多いエタノール産生について、僅かにより良好な発酵性能を示した。ＲＭＸ８％とは異なり、酢酸塩を伴うまたは伴わないＲＭＧ１０％Ｘ８％では、両方の株とも副産物キシリトールを産生したが、８ｂと比較してＺＷ６５８ではキシリトールがより少なく産生された。２つの株の発酵性能を表１に要約する。全体として、ＺＷ６５８は、純粋な糖発酵において８ｂより良好に作動した。実施例１に記載のように、ＺＷ６５８は、抗生物質選択マーカーを含まず、これは、商業的用途において発酵生物体に貴重な特性である。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
実施例３
ＺＷ１およびＺＷ６５８におけるグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）遺伝子の挿入不活化の自殺構築物の調製
ＺＷ１およびＺＷ６５８においてグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするために使用される自殺構築物（「ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷ」）を、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）においてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を挿入により不活化するために先に使用された別の自殺構築物（「ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ」）から誘導した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、先に作製された他の多くの構築物から誘導した。これらの構築物のすべての最初の前駆体は、プラスミドベクターｐＮＥＢ１９３（ＮＥＢ番号Ｎ３０５１Ｓ；ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））であった。それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製することができるが、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では複製することができないため、このプラスミドを選択した。ＧＦＯＲを作製するのに関与したすべての工程および中間体について、プラスミドｐＮＥＢ１９３から開始して、年代順に以下に説明する。
【０１３３】
ｐＬＤＨ１９３の構築
以下に説明するＤＮＡフラグメントの挿入のために、ｐＮＥＢ１９３をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで二重消化した。両方の制限部位は独特であり、そしてプラスミドのマルチクローニング領域に局在する。ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ−線状化ｐＮＥＢ１９３プラスミドＤＮＡフラグメントを、製造者のプロトコルに従い、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製ＱＩＡクイック・ピュリフィケーション・キット（ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（カタログ番号２８１０４）を使用して、精製した。ｐＮＥＢ１９３にクローニングされたＤＮＡフラグメントは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製ブラッド・アンド・セル・カルチャー・マキシ・キット（Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ）（カタログ番号１３３６２）を使用して、株ＺＷ１から単離されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された２２６８ｂｐフラグメントであった。このフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用した合成オリゴヌクレオチドは、プライマー１および２であった：
プライマー１（配列番号１７）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣ
プライマー２（配列番号１８）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＡＣ
【０１３４】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ホスホグリセロムターゼ（ｐｇｍ）をコードするオープンリーディングフレームの３’末端でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド１２６２７３９〜１２６２７２０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、アルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ（ａｄｈＩ）をコードするオープンリーディングフレームの直ぐ上流であるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド１２６０４９０〜１２６０４７２にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。従って、ＰＣＲ増幅の標的であった２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＳｂｆＩ部位から開始し、そしてＡｓｃＩ部位で終了する次のエレメントからなる：（ａ）ｐｇｍ遺伝子の３’末端、（ｂ）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子全体、および（ｃ）遺伝子の５’非翻訳領域。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、上記で説明したＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ線状化ｐＮＥＢ１９３ベクターに連結した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０を形質転換して、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを含有するアンピシリン耐性形質転換体を、はじめに、再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）ならびにプライマー１および２によって同定した。ポジティブクローンの以後の確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにアンピシリン耐性形質転換体によるコロニーＰＣＲによって作製した２２６８ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列解析によって行った。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、「ｐＬＤＨ１９３」と称する。
【０１３５】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７の構築
プラスミドｐＬＤＨ１９３は、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間付近に局在する独特なＮｃｏＩ部位を有する。この部位を使用して、テトラサイクリンに対して耐性を付与するＤＮＡフラグメントを挿入した。この操作のために使用したテトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃｒ−カセット）を、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０６４０３）、ならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー３および４を使用するＰＣＲによって作製した。
プライマー３（配列番号１９）：
ＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃａｔｇｇＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＴｇｃｇｇｃｃｇｃＡＡＴＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣ
プライマー４（配列番号２０）：
ＡＴＣＴＣＡＣＴｃｃａｔｇｇＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡｔｔａａｔｔａａＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧ
プライマー３（順方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターの直ぐ上流にハイブリダイズする。プライマー３はまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、およびＮｏｔＩ）を有する。ＮｃｏＩ部位を小文字で表す。ＡｓｉＳＩ部位には、細い下線が付されている。Ｎｏｔ Ｉ部位を斜体の小文字で表す。プライマー４（逆方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子の終止コドンの直ぐ上流にハイブリダイズし、そしてこのプライマーはまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩ）を有する。上記の標識化と同様に、ＮｃｏＩ部位を小文字で表し、ＦｓｅＩ部位に細い下線を付し、そしてＰａｃＩ部位を斜体の小文字で表す。プライマー３および４で作製した１４４８ｂｐのＴｃｒ−カセットを、ＮｃｏＩで切断し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、プラスミド、ｐＬＤＨ１９３のｌｄｈオープンリーディングフレームに存在する独特なＮｃｏＩ部位に連結した。挿入を伴わないベクターの再環状化の可能性を最小限にするために、連結の前に、ＮｃｏＩ消化ｐＮＥＢ１９３を仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。連結反応混合物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入し、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確な挿入を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてＴｃｒ−カセットの配向を、適切なプライマーを使用するＰＣＲ分析によって確認した。さらなる操作のために選択したプラスミド（ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７）の環状図を、図１２に示す。ここに記載されていない実験では、この自殺構築物を使用し、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択としてテトラサイクリン上での増殖を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を、挿入により不活化（即ち、「破壊」または「ノックアウト」）した。
【０１３６】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を「ノックアウト」し得ることを実証したことから、次の工程は、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して、遺伝子破壊後の染色体から選択マーカーを取り出すことが可能であるように、この構築物を改変することであった。この目的を達成するために、Ｔｃｒ−カセットにフランキングする４つの独特な制限部位、即ち、５’末端におけるＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩならびに３’末端におけるＰａｃＩおよびＦｓｅＩを利用して、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、１９９８年）をｐＬＤＨＴｃ１３９＃７に付加した。構築物を両方の酵素で切断し、そして得られる大きなＤＮＡフラグメントを精製した後、第１のｌｏｘＰ部位を、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位は、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド５および６（配列番号２１および２２）から作製した。
