カロチノイドを高濃度で生産する微生物及びそれを使用したカロチノイド生産方法
【課題】パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）菌株及び該菌株を使用したカロチノイド生産方法を提供する。
【解決手段】パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得られた変異株パラコッカスＲＦ１、及び前記変異株を使用したアスタキサンチンを含むカロチノイドを母菌株より７倍以上の高効率で生産する方法を提供する。本発明によるアスタキサンチンを含むカロチノイドの大量生産技術は、化粧品、食品及び飼料など多様な産業に有用に使用することができる。
【解決手段】パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得られた変異株パラコッカスＲＦ１、及び前記変異株を使用したアスタキサンチンを含むカロチノイドを母菌株より７倍以上の高効率で生産する方法を提供する。本発明によるアスタキサンチンを含むカロチノイドの大量生産技術は、化粧品、食品及び飼料など多様な産業に有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）菌株及び該菌株を使用したカロチノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）の生産方法に関するもので、より詳細にはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得られた変異株パラコッカスＲＦ１及び該変異株を使用したアスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）を含むカロチノイドの高効率生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロチノイドは、抗酸化活性を有しているＣ４０イソプレノイド化合物（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として自然界に広く分布している一群の色素を総称するもので、現在まで知られたカロチノイドは、６百余種に至る。これらは、それぞれ異なる形態で存在し、分子構造によって黄色、赤色、朱色、橙色など多くの色で存在する。その例としてβ−カロテン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ；ニンジンの橙色色素）、リコピン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ；トマトの赤色色素）、フコキサンチン（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ；海藻の黄褐色または茶色色素）などがある。カロチノイドは、人体内でビタミンＡの前駆体としてはたらき、酸化防止効果と有害酸素消去作用、癌細胞増殖抑制作用及び発癌抑制作用が強く、循環器疾患、癌及び成人病などを予防する効能を有していることが知られている。最近には、カロチノイドが直接的な紫外線による身体の免疫機能を高めて、紫外線露出から肌の損傷を減らしたりメラニン生成を抑制したりすることが解明されて、ヨーロッパやアメリカで美容素材として脚光を浴び始めた。現在カロチノイドは、健康食品素材（栄養補助剤）、人間を対象にした薬学製剤と食品着色剤または動物用飼料の色素などに使用されている。
【０００３】
アスタキサンチンは、主にエビ、マダイ（ｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ）、サケ及びロブスターなどの海洋動物組織に存在することが知られている（非特許文献１〜３）。アスタキサンチンは、正常な好気的代謝過程中に活性酸素が細胞内ＤＮＡ、タンパク質、脂質などを損傷させると共に細胞と組織の老化及び発癌を誘発する反応を抑制するだけでなく、ヒドロキシラジカルまたはペルオキシラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙ ｏｒ ｐｅｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ）の生成を抑制する作用をもつ（非特許文献４、５）。また、免疫調節活性（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び心保護効果（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）を有することが知られている（非特許文献６）。特に、アスタキサンチンの抗酸化力は、他のカロチノイドの１０倍以上で、α−トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）の１００倍以上であることが知られている。現在まで、アスタキサンチンの毒性に対しては、報告されたことがない。したがって、アスタキサンチンは、神経疾患、癌、免疫疾患及び心臓血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）などを含む多様な疾患の治療及び予防に使用されていて、それに対する研究が続けられている（非特許文献７〜９）。また、アスタキサンチンは、産業的に色素増進物質に使用されていて、韓国では「パフィア色素」という名称で食品添加物に登録されている。このような理由から、アスタキサンチンの需要は、毎年１５％以上の消費成長を見せており、それによってアスタキサンチンの重要性が台頭してきている。
【０００４】
最近、スイスのホフマン・ラ・ロシュ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）社でアスタキサンチンの化学合成法が開発されたが、化学合成で製造されたアスタキサンチンは、天然アスタキサンチンに比べて低い生体吸収率を示し、食品添加剤としての安全性が問題になっていて、ヨーロッパの一部国家でのみ使用が許可されている状態である。したがって、天然アスタキサンチンの合成法に関心が集中していて、アスタキサンチンを生産する微生物を使用したアスタキサンチンの製造に商業的関心が集まっている。現在、アスタキサンチンを生産することが知られた微生物には、酵母であるファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、緑色藻類であるヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、グラム陽性菌ブレビバクテリウム１０３（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ １０３）、グラム陰性菌アグロバクテリウム・アウランチアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、パラコッカス・マルクシイ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ）及びパラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などが知られている。しかし、このような微生物は、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができないので、高濃度でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができる菌株の開発が求められている。
【０００５】
