キノコ廃菌床を原料としたエタノール変換方法
【課題】本発明は、キノコ廃菌床を利用してエタノールを容易にかつ収率よく得る方法の開発を課題とする。
【解決手段】本発明は、キノコ廃菌床をアルカリ溶液で処理し、後酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵を行うか又は酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵の併用による併行複発酵を行い、エタノールを得るものである。
【解決手段】本発明は、キノコ廃菌床をアルカリ溶液で処理し、後酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵を行うか又は酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵の併用による併行複発酵を行い、エタノールを得るものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキノコ栽培後に廃棄物として残る廃菌床中の、エネルギー資源として利用可能な、木質バイオマスを利用してキノコ廃菌床のエタノールへの変換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
木材成分の約半分を占めるセルロースはグルコースが多数直鎖状に連なったもので、そのままでも紙などに利用できるが、グルコースまで分解する（糖化）ことによりその利用法は広がる。特に注目されているのはグルコースをエタノールに変換することによる液体燃料としての利用である。
【０００３】
しかしながら木材のセルロースはリグニンなどに囲まれており単離し難く、セルロース自身も難分解性であるという点でその利用が制限されていた。そのため古くは第二次世界大戦前より様々な分解（糖化）法が考えられ、試みられてきた。
【０００４】
古くから木材を糖化する方法として知られているのは濃硫酸糖化法である。これは濃硫酸と木材を高温下で反応させることにより、セルロースを加水分解してグルコースを取り出す方法である。この方法でよく知られているのがショーラー法や北海道法である。また、それが改良された方法として短時間の濃硫酸処理の後に30%程度まで硫酸を希釈して熱をかけて糖化するアルケノール社の方法などが存在する。
【０００５】
これらの方法は最も簡単に木材からグルコースを取り出すことができる方法として知られているが、反面濃硫酸を用いるため装置の腐食を考慮する必要があり、その素材にかける費用やメンテナンスの費用が大きくなるという問題がある。
【０００６】
濃硫酸糖化法に変わる方法として考えられているのは、酵素糖化法である。これはセルロースを分解する酵素セルラーゼを用いて濃硫酸糖化法よりも温和な条件でグルコースを得ることを目的としている。また、セルラーゼ糖化と酵母によるエタノール発酵を同時併用による併行複発酵を行うことで、セルラーゼ類の活性が、生じた糖により阻害されることが防がれ、エタノール変換効率が上昇する。さらにひとつの容器で二つの反応を同時に行うことができるので、工程を簡略化することができる。しかし、木材中セルロースは前述の通りリグニンなどに囲まれているため、そのままではセルラーゼと反応させても糖化し難い。従って木材に何らかの前処理が必要となる。
【０００７】
酵素糖化法の前処理として考えられているのにアルカリ法や希硫酸法などが存在する。アルカリ処理は草本系植物では実績があるものの、木質系植物では大きな効果が得られていない。一方の希硫酸処理は1%未満の硫酸で木材を処理するものであり、酵素糖化法の前処理としては最も用いられている方法である。しかしながら、高温高圧化での反応を必要としており、またやはり硫酸を用いるということで濃硫酸糖化法と同様に装置の腐食の問題が生じてしまう。
【０００８】
一方、マイタケを含むキノコ類の人工栽培では周年空調菌床栽培が一般的となりつつある。菌床栽培では細かく砕いたオガコとキノコの栄養分を混ぜ合わせ、含水率を適宜調節して袋やビンに詰めた培地を作成する。これを滅菌してからキノコ菌糸を植えて適当な条件下で数ヶ月培養し、キノコ菌糸が培地内外に蔓延した(この状態を菌床と言う。)後、キノコ子実体を形成させる。自然界ではキノコ類が含まれる担子菌類は他の生物と競合せざるを得ず、その結果として難分解性の木材を資化しているが、菌床栽培ではその競合が無いため、より資化しやすい木材以外の栄養分を使って成長していると考えられている。
【０００９】
実際、マイタケでは木材のβ-グルカン（セルロース）よりも栄養分由来のα-グルカンを優先的に消化することが知られている。よって、菌床栽培でキノコを収穫した後に残る菌床（廃菌床）には未利用のオガコ中セルロース分がほとんど無傷のまま残っていると考えられる。かかる観点から廃菌床は木質系バイオマス資源としては有望である。さらにマイタケなど一部のキノコは工場での大規模栽培が行われており、大量にまとめて廃菌床を得ることができる。しかしながら、現在のところ廃菌床の利用はボイラーの熱源などごく一部に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、キノコ廃菌床を利用してエタノールを容易にかつ収率よく得る方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、キノコの工場栽培で大量に排出され、限定的な利用しかできない廃菌床に残っているセルロースを酵素処理により糖、さらにエタノールに変換する際、アルカリ溶液による前処理効果が高いことを知見して本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、キノコ廃菌床をアルカリ溶液で処理し、後酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵を行うか又は酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵の併用による併行複発酵を行い、エタノールを得るもので以下詳述する。
