ガラス化生物試薬の調製
本発明は、乾燥試薬標品の製造方法に関するものであり、この方法は、１種以上の緩衝生物試薬の水溶液を調製し、（ｂ）ガラス形成性フィラー材料を、緩衝生物試薬溶液と混合して、多孔質ガラス状組成物の形成を促進するのに十分な濃度のフィラー材料を含む混合物を調製し、上記混合物を実質的に均一な液滴の形態でマルチウェル容器の各ウェルに１滴ずつ分注し、上記容器中で液滴を乾燥して試薬標品を形成する工程を含んでいる。試薬標品は水溶性で、試薬標品のＴｇは、室温で安定に存在し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料及び試薬の多孔質ガラス状態での長期保存に関する。特に、本発明は、かかる材料及び試薬のマルチウェルプレートを用いた製造法並びに保存に関する。
【背景技術】
【０００２】
室温の溶液中で単離、精製、保存できるほど十分に安定な生体活性材料は少ない。生物試薬は、通常４℃、−２０℃又は−７０℃の温度に保たれたグリセロール溶液中で保存される。これらはまとめて保存され、使用時に他の試薬と混合される。
【０００３】
生体試料の簡単で効率的な検査のための試薬を調製する際には、別々の一様な量の乾燥化学試薬製剤を得ることが重要となることが多い。生物試薬の安定化に従前使用されてきた担体又はフィラーの１種は、ガラス形成性フィラー材料である。生物試薬の溶液がガラス形成性フィラー材料（水溶性又は水膨潤性物質）に導入される。これを乾燥すると、生物試薬が固定化され安定化されたガラス状組成物が得られる。生物試薬の安定化に用いるガラス形成性フィラー材料の例については、米国特許第５０９８８９３号、同第５２００３９９号、同第５２４０８４３号を参照されたい。
【０００４】
グルコース、スクロース、マルトース、マルトトリオースのような炭水化物は、ガラス形成性物質の重要な群をなす。その他のポリヒドロキシ化合物、例えばソルビトールのような炭水化物誘導体及び化学修飾炭水化物も使用できる。ガラス形成性物質のもう一つの重要な群は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド又はポリエチレンイミンのような合成ポリマーである。
【０００５】
ガラス形成性物質のさらに別の例として、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社からＦＩＣＯＬＬ（商標）という商標で市販されているもののような糖共重合体がある。ＦＩＣＯＬＬ（商標）は分子量５０００〜１００００００であり、スクロース残基がエーテルを介して二官能性基に結合している（米国特許第３３００４７４号）。二官能性基は炭素原子数２又は３以上のアルキレンとし得るが、通常は炭素原子数は１０以下である。二官能性基は、糖残基同士を結合する役割を果たす。かかるポリマーは、例えば、糖とハロヒドリン又はビスエポキシ化合物との反応によって製造できる。
【０００６】
炭水化物ポリマーのガラス状マトリックス中で安定化させた生体材料は、凍結乾燥（米国特許第５５９３８２４号（Ｔｒｅｍｌ他）、同第５０９８８９３号（Ｆｒａｎｋｓ及びＨａｔｌｅｙ））又は真空乾燥（米国特許第５５６５３１８号（Ｗａｌｋｅｒ他））のいずれかによって製造できる。かかる水溶性試薬は、複雑な分子生物学用途での使用に適している。このアプローチは、１回分の使用量の酵素、ヌクレオチド又は他の成分からなる試薬系に特に有用である。ガラス状マトリックスを再構成すると、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ配列決定を始めとする各種用途に使用できる緩衝酵素が得られる。
【０００７】
現在、数多くの乾燥分子生物学用製品が市販されている。しかし、これらの製品には、煩雑な多大な手作業を要するプロセスで製造されるものもある。乾燥時に冷蔵を要する製品もある。室温乾燥試薬の改良製造方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５０９８８９３号明細書
【特許文献２】米国特許第５２００３９９号明細書
【特許文献３】米国特許第５２４０８４３号明細書
【特許文献４】米国特許第３３００４７４号明細書
【特許文献５】米国特許第５５９３８２４号明細書
【特許文献６】米国特許第５５６５３１８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様では、乾燥試薬の製造方法を提供する。本方法は、１種以上の緩衝生物試薬の水溶液を調製する工程と、ガラス形成性フィラー材料を緩衝生物試薬溶液と混合して、多孔質ガラス状組成物の形成を促進するのに十分な濃度のフィラー材料を含む混合物を調製する工程と、混合物をマルチウェル容器のウェルに所定量分注する工程と、上記容器中で混合物を乾燥して乾燥試薬標品を形成する工程を含んでおり、試薬標品は水溶性であり、室温安定性に十分なＴｇを有する。混合物は、好ましくは均質溶液である。
【００１０】
本発明の一実施形態では、乾燥試薬標品は、長期室温保存のため試薬瓶に回収する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、乾燥試薬はマルチウェル容器に保存され、容器の上部は長期保存のためシールテープで封止される。シールテープは、適宜、熱活性化される。
【００１２】
本発明のマルチウェル容器は、シリカモールド又はポリスチレンプレートとすることができる。マルチウェル容器がポリスチレンプレートである場合、本発明は、凍結乾燥前に、ポリスチレンプレートを金属モールドに載せて、効率的な熱伝達のためポリスチレンプレートの各ウェルの外壁を金属モールドのウェルと密着させる工程をさらに含む。本発明者らは、これによって、乾燥プロセスが改善され、健全性の向上した乾燥試薬が得られることを見出した。
【００１３】
別の態様では、本発明は、上述の方法で製造した乾燥生物試薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明の方法で製造した生物試薬組成物は、水溶性であり、室温安定性を担保するＴｇを有する。好ましくは、生物試薬組成物は構造的健全性を有する。
【００１５】
生物試薬組成物は、２５μｌの水溶液に１分未満、好ましくは３０秒未満で完全に溶解する。生物試薬組成物は好ましくは１０％未満の水分含量を有する。
【００１６】
生物試薬組成物は、単独では室温の水溶液中で不安定な１種以上の試薬を含んでいてもよい。生物試薬組成物は複数の試薬を含んでいてもよく、それらは室温の水溶液中で互いに反応するものであっても、反応しないものであってもよい。
【００１７】
したがって、本発明の目的及び利点は、乾燥生物試薬組成物並びにその製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明の上記その他の目的や利点は、以下の記載から明らかとなろう。ただし、以下の記載は、好ましい実施形態について記載したものにすぎず、本発明の範囲を把握するには特許請求の範囲を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法の作業の流れを示す図である。
【図２】図２ の左上は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法に使用される３８４ウェルのポリスチレンプレートを示す。右上は、鋳型を含まない対照を含め、鋳型として出発濃度１０００万〜１０００コピーの様々な量のλＤＮＡを用いた標準曲線を示す。左下は、３８４ウェルポリスチレンプレートから製造し、プラスチックボトル中で保存した乾燥試薬標品のケーク／キューブを示す。右下は、乾燥試薬標品がλＤＮＡリアルタイムｑＰＣＲ増幅反応にうまく使用できたことを示す増幅プロットを示す。
【図３】図３の左上は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法に使用される９６ウェルのシリカモールドを示す。右上は、鋳型を含まない対照を含め、鋳型として出発濃度１０００万〜１０００コピーの様々な量のλＤＮＡを用いた標準曲線を示す。左下は、９６ウェルシリカモールドから製造し、プラスチックボトル中で保存した乾燥試薬錠剤を示す。右下は、乾燥試薬標品がλＤＮＡリアルタイムｑＰＣＲ増幅反応にうまく使用できたことを示す増幅プロットを示す。
【図４】図４は、凍結乾燥前に、ＰＣＲ製剤の入った９６ウェルＰＣＲプレートを金属ホルダーに嵌め込むところを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態にしたがって製造した様々なフォーマットの室温安定性ＰＣＲ試薬を示す。左上は瓶中の乾燥ＰＣＲミックスであり、右上は９６ウェルプレート中の乾燥ＰＣＲミックスであり、左下は３８４ウェルプレート中の乾燥ＰＣＲミックスであり、右下は９６ウェル多孔プレート中の乾燥ＰＣＲミックスである。
【図６】図６は、本発明の実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスをλＤＮＡのｑＰＣＲに使用した。（１）「湿潤」ビーズミックス（左上）、（２）本発明のプロトコルで製造した乾燥ケーク（右上）、（３）ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのｐｕＲｅ ｔａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）（ＲＴＧ）ＰＣＲビーズ（左下）で同様の性能が認められた。右下は、上述の３つの反応を３回繰り返したときのＣｔ値及びＰＣＲ効率。新規フォーマット及びｐｕＲｅ ＴａｑビーズのＣｔ値及びＰＣＲ効率は同等であった。
【図７】図７は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスを４０℃及び室温で８日間保存した。乾燥試薬をλＤＮＡのｑＰＣＲに使用したところ、同様の性能が認められた。左上は乾燥ＰＣＲ試薬ケークを室温で保存したものであり、右上は乾燥ＰＣＲ試薬ケークを４０℃で保存したものである。左下はｐｕＲｅ Ｔａｑビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を室温で保存したものであり、右下はｐｕＲｅ Ｔａｑビーズを４０℃で保存したものである。
【図８】図８は、上述の４種の反応を２回繰り返したときのＣｔ値及びＰＣＲ効率を示す。本発明のフォーマット及びｐｕＲｅ ＴａｑビーズのＣｔ値及びＰＣＲ効率は４０℃及び室温で同等であった。
【図９】図９は、本発明の一実施例でのリアルタイムＰＣＲ反応の結果を示す。左上はＴａｑＭａｎプライマーとプローブを含む凍結乾燥試薬を用いたリアルタイムＰＣＲである。左下は凍結乾燥試薬対照（ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブは凍結乾燥せず、他の試薬は実施例１と同様に凍結乾燥した）である。右上は市販ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ対照（他の試薬は凍結乾燥せず）である。ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧ反応を用いて標準曲線を作成して、他の反応を未知として処理したところ、同量の鋳型ＤＮＡを用いた反応は標準曲線と合致した（右下、「Ｘ」は「未知」を示す）。
【図１０】図１０は、φ２９ＤＮＡポリメラーゼが凍結乾燥形態で安定であることを示す。凍結乾燥試薬又は「湿潤」混合物を用いた全ゲノム増幅アッセイを実施した。４０℃で３５日間保存した凍結乾燥試薬でも強い増幅が検出された。
【図１１】図１１は、凍結乾燥ＩＶＴ試薬（Ａ、Ｂ、Ｃ）を使用したときに、従来の「湿潤」キット（Ｒｏｃｈｅ社製ＩＶＴ）と比較して、ＤＮＡ鋳型がうまく転写されることを示す。ｎｔｃは鋳型なしの対照を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
生物試薬
本発明の方法による保存には数多くの生物試薬が適している。本発明の生物試薬組成物は、血漿又は希釈血漿での実施が好適又は必要とされる多種多様な分析法の実施に特に適している。分析法では、血漿の特定の成分又は特性と関連付けることのできる検出可能な変化を血漿に生じさせるため、血漿を１種以上の球状試薬と組合せることが一般に必要とされる。好ましくは、従来の分光光度計、蛍光光度計、光検出器などで測定できる変色、蛍光及び発光を生じる反応その他の変化を血漿に起こさせる。場合によっては、イムノアッセイその他の特異的結合アッセイを実施してもよい。
【００２１】
本発明を適用し得る生物試薬の別のカテゴリーは、タンパク質及びペプチド、並びに糖タンパク質のようなそれらの誘導体である。かかるタンパク質及びペプチドは、酵素、輸送タンパク質（例えばヘモグロビン、免疫グロブリン、ホルモン、血液凝固因子、薬理活性タンパク質又はペプチド）のいずれであってもよい。
【００２２】
本発明を適用し得る他のカテゴリーとしては、ヌクレオシド、ヌクレオチド（例えばデオキシヌクレオチド、リボニクレオチド及びジデオキシヌクレオチド）、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、並びに酵素補因子（それらがヌクレオチドであるか否かを問わない）などがある。酵素の基質も全般に本発明を適用し得る生物試薬である。
【００２３】
保存安定化のための生物試薬は、天然源、動物、植物、菌類、細菌などから単離したものでも、発酵や人工培養で増殖させた細胞から製造又は単離した試薬であってもよい。かかる細胞は形質転換細胞であってもなくてもよい。