以上のことに鑑みて、本発明者はパラコッカス属の微生物に放射線の照射を通じて得られた突然変異株の中から、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができる菌株を選別することによって、本発明を完成した。
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｔａ等，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ．，１９８３年，第４９巻，１８５５−１８６９頁
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９１年，第１１巻，２９７−３２６頁
【非特許文献３】Ｎｅｌｉｓ等，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１年，第７０巻，１８１−１９１頁
【非特許文献４】Ｐａｌｏｚｚａ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２年，第２９７巻，２９１−２９５頁
【非特許文献５】Ｓｈｉｍｉｄｚｕ等，Ｆｉｓｈ Ｓｃｉ．，１９９６年，第６２巻，１３４−１３７頁
【非特許文献６】Ｊｙｏｎｕｃｈｉ等，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３年，第１９巻，２６９−２８０頁
【非特許文献７】Ｂｅａｌ，Ｈ．Ｆ．，Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１９９１年，第３巻，２１−２７頁
【非特許文献８】Ｃｈｅｗ等，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９年，第１９巻，１８４９−１８５３頁
【非特許文献９】Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｅ．，Ａｒｃｈ．Ｌａｔｉｎｏａｍ．Ｎｕｔｒ．，１９９２年，第４２巻，４０９−４１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、放射線の照射を通じて得られた、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができるパラコッカスＦＲ１菌株、及びそれを使用したカロチノイド生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属変異菌株を提供する。
【０００９】
また、本発明は、
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養してカロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
とを含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法を提供する。
【００１０】
同時に、本発明は、
１）寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
とを含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法を提供する。
【００１１】
本発明（１）は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）変異菌株である。
本発明（２）は、パラコッカス属母菌株と比較してカロチノイドを５〜１０倍の高効率で生産することを特徴とする、本発明（１）の菌株である。
本発明（３）は、
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養して、カロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
を含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法である。
本発明（４）は、工程１）のパラコッカス属菌株が、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（５）は、工程１）の放射線が、ガンマ線、電子線及びイオンビームからなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（６）は、前記放射線が、ガンマ線であることを特徴とする、本発明（５）の方法である。
本発明（７）は、前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、本発明（６）の方法である。
本発明（８）は、前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、本発明（７）の方法である。
本発明（９）は、工程１）の放射線が、時間当り３０〜１００Ｇｙの線量で照射されることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１０）は、工程１）の放射線が、総吸収線量が１００〜５００Ｇｙになるように照射されることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１１）は、工程２）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１２）は、工程２）の培養が、２０〜３０℃の温度で培養することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１３）は、工程２）の培養が、３〜５日間培養することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１４）は、工程２）の選別が、パラコッカス属母菌株のカロチノイドの含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１５）は、
１）本発明（１）の菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
を含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法である。
本発明（１６）は、工程１）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、本発明（１５）の方法である。
本発明（１７）は、高効率が、パラコッカス属母菌株のカロチノイド生産量に比べて５〜１０倍であることを特徴とする、本発明（１５）の方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のパラコッカス（ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線照射を通じて得た変異株パラコッカスＲＦ１は、アスタキサンチンを含むカロチノイドを母菌株より７倍以上高効率で生産することができることが確認され、アスタキサンチンは、様々な重要な生物学的機能を有し、化粧品、食品及び飼料産業などに有用に使用できる物質であることが知られているので、本発明の変異株及びそれを使用したアスタキサンチンの大量生産技術は、化粧品、食品または飼料産業に有用に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属変異菌株を提供する。
【００１５】
前記変異菌株は、下記の工程を含む製造方法によって製造される：
