クモ糸タンパク質およびクモ糸タンパク質の生産方法
本発明は、１５０〜４２０アミノ酸残基からなり、式ＲＥＰ−ＣＴにより規定される単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質を提供する。ＲＥＰは、８０〜３００アミノ酸残基を有する反復的なＮ末端誘導タンパク質フラグメントである。ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基を有するＣ末端誘導タンパク質フラグメントである。本発明はさらに、大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメントならびに融合パートナーおよび切断剤認識部位を含む第二タンパク質フラグメントからなる単離された融合タンパク質を提供する。第一タンパク質フラグメントは、切断剤認識部位を通じて融合パートナーに結合されている。本発明はまた、大瓶状腺スピドロインタンパク質およびそのポリマーの製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の組換え生産の分野に関係する。とりわけ、本発明は、クモ糸タンパク質（ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の組換え生産に関係している。本発明は、新規な単離された大瓶状腺（ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ）スピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎ）タンパク質、および大瓶状腺スピドロイン融合タンパク質、ならびにこのようなタンパク質の製造方法およびその製造のためのポリ核酸分子を提供する。大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーおよびこのようなポリマーの製造方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸は、強度と弾性の組み合わせにより桁外れの強靱性を獲得する天然の高性能ポリマーである。クモには最大７つの特化した腺が存在し、これらは異なる機械的特性および機能を有する様々なタイプの糸繊維を産生する。大瓶状腺により産生されるしおり糸（ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ）は最も強靭な繊維であり、同重量では、人為的に製造された素材、例えば高張力鋼およびケブラー（Ｋｅｖｌａｒ）より優れている。しおり糸の特性は、医療または技術目的の新素材の開発において注目されている。
【０００３】
しおり糸は、２つの主要なポリペプチドからなり、これらはほとんどの場合大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１および２と称されるがニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）においてはＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４と称される。これらのタンパク質は、サンプルの経年数および分析条件に依存して２００〜７２０ｋＤａの範囲の見かけ上の分子量を有するが、クモしおり糸の全長遺伝子は未だ報告されていない。しおり糸ポリペプチドの特性については、Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，２０７０−２０７４（２００４）において議論されている。公知のしおり糸であるスピドロインは、その繊維内で結晶βシートを形成するアラニンリッチセグメントと、より柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いているグリシンリッチセグメントが交互に並ぶ、高度に反復的なブロックから構成される。そのＣ末端領域は非反復的であり、種の間で高度に保存されており、αヘリックスの立体配座をとる。しおり糸タンパク質のＮ末端領域は、つい最近特徴付けられたばかりであり、種々のスピドロインの間で、かつ種々のクモ種の間でさえも高度に保存されているＮ末端ドメインであることが明らかにされた（Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｏｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ｄｒａｇｌｉｎｅ，ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ，ａｎｄ ｃｙｌｉｎｄｒｉｆｏｒｍ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ７，３１２０−３１２４（２００６））。
【０００４】
しおり糸の機械的特性は種間で異なり；ユープロステノプス エスピー（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．）のしおり糸は、例えばニワオニグモまたはアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）のしおり糸を上回る堅さ、強度（破るのにより強い力が必要となる）を有し、かつ伸縮性が小さい。ユープロステノプス エスピー由来のしおり糸は、ニワオニグモ由来のしおり糸よりも結晶βシート構造の割合が高いようであり、その原因はユープロステノプス エスピーのＭａＳｐが今日までに分析されている全ての種の中で最高のポリアラニン含有量を有することによる可能性が高い（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，Ｎ．Ｎ．＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））。
【０００５】
人工的なクモ糸を生産する試みは、全長遺伝子が未だに報告されていないがために、しおり糸タンパク質をコードする天然または合成遺伝子のフラグメントを利用している。組換えしおり糸タンパク質は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞、トランスジェニック蚕、およびトランスジェニックヤギを含む様々な系において発現されている。例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．７，４００−４０６（１９９６）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｉｒｗｉｎ，Ｓ．Ｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，２３−３２（１９９７）；Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，３１−３８（１９９８）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｂｅｄｚｙｋ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，３３−３９（１９９７）；およびＬａｚａｒｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｅｒｓ ｓｐｕｎ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，４７２−４７６（２００２）を参照のこと。
【０００６】
ＷＯ ２００４／０１６６５１（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｙｏｒｋ）には、ユープロステノプス エスピー由来のＭａＳｐ１タンパク質の内部の反復部分をコードする核酸配列が記載されている。タンパク質は発現されていない。
【０００７】
Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）には、全てオニグモ科（Ａｒａｎｅｕｓ）由来のＡＤＦ３から獲得した、反復的なＡｌａリッチおよびＧｌｙ／Ｇｌｎリッチフラグメントならびに非反復フラグメントをコードする合成遺伝子「（ＡＱ）12ＮＲ３」が記載されている。この遺伝子は、凝集するがポリマーまたは繊維を形成しない可溶性タンパク質（５９.８ｋＤ、＞５２８ａａ）を発現させる。このタンパク質のアラニン含有量は１０〜１５％である。
【０００８】
ＷＯ ０３／０５７７２７には、哺乳動物細胞株および動物における可溶性組換えクモ糸ポリペプチドの発現が記載されている。一つの発現されたクモ糸ポリペプチド（ＡＤＦ−３；６０ｋＤ、６５２ａａ）は、反復単位および非反復的親水性ドメインからなる。別の発現されたクモ糸ポリペプチド（ＡＤＦ−３ Ｈｉｓ；６３ｋＤ、６７７ａａ）は、反復単位、非反復的親水性ドメイン、ｃ−ｍｙｃエピトープ、および６ヒスチジンタグからなる。反復単位のＡｌａ含量は低い（１０〜２０％）。得られたクモ糸ポリペプチドは、水性媒体に対する溶解性が乏しく、および／または沈殿物を形成する。得られたクモ糸ポリペプチドは自発的に重合しないので、ポリマーまたは繊維を得るために紡糸（ｓｐｉｎｎｉｎｇ）が必要となる。
【０００９】