【００１３】
本発明は、
（１）キノコ廃菌床をアルカリ溶液を用いて前処理後、アルカリを除き、次いでセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行うか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵の併用による併行複発酵を行うかの何れかによる、キノコ廃菌床のエタノールへの変換方法、
(２)アルカリを除くために酸による中和を施すことを特徴とする(１)記載の変換方法、
(３）アルカリ溶液を用いた前処理を, 水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの溶液を用いて90-125℃で加熱処理とすることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の変換方法、
（４）キノコ廃菌床がマイタケ廃菌床、ブナシメジ廃菌床又はエリンギ廃菌床であることを特徴とする上記（1）乃至（３）に記載の変換方法
に関する。
【００１４】
まず、キノコの袋栽培やビン栽培の廃菌床(ここでいう廃菌床とは、マイタケ、ブナシメジ、エリンギ、エノキタケ、ヒラタケ及びシイタケなどオガコを利用した培地で栽培した商用キノコの子実体を収穫した後の菌床を指す)をアルカリ溶液に懸濁する。袋栽培の場合、キノコ廃菌床は通常ブロック状で排出される。まずこれを崩してからアルカリ溶液に懸濁すると良い。ビン栽培の場合はビン内部の廃菌床を掻きだしてからアルカリ溶液に懸濁する。この時キノコ菌糸体は混入しても良い。
【００１５】
ここで言うアルカリとは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムや水酸化カルシウムなど塩基性を示す、主としてアルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物を指し、そのアルカリ溶液のアルカリ濃度は1%（w/v）以上であれば効果的であるが、10%までは濃くなるほどその後の酵素処理による変換が起こり易くなる。しかしながら、アルカリが濃いほどアルカリに溶出する成分が多くなるので、目的に応じて使い分けると良い。溶液がアルカリ性を示すものであれば良い。
【００１６】
アルカリ溶液に懸濁する廃菌床の量は、アルカリ溶液の体積に対して40%を超えない程度が良好であり、望むべきは20%以下である。
【００１７】
廃菌床をアルカリ液に浸すだけでもある程度のアルカリ処理効果が望めるが、より効果的に反応させるには加熱する必要がある。パルプ業界等では木材のアルカリ蒸解では水酸化ナトリウムや硫化ナトリウムからなるアルカリ蒸解液を用いて160〜200℃まで加熱してリグニン等の物質を除いてセルロースとする。本発明では室温程度で十分な効果が得られるが、好ましくは90〜125℃で約１時間程度の処理にて望むべき効果を得ることが可能である。すなわち、通常の木材のアルカリ蒸解に比し、低い温度で処理することができる。
【００１８】
加熱時間は60分以上行っても大きな効果を得ることはできないので、60分程度とするのが良い。加熱はオートクレーブを用いるのが手軽であるが、大量に反応させるには耐アルカリ、耐圧で加熱できる反応器を作成するのが適当である。加熱方法は、処理量が少量の場合はオイルバスやホットプレート等、大量の場合は蒸気など加熱・加温できるものであればその種類は問わない。その際、攪拌をすることにより、より効果的に反応させることができる。
【００１９】
加熱反応後、廃菌床−アルカリ液を冷却し、次にアルカリを除く洗浄が行われる。洗浄は流水で流すだけでも良いが、アルカリが完全に除けるまで時間がかかる場合は、酸を用いてアルカリを中和してから洗浄すると、洗浄時間を短縮できるので好ましい。洗浄は廃液が透明になるまで行うのが良い。
【００２０】
中和に用いる酸としては、硫酸、塩酸又は燐酸等が使用でき、特に硫酸が好ましい。
洗浄後の廃菌床はそのまま次の変換工程に用いても良いが、乾燥することにより、長期保存ができるようになる。
【００２１】
一連の処理を受けた廃菌床はセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行なうか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵を併行して同時に行う併行複発酵を行うことによりエタノールに変換される。
【００２２】
特に本発明によるアルカリ処理済廃菌床は、セルラーゼ若しくはセルラーゼを主体とする酵素及び酵母とともに培養することにより、セルラーゼによる廃菌床中セルロースのグルコースへの糖化すなわちセルラーゼ糖化と、そのグルコースを用いて酵母によるエタノール発酵を同時に行う併行複発酵において、グルコースによるセルラーゼ活性阻害が少なくなり、より効果的に発酵が進むことになる。
【００２３】