【００２４】
本発明で開発したもう一つの点は、同一反応系の２種以上の試薬を試薬ガラス球中で保存することである。これは、アッセイ又は診断キットなどで一緒に使用する必要のある複数の材料に有用である。
【００２５】
複数の試薬を単一のガラス状標品で保存すると、最終用途に好都合な形態となる。例えば、あるアッセイで基質又は補因子と酵素との組合せが必要とされる場合、アッセイですぐに使用できるように２種又は３種の試薬すべてを試薬ガラス球に所要の濃度比で保存しておくことができる。
【００２６】
複数の試薬を保存する場合、それらを水性エマルジョン中で混合してからガラスに導入してもよい。或いは、各々別のガラスに導入してから混合してもよい。
【００２７】
複数の試薬を単一の組成物（２種のガラスを混合したものでもよい）中で保存する場合には、試薬の１種以上はタンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド又は酵素補因子とすることができる。試薬はもっと簡単な化学種であってもよい。例えば、標準的なアッセイ方法では、ピルビン酸塩とＮＡＤＨが共存していることが必要とされることがある。いずれも単独では十分な安定性をもって保存できる。しかし、水溶液中で共存させると、反応し始める。試薬ガラス球に所定の割合で導入すれば、反応を起こさずに、ガラスを保存できる。「反応」という用語は、任意の生化学反応を意味する。
【００２８】
本発明の好ましい生物試薬は、核酸の検出、増幅、修飾又は配列決定のための試薬系を与える酵素及び補因子である。かかる酵素としては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばクレノウ）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのような各種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ又はマウス逆転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素が挙げられる。補因子としては、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素活性に必要な塩（例えば、マグネシウム、カリウム、ナトリウム）、緩衝作用に必要な塩などが挙げられる。緩衝剤の塩は、適切なｐＨ範囲を与え、安定性に資する。使用できる緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６〜８．３）が挙げられる。
【００２９】
生物試薬の候補は、実施例１のプロトコルを用いて評価できる。例えば、適当な生物試薬を球状試薬で安定化させ、実施例１で用いたような機能性試験で測定される。
【００３０】
ガラス形成性フィラー材料
本発明で使用できるガラス形成性フィラー材料の例としては、ＦＩＣＯＬＬ（商標）、スクロース、グルコース、トレハロース、メレチトース、デキストラン（商標）及びマンニトールのような炭水化物、ＢＳＡ、ゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質、並びにＰＥＧ及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなポリマーが挙げられる。ガラス形成性フィラー材料は、好ましくは、ＦＩＣＯＬＬ（商標）ポリマー、ＢＳＡ、スクロース、デキストラン（商標）又はそれらの組合せである。本発明での使用に特に好ましいガラス形成性フィラー材料は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）ポリマーである。
【００３１】
処方
生物試薬とガラス形成性フィラー材料と水との高粘度混合物の処方は、反復法で決定される。まず、その系の望ましい最終使用濃度を決定する。この濃度は通常モル濃度で表される。生物試薬毎に処方が異なることがある。次いで、かかる濃度を固体では重量／用量基準、液体では体積／用量基準に換算する。
【００３２】
第３工程として、高粘度混合物の固形分（％）と所望の混合物体積の初期値を選択する。５５％の固形分濃度でうまくいくことが判明した。固形分濃度が６２％を超えると、混合物は、粘稠すぎて分注が難しくなる。エマルジョンが望まれる場合には、混合物の固形分濃度を５２％未満とすると、混合物が薄くなりすぎて、乾燥すると透明で硬くなる。セミエマルジョンが望まれる場合、１０％の下限が容認される。固形分（％）という用語は、｛（固形分重量×１００）／（液体重量＋固形分重量）｝を意味する。
【００３３】
ガラス形成性材料を溶液に加えると、混合物を乾燥したときに硬いガラス状となる。したがって、望ましい混合物は溶液ではなくエマルジョンである。「エマルジョン」という用語は、固相と液相の２相が存在する飽和混合物を意味する。例えば、本発明では、生物試薬／緩衝液中のガラス形成性フィラー材料のセミエマルジョンでもよい。固形分が存在すると、エマルジョンは不透明乃至白色となる。高粘度エマルジョンも乾燥時にガラス状となるが、表面に細孔が存在し、水が入り混んで乾燥試薬標品が迅速に溶解される。エマルジョンは白色であるべきである。エマルジョンが透明であると、乾燥時に硬いガラス状となり、非多孔質となる。「多孔度」という用語は、乾燥試薬標品がその溶解を促進する気泡のポケットを複数有することを意味する。好ましい多孔度では、標品は約２分以下で溶解する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ガラス形成性フィラー材料と生物試薬／緩衝液の混合物であって、セミエマルジョンであることを特徴とする混合物を提供する。「セミエマルジョン」とは、少なくともある程度エマルジョンの性質を有する混合物を意味する。本発明のセミエマルジョンは、固形分濃度が約１０％〜約５０％となるように、上述の反復法を用いることによって製造できる。セミエマルジョンを分注・乾燥すると、乾燥試薬標品を形成することができる。
【００３５】
第４工程では、第２工程の１用量当たりのガラス形成性材料のグラム数を用いて、用量を計算する。
【００３６】
第５工程では、用量数及び第２工程の重量／用量比を用いて、他の成分の体積中の重量を決定する。最後に、第５工程で測定した重量及び体積を用いて、最終混合物中の固形分（％）を計算する。混合物の最終固形分が所望範囲外である場合、最終的な値が正しい範囲内となるまで、別の初期値を用いて第３〜第６工程を繰り返す。
【００３７】
上述の反復法によるプロトコルを用いて、任意のガラス形成性材料候補を評価できる。こうして、適当なガラス形成性材料を用いて、許容範囲内の硬さ、寸法、形状、Ｔｇ、多孔度、溶解度及び安定性を有する試薬標品を得ることができる。
【００３８】
マルチウェル容器
乾燥試薬標品の製造に用いられるマルチウェル容器の例としては、ポリスチレンプレート、シリカモールドなどが挙げられる。好ましくは、マルチウェルプレートは、ＰＣＲのような用途のため標準的なサーマルサイクラーを利用できる標準的な寸法及びレイアウトのものである。
【００３９】
一般に、マルチウェル容器は、ウェル領域と境界領域との２つの領域を備える。境界領域はどのような寸法、形状、厚さでもよいが、好ましくは、標準的な９６又は３８４ウェルの市販マイクロタイタープレート（幅約８５．５ｍｍ×長さ約１２７．７５ｍｍ）の外寸と類似の外寸を有するマルチウェルプラットフォームを形成するものである。
【００４０】
通例、プレートは、格子状に配置された複数の穴を備える。これらの穴はウェルと呼ばれ、個々の反応のための反応容器或いは個々の試料の保管容器として機能する。ウェルは、マルチウェルプラットフォームに二次元線形アレイとして配置される。ただし、ウェルは、幾何学的又は非幾何学的なアレイのように、任意のタイプのアレイとして設けることができる。ウェルの数は９６の倍数であり、かかる範囲で好ましくは整数の二乗に９６を乗じた数である。
【００４１】
市販プレートのウェルは通例標準的な間隔で設計されている。９６ウェルプレートは１２列×８行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は９ｍｍである。３８４ウェルプレートは２４列×１６行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は４．５ｍｍである。１５３６ウェルプレートは４８列×３２行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は２．２５ｍｍである。上記フォーマットの２分の１のマイクロタイタープレートも用いられている。隣り合うウェルの中心間の間隔が同様のウェルストリップも利用できる。かかる寸法のマルチウェル容器は、当技術分野で公知のマルチウェルフォーマットトランスロケータ及びリーダーのようなロボット装置及び器具類と適合できる。
【００４２】
マルチウェルプラットフォームの製造用材料は通例ポリマーである。これはポリマーが大量生産に適しているからである。好ましくは、ポリマーは、蛍光性その他の特性の低いことが知られているものから選択される。選択したポリマーが所望の特性を有していることは様々な方法で確認できる。ポリマー材料は、インサート成形又は射出成形のような当技術分野で公知の成形法又は将来開発される方法によるプレートの製造に特に適している。
【００４３】
ポリマープレートに代わるものは、９６ウェル及び３８４ウェルフォーマットのシリカモールドである。実施例に示すように、９６ウェル多孔シリカモールドプレートは、試薬の分注、凍結乾燥に使用できる。その利点は、凍結乾燥後にモールドから乾燥試薬を容易に取り出せることである。
【００４４】
混合及び分注
典型的な製剤（一例としてＤＮＡ標識用製剤）は以下の通り作られる。
【００４５】
通例、用いられる試薬はすべて使用前にオートクレーブ又は濾過滅菌（好ましくは０．２５μｍフィルター）される。製剤は氷上で製造、保存され、次いで分注される。２００ｍｌのＤＮＡ標識用製剤（２００００回分の用量の標品）では、Ｆｉｃｏｌｌ ４００及びＦｉｃｏｌｌ ７０各１５ｇと、２０ｇのメレチトースを約９０ｍｌの滅菌水に加え、撹拌プレート上で溶解するまで混合する。
【００４６】
２０倍濃度のＤＮＡ標識用緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＭｇＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ）５０ｍｌを、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液１０ｍｌと共に加える。各１ｍｌの１００ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ及びＴＴＰを加える。すべての試薬を溶液に加えたら、分注に用いるまで、製剤を氷上で又は冷蔵保存する。使用直前に、４００Ｋｕのクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼを加える（最終標品中のグリセロール濃度を１％未満に保つため、原液の最低濃度は１００Ｋｕ／ｍｌとすべきである。）。また、使用直前に、１２００Ａ２６０単位のｄ（Ｎ）９プライマーを加える。製剤に添加する前に、プライマーを６５℃で７分間加熱し、氷上で急冷しておくべきである。酵素及びプライマーの添加後、滅菌水を用いて最終体積を２００ｍｌとすべきである。最終溶液の密度は、１．１４ｇ／ｍｌとなる。
【００４７】
試薬標品を希釈溶液に溶解したときの体積が１０〜１００μｌとなるように、均質試薬溶液の分注量当たりの最終体積は、５〜３０μｌのように少量であることが多く、好ましくは１０μｌである。
【００４８】
所定量の均質溶液を典型的には液体分注ロボット（９６ウェル／３８４ウェルピン）を用いてマルチウェル容器の各ウェルに分注する。溶液は、４μｌ〜２０μｌ、好ましくは１０μｌの体積で分注される。
【００４９】
乾燥プロセス
分注試料は凍結乾燥で乾燥させることができる。適当な乾燥法によって、許容できる硬さ、寸法、形状、Ｔｇ、多孔度、可溶性及び安定性の試薬標品を製造することができる。
【００５０】
適切な凍結乾燥プロフィールの典型例を表１に示す。
【００５１】
【表１】
好ましい乾燥法は凍結乾燥によるものである。分注した試薬を、９６又は３８４ウェルのポリスチレンプレートでうまく乾燥することができる。驚くべきことに、薄肉ポリスチレンプレートを金属板ホルダーに直接接触するように載せると、金属ホルダーを用いずに乾燥させたプレートに比べ、乾燥プロセスがうまくいき、乾燥試薬の発泡及びフレークが認められない（図１及び４）。ポリスチレンウェル（管）の外壁を金属板ホルダーの金属ウェルと直接接触させると、金属棚接触面積が間接的に増大し、ひいては試料への熱伝達が改善される。一方、シリカモールドは各ウェルで厚い壁と平らな底を有しており、金属ホルダーを使用しなくても、シリカモールドでの凍結乾燥プロセスはうまくいく。これは多分モールドと凍結乾燥装置の棚との接触が良好であること、シリカの熱伝達特性によるためである。好ましい凍結乾燥プロファイルを以下の表２に示す。なお、試料は、以下のプログラムを行う前に、凍結乾燥装置で−４６℃で１時間凍結させておいた。
【００５２】
【表２】
保存