いくつかの要因がしおり糸タンパク質の発現を困難にしている。その遺伝子の高度に反復的な性質、およびそれに付随するそのタンパク質の限局的なアミノ酸組成に起因して、転写および翻訳の誤りが生じる。その後の不連続的な翻訳で微生物発現系においてｔＲＮＡプールを使い果たすことによりタンパク質合成が完遂せずに終了することが別の理由であり得る。タンパク質合成の打ち切りについて議論されている他の理由は、ｍＲＮＡの二次構造の形成および遺伝子の組換えである。２.５ｋｂより大きいネイティブＭａＳｐ遺伝子は、細菌宿主において不安定であることが示されている。さらに、天然型のしおり糸フラグメントおよび設計されたブロックコポリマーは両方とも、特にＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４由来タンパク質は、容易に自己会合して無定形の凝集物を形成し、これが沈降およびタンパク質の減少を引き起こすため、組換えしおり糸タンパク質を可溶化形態で維持する困難性もある。Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）およびＬａｚａｒｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｅｒｓ ｓｐｕｎ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，４７２−４７６（２００２）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、クモ糸繊維を提供できる新規なクモ糸タンパク質を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、必要に応じて繊維に自己重合させることが容易に操作できる水溶性のクモ糸タンパク質を提供することである。これは、特有の用途、例えばその繊維上での真核細胞の培養を可能にする。さらに、この特性により、以下の工程の全てを生理学的条件下で行うことができ、これにより毒性およびタンパク質変性の危険が少なくなる。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、新規なクモ糸タンパク質の繊維を提供することである。
【００１３】
本発明の一つの目的は、必要に応じて繊維に自己重合させることが容易に操作できるクモ糸タンパク質をラージスケールで提供することである。
【００１４】
本発明の目的はまた、クモ糸タンパク質およびクモ糸タンパク質の繊維の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これらおよび以下の開示から明らかとなる他の目的のために、本発明は、一つの側面に従い、１５０〜４２０アミノ酸残基からなり、式ＲＥＰ−ＣＴ［式中、ＲＥＰは、８０〜３００アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、ここで該フラグメントはＬ（ＡＧ）nＬ、Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、Ｌ（ＧＡ）nＬ、Ｌ（ＧＡ）nＧＬ（式中、ｎは４〜８の整数であり；各個々のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０〜３個がＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；各個々のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；かつ各個々のＬセグメントは、０〜２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である）の群から選択され；そしてＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、このフラグメントは大瓶状腺スピドロインタンパク質由来のＣ末端フラグメントである］により規定される、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質、またはその誘導体を提供する。
【００１６】
本発明は、クモ糸様繊維を形成するのに十分なタンパク質モチーフの同定、および適する宿主、例えば細菌、好ましくは大腸菌において生産させることができる組換えＭａＳｐタンパク質を構築するための上記モチーフの使用に基づくものである。
【００１７】
本発明に従う特定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列である。
【００１８】
本発明に従ういくつかの実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様においては、各個々のＧセグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００１９】
本発明に従う特定の実施態様において、ＣＴフラグメントは、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、または配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、および配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、ならびに図３の任意のアミノ酸配列、特に図３のＭａＳｐ１配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様においては、ＣＴフラグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列である。
【００２０】
本発明に従う特定の実施態様において、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）および他の発熱物質の含量は、１内毒素単位（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｕｎｉｔ）（ＥＵ）／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。
【００２１】
別の側面によれば、本発明は、大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、および第二タンパク質フラグメントからなり、ここで該第二タンパク質フラグメントが融合パートナーおよび切断剤認識部位を含み、ここで上記第一タンパク質フラグメントが切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される、単離された融合タンパク質を提供する。
【００２２】
本発明は、Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘ［式中、ＲＥＰおよびＣＴは本発明に従うタンパク質フラグメントであり；かつＸは融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントであり；ここでタンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは切断剤認識部位を通じて融合パートナーに結合される］の群から選択される、単離された融合タンパク質を提供する。
【００２３】
本発明に従う特定の実施態様において、単離された融合タンパク質におけるＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。
【００２４】
さらに別の側面によれば、本発明は、（ｉ）本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；および場合により（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、（ｉ）本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させること；および場合により（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。好ましい方法において、前記工程（ｉｉｉ）はさらに、前記液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、ここで前記重合は上記界面または上記界面付近の領域で開始される。好ましい方法において、前記液体媒体は水性媒体であり、別の相は空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される。
【００２６】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。
【００２７】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明の別の側面は、（ｉ）本発明の可溶性融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適した宿主において発現させること；および（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること、の工程を含む、本発明の可溶性融合タンパク質の生産方法にある。場合により、可溶性融合タンパク質を単離する前記工程（ｉｉ）はＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００２９】