発酵に用いるセルラーゼ若しくはセルラーゼを主体とする酵素は市販品であっても、糸状菌を培養した培養液やそれから精製したものであっても、セルロースをグルコースへ分解できるものであれば良い。酵素の量は、ろ紙分解活性(Filter Paper Unit、FPU)が発酵に用いたアルカリ処理済廃菌床１ｇ当り12.5−50FPUとなるように加える。酵素の形態が粉末状である場合はpH5.0付近のバッファーに懸濁すると使用しやすい。酵素液は0.45μm以下のフィルターを通して雑菌を除いておくと発酵系への雑菌のコンタミネーションを防ぐことができる。
【００２４】
同じく使用する微生物のうち酵母については、Saccharomyces cereviciaeを用いるのが簡便であるので有効であるが、条件に応じて耐塩性のShizosaccharomyces pombeやペントース発酵が可能であるPichia stipitis、また酵母以外ではエタノール発酵が可能な細菌であるZymomonas mobilisなどエタノール発酵が可能である生物ならば、遺伝子組み換えをされたものも含めて何でも使用できる。S. cereviciaeを用いる場合、スラントや凍結などで保存されているものを使用して良いが、市販のパン酵母を用いても良い。パン酵母を用いる場合はその形態が乾燥であれ、生であれ、そのまま発酵系に投入することにより、発酵初期から酵母が高濃度で存在することとなるため効率が良い。スラント等で保存してある状態の酵母を用いる場合は、併行複発酵に用いる前に液体培地を用いて前培養すると酵母の量や活性を上げることができるので望ましい。
【００２５】
前培養に用いる液体培地は1%酵母エキス、2%ペプトン、3%グルコース、pH5.0のような、酵母の培養に適しているものであれば何でも良い。前培養終了後に集菌して使用する。酵母の投入量は終濃度0.1g／L以上であれば問題なく発酵できるが、多ければ前述のように発酵効率が良いとともにコンタミネーションを防ぐことができる。
【００２６】
廃菌床は発酵量に対して適当量加えて良いが、廃菌床が高濃度になると高粘度となるので発酵初期の攪拌が困難になる。よって、投入する廃菌床の量は攪拌機の能力を考慮してよく攪拌できる量に調整すると良い。
【００２７】
廃菌床や酵母成長に必要な栄養源を加えた発酵液はオートクレーブにて滅菌する（121℃、15分以上）。滅菌後37℃程度まで冷却し、先に述べた酵素や酵母を投入し、37℃で発酵を開始する。発酵中は嫌気状態にし、攪拌を行うと効率が上がる。こうして1−3日培養を行うことにより、廃菌床中のセルロース分をエタノールに変換することができる。
【発明の効果】
【００２８】
キノコ栽培後の廃菌床を再利用して、木材等からの製造に比較して、緩和な製造条件で、しかもより高い収率でエタノールが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明をより具体的に説明するために、以下に実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
小スケールでの変換
ブナオガコとコーンブランを体積比9：1で混合し、含水率を65%に調整したものをマイタケ栽培培地として作成した。それを2.5kgマイタケ栽培用袋に詰めて105℃、2時間滅菌した。冷却後マイタケ菌を植菌して25℃程度で2.5ヶ月培養後16℃程度の部屋に移し、栽培袋上部を切りマイタケ子実体を発生させた。子実体の収穫適期になったら収穫し、廃菌床を得た。
【００３１】
廃菌床上部の菌糸塊を取り除いた後、廃菌床を崩してよく混ぜた。乾重量で20gとなるように崩した廃菌床をプラスチック製ビン中に入れ、そこに5%NaOH溶液を100ml注ぎ込んだ。よく混ぜて廃菌床全体がNaOH溶液に浸るようにし、ラップで封をして100℃、60分にてオートクレーブした。オートクレーブ終了後、廃菌床−NaOH溶液を室温まで冷却した。廃菌床−NaOH溶液のpHが12.5であったため、硫酸を用いてpHを7.0付近まで下げた。その後80メッシュのふるいと流水を用いてNaOH処理済廃菌床を洗浄廃液が透明になるまで洗浄した。乾燥機を用いて洗浄したNaOH処理済廃菌床を乾燥した後エタノール変換に用いた。
【００３２】
エタノール変換は発酵液40mlの系で行った。すなわち、100mlの三角フラスコに30mlの50mMクエン酸−燐酸バッファー（pH5.0）をいれ、そこに4.8g（終濃度12%）の処理済廃菌床を混合し、濃燐酸を用いてpHを5.0に調整した。別に10倍濃の0.1%酵母エキス、0.2%ペプトンからなる栄養溶液を作成した。それぞれ121℃、15分オートクレーブし、室温まで冷却した。滅菌した50mMクエン酸−燐酸バッファー（pH5.0）に乾燥酵母を10g／Lとなるように加えてよく攪拌し、酵母液とした。また、60FPU分のセルラーゼ粉末を2mlのバッファーに懸濁しセルラーゼ溶液とし、それを0.42μmのフィルターを用いてフィルター滅菌した。
【００３３】
クリーンベンチ内で無菌的に30mlの廃菌床液に4mlの栄養溶液及び酵母液、及び2mlのセルラーゼ溶液を添加して40mlとした。三角フラスコにエタノールで滅菌した発酵栓でふたをし、隙間をパラフィルムでふさいだ。こうして調整したフラスコを37℃のインキュベーターに入れ、120往復の振盪をしながら7日間発酵（培養）させた。
【００３４】
比較対照として培地に使用するブナオガコを同様にNaOH処理、SSF(併行複発酵、Simultaneous Saccharification and Fermentation)したものを用意した。