出願人は、ポリスチレン及びシリカ系プレート又はモールドで、錠剤、円柱及び立方形の安定な生物試薬標品をうまく製造することができた。本発明の技術によって、温度感受性のタンパク質及び核酸分子を室温で安定な単回用量標品として安定化することができる。単回用量標品（ビーズ又はケーク）は、その分子が用いられる特定のアッセイに必要な所定量の緩衝剤、塩、界面活性剤、ヌクレオチドなどを含むことができる。これらの酵素及びその組合せは、特に限定されないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、全ゲノム増幅、インビトロ転写、ｃＤＮＡ合成を始めとする様々な分子生物学用途に使用できる。
【００５３】
本発明の方法では、試薬混合物を液体窒素又は冷却表面で液滴を凍結する必要はないが、乾燥試薬の良好な構造的健全性は保たれる。また、本発明の方法では、製造プロセスの工程数が少ない。乾燥試薬標品は適切に封止すればプレート又はモールドで直接保存することができ、製造及び包装コストを大幅に減らすことができる。また、乾燥試薬をシリカモールドから錠剤として及びＰｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ社製９６ウェルプレートからキューブとして取り出して、密閉容器（蓋付き瓶）で保存してもよい。
【００５４】
プレート又はモールドの封止は、蓋、テープ、熱活性化テープなどを用いて実施できる。本発明の一実施形態では、プレートの封止は、ＡｂＧｅｎｅ社製のＴｈｅｒｍｏ−Ｓｅａｌ及びＥａｓｙ−Ｐｅｅｌシートを用いた熱活性化シールで行われる。
【００５５】
本発明の試薬標品は室温安定性である。「室温安定性」とは、標品を２２℃で６ヶ月以上、試薬乾燥時の活性と比べて２０％未満の酵素活性の損失で保存できることを意味する。
【００５６】
本発明の試薬標品は１０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。試薬標品の典型的なＴｇは４０℃である。４０℃以上のＴｇで室温（２２℃）での安定性が担保される。好ましいＴｇは４５℃である。ガラス転移温度は、それ以上の温度でガラス質材料の粘度が急激に低下してゴム状、次いで変形可能な可塑体となり、さらに温度を高めると液体となる温度をいう。
【００５７】
ガラス転移温度は、標品の安定性の重要な指標として用いられる。Ｔｇ未満又はその近傍では、試料は安定なガラス状態のままとどまる。温度がＴｇを超えて上昇すると、試料はゴム状となり、安定性が減る。Ｔｇは示差走査熱量測定で求められる。２〜５ｍｇの試料（１〜２個の球剤を破砕したもの）をアルミニウム製パンに入れる。試料のＴｇは、昇温速度１０℃／分で０℃から１００℃に昇温させる温度制御プログラムで測定される。試料の熱の出入りは、ベースラインのシフトとして測定、表示される。Ｔｇは、ベースラインのシフトの中点の温度として表れる。
【００５８】
典型的な多孔度では、球剤は２０μｌの水に１分以内に溶解する。好ましい多孔度では３０秒以内に溶解する。
【００５９】
本発明のガラス化生物試薬標品の製造方法には、幾つかの利点がある。まず、製造プロセスが大幅に簡略化される。試薬混合物を市販マイクロタイタープレートのような標準的フォーマットのマルチウェルプレートのウェルに直接分注する。そのため、試薬の液滴を液体窒素中又は冷却表面上で凍結する必要がない。分注混合物を次いでウェル中で凍結、乾燥し、ウェル中で保存することができる。そのため、乾燥パンからビーズやケークを保存容器に移動させる必要がない。乾燥組成物はマルチウェルプレートで保存できるので、組成物を、後段の自動化されたワークフローに使用できる。プレートの処理には、ロボット装置を使用できる。
【００６０】
さらに、組成物は室温で安定である。そのため、輸送コストが削減でき（ドライアイス輸送は不要となる）、冷凍保存の必要がなく、試薬の調製時間が短縮できる（解凍不要）。ユーザーにも好都合である。アッセイ成分の大半を予め分注して単回用量フォーマットで安定に保存しておくことができる。そのため、ユーザーは時間を節約でき、試薬の原液の調製のためのプラスチック消耗品のコストも節約できる。汚染及び誤差のリスクが減るため、再現性及び信頼性も増す。組成物は予め分注した形態で調製する。そのため、試料の取扱い及びピペット処理工程が減り、ユーザーによる汚染及びピペット作業の誤差の危険性が低減する。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例示するものにすぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって規定される。本明細書の他の以下その他の箇所で引用した文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６２】
実施例１：３８４ウェルポリスチレンプレートでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤（本例ではＰＣＲ用試薬混合物）を、標準的プロトコルにしたがって調製する。略述すると、１０μｌの球状製剤は、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（室温でｐＨ９．０）、１２５ｍＭのＫＣｌ、３．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３．５単位のｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに合成ポリマーＦｉｃｏｌｌ ４００（６．２５％）、Ｆｉｃｏｌｌ ７０（６．２５％）及び二次炭水化物メレチトース（１０％）からなるガラス形成性フィラー材料を含む。通例、試薬はすべて使用前にオートクレーブ又は濾過滅菌される。製剤は、ポリスチレンプレート又はシリカモールドで混合・分注されるまで、氷上で製造・保存される。最終製剤は、上述のガラス形成性フィラー材料、ＢＳＡ、ｄＮＴＰ、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び塩からなる。
【００６３】
均質試薬溶液１用量当たりの最終体積は１０μｌであった。こうして、ＰＣＲの作業体積を２５μｌとすることができる。試薬は、自動ピペットを用いて３８４ウェルポリスチレンプレートに分注した。
【００６４】
３８４ウェルプレートを予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機の棚に約６０分間おいて試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００６５】
乾燥試薬を含むプレートを、単に接着性カバー又は蓋又はヒートシールで覆うことによって、再封止可能な乾燥剤入りパウチに一体パッケージとして保存した。別法では、乾燥試薬をプレートから取り出し、乾燥試薬錠剤又はキューブとして瓶中で保存し、瓶を、再封止可能な乾燥剤入りパウチに保存した。
【００６６】
乾燥試薬組成物の安定性を、λＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。試験に使用したプライマーは、配列番号１（５’−ＧＧＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＧＣ Ｃ−３’）及び配列番号２（５’−ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ Ｇ−３’）であった。リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を図２に示す。
【００６７】
図２の左上に、乾燥試薬組成物の製造に用いた３８４ウェルポリスチレンプレートを示す。乾燥試薬錠剤をプラスチック瓶に入れ（左下）、再封止可能な乾燥剤入りパウチ中で室温で約１週間保存した。乾燥試薬を含む３８４ウェルプレートを左上に示すが、プレートは接着性シールで覆われている。様々な希釈度のλＤＮＡ鋳型の標準曲線を右上に示す。様々な希釈度のλＤＮＡのリアルタイム増幅曲線を右下に示す。結論として、リアルタイムＰＣＲ増幅反応の成功は乾燥試薬組成物が安定であることを立証している。
【００６８】
実施例２：９６ウェルシリカモールドでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤及びガラス形成性フィラー材料を実施例１に準拠して調製及び混合した。約２０μｌの試薬混合物を、自動ピペットを用いて９６ウェルシリカモールドに分注した（図３、左上）。シリカモールドを、予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機に約６０分間載せて試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００６９】
乾燥試薬は、単にモールドを接着性シールで覆い、プレートを乾燥剤入りアルミニウムパウチ中に入れることによってモールド中で保存することができた。別法として、乾燥試薬をモールドから乾燥試薬ケークとして取り出し、乾燥剤入り瓶で保存した。
【００７０】
乾燥試薬組成物の安定性を、実施例１に記載のλＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。結果を図３に示す。
【００７１】
図３の左上に、乾燥試薬組成物の製造に用いた９６ウェルシリカモールドを示す。乾燥試薬のキューブをプラスチック瓶に入れ（左下）、再封止可能な乾燥剤入りパウチ中で室温で約１週間保存してから、λＤＮＡ機能試験を実施した。様々な希釈度のλＤＮＡ鋳型の標準曲線を右上に示す。様々な希釈度のλＤＮＡのリアルタイム増幅プロットを右下に示す。結論として、リアルタイムＰＣＲ増幅反応の成功は乾燥試薬組成物が安定であったことを立証している。
【００７２】
実施例３：９６ウェルポリスチレンプレートでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤及びガラス形成性フィラー材料を実施例１に準拠して調製及び混合した。約１０μｌの試薬混合物を、液体分注ロボットを用いて分注した（図１、左下）。９６ウェルプレートを９６ウェル金属ホルダーに載せた（図４）。９６ウェルプレートを金属ホルダーと共に予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機に約６０分間載せて、試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００７３】
乾燥試薬は、ヒートシーラーを用いて単に接着性カバー又は蓋又はヒートシールで９６ウェルプレートを覆うことによって一体パッケージとして保存することができた。調製したての「湿潤」製剤及び乾燥試薬、並びにｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズで、λＤＮＡリアルタイムＰＣＲ機能試験を行った。封止プレートは、室温又は４０℃のインキュベーター内で８日間、乾燥剤入りのパウチ中で保存した。乾燥試薬組成物の安定性は、λＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅反応（実施例１参照）で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。結果を、図６、図７及び図８に示す。
【００７４】
図６は、９６ウェル乾燥ＰＣＲケークでのλｑＰＣＲ並びに「湿潤」製剤及びｐｕｒｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズと比較した結果を示す。この図は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。鋳型を含まない対照と併せて、鋳型として出発濃度１０００万〜１０コピーの様々な濃度のλＤＮＡでリアルタイムＰＣＲを実施した。Ｃｔ値及びＰＣＲ効率に関して、本発明の実施形態（右上）とｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ（左下）と「湿潤」製剤（左上）とで同様の性能が認められた（左下の表）。
【００７５】
図７は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスを４０℃又は室温（ＲＴ）で８日間保存してから、λＤＮＡのｑＰＣＲに使用した。本発明の方法で製造した試薬は、市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズと同様の性能を示した。左上は、室温で保存した乾燥ＰＣＲ試薬ケークである。右上は、４０℃で保存した乾燥ＰＣＲ試薬ケークである。左下は、室温で保存したｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズである。右下は、４０℃で保存したｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズである。図８は、室温及び４０℃で保存した本発明の実施形態の試薬及びｐｕｒｅＴａｑ ＲＴＧビーズでのＣｔ値及びＰＣＲ効率を示す。
【００７６】
実施例４：リアルタイムＰＣＲアッセイ用の乾燥試薬の調製
