キラルアミノ酸を有するメイタンシノールのアシル化方法
本発明は、癌の治療のために用いられる、例えばＤＭ１及びＤＭ４のような、キラルアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドの製造方法を提供する。この方法によると、アミノ酸キラル中心のエピマー化を殆ど伴わずに側鎖を加えることが可能である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００５年８月９日出願の仮出願No.60/706,694（これの開示はその全体で本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は、キラルアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドの製造方法に関する。メイタンシノイドは、例えば抗体のような細胞結合剤にコンジュゲートすることができ、特に癌治療のための有用な治療薬である。
【０００３】
発明の背景
メイタンシノイドは強力な抗癌性化合物であるが、その使用はそれらの毒性のために限定されている。これらの薬剤の毒性を処理するための一つのアプローチは、特異的に腫瘍をターゲットとする抗体にメイタンシノイドを結合させることである。抗体−メイタンシノイド・コンジュゲートは、ヒト異種移植研究において強力な抗腫瘍活性を有することが判明している(C. Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8618-8623 (1996))。ＭＬＮ２７０４はこのようなコンジュゲートの一つであり、現在、転移性アンドロゲン独立性前立腺癌の治療のためのPhase II臨床試験中である。ＭＬＮ２７０４は、それらの表面上に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する腫瘍細胞に特異的に致死ペイロード(lethal payload)をデリバリーするように設計されたターゲッティング・モノクローナル抗体ビヒクル（Ｔ−ＭＡＶ）から成る。ＭＬＮ２７０４の場合に、致死ペイロードは、Ｔ−ＭＡＶにコンジュゲートしている化学療法用メイタンシノイドＤＭ１から成る。臨床前研究では、Ｔ−ＭＡＶは、腫瘍細胞の表面上のＰＳＭＡに結合した後に、細胞の内側に運ばれ、腫瘍細胞はＤＭ１によって破壊された。ＰＳＭＡは、原発性と転移性の両方の、殆ど全ての前立腺癌細胞上に発現され、細胞表面上のその存在度は癌が進行するにつれて増加する。これらの所見は、ＭＬＮ２７０４が前立腺癌の特異的な新しい療法としての可能性を有することを示唆する。（http://www.mlnm.com/rd/oncology/candidates/mln2704.aspを参照のこと）。
【０００４】
ＤＭ１は、メイタンシノール：
【０００５】
【化１】
【０００６】
から製造されている。上記に示したＤＭ１の構造において、太字のキラル側鎖は、毒性のメイタンシノイドと腫瘍を標的にするために用いられる抗体とを連結するリンカー基に付着することができる。メイタンシノイドからＤＭ１への二工程転化は当該技術分野で知られている（米国特許No.5,208,020参照）。第１工程は、メイタンシノールと、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニン：ＨＯ２ＣＣＨ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＳＭｅ（これの製造は米国特許No.6,570,024に記載されている）とのカップリングである。第２工程では、−ＳＳＭｅ基は、ＤＭ１の−ＳＨ基に還元される。この合成の欠点は、第１工程で生じる、側鎖キラル中心のエピマー化である。比較的緩和なカップリング条件（ＤＣＣとＺｎＣｌ２）下でさえ、完全なエピマー化が生じる。エピマー化が目的生成物の収量を低下させるのみでなく、好ましくないジアステレオマーを時間のかかるクロマトグラフィー分離法によって除去しなければならない。
【０００７】
ＥＰ特許出願公開No.0021173は、メイタンシノール３−（Ｓ）−及び３−（Ｒ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネートの、対応するメイタンシノール３−α−（Ｎ−メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノプロピオネートからの合成を記載している。後者の化合物は、メイタンシノールをＤＣＣの存在下でＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンとカップリングさせることによって製造した。このカップリング反応は３−（Ｓ）−エピマーと３−（Ｒ）−エピマーの両方の低い収率を生じた。
【０００８】
キラル側鎖リンカーを有する、ＤＭ１及びメイタンシノイドを用意することは費用がかかる。出発物質のメイタンシノールは高価であり、カップリング反応は、主としてカップリング反応で側鎖が付着する際のエピマー化のために、典型的に低収率を生じる。従って、側鎖リンカーのカップリングにおけるエピマー化を回避する又は減ずる高収率方法が必要とされている。
【０００９】
発明の説明
本発明は、例えばＤＭ１又はＤＭ４のようなメイタンシノイドの製造方法に関する。この方法における重要な工程は、メイタンシノール又はその類似体と、キラルの４−アルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン又は３，４−ジアルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンとのカップリングである。これらの１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンは、α−アミノ酸のＮ−カルボキシアンヒドリド誘導体（ＮＣＡｓ）である。エナンチオマー的に純粋な天然生成アミノ酸から得ることができるＮＣＡｓが、このアミノ酸キラル中心の立体配置(configuration)がカップリング反応において高度に保護されるので、特に有用なカップリング・パートナーであることが、現在判明している。ＤＭ１及びＤＭ４の製造に特に有用である、（Ｓ）−３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１、Ｎ−メチルアラニン−Ｎ−カルボキシアンヒドリド若しくはＮ−ＭｅＡｌａＮＣＡ）を用いて、本発明を例証する。化合物１によるカップリング工程は、高いジアステレオマー的純度で、Ｎ−メチル−アラニン側鎖を有するメイタンシノールエステル中間体を生成する。ＮＣＡカップリング反応から得られた中間体は、キラルアミノ酸側鎖を有する、多様なメイタンシノイドの製造に有用である。癌の治療用に、種々な抗体にメイタンシノイドをコンジュゲートするために該側鎖をリンカー基に付着させることができる。
スキーム１
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
上記スキーム１は、高いジアステレオマー的純度を有するＤＭ１（Ｘ＝Ｃｌ）の製造のための総合的ルートの一部としての方法を説明する。この方法は、メイタンシノール（Ｒ＝Ｈ）をホモキラル若しくはエナンチオマー的富化３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１）によって処理することによって、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａ）を製造する工程を含む。この工程は、時には、本明細書において化合物１（若しくはＮ−ＭｅＡｌａ，ＮＣＡ）とのカップリング反応と呼ばれる。この方法での化合物１の使用は、Ｎ−メチル−アラニン側鎖の完全な若しくはほぼ完全なエピマー化を回避することによって、先行技術を超えて有利である。この反応はごく軽度のエピマー化を伴って進行して、好ましくないメイタンシノール３−（Ｒ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（若しくは３−（Ｒ）−Ａａ，Ｄ−異性体）とは対照的に、主として、目的のメイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（若しくは３−（Ｓ）−Ａａ，Ｌ−異性体）を生成する。以下に述べる、ある一定の条件下では、約９８：２〜９９：１程度の高い３−（Ｓ）−Ａａ対３−（Ｒ）−Ａａ比率を有する化合物Ａａを得ることができる。
【００１３】
スキーム１に概略を示した方法は、一般に、化合物１を式２：
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物と取り替えることによって、他のＮＣＡｓに拡大適用することができる。好ましくは、Ｒ１は、天然生成α−アミノ酸のアミノ酸側鎖であり、より好ましくは、Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルである。好ましくは、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
したがって、本発明の１実施態様は、式Ａ：
【００１６】
【化５】
【００１７】
［上記式中、Ｘは、Ｃｌ又はＨであり、そしてＲは、
【００１８】
【化６】
【００１９】