オリゴヌクレオチド５（配列番号２１）：
ｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃ
オリゴヌクレオチド６（配列番号２２）：
ｇｇｃｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃｇａｔ
これらのオリゴヌクレオチドは相互に相補的であり、そして共にアニールする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。オリゴヌクレオチド中の大文字は、完全長の野生型ｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位に連結するために使用したヌクレオチドを示す。
【０１３７】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳｉおよびＮｏｔＩ部位に正確に挿入されたｌｏｘＰ部位を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、コロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、「ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗ」と称する。
【０１３８】
次に、両方の酵素でプラスミドを切断し、そして得られる大きなベクターフラグメントを精製した後、第２の野生型ｌｏｘＰ部位を、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷにおけるＴｃｒ−カセットの他方の末端のＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位もまた、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド７および８（配列番号２３および２４）で作製した。
オリゴヌクレオチド７（配列番号２３）：
ｔａａＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｇｃｃｇｇ
オリゴヌクレオチド８（配列番号２４）：
ｃｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｔｔａａｔ
オリゴヌクレオチド７および８は相互に相補的であり、そしてハイブリダイズする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。オリゴヌクレオチド中の大文字は、完全長のｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に連結するために使用されるヌクレオチドを示す。
【０１３９】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に正確に挿入された野生型ｌｏｘＰ部位を伴うプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、コロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと称し、そしてこの構築物の環状図を図１２に示す。
【０１４０】
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷはｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと同一であるが、但し、後者の構築物のテトラサイクリン耐性カセットは、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃｒ−カセット）で置き換えられた。後者は、テンプレートとしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（カフーン（Ｃａｈｏｏｎ）ら、２００３年）ならびにプライマー９および１０を使用するＰＣＲによって作製した。ｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの完全なヌクレオチド配列およびそのプロモーターを含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４０３）の公開された配列に基づく。
プライマー９（配列番号２５）：
ＡＴＡＡＡＡｇｃｇｇｃｃｇｃＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡ
プライマー１０（配列番号２６）：
ＧＧＣＧｔｔａａｔｔａａＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧ
【０１４１】
プライマー９（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ６〜１７に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位に対応する。プライマー１０（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００６〜１０１９に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＰａｃＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された１０４０ｂｐのＳｐｅｃｒ−カセットを、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、Ｔｃｒ−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化し、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズの挿入を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷと称し；この構築物の環状図を図１２に示す。ここに記載されていない実験では、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを使用し、スペクチノマイシンに対する耐性を選択マーカーとして使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子をノックアウトした。自殺構築物による遺伝子不活化は、宿主経由、二重交差、相同組み換えを介して生じ（国際公開第０１／８３７８４Ａ２号パンフレット）、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間における２つの野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされる選択マーカー（Ｓｐｅｃｒ−カセット）の挿入を生じた。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのＳｐｅｃｒ−カセットにフランキングする２つのＤＮＡフラグメントによって、二重交差事象の標的をｌｄｈ遺伝子に定めた。これらのフラグメントの一方（以降、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、Ｓｐｅｃｒ−カセットの直ぐ上流にあり、そしてＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位の間に局在する。この約１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は、ｐｇｍ遺伝子の３’末端およびｌｄｈオープンリーディングフレームのはじめのおよそ半分をコードするＺＷ１染色体ＤＮＡと同一である。他方のＤＮＡフラグメント（以降、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間のＳｐｅｃｒ−カセットの対向末端に局在する。３’ｌｄｈフランキングＤＮＡのヌクレオチド配列（これもまた、約１１００ｂｐである）は、ｌｄｈ遺伝子の他方の半分およびａｄｈＩ遺伝子の５’非翻訳領域の部分をコードする染色体ＤＮＡと同一である。５’および３’ｌｄｈフランキングＤＮＡフラグメントの両方がそれらの染色体対応物と相互作用し、そして相同組み換えを経験する場合、二重交差事象を生じる。本質的に不可逆的であり、そしてもっぱら、宿主の酵素的機構によって仲介されるこの現象は、オープンリーディングフレームの中間にＳｐｅｃｒ−カセットを挿入することによって、染色体ｌｄｈ遺伝子を不活化する。構築物は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができず、このことがそれを自殺構築物にするため、（極めて低い頻度で生じる自然発生性の薬剤耐性変異体とは別の）ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを伴う安定なスペクチノマイシン耐性コロニーを作製するための唯一の方法は、相同組み換えを介する二重交差事象である。二重交差事象によって染色体に挿入されるＳｐｅｃｒ−カセットはなお、自殺構築物に存在する２つの野生型ｌｏｘＰ部位の間に挟まれていることに留意することが重要である。この配置のため、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクターを使用することによってそれを再活性化することを伴わずに、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選択マーカーを取り出すことが容易である。
【０１４２】
ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを、以下に記載の第２の工程手順におけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）の遺伝子不活化のための自殺構築物に変換した。第１の工程は、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてそれを、ＧＦＯＲをコードする染色体遺伝子をプラスミド構築物の標的にする類似のＤＮＡフラグメントで置き換えることであった。後者のＤＮＡフラグメント（以降、３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡと称する）は、テンプレートとしてＺＷ１ゲノムＤＮＡおよびＰＣＲプライマーとしてプライマー１１および１２を使用するＰＣＲによって作製した。
プライマー１１（配列番号２７）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＴＣＡＧＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣ
プライマー１２（配列番号２８）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＧＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＧ
【０１４３】
プライマー１１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームのおよそ中間にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８４３２４〜６８４３０５にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー１２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲ終止コドンから約６２５ｂｐ下流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８３１２４〜６８３１４３にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。１２３４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてこの操作から得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲにより作製された３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡを、ゲル精製した大きなベクターフラグメントのＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間で連結し、そして連結反応混合物のアリコートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートした。形質転換された細胞を、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレート化し、そしてプレートを３７℃でインキュベートした。正確な挿入物を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、コロニーＰＣＲならびにＦｓｅＩおよびＡｓｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、以降、ｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷと称した。