リアルタイムＰＣＲは、遺伝子発現解析のアッセイプラットフォームとして普及しつつある。リアルタイムＰＣＲにおける増幅産物を検出する方法の一つでは、鋳型の特異的部分に相同な二重標識一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡプローブを使用する。このプローブの蛍光修飾部は、レポーター（ＦＡＭ）及びクエンチャー（ＴＡＭＲＡ）として役立つ。一本鎖鋳型の存在下で、プローブは鋳型にアニールするが、レポーター色素とクエンチャー色素が近接しているので蛍光信号は発しない。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで鋳型からＤＮＡが増幅されると、鋳型にアニールした標識プローブが酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって開裂し、クエンチャー色素が放出されるので、レポーターは蛍光を発するようになる。すると、蛍光信号がリアルタイム機器で記録される。
【００７７】
本例では、賦形剤の存在下でＰＣＲプライマーをＴａｑＭａｎプローブと共に凍結乾燥することができて、プライマー及びプローブを凍結乾燥しなかった反応に比べて、機能を損なわずにリアルタイムＰＣＲに使用できることを実証する。β−アクチンのアッセイ用２．５倍濃縮製剤は、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９）、１２５ｍＭのＫＣｌ、３．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μｌのｒＴａｑ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、０．０５％のＮＰ−４０、１．５μＭのβ−アクチンＦｗｄプライマー（配列番号３：５’−ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ−３’）、１．５μＭのβ−アクチンＲｅｖプライマー（配列番号４：５’−ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ−３’）、１μＭのβ−アクチンプローブ（配列番号５：５’−ＦＡＭ−ＡＴＧ ＣＣＣ−Ｎ（ＴＡＭＲＡ）ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＴ Ｃ ＣＴＧ ＣＧＴ ｐ−３’）、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ７０、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ４００及び１０％メレチトースを含む。
【００７８】
製剤１０μｌを、９６ウェルプレートにピペットで分注し、凍結乾燥した。１個の乾燥ケークを様々な量のヒトゲノムＤＮＡ鋳型と共に２５μｌの最終体積に再水和した。リアルタイムＰＣＲ反応はＡＢＩ ７９００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置で実施した。この反応を、プライマー及びプローブを含まない同様の製剤と比較した。後者の反応では、ＰＣＲ反応のセットアップ中に、プライマーとプローブを加えた。さらに別の対照として、市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズを用いた。
【００７９】
図９は、これらの反応の結果を示す。左上はＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを含む凍結乾燥試薬を用いたリアルタイムＰＣＲである。左下は対照凍結乾燥試薬（プライマー及びプローブは凍結乾燥製剤に配合せず、リアルタイムＰＣＲ反応の前に加えた）。右上は市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズの対照（他の試薬はいずれも凍結乾燥せず）である。すべての反応で、増幅プロファイルＲ２値及び傾きは同等であった。ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧ反応を用いて標準曲線の作成し、他のすべての反応を未知として処理したところ、同量の鋳型ＤＮＡでの反応は標準曲線と合致した（右下）。こうした結果は、ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブがＲＴＧの導入に順応できることを示している。
【００８０】
実施例５：φ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有する乾燥試薬の調製
φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、全ゲノム増幅並びにローリングサークル増幅に広く使用されている。出願人は、この酵素を、全ゲノム増幅の可能な製剤として乾燥凍結した。その分析結果は、凍結乾燥製剤が全ゲノム増幅の実施に際して「湿潤」製剤と同じ活性を有していることを示している。
【００８１】
ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＨＹ（高収率）ＤＮＡ増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）は、等温鎖置換増幅による全ゲノム増幅に必要なすべての成分を含んでいる。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ反応の出発材料は、精製ＤＮＡでも、非精製細胞溶解物でもよい。数ｎｇの量の出発材料からμｇオーダーのＤＮＡをわずか数時間で生成させることができる。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＨＹ反応での典型的なＤＮＡ収率は、５０μｌ反応当たり４０〜５０μｇであり、平均的な生成物の鎖長は１０ｋｂを超える。ＤＮＡ複製は酵素の校正３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のため極めて正確である。
【００８２】
φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムヘキサマー、ｄＮＴＰ及びＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＨＹ反応緩衝液を、安定剤のＦｉｃｏｌｌ ７０、Ｆｉｃｏｌｌ ４００、メレチトース及びＢＳＡと共に含むＧｅｎｏｍｉＰｈｉ反応混合物を２倍混合物として調製した。混合物の１０μｌ量を１２ウェルＰＣＲストリップチューブに分注した。分注生成物をＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥機を用いてケークとして凍結乾燥した。乾燥生成物を室温又は４０℃で３５日間保存した。これらの生成物で、１０ｎｇの少量のヒトゲノムＤＮＡでも全ゲノム増幅をうまく実施できた。これを、調製したての混合物を使用した全ゲノム増幅と、時間０及び室温又は４０℃で３５日間保存後に比較した。
【００８３】
図１０は、凍結乾燥試薬又は「湿潤」混合物を用いた全ゲノム増幅アッセイの結果を示す。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを鋳型材料として使用し、３０℃で９０分間増幅反応を行った。９０分で４μｇ超のＤＮＡが生成するものと予測された。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで、４０℃で３５日間保存しておいた凍結乾燥試薬でも強い増幅が検出された。φ２９ＤＮＡポリメラーゼは凍結乾燥フォーマットでうまく安定化された。
【００８４】
実施例６：インビトロ転写用の乾燥試薬の製造
転写は、すべての種類の細胞で定期的に行われる生命維持に必須な生物学的プロセスであり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鋳型を用いてＲＮＡが作られる。インビトロ転写（ＩＶＴ）では、エンドユーザーが選択した転写物を生成するため、これと同じプロセスを細胞外の試験管内で行う。得られたＲＮＡ分子は、タンパク質のインビトロ翻訳或いはハイブリダイゼーション反応、例えばノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ分析及びマイクロインジェクションなどに使用できる。
【００８５】
本発明者らは、ＲＮＡの生成に必要な、鋳型を除くすべての成分を賦形剤の存在下で凍結乾燥した室温安定性凍結乾燥ＩＶＴ試薬を成功裡に得ることができた。これによってＩＶＴ反応は大幅に簡略化され、エンドユーザーは鋳型ＤＮＡと水を加えるだけで反応を開始させることができる。
【００８６】
凍結乾燥試薬の製造に用いられるＩＶＴ製剤は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＣＴＰ、０．５ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍＭのＵＴＰ、２ＵのＲＮＡＧｕａｒｄ、１０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ４００、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ７０、１０％のメレチトースを含んでいた。調製した製剤を８ウェルのストリップチューブに２５μｌずつ分注し、実施例１及び表２にしたがって凍結乾燥した。乾燥試薬ケークを、Ｒｏｃｈｅ社製ＳＰ６／Ｔ７ ＩＶＴキットの対照ＤＮＡを用いて試験した。並行して、Ｒｏｃｈｅ社製ＳＰ６／Ｔ７ ＩＶＴキットを用いたＩＶＴ反応を実施した。
【００８７】
予想通り、Ｒｏｃｈｅ社製キットだけでなく、凍結乾燥試薬を用いても、約１０００塩基対の転写物が生成した（図１１）。したがって、転写に必要な試薬を賦形剤の存在下で成功裡に凍結乾燥させ、ＤＮＡ鋳型の存在下で適量の反応体積に再水和すれば、ＲＮＡ転写物を生成させることができる。
【００８８】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明してきたが、本発明の教示内容から逸脱せずに様々な変更及び修正をなすことができることは自明であろう。以上の明細書及び添付の図面に記載された事項は例示を目的としたものにすぎず、限定的なものではない。本発明の技術的範囲は、従来技術に照らして特許請求の範囲を解釈することによって規定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料及び試薬の多孔質ガラス状態での長期保存に関する。特に、本発明は、かかる材料及び試薬のマルチウェルプレートを用いた製造法並びに保存に関する。
【背景技術】
【０００２】
室温の溶液中で単離、精製、保存できるほど十分に安定な生体活性材料は少ない。生物試薬は、通常４℃、−２０℃又は−７０℃の温度に保たれたグリセロール溶液中で保存される。これらはまとめて保存され、使用時に他の試薬と混合される。
【０００３】
生体試料の簡単で効率的な検査のための試薬を調製する際には、別々の一様な量の乾燥化学試薬製剤を得ることが重要となることが多い。生物試薬の安定化に従前使用されてきた担体又はフィラーの１種は、ガラス形成性フィラー材料である。生物試薬の溶液がガラス形成性フィラー材料（水溶性又は水膨潤性物質）に導入される。これを乾燥すると、生物試薬が固定化され安定化されたガラス状組成物が得られる。生物試薬の安定化に用いるガラス形成性フィラー材料の例については、米国特許第５０９８８９３号、同第５２００３９９号、同第５２４０８４３号を参照されたい。
【０００４】
グルコース、スクロース、マルトース、マルトトリオースのような炭水化物は、ガラス形成性物質の重要な群をなす。その他のポリヒドロキシ化合物、例えばソルビトールのような炭水化物誘導体及び化学修飾炭水化物も使用できる。ガラス形成性物質のもう一つの重要な群は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド又はポリエチレンイミンのような合成ポリマーである。
【０００５】
ガラス形成性物質のさらに別の例として、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社からＦＩＣＯＬＬ（商標）という商標で市販されているもののような糖共重合体がある。ＦＩＣＯＬＬ（商標）は分子量５０００〜１００００００であり、スクロース残基がエーテルを介して二官能性基に結合している（米国特許第３３００４７４号）。二官能性基は炭素原子数２又は３以上のアルキレンとし得るが、通常は炭素原子数は１０以下である。二官能性基は、糖残基同士を結合する役割を果たす。かかるポリマーは、例えば、糖とハロヒドリン又はビスエポキシ化合物との反応によって製造できる。
【０００６】
炭水化物ポリマーのガラス状マトリックス中で安定化させた生体材料は、凍結乾燥（米国特許第５５９３８２４号（Ｔｒｅｍｌ他）、同第５０９８８９３号（Ｆｒａｎｋｓ及びＨａｔｌｅｙ））又は真空乾燥（米国特許第５５６５３１８号（Ｗａｌｋｅｒ他））のいずれかによって製造できる。かかる水溶性試薬は、複雑な分子生物学用途での使用に適している。このアプローチは、１回分の使用量の酵素、ヌクレオチド又は他の成分からなる試薬系に特に有用である。ガラス状マトリックスを再構成すると、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ配列決定を始めとする各種用途に使用できる緩衝酵素が得られる。
【０００７】
現在、数多くの乾燥分子生物学用製品が市販されている。しかし、これらの製品には、煩雑な多大な手作業を要するプロセスで製造されるものもある。乾燥時に冷蔵を要する製品もある。室温乾燥試薬の改良製造方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５０９８８９３号明細書