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養してカロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程。
前記の方法において、工程１）のパラコッカス属菌株は、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることが好ましいが、それに限定されない。放射線は、ガンマ線、電子線またはイオンビームなどすべて使用することができ、ガンマ線を使用することが好ましい。前記ガンマ線は、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されるガンマ線を使用して照射することができ、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることがより好ましいが、これに限定されない。前記ガンマ線の照射線量は、時間当り３０〜１００Ｇｙであることが好ましく、総吸収線量は１００〜５００Ｇｙであることが好ましいが、これに限定されない。放射線の照射は、微生物の染色体構造を破壊して、染色体構造を再結合させることによって発生する突然変異を惹起させる。
【００１６】
本発明では、パラコッカス（ＭＢＩＣ０１１４３）母菌株が初期対数増殖期（ｅａｒｌｙ ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）まで育った以後に、滅菌水で洗浄しかつ生理食塩水に懸濁した後、コバルト（Ｃｏ）−６０ガンマ線照射施設を使用して室温で時間当り５０Ｇｙの線量率で１００Ｇｙの総吸収線量を得るように照射した。
【００１７】
前記の方法において、工程２）の培養は、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）または、これらの改変培地を使用することが好ましく、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）培地を使用することがより好ましいが、これに限定されない。前記培養は、培養温度が２０〜３０℃であることが好ましく、２５℃であることがさらに好ましいが、これに限定されない。前記培養は、３〜５日間培養することが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本発明では、放射線の照射以後の微生物懸濁液を、滅菌水で菌体の濃度が一平板培地当たり２００個程度になるように希釈して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）培地に塗抹した後、２５℃で３〜５日間培養した。
【００１９】
前記の方法において、工程２）の選別は、パラコッカス属母菌株のカロチノイド含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することが好ましく、７〜８倍増加したものを選別することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明では、野生型パラコッカス及び変異株パラコッカスの細胞成長速度及び最終細胞濃度を比較するため、前記それぞれの菌株の培地に分光光度計を使用して吸光度を測定した。その結果、野生型パラコッカスは２時間後、変異株パラコッカスＲＦ１は５時間後に、それぞれ対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に到逹したが、対数増殖期での比増殖速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）は、野生株と変異株で類似の値を示し、最終細胞濃度も類似していた。
【００２１】
本発明では、野生型パラコッカス及び変異株パラコッカスのカロチノイド濃度を比較するため、前記微生物をそれぞれ遠心分離後、洗浄して細胞を破砕した後、培養して遠心分離し、上澄み液に抽出されたカロチノイド含量に対して、分光光度計を使用して吸光度を測定した。その結果、本発明で開発した変異株パラコッカスＲＦ１のカロチノイド含量が、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の含量に比べて約７倍増加した。
【００２２】
本発明者等は、既存のパラコッカス菌株よりカロチノイド含量が顕著に高い変異株を「パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）」と命名して、前記菌株を２００７年１０月２２日付けで国際寄託機関である韓国生命工学研究院内遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰ）。
【００２３】
また、本発明は、
１）寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
とを含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率的に生産する方法を提供する。
【００２４】
前記方法で、工程１）の培養は、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地を使用することが好ましく、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）培地を使用することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
前記方法で、工程３）のカラムクロマトグラフィーでは、シリカゲル、セファデックス、ＲＰ−１８、ポリアミド、トヨパール及びＸＡＤ樹脂からなる群から選択された充填剤を使用したカラムクロマトグラフィーを実施して精製することができる。カラムクロマトグラフィーは、必要によって適切な充填剤を選択して数回実施することができる。前記カラムクロマトグラフィーを使用したカロチノイド分離方法は、文献（Ｋａｎｇ、Ｍ．−Ｊ等．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５年，第１５（４）卷、８８０−８８６頁）を参考にした。
【００２６】
前記方法で、高効率とは、パラコッカス属母菌株に比較して５〜１０倍を生産することができることを特徴とする。
【００２７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００２８】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容は実施例によって限定されない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞放射線の照射によるパラコッカス菌株の突然変異株製造
本発明者等は、パラコッカスＭＢＩＣ０１１４３（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）微生物（海洋バイオテクノロジー研究所カルチャーコレクション（ＭＢＩＣ）、日本国岩手県釜石市平田３−７５−１）が、初期対数増殖期（ｅａｒｌｙ ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）まで育った以後に、前記微生物を滅菌水で２回洗浄した後、０．９５％生理食塩水に６００ｎｍでの吸光度が１になるように懸濁した。ガンマ線の照射は、韓国原子力研究院放射線科研究所内の線源３０００Ｃｉ、Ｃｏ−６０ガンマ線照射施設を使用して、室温（１２±１℃）で時間当り５０Ｇｙの線量率で照射した。微生物懸濁液のガンマ線の照射線量は、総吸収線量１００Ｇｙが得られるようにし、吸収線量の確認はアラニン放射線量計（ａｌａｎｉｎｅ ｄｏｓｉｍｅｔｅｒ）を使用した。総吸収線量の誤差は、±５％であった。