【０１４４】
次の工程は、ｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷから５’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し、そしてそれを、５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡで置き換えることであったが、そのため、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの破壊のために選択した染色体標的において、二重交差事象が生じ得る。テンプレートとしてＺＷ１ゲノムＤＮＡならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー１３および１４を使用するＰＣＲによって、５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡフラグメントを作製した。
プライマー１３（配列番号２９）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴａｔｇｃａｔＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣ
プライマー１４（配列番号３０）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇａｔｃｇｃＴＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴ
【０１４５】
プライマー１３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲ開始コドンから約５２０ｂｐ上流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８５５８４〜６８５５６４にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｓｉＩ部位に対応する。プライマー１４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間近くにあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド６８４３９６〜６８４４１５にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｉＳＩ部位に対応する。１２１７ｂｐのＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＡｓｉＳＩで切断し、そしてｐＬＤＨ／ＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷを、ＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩで二重消化して、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡを取り出し；後者の操作から生じる大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲにより作製された５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡを、上記のゲル精製した大きなベクターフラグメントのＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位に連結し、そして連結反応混合物のアリコートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄｃｍ−およびｄａｍ−である）にエレクトロポレートして、ＺＷ１およびＺＷ６５８の以後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得た（実施例５および７において詳述する）。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から単離されるメチル化プラスミドＤＮＡは、ＤＨ１０Ｂと同様に、宿主の制限／改変系によって容易に破壊される（米国特許第６５６６１０７Ｂ１号明細書に記載されている）ため、ＺＭ４から誘導されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡの使用が、成功に極めて重要であることに留意すること。ＮｓｉＩおよびＳｂｆＩは適合性の粘着末端を有するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレート化し、そしてプレートを３７℃でインキュベートした。正確な挿入物を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、コロニーＰＣＲおよび制限消化分析によって同定した。ＺＷ１およびＺＷ６５８においてＧＦＯＲ遺伝子をノックアウトするために使用したこの得られる自殺構築物を、以降、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷと称する。このプラスミドの環状図を図１２に示し、そしてその完全なヌクレオチド配列を配列番号３１に開示する。この自殺構築物とＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体ＧＦＯＲ遺伝子との間の二重交差事象により、２つの野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされるＳｐｅｃｒ−カセットの挿入を生じ、ｐＬＤＨ−Ｓｐｅｃ−９ＷＷについて上記の状況に類似することに留意することが重要である。
【０１４６】
実施例４
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現のためのプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）を作製した（図１３）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、それぞれの細菌種に対して１つずつ有するため、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｔｃｒ−カセット）を含有する。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃｒ−カセットを取り出し、そしてそれを、カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｋａｎｒ−カセット）で置き換えることであった。ｐＺＢ１８８からＴｃｒ−カセットを切り出すために、プラスミドをＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。ＰＣＲ増幅のために、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））ならびにプライマー１５および１６を使用するＰＣＲによって、Ｋａｎｒ−カセットを作製した。ｐＥＴ−２４ａは、Ｋａｎｒ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームおよびその関連するプロモーターを含有する。
プライマー１５（配列番号３２）：
ＧＣｔｃｔａｇａＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣ
プライマー１６（配列番号３３）：
ＡＣＡＴＴＧｇｃｇｃｇｃＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣ
プライマー１５（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｐＥＴ−２４ａにおけるＫａｎｒ遺伝子の開始コドンから約１６０ｂｐ上流にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＸｂａＩ部位に対応する。プライマー１６（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｋａｎｒ遺伝子のオープンリーディングフレームの他方の末端でハイブリダイズし、そして終結コドンを含む一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＢｓｓＨＩＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された９９１ｂｐのＫａｎｒ−カセットを、ＸｂａＩおよびＢｓｓｈＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１４７】
次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、標準的な連結反応で、上記のｐＺＢ１８８ＤＮＡフラグメントのＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位の間に挿入した。エレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、そして細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡを、カナマイシン耐性形質転換体の１つから単離したが、得られた構築物を以降、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎと称し；このシャトルベクターの環状図を図１３に示す。
【０１４８】
次の工程では、後者を両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ＫａｎのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、後者の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製した後、プラスミドｐＺＢ４から誘導した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図１３の枠内の図に示す。
【０１４９】
ＮｃｏＩおよびＣｌａＩ部位を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットのそれぞれ５’および３’末端に局在させた。米国特許第５５１４５８３号明細書において記載のように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターを含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンが直ぐ後に続く小さなステムループ領域を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ＫａｎのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。次いで、連結反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）にエレクトロポレートして、以下の実施例６に記載のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを有するカナマイシン耐性形質転換体を、制限消化分析およびコロニーＰＣＲによって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼを発現させるために使用したプラスミドを、以降、「ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ」と称する；この構築物の環状図を図１３に示す。
【０１５０】
実施例５
ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体の作製