【００３５】
培養終了後、遠心分離にて上清を採取し、ガスクロマトグラフィーにてエタノール濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、廃菌床を利用することにより前処理を行わなくても得られたエタノール量は前処理をしていないブナオガコよりも増加する。廃菌床をNaOHにより処理することにより更にエタノール濃度が増加し、得られたエタノール濃度はNaOH処理をしない場合と比較して約2倍強となった。ブナオガコもNaOH処理によりエタノール濃度が増えるが、廃菌床ほど多くのエタノールは得られなかった。
【実施例２】
【００３８】
大スケールでの変換
使用した廃菌床は実施例1に準じる。50L容の反応用タンクに20Lの5%NaOH溶液と乾重量で4kgの廃菌床を入れ、付属の攪拌羽を用いてよく攪拌した。タンク外部のジャケット中にボイラーからの蒸気を流入し、反応液温度を100℃まで上昇させた。その際、常に120rpmで攪拌し続けた。60分反応後蒸気流入を止め、50℃程度まで冷却した。
【００３９】
反応液は固液分離装置により固形分と液体に分けられ、固形分は固液分離装置に入れたまま、上部より水をシャワー状にかけ続けることにより固形分の洗浄を行った。洗浄は廃液が中性になるまで続けた。ここまでを廃菌床の前処理とした。
【００４０】
蒸気にて空滅菌していた80L容の発酵用タンクにpH計、溶存酸素計を取り付け、上記前処理済廃菌床2.4kg（乾）、水18L、を投入し備え付けの攪拌羽でよく混ぜた。この際、酵母の栄養源となる酵母エキス及びペプトンは添加しなかった。蓋をしてタンク外部のジャケット中にボイラーからの蒸気を流入し、タンク内溶液を120℃まで上昇させて30分保持することにより滅菌した。冷却後、5NNaOH溶液及び濃燐酸にて液のｐHを5.0に調整した。そこに2Lの50mMクエン酸−燐酸バッファーに60kFPU分のセルラーゼ粉末を懸濁した酵素液及び200gの乾燥パン酵母を投入することにより発酵液を作成した。
【００４１】
発酵タンクを温度37℃、攪拌回転数150rpm、pH5.0に保ちつつ4日間発酵を行わせた。一日おきに発酵液を数量サンプリングし、遠心後の上清中エタノール濃度を実施例1と同様にして調べた。また、廃菌床に代えてブナオガコを用いて行ったものを比較対照とした。エタノール収率の経時変化結果を表2に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２から分かる様にブナオガコと比較して廃菌床を用いた場合、約1.6倍のエタノール収率となる。
【００４４】
実施例1、2からマイタケ廃菌床を用いることにより、同様のアルカリ処理と発酵操作を行ったブナオガコよりも効率よくエタノールを得ることが出来ることが分かる。
【実施例３】
【００４５】
ブナシメジ廃菌床の糖への変換
スギオガコを主体とした培地を850mlビンに作成し、滅菌後ブナシメジを植菌した。3ヶ月ほど培養後子実体を形成させ収穫を行い廃菌床を得た。収穫直後の廃菌床について実施例1と同様にNaOH処理を行った後、糖化を実施した。対照として培養前培地及びスギオガコを用意した。
【００４６】
糖化は次のようにして実施した。すなわち、50mMクエン酸バッファー中に60FPU／gバイオマスのセルラーゼ及び1mMアジ化ナトリウムが含まれた酵素液を作成し、10mlを100mgの乾燥させたNaOH処理済廃菌床、NaOH処理済培養前培地、NaOH処理済スギオガコを入れた50ml三角フラスコに分注した。水分が蒸発しないように蓋をし、50℃にて120rpmで振盪をしながら3日間反応させた。反応終了後、必要量をサンプリングし、沸騰湯浴中で5分保持することによりセルラーゼを失活させた。遠心にて不溶分を除いた後に、グルコースセンサーを用いて溶液中のグルコース濃度を求めた。その結果を表3に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
表３から分かるように、ブナシメジにおいてもマイタケと同様に栽培を行い、その廃菌床を前処理して用いることにより、より多くのグルコースを得ることができる。このグルコースを酵母等により発酵させることにより、エタノールなどにさらに変換することが可能である。
なお、スギオガコを主体としたエリンギ廃菌床においてもほぼ同様の結果が得られることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明はキノコ栽培後に廃棄物として残る廃菌床中の、エネルギー資源として利用可能な、木質バイオマスを利用してキノコ廃菌床のエタノールへの変換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
木材成分の約半分を占めるセルロースはグルコースが多数直鎖状に連なったもので、そのままでも紙などに利用できるが、グルコースまで分解する（糖化）ことによりその利用法は広がる。特に注目されているのはグルコースをエタノールに変換することによる液体燃料としての利用である。
【０００３】
しかしながら木材のセルロースはリグニンなどに囲まれており単離し難く、セルロース自身も難分解性であるという点でその利用が制限されていた。そのため古くは第二次世界大戦前より様々な分解（糖化）法が考えられ、試みられてきた。
【０００４】