【００３０】
放射線の照射以後の微生物懸濁液を滅菌水で菌体の濃度が一平板培地当たり２００個程度になるように希釈して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ ０９７９）に塗抹した後、２５℃で３〜５日間培養後、突然変異株を分離した。前記方法によって得られた変異株の中で、野生株より特徴的に色が濃い変異株を選別して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）液体培地に振盪培養してカロチノイドの含量を測定した。
【００３１】
前記突然変異株の中で既存のパラコッカス菌株よりカロチノイド含量が顕著に高い変異株を「パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）」と命名して、前記菌株を、２００７年１０月２２日付けで国際寄託機関である韓国生命工学研究院内遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰ）。
【００３２】
＜実施例２＞細胞増殖速度測定
本発明者等は、変異株パラコッカスＲＦ１及び野生株パラコッカスの成長速度を測定して比較した。野生株と変異株をそれぞれ２０ｍｌのＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）に接種して振盪インキュベーター（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２５℃、１５０ｒｐｍで培養した。Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を使用して、６００ｎｍで吸光度を測定することによってＭＢでの各菌株の細胞増殖を測定した。前記測定の結果、図１に見られるように野生型パラコッカスは、２時間後に対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に到逹する一方、変異株パラコッカスＲＦ１は、５時間後に対数期に到逹した。しかし、対数増殖期での比増殖速度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）は、野生株と変異株で類似の値を示し、最終細胞濃度も類似していた。
【００３３】
＜実施例３＞カロチノイド含量測定
本発明者等は、カロチノイドの濃度分析のために微生物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）後、洗浄して高純度アセトン１ｍｌを入れてホモゲナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で細胞を破砕し、２０分間培養した後、遠心分離して上澄み液に抽出されたカロチノイド含量を測定した。前記抽出物に対してＵｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を使用して、４７４ｎｍで吸光度を測定した。その結果、表１にみられるように変異株のカロチノイド含量は、野生株に比べて約７倍以上増加した。
【００３４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得た変異株パラコッカスＲＦ１は、様々な重要な生物学的機能を有し、化粧品、食品または飼料産業などに有用に使用され得る物質として知られたアスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産することができるので、本発明の変異株及びこれを使用したアスタキサンチンの大量生産技術は、化粧品、食品または飼料産業に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株及び母菌株であるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株の成長曲線を比較したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）菌株及び該菌株を使用したカロチノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）の生産方法に関するもので、より詳細にはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得られた変異株パラコッカスＲＦ１及び該変異株を使用したアスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）を含むカロチノイドの高効率生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロチノイドは、抗酸化活性を有しているＣ４０イソプレノイド化合物（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として自然界に広く分布している一群の色素を総称するもので、現在まで知られたカロチノイドは、６百余種に至る。これらは、それぞれ異なる形態で存在し、分子構造によって黄色、赤色、朱色、橙色など多くの色で存在する。その例としてβ−カロテン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ；ニンジンの橙色色素）、リコピン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ；トマトの赤色色素）、フコキサンチン（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ；海藻の黄褐色または茶色色素）などがある。カロチノイドは、人体内でビタミンＡの前駆体としてはたらき、酸化防止効果と有害酸素消去作用、癌細胞増殖抑制作用及び発癌抑制作用が強く、循環器疾患、癌及び成人病などを予防する効能を有していることが知られている。最近には、カロチノイドが直接的な紫外線による身体の免疫機能を高めて、紫外線露出から肌の損傷を減らしたりメラニン生成を抑制したりすることが解明されて、ヨーロッパやアメリカで美容素材として脚光を浴び始めた。現在カロチノイドは、健康食品素材（栄養補助剤）、人間を対象にした薬学製剤と食品着色剤または動物用飼料の色素などに使用されている。
【０００３】