ＺＷ１（ＺＷ６５８が最初に誘導された野生型株）においてＧＦＯＲ酵素活性をなくすために、実施例３において詳述した自殺構築物ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷを使用した。米国特許第５５１４５８３号明細書に本質的に記載されているように、エレクトロポレーションを使用して、非複製プラスミドＤＮＡを細菌宿主に導入した。簡単に説明すると、５０μｌの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の約１０１０個の細胞／ｍｌおよび実施例３に記載のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離した約０．９μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを含有した。コントロール反応物も全く同様に処置したが、プラスミドＤＮＡを含まなかった。エレクトロポレーターの設定は、１６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、および１ｍＭのＭｇＳＯ４）で希釈し、そして細胞を約５時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り出した。細胞ペレットを、１５０μｌの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして５０および１００μｌアリコートの細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。プレートを、嫌気チャンバにおいて３０℃でインキュベートし、そして２〜３日後、５０〜１５０個のコロニーが実験プレート上に出現した。このとき、コントロールプレート上にスペクチノマイシン耐性コロニーは認められなかったが、さらに４８時間のインキュベーション期間後に若干出現した。以下に記載のさらなる操作のために、ＧＦＯＲノックアウト構築物による形質転換から生じたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち２個を選択した。
【０１５１】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷに類似する自殺構築物を伴う先の実験から、染色体とプラスミドＤＮＡとの間の初期の相互作用は２つの標的化遺伝子座のうちの１つにおける一重交差であること、および一重交差事象は最終的に二重交差事象を生じることが示されている。二重交差事象への移行は、通常、自殺構築物のための選択因子を含有する液体培地における若干の連続的継代後、極めて迅速に生じる。ＧＦＯＲノックアウト構築物から生じる２つの選択されたＺＷ１形質転換体のための二重交差事象を容易にするために、１００ｇ／Ｌのグルコースおよび２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する１０ｍｌのＲＭ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）に細胞を播種した。３０℃で２４時間のインキュベーション期間の後、両方の培養物とも、定常期に到達した。次に、１０μｌアリコートの第１代培養物を使用して、１０ｍｌの同じ増殖培地に播種し、そしてこれらの両方の培養物もまた、３０℃で２４時間後に定常期に到達した。最終的に、１０μｌアリコートの第２代培養物を１０ｍｌの同じ増殖培地に播種し、そして３０℃でさらに２４時間、増殖を促進させた。液体培地における最後の継代後、第３代培養物のアリコートを希釈し、そしてスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧ培地上でプレート化して、単一のコロニーを入手し、そしてプレートを、嫌気条件下、３０℃で４８時間、インキュベートした。
【０１５２】
３つの異なる対のプライマーを使用するコロニーＰＣＲ実験から、二重交差事象が実際に生じたことが確認された。自殺構築物における５’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験している場合、ＰＣＲプライマーの第１の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。同様に、自殺構築物における３’ＧＦＯＲフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を生じている場合、ＰＣＲプライマーの第２の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。最終的に、二重交差事象が生じており、そしてさらに、一重および二重交差事象の集団の混合の可能性がなくされる場合、ＰＣＲプライマーの第３の対は、正確なサイズのＤＮＡフラグメントのみを作製することができる。この分析に使用した２個のスペクチノマイシン耐性コロニーを、自殺構築物とのＺＷ１エレクトロポレーション反応由来の２つの異なる主な形質転換体（これは、液体培地において３回継代し、そして上記のようにプレート化して単一のコロニーを得た）から誘導し、そしてこの実験のコントロールを親株、ＺＷ１とした。両方の形質転換体とも３つの異なる組のＰＣＲプライマーによりポジティブな結果を呈したため、さらなる分析のために、それらのうちただ１つを選択した。この株（ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体）を、以降、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲと称する。
【０１５３】
実施例６
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼは、生理学的条件下でキシリトール形成に対する主な寄与物であり得る
ＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体（ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ）を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株におけるキシリトール形成が、ペリプラズム酵素ＧＦＯＲか、または酵素的に活性でもあるそのより大きな分子量のサイトゾル前駆体によって少なくとも部分的に仲介されるという仮説（ロース（Ｌｏｏｓ）ら、上掲）を試験した。実施例２（図１１）に示されるように、キシリトールは、キシロース資化株８ｂおよびＺＷ６５８の主な副産物であるが、キシロースが増殖培地に存在する場合にのみ形成される。ＣＰ４のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の野生型株は、キシロースをキシリトールに直接還元することができるＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼを有する（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）が、図ＩＩおよびＩＩＩに示すように、増殖培地がキシロースまたはグルコースおよびキシロースの混合物を含有する場合、ＧＦＯＲはまた、インビボでのキシリトール形成に寄与し得ることが考えられる。しかし、インビトロでのＧＦＯＲ酵素特徴付けアッセイ（ザカライオウ（Ｚａｃｈａｒｉｏｕ）およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、上掲）および粗無細胞抽出物による実験（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）において示されるように、この化合物はＧＦＯＲ仲介キシリトール産生に不可欠な電子受容体であるため、これらの反応のいずれかが生じるためには、酵素がキシルロースにアクセスする必要がある。キシロース上での増殖のために操作されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株では、キシリトール合成に必要なキシルロースは、キシロース代謝（図１）の第１の工程を触媒し、ＺＷ１のような野生型株には存在しないキシロースイソメラーゼによって作製される。
【０１５４】
キシロースおよびグルコースの両方が増殖培地存在する場合にＧＦＯＲがキシリトールを作製することができる可能を試験するために、実施例４で説明した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）を、ＺＷ１およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲに導入した。ストラテジーは、これらの糖類のいずれかにおいて増殖することができない２つの株におけるキシロースからキシルロースへの経路を提供し、そしてＧＦＯＲがキシリトールを作製し得るかどうかを決定することであった。形質転換のために使用したエレクトロポレーション手順については本質的に実施例５に記載のとおりであったが、回復期間後、形質転換された細胞を、３００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。この実験のコントロールとして、ＺＷ１およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲもまた、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡと同一であるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くｐＺＢ１８８／Ｋａｎ（図１３）で形質転換した。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡまたはコントロールプラスミドを所有するカナマイシン耐性コロニーを、コロニーＰＣＲによって同定し、そして各形質転換反応由来のそれぞれのコロニーを、図１４に示す実験のために無作為に選択した。これらの４つのプラスミドを有する株を、以降、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）およびＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）と称する。
【０１５５】
１晩培養物を、１５ｍｌキャップ付き試験管中、３０℃で、５ｍｌの６０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ２（７Ｈ２０）および３００μｇ／ｍｌのカナマイシンにおいて増殖させた。次いで、これらの１晩培養物のアリコートを使用して、２０ｇ／Ｌのキシロースを伴うまたは伴わない同じ増殖培地を含有する（５０ｍｌキャップ付き試験管中の）２０ｍｌ培養物に播種した。増殖は、３０℃において穏やかな撹拌を伴い、そして初期のＯＤ６００値は約０．１であった。０、２４、４８、および１２０時間の増殖後、ＨＰＬＣ分析のために、屈折率検出器を具備するＨＰ１１００（ヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を使用して、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出し、発酵ブロス中に存在するキシロース、キシルロースおよびキシリトールの濃度を決定した。ＨＰＬＣ分析の前に、遠心分離によって細胞を取り出し、そして０．２２μｍ酢酸セルローススピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ遠心管フィルター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、カタログ番号８１６０）を介して上清をろ過して、小さな粒子を取り出した。化合物を、０．６ｍｌ／分の流速および移動相として０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を使用する均一溶媒条件下、５５℃で稼動させたアミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））上で分離させた。既知濃度の標準物質を使用して、目的のピークを定量し、そしてすべての結果をｇ／Ｌで表した。
【０１５６】