【特許文献２】米国特許第５２００３９９号明細書
【特許文献３】米国特許第５２４０８４３号明細書
【特許文献４】米国特許第３３００４７４号明細書
【特許文献５】米国特許第５５９３８２４号明細書
【特許文献６】米国特許第５５６５３１８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様では、乾燥試薬の製造方法を提供する。本方法は、１種以上の緩衝生物試薬の水溶液を調製する工程と、ガラス形成性フィラー材料を緩衝生物試薬溶液と混合して、多孔質ガラス状組成物の形成を促進するのに十分な濃度のフィラー材料を含む混合物を調製する工程と、混合物をマルチウェル容器のウェルに所定量分注する工程と、上記容器中で混合物を乾燥して乾燥試薬標品を形成する工程を含んでおり、試薬標品は水溶性であり、室温安定性に十分なＴｇを有する。混合物は、好ましくは均質溶液である。
【００１０】
本発明の一実施形態では、乾燥試薬標品は、長期室温保存のため試薬瓶に回収する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、乾燥試薬はマルチウェル容器に保存され、容器の上部は長期保存のためシールテープで封止される。シールテープは、適宜、熱活性化される。
【００１２】
本発明のマルチウェル容器は、シリカモールド又はポリスチレンプレートとすることができる。マルチウェル容器がポリスチレンプレートである場合、本発明は、凍結乾燥前に、ポリスチレンプレートを金属モールドに載せて、効率的な熱伝達のためポリスチレンプレートの各ウェルの外壁を金属モールドのウェルと密着させる工程をさらに含む。本発明者らは、これによって、乾燥プロセスが改善され、健全性の向上した乾燥試薬が得られることを見出した。
【００１３】
別の態様では、本発明は、上述の方法で製造した乾燥生物試薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明の方法で製造した生物試薬組成物は、水溶性であり、室温安定性を担保するＴｇを有する。好ましくは、生物試薬組成物は構造的健全性を有する。
【００１５】
生物試薬組成物は、２５μｌの水溶液に１分未満、好ましくは３０秒未満で完全に溶解する。生物試薬組成物は好ましくは１０％未満の水分含量を有する。
【００１６】
生物試薬組成物は、単独では室温の水溶液中で不安定な１種以上の試薬を含んでいてもよい。生物試薬組成物は複数の試薬を含んでいてもよく、それらは室温の水溶液中で互いに反応するものであっても、反応しないものであってもよい。
【００１７】
したがって、本発明の目的及び利点は、乾燥生物試薬組成物並びにその製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明の上記その他の目的や利点は、以下の記載から明らかとなろう。ただし、以下の記載は、好ましい実施形態について記載したものにすぎず、本発明の範囲を把握するには特許請求の範囲を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法の作業の流れを示す図である。
【図２】図２ の左上は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法に使用される３８４ウェルのポリスチレンプレートを示す。右上は、鋳型を含まない対照を含め、鋳型として出発濃度１０００万〜１０００コピーの様々な量のλＤＮＡを用いた標準曲線を示す。左下は、３８４ウェルポリスチレンプレートから製造し、プラスチックボトル中で保存した乾燥試薬標品のケーク／キューブを示す。右下は、乾燥試薬標品がλＤＮＡリアルタイムｑＰＣＲ増幅反応にうまく使用できたことを示す増幅プロットを示す。
【図３】図３の左上は、本発明の一実施形態に係る乾燥試薬標品の製造方法に使用される９６ウェルのシリカモールドを示す。右上は、鋳型を含まない対照を含め、鋳型として出発濃度１０００万〜１０００コピーの様々な量のλＤＮＡを用いた標準曲線を示す。左下は、９６ウェルシリカモールドから製造し、プラスチックボトル中で保存した乾燥試薬錠剤を示す。右下は、乾燥試薬標品がλＤＮＡリアルタイムｑＰＣＲ増幅反応にうまく使用できたことを示す増幅プロットを示す。
【図４】図４は、凍結乾燥前に、ＰＣＲ製剤の入った９６ウェルＰＣＲプレートを金属ホルダーに嵌め込むところを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態にしたがって製造した様々なフォーマットの室温安定性ＰＣＲ試薬を示す。左上は瓶中の乾燥ＰＣＲミックスであり、右上は９６ウェルプレート中の乾燥ＰＣＲミックスであり、左下は３８４ウェルプレート中の乾燥ＰＣＲミックスであり、右下は９６ウェル多孔プレート中の乾燥ＰＣＲミックスである。
【図６】図６は、本発明の実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスをλＤＮＡのｑＰＣＲに使用した。（１）「湿潤」ビーズミックス（左上）、（２）本発明のプロトコルで製造した乾燥ケーク（右上）、（３）ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのｐｕＲｅ ｔａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）（ＲＴＧ）ＰＣＲビーズ（左下）で同様の性能が認められた。右下は、上述の３つの反応を３回繰り返したときのＣｔ値及びＰＣＲ効率。新規フォーマット及びｐｕＲｅ ＴａｑビーズのＣｔ値及びＰＣＲ効率は同等であった。
【図７】図７は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスを４０℃及び室温で８日間保存した。乾燥試薬をλＤＮＡのｑＰＣＲに使用したところ、同様の性能が認められた。左上は乾燥ＰＣＲ試薬ケークを室温で保存したものであり、右上は乾燥ＰＣＲ試薬ケークを４０℃で保存したものである。左下はｐｕＲｅ Ｔａｑビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を室温で保存したものであり、右下はｐｕＲｅ Ｔａｑビーズを４０℃で保存したものである。
【図８】図８は、上述の４種の反応を２回繰り返したときのＣｔ値及びＰＣＲ効率を示す。本発明のフォーマット及びｐｕＲｅ ＴａｑビーズのＣｔ値及びＰＣＲ効率は４０℃及び室温で同等であった。
【図９】図９は、本発明の一実施例でのリアルタイムＰＣＲ反応の結果を示す。左上はＴａｑＭａｎプライマーとプローブを含む凍結乾燥試薬を用いたリアルタイムＰＣＲである。左下は凍結乾燥試薬対照（ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブは凍結乾燥せず、他の試薬は実施例１と同様に凍結乾燥した）である。右上は市販ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ対照（他の試薬は凍結乾燥せず）である。ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧ反応を用いて標準曲線を作成して、他の反応を未知として処理したところ、同量の鋳型ＤＮＡを用いた反応は標準曲線と合致した（右下、「Ｘ」は「未知」を示す）。
【図１０】図１０は、φ２９ＤＮＡポリメラーゼが凍結乾燥形態で安定であることを示す。凍結乾燥試薬又は「湿潤」混合物を用いた全ゲノム増幅アッセイを実施した。４０℃で３５日間保存した凍結乾燥試薬でも強い増幅が検出された。
【図１１】図１１は、凍結乾燥ＩＶＴ試薬（Ａ、Ｂ、Ｃ）を使用したときに、従来の「湿潤」キット（Ｒｏｃｈｅ社製ＩＶＴ）と比較して、ＤＮＡ鋳型がうまく転写されることを示す。ｎｔｃは鋳型なしの対照を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
生物試薬
本発明の方法による保存には数多くの生物試薬が適している。本発明の生物試薬組成物は、血漿又は希釈血漿での実施が好適又は必要とされる多種多様な分析法の実施に特に適している。分析法では、血漿の特定の成分又は特性と関連付けることのできる検出可能な変化を血漿に生じさせるため、血漿を１種以上の球状試薬と組合せることが一般に必要とされる。好ましくは、従来の分光光度計、蛍光光度計、光検出器などで測定できる変色、蛍光及び発光を生じる反応その他の変化を血漿に起こさせる。場合によっては、イムノアッセイその他の特異的結合アッセイを実施してもよい。
【００２１】
本発明を適用し得る生物試薬の別のカテゴリーは、タンパク質及びペプチド、並びに糖タンパク質のようなそれらの誘導体である。かかるタンパク質及びペプチドは、酵素、輸送タンパク質（例えばヘモグロビン、免疫グロブリン、ホルモン、血液凝固因子、薬理活性タンパク質又はペプチド）のいずれであってもよい。
【００２２】
本発明を適用し得る他のカテゴリーとしては、ヌクレオシド、ヌクレオチド（例えばデオキシヌクレオチド、リボニクレオチド及びジデオキシヌクレオチド）、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、並びに酵素補因子（それらがヌクレオチドであるか否かを問わない）などがある。酵素の基質も全般に本発明を適用し得る生物試薬である。
【００２３】
保存安定化のための生物試薬は、天然源、動物、植物、菌類、細菌などから単離したものでも、発酵や人工培養で増殖させた細胞から製造又は単離した試薬であってもよい。かかる細胞は形質転換細胞であってもなくてもよい。
【００２４】
本発明で開発したもう一つの点は、同一反応系の２種以上の試薬を試薬ガラス球中で保存することである。これは、アッセイ又は診断キットなどで一緒に使用する必要のある複数の材料に有用である。
【００２５】
複数の試薬を単一のガラス状標品で保存すると、最終用途に好都合な形態となる。例えば、あるアッセイで基質又は補因子と酵素との組合せが必要とされる場合、アッセイですぐに使用できるように２種又は３種の試薬すべてを試薬ガラス球に所要の濃度比で保存しておくことができる。
【００２６】
複数の試薬を保存する場合、それらを水性エマルジョン中で混合してからガラスに導入してもよい。或いは、各々別のガラスに導入してから混合してもよい。
【００２７】
複数の試薬を単一の組成物（２種のガラスを混合したものでもよい）中で保存する場合には、試薬の１種以上はタンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド又は酵素補因子とすることができる。試薬はもっと簡単な化学種であってもよい。例えば、標準的なアッセイ方法では、ピルビン酸塩とＮＡＤＨが共存していることが必要とされることがある。いずれも単独では十分な安定性をもって保存できる。しかし、水溶液中で共存させると、反応し始める。試薬ガラス球に所定の割合で導入すれば、反応を起こさずに、ガラスを保存できる。「反応」という用語は、任意の生化学反応を意味する。
【００２８】
本発明の好ましい生物試薬は、核酸の検出、増幅、修飾又は配列決定のための試薬系を与える酵素及び補因子である。かかる酵素としては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばクレノウ）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのような各種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ又はマウス逆転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素が挙げられる。補因子としては、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素活性に必要な塩（例えば、マグネシウム、カリウム、ナトリウム）、緩衝作用に必要な塩などが挙げられる。緩衝剤の塩は、適切なｐＨ範囲を与え、安定性に資する。使用できる緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６〜８．３）が挙げられる。
【００２９】
生物試薬の候補は、実施例１のプロトコルを用いて評価できる。例えば、適当な生物試薬を球状試薬で安定化させ、実施例１で用いたような機能性試験で測定される。
【００３０】
ガラス形成性フィラー材料
本発明で使用できるガラス形成性フィラー材料の例としては、ＦＩＣＯＬＬ（商標）、スクロース、グルコース、トレハロース、メレチトース、デキストラン（商標）及びマンニトールのような炭水化物、ＢＳＡ、ゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質、並びにＰＥＧ及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなポリマーが挙げられる。ガラス形成性フィラー材料は、好ましくは、ＦＩＣＯＬＬ（商標）ポリマー、ＢＳＡ、スクロース、デキストラン（商標）又はそれらの組合せである。本発明での使用に特に好ましいガラス形成性フィラー材料は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）ポリマーである。
【００３１】
処方
生物試薬とガラス形成性フィラー材料と水との高粘度混合物の処方は、反復法で決定される。まず、その系の望ましい最終使用濃度を決定する。この濃度は通常モル濃度で表される。生物試薬毎に処方が異なることがある。次いで、かかる濃度を固体では重量／用量基準、液体では体積／用量基準に換算する。