アスタキサンチンは、主にエビ、マダイ（ｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ）、サケ及びロブスターなどの海洋動物組織に存在することが知られている（非特許文献１〜３）。アスタキサンチンは、正常な好気的代謝過程中に活性酸素が細胞内ＤＮＡ、タンパク質、脂質などを損傷させると共に細胞と組織の老化及び発癌を誘発する反応を抑制するだけでなく、ヒドロキシラジカルまたはペルオキシラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙ ｏｒ ｐｅｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ）の生成を抑制する作用をもつ（非特許文献４、５）。また、免疫調節活性（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び心保護効果（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）を有することが知られている（非特許文献６）。特に、アスタキサンチンの抗酸化力は、他のカロチノイドの１０倍以上で、α−トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）の１００倍以上であることが知られている。現在まで、アスタキサンチンの毒性に対しては、報告されたことがない。したがって、アスタキサンチンは、神経疾患、癌、免疫疾患及び心臓血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）などを含む多様な疾患の治療及び予防に使用されていて、それに対する研究が続けられている（非特許文献７〜９）。また、アスタキサンチンは、産業的に色素増進物質に使用されていて、韓国では「パフィア色素」という名称で食品添加物に登録されている。このような理由から、アスタキサンチンの需要は、毎年１５％以上の消費成長を見せており、それによってアスタキサンチンの重要性が台頭してきている。
【０００４】
最近、スイスのホフマン・ラ・ロシュ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）社でアスタキサンチンの化学合成法が開発されたが、化学合成で製造されたアスタキサンチンは、天然アスタキサンチンに比べて低い生体吸収率を示し、食品添加剤としての安全性が問題になっていて、ヨーロッパの一部国家でのみ使用が許可されている状態である。したがって、天然アスタキサンチンの合成法に関心が集中していて、アスタキサンチンを生産する微生物を使用したアスタキサンチンの製造に商業的関心が集まっている。現在、アスタキサンチンを生産することが知られた微生物には、酵母であるファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、緑色藻類であるヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、グラム陽性菌ブレビバクテリウム１０３（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ １０３）、グラム陰性菌アグロバクテリウム・アウランチアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、パラコッカス・マルクシイ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ）及びパラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などが知られている。しかし、このような微生物は、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができないので、高濃度でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができる菌株の開発が求められている。
【０００５】
以上のことに鑑みて、本発明者はパラコッカス属の微生物に放射線の照射を通じて得られた突然変異株の中から、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができる菌株を選別することによって、本発明を完成した。
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｔａ等，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ．，１９８３年，第４９巻，１８５５−１８６９頁
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９１年，第１１巻，２９７−３２６頁
【非特許文献３】Ｎｅｌｉｓ等，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１年，第７０巻，１８１−１９１頁
【非特許文献４】Ｐａｌｏｚｚａ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２年，第２９７巻，２９１−２９５頁
【非特許文献５】Ｓｈｉｍｉｄｚｕ等，Ｆｉｓｈ Ｓｃｉ．，１９９６年，第６２巻，１３４−１３７頁
【非特許文献６】Ｊｙｏｎｕｃｈｉ等，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３年，第１９巻，２６９−２８０頁
【非特許文献７】Ｂｅａｌ，Ｈ．Ｆ．，Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１９９１年，第３巻，２１−２７頁
【非特許文献８】Ｃｈｅｗ等，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９年，第１９巻，１８４９−１８５３頁
【非特許文献９】Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｅ．，Ａｒｃｈ．Ｌａｔｉｎｏａｍ．Ｎｕｔｒ．，１９９２年，第４２巻，４０９−４１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、放射線の照射を通じて得られた、高い含量でアスタキサンチンを含むカロチノイドを生産することができるパラコッカスＦＲ１菌株、及びそれを使用したカロチノイド生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属変異菌株を提供する。
【０００９】
また、本発明は、
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養してカロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
とを含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法を提供する。
【００１０】
同時に、本発明は、
１）寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
とを含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法を提供する。
【００１１】
本発明（１）は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）変異菌株である。
本発明（２）は、パラコッカス属母菌株と比較してカロチノイドを５〜１０倍の高効率で生産することを特徴とする、本発明（１）の菌株である。
本発明（３）は、
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養して、カロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
を含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法である。
本発明（４）は、工程１）のパラコッカス属菌株が、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（５）は、工程１）の放射線が、ガンマ線、電子線及びイオンビームからなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（６）は、前記放射線が、ガンマ線であることを特徴とする、本発明（５）の方法である。