結果は、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）、「空の」ベクターを伴うコントロール株をグルコースおよびキシロースの存在下で増殖させる場合、１２０時間のインキュベーション期間後、極少量のキシリトールが増殖培地に蓄積したことを示す（図１４Ａ）。この株で観察された最大量のキシリトールは、＜０．５ｇ／Ｌであった。対照的に、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）を同じ濃度のグルコースにおいて増殖させたが、キシロースを省いた場合、キシリトールは形成されず、そしてこれは他の３つの株についても同様であった。結果として、グルコースおよびキシロースの両方の存在下で実施した実験のみを、図１４に示す。意外にも、ＺＷ１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現は、発酵ブロスにおいて出現したキシリトールの量を顕著に増加し、そして１２０時間まで、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）は、この化合物を、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ）より５倍多く作製した（図１４Ｂ）。キシロースイソメラーゼは、キシロースからキシルロースへの異性化を触媒するため、予想したとおり、ＺＷ１におけるキシロースイソメラーゼの発現もまた、キシルロースの産生を生じた。この実験において、増殖培地に添加された全キシロースのうち約１６％が、キシルロースまたはキシリトールに変換されたことに留意すること。また、これらの２つの化合物の間に明らかな前駆体／産物の関係（キシリトールが増加する時、キシルロースは減少する）が存在し、これは、グルコースおよびキシロースが両方とも増殖培地に存在する場合、生理学的条件下でＧＦＯＲはキシルロースをキシリトールに変換することが可能であるという仮説に一致することに留意すること。
【０１５７】
ＺＷ１と同様に、キシロースイソメラーゼ発現ベクターの非存在下では、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲによって作製されるキシリトールは極僅かであった（図１４Ｃ）。これらの条件下で形成された少量のキシリトールは、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼから生じ得、フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら（１９９２年、上掲）により示唆されている。特に、キシロースイソメラーゼをＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体において発現させた場合、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）で得られた結果とは対照的に、さらなるキシリトールは作製されなかった（図１４Ｄ）。実際、ＺＷ１−ΔＧＦＯＲ（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ）は大量のキシルロースを産生し、そして形成されたこの化合物の量は、対応するＺＷ１株（即ち、ＺＷ１（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−ＸｙｌＡ））によって作製されたキシルロースおよびキシリトールの全量に極めて類似した。これらの実験は、酵素がキシルロースにアクセスする場合、ＧＦＯＲがインビボにおけるキシリトール形成に実質的に寄与することができ、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株がグルコースおよびキシロースの混合物において増殖する場合に他ならないことを明確に実証する。これらの結果は、さらに、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組み換え株をキシロース含有培地において増殖させる場合、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼが、キシリトール産生においてあまり役割を果たしていないことを示し、文献（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲；キム（Ｋｉｍ）ら、上掲）の予想とは対照的である。
【０１５８】
実施例７
ＺＷ６５８ ＧＦＯＲノックアウト変異体の作製およびこの株が機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないことの実証
実施例６において示されるように、グルコースおよびキシルロースの両方が利用可能である場合、生理学的条件下で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるキシリトール形成に寄与することができるＧＦＯＲをコードする遺伝子を、自殺構築物、ｐＧＦＯＲＳｐ−９ＷＷ（実施例３に記載されている）を使用して、ＺＷ６５８において挿入により不活化した。この手順におけるすべての工程は、実施例５におけるＺＷ１ ＧＦＯＲノックアウト変異体に記載の工程と同一であり、３つの組のＰＣＲプライマーによる二重交差事象の確認を含む。以下に記載の以後の実験のために選択したＺＷ６５８ノックアウト変異体を、ＺＷ８００と命名した。
【０１５９】
ＺＷ８００が、グルコースおよびフルクトースからソルビトールを作製すること（ＧＦＯＲによって触媒される生理学的反応である）ができる酵素を産生しないことを実証するために、以下の実験を実施した。ＺＷ８００および親株ＺＷ６５８の１．５ミリリットル培養液を、１０ｍｌキャップ付き試験管中、３０℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において、早期定常期まで増殖させた。培養物が約５．５のＯＤ６００に到達したら、遠心分離によって細胞を回収し、そして上清を注意深く取り出し、そして廃棄した。次に、細胞ペレットを、次の組成を有する５ｍｌの新鮮増殖培地に再懸濁した：１１０ｇ／Ｌグルコース、１１０ｇ／Ｌフルクトース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、および４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３。上記のすべての工程を滅菌条件下で実施し、そして細胞を再懸濁する前に、増殖培地の初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。次いで、得られた培養物を、３０℃で、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させ、そして表２に示された時間に、実施例６に記載したのと同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにサンプルを取り出した。この実験のための目的のピークは、グルコース、フルクトース、ソルビトールおよびエタノールであり、そして細胞を遠心分離によって回収した後、既知量の標準物質を使用して、発酵ブロスにおけるそれらの濃度を算出した；表２では、すべての濃度をｇ／Ｌで表す。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
表２に示されるように、ＺＷ６５８培養物は、２３時間後にほとんどすべてのグルコースおよびおよそ半分のフルクトースを消費し、そして主な産物として匹敵する量のソルビトールおよびエタノールを作製した；最初の時間ポイント中の２つの後者の化合物の値は、それぞれ、４５．９９ｇ／Ｌおよび４９．３６ｇ／Ｌであった。それ故、ＺＷ６５８培養物中のＧＦＯＲによって、はじめにあったフルクトースのうち４０％を超えるものがソルビトールに変換された。極めて対照的に、２３時間のインキュベーション期間後のＺＷ８００培養物由来の発酵ブロスでは、ソルビトールは検出されなかったが、その代わり、グルコースおよびフルクトースは、ほぼ定量的にエタノールに変換され、１グラムの消費された糖あたり理論値で０．５１グラムのエタノールに極めて近かった。さらに２４時間の増殖後、ＺＷ６５８培養物におけるソルビトールの量のさらなる増加は認められなかったことに留意すること。ほぼすべてのグルコースが早期に枯渇され、そしてフルクトースとのＧＦＯＲ反応のための電子供与体が存在しなかったため、これは予想されることであった。興味深いことに、４７時間時点のＺＷ８００培養物の発酵ブロスにおいて少量のソルビトール（１０．２１ｇ／Ｌ）が見出され、そしてこれは、ＮＡＤＰＨ依存性アルドースレダクターゼ（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）ら、上掲）または未だ解明されていない他のいくつかの酵素によって作製され得る。それにもかかわらず、上記の結果は、ＺＷ８００のＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間に挿入されたＳｐｅｃｒ−カセットは、全てではないにしても大部分がＧＦＯＲ酵素活性を廃止した証拠を提供する。
【０１６２】
さらに、この結論は、ＺＷ１、ＺＷ６５８およびＺＷ８００から調製された無細胞抽出物によるインビトロ実験によって支持される。目的は、他の物質または補因子を添加することなく、ＺＷ６５８がキシロースをキシリトールに変換することができるかどうかを決定すること、およびＧＦＯＲ不活化の結果として、ＺＷ８００がこの反応を行う能力を失っているかどうかを調べることであった。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）無細胞抽出物によるＧＦＯＲ仲介キシリトール産生には次の３つの要件が存在する：１）ＧＦＯＲの強固に結合した補因子を還元することが可能であるグルコースまたはキシロースのような糖電子供与体、２）電子受容体としてのキシルロース（何故なら、酵素が実際にキシリトールに還元するのはこの化合物であるからである）、および３）機能性ＧＦＯＲ酵素。キシルロースが反応混合物に添加されない場合、無細胞抽出物はまた、キシロースをキシルロースに変換するためのキシロースイソメラーゼを含有しなければならない。
【０１６３】
無細胞抽出物を、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および５０ｇ／Ｌグルコースを含有する２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて３３℃で増殖させた１００ｍｌ培養物から調製した。２〜３の間のＯＤ６００で遠心分離によって細胞を回収し、そして氷冷５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールで２回洗浄した。最終的なペレットを、１．０ｍｌの同じ緩衝液に再懸濁し、そして細胞を音波処理によって破砕した。細胞破砕物を４℃で遠心分離（１６，０００×ｇ、６０分間）によって取り出した後、以下に記載のように、無細胞抽出物を、キシリトール産生について直ちにアッセイした。５００μｌの反応を、ポリプロピレン微量遠心管において行い、そして最終濃度で次の組成を含有した：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、６６ｍＭキシロース、および０．３２〜０．３５ｍｇの無細胞抽出物タンパク質；タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用するＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））によって決定した。４０℃で１５時間のインキュベーション期間後、反応を、最終濃度で３０ｍＭのピバリン酸で終結させ、そして移動相として０．０１Ｎ硫酸を伴うＳＨ１０１１カラム（ショウデックス（Ｓｈｏｗｄｅｘ））を使用するＨＰＬＣによって、アリコートを分析した。カラム温度を５０℃に維持し、流速は１．０ｍｌ／分であった。この実験のためのコントロールは無細胞抽出物を含まなかったが、それ以外は全く同様に処置した。
【０１６４】
表３に示すように、ＺＷ１無細胞抽出物を反応混合物に添加する場合、１５時間のインキュベーション期間中、キシロースはキシルロースまたはキシリトールに変換されなかった。既に示したように、ＺＷ６５８およびＺＷ８００とは対照的に、ＺＷ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼを発現しない野生型株であるため、この結果は予想されることであった。対照的に、無細胞抽出物は、これらの２つの化合物の形成に必要な両方の酵素を含有したため、ＺＷ６５８無細胞抽出物を使用した場合、有意量のキシルロースおよびキシリトールを作製した。キシロースが、反応混合物に添加される唯一のＧＦＯＲ基質である場合、作製されるキシリトールの各分子について２分子のキシロースが消費されるため、この場合、はじめにあった６６ｍＭキシロースのうち８％近くがキシリトール産生に使用されたことに留意すること。最終的に、そして最も重要なことに、ＺＷ８００無細胞抽出物はキシロースイソメラーゼ活性を含有したが、それはＧＦＯＲ酵素活性を欠いたため、ＺＷ８００無細胞抽出物のみが、キシロースをキシルロースに変換することが可能であった。精製されたキシロースイソメラーゼでスパイクされた野生型無細胞抽出物で先に示されている（ダニエルソン（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ）、上掲）ように、これらの結果は、ＺＷ８００が機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないさらなる証拠を提供し、そしてこのタンパク質がキシロースを電子供与体として使用して、キシルロースをキシリトールに還元することが可能であることをさらに実証する。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