【００３２】
第３工程として、高粘度混合物の固形分（％）と所望の混合物体積の初期値を選択する。５５％の固形分濃度でうまくいくことが判明した。固形分濃度が６２％を超えると、混合物は、粘稠すぎて分注が難しくなる。エマルジョンが望まれる場合には、混合物の固形分濃度を５２％未満とすると、混合物が薄くなりすぎて、乾燥すると透明で硬くなる。セミエマルジョンが望まれる場合、１０％の下限が容認される。固形分（％）という用語は、｛（固形分重量×１００）／（液体重量＋固形分重量）｝を意味する。
【００３３】
ガラス形成性材料を溶液に加えると、混合物を乾燥したときに硬いガラス状となる。したがって、望ましい混合物は溶液ではなくエマルジョンである。「エマルジョン」という用語は、固相と液相の２相が存在する飽和混合物を意味する。例えば、本発明では、生物試薬／緩衝液中のガラス形成性フィラー材料のセミエマルジョンでもよい。固形分が存在すると、エマルジョンは不透明乃至白色となる。高粘度エマルジョンも乾燥時にガラス状となるが、表面に細孔が存在し、水が入り混んで乾燥試薬標品が迅速に溶解される。エマルジョンは白色であるべきである。エマルジョンが透明であると、乾燥時に硬いガラス状となり、非多孔質となる。「多孔度」という用語は、乾燥試薬標品がその溶解を促進する気泡のポケットを複数有することを意味する。好ましい多孔度では、標品は約２分以下で溶解する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ガラス形成性フィラー材料と生物試薬／緩衝液の混合物であって、セミエマルジョンであることを特徴とする混合物を提供する。「セミエマルジョン」とは、少なくともある程度エマルジョンの性質を有する混合物を意味する。本発明のセミエマルジョンは、固形分濃度が約１０％〜約５０％となるように、上述の反復法を用いることによって製造できる。セミエマルジョンを分注・乾燥すると、乾燥試薬標品を形成することができる。
【００３５】
第４工程では、第２工程の１用量当たりのガラス形成性材料のグラム数を用いて、用量を計算する。
【００３６】
第５工程では、用量数及び第２工程の重量／用量比を用いて、他の成分の体積中の重量を決定する。最後に、第５工程で測定した重量及び体積を用いて、最終混合物中の固形分（％）を計算する。混合物の最終固形分が所望範囲外である場合、最終的な値が正しい範囲内となるまで、別の初期値を用いて第３〜第６工程を繰り返す。
【００３７】
上述の反復法によるプロトコルを用いて、任意のガラス形成性材料候補を評価できる。こうして、適当なガラス形成性材料を用いて、許容範囲内の硬さ、寸法、形状、Ｔｇ、多孔度、溶解度及び安定性を有する試薬標品を得ることができる。
【００３８】
マルチウェル容器
乾燥試薬標品の製造に用いられるマルチウェル容器の例としては、ポリスチレンプレート、シリカモールドなどが挙げられる。好ましくは、マルチウェルプレートは、ＰＣＲのような用途のため標準的なサーマルサイクラーを利用できる標準的な寸法及びレイアウトのものである。
【００３９】
一般に、マルチウェル容器は、ウェル領域と境界領域との２つの領域を備える。境界領域はどのような寸法、形状、厚さでもよいが、好ましくは、標準的な９６又は３８４ウェルの市販マイクロタイタープレート（幅約８５．５ｍｍ×長さ約１２７．７５ｍｍ）の外寸と類似の外寸を有するマルチウェルプラットフォームを形成するものである。
【００４０】
通例、プレートは、格子状に配置された複数の穴を備える。これらの穴はウェルと呼ばれ、個々の反応のための反応容器或いは個々の試料の保管容器として機能する。ウェルは、マルチウェルプラットフォームに二次元線形アレイとして配置される。ただし、ウェルは、幾何学的又は非幾何学的なアレイのように、任意のタイプのアレイとして設けることができる。ウェルの数は９６の倍数であり、かかる範囲で好ましくは整数の二乗に９６を乗じた数である。
【００４１】
市販プレートのウェルは通例標準的な間隔で設計されている。９６ウェルプレートは１２列×８行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は９ｍｍである。３８４ウェルプレートは２４列×１６行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は４．５ｍｍである。１５３６ウェルプレートは４８列×３２行であり、隣り合うウェルの中心間の間隔は２．２５ｍｍである。上記フォーマットの２分の１のマイクロタイタープレートも用いられている。隣り合うウェルの中心間の間隔が同様のウェルストリップも利用できる。かかる寸法のマルチウェル容器は、当技術分野で公知のマルチウェルフォーマットトランスロケータ及びリーダーのようなロボット装置及び器具類と適合できる。
【００４２】
マルチウェルプラットフォームの製造用材料は通例ポリマーである。これはポリマーが大量生産に適しているからである。好ましくは、ポリマーは、蛍光性その他の特性の低いことが知られているものから選択される。選択したポリマーが所望の特性を有していることは様々な方法で確認できる。ポリマー材料は、インサート成形又は射出成形のような当技術分野で公知の成形法又は将来開発される方法によるプレートの製造に特に適している。
【００４３】
ポリマープレートに代わるものは、９６ウェル及び３８４ウェルフォーマットのシリカモールドである。実施例に示すように、９６ウェル多孔シリカモールドプレートは、試薬の分注、凍結乾燥に使用できる。その利点は、凍結乾燥後にモールドから乾燥試薬を容易に取り出せることである。
【００４４】
混合及び分注
典型的な製剤（一例としてＤＮＡ標識用製剤）は以下の通り作られる。
【００４５】
通例、用いられる試薬はすべて使用前にオートクレーブ又は濾過滅菌（好ましくは０．２５μｍフィルター）される。製剤は氷上で製造、保存され、次いで分注される。２００ｍｌのＤＮＡ標識用製剤（２００００回分の用量の標品）では、Ｆｉｃｏｌｌ ４００及びＦｉｃｏｌｌ ７０各１５ｇと、２０ｇのメレチトースを約９０ｍｌの滅菌水に加え、撹拌プレート上で溶解するまで混合する。
【００４６】
２０倍濃度のＤＮＡ標識用緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＭｇＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ）５０ｍｌを、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液１０ｍｌと共に加える。各１ｍｌの１００ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ及びＴＴＰを加える。すべての試薬を溶液に加えたら、分注に用いるまで、製剤を氷上で又は冷蔵保存する。使用直前に、４００Ｋｕのクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼを加える（最終標品中のグリセロール濃度を１％未満に保つため、原液の最低濃度は１００Ｋｕ／ｍｌとすべきである。）。また、使用直前に、１２００Ａ２６０単位のｄ（Ｎ）９プライマーを加える。製剤に添加する前に、プライマーを６５℃で７分間加熱し、氷上で急冷しておくべきである。酵素及びプライマーの添加後、滅菌水を用いて最終体積を２００ｍｌとすべきである。最終溶液の密度は、１．１４ｇ／ｍｌとなる。
【００４７】
試薬標品を希釈溶液に溶解したときの体積が１０〜１００μｌとなるように、均質試薬溶液の分注量当たりの最終体積は、５〜３０μｌのように少量であることが多く、好ましくは１０μｌである。
【００４８】
所定量の均質溶液を典型的には液体分注ロボット（９６ウェル／３８４ウェルピン）を用いてマルチウェル容器の各ウェルに分注する。溶液は、４μｌ〜２０μｌ、好ましくは１０μｌの体積で分注される。
【００４９】
乾燥プロセス
分注試料は凍結乾燥で乾燥させることができる。適当な乾燥法によって、許容できる硬さ、寸法、形状、Ｔｇ、多孔度、可溶性及び安定性の試薬標品を製造することができる。
【００５０】
適切な凍結乾燥プロフィールの典型例を表１に示す。
【００５１】
【表１】
好ましい乾燥法は凍結乾燥によるものである。分注した試薬を、９６又は３８４ウェルのポリスチレンプレートでうまく乾燥することができる。驚くべきことに、薄肉ポリスチレンプレートを金属板ホルダーに直接接触するように載せると、金属ホルダーを用いずに乾燥させたプレートに比べ、乾燥プロセスがうまくいき、乾燥試薬の発泡及びフレークが認められない（図１及び４）。ポリスチレンウェル（管）の外壁を金属板ホルダーの金属ウェルと直接接触させると、金属棚接触面積が間接的に増大し、ひいては試料への熱伝達が改善される。一方、シリカモールドは各ウェルで厚い壁と平らな底を有しており、金属ホルダーを使用しなくても、シリカモールドでの凍結乾燥プロセスはうまくいく。これは多分モールドと凍結乾燥装置の棚との接触が良好であること、シリカの熱伝達特性によるためである。好ましい凍結乾燥プロファイルを以下の表２に示す。なお、試料は、以下のプログラムを行う前に、凍結乾燥装置で−４６℃で１時間凍結させておいた。
【００５２】
【表２】
保存
出願人は、ポリスチレン及びシリカ系プレート又はモールドで、錠剤、円柱及び立方形の安定な生物試薬標品をうまく製造することができた。本発明の技術によって、温度感受性のタンパク質及び核酸分子を室温で安定な単回用量標品として安定化することができる。単回用量標品（ビーズ又はケーク）は、その分子が用いられる特定のアッセイに必要な所定量の緩衝剤、塩、界面活性剤、ヌクレオチドなどを含むことができる。これらの酵素及びその組合せは、特に限定されないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、全ゲノム増幅、インビトロ転写、ｃＤＮＡ合成を始めとする様々な分子生物学用途に使用できる。
【００５３】
本発明の方法では、試薬混合物を液体窒素又は冷却表面で液滴を凍結する必要はないが、乾燥試薬の良好な構造的健全性は保たれる。また、本発明の方法では、製造プロセスの工程数が少ない。乾燥試薬標品は適切に封止すればプレート又はモールドで直接保存することができ、製造及び包装コストを大幅に減らすことができる。また、乾燥試薬をシリカモールドから錠剤として及びＰｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ社製９６ウェルプレートからキューブとして取り出して、密閉容器（蓋付き瓶）で保存してもよい。
【００５４】
プレート又はモールドの封止は、蓋、テープ、熱活性化テープなどを用いて実施できる。本発明の一実施形態では、プレートの封止は、ＡｂＧｅｎｅ社製のＴｈｅｒｍｏ−Ｓｅａｌ及びＥａｓｙ−Ｐｅｅｌシートを用いた熱活性化シールで行われる。
【００５５】
本発明の試薬標品は室温安定性である。「室温安定性」とは、標品を２２℃で６ヶ月以上、試薬乾燥時の活性と比べて２０％未満の酵素活性の損失で保存できることを意味する。
【００５６】
本発明の試薬標品は１０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。試薬標品の典型的なＴｇは４０℃である。４０℃以上のＴｇで室温（２２℃）での安定性が担保される。好ましいＴｇは４５℃である。ガラス転移温度は、それ以上の温度でガラス質材料の粘度が急激に低下してゴム状、次いで変形可能な可塑体となり、さらに温度を高めると液体となる温度をいう。
【００５７】
ガラス転移温度は、標品の安定性の重要な指標として用いられる。Ｔｇ未満又はその近傍では、試料は安定なガラス状態のままとどまる。温度がＴｇを超えて上昇すると、試料はゴム状となり、安定性が減る。Ｔｇは示差走査熱量測定で求められる。２〜５ｍｇの試料（１〜２個の球剤を破砕したもの）をアルミニウム製パンに入れる。試料のＴｇは、昇温速度１０℃／分で０℃から１００℃に昇温させる温度制御プログラムで測定される。試料の熱の出入りは、ベースラインのシフトとして測定、表示される。Ｔｇは、ベースラインのシフトの中点の温度として表れる。
【００５８】
典型的な多孔度では、球剤は２０μｌの水に１分以内に溶解する。好ましい多孔度では３０秒以内に溶解する。
【００５９】
本発明のガラス化生物試薬標品の製造方法には、幾つかの利点がある。まず、製造プロセスが大幅に簡略化される。試薬混合物を市販マイクロタイタープレートのような標準的フォーマットのマルチウェルプレートのウェルに直接分注する。そのため、試薬の液滴を液体窒素中又は冷却表面上で凍結する必要がない。分注混合物を次いでウェル中で凍結、乾燥し、ウェル中で保存することができる。そのため、乾燥パンからビーズやケークを保存容器に移動させる必要がない。乾燥組成物はマルチウェルプレートで保存できるので、組成物を、後段の自動化されたワークフローに使用できる。プレートの処理には、ロボット装置を使用できる。
【００６０】
さらに、組成物は室温で安定である。そのため、輸送コストが削減でき（ドライアイス輸送は不要となる）、冷凍保存の必要がなく、試薬の調製時間が短縮できる（解凍不要）。ユーザーにも好都合である。アッセイ成分の大半を予め分注して単回用量フォーマットで安定に保存しておくことができる。そのため、ユーザーは時間を節約でき、試薬の原液の調製のためのプラスチック消耗品のコストも節約できる。汚染及び誤差のリスクが減るため、再現性及び信頼性も増す。組成物は予め分注した形態で調製する。そのため、試料の取扱い及びピペット処理工程が減り、ユーザーによる汚染及びピペット作業の誤差の危険性が低減する。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例示するものにすぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって規定される。本明細書の他の以下その他の箇所で引用した文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６２】