本発明はまた、（ｉ）本発明の可溶性融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適する宿主において発現させること；（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；および場合により（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、からなる、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。さらに、場合により、可溶性融合タンパク質を単離する前記工程（ｉｉ）および大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する場合による工程（ｖ）は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００３０】
本発明はさらに、（ｉ）本発明の可溶型融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適する宿主において発現させること；（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させること；および場合により（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。好ましい方法において、前記工程（ｖ）はさらに、液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、前記重合は上記界面または上記界面付近の領域で開始される。好ましい方法において、前記液体媒体は水性媒体であり、別の相は空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される。
【００３１】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。本発明はまた、本発明に従う方法により得ることができる、大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。好ましい実施態様において、前記ポリマーは繊維である。他の好ましい実施態様において、前記ポリマーは、泡、ゲル、メッシュ、またはフィルムからなる群より選択される構造を形成する。
【００３２】
さらに別の側面によれば、本発明は、融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの、上記切断剤認識部位を介してクモ糸タンパク質フラグメントに結合された上記タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質を生産するための新規な使用を提供する。好ましい実施態様において、前記クモ糸タンパク質フラグメントは、１５０〜４２０アミノ酸残基からなる。
【００３３】
最後の側面によれば、本発明は、配列番号１、および配列番号２〜１６をコードする核酸配列、またはその相補的核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。本発明はまた、クモ糸タンパク質をコードする非天然型遺伝子を生産するための、単離されたポリ核酸分子の使用を提供する。
【００３４】
発明の詳細な開示
本発明は概して、クモ糸繊維の組換え生産に十分なスピドロインタンパク質モチーフの同定に基づくものである。このモチーフは、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）からの部分大瓶状腺スピドロイン１（ＭａＳｐ１）ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定からの推定アミノ酸配列に基づく。単離されたＭａＳｐ１ ｃＤＮＡは、新規なスピドロイン遺伝子、例えば本明細書中で報告されている遺伝子の構築の出発点として有用である。この新規スピドロイン ｃＤＮＡから得られるタンパク質から形成されるポリマーは、それらの物理的特性、特に高強度、弾性、および軽量という有用な組み合わせから有用である。それらはまた、細胞の付着および成長を支持する能力からも有用である。このしおり糸の特性は、医療目的または技術目的の新素材を開発する上で魅力的である。特に、本発明のクモ糸は、医療用デバイス、例えばインプラントおよび医療製品、例えば創縫合システム、バンドエンド、縫合糸、創傷包帯、ならびに組織工学および誘導細胞再生（ｇｕｉｄｅｄ ｃｅｌｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のスカフォールドにおいて有用である。本発明のクモ糸はまた、パラシュート、防弾チョッキ、シートベルト等の織物または編物として使用する上でも特に有用である。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、用語「繊維」は、少なくとも１μｍの厚みを有するポリマー、好ましくは肉眼で視認できる、すなわち少なくとも１μｍの厚みを有し、かつその厚みに対して長さでかなりの伸び、好ましくは５ｍｍ以上を有する巨視的なポリマーに関する。用語「繊維」は、構造化されていない凝集物または沈殿物を含まない。
【００３６】
用語「大瓶状腺スピドロインタンパク質」、「スピドロインタンパク質」は、本明細書を通じて互換的に使用され、全ての公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質、ニワオニグモの場合は典型的には「ＭａＳｐ」または「ＡＤＦ」と省略される、を包含する。これらの大瓶状腺スピドロインタンパク質は、一般的に二つのタイプ、１型および２型のものである。これらの用語はさらに、添付の特許請求の範囲において規定されるような本発明の新規タンパク質、ならびに公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質に対して高度の同一性および／または類似性を有する他の非天然型タンパク質を包含する。
【００３７】
本発明者らは、この同定したスピドロインタンパク質モチーフを、非天然型のスピドロインタンパク質をコードする新規な遺伝子構築物を構築するのに利用した。１５０〜４２０アミノ酸残基、換言すれば１５０以上、好ましくは２２０以上、好ましくは２５０以上で、かつ４２０以下、好ましくは３８０アミノ酸残基以下、好ましくは３２０アミノ酸残基以下、好ましくは２８０アミノ酸残基以下の、例えば２２０〜３６０のアミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質を、例えば細菌または他の適する生産生物において組換え生産させることができることを発見した。得られるスピドロインタンパク質は、本発明に従う巨視的なクモ糸繊維を自発的に形成する。これは驚くべき結果である。なぜならば、天然のスピドロインタンパク質および以前から知られている組換え生産された繊維形成性のスピドロインタンパク質は、本発明に従うタンパク質よりもずっと長いからである。さらに、天然のスピドロインタンパク質および以前から知られている組換え生産された繊維形成性のスピドロインタンパク質は、多量の内部リピートを含む傾向があり、重合のために紡糸および／または過酷な溶媒を使用する必要がある。
【００３８】
スピドロインタンパク質がインビトロで自発的に繊維を形成できることを示したのは本発明が初めてである。本明細書中に示されるデータもまた、繊維形成を誘導するのにスピドロイン配列の一部のみが存在する必要があることを示している。さらに、ユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ）の反復ドメインおよびジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ）の非反復Ｃ末端ドメイン（実施例６Ｃを参照のこと）を含む種間ハイブリッドも繊維を形成し、このことは、このモチーフの線維形成能が強力であることを示している。
【００３９】
その全般的な側面において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、式ＲＥＰ−ＣＴにより規定される。ＲＥＰタンパク質フラグメントおよびＣＴタンパク質フラグメントは共有結合により、典型的にはペプチド結合を介して結合される。
【００４０】
タンパク質フラグメントＲＥＰは、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチが交互に並ぶ、反復的な特徴を有する。ＲＥＰフラグメントは、一般的に、８０以上、例えば１４０以上で、かつ３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、そして、以下でより詳細に説明するが、それ自体をいくつかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント、およびＧ（グリシンリッチ）セグメントに分けることができる。典型的には、リンカーセグメント（これは任意のものである）はＲＥＰフラグメントの末端に位置し、残りのセグメントはアラニンリッチおよびグリシンリッチが順々に並ぶものである。従って、ＲＥＰフラグメントは、一般的に、以下の構造［式中のｎは整数である］：
Ｌ（ＡＧ）nＬ、例えばＬＡ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、例えばＬＡ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5Ａ6Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）nＬ、例えばＬＧ1Ａ1Ｇ2Ａ2Ｇ3Ａ3Ｇ4Ａ4Ｇ5Ａ5Ｌ；または