実施例８
ソルビトールはグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００の増殖に必要である
グルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００によるエタノールの産生のための発酵性能を試験した。実験は、ｐＨ制御された発酵槽において、９７ｇ／Ｌまたは１８８ｇ／Ｌの全糖において約５：４の一定のグルコース対キシロース比を使用して、行った。
【０１６７】
ＺＷ６５８およびＺＷ８００の種培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において増殖させた；初期ｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。ＯＤ６００が約５．０に到達したら、種培養物の５０ｍｌアリコートを使用して、４５０ｍｌの増殖培地を含有する１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム・インク．（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）、米国ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））に接種した。最終的な５００ｍｌ培養物は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４および低濃度の糖（５４ｇ／Ｌグルコース、４３ｇ／Ｌキシロース）または高濃度の糖（１０４ｇ／Ｌグルコース、８４ｇ／Ｌキシロース）のいずれか一方を含有する。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。多様な時間において、実施例６に記載したのと同じ手順および条件を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験のための目的の化合物はグルコース、キシロース、およびエタノールであり、そして既知濃度の標準物質を使用して、クロマトグラムのピークを定量した。また、６００ｎｍの光学密度に設定した分光光度計による濁度の変化を追跡することによって、細胞増殖をモニターし、そして得られるＯＤ６００値をプロットした。
【０１６８】
図１５に示すように、発酵槽が低濃度の糖（５４ｇ／Ｌグルコース、４３ｇ／Ｌキシロース）を含有した場合、ＧＦＯＲ不活化は、増殖、糖消費、またはエタノール力価に影響を及ぼさなかった。しかし、全糖濃度を図１６において認められる場合の約２倍に増加し
た場合、発酵性能において大きな差異が観察された。ＺＷ６５８は、約３０時間の停滞期間を経験したが、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株をグルコースおよびキシロースの希釈混合物から約１８０ｇ／Ｌの全糖を超える同じ糖類の濃縮混合物へ移す場合、それらに典型的である。停滞期間後、細胞は増殖を開始し、そして培地中の全てのグルコースおよび約７５％のキシロースを消費し、それ故、約７３ｇ／Ｌの最終エタノール力価を生じた（図１６Ａ）。対照的に、ＺＷ８００培養物は、１３０時間のインキュベーション期間後であっても、停滞期間から回復せず（図１６Ｂ）、そしてこの結果は２回の個別の施行において観察された。
【０１６９】
図１５に示すように、ＺＷ８００は、グルコースおよびキシロースの希釈混合物において良好に増殖したため、高い糖混合物においてこの株が回復できないことは、浸透圧ストレスにいくらか関係する可能性があるようであった。実際、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をグルコースおよびフルクトースの濃縮混合物または高濃度のスクロースに移す場合（これはまた、インベルターゼの作用を介してグルコースおよびフルクトースを上昇させる）、ＧＦＯＲは、ソルビトールを作製することによって、浸透圧バランスを維持することに極めて重要な役割を果たす（ロース（Ｌｏｏｓ）ら、上掲）。ペリプラズム空間においてＧＦＯＲによって産生されるソルビトールは、濃度勾配に対して細胞に輸送され、ここで、それは、さらに代謝されないため、高レベルで蓄積する。これは、形質膜を横切る浸透圧差をなくし、そして浸透圧バランスを回復する（ヴィーゲルト（Ｗｉｅｇｅｒｔ）ら、上掲）。しかし、ＧＦＯＲ仲介ソルビトール産生の前提条件は、グルコースおよびフルクトースが同時に存在することであり、そしてこの反応は、フルクトースを欠く増殖培地では生じるべきではない。それにもかかわらず、ソルビトールは、ＧＦＯＲの生理学的に重要な産物であり、そしてこの酵素は、ＺＷ８００において非活性であるため、ソルビトールをグルコースおよびキシロースの濃縮混合物に添加する効果を、下記の実験において試験した。
【０１７０】
高度の糖混合物における約７０時間後（図１６において垂直矢印で示した時点）、区画されたＺＷ８００培養物の５つの４．５ｍｌアリコートを発酵槽から取り出し、そして１５ｍｌキャップ付き試験管に移した。次いで、試験管のうち４つに、０〜２０ｍＭソルビトール（最終濃度）を補充し、そして全ての場合において、培養物の全容積を脱イオン水で５．０ｍｌに調整した；この実験に使用したソルビトールストック溶液もまた、水で作製した。水およびソルビトールを添加する場合、増殖培地の１０％希釈のためのコントロールに対し、第５の培養物に何も添加しなかった。次いで、培養物の全てを、３３℃で、穏やかに撹拌（２００ｒｐｍ）しながらインキュベートし、そして分光光度により増殖をモニターした。図１７に示すように、ソルビトールを増殖培地に添加すると、試験した最も低い濃度（５ｍＭ）であっても、細胞は、ほぼ直ちに増殖を開始した。ソルビトールを添加しなかったが、培養物を水で１０％希釈し、全糖濃度を１８８ｇ／Ｌから１６９ｇ／Ｌへ減少させた場合、増殖のいくつかの刺激が観察された。しかし、増殖に対するソルビトールの刺激効果は、希釈の効果よりもかなり大きかった。
【０１７１】
ＺＷ６５８は、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物において、フルクトースの既知の供給源を伴わずに、停滞期から回復し、そして良好に増殖したため、ソルビトールによるＺＷ８００増殖の救出は全く予想外であった。後者の化合物はＧＦＯＲ仲介ソルビトール産生に不可欠な電子受容体であるため、ソルビトールを合成し得ず、または高濃度のグルコースおよびキシロースを含有する培地における浸透圧バランスにおいて役割を果たし得ないようであった。それ故、ソルビトールが、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物においてＺＷ６５８またはＺＷ８００の増殖のための重要な因子であることを示すものはなかった。
【０１７２】
実施例９
ＧＦＯＲ不活化は、プロセス関連条件下でキシロースからのエタノール産生を改善する
プロセス関連条件下でのグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ６５８およびＺＷ８００の発酵性能を、並行する様式で比較して、ＧＦＯＲ不活化が有益または有害な代謝エンジニアリングストラテジーであるかどうかを決定した。高濃度のグルコースおよびキシロースをこれらの実験において使用したため、ソルビトールを培地に添加して、ＺＷ８００の増殖を可能にした。ここに記載されていない実験では、ソルビトールがＺＷ６５８の停滞期をなくすことも発見した。それ故、増殖培地のソルビトール補充は、これらの２つの株をプロセス関連条件下で比較するための理想的な方法を提供する。
【０１７３】
酢酸塩の存在および非存在下、全糖類の２つの濃度を使用して、６つの異なる条件下でＺＷ６５８ならびにＺＷ８００を比較し、そしてより濃縮された糖混合物について、２つの異なる緩衝能を調べた。これらの実験は、３０℃で、５０ｍｌ試験管中、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させた２０ｍｌ培養物で行った。ｐＨは制御しなかったが、種培養物の播種の前に、増殖培地の初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。基本増殖培地は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトールならびに４ｇ／Ｌ（図１８および１９）のＫＨＣＯ３または８ｇ／Ｌ（図２０）のＫＨＣＯ３のいずれか一方を含有した。上記および下記の全ての値は、種培養物を添加した後の最終濃度である。ＫＨＣＯ３を使用して、増殖培地の緩衝能を増加し、細菌増殖中に通常生じるｐＨの低下を最小限にした。これらのすべての実験の炭素源は、全糖の異なる２つの濃度で前処置したコーンストーバ加水分解物におけるこれらの２つの糖類の比に近似するグルコースおよびキシロースの混合物であった。グルコースおよびキシロースの初期濃度は、それぞれ９２ｇ／Ｌおよび８２ｇ／Ｌ（図１８）または１０７ｇ／Ｌおよび９６ｇ／Ｌ（図１９および２０）のいずれか一方であった。表示される場合は、６ｇ／Ｌの酢酸塩（前処置したコーンストーバ加水分解物に存在するインヒビター）もまた存在した。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において３０℃で約５．０のＯＤ６００まで増殖させ、そして１／１０容積を使用して、実験培養物に播種した。多様な時間において、実施例６において先に記載のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして全ての値をｇ／Ｌで報告する。最初の時間ポイントを採取する前に、事実上全てのグルコースが消費されたため、この糖の値はグラフにプロットしなかった。
【０１７４】
図１８〜２０に示す実験から、次の２つの異なる基準によって判定される試験した全ての条件下で、ＺＷ８００がＺＷ６５８より優れた性能を呈することが明らかである：（ａ）実験経過中に消費されたキシロースの全量、および（ｂ）到達した最大エタノール力価。また、このデータから、ＧＦＯＲ不活化の有益な効果は、最もストレスの多い条件に遭遇する場合（即ち、すべてのグルコースが枯渇し、そしてエタノール濃度が毒性レベルに接近し始めた後）に、発酵の後期段階中に主として生じたことが明らかである。実際、２つの株の最も顕著な差異は、増殖培地中にさらなるストレスに寄与する阻害濃度の酢酸塩が存在した場合に観察された。３組の実験条件について酢酸塩の存在下におけるＺＷ８００のエタノール力価の平均の増加は、１０．２％であり、値の範囲は４．４％〜１３．７％である。ＺＷ８００はまた、３つのすべての実験において酢酸塩の非存在下でＺＷ６５８より多くのエタノールを産生したが、この場合の平均の増加は３．２％であった。予想したとおり、ＺＷ６５８は、有意な量のキシロースを、所望されない副産物キシリトールに変換し、そして条件が最もストレスの多いものである場合（即ち、発酵の後期段階中および酢酸塩が増殖培地に存在した場合）、最も高いレベルのこの化合物が観察された。例えば、図１８〜２０に示す酢酸塩による実験では、ＺＷ６５８は、全キシロースの８．１％、８．３％および９．９％を変換し、これは消費されて、キシリトールになった。対照的に、ＺＷ８００培養物では、試験したいずれの条件下においても、キシリトールは見出されなかった。これらの結果は、プロセス関連条件下、特に、阻害濃度の酢酸塩の存在下で、ＧＦＯＲ不活化が、エタノール産生のためのキシロース代謝に有益であることを明確に示す。図１８および１９に示す試験管での実験を２回実施し、そして事実上、同一の結果を得た。
【０１７５】