本発明（７）は、前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、本発明（６）の方法である。
本発明（８）は、前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、本発明（７）の方法である。
本発明（９）は、工程１）の放射線が、時間当り３０〜１００Ｇｙの線量で照射されることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１０）は、工程１）の放射線が、総吸収線量が１００〜５００Ｇｙになるように照射されることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１１）は、工程２）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１２）は、工程２）の培養が、２０〜３０℃の温度で培養することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１３）は、工程２）の培養が、３〜５日間培養することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１４）は、工程２）の選別が、パラコッカス属母菌株のカロチノイドの含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することを特徴とする、本発明（３）の方法である。
本発明（１５）は、
１）本発明（１）の菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
を含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法である。
本発明（１６）は、工程１）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、本発明（１５）の方法である。
本発明（１７）は、高効率が、パラコッカス属母菌株のカロチノイド生産量に比べて５〜１０倍であることを特徴とする、本発明（１５）の方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のパラコッカス（ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線照射を通じて得た変異株パラコッカスＲＦ１は、アスタキサンチンを含むカロチノイドを母菌株より７倍以上高効率で生産することができることが確認され、アスタキサンチンは、様々な重要な生物学的機能を有し、化粧品、食品及び飼料産業などに有用に使用できる物質であることが知られているので、本発明の変異株及びそれを使用したアスタキサンチンの大量生産技術は、化粧品、食品または飼料産業に有用に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属変異菌株を提供する。
【００１５】
前記変異菌株は、下記の工程を含む製造方法によって製造される：
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養してカロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程。
前記の方法において、工程１）のパラコッカス属菌株は、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることが好ましいが、それに限定されない。放射線は、ガンマ線、電子線またはイオンビームなどすべて使用することができ、ガンマ線を使用することが好ましい。前記ガンマ線は、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されるガンマ線を使用して照射することができ、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることがより好ましいが、これに限定されない。前記ガンマ線の照射線量は、時間当り３０〜１００Ｇｙであることが好ましく、総吸収線量は１００〜５００Ｇｙであることが好ましいが、これに限定されない。放射線の照射は、微生物の染色体構造を破壊して、染色体構造を再結合させることによって発生する突然変異を惹起させる。
【００１６】
本発明では、パラコッカス（ＭＢＩＣ０１１４３）母菌株が初期対数増殖期（ｅａｒｌｙ ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）まで育った以後に、滅菌水で洗浄しかつ生理食塩水に懸濁した後、コバルト（Ｃｏ）−６０ガンマ線照射施設を使用して室温で時間当り５０Ｇｙの線量率で１００Ｇｙの総吸収線量を得るように照射した。
【００１７】
前記の方法において、工程２）の培養は、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）または、これらの改変培地を使用することが好ましく、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）培地を使用することがより好ましいが、これに限定されない。前記培養は、培養温度が２０〜３０℃であることが好ましく、２５℃であることがさらに好ましいが、これに限定されない。前記培養は、３〜５日間培養することが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本発明では、放射線の照射以後の微生物懸濁液を、滅菌水で菌体の濃度が一平板培地当たり２００個程度になるように希釈して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）培地に塗抹した後、２５℃で３〜５日間培養した。
【００１９】
前記の方法において、工程２）の選別は、パラコッカス属母菌株のカロチノイド含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することが好ましく、７〜８倍増加したものを選別することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明では、野生型パラコッカス及び変異株パラコッカスの細胞成長速度及び最終細胞濃度を比較するため、前記それぞれの菌株の培地に分光光度計を使用して吸光度を測定した。その結果、野生型パラコッカスは２時間後、変異株パラコッカスＲＦ１は５時間後に、それぞれ対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に到逹したが、対数増殖期での比増殖速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）は、野生株と変異株で類似の値を示し、最終細胞濃度も類似していた。
【００２１】
本発明では、野生型パラコッカス及び変異株パラコッカスのカロチノイド濃度を比較するため、前記微生物をそれぞれ遠心分離後、洗浄して細胞を破砕した後、培養して遠心分離し、上澄み液に抽出されたカロチノイド含量に対して、分光光度計を使用して吸光度を測定した。その結果、本発明で開発した変異株パラコッカスＲＦ１のカロチノイド含量が、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の含量に比べて約７倍増加した。
【００２２】