Ｌ（ＧＡ）nＧＬ、例えばＬＧ1Ａ1Ｇ2Ａ2Ｇ3Ａ3Ｇ4Ａ4Ｇ5Ａ5Ｇ6Ｌ
のいずれかであり得る。当然の結果として、アラニンリッチセグメントまたはグリシンリッチセグメントのどちらがＮ末端またはＣ末端のリンカーセグメントに隣接しているかは重要なことではないということになる。ｎは４〜８、より好ましくは４〜６の整数；すなわちｎ＝４、ｎ＝５、またはｎ＝６であることが好ましい。
【００４１】
好ましい実施態様において、本発明に従うＲＥＰフラグメントのアラニン含量は、２０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上で、かつ５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３５％以下である。アラニン含量の高さは、より堅くおよび／もしくは強くならびに／またはより延びない繊維を提供すると考えられるので、これは利点である。この理由は、アラニン含量の高さは、その繊維におけるβシート構造の含量の高さに関係するためであると考えられる。従って、好ましい実施態様において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー、例えば繊維におけるβシート含量は５０％以上である、すなわちそのタンパク質の二次構造の５０％以上がβシート形態をとっている。
【００４２】
特定の実施態様において、ＲＥＰフラグメントは、プロリン残基を欠いている、すなわちＲＥＰフラグメントにはＰｒｏ残基が存在しない。
【００４３】
次に、本発明のＲＥＰフラグメントを構成するセグメントを見るに、各セグメントは独立している、すなわち、特定のＲＥＰフラグメントの任意の二つのＡセグメント、任意の二つのＧセグメント、または任意の二つのＬセグメントは同一であっても同一でなくてもよいことが強調される。従って、特定のＲＥＰフラグメント内で各タイプのセグメントが同一であるということは本発明の一般的特徴ではない。むしろ、以下の開示は、当業者に対して、どのように個々のセグメントを設計するか、そして本発明の機能的なスピドロインタンパク質の一部であるＲＥＰフラグメントにそれらをどのように集成するかのガイドラインを提供するものである。
【００４４】
本明細書中に示される実験データから、各個々のＡセグメントが８〜１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であることが結論付けられた。各個々のＡセグメントは１３〜１５アミノ酸残基を含むことが好ましい。Ａセグメントの大部分または二つ以上が１３〜１５アミノ酸残基を含み、そしてＡセグメントの少数派、例えば一つまたは二つが８〜１８アミノ酸残基、例えば８〜１２または１６〜１８アミノ酸残基を含むことも可能である。これらのアミノ酸残基の圧倒的多数がアラニン残基である。とりわけ、アミノ酸残基の０〜３個がアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。従って、各個々のＡセグメントにおける全てのアミノ酸残基が例外なく、または一つ、二つ、もしくは三つのアミノ酸残基（任意のアミノ酸であり得る）を除いてアラニン残基である。アラニンに置き換わるアミノ酸は天然アミノ酸であり、好ましくは個々にセリン、グルタミン酸、システイン、およびグリシンの群から選択されることが好ましく、より好ましくはセリンである。当然のことであるが、Ａセグメントの一つまたはそれ以上が完全アラニンセグメントであり、残りのＡセグメントが１〜３個の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン、またはグリシンを含むことも可能である。
【００４５】
好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上記のように、１０〜１５個のアラニン残基および０〜３個の非アラニン残基を含む１３〜１５アミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上記のように、１２〜１５個のアラニン残基および０〜１個の非アラニン残基を含む１３〜１５アミノ酸残基を含む。
【００４６】
各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の天然型配列のセグメントの対応する。実施例１〜２および図１〜２Ａを参照のこと。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１、配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０、配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２、ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。この群の各配列は、適切な条件下でクモ糸繊維を形成する能力を有する、本発明の発現された非天然型のスピドロインタンパク質のセグメントに対応する。実施例５〜８、１２、および図２Ｂを参照のこと。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明のＡセグメントはヘリックス構造またはベータシートを形成するものと予想される。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される用語「％同一性」は、以下の通りに算出される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて、クエリー配列と標的配列のアラインメントを行う。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列において完全一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｓ）を示すクエリー配列上の位置の割合を、％同一性として表す。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される用語「％類似性」は、疎水性の残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、およびＣｙｓが類似し；塩基性の残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓが類似し；酸性の残基ＧｌｕおよびＡｓｐが類似し；そして親水性の非荷電残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒが類似する点を除いて「％同一性」について記載した通りに算出される。残った天然アミノ酸Ｇｌｙはこの文脈では他のアミノ酸と類似しない。
【００４９】
本明細書を通じて、本発明に従う代替の実施態様は、特定された割合の同一性の代わりにそれに対応する割合の類似性を満たすものである。他の代替の実施態様は、特定の割合の同一性に加えて、各配列における好ましい同一性の割合の群から選択される、別のより高い割合の類似性を満たすものである。例えば、ある配列は、別の配列に対して７０％類似であり得；別の配列に対して７０％同一であり得：または別の配列に対して７０％同一かつ９０％類似でもあり得る。
【００５０】
本発明に従う好ましい実施態様において、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。従って、本発明に従う特定の実施態様においては、各個々のＡセグメントは、上記アミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００５１】
さらに、本明細書中に示される実験データから、各個々のＧセグメントが１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが結論付けられた。各個々のＧセグメントは１４〜２３アミノ酸残基からなることが好ましい。各Ｇセグメントのアミノ酸残基の少なくとも４０％はグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含量は４０〜６０％の範囲である。
【００５２】
各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の天然型配列のセグメントに対応する。実施例１〜２および図１〜２Ａを参照のこと。あるいは、各個々のＧセグメントは、配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２、ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。この群の各配列は、適切な条件下でクモ糸繊維を形成する能力を有する、本発明に従う発現された非天然型のスピドロインタンパク質の一セグメントに対応する。実施例５〜８、１２、および図２Ｂを参照のこと。
【００５３】
本発明に従う好ましい実施態様において、各個々Ｇセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。従って、本発明に従う特定の実施態様においては、各個々のＧセグメントは、上記アミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００５４】