であり、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）
（ｉ）Ｒが水素であることを除いて、式Ａと同じ式によって示される出発物質、
（ｉｉ）式２：
【００２０】
【化７】
【００２１】
で示される化合物、
（ｉｉｉ）ルイス酸、
（ｉｖ）非求核性塩基、及び
（ｖ）有機溶媒
を含む混合物を用意する工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、該出発物質の一部が、通常は少なくとも２０％が式Ａで示される化合物に転化されるまで反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物から、式Ａで示される粗化合物を取り出す工程；及び
（ｄ）任意に、工程（ｃ）で得られた、式Ａで示される化合物を精製する工程
を含む方法に関する。
【００２２】
Ｒ１アミノ酸側鎖は、天然生成アミノ酸に見出されるものであることができる。特定の例は、例えば、Ｒ１がそれぞれメチル、イソブチル又はイソプロピルである、アラニン、ロイシン又はバリンの側鎖のような、小アルキル側鎖（炭素数１〜６）を包含する。Ｒ２アリール基は、典型的には、例えばフェニルのような、５員若しくは６員芳香環である。Ｒ２アラルキル基の例は、例えばベンジル又はフェネチルのような、Ｃ１−Ｃ３アルキル鎖を有するアリール基を包含する。好ましくは、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルである。
【００２３】
アミノ酸２のＮ−カルボキシアンヒドリドの一般的な製造は、アラニンからのＬ−３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１）の製造を含めて、Tetrahedron, Vol. 50, No. 30, pp. 9051-9060 (1994)に記載されている。例えば化合物１のようなＮＣＡと、メイタンシノールとの反応は、有機溶媒中、ルイス酸及びヒンダード有機塩基の存在下で行なわれる。特に指定しない限り、“有機溶媒”なる用語は単独溶媒に限定されず、有機溶媒の混合物をも包含する。例えば、ＴＨＦとＤＭＦの混合物が、“有機溶媒”なる用語に包含される。使用可能である、特定の有機溶媒の例は、エーテル溶媒、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、クロロ炭化水素溶媒、例えばジクロロメタン（ＤＣＭ）、エステル溶媒、例えば酢酸エチルと酢酸イソプロピル、芳香族溶媒、例えばトルエン、及び極性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とアセトニトリルを包含する。溶媒量は、典型的に、メイタンシノールｇ当たり約５〜５０ｍｌの範囲内、好ましくは約５〜２０ｍｌ／ｇ、より好ましくは約１２〜１７ｍｌ／ｇの範囲内である。
【００２４】
該反応におけるＮＣＡの使用量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たり約２〜１０当量の範囲内である。好ましくは、約５〜７当量のＮＣＡが該反応に用いられる。
メイタンシノールとＮＣＡとのカップリング反応において、塩基は非求核性塩基である。このために適当であるのは、例えばヒンダード第３級アミンのようなヒンダード有機塩基である。適当な塩基の例は、例えばジイソプロピルエチルアミンのようなトリアルキルアミンを包含する。塩基の量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たり塩基２〜１０当量の範囲内、好ましくは約４〜６当量の範囲内である。
【００２５】
ＮＣＡとのカップリング反応に用いるルイス酸は、弱いから中程度までのルイス酸である。このようなルイス酸の例は、亜鉛トリフレート−Ｚｎ（ＯＴｆ）２、塩化亜鉛−ＺｎＣｌ２、臭化マグネシウム、マグネシウム・トリフレート−Ｍｇ（ＯＴｆ）２、銅トリフレート−Ｃｕ（ＯＴｆ）２、臭化銅（ＩＩ）−ＣｕＢｒ２及び塩化銅（ＩＩ）−ＣｕＣｌ２を包含する。ルイス酸の量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たりルイス酸１．５〜１０当量の範囲内、好ましくは約２〜４当量である。
【００２６】
ＮＣＡとのカップリング反応の反応温度は、通常、溶媒及び試薬の選択に大きく依存して、０℃〜約６０℃の範囲内である。ＤＭＦを溶媒又は共溶媒として用いる場合に、該温度は典型的に約１５℃〜約３０℃の範囲内、より好ましくは約１５〜２５℃の範囲内である。温度が約６０℃を超えて上昇すると、生成物の分解が生じる可能性がある。生成物混合物における高いジアステレオ選択性を得るためには、出発物質から生成物への良好な転化を達成するために温度が充分であることを条件として、該温度範囲の下限が望ましい。
【００２７】
３−（Ｒ）−Ａに対して相対的な、望ましい３−（Ｓ）−Ａジアステレオマーの獲得量は、用いる試薬及び反応条件に依存するであろう。３−（Ｒ）−Ａを超える３−（Ｓ）−Ａのジアステレオマー過剰％（％ｄｅ）は、約４０％を超えて約９８〜９９％ほどの大きさまでの範囲になりうる。典型的に、％ｄｅは約８０％より大きく、９８〜９９％ほどの大きさである。ジクロロメタン中の亜鉛トリフレート及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング反応の％ｄｅは約７６％〜９５％の範囲であった。ＴＨＦ中における同様な条件下で、％ｄｅは９５％より良好であった。２：１の比率でのＤＭＦとＴＨＦとから成る有機溶媒混合物中での約２０℃及び亜鉛トリフレートの存在下においては、出発物質から生成物への転化率８０〜９０％を、９０％を超える％ｄｅで得ることができる。ＮＣＡとのカップリング反応では、出発物質のメイタンシノールの全てが消耗されることは、必ずしも必要ではない。反応の仕上げ処理後に、若干の出発物質のメイタンシノールを含有する粗反応物質はしばしば、精製せずに次の工程に用いるために適する。このことは、出発物質のメイタンシノールを除去する前に、少なくとももう一つの工程に通して運ぶことができることを意味する。次の工程で用いる粗物質は約１〜８０％のメイタンシノールと、約２０〜９９％のメイタンシノール・α−アミノ酸エステルを含有することができ、この場合、％ｄｅは約４０〜９９％の範囲内である。粗物質中のメイタンシノール・α−アミノ酸エステルの量は典型的に少なくとも約６０％、通常は少なくとも７０％であり、この場合、％ｄｅは８０〜９９％の範囲内である。
【００２８】
該反応は、任意の標準高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系を用いてモニターすることができる。１例として、本発明のために出願人は、Agilent ZorBax-CNカラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を装備したAgilent 1100系を用いた。反応の経過をフォローするために、次の条件を用いた：注入温度は５０℃であり、注入量は５μｌであり、流速は１．０ｍｌ／分であり、検出は２５４ｎｍで行ない、溶離溶媒は１０ｍＭ酢酸アンモニウム（溶媒Ａ）と、９５：５アセトニトリル：水（溶媒Ｂ）とから成るものであった。勾配溶離は、５５：４５に等しい溶媒Ａ：溶媒Ｂの出発混合物から４５：５５のＡ：Ｂ溶媒混合物まで１５分間にわたって進行した。これらの条件下で、出発物質のメイタンシノールの保持時間は５．４分間であり、生成物３−（Ｓ）−Ａの保持時間は７．３分間である。
【００２９】
本発明の方法の１実施例では、下記方法を用いて、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）を製造した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍｌ，１．２ｍｍｏｌ）とＬ−３，４−ジメチル−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１２９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（１．７ｍｌ）中のメイタンシノール（１１３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この混合物を２〜３分間撹拌し、この時間後に、亜鉛トリフレート（２１８ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を５０〜５５℃において、ＨＰＬＣによって時々モニターしながら、撹拌した。２６時間後に、ＨＰＬＣ分析は、反応混合物が５７．５％の目的３−（Ｓ）−Ａａ、２％の３−（Ｒ）−Ａａ及び３１％の出発物質メイタンシノールを含有することを実証した。２８時間後に、加熱を除去し、反応を周囲温度に一晩放置させた。ＨＰＬＣ分析は、２８時間目に測定した反応プロフィルに比べて、反応プロフィルの変化を示さなかった。この反応混合物に酢酸エチル（３ｍｌ）と飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加えた。結果として生じた混合物を２〜３分間撹拌して、撹拌を停止した時に、層が分離した。水層を新鮮な酢酸エチル（１．５ｍｌ）で抽出した。有機層を一緒にして、最初は水（２ｍｌ）で、次は飽和ブライン溶液（１ｍｌ）で洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、褐色油状物と泡状固体を得た。得られた粗メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）は、例えばＨＰＬＣを用いて精製することも、又は次の工程に直接用いることも可能である。