ｐＨ制御された発酵槽を使用して、酢酸塩を伴うグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるＺＷ８００およびＺＷ６５８による別の並行実験を実施した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によって産生される有機酸および二酸化炭素のような代謝の副産物は、酢酸対酢酸塩の比を増加する増殖培地のｐＨを低下することができ、そしてプロトン化種が、細菌増殖を実際に阻害する化合物であることは公知である（キム（Ｋｉｍ）ら、（２０００年）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８４−８６：３５７−３７０）。それ故、５．８から５．０へのｐＨの低下により、酢酸の濃度が５倍増加するため、ｐＨ制御は大規模発酵において極めて重要である。
【０１７６】
ＺＷ８００およびＺＷ６５８の種培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において増殖させた；初期ｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。ＯＤ６００が約５．０に到達したら、種培養物の５０ｍｌアリコートを使用して、４５０ｍｌの増殖培地を含有する１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム・インク．（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）、米国ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））に接種した。最終的な５００ｍｌ培養物は、９２ｇ／Ｌグルコース、９７ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭソルビトールおよび７．２ｇ／Ｌの酢酸塩を含有した。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した；混合速度は１５０ｒｐｍであった。多様な時間において、実施例６に記載されている同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして細胞増殖（ＯＤ６００）もまた、モニターした。図２１は、ＺＷ８００培養物によって稼動させた発酵槽のこれらのパラメータについての全ての時間経過を示し、そして表４は、両方の株についてのキシロース、エタノールおよびキシリトールのエンドポイント値についてまとめている。
【０１７７】
【表５】
【０１７８】
酢酸塩による試験管の結果（図１８〜２０）と同様に、ｐＨ制御された発酵槽において、ＺＷ８００は、ＺＷ６５８より１４％多いキシロースを消費し、そして９．６％多いエタノールを作製した（図２１）。この株は検出可能なキシリトールを何ら産生しなかったため、ＺＷ８００のエタノール収率もまた、約５％高かった。対照的に、ＺＷ６５８の発酵ブロスにおけるキシリトールの最終濃度は３．９２ｇ／Ｌであったが、実験の過程中に消費された全キシロースの約６．５％を示す。これらの実験は、キシリトール形成をなくすことによって、ＧＦＯＲ不活化がキシロースからのエタノール産生を改善するさらなる証拠を提供する。既に示したように、所望されない副産物キシリトールは、少なくとも２つの異なる方法でキシロース代謝を妨害し、そして細菌増殖を阻害して、より低いレベルのＡＴＰを生じる。それ故、ＧＦＯＲがキシリトールを作製する場合、それは、リグノセルロース系供給原料からのエタノール産生中にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）が通常遭遇する他の全てのエネルギー消費ストレスに対処するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の能力を減少する。ＺＷ８００は、ＺＷ６５８とは対照的に、キシリトール関連ストレスに取り組む必要がないため、それは、より多くのキシロースを消費し、より多くのＡＴＰを産生し、そして最も高いレベルのストレスに遭遇する場合、発酵の後期段階中により多くのエタノールを作製する。
【０１７９】
実施例１０
ＺＷ８００からの選択マーカーの取り出し、および得られた株、ＺＷ８０１−４の特徴付け
Ｃｒｅ発現構築物、ｐＺＢ１８８−Ｋａｎ／Ｃｒｅの作製
実施例３に記載のように、ＺＷ８００におけるＧＦＯＲオープンリーディングフレームに挿入されたＳｐｅｃｒ−カセットは、２つの野生型ｌｏｘＰ部位の間に挟まれている。この配置は、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用することによって、染色体から選択マーカーを取り出すことを容易にしている（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４６７−４８６；リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、上掲；トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら（２０００年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４４（２）：１８５−１９３）。しかし、これを行うために、第１に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるＣｒｅ発現ベクター（図２２）を作製する必要があった。Ｃｒｅ発現ベクターの前駆体はｐＺＢ１８８／Ｋａｎであり、実施例４において詳述した。簡単に説明すると、ｐＺＢ１８８／Ｋａｎは両方の細菌種の複製開始点を有するため、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるシャトルベクターである。それはまた、カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｋａｎｒ−カセット）を含有する。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重消化し、そして大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次の工程は、Ｃｒｅ−発現カセットを作製することであり、そしてプライマー１７および１８を使用するＰＣＲによって、これを達成した。Ｃｒｅ−発現カセットの増幅のために使用したＤＮＡテンプレートは、そのプロモーターを含むバクテリオファージＰＩ Ｃｒｅリコンビナーゼの完全長の遺伝子を含有するプラスミド（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら（１９８６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７（２）：１９７−２１２）であった。
プライマー１７（配列番号３５）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃａｔｇｇＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣ
プライマー１８（配列番号３６）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇｇｃｃｇｃＴＴＡＡＴＧＧＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣ
【０１８０】
プライマー１７（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｃｒｅ開始コドンから約２００ｂｐ上流にあるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４５３配列のｎｔ２８６〜３０７にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｃｏＩ部位に対応する。プライマー１８（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｃｒｅオープンリーディングフレームの他方の末端で、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｘ０３４５３配列のｎｔ１５２３〜１５０３に結合する一方、小文字は、このプライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位を示す。１２３８ｂｐのＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重消化し、そしてＣｒｅリコンビナーゼの完全なオープンリーディングフレームおよびその推定プロモーターを含有する、得られたＤＮＡフラグメント（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら、１９８６年、上掲）を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、Ｃｒｅ−発現カセットを、標準的な連結反応において上述したｐＺＢ１８８／Ｋａｎ ＤＮＡフラグメントのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。連結反応混合物のアリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートし、そして形質転換された細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをカナマイシン耐性形質転換体の１つから単離し、次いで、この調製物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０（ｄｃｍ−、ｄａｍ−）に導入して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の以後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得た（以降を参照のこと）。Ｃｒｅ発現ベクターｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅのプラスミド地図を図２２に示す。
【０１８１】
ＺＷ８００の染色体から選択マーカーを取り出すためのＣｒｅ処置およびＣｒｅ発現ベクターのキュアリング
バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）は、特定の３４ｂｐのＤＮＡ配列、８ｂｐの非対称コアにフランキングする２つの１３ｂｐの逆方向反復を含有する「ｌｏｘＰ部位」を認識することが可能である（スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、１９８１年、上掲；リー（Ｌｅｅ）およびサイトウ（Ｓａｉｔｏ）、上掲；トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら、上掲）。Ｃｒｅはまた、２つの同一のｌｏｘＰ部位の間に配置される任意の介在ＤＮＡフラグメントを切り出すことが可能であり、そして切り出し反応は極めて迅速である。ＧＦＯＲオープンリーディングフレームからＳｐｅｃｒ−カセットを取り出すために、Ｃｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）をＺＷ８００に導入した。形質転換プロトコルは、本質的に実施例５に記載のとおりであったが、回収期間後、Ｃｒｅ発現ベクターの選択因子である３５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＭＭＧ培地上で、細胞をプレート化した。Ｃｒｅにより染色体から回収したＳｐｅｃｒ−カセットは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができないＤＮＡの環状片（ｃｉｒｃｌｕｌａｒ ｐｉｅｃｅ）であるため、このプロセスから回収した一次形質転換体は、スペクチノマイシンに対してもはや耐性ではなかった。３０℃、嫌気条件下で４８時間のインキュベーション期間後、Ｋａｎｒ／Ｓｐｅｃｓ一次形質転換体のうちの２つを、Ｃｒｅプラスミドキュアリングプロセスに供した。ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができるが、カナマイシンを含有しない培地で細胞を増殖させることによって、このプラスミドをキュアリングすることは比較的容易である。本発明においてＣｒｅ発現ベクターをキュアリングするために、細胞を、高温度（３７℃）で、カナマイシンを含有しない液体ＭＭＧ培地で増殖させた；細胞を、同じ組成を伴う新鮮増殖培地に、２４〜３６時間ごとに移した。少なくとも５０代が生じた後、単一のコロニーをＭＭＧプレート上で単離し、そして両方の本来の一次形質転換体由来の５個のコロニーを、さらなる特徴付けのために無作為に選択した。予想したとおり、これらのうち、カナマイシン（３５０μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＭＧプレート上で増殖することが可能なコロニーは認められなかった。カナマイシン上で増殖することができないことは、プラスミドキュアリングプロセスが成功したことを良好に示すものであったが、この結果を、Ｃｒｅ−発現カセットにハイブリダイズするプライマーを使用するコロニーＰＣＲによって確認した。これらの実験に基づいて、Ｃｒｅ処置した、プラスミドがキュアリングされたＺＷ８００誘導体のうち３つを、さらなる特徴付けのために選択したが、これらの株を、以降、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−５およびＺＷ８０１−６と称する。