特定の実施態様において、本発明の各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でない。
【００５５】
特定の実施態様において、保存されたＴｙｒ残基に対応する（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応する）位置は、本発明の全てのＧセグメントにおいてＰｈｅではない。
【００５６】
特定の実施態様において、保存されたＴｙｒ残基に対応する（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応する）位置は、本発明に従う各ＧセグメントにおいてＴｙｒである。
【００５７】
当然の結果として、本発明のタンパク質の特定の実施態様は、上記の制限の組み合わせを示す、すなわち本発明の各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基が−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でなくかつ保存されたＴｙｒ残基（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応）が本発明の各ＧセグメントにおいてＴｙｒとなるということである。特定の実施態様において、個別に、または任意の起りうる組み合わせで採られた上記の制限はさらに、前で議論したようなＲＥＰフラグメントがプロリン残基を欠いているという制限と組み合わせることができる。
【００５８】
図１〜２および実施例３〜４を参照すれば、本発明のＧセグメントには三つのサブタイプがあることが分かる。この分類は、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質配列の注意深い分析（図１〜２Ａ）に基づいており、そしてこの情報は新規な非天然型のクモ糸タンパク質の構築において利用され、検証されている（図２Ｂ）。
【００５９】
本発明のＧセグメントの第一のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号５に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ ＧＳＳにより表される。この第一の、かつ全体の中で最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には２３アミノ酸残基を含むが、それより少ない１７アミノ酸残基を含みかつ荷電残基を欠くまたは荷電残基を一つ含む場合もある。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、１７〜２３アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより少ない１２アミノ酸残基またはそれより多い３０アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、コイル構造または３1ヘリックス構造を形成すると予想される。この第一サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、８４〜１０６、１４８〜１７０、２１２〜２３４、３０７〜３２９、３７１〜３９３、４３５〜４５７、５３０〜５５２、５９５〜６１７、６８９〜７１１、７５３〜７７５、８１７〜８３９、８８１〜９０３、９４６〜９６８、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基２６〜４５および８９〜１１１である。この第一サブタイプの代替のＧセグメントは、配列番号１３のアミノ酸残基１２０〜１４９および１５９〜１７２である。特定の実施態様において、本発明に従うこの第一サブタイプの各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でない。
【００６０】
本発明のＧセグメントの第二のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号６に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）Ｙ ＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓにより表される。この第二の、全体の中で中間サイズのＧセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、かつ荷電残基を欠くかまたは荷電残基を一つ含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、１４〜２０アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより少ない１２アミノ酸残基またはそれより多い３０アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、コイル構造を形成すると予想される。この第二サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２４９〜２６５、４７１〜４８８、６３１〜６４７、および９８２〜９９８；ならびに配列番号９のアミノ酸残基４３〜６０である。
【００６１】
本発明のＧセグメントの第三のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号７に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮにより表される。この第三のＧセグメントサブタイプは典型的には１４アミノ酸残基を含み、全体の中では本発明に従うＧセグメントサブタイプの中で最短である。この第三のＧセグメントサブタイプは、１２〜１７アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより多い２３アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、ターン構造を形成すると予想される。この第三サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基５７〜７０、１２１〜１３４、１８４〜１９７、２８０〜２９３、３４３〜３５６、４０７〜４２０、５０３〜５１６、５６７〜５８０、６６２〜６７５、７２６〜７３９、７９０〜８０３、８５４〜８６７、９１８〜９３１、１０１４〜１０２７；配列番号９のアミノ酸残基７６〜８９；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基６１〜７４である。この第三サブタイプの代替のＧセグメントは、配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１である。
【００６２】
従って、好ましい実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号５、配列番号６、および配列番号７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有する。
【００６３】
ＲＥＰフラグメントのＡセグメントおよびＧセグメントの交互配列の好ましい実施態様において、一つおきのＧセグメントが第一サブタイプのものであり、残りのＧセグメントが第三サブタイプのもの、例えば．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧshortＡ4ＧlongＡ5Ｇshort．．．である。ＲＥＰフラグメントの別の好ましい実施態様において、一つの第二サブタイプのＧセグメントが、このＧセグメントの規則性を挿入によって中断している、例えば．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧmidＡ4ＧshortＡ5Ｇlong．．．である。
【００６４】
各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表し、０〜２０アミノ酸残基、例えば０〜１０アミノ酸残基を含み得る。このセグメントは任意であり機能的にはスピドロインタンパク質にとって重要でないが、それでもその存在により、本発明のクモ糸繊維を形成する完全に機能的なスピドロインタンパク質が実現したとも言える。リンカーアミノ酸配列はまた、ユープロステノプス オーストラリス由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号３）にも存在する。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されるＡセグメントまたはＧセグメントのいずれかと似ている場合もあるが、通常、本明細書中に規定されるようなそれらの基準を十分に満たすものではない。
【００６５】
図２Ａに示されるように、ＲＥＰフラグメントのＣ末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳおよびＡＳＡＡＳＡＡＡにより表すことができ、これらはアラニンが豊富である。実際、二番目の配列は本発明のＡセグメントであると考えることができ、一番目の配列は本発明のＡセグメントに対して高い類似性を有する。本発明のリンカーセグメントの別の例は、一文字アミノ酸配列ＧＳＡＭＧＱＧＳを有し、これはグリシンが豊富であり本発明のＧセグメントに対して高い類似性を有する。
【００６６】