【００３０】
本発明の方法の第２実施例では、下記方法を用いて、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）を製造した。乾燥ＴＨＦ（１．２ｍｌ）と乾燥ＤＭＦ（０．６０ｍｌ）中のメイタンシノール（１２０ｍｇ，０．２１２ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２２２μｌ，６．０当量）、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（２３１ｍｇ，３．０当量）及びＮＭｅＡｌａＮＣＡ（１３８ｍｇ，５．０当量）を加えた。得られたほぼ溶液を周囲温度において撹拌し、定期的に反応転化に関してＨＰＬＣによってモニターした。ＨＰＬＣサンプル調製：反応混合物１０μｌを１：１アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５によって１ｍｌに希釈した。室温における２０時間後に、次回分のＮＣＡ（４１ｍｇ，１．５当量）を加えて、この反応を室温において、ＨＰＬＣによって定期的にモニターしながら、進行させた。２０時間を記録した時点で、メイタンシノールからＮ−メチルアラニンエステルＡａへの転化％は約７１％であり、ジアステレオマー過剰％は９５％であった。４０時間後に、ＨＰＬＣ分析は、メイタンシノールから該エステルＡａへの８４％転化を示し、ジアステレオマー過剰％は９３％であった。
【００３１】
３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）と３−（２−メチルジスルファニル）プロパン酸、ＨＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＳＳＭｅ（２）とのカップリングによって、ＤＭ１−ＳＭｅを製造することができる：
【００３２】
【化８】
【００３３】
上記反応を実施するための多様な方法は、当業者の知識の範囲内である。例えば、酸２の活性エステル形、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（−ＯＳｕ）又はペンタフルオロフェニル（−Ｐｆ）エステルを該カップリング反応に用いることができる。或いは、遊離酸２と適当なカップリング試薬とのカップリングによって、ＤＭ１を製造することができる。カップリング試薬の例は、ウロニウム型カップリング剤、例えば、非限定的に、Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート（ＴＯＴＵ）、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ＨＢＴＵ又はＴＢＴＵ（それぞれ、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート及びテトラフルオロボレート）；カルボジイミド型試薬、例えば、非限定的に、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）；活性エステル；又はホスホニウム型カップリング剤、例えば、Ｂｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）又はＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ（ピロリジノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）を包含する。他の有用なカップリング剤は、ＩＩＤＱ（２−イソブトキシ−１−イソブトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）及びイソブチルクロロホルメートを包含する。ペプチド・カップリングは、例えば、Humphrey and Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266に記載されており、この文献はその全体で本明細書に援用される。
【００３４】
１実施例では、下記方法を用いて、３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）をＤＭ１−ＳＭｅに転化させた。塩化メチレン（１．８ｍｌ）中の粗Ａ（上記実施例に従って得たもの、９５ｍｇ，０．１４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５１μｌ，０．２９ｍｍｏｌ）を加えた。該溶液を２〜３分間撹拌した後に、３−メチルジスルファニル−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル・エステル（５５ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌した反応混合物を次に３０〜３５℃に１６時間加熱した。ＨＰＬＣ分析は、該反応混合物が約４５〜５０％のＤＭ１−ＳＭｅと３０〜３５％のメイタンシノール（先行工程から）を含有することを実証した。Ｌ−異性体対Ｄ−異性体の比率は依然として変化せずに約９８：２であった。
【００３５】
ＤＭ１−ＳＭｅからＤＭ１への転化は、ジスルフィド結合を既知方法で切断することによって達成することができる。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、このような転化のための選択すべき試薬である。Tetrahedron Lett. 1993, 34, 8169。
【００３６】
メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）は、例えばＤＭ４のような、他のメイタンシノイドを製造するための有用な中間体である：
【００３７】
【化９】
【００３８】
ＤＭ１−ＳＭｅに関して上述した製造と同様な方法で、３−（２−メチルジスルファニル）プロパン酸を４−メチル−４−（２−メチルジスルファニル）ペンタン酸、ＨＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＳＳＭｅ又はその活性化形と取り替えることによって、中間体ＡａからＤＭ４−ＳＭｅを製造することができる。次に、上述したように、ジスルフィド結合を還元することによって、ＤＭ４−ＳＭｅをＤＭ４に転化することができる。
【００３９】
抗腫瘍剤として用いるために、該薬物の硫黄原子と抗体リンカー基の硫黄原子との間にジスルフィド結合を形成することによって、ＤＭ１及びＤＭ４を抗体にコンジュゲートさせることができる。ＤＭ１に比べて、ＤＭ４の硫黄は、該硫黄にメチル基が隣接する結果としてより大きく立体障害を受けている。この立体障害は、抗体−薬物コンジュゲートを化学的により大きく安定にするように設計される。種々なメイタンシノイドの設計では、該硫黄に隣接して種々な、他の置換基を導入することによって、該コンジュゲートの安定性を調節することができる。このようにして、該薬物−抗体コンジュゲートの効力及び耐性(tolerability)を、特定の抗腫瘍抗体に要求されるように、最適化することができる。本発明の方法の利点は、該側鎖のＮ−メチル−アラニル部分に取り付けたメルカプト−アルカノイル部分上の、種々な鎖長及び置換基を有する多様なＤＭ型側鎖の製造に、中間体Ａを用いることができることである。
【００４０】
本発明の方法は、種々なキラルアミノ酸側鎖を有するメイタンシンの類似体である化合物の製造にも有用である。多くのメイタンシン及びメイタンシノールの合成が報告されている。報告された合成は、例えば化合物１のような、４−アルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン又は３，４−ジアルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンとのカップリング反応を受けて、次に、抗体へのコンジュゲーションに適した側鎖の作製(elaboration)を可能にする、種々な類似体の製造を可能にする。その上、メイタンシノールは、アンサマクロライドのクラスの１員である、多くのアンサマクロライドは微生物から単離されており、細胞障害活性を有することが判明している(Merck Index, 13ｔｈ Edition, 2001)。このような類似体の一つは、該マクロライドのフェニル部分上のクロロ置換基が存在する場所に水素が存在することを除いて、メイタンシノールと同じである。
【００４１】
典型的に、用いる置換１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンはホモキラルであるか又はエナンチオマー的に富化しており、主要な異性体はＳ−異性体である。天然生成アミノ酸は、Ｒ１基を有する炭素がこの望ましい立体配置を有する、多様な１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンを提供する。好ましいＲ１基は、例えば、メチル、イソブチル又はベンジルのような、小さい置換若しくは非置換アルキル基を包含する。Ｒ２は水素又は小アルキル基であることができる。工程（ａ）の非求核性塩基が有機塩基であることも好ましく、上記ヒンダード有機塩基の一つであることがさらに好ましい。