古くから木材を糖化する方法として知られているのは濃硫酸糖化法である。これは濃硫酸と木材を高温下で反応させることにより、セルロースを加水分解してグルコースを取り出す方法である。この方法でよく知られているのがショーラー法や北海道法である。また、それが改良された方法として短時間の濃硫酸処理の後に30%程度まで硫酸を希釈して熱をかけて糖化するアルケノール社の方法などが存在する。
【０００５】
これらの方法は最も簡単に木材からグルコースを取り出すことができる方法として知られているが、反面濃硫酸を用いるため装置の腐食を考慮する必要があり、その素材にかける費用やメンテナンスの費用が大きくなるという問題がある。
【０００６】
濃硫酸糖化法に変わる方法として考えられているのは、酵素糖化法である。これはセルロースを分解する酵素セルラーゼを用いて濃硫酸糖化法よりも温和な条件でグルコースを得ることを目的としている。また、セルラーゼ糖化と酵母によるエタノール発酵を同時併用による併行複発酵を行うことで、セルラーゼ類の活性が、生じた糖により阻害されることが防がれ、エタノール変換効率が上昇する。さらにひとつの容器で二つの反応を同時に行うことができるので、工程を簡略化することができる。しかし、木材中セルロースは前述の通りリグニンなどに囲まれているため、そのままではセルラーゼと反応させても糖化し難い。従って木材に何らかの前処理が必要となる。
【０００７】
酵素糖化法の前処理として考えられているのにアルカリ法や希硫酸法などが存在する。アルカリ処理は草本系植物では実績があるものの、木質系植物では大きな効果が得られていない。一方の希硫酸処理は1%未満の硫酸で木材を処理するものであり、酵素糖化法の前処理としては最も用いられている方法である。しかしながら、高温高圧化での反応を必要としており、またやはり硫酸を用いるということで濃硫酸糖化法と同様に装置の腐食の問題が生じてしまう。
【０００８】
一方、マイタケを含むキノコ類の人工栽培では周年空調菌床栽培が一般的となりつつある。菌床栽培では細かく砕いたオガコとキノコの栄養分を混ぜ合わせ、含水率を適宜調節して袋やビンに詰めた培地を作成する。これを滅菌してからキノコ菌糸を植えて適当な条件下で数ヶ月培養し、キノコ菌糸が培地内外に蔓延した(この状態を菌床と言う。)後、キノコ子実体を形成させる。自然界ではキノコ類が含まれる担子菌類は他の生物と競合せざるを得ず、その結果として難分解性の木材を資化しているが、菌床栽培ではその競合が無いため、より資化しやすい木材以外の栄養分を使って成長していると考えられている。
【０００９】
実際、マイタケでは木材のβ-グルカン（セルロース）よりも栄養分由来のα-グルカンを優先的に消化することが知られている。よって、菌床栽培でキノコを収穫した後に残る菌床（廃菌床）には未利用のオガコ中セルロース分がほとんど無傷のまま残っていると考えられる。かかる観点から廃菌床は木質系バイオマス資源としては有望である。さらにマイタケなど一部のキノコは工場での大規模栽培が行われており、大量にまとめて廃菌床を得ることができる。しかしながら、現在のところ廃菌床の利用はボイラーの熱源などごく一部に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、キノコ廃菌床を利用してエタノールを容易にかつ収率よく得る方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、キノコの工場栽培で大量に排出され、限定的な利用しかできない廃菌床に残っているセルロースを酵素処理により糖、さらにエタノールに変換する際、アルカリ溶液による前処理効果が高いことを知見して本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、キノコ廃菌床をアルカリ溶液で処理し、後酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵を行うか又は酵素による糖化と微生物によるアルコール発酵の併用による併行複発酵を行い、エタノールを得るもので以下詳述する。
【００１３】
本発明は、
（１）キノコ廃菌床をアルカリ溶液を用いて前処理後、アルカリを除き、次いでセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行うか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵の併用による併行複発酵を行うかの何れかによる、キノコ廃菌床のエタノールへの変換方法、
(２)アルカリを除くために酸による中和を施すことを特徴とする(１)記載の変換方法、
(３）アルカリ溶液を用いた前処理を, 水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの溶液を用いて90-125℃で加熱処理とすることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の変換方法、
（４）キノコ廃菌床がマイタケ廃菌床、ブナシメジ廃菌床又はエリンギ廃菌床であることを特徴とする上記（1）乃至（３）に記載の変換方法
に関する。
【００１４】
まず、キノコの袋栽培やビン栽培の廃菌床(ここでいう廃菌床とは、マイタケ、ブナシメジ、エリンギ、エノキタケ、ヒラタケ及びシイタケなどオガコを利用した培地で栽培した商用キノコの子実体を収穫した後の菌床を指す)をアルカリ溶液に懸濁する。袋栽培の場合、キノコ廃菌床は通常ブロック状で排出される。まずこれを崩してからアルカリ溶液に懸濁すると良い。ビン栽培の場合はビン内部の廃菌床を掻きだしてからアルカリ溶液に懸濁する。この時キノコ菌糸体は混入しても良い。