代表的なＬセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１〜６および１０９３〜１１１０；配列番号９のアミノ酸残基１〜１０および１５３〜１７１；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１７３〜１８０であるが、当業者はこれらのセグメントに関して多くの適切な代替のアミノ酸配列が存在することを容易に認識するであろう。本発明に従うＲＥＰフラグメントの一つの実施態様において、Ｌセグメントの一つは０アミノ酸を含む、すなわちＬセグメントの一つは存在しない。本発明に従うＲＥＰフラグメントの別の実施態様において、両方のＬセグメントが０アミノ酸を含む、すなわち両方のＬセグメントとも存在しない。従って、本発明に従うＲＥＰフラグメントのこれらの実施態様は、概略的に、以下のように（ＡＧ）nＬ、（ＡＧ）nＡＬ、（ＧＡ）nＬ、（ＧＡ）nＧＬ； Ｌ（ＡＧ）n、Ｌ（ＡＧ）nＡ、Ｌ（ＧＡ）n、Ｌ（ＧＡ）nＧ；および（ＡＧ）n、（ＡＧ）nＡ、（ＧＡ）n、（ＧＡ）nＧで表され得る。これらのＲＥＰフラグメントはいずれも、以下に規定される任意のＣＴフラグメントと共に使用するのに適している。
【００６７】
本発明に従うスピドロインタンパク質のＣ末端（ＣＴ）フラグメントは、スピドロインタンパク質のＣ末端アミノ酸配列に対して高い類似性を有する。図３に示されるように、このアミノ酸配列は様々な種ならびにＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２を含むスピドロインタンパク質の間で十分に保存されている。以下の実施例においては、ＣＴフラグメントが完全に欠失していない限り、具体的にどのＣＴフラグメントが本発明に従うスピドロインタンパク質に存在するかは重要なことではないことが実証されている。従って、本発明に従うＣＴフラグメントは、図３に示されるアミノ酸配列または類似性の高い配列のいずれかから選択できる。配列番号１３のＣＴhybフラグメントは配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して９６％の同一性を有するが、配列番号９のＣＴnatフラグメントは配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して５９％の同一性しか示さないことに注目されたい。このことは、幅広い様々なＣ末端配列が本発明のスピドロインタンパク質において使用できることを示している。
【００６８】
本発明に従うＣＴフラグメントの配列は、図３のアミノ酸配列に基づく配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％の同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明のＣＴフラグメントの配列は、配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜７１に対して少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明のＣＴフラグメントはさらに、配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列またはそのアミノ酸残基１〜７１に対して７０％の同一性、好ましくは８０％の類似性を有する。
【００６９】
本発明の典型的なＣＴフラグメントは、配列番号４のユープロステノプス オーストラリス配列、配列番号９のユープロステノプス オーストラリス由来アミノ酸残基１７２〜２６９、ならびにユープロステノプス エスピー由来であると主張されている（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，Ｎ．Ｎ．＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））が、アメリカジョロウグモおよびセネガルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）由来のＭａＳｐ１に対する類似性が高い配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６である。従って、本発明の好ましい側面によれば、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。本発明の好ましい側面において、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい側面において、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列と同一である。
【００７０】
ＣＴフラグメントは、典型的には、７０〜１２０アミノ酸残基からなる。ＣＴフラグメントは、少なくとも７０、または８０以上、好ましくは９０以上のアミノ酸残基を含むのが好ましい。ＣＴフラグメントが、最大１２０または１１０未満のアミノ酸残基を含むことも好ましい。典型的なＣＴフラグメントは、およそ１００アミノ酸残基を含む。
【００７１】
別の側面によれば、本発明は、好ましくは１５０〜４２０アミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、ならびに融合パートナーおよび切断剤認識部位を含む第二タンパク質フラグメントからなる単離された融合タンパク質を提供する。第一タンパク質フラグメントは切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合されていて、すなわち適切な条件下で適切な切断剤によって融合タンパク質を処理することによって融合パートナーを切り出し、好ましくは１５０〜４２０アミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質を提供することができる。この融合タンパク質を用いる利点は、沈降および適切な宿主、例えば細菌、好ましくは大腸菌で生産させる場合のその他の生産上の問題を引き起こさずに、溶液中で、好ましくは生理学的な媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９中で大量に生産させることができる点である。溶液中の融合タンパク質は、長い期間、典型的には数日または数週間の間、可溶性であり、これによりラージスケールでの生産が容易になり、タンパク質の凝集の危険が小さくなる。用語「可溶性」および「溶液中」は、タンパク質が目に見えて凝集せず、６００００×ｇで溶媒から沈降しないことを意味する。必要あらば、溶液中の融合タンパク質は、適当な切断剤を用いた切断に供され、自発的にクモ糸繊維を形成する大瓶状腺スピドロインタンパク質を提供することができる。
【００７２】
好ましい側面において、本発明は、Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘの群から選択される単離された融合タンパク質、好ましくはＸ−ＲＥＰ−ＣＴを提供する。ＲＥＰおよびＣＴは、本発明に従うタンパク質フラグメントであり、得られるＲＥＰ−ＣＴの形態のＭａＳｐタンパク質が本発明に従うＭａＳｐタンパク質であることを意味する。Ｘは、上記のような融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントである。タンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは、切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される。
【００７３】
本発明の融合パートナーには、その相手となるタンパク質フラグメント、ここでは本発明のＭａＳｐタンパク質、の溶解性および／または安定性を改善する任意のタンパク質フラグメントが含まれる。融合パートナーはまた、アフィニティ精製に適したハンドルを提供する。本発明に従う融合パートナーの例には、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＭＴＢ３２−Ｃ、Ｇｂ１、ＺＺ、およびＮｕｓ Ａが含まれるがこれらに限定されない。当業者は、代替の適切な融合パートナーを十分承知している。本発明の好ましい実施態様において、融合パートナーは、ＨｉｓタグおよびＳタグと組み合わせのチオレドキシン部分（ＴｈｒＸ）である。本発明の一つの好ましい実施態様において、融合パートナーは、二つのＨｉｓタグを有するＴｈｒＸ部分、すなわちＨｉｓタグ／ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグである。本発明の別の好ましい実施態様において、融合パートナーは、チオレドキシン部分（ＴｈｒＸ）である。
【００７４】