【００４２】
上述したように、本発明は、抗体へのコンジュゲーションのための第２級アミノ酸側鎖を有する、広範囲なメイタンシンの製造に従うものである。したがって、本発明のもう一つの実施態様は、式ＩＩ：
【００４３】
【化１０】
【００４４】
［式中、ＸはＣｌ又はＨであり；Ｒ１はアミノ酸側鎖であり；Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；Ｌは、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル及びＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから成る群から独立的に選択される０〜２個の置換基を有するＣ２−Ｃ６アルキレン鎖であり；Ｒ３は水素又はＳ−Ｒ４であり；Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法に関する。該方法は、
（ａ）化合物２と、メイタンシノール又はその類似体とのカップリング反応によって、
式Ｉ：
【００４５】
【化１１】
【００４６】
［式中、Ｘ＝Ｈ］
で示される化合物を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた、式Ｉで示される化合物をＲ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４［式中、Ｒ５は水素又は活性化基である］とカップリングさせて、ＲがＳ−Ｒ４である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程；及び
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程
を含む。
【００４７】
好ましい出発物質はメイタンシノール（Ｘ＝Ｃｌ）である。好ましくは、Ｌは、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立的に選択される０〜２個の置換基を有するＣ２−Ｃ３アルキレン鎖であり、より好ましくは、該アルキレン鎖は０〜２個のメチル基によって置換される。最も好ましくは、Ｒ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４は、
【００４８】
【化１２】
【００４９】
から選択され、これらは、それぞれ、ＤＭ１−ＳＭｅ又はＤＭ４−ＳＭｅを提供する。抗体コンジュゲーションに適した側鎖を提供するために、上記工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を例えばジチオトレイトールのような還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る。
【００５０】
本発明の方法によって製造されるメイタンシノイドは、多様な抗体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートしたＰＳＭＡ抗体である上記ＭＬＮ２７０４の他に、他のＤＭコンジュゲート抗体(DM-conjugated antibodies)の例は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌及びある一定の非小細胞肺癌の治療のためにＣａｎＡｇ抗体を標的とするカンツズマブ・メルタンシン（cantuzmab・mertansine）／ｈｕＣ２４２−ＤＭ１、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍及びある一定の血液癌の治療のためにＣＤ５６抗原を標的とするｈｕＮ９０１−ＤＭ１、並びにＨｅｒ２腫瘍の治療のためにＨｅｒ２抗原を標的とするトラスツズマブ−ＤＭ１を包含する。
【００５１】
解明と理解のために上記発明をある程度詳細に説明してきたが、これらの特定の実施態様は例示及び非限定と解釈すべきである。形式及び細部における多様な変更が、特定の実施態様によってではなく特許請求の範囲によって定義されるべきである、本発明の実際の範囲から逸脱することなくなされうることは、この開示を読むならば当業者によって理解されるであろう。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００５年８月９日出願の仮出願No.60/706,694（これの開示はその全体で本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は、キラルアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドの製造方法に関する。メイタンシノイドは、例えば抗体のような細胞結合剤にコンジュゲートすることができ、特に癌治療のための有用な治療薬である。
【０００３】
発明の背景
メイタンシノイドは強力な抗癌性化合物であるが、その使用はそれらの毒性のために限定されている。これらの薬剤の毒性を処理するための一つのアプローチは、特異的に腫瘍をターゲットとする抗体にメイタンシノイドを結合させることである。抗体−メイタンシノイド・コンジュゲートは、ヒト異種移植研究において強力な抗腫瘍活性を有することが判明している(C. Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8618-8623 (1996))。ＭＬＮ２７０４はこのようなコンジュゲートの一つであり、現在、転移性アンドロゲン独立性前立腺癌の治療のためのPhase II臨床試験中である。ＭＬＮ２７０４は、それらの表面上に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する腫瘍細胞に特異的に致死ペイロード(lethal payload)をデリバリーするように設計されたターゲッティング・モノクローナル抗体ビヒクル（Ｔ−ＭＡＶ）から成る。ＭＬＮ２７０４の場合に、致死ペイロードは、Ｔ−ＭＡＶにコンジュゲートしている化学療法用メイタンシノイドＤＭ１から成る。臨床前研究では、Ｔ−ＭＡＶは、腫瘍細胞の表面上のＰＳＭＡに結合した後に、細胞の内側に運ばれ、腫瘍細胞はＤＭ１によって破壊された。ＰＳＭＡは、原発性と転移性の両方の、殆ど全ての前立腺癌細胞上に発現され、細胞表面上のその存在度は癌が進行するにつれて増加する。これらの所見は、ＭＬＮ２７０４が前立腺癌の特異的な新しい療法としての可能性を有することを示唆する。（http://www.mlnm.com/rd/oncology/candidates/mln2704.aspを参照のこと）。
【０００４】
ＤＭ１は、メイタンシノール：
【０００５】
【化１】
【０００６】
から製造されている。上記に示したＤＭ１の構造において、太字のキラル側鎖は、毒性のメイタンシノイドと腫瘍を標的にするために用いられる抗体とを連結するリンカー基に付着することができる。メイタンシノイドからＤＭ１への二工程転化は当該技術分野で知られている（米国特許No.5,208,020参照）。第１工程は、メイタンシノールと、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニン：ＨＯ２ＣＣＨ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＳＭｅ（これの製造は米国特許No.6,570,024に記載されている）とのカップリングである。第２工程では、−ＳＳＭｅ基は、ＤＭ１の−ＳＨ基に還元される。この合成の欠点は、第１工程で生じる、側鎖キラル中心のエピマー化である。比較的緩和なカップリング条件（ＤＣＣとＺｎＣｌ２）下でさえ、完全なエピマー化が生じる。エピマー化が目的生成物の収量を低下させるのみでなく、好ましくないジアステレオマーを時間のかかるクロマトグラフィー分離法によって除去しなければならない。
【０００７】
ＥＰ特許出願公開No.0021173は、メイタンシノール３−（Ｓ）−及び３−（Ｒ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネートの、対応するメイタンシノール３−α−（Ｎ−メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノプロピオネートからの合成を記載している。後者の化合物は、メイタンシノールをＤＣＣの存在下でＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンとカップリングさせることによって製造した。このカップリング反応は３−（Ｓ）−エピマーと３−（Ｒ）−エピマーの両方の低い収率を生じた。
【０００８】
キラル側鎖リンカーを有する、ＤＭ１及びメイタンシノイドを用意することは費用がかかる。出発物質のメイタンシノールは高価であり、カップリング反応は、主としてカップリング反応で側鎖が付着する際のエピマー化のために、典型的に低収率を生じる。従って、側鎖リンカーのカップリングにおけるエピマー化を回避する又は減ずる高収率方法が必要とされている。
【０００９】
発明の説明