実施例１：３８４ウェルポリスチレンプレートでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤（本例ではＰＣＲ用試薬混合物）を、標準的プロトコルにしたがって調製する。略述すると、１０μｌの球状製剤は、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（室温でｐＨ９．０）、１２５ｍＭのＫＣｌ、３．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３．５単位のｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに合成ポリマーＦｉｃｏｌｌ ４００（６．２５％）、Ｆｉｃｏｌｌ ７０（６．２５％）及び二次炭水化物メレチトース（１０％）からなるガラス形成性フィラー材料を含む。通例、試薬はすべて使用前にオートクレーブ又は濾過滅菌される。製剤は、ポリスチレンプレート又はシリカモールドで混合・分注されるまで、氷上で製造・保存される。最終製剤は、上述のガラス形成性フィラー材料、ＢＳＡ、ｄＮＴＰ、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び塩からなる。
【００６３】
均質試薬溶液１用量当たりの最終体積は１０μｌであった。こうして、ＰＣＲの作業体積を２５μｌとすることができる。試薬は、自動ピペットを用いて３８４ウェルポリスチレンプレートに分注した。
【００６４】
３８４ウェルプレートを予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機の棚に約６０分間おいて試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００６５】
乾燥試薬を含むプレートを、単に接着性カバー又は蓋又はヒートシールで覆うことによって、再封止可能な乾燥剤入りパウチに一体パッケージとして保存した。別法では、乾燥試薬をプレートから取り出し、乾燥試薬錠剤又はキューブとして瓶中で保存し、瓶を、再封止可能な乾燥剤入りパウチに保存した。
【００６６】
乾燥試薬組成物の安定性を、λＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。試験に使用したプライマーは、配列番号１（５’−ＧＧＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＧＣ Ｃ−３’）及び配列番号２（５’−ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ Ｇ−３’）であった。リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を図２に示す。
【００６７】
図２の左上に、乾燥試薬組成物の製造に用いた３８４ウェルポリスチレンプレートを示す。乾燥試薬錠剤をプラスチック瓶に入れ（左下）、再封止可能な乾燥剤入りパウチ中で室温で約１週間保存した。乾燥試薬を含む３８４ウェルプレートを左上に示すが、プレートは接着性シールで覆われている。様々な希釈度のλＤＮＡ鋳型の標準曲線を右上に示す。様々な希釈度のλＤＮＡのリアルタイム増幅曲線を右下に示す。結論として、リアルタイムＰＣＲ増幅反応の成功は乾燥試薬組成物が安定であることを立証している。
【００６８】
実施例２：９６ウェルシリカモールドでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤及びガラス形成性フィラー材料を実施例１に準拠して調製及び混合した。約２０μｌの試薬混合物を、自動ピペットを用いて９６ウェルシリカモールドに分注した（図３、左上）。シリカモールドを、予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機に約６０分間載せて試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００６９】
乾燥試薬は、単にモールドを接着性シールで覆い、プレートを乾燥剤入りアルミニウムパウチ中に入れることによってモールド中で保存することができた。別法として、乾燥試薬をモールドから乾燥試薬ケークとして取り出し、乾燥剤入り瓶で保存した。
【００７０】
乾燥試薬組成物の安定性を、実施例１に記載のλＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。結果を図３に示す。
【００７１】
図３の左上に、乾燥試薬組成物の製造に用いた９６ウェルシリカモールドを示す。乾燥試薬のキューブをプラスチック瓶に入れ（左下）、再封止可能な乾燥剤入りパウチ中で室温で約１週間保存してから、λＤＮＡ機能試験を実施した。様々な希釈度のλＤＮＡ鋳型の標準曲線を右上に示す。様々な希釈度のλＤＮＡのリアルタイム増幅プロットを右下に示す。結論として、リアルタイムＰＣＲ増幅反応の成功は乾燥試薬組成物が安定であったことを立証している。
【００７２】
実施例３：９６ウェルポリスチレンプレートでの乾燥ＰＣＲ混合物の調製
生物試薬製剤及びガラス形成性フィラー材料を実施例１に準拠して調製及び混合した。約１０μｌの試薬混合物を、液体分注ロボットを用いて分注した（図１、左下）。９６ウェルプレートを９６ウェル金属ホルダーに載せた（図４）。９６ウェルプレートを金属ホルダーと共に予冷（−４６℃）Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機に約６０分間載せて、試薬を凍結させた。凍結試薬を次いで表２に記載のプロセスによる一次乾燥及び二次乾燥に付した。
【００７３】
乾燥試薬は、ヒートシーラーを用いて単に接着性カバー又は蓋又はヒートシールで９６ウェルプレートを覆うことによって一体パッケージとして保存することができた。調製したての「湿潤」製剤及び乾燥試薬、並びにｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズで、λＤＮＡリアルタイムＰＣＲ機能試験を行った。封止プレートは、室温又は４０℃のインキュベーター内で８日間、乾燥剤入りのパウチ中で保存した。乾燥試薬組成物の安定性は、λＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅反応（実施例１参照）で試験し、その増幅プロファイルを市販品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ）と比較した。結果を、図６、図７及び図８に示す。
【００７４】
図６は、９６ウェル乾燥ＰＣＲケークでのλｑＰＣＲ並びに「湿潤」製剤及びｐｕｒｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズと比較した結果を示す。この図は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。鋳型を含まない対照と併せて、鋳型として出発濃度１０００万〜１０コピーの様々な濃度のλＤＮＡでリアルタイムＰＣＲを実施した。Ｃｔ値及びＰＣＲ効率に関して、本発明の実施形態（右上）とｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズ（左下）と「湿潤」製剤（左上）とで同様の性能が認められた（左下の表）。
【００７５】
図７は、本発明の一実施形態にしたがって製造した乾燥ＰＣＲ試薬の安定性を示す。乾燥ＰＣＲミックスを４０℃又は室温（ＲＴ）で８日間保存してから、λＤＮＡのｑＰＣＲに使用した。本発明の方法で製造した試薬は、市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズと同様の性能を示した。左上は、室温で保存した乾燥ＰＣＲ試薬ケークである。右上は、４０℃で保存した乾燥ＰＣＲ試薬ケークである。左下は、室温で保存したｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズである。右下は、４０℃で保存したｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズである。図８は、室温及び４０℃で保存した本発明の実施形態の試薬及びｐｕｒｅＴａｑ ＲＴＧビーズでのＣｔ値及びＰＣＲ効率を示す。
【００７６】
実施例４：リアルタイムＰＣＲアッセイ用の乾燥試薬の調製
リアルタイムＰＣＲは、遺伝子発現解析のアッセイプラットフォームとして普及しつつある。リアルタイムＰＣＲにおける増幅産物を検出する方法の一つでは、鋳型の特異的部分に相同な二重標識一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡプローブを使用する。このプローブの蛍光修飾部は、レポーター（ＦＡＭ）及びクエンチャー（ＴＡＭＲＡ）として役立つ。一本鎖鋳型の存在下で、プローブは鋳型にアニールするが、レポーター色素とクエンチャー色素が近接しているので蛍光信号は発しない。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで鋳型からＤＮＡが増幅されると、鋳型にアニールした標識プローブが酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって開裂し、クエンチャー色素が放出されるので、レポーターは蛍光を発するようになる。すると、蛍光信号がリアルタイム機器で記録される。
【００７７】
本例では、賦形剤の存在下でＰＣＲプライマーをＴａｑＭａｎプローブと共に凍結乾燥することができて、プライマー及びプローブを凍結乾燥しなかった反応に比べて、機能を損なわずにリアルタイムＰＣＲに使用できることを実証する。β−アクチンのアッセイ用２．５倍濃縮製剤は、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９）、１２５ｍＭのＫＣｌ、３．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μｌのｒＴａｑ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、０．０５％のＮＰ−４０、１．５μＭのβ−アクチンＦｗｄプライマー（配列番号３：５’−ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ−３’）、１．５μＭのβ−アクチンＲｅｖプライマー（配列番号４：５’−ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ−３’）、１μＭのβ−アクチンプローブ（配列番号５：５’−ＦＡＭ−ＡＴＧ ＣＣＣ−Ｎ（ＴＡＭＲＡ）ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＴ Ｃ ＣＴＧ ＣＧＴ ｐ−３’）、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ７０、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ４００及び１０％メレチトースを含む。
【００７８】
製剤１０μｌを、９６ウェルプレートにピペットで分注し、凍結乾燥した。１個の乾燥ケークを様々な量のヒトゲノムＤＮＡ鋳型と共に２５μｌの最終体積に再水和した。リアルタイムＰＣＲ反応はＡＢＩ ７９００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置で実施した。この反応を、プライマー及びプローブを含まない同様の製剤と比較した。後者の反応では、ＰＣＲ反応のセットアップ中に、プライマーとプローブを加えた。さらに別の対照として、市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズを用いた。
【００７９】
図９は、これらの反応の結果を示す。左上はＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを含む凍結乾燥試薬を用いたリアルタイムＰＣＲである。左下は対照凍結乾燥試薬（プライマー及びプローブは凍結乾燥製剤に配合せず、リアルタイムＰＣＲ反応の前に加えた）。右上は市販のｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧビーズの対照（他の試薬はいずれも凍結乾燥せず）である。すべての反応で、増幅プロファイルＲ２値及び傾きは同等であった。ｐｕＲｅ Ｔａｑ ＲＴＧ反応を用いて標準曲線の作成し、他のすべての反応を未知として処理したところ、同量の鋳型ＤＮＡでの反応は標準曲線と合致した（右下）。こうした結果は、ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブがＲＴＧの導入に順応できることを示している。
【００８０】
実施例５：φ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有する乾燥試薬の調製
φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、全ゲノム増幅並びにローリングサークル増幅に広く使用されている。出願人は、この酵素を、全ゲノム増幅の可能な製剤として乾燥凍結した。その分析結果は、凍結乾燥製剤が全ゲノム増幅の実施に際して「湿潤」製剤と同じ活性を有していることを示している。
【００８１】
ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＨＹ（高収率）ＤＮＡ増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）は、等温鎖置換増幅による全ゲノム増幅に必要なすべての成分を含んでいる。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ反応の出発材料は、精製ＤＮＡでも、非精製細胞溶解物でもよい。数ｎｇの量の出発材料からμｇオーダーのＤＮＡをわずか数時間で生成させることができる。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＨＹ反応での典型的なＤＮＡ収率は、５０μｌ反応当たり４０〜５０μｇであり、平均的な生成物の鎖長は１０ｋｂを超える。ＤＮＡ複製は酵素の校正３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のため極めて正確である。
【００８２】
φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムヘキサマー、ｄＮＴＰ及びＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＨＹ反応緩衝液を、安定剤のＦｉｃｏｌｌ ７０、Ｆｉｃｏｌｌ ４００、メレチトース及びＢＳＡと共に含むＧｅｎｏｍｉＰｈｉ反応混合物を２倍混合物として調製した。混合物の１０μｌ量を１２ウェルＰＣＲストリップチューブに分注した。分注生成物をＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥機を用いてケークとして凍結乾燥した。乾燥生成物を室温又は４０℃で３５日間保存した。これらの生成物で、１０ｎｇの少量のヒトゲノムＤＮＡでも全ゲノム増幅をうまく実施できた。これを、調製したての混合物を使用した全ゲノム増幅と、時間０及び室温又は４０℃で３５日間保存後に比較した。
【００８３】
図１０は、凍結乾燥試薬又は「湿潤」混合物を用いた全ゲノム増幅アッセイの結果を示す。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを鋳型材料として使用し、３０℃で９０分間増幅反応を行った。９０分で４μｇ超のＤＮＡが生成するものと予測された。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで、４０℃で３５日間保存しておいた凍結乾燥試薬でも強い増幅が検出された。φ２９ＤＮＡポリメラーゼは凍結乾燥フォーマットでうまく安定化された。
【００８４】
実施例６：インビトロ転写用の乾燥試薬の製造
転写は、すべての種類の細胞で定期的に行われる生命維持に必須な生物学的プロセスであり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鋳型を用いてＲＮＡが作られる。インビトロ転写（ＩＶＴ）では、エンドユーザーが選択した転写物を生成するため、これと同じプロセスを細胞外の試験管内で行う。得られたＲＮＡ分子は、タンパク質のインビトロ翻訳或いはハイブリダイゼーション反応、例えばノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ分析及びマイクロインジェクションなどに使用できる。
【００８５】
本発明者らは、ＲＮＡの生成に必要な、鋳型を除くすべての成分を賦形剤の存在下で凍結乾燥した室温安定性凍結乾燥ＩＶＴ試薬を成功裡に得ることができた。これによってＩＶＴ反応は大幅に簡略化され、エンドユーザーは鋳型ＤＮＡと水を加えるだけで反応を開始させることができる。
【００８６】
凍結乾燥試薬の製造に用いられるＩＶＴ製剤は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＣＴＰ、０．５ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍＭのＵＴＰ、２ＵのＲＮＡＧｕａｒｄ、１０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ４００、６．２５％のＦｉｃｏｌｌ ７０、１０％のメレチトースを含んでいた。調製した製剤を８ウェルのストリップチューブに２５μｌずつ分注し、実施例１及び表２にしたがって凍結乾燥した。乾燥試薬ケークを、Ｒｏｃｈｅ社製ＳＰ６／Ｔ７ ＩＶＴキットの対照ＤＮＡを用いて試験した。並行して、Ｒｏｃｈｅ社製ＳＰ６／Ｔ７ ＩＶＴキットを用いたＩＶＴ反応を実施した。
【００８７】
予想通り、Ｒｏｃｈｅ社製キットだけでなく、凍結乾燥試薬を用いても、約１０００塩基対の転写物が生成した（図１１）。したがって、転写に必要な試薬を賦形剤の存在下で成功裡に凍結乾燥させ、ＤＮＡ鋳型の存在下で適量の反応体積に再水和すれば、ＲＮＡ転写物を生成させることができる。
【００８８】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明してきたが、本発明の教示内容から逸脱せずに様々な変更及び修正をなすことができることは自明であろう。以上の明細書及び添付の図面に記載された事項は例示を目的としたものにすぎず、限定的なものではない。本発明の技術的範囲は、従来技術に照らして特許請求の範囲を解釈することによって規定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥試薬標品の製造方法であって、当該方法が、
（ａ）１種以上の緩衝生物試薬の水溶液を調製する工程と、
（ｂ）ガラス形成性フィラー材料を、緩衝生物試薬溶液と混合して、多孔質ガラス状組成物の形成を促進するのに十分な濃度のフィラー材料を含む混合物を調製する工程と、
（ｃ）上記混合物を実質的に均一な液滴の形態でマルチウェル容器の各ウェルに１滴ずつ分注する工程と、
（ｄ）上記容器中で液滴を乾燥して試薬標品を形成する工程と
を含んでおり、上記試薬標品が水溶性であり室温安定性に十分なＴｇを有する、方法。
【請求項２】
乾燥試薬の長期保存のため乾燥液滴を試薬瓶に回収する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記マルチウェル容器を、乾燥試薬の長期保存のためシールテープ又はヒートシールで封止する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記シールテープが熱活性化される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記マルチウェル容器がシリカモールドである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記マルチウェル容器がポリスチレンプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリスチレンプレートが９６ウェルプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ポリスチレンプレートが３８４ウェルプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥工程の前に、前記ポリスチレンプレートを金属モールド上に載せてポリスチレンマルチウェルプレートの各ウェルの外壁を金属モールドのウェルと密着させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記乾燥工程が凍結乾燥で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上の緩衝生物試薬が、生物アッセイ用のアッセイ混合物である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記乾燥工程の前に、分注した混合物を凍結させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法で製造した乾燥試薬標品を含む試薬組成物。
【請求項１４】
乾燥試薬標品が、１回のアッセイに十分な量の乾燥試薬を含む、請求項１３記載の試薬組成物。
【請求項１５】
前記アッセイ混合物が、増幅用の鋳型とプライマーを除く、ＰＣＲに必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、インビトロ転写に必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、全ゲノム増幅に必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、リアルタイムＰＣＲに必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１】
乾燥試薬標品の製造方法であって、当該方法が、
（ａ）１種以上の緩衝生物試薬の水溶液を調製する工程と、
（ｂ）ガラス形成性フィラー材料を、緩衝生物試薬溶液と混合して、多孔質ガラス状組成物の形成を促進するのに十分な濃度のフィラー材料を含む混合物を調製する工程と、
（ｃ）上記混合物を実質的に均一な液滴の形態でマルチウェル容器の各ウェルに１滴ずつ分注する工程と、
（ｄ）上記容器中で液滴を乾燥して試薬標品を形成する工程と
を含んでおり、上記試薬標品が水溶性であり室温安定性に十分なＴｇを有する、方法。
【請求項２】
乾燥試薬の長期保存のため乾燥液滴を試薬瓶に回収する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記マルチウェル容器を、乾燥試薬の長期保存のためシールテープ又はヒートシールで封止する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記シールテープが熱活性化される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記マルチウェル容器がシリカモールドである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記マルチウェル容器がポリスチレンプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリスチレンプレートが９６ウェルプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ポリスチレンプレートが３８４ウェルプレートである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥工程の前に、前記ポリスチレンプレートを金属モールド上に載せてポリスチレンマルチウェルプレートの各ウェルの外壁を金属モールドのウェルと密着させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記乾燥工程が凍結乾燥で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上の緩衝生物試薬が、生物アッセイ用のアッセイ混合物である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記乾燥工程の前に、分注した混合物を凍結させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法で製造した乾燥試薬標品を含む試薬組成物。
【請求項１４】
乾燥試薬標品が、１回のアッセイに十分な量の乾燥試薬を含む、請求項１３記載の試薬組成物。
【請求項１５】
前記アッセイ混合物が、増幅用の鋳型とプライマーを除く、ＰＣＲに必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、インビトロ転写に必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、全ゲノム増幅に必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記アッセイ混合物が、鋳型を除く、リアルタイムＰＣＲに必要なすべての試薬を含む、請求項１１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５０３４１０（Ｐ２０１０−５０３４１０Ａ）
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８４７０（Ｐ２００９−５２８４７０）
【出願日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８３７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６５４４
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８３７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６５４４
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]