【００１５】
ここで言うアルカリとは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムや水酸化カルシウムなど塩基性を示す、主としてアルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物を指し、そのアルカリ溶液のアルカリ濃度は1%（w/v）以上であれば効果的であるが、10%までは濃くなるほどその後の酵素処理による変換が起こり易くなる。しかしながら、アルカリが濃いほどアルカリに溶出する成分が多くなるので、目的に応じて使い分けると良い。溶液がアルカリ性を示すものであれば良い。
【００１６】
アルカリ溶液に懸濁する廃菌床の量は、アルカリ溶液の体積に対して40%を超えない程度が良好であり、望むべきは20%以下である。
【００１７】
廃菌床をアルカリ液に浸すだけでもある程度のアルカリ処理効果が望めるが、より効果的に反応させるには加熱する必要がある。パルプ業界等では木材のアルカリ蒸解では水酸化ナトリウムや硫化ナトリウムからなるアルカリ蒸解液を用いて160〜200℃まで加熱してリグニン等の物質を除いてセルロースとする。本発明では室温程度で十分な効果が得られるが、好ましくは90〜125℃で約１時間程度の処理にて望むべき効果を得ることが可能である。すなわち、通常の木材のアルカリ蒸解に比し、低い温度で処理することができる。
【００１８】
加熱時間は60分以上行っても大きな効果を得ることはできないので、60分程度とするのが良い。加熱はオートクレーブを用いるのが手軽であるが、大量に反応させるには耐アルカリ、耐圧で加熱できる反応器を作成するのが適当である。加熱方法は、処理量が少量の場合はオイルバスやホットプレート等、大量の場合は蒸気など加熱・加温できるものであればその種類は問わない。その際、攪拌をすることにより、より効果的に反応させることができる。
【００１９】
加熱反応後、廃菌床−アルカリ液を冷却し、次にアルカリを除く洗浄が行われる。洗浄は流水で流すだけでも良いが、アルカリが完全に除けるまで時間がかかる場合は、酸を用いてアルカリを中和してから洗浄すると、洗浄時間を短縮できるので好ましい。洗浄は廃液が透明になるまで行うのが良い。
【００２０】
中和に用いる酸としては、硫酸、塩酸又は燐酸等が使用でき、特に硫酸が好ましい。
洗浄後の廃菌床はそのまま次の変換工程に用いても良いが、乾燥することにより、長期保存ができるようになる。
【００２１】
一連の処理を受けた廃菌床はセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行なうか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵を併行して同時に行う併行複発酵を行うことによりエタノールに変換される。
【００２２】
特に本発明によるアルカリ処理済廃菌床は、セルラーゼ若しくはセルラーゼを主体とする酵素及び酵母とともに培養することにより、セルラーゼによる廃菌床中セルロースのグルコースへの糖化すなわちセルラーゼ糖化と、そのグルコースを用いて酵母によるエタノール発酵を同時に行う併行複発酵において、グルコースによるセルラーゼ活性阻害が少なくなり、より効果的に発酵が進むことになる。
【００２３】
発酵に用いるセルラーゼ若しくはセルラーゼを主体とする酵素は市販品であっても、糸状菌を培養した培養液やそれから精製したものであっても、セルロースをグルコースへ分解できるものであれば良い。酵素の量は、ろ紙分解活性(Filter Paper Unit、FPU)が発酵に用いたアルカリ処理済廃菌床１ｇ当り12.5−50FPUとなるように加える。酵素の形態が粉末状である場合はpH5.0付近のバッファーに懸濁すると使用しやすい。酵素液は0.45μm以下のフィルターを通して雑菌を除いておくと発酵系への雑菌のコンタミネーションを防ぐことができる。
【００２４】
同じく使用する微生物のうち酵母については、Saccharomyces cereviciaeを用いるのが簡便であるので有効であるが、条件に応じて耐塩性のShizosaccharomyces pombeやペントース発酵が可能であるPichia stipitis、また酵母以外ではエタノール発酵が可能な細菌であるZymomonas mobilisなどエタノール発酵が可能である生物ならば、遺伝子組み換えをされたものも含めて何でも使用できる。S. cereviciaeを用いる場合、スラントや凍結などで保存されているものを使用して良いが、市販のパン酵母を用いても良い。パン酵母を用いる場合はその形態が乾燥であれ、生であれ、そのまま発酵系に投入することにより、発酵初期から酵母が高濃度で存在することとなるため効率が良い。スラント等で保存してある状態の酵母を用いる場合は、併行複発酵に用いる前に液体培地を用いて前培養すると酵母の量や活性を上げることができるので望ましい。
【００２５】
前培養に用いる液体培地は1%酵母エキス、2%ペプトン、3%グルコース、pH5.0のような、酵母の培養に適しているものであれば何でも良い。前培養終了後に集菌して使用する。酵母の投入量は終濃度0.1g／L以上であれば問題なく発酵できるが、多ければ前述のように発酵効率が良いとともにコンタミネーションを防ぐことができる。
【００２６】
廃菌床は発酵量に対して適当量加えて良いが、廃菌床が高濃度になると高粘度となるので発酵初期の攪拌が困難になる。よって、投入する廃菌床の量は攪拌機の能力を考慮してよく攪拌できる量に調整すると良い。