本発明は、例えばＤＭ１又はＤＭ４のようなメイタンシノイドの製造方法に関する。この方法における重要な工程は、メイタンシノール又はその類似体と、キラルの４−アルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン又は３，４−ジアルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンとのカップリングである。これらの１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンは、α−アミノ酸のＮ−カルボキシアンヒドリド誘導体（ＮＣＡｓ）である。エナンチオマー的に純粋な天然生成アミノ酸から得ることができるＮＣＡｓが、このアミノ酸キラル中心の立体配置(configuration)がカップリング反応において高度に保護されるので、特に有用なカップリング・パートナーであることが、現在判明している。ＤＭ１及びＤＭ４の製造に特に有用である、（Ｓ）−３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１、Ｎ−メチルアラニン−Ｎ−カルボキシアンヒドリド若しくはＮ−ＭｅＡｌａＮＣＡ）を用いて、本発明を例証する。化合物１によるカップリング工程は、高いジアステレオマー的純度で、Ｎ−メチル−アラニン側鎖を有するメイタンシノールエステル中間体を生成する。ＮＣＡカップリング反応から得られた中間体は、キラルアミノ酸側鎖を有する、多様なメイタンシノイドの製造に有用である。癌の治療用に、種々な抗体にメイタンシノイドをコンジュゲートするために該側鎖をリンカー基に付着させることができる。
スキーム１
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
上記スキーム１は、高いジアステレオマー的純度を有するＤＭ１（Ｘ＝Ｃｌ）の製造のための総合的ルートの一部としての方法を説明する。この方法は、メイタンシノール（Ｒ＝Ｈ）をホモキラル若しくはエナンチオマー的富化３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１）によって処理することによって、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａ）を製造する工程を含む。この工程は、時には、本明細書において化合物１（若しくはＮ−ＭｅＡｌａ，ＮＣＡ）とのカップリング反応と呼ばれる。この方法での化合物１の使用は、Ｎ−メチル−アラニン側鎖の完全な若しくはほぼ完全なエピマー化を回避することによって、先行技術を超えて有利である。この反応はごく軽度のエピマー化を伴って進行して、好ましくないメイタンシノール３−（Ｒ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（若しくは３−（Ｒ）−Ａａ，Ｄ−異性体）とは対照的に、主として、目的のメイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（若しくは３−（Ｓ）−Ａａ，Ｌ−異性体）を生成する。以下に述べる、ある一定の条件下では、約９８：２〜９９：１程度の高い３−（Ｓ）−Ａａ対３−（Ｒ）−Ａａ比率を有する化合物Ａａを得ることができる。
【００１３】
スキーム１に概略を示した方法は、一般に、化合物１を式２：
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物と取り替えることによって、他のＮＣＡｓに拡大適用することができる。好ましくは、Ｒ１は、天然生成α−アミノ酸のアミノ酸側鎖であり、より好ましくは、Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルである。好ましくは、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
したがって、本発明の１実施態様は、式Ａ：
【００１６】
【化５】
【００１７】
［上記式中、Ｘは、Ｃｌ又はＨであり、そしてＲは、
【００１８】
【化６】
【００１９】
であり、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）
（ｉ）Ｒが水素であることを除いて、式Ａと同じ式によって示される出発物質、
（ｉｉ）式２：
【００２０】
【化７】
【００２１】
で示される化合物、
（ｉｉｉ）ルイス酸、
（ｉｖ）非求核性塩基、及び
（ｖ）有機溶媒
を含む混合物を用意する工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、該出発物質の一部が、通常は少なくとも２０％が式Ａで示される化合物に転化されるまで反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物から、式Ａで示される粗化合物を取り出す工程；及び
（ｄ）任意に、工程（ｃ）で得られた、式Ａで示される化合物を精製する工程
を含む方法に関する。
【００２２】
Ｒ１アミノ酸側鎖は、天然生成アミノ酸に見出されるものであることができる。特定の例は、例えば、Ｒ１がそれぞれメチル、イソブチル又はイソプロピルである、アラニン、ロイシン又はバリンの側鎖のような、小アルキル側鎖（炭素数１〜６）を包含する。Ｒ２アリール基は、典型的には、例えばフェニルのような、５員若しくは６員芳香環である。Ｒ２アラルキル基の例は、例えばベンジル又はフェネチルのような、Ｃ１−Ｃ３アルキル鎖を有するアリール基を包含する。好ましくは、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルである。
【００２３】
アミノ酸２のＮ−カルボキシアンヒドリドの一般的な製造は、アラニンからのＬ−３，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１）の製造を含めて、Tetrahedron, Vol. 50, No. 30, pp. 9051-9060 (1994)に記載されている。例えば化合物１のようなＮＣＡと、メイタンシノールとの反応は、有機溶媒中、ルイス酸及びヒンダード有機塩基の存在下で行なわれる。特に指定しない限り、“有機溶媒”なる用語は単独溶媒に限定されず、有機溶媒の混合物をも包含する。例えば、ＴＨＦとＤＭＦの混合物が、“有機溶媒”なる用語に包含される。使用可能である、特定の有機溶媒の例は、エーテル溶媒、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、クロロ炭化水素溶媒、例えばジクロロメタン（ＤＣＭ）、エステル溶媒、例えば酢酸エチルと酢酸イソプロピル、芳香族溶媒、例えばトルエン、及び極性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とアセトニトリルを包含する。溶媒量は、典型的に、メイタンシノールｇ当たり約５〜５０ｍｌの範囲内、好ましくは約５〜２０ｍｌ／ｇ、より好ましくは約１２〜１７ｍｌ／ｇの範囲内である。
【００２４】
該反応におけるＮＣＡの使用量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たり約２〜１０当量の範囲内である。好ましくは、約５〜７当量のＮＣＡが該反応に用いられる。
メイタンシノールとＮＣＡとのカップリング反応において、塩基は非求核性塩基である。このために適当であるのは、例えばヒンダード第３級アミンのようなヒンダード有機塩基である。適当な塩基の例は、例えばジイソプロピルエチルアミンのようなトリアルキルアミンを包含する。塩基の量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たり塩基２〜１０当量の範囲内、好ましくは約４〜６当量の範囲内である。
【００２５】
ＮＣＡとのカップリング反応に用いるルイス酸は、弱いから中程度までのルイス酸である。このようなルイス酸の例は、亜鉛トリフレート−Ｚｎ（ＯＴｆ）２、塩化亜鉛−ＺｎＣｌ２、臭化マグネシウム、マグネシウム・トリフレート−Ｍｇ（ＯＴｆ）２、銅トリフレート−Ｃｕ（ＯＴｆ）２、臭化銅（ＩＩ）−ＣｕＢｒ２及び塩化銅（ＩＩ）−ＣｕＣｌ２を包含する。ルイス酸の量は、典型的に、メイタンシノール１当量当たりルイス酸１．５〜１０当量の範囲内、好ましくは約２〜４当量である。
【００２６】
ＮＣＡとのカップリング反応の反応温度は、通常、溶媒及び試薬の選択に大きく依存して、０℃〜約６０℃の範囲内である。ＤＭＦを溶媒又は共溶媒として用いる場合に、該温度は典型的に約１５℃〜約３０℃の範囲内、より好ましくは約１５〜２５℃の範囲内である。温度が約６０℃を超えて上昇すると、生成物の分解が生じる可能性がある。生成物混合物における高いジアステレオ選択性を得るためには、出発物質から生成物への良好な転化を達成するために温度が充分であることを条件として、該温度範囲の下限が望ましい。
【００２７】