切断剤認識部位は、ＭａＳｐタンパク質フラグメントに結合されるＸタンパク質フラグメントの末端に置かれて、その認識部位における切断によりＭａＳｐタンパク質および融合パートナーが生じる。本発明に従う切断剤認識部位の例には、アミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳ（ＲとＧの間で切断される）を有するトロンビン認識部位；アミノ酸配列ＤＤＤＫ（Ｋの後ろで切断される）を有するエンテロキナーゼ認識部位；アミノ酸配列ＮＧ（ＮとＧの間で切断される）を有するヒドロキシルアミン認識部位；アミノ酸配列ＬＧＶＬＦＱＧＰ（ＱとＧの間で切断される）を有するＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ認識部位；アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（Ｒの後ろで切断される）を有する第Ｘａ因子認識部位；アミノ酸配列ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）、一般的にはＥＮＬＹＦＱＧ（ＱとＧ／Ｓの間で切断される）を有するＴＥＶ認識部位；アミノ酸配列ＥＤＮＬＹＦＱＧ（ＱとＧの間で切断される）を有するＡｃ−ＴＥＶ認識部位；およびアミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＱとＧの間で切断される）を有するＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ認識部位が含まれるがこれらに限定されない。他の適当な認識部位は、トリプシン、エンドプロテイナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ペプシン、およびＣＮＢｒの切断部位である。好適な切断認識部位のさらなる例は、十分に当業者の手の届く範囲内にある。本発明の好ましい実施態様において、切断剤認識部位はトロンビン認識部位である。
【００７５】
好ましい実施態様において、本発明のＸフラグメントは、ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグ／Ｓタグ／トロンビン切断部位という構造を有し、かつＸフラグメントは本発明のＲＥＰ−ＣＴタンパク質フラグメントのＮ末端に結合される。
【００７６】
一つの好ましい実施態様において、本発明のＸフラグメントはＨｉｓタグ／ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグ／トロンビン切断部位という構造を有し、かつＸフラグメントは本発明のＲＥＰ−ＣＴタンパク質フラグメントのＮ末端に結合される。
【００７７】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する。好ましくは、融合タンパク質は凝集せず、従って再溶解手順は必要ない。融合タンパク質は組換え生産され、融合タンパク質上のアフィニティハンドル、例えばＨｉｓタグまたは融合タンパク質中の任意の適切なエピトープを用いて精製され得る。液体媒体は、任意の適している媒体、好ましくは生理学的媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９であり得る。第二工程においては、切断剤認識部位において融合タンパク質の切断を達成するために、本発明に従う切断剤が液体媒体に加えられる。上記のように、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、これによって得られる。第三の場合による工程においては、このようにして得た大瓶状腺スピドロインタンパク質を、適する単離技術、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて液体媒体から単離する。
【００７８】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する。好ましくは、融合タンパク質は凝集せず、従って再溶解手順は必要ない。融合タンパク質は組換え生産され、融合タンパク質上のアフィニティハンドル、例えばＨｉｓタグまたは融合タンパク質中の任意の適切なエピトープを用いて精製され得る。液体媒体は、任意の適している媒体、好ましくは生理学的媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９であり得る。第二工程においては、切断剤認識部位において融合タンパク質の切断を達成するために、本発明に従う切断剤が液体媒体に加えられる。上記のように、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、これによって得られる。第三工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる。重合は、典型的には、二つの異なる相の間の界面で、例えば液体／空気、液体／固体、および水／油の界面で開始される。従って、この第三工程はさらに、液体媒体と別の相の間の界面の提供も含み得る。別の相は、気相、液相、および固相からなる群より選択される。上記のように、液体媒体は典型的には水性媒体であり、適当な別の相は、例えば空気および水不混和性の有機溶媒、例えば油、例えばＰＣＲ反応に適した鉱油である。生じる界面の存在は、その界面またはその界面付近の液体媒体に及ぶ領域において重合を刺激し、それによってこの界面または界面領域において重合が開始される。好ましい界面には、水／空気および水／油の界面が含まれる。重合は、典型的には、室温でのインキュベーションによって、数分または数時間以内に、例えば１分〜５時間以内に自然に起こる。第四の場合による工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを、適切な単離技術を用いて液体媒体から単離する。
【００７９】
上記のように、繊維の形成は、融合タンパク質からのミニチュアスピドロインのタンパク質分解による遊離により誘導される。切断反応を、穏やかに左右に揺すられているチューブ内で行うと、繊維は、そのチューブに沿う空気−水の界面で形成される。チューブは任意の適切な素材、例えばプラスチックまたはガラスから製造され得る。切断混合物を静置すると、空気−水の界面にフィルムが形成される。水性の切断混合物の上面に油を添加すると、静置する場合であっても揺する場合であっても、フィルムは油−水の界面で形成される。切断混合物を、例えば空気によるバブリングまたはホイッピングにより泡立てると、この泡は安定であり、乾燥させれば固化する。
【００８０】
本発明の方法を用いれば、必要に応じて切断できおよび重合させ得る、本発明の融合タンパク質を多量に組換え生産することが可能である。これにより、重合工程の制御性が良くなり、望ましい特性を有するクモ糸繊維を獲得するためにパラメータを最適化させることができる。
【００８１】
本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、典型的には、様々な好適な宿主を用いて組換え生産される。従って、別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質、例えば配列番号９〜１３、好ましくは配列番号９、１２、および１３、をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む単離されたポリ核酸分子を提供する。これらのポリ核酸分子および本明細書中に開示される様々なタンパク質（配列番号２〜１６）をコードするポリ核酸分子もまた、非天然型のスピドロインタンパク質またはその生産系のさらなる開発に有用であり得る。
【００８２】
本発明に従う融合タンパク質は、典型的には、様々な適する宿主、例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞、およびトランスジェニック動物を用いて組換え生産される。本発明に従う融合タンパク質を細菌中で生産させるのが好ましい。
【００８３】
従って、別の側面によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む単離されたポリ核酸分子を提供する。このポリ核酸分子はまた、非天然型のスピドロインタンパク質またはその生産系のさらなる開発にも有用であり得る。
【００８４】
本発明に従うポリ核酸分子は、ｃＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。当業者なら十分に認識するように、ある核酸配列は、さらにその相補的核酸配列をも表わし得る。従って、本発明に従う核酸配列に相補的な核酸配列もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００８５】
一つの側面によれば、本発明は、本発明に従う可溶性融合タンパク質の生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。場合により、可溶性融合タンパク質を単離する第二工程は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００８６】
本発明はさらに、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の製造方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。第三工程においては、単離された融合タンパク質の溶液を供給し、第四工程においては、その液体媒体に適した切断剤を添加する。これにより、切断剤認識部位における融合タンパク質の切断が達成され、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質が提供される。場合による第五工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体から単離する。さらに、場合により、可溶性融合タンパク質を単離する第二工程および大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する場合による第五工程は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００８７】