【００２７】
廃菌床や酵母成長に必要な栄養源を加えた発酵液はオートクレーブにて滅菌する（121℃、15分以上）。滅菌後37℃程度まで冷却し、先に述べた酵素や酵母を投入し、37℃で発酵を開始する。発酵中は嫌気状態にし、攪拌を行うと効率が上がる。こうして1−3日培養を行うことにより、廃菌床中のセルロース分をエタノールに変換することができる。
【発明の効果】
【００２８】
キノコ栽培後の廃菌床を再利用して、木材等からの製造に比較して、緩和な製造条件で、しかもより高い収率でエタノールが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明をより具体的に説明するために、以下に実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
小スケールでの変換
ブナオガコとコーンブランを体積比9：1で混合し、含水率を65%に調整したものをマイタケ栽培培地として作成した。それを2.5kgマイタケ栽培用袋に詰めて105℃、2時間滅菌した。冷却後マイタケ菌を植菌して25℃程度で2.5ヶ月培養後16℃程度の部屋に移し、栽培袋上部を切りマイタケ子実体を発生させた。子実体の収穫適期になったら収穫し、廃菌床を得た。
【００３１】
廃菌床上部の菌糸塊を取り除いた後、廃菌床を崩してよく混ぜた。乾重量で20gとなるように崩した廃菌床をプラスチック製ビン中に入れ、そこに5%NaOH溶液を100ml注ぎ込んだ。よく混ぜて廃菌床全体がNaOH溶液に浸るようにし、ラップで封をして100℃、60分にてオートクレーブした。オートクレーブ終了後、廃菌床−NaOH溶液を室温まで冷却した。廃菌床−NaOH溶液のpHが12.5であったため、硫酸を用いてpHを7.0付近まで下げた。その後80メッシュのふるいと流水を用いてNaOH処理済廃菌床を洗浄廃液が透明になるまで洗浄した。乾燥機を用いて洗浄したNaOH処理済廃菌床を乾燥した後エタノール変換に用いた。
【００３２】
エタノール変換は発酵液40mlの系で行った。すなわち、100mlの三角フラスコに30mlの50mMクエン酸−燐酸バッファー（pH5.0）をいれ、そこに4.8g（終濃度12%）の処理済廃菌床を混合し、濃燐酸を用いてpHを5.0に調整した。別に10倍濃の0.1%酵母エキス、0.2%ペプトンからなる栄養溶液を作成した。それぞれ121℃、15分オートクレーブし、室温まで冷却した。滅菌した50mMクエン酸−燐酸バッファー（pH5.0）に乾燥酵母を10g／Lとなるように加えてよく攪拌し、酵母液とした。また、60FPU分のセルラーゼ粉末を2mlのバッファーに懸濁しセルラーゼ溶液とし、それを0.42μmのフィルターを用いてフィルター滅菌した。
【００３３】
クリーンベンチ内で無菌的に30mlの廃菌床液に4mlの栄養溶液及び酵母液、及び2mlのセルラーゼ溶液を添加して40mlとした。三角フラスコにエタノールで滅菌した発酵栓でふたをし、隙間をパラフィルムでふさいだ。こうして調整したフラスコを37℃のインキュベーターに入れ、120往復の振盪をしながら7日間発酵（培養）させた。
【００３４】
比較対照として培地に使用するブナオガコを同様にNaOH処理、SSF(併行複発酵、Simultaneous Saccharification and Fermentation)したものを用意した。
【００３５】
培養終了後、遠心分離にて上清を採取し、ガスクロマトグラフィーにてエタノール濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、廃菌床を利用することにより前処理を行わなくても得られたエタノール量は前処理をしていないブナオガコよりも増加する。廃菌床をNaOHにより処理することにより更にエタノール濃度が増加し、得られたエタノール濃度はNaOH処理をしない場合と比較して約2倍強となった。ブナオガコもNaOH処理によりエタノール濃度が増えるが、廃菌床ほど多くのエタノールは得られなかった。
【実施例２】
【００３８】
大スケールでの変換
使用した廃菌床は実施例1に準じる。50L容の反応用タンクに20Lの5%NaOH溶液と乾重量で4kgの廃菌床を入れ、付属の攪拌羽を用いてよく攪拌した。タンク外部のジャケット中にボイラーからの蒸気を流入し、反応液温度を100℃まで上昇させた。その際、常に120rpmで攪拌し続けた。60分反応後蒸気流入を止め、50℃程度まで冷却した。
【００３９】
反応液は固液分離装置により固形分と液体に分けられ、固形分は固液分離装置に入れたまま、上部より水をシャワー状にかけ続けることにより固形分の洗浄を行った。洗浄は廃液が中性になるまで続けた。ここまでを廃菌床の前処理とした。
【００４０】
蒸気にて空滅菌していた80L容の発酵用タンクにpH計、溶存酸素計を取り付け、上記前処理済廃菌床2.4kg（乾）、水18L、を投入し備え付けの攪拌羽でよく混ぜた。この際、酵母の栄養源となる酵母エキス及びペプトンは添加しなかった。蓋をしてタンク外部のジャケット中にボイラーからの蒸気を流入し、タンク内溶液を120℃まで上昇させて30分保持することにより滅菌した。冷却後、5NNaOH溶液及び濃燐酸にて液のｐHを5.0に調整した。そこに2Lの50mMクエン酸−燐酸バッファーに60kFPU分のセルラーゼ粉末を懸濁した酵素液及び200gの乾燥パン酵母を投入することにより発酵液を作成した。
【００４１】