３−（Ｒ）−Ａに対して相対的な、望ましい３−（Ｓ）−Ａジアステレオマーの獲得量は、用いる試薬及び反応条件に依存するであろう。３−（Ｒ）−Ａを超える３−（Ｓ）−Ａのジアステレオマー過剰％（％ｄｅ）は、約４０％を超えて約９８〜９９％ほどの大きさまでの範囲になりうる。典型的に、％ｄｅは約８０％より大きく、９８〜９９％ほどの大きさである。ジクロロメタン中の亜鉛トリフレート及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング反応の％ｄｅは約７６％〜９５％の範囲であった。ＴＨＦ中における同様な条件下で、％ｄｅは９５％より良好であった。２：１の比率でのＤＭＦとＴＨＦとから成る有機溶媒混合物中での約２０℃及び亜鉛トリフレートの存在下においては、出発物質から生成物への転化率８０〜９０％を、９０％を超える％ｄｅで得ることができる。ＮＣＡとのカップリング反応では、出発物質のメイタンシノールの全てが消耗されることは、必ずしも必要ではない。反応の仕上げ処理後に、若干の出発物質のメイタンシノールを含有する粗反応物質はしばしば、精製せずに次の工程に用いるために適する。このことは、出発物質のメイタンシノールを除去する前に、少なくとももう一つの工程に通して運ぶことができることを意味する。次の工程で用いる粗物質は約１〜８０％のメイタンシノールと、約２０〜９９％のメイタンシノール・α−アミノ酸エステルを含有することができ、この場合、％ｄｅは約４０〜９９％の範囲内である。粗物質中のメイタンシノール・α−アミノ酸エステルの量は典型的に少なくとも約６０％、通常は少なくとも７０％であり、この場合、％ｄｅは８０〜９９％の範囲内である。
【００２８】
該反応は、任意の標準高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系を用いてモニターすることができる。１例として、本発明のために出願人は、Agilent ZorBax-CNカラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を装備したAgilent 1100系を用いた。反応の経過をフォローするために、次の条件を用いた：注入温度は５０℃であり、注入量は５μｌであり、流速は１．０ｍｌ／分であり、検出は２５４ｎｍで行ない、溶離溶媒は１０ｍＭ酢酸アンモニウム（溶媒Ａ）と、９５：５アセトニトリル：水（溶媒Ｂ）とから成るものであった。勾配溶離は、５５：４５に等しい溶媒Ａ：溶媒Ｂの出発混合物から４５：５５のＡ：Ｂ溶媒混合物まで１５分間にわたって進行した。これらの条件下で、出発物質のメイタンシノールの保持時間は５．４分間であり、生成物３−（Ｓ）−Ａの保持時間は７．３分間である。
【００２９】
本発明の方法の１実施例では、下記方法を用いて、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）を製造した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍｌ，１．２ｍｍｏｌ）とＬ−３，４−ジメチル−オキサゾリジン−２，５−ジオン（１２９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（１．７ｍｌ）中のメイタンシノール（１１３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この混合物を２〜３分間撹拌し、この時間後に、亜鉛トリフレート（２１８ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を５０〜５５℃において、ＨＰＬＣによって時々モニターしながら、撹拌した。２６時間後に、ＨＰＬＣ分析は、反応混合物が５７．５％の目的３−（Ｓ）−Ａａ、２％の３−（Ｒ）−Ａａ及び３１％の出発物質メイタンシノールを含有することを実証した。２８時間後に、加熱を除去し、反応を周囲温度に一晩放置させた。ＨＰＬＣ分析は、２８時間目に測定した反応プロフィルに比べて、反応プロフィルの変化を示さなかった。この反応混合物に酢酸エチル（３ｍｌ）と飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加えた。結果として生じた混合物を２〜３分間撹拌して、撹拌を停止した時に、層が分離した。水層を新鮮な酢酸エチル（１．５ｍｌ）で抽出した。有機層を一緒にして、最初は水（２ｍｌ）で、次は飽和ブライン溶液（１ｍｌ）で洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、褐色油状物と泡状固体を得た。得られた粗メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）は、例えばＨＰＬＣを用いて精製することも、又は次の工程に直接用いることも可能である。
【００３０】
本発明の方法の第２実施例では、下記方法を用いて、メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）を製造した。乾燥ＴＨＦ（１．２ｍｌ）と乾燥ＤＭＦ（０．６０ｍｌ）中のメイタンシノール（１２０ｍｇ，０．２１２ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２２２μｌ，６．０当量）、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（２３１ｍｇ，３．０当量）及びＮＭｅＡｌａＮＣＡ（１３８ｍｇ，５．０当量）を加えた。得られたほぼ溶液を周囲温度において撹拌し、定期的に反応転化に関してＨＰＬＣによってモニターした。ＨＰＬＣサンプル調製：反応混合物１０μｌを１：１アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５によって１ｍｌに希釈した。室温における２０時間後に、次回分のＮＣＡ（４１ｍｇ，１．５当量）を加えて、この反応を室温において、ＨＰＬＣによって定期的にモニターしながら、進行させた。２０時間を記録した時点で、メイタンシノールからＮ−メチルアラニンエステルＡａへの転化％は約７１％であり、ジアステレオマー過剰％は９５％であった。４０時間後に、ＨＰＬＣ分析は、メイタンシノールから該エステルＡａへの８４％転化を示し、ジアステレオマー過剰％は９３％であった。
【００３１】
３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）と３−（２−メチルジスルファニル）プロパン酸、ＨＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＳＳＭｅ（２）とのカップリングによって、ＤＭ１−ＳＭｅを製造することができる：
【００３２】
【化８】
【００３３】
上記反応を実施するための多様な方法は、当業者の知識の範囲内である。例えば、酸２の活性エステル形、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（−ＯＳｕ）又はペンタフルオロフェニル（−Ｐｆ）エステルを該カップリング反応に用いることができる。或いは、遊離酸２と適当なカップリング試薬とのカップリングによって、ＤＭ１を製造することができる。カップリング試薬の例は、ウロニウム型カップリング剤、例えば、非限定的に、Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート（ＴＯＴＵ）、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ＨＢＴＵ又はＴＢＴＵ（それぞれ、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート及びテトラフルオロボレート）；カルボジイミド型試薬、例えば、非限定的に、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）；活性エステル；又はホスホニウム型カップリング剤、例えば、Ｂｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）又はＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ（ピロリジノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）を包含する。他の有用なカップリング剤は、ＩＩＤＱ（２−イソブトキシ−１−イソブトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）及びイソブチルクロロホルメートを包含する。ペプチド・カップリングは、例えば、Humphrey and Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266に記載されており、この文献はその全体で本明細書に援用される。
【００３４】
１実施例では、下記方法を用いて、３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）をＤＭ１−ＳＭｅに転化させた。塩化メチレン（１．８ｍｌ）中の粗Ａ（上記実施例に従って得たもの、９５ｍｇ，０．１４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５１μｌ，０．２９ｍｍｏｌ）を加えた。該溶液を２〜３分間撹拌した後に、３−メチルジスルファニル−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル・エステル（５５ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌した反応混合物を次に３０〜３５℃に１６時間加熱した。ＨＰＬＣ分析は、該反応混合物が約４５〜５０％のＤＭ１−ＳＭｅと３０〜３５％のメイタンシノール（先行工程から）を含有することを実証した。Ｌ−異性体対Ｄ−異性体の比率は依然として変化せずに約９８：２であった。
【００３５】