【０１８２】
これらの株が、阻害濃度の酢酸塩の存在下で、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物においてどの程度良好に作動するかを調べるために、振盪フラスコ実験を実施した。この分析には、ＺＷ６５８およびＺＷ８００も含めた。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において３０℃で約３．０のＯＤ６００まで増殖させ、そして１５ｍｌ実験培養のために１０％播種物を使用した。後者を、５０ｍｌ試験管において、３０℃で、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させた。増殖培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトール、４０ｍＭのＫＨＣＯ３、９５ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、および７．７ｇ／Ｌ酢酸塩を含有した；初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。多様な時間において、実施例６において先に記載のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、培養物のアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして全ての値をｇ／Ｌで報告する。
【０１８３】
表５に示すように、ＺＷ６５８は、６６．３５ｇ／Ｌのエタノールを産生し、そして後に４０．６ｇ／Ｌの残留キシロースを残した。また、ＺＷ６５８は機能性ＧＦＯＲ酵素を有したため、それは、３．１９ｇ／Ｌの所望されない副産物キシリトールを産生した。他の並行実験において先に観察されたものと同様に、ＺＷ８００は、ＺＷ６５８より１７％多いキシロースを消費し、そして６．２％多いエタノールを産生し、そしてそれは、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６では僅かに良好な結果が得られたが、これらの差異は、おそらく実験誤差の範囲内であり、そして統計的に有意ではない。この実験で観察されたＺＷ８０１−５の性能がそれほど良好ではなかったことについては、解明されていないが、それ以上調べなかった。これらの結果に基づいて、さらなる分析のために、株ＺＷ８０１−４を選択した。
【０１８４】
【表６】
【０１８５】
ＺＷ８０１−４が少なくともＺＷ８００と同様に作動したことを示唆した振盪フラスコ実験の結果を確認するために、これらの２つの株を、ｐＨ制御条件下で比較した。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する培地において、３０℃で増殖させた。ＯＤ６００が約４．６に到達したら、種培養物の１７ｍｌアリコートを使用して、１５３ｍｌの増殖培地を含有するｐＨ制御バイオリアクターに播種した。最終的な１７０ｍｌ培養物は、１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトールおよび７．２ｇ／Ｌの酢酸塩を含有した。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した；混合速度は約１５０ｒｐｍであった。多様な時間において、上記のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、バイオリアクターから培養物のアリコートを取り出し、そしてまた、ＯＤ６００もモニターした。これらの実験条件下では、ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の増殖曲線は、ほとんど重ね合わせることができた（図２３Ａ）。グルコースおよびキシロース消費の時間経過はまた、事実上同一であり、そして両方の株は、同様の動態で同じ量のエタノールを産生した（図２３Ｂ）。さらに加えて、これらの株のいずれも、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。これらの観察に基づいて、本発明者らは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームからＳｐｅｃｒ−カセットを取り出しても、ＧＦＯＲ酵素活性が回復または部分的に回復しなかったこと、およびこの操作は発酵性能に有害な影響を及ぼさなかったことを結論付けている。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４は両方とも機能性ＧＦＯＲ酵素を有する親株（ＺＷ６５８）より良好に作動したが、ＺＷ８０１−４は抗生物質に対する耐性を付与する外来遺伝子を含有しないため、商業的アプリケーションに好適な株は、ＺＷ８０１−４である。ＺＷ８０１−４由来のゲノムＤＮＡの配列解析は、正確なＣｒｅ切り出し事象が実際に生じた明白な証拠を提供した。ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲオープンリーディングの完全なヌクレオチド配列（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）を配列番号３７に示し、そして図２４は、翻訳された変異体配列と野生型ＧＦＯＲタンパク質とのアラインメントを示し；後者は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のｎｔ６８３７５１〜６８５０５２の逆相補鎖によってコードされる。予想したとおり、Ｓｐｅｃｒ−カセットのＣｒｅ切り出しは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型ｌｏｘＰ部位を残し、そしてこの挿入事象は、タンパク質を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じた；「ｌｏｘ ｓｃａｒ」の局在を、灰色で強調された残基によって示す。自殺構築物の設計の結果として、変異体ヌクレオチド配列もまた、同じ場所で生来の野生型ＧＦＯＲヌクレオチド配列のうち約７２ｂｐを失っている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株。
【請求項２】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換えザイモモナス株。
【請求項３】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、相同組み換えによって、株のグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子に導入される挿入である、請求項１に記載の組み換えザイモモナス株。
【請求項４】
ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６からなる群から選択された株として同定される、請求項１に記載のザイモモナス株。
【請求項５】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変を伴わない株と比較して、低減した量のキシリトールを産生する、請求項１に記載のザイモモナス株。
【請求項６】
実質的にキシリトールを産生しない、請求項５に記載のザイモモナス株。
【請求項７】
ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程；および
ｂ）（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、該改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる工程
を含む、低減したＧＦＯＲ活性を有する、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス株を作製するための方法。
【請求項８】
（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株は、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、Ｚ．モビリス８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＭ４（ｐＺＢ５）およびＺ．モビリスＣＰ４：ｐＺＢ５からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株。
【請求項２】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換えザイモモナス株。
【請求項３】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、相同組み換えによって、株のグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子に導入される挿入である、請求項１に記載の組み換えザイモモナス株。
【請求項４】
ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６からなる群から選択された株として同定される、請求項１に記載のザイモモナス株。
【請求項５】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変を伴わない株と比較して、低減した量のキシリトールを産生する、請求項１に記載のザイモモナス株。
【請求項６】
実質的にキシリトールを産生しない、請求項５に記載のザイモモナス株。
【請求項７】
ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程；および
ｂ）（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、該改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる工程
を含む、低減したＧＦＯＲ活性を有する、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス株を作製するための方法。
【請求項８】
（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株は、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、Ｚ．モビリス８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＭ４（ｐＺＢ５）およびＺ．モビリスＣＰ４：ｐＺＢ５からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１０−５０４７５８（Ｐ２０１０−５０４７５８Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０４３３（Ｐ２００９−５３０４３３）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２０９５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３３６３８
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０９０８７７３７）ミッドウェスト・リサーチ・インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２０９５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３３６３８
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０９０８７７３７）ミッドウェスト・リサーチ・インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
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