本発明者等は、既存のパラコッカス菌株よりカロチノイド含量が顕著に高い変異株を「パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）」と命名して、前記菌株を２００７年１０月２２日付けで国際寄託機関である韓国生命工学研究院内遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰ）。
【００２３】
また、本発明は、
１）寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
とを含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率的に生産する方法を提供する。
【００２４】
前記方法で、工程１）の培養は、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地を使用することが好ましく、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）培地を使用することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
前記方法で、工程３）のカラムクロマトグラフィーでは、シリカゲル、セファデックス、ＲＰ−１８、ポリアミド、トヨパール及びＸＡＤ樹脂からなる群から選択された充填剤を使用したカラムクロマトグラフィーを実施して精製することができる。カラムクロマトグラフィーは、必要によって適切な充填剤を選択して数回実施することができる。前記カラムクロマトグラフィーを使用したカロチノイド分離方法は、文献（Ｋａｎｇ、Ｍ．−Ｊ等．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５年，第１５（４）卷、８８０−８８６頁）を参考にした。
【００２６】
前記方法で、高効率とは、パラコッカス属母菌株に比較して５〜１０倍を生産することができることを特徴とする。
【００２７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００２８】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容は実施例によって限定されない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞放射線の照射によるパラコッカス菌株の突然変異株製造
本発明者等は、パラコッカスＭＢＩＣ０１１４３（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）微生物（海洋バイオテクノロジー研究所カルチャーコレクション（ＭＢＩＣ）、日本国岩手県釜石市平田３−７５−１）が、初期対数増殖期（ｅａｒｌｙ ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）まで育った以後に、前記微生物を滅菌水で２回洗浄した後、０．９５％生理食塩水に６００ｎｍでの吸光度が１になるように懸濁した。ガンマ線の照射は、韓国原子力研究院放射線科研究所内の線源３０００Ｃｉ、Ｃｏ−６０ガンマ線照射施設を使用して、室温（１２±１℃）で時間当り５０Ｇｙの線量率で照射した。微生物懸濁液のガンマ線の照射線量は、総吸収線量１００Ｇｙが得られるようにし、吸収線量の確認はアラニン放射線量計（ａｌａｎｉｎｅ ｄｏｓｉｍｅｔｅｒ）を使用した。総吸収線量の誤差は、±５％であった。
【００３０】
放射線の照射以後の微生物懸濁液を滅菌水で菌体の濃度が一平板培地当たり２００個程度になるように希釈して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ ０９７９）に塗抹した後、２５℃で３〜５日間培養後、突然変異株を分離した。前記方法によって得られた変異株の中で、野生株より特徴的に色が濃い変異株を選別して、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）液体培地に振盪培養してカロチノイドの含量を測定した。
【００３１】
前記突然変異株の中で既存のパラコッカス菌株よりカロチノイド含量が顕著に高い変異株を「パラコッカスＲＦ１（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＦ１）」と命名して、前記菌株を、２００７年１０月２２日付けで国際寄託機関である韓国生命工学研究院内遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰ）。
【００３２】
＜実施例２＞細胞増殖速度測定
本発明者等は、変異株パラコッカスＲＦ１及び野生株パラコッカスの成長速度を測定して比較した。野生株と変異株をそれぞれ２０ｍｌのＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ）に接種して振盪インキュベーター（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２５℃、１５０ｒｐｍで培養した。Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を使用して、６００ｎｍで吸光度を測定することによってＭＢでの各菌株の細胞増殖を測定した。前記測定の結果、図１に見られるように野生型パラコッカスは、２時間後に対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に到逹する一方、変異株パラコッカスＲＦ１は、５時間後に対数期に到逹した。しかし、対数増殖期での比増殖速度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）は、野生株と変異株で類似の値を示し、最終細胞濃度も類似していた。
【００３３】
＜実施例３＞カロチノイド含量測定
本発明者等は、カロチノイドの濃度分析のために微生物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）後、洗浄して高純度アセトン１ｍｌを入れてホモゲナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で細胞を破砕し、２０分間培養した後、遠心分離して上澄み液に抽出されたカロチノイド含量を測定した。前記抽出物に対してＵｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を使用して、４７４ｎｍで吸光度を測定した。その結果、表１にみられるように変異株のカロチノイド含量は、野生株に比べて約７倍以上増加した。
【００３４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株への放射線の照射を通じて得た変異株パラコッカスＲＦ１は、様々な重要な生物学的機能を有し、化粧品、食品または飼料産業などに有用に使用され得る物質として知られたアスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産することができるので、本発明の変異株及びこれを使用したアスタキサンチンの大量生産技術は、化粧品、食品または飼料産業に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたパラコッカス属変異菌株及び母菌株であるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ０１１４３）菌株の成長曲線を比較したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）変異菌株。
【請求項２】