ＤＭ１−ＳＭｅからＤＭ１への転化は、ジスルフィド結合を既知方法で切断することによって達成することができる。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、このような転化のための選択すべき試薬である。Tetrahedron Lett. 1993, 34, 8169。
【００３６】
メイタンシノール３−（Ｓ）−α−Ｎ−メチルアミノプロピオネート（Ａａ）は、例えばＤＭ４のような、他のメイタンシノイドを製造するための有用な中間体である：
【００３７】
【化９】
【００３８】
ＤＭ１−ＳＭｅに関して上述した製造と同様な方法で、３−（２−メチルジスルファニル）プロパン酸を４−メチル−４−（２−メチルジスルファニル）ペンタン酸、ＨＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＳＳＭｅ又はその活性化形と取り替えることによって、中間体ＡａからＤＭ４−ＳＭｅを製造することができる。次に、上述したように、ジスルフィド結合を還元することによって、ＤＭ４−ＳＭｅをＤＭ４に転化することができる。
【００３９】
抗腫瘍剤として用いるために、該薬物の硫黄原子と抗体リンカー基の硫黄原子との間にジスルフィド結合を形成することによって、ＤＭ１及びＤＭ４を抗体にコンジュゲートさせることができる。ＤＭ１に比べて、ＤＭ４の硫黄は、該硫黄にメチル基が隣接する結果としてより大きく立体障害を受けている。この立体障害は、抗体−薬物コンジュゲートを化学的により大きく安定にするように設計される。種々なメイタンシノイドの設計では、該硫黄に隣接して種々な、他の置換基を導入することによって、該コンジュゲートの安定性を調節することができる。このようにして、該薬物−抗体コンジュゲートの効力及び耐性(tolerability)を、特定の抗腫瘍抗体に要求されるように、最適化することができる。本発明の方法の利点は、該側鎖のＮ−メチル−アラニル部分に取り付けたメルカプト−アルカノイル部分上の、種々な鎖長及び置換基を有する多様なＤＭ型側鎖の製造に、中間体Ａを用いることができることである。
【００４０】
本発明の方法は、種々なキラルアミノ酸側鎖を有するメイタンシンの類似体である化合物の製造にも有用である。多くのメイタンシン及びメイタンシノールの合成が報告されている。報告された合成は、例えば化合物１のような、４−アルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン又は３，４−ジアルキル−１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンとのカップリング反応を受けて、次に、抗体へのコンジュゲーションに適した側鎖の作製(elaboration)を可能にする、種々な類似体の製造を可能にする。その上、メイタンシノールは、アンサマクロライドのクラスの１員である、多くのアンサマクロライドは微生物から単離されており、細胞障害活性を有することが判明している(Merck Index, 13ｔｈ Edition, 2001)。このような類似体の一つは、該マクロライドのフェニル部分上のクロロ置換基が存在する場所に水素が存在することを除いて、メイタンシノールと同じである。
【００４１】
典型的に、用いる置換１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンはホモキラルであるか又はエナンチオマー的に富化しており、主要な異性体はＳ−異性体である。天然生成アミノ酸は、Ｒ１基を有する炭素がこの望ましい立体配置を有する、多様な１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオンを提供する。好ましいＲ１基は、例えば、メチル、イソブチル又はベンジルのような、小さい置換若しくは非置換アルキル基を包含する。Ｒ２は水素又は小アルキル基であることができる。工程（ａ）の非求核性塩基が有機塩基であることも好ましく、上記ヒンダード有機塩基の一つであることがさらに好ましい。
【００４２】
上述したように、本発明は、抗体へのコンジュゲーションのための第２級アミノ酸側鎖を有する、広範囲なメイタンシンの製造に従うものである。したがって、本発明のもう一つの実施態様は、式ＩＩ：
【００４３】
【化１０】
【００４４】
［式中、ＸはＣｌ又はＨであり；Ｒ１はアミノ酸側鎖であり；Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；Ｌは、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル及びＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから成る群から独立的に選択される０〜２個の置換基を有するＣ２−Ｃ６アルキレン鎖であり；Ｒ３は水素又はＳ−Ｒ４であり；Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法に関する。該方法は、
（ａ）化合物２と、メイタンシノール又はその類似体とのカップリング反応によって、
式Ｉ：
【００４５】
【化１１】
【００４６】
［式中、Ｘ＝Ｈ］
で示される化合物を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた、式Ｉで示される化合物をＲ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４［式中、Ｒ５は水素又は活性化基である］とカップリングさせて、ＲがＳ−Ｒ４である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程；及び
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程
を含む。
【００４７】
好ましい出発物質はメイタンシノール（Ｘ＝Ｃｌ）である。好ましくは、Ｌは、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立的に選択される０〜２個の置換基を有するＣ２−Ｃ３アルキレン鎖であり、より好ましくは、該アルキレン鎖は０〜２個のメチル基によって置換される。最も好ましくは、Ｒ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４は、
【００４８】
【化１２】
【００４９】
から選択され、これらは、それぞれ、ＤＭ１−ＳＭｅ又はＤＭ４−ＳＭｅを提供する。抗体コンジュゲーションに適した側鎖を提供するために、上記工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を例えばジチオトレイトールのような還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る。
【００５０】
本発明の方法によって製造されるメイタンシノイドは、多様な抗体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートしたＰＳＭＡ抗体である上記ＭＬＮ２７０４の他に、他のＤＭコンジュゲート抗体(DM-conjugated antibodies)の例は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌及びある一定の非小細胞肺癌の治療のためにＣａｎＡｇ抗体を標的とするカンツズマブ・メルタンシン（cantuzmab・mertansine）／ｈｕＣ２４２−ＤＭ１、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍及びある一定の血液癌の治療のためにＣＤ５６抗原を標的とするｈｕＮ９０１−ＤＭ１、並びにＨｅｒ２腫瘍の治療のためにＨｅｒ２抗原を標的とするトラスツズマブ−ＤＭ１を包含する。
【００５１】
解明と理解のために上記発明をある程度詳細に説明してきたが、これらの特定の実施態様は例示及び非限定と解釈すべきである。形式及び細部における多様な変更が、特定の実施態様によってではなく特許請求の範囲によって定義されるべきである、本発明の実際の範囲から逸脱することなくなされうることは、この開示を読むならば当業者によって理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
［上記式中、Ｘは、Ｃｌ又はＨであり、そしてＲは、
【化２】
であり、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキル基である］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）
（ｉ）Ｒが水素であることを除いて、式Ａと同じ式によって示される出発物質、
（ｉｉ）式２：
【化３】
で示される化合物、
（ｉｉｉ）ルイス酸、
（ｉｖ）非求核性塩基、及び
（ｖ）有機溶媒
を含む混合物を用意する工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、該出発物質の一部が式Ａで示される化合物に転化されるまで反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物から、式Ａで示される粗化合物を取り出す工程；及び
（ｄ）任意に、工程（ｃ）で得られた、式Ａで示される化合物を精製する工程
を含む方法。
【請求項２】