発酵タンクを温度37℃、攪拌回転数150rpm、pH5.0に保ちつつ4日間発酵を行わせた。一日おきに発酵液を数量サンプリングし、遠心後の上清中エタノール濃度を実施例1と同様にして調べた。また、廃菌床に代えてブナオガコを用いて行ったものを比較対照とした。エタノール収率の経時変化結果を表2に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２から分かる様にブナオガコと比較して廃菌床を用いた場合、約1.6倍のエタノール収率となる。
【００４４】
実施例1、2からマイタケ廃菌床を用いることにより、同様のアルカリ処理と発酵操作を行ったブナオガコよりも効率よくエタノールを得ることが出来ることが分かる。
【実施例３】
【００４５】
ブナシメジ廃菌床の糖への変換
スギオガコを主体とした培地を850mlビンに作成し、滅菌後ブナシメジを植菌した。3ヶ月ほど培養後子実体を形成させ収穫を行い廃菌床を得た。収穫直後の廃菌床について実施例1と同様にNaOH処理を行った後、糖化を実施した。対照として培養前培地及びスギオガコを用意した。
【００４６】
糖化は次のようにして実施した。すなわち、50mMクエン酸バッファー中に60FPU／gバイオマスのセルラーゼ及び1mMアジ化ナトリウムが含まれた酵素液を作成し、10mlを100mgの乾燥させたNaOH処理済廃菌床、NaOH処理済培養前培地、NaOH処理済スギオガコを入れた50ml三角フラスコに分注した。水分が蒸発しないように蓋をし、50℃にて120rpmで振盪をしながら3日間反応させた。反応終了後、必要量をサンプリングし、沸騰湯浴中で5分保持することによりセルラーゼを失活させた。遠心にて不溶分を除いた後に、グルコースセンサーを用いて溶液中のグルコース濃度を求めた。その結果を表3に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
表３から分かるように、ブナシメジにおいてもマイタケと同様に栽培を行い、その廃菌床を前処理して用いることにより、より多くのグルコースを得ることができる。このグルコースを酵母等により発酵させることにより、エタノールなどにさらに変換することが可能である。
なお、スギオガコを主体としたエリンギ廃菌床においてもほぼ同様の結果が得られることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キノコ廃菌床をアルカリ溶液を用いて前処理後、アルカリを除き、次いでセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行うか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵の併用による併行複発酵を行うかの何れかによる、キノコ廃菌床のエタノールへの変換方法。
【請求項２】
アルカリを除くために酸による中和を施すことを特徴とする請求項１記載の変換方法。
【請求項３】
アルカリ溶液を用いた前処理を、 水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの溶液を用いて90-125℃で加熱処理とすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の変換方法。
【請求項４】
キノコ廃菌床がマイタケ廃菌床、ブナシメジ廃菌床又はエリンギ廃菌床であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の変換方法。
【請求項１】
キノコ廃菌床をアルカリ溶液を用いて前処理後、アルカリを除き、次いでセルラーゼ糖化によるグルコースを生成させた後グルコースの微生物によるエタノール発酵を行うか、又はセルラーゼ糖化と微生物によるエタノール発酵の併用による併行複発酵を行うかの何れかによる、キノコ廃菌床のエタノールへの変換方法。
【請求項２】
アルカリを除くために酸による中和を施すことを特徴とする請求項１記載の変換方法。
【請求項３】
アルカリ溶液を用いた前処理を、 水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの溶液を用いて90-125℃で加熱処理とすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の変換方法。
【請求項４】
キノコ廃菌床がマイタケ廃菌床、ブナシメジ廃菌床又はエリンギ廃菌床であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の変換方法。
【公開番号】特開２００６−２０６０３（Ｐ２００６−２０６０３Ａ）
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０３７５７（Ｐ２００４−２０３７５７）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（５９３０８４９１５）株式会社雪国まいたけ (30)
【出願人】（３０４０２１２８８）国立大学法人長岡技術科学大学 (458)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（５９３０８４９１５）株式会社雪国まいたけ (30)
【出願人】（３０４０２１２８８）国立大学法人長岡技術科学大学 (458)
【Ｆターム（参考）】
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