パラコッカス属母菌株と比較してカロチノイドを５〜１０倍の高効率で生産することを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養して、カロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
を含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法。
【請求項４】
工程１）のパラコッカス属菌株が、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程１）の放射線が、ガンマ線、電子線及びイオンビームからなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記放射線が、ガンマ線であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程１）の放射線が、時間当り３０〜１００Ｇｙの線量で照射されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
工程１）の放射線が、総吸収線量が１００〜５００Ｇｙになるように照射されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
工程２）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
工程２）の培養が、２０〜３０℃の温度で培養することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
工程２）の培養が、３〜５日間培養することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
工程２）の選別が、パラコッカス属母菌株のカロチノイドの含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
１）請求項１に記載の菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
を含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法。
【請求項１６】
工程１）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
高効率が、パラコッカス属母菌株のカロチノイド生産量に比べて５〜１０倍であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
寄託番号ＫＣＴＣ１１２２２ＢＰで寄託されたカロチノイドの高効率生産が可能なパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）変異菌株。
【請求項２】
パラコッカス属母菌株と比較してカロチノイドを５〜１０倍の高効率で生産することを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
１）パラコッカス属菌株に放射線を照射して突然変異させる工程、及び
２）工程１）の突然変異菌株を培地で培養して、カロチノイドの含量が増加した変異株を選別する工程
を含む、カロチノイドを高効率で生産するパラコッカス属変異菌株を製造する方法。
【請求項４】
工程１）のパラコッカス属菌株が、パラコッカスＭＢＩＣＯ１１４３であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程１）の放射線が、ガンマ線、電子線及びイオンビームからなる群から選択されたいずれかひとつであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記放射線が、ガンマ線であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか一つの放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性アイソトープから放出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程１）の放射線が、時間当り３０〜１００Ｇｙの線量で照射されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
工程１）の放射線が、総吸収線量が１００〜５００Ｇｙになるように照射されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
工程２）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
工程２）の培養が、２０〜３０℃の温度で培養することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
工程２）の培養が、３〜５日間培養することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
工程２）の選別が、パラコッカス属母菌株のカロチノイドの含量に比べて５〜１０倍増加したものを選別することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
１）請求項１に記載の菌株を培地で培養する工程、
２）工程１）の培養液を遠心分離して上澄み液を得る工程、及び
３）工程２）の上澄み液をカラムクロマトグラフィーに供してカロチノイドを分離する工程
を含む、アスタキサンチンを含むカロチノイドを高効率で生産する方法。
【請求項１６】
工程１）の培地が、ＭＢ（Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＤＭＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ）、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＤＮＢ（ｄｉｌｕｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、ＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、ＺＢ（Ｚｏｂｅｌｌ’ｓ ｂｒｏｔｈ）、ＤＺＢ（ｄｉｌｕｔｅ ｚｏｂｅｌｌ ｂｒｏｔｈ）またはこれらの改変培地であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
高効率が、パラコッカス属母菌株のカロチノイド生産量に比べて５〜１０倍であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１４２２７５（Ｐ２００９−１４２２７５Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０６９８３（Ｐ２００８−３０６９８３）
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【出願人】（５９７０６０６４５）コリア アトミック エナジー リサーチ インスティテュート (22)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【出願人】（５９７０６０６４５）コリア アトミック エナジー リサーチ インスティテュート (22)
【Ｆターム（参考）】
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