出発物質がメイタンシノールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ２がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
式２で示される化合物が主として（Ｓ）異性体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
式２で示される化合物が３，４−ジメチル−オキサゾリジン−２，５−ジオンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩ：
【化４】
［式中、ＸはＣｌ又はＨであり；Ｒ１はアミノ酸側鎖であり；Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルであり；Ｌは、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル及びＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから成る群から独立的に選択される置換基０〜２個を有するＣ２−Ｃ６アルキレン鎖であり；Ｒ３は水素又はＳ−Ｒ４であり；そしてＲ４はＣ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）式２で示される化合物と、メイタンシノール又はその類似体とのカップリング反応によって、
式Ｉ：
【化５】
［式中、Ｘ＝Ｈ］
で示される化合物を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた、式Ｉで示される化合物をＲ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４［式中、Ｒ５は水素又は活性化基である］とカップリングさせて、ＲがＳ−Ｒ４である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程；及び
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程
を含む方法。
【請求項７】
Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｌが、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立的に選択される置換基０〜２個を有するＣ２−Ｃ３アルキレン鎖である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｌが、０〜２個のメチル基によって置換されたアルキレン鎖である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキルが、
【化６】
である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を、還元剤で処理して、Ｒが水素である、式ＩＩで示される化合物を得る、請求項９記載の方法。
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
［上記式中、Ｘは、Ｃｌ又はＨであり、そしてＲは、
【化２】
であり、Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキル基である］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）
（ｉ）Ｒが水素であることを除いて、式Ａと同じ式によって示される出発物質、
（ｉｉ）式２：
【化３】
で示される化合物、
（ｉｉｉ）ルイス酸、
（ｉｖ）非求核性塩基、及び
（ｖ）有機溶媒
を含む混合物を用意する工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、該出発物質の一部が式Ａで示される化合物に転化されるまで反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物から、式Ａで示される粗化合物を取り出す工程；及び
（ｄ）任意に、工程（ｃ）で得られた、式Ａで示される化合物を精製する工程
を含む方法。
【請求項２】
出発物質がメイタンシノールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ２がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
式２で示される化合物が主として（Ｓ）異性体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
式２で示される化合物が３，４−ジメチル−オキサゾリジン−２，５−ジオンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩ：
【化４】
［式中、ＸはＣｌ又はＨであり；Ｒ１はアミノ酸側鎖であり；Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルであり；Ｌは、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル及びＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから成る群から独立的に選択される置換基０〜２個を有するＣ２−Ｃ６アルキレン鎖であり；Ｒ３は水素又はＳ−Ｒ４であり；そしてＲ４はＣ１−Ｃ６アルキル、アリール又はアラルキルである］
で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）式２で示される化合物と、メイタンシノール又はその類似体とのカップリング反応によって、
式Ｉ：
【化５】
［式中、Ｘ＝Ｈ］
で示される化合物を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた、式Ｉで示される化合物をＲ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｒ４［式中、Ｒ５は水素又は活性化基である］とカップリングさせて、ＲがＳ−Ｒ４である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程；及び
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を還元剤で処理して、Ｒが水素である場合の式ＩＩで示される化合物を得る工程
を含む方法。
【請求項７】
Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｌが、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立的に選択される置換基０〜２個を有するＣ２−Ｃ３アルキレン鎖である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｌが、０〜２個のメチル基によって置換されたアルキレン鎖である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ５Ｏ２Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキルが、
【化６】
である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）で得られた、式ＩＩで示される化合物を、還元剤で処理して、Ｒが水素である、式ＩＩで示される化合物を得る、請求項９記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５０４６５５（Ｐ２００９−５０４６５５Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２６１２５（Ｐ２００８−５２６１２５）
【出願日】平成１８年８月８日（２００６．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２１６７４
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５００２８７６３９）ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (98)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＥＮＮＩＵＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月８日（２００６．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２１６７４
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５００２８７６３９）ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (98)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＥＮＮＩＵＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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