本発明はまた、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。第三工程においては、単離された融合タンパク質の溶液を供給し、第四工程においては、その液体媒体に適した切断剤を添加する。これにより、切断剤認識部位における融合タンパク質の切断が達成され、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質が提供される。第五工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる。重合は、典型的には、二つの異なる相の間の界面で、例えば液体／空気、液体／固体、および水／油の界面で開始する。従って、この第五工程はさらに、液体媒体と別の相の間の界面を提供することも含み得る。別の相は、気相、液相、および固相からなる群より選択される。上記のように、液体媒体は典型的には水性媒体であり、適した別の相は、例えば空気および水不混和性の有機溶媒、例えば油、例えばＰＣＲ反応に適した鉱油である。生じる界面の存在は、その界面またはその界面付近の液体媒体に及ぶ領域において重合を刺激し、それによってこの界面または界面領域において重合が開始される。好ましい界面には、水／空気および水／油の界面が含まれる。重合は、典型的には、室温でインキュベーションすると、数分または数時間以内に、例えば１分〜５時間以内に自然に起こる。場合による第六工程においては、このようにして得られたポリマーを、液体媒体から単離する。
【００８８】
インビボで生体材料として使用する上での必須の、低発熱物質含量のタンパク質を得るため、リポ多糖類（ＬＰＳ）の除去に最適化された精製プロトコルを開発した。遊離したＬＰＳの混入を回避するため、産生細菌細胞を、ＣａＣｌ2およびＥＤＴＡの交互の洗浄工程に供する。細胞溶解後の後続の全ての精製工程は、標的タンパク質とＬＰＳの間の疎水性相互作用を最小限に抑えるために、低伝導率の緩衝液中で行われる。ＬＰＳ含量は、このタンパク質溶液を、ＬＰＳを特異的に吸着するリガンドを有するＥｎｄｏｔｒａｐカラムに通すことによってさらに最小限に抑える。ＬＰＳおよび他の発熱物質が絶えず低含量であることを確認するため、全てのバッチを、インビトロ発熱性物質試験法（ＩＰＴ）および／またはリムルスアメーバ様細胞溶解産物（ＬＡＬ）動態アッセイを用いて分析する。グラム陰性細菌の宿主において生産されたにもかかわらず、組換えスピドロインタンパク質を、ＬＰＳおよび他の発熱物質の残留レベルが動物試験において要求される限界以下、すなわち２５ ＥＵ／インプラント以下にまで精製することができる。本発明に従う特定の実施態様において、単離された融合タンパク質中のＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。本発明に従う特定の実施態様において、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質中のＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満、好ましくは０.２５ ＥＵ／ｍｇタン
パク質またはそれ未満である。
【００８９】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。好ましい実施態様において、このタンパク質のポリマーは、本発明に従う方法のいずれか一つによって獲得できる。
【００９０】
好ましい実施態様において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーのβシート含量は５０％以上である、すなわちこのタンパク質のポリマーの二次構造の５０％より多くがβシート形態をとっている。より高いβシート構造の含量は、より堅くおよび／もしくは強く、ならびに／またはより延びない繊維を提供すると考えられるので、これは利点である。
【００９１】
本発明に従うスピドロインタンパク質のポリマーは、巨視的な大きさの、すなわち１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上の直径および５ｍｍ以上の長さを有する繊維であるのが好ましい。繊維は１０〜４００μｍ、好ましくは６０〜１２０μｍの範囲の直径、および０.５〜３００ｃｍ、好ましくは１〜１００ｃｍの範囲の長さを有することが好ましい。他の好ましい範囲は、０.５〜３０ｃｍおよび１〜２０ｃｍである。本発明のスピドロインタンパク質のポリマーは１ＭＰａ以上、好ましくは２ＭＰａ以上、より好ましくは１０ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有することも好ましい。本発明のスピドロインタンパク質のポリマーは、１００ＭＰａ以上、より好ましくは２００ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有することが好ましい。本繊維は、物理的操作の間もインタクトな状態を維持する能力を有する、すなわち、紡糸、製織（ｗｅａｖｉｎｇ）、撚糸（ｔｗｉｓｔｉｎｇ）、かぎ針編み（ｃｒｏｃｈｅｔｉｎｇ）、および類似の方法に使用できる。
【００９２】
好ましい実施態様において、本発明に従うスピドロインタンパク質のポリマーは、泡、ゲル、メッシュ、またはフィルムを形成する。
【００９３】
さらに別の側面によれば、本発明は、融合タンパク質を製造するための、融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの新規な使用を提供する。本融合タンパク質は、前記タンパク質フラグメントおよび本発明のクモ糸タンパク質フラグメントを含むものであり、二つのフラグメントは切断剤認識部位を介して結合されている。クモ糸タンパク質フラグメントは、好ましくは、１５０〜４２０アミノ酸残基からなる。
【００９４】
以下、本発明を下記の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００９５】
実施例
実施例１ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１ ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
南アフリカで採取した、およそ１００匹の雌成体ユープロステノプス オーストラリスのクモ由来の大瓶状腺を用いて特注のｐＤＯＮＲ２２２ベースのＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ ｃＤＮＡライブラリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を構築した。ＭａＳｐ１タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンは、ユープロステノプス属の未知の亜種のクモを起源とするアラニンリッチおよびグリシンリッチフラグメントをコードするｃＤＮＡプローブを用いてライブラリをスクリーニングすることによって得た。コロニーブロッティングおよび検出はＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を製造元の指示に従い用いて行った。
一つの単一クローンをさらなる特徴付けのために選択した。このクローンからｃＤＮＡインサートの全長配列を得るため、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて塩基配列段階的削除（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を作製し、配列決定をＭｅｇａＢａｓｅ １０００機器（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行った。
得られた３.８ｋｂ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、３４のアラニンリッチセグメントおよびグリシンリッチセグメントの反復フラグメント（配列番号３）ならびに９７アミノ酸残基のＣ末端非反復フラグメント（配列番号４）を含む、１２０７アミノ酸残基のＭａＳｐ１タンパク質（配列番号２）をコードするものであった。
【００９６】
実施例２ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントの配列分析
実施例１のユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質配列の反復フラグメント（配列番号３）を、このフラグメントの反復セグメントのアラインメントによりさらに分析した。図１を参照のこと。このアラインメントを注意深く精査し、以下の構造情報を得た。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質のアラニンリッチセグメントは１３〜１５アミノ酸残基長であり、アラニン残基のみからなるかまたは一つの残基（セリン、グルタミン酸、またはグリシン残基であった）を除いて全てがアラニン残基からなるものであった。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントはさらに、三つの関連する、しかし異なるタイプのグリシンリッチセグメントをさらに含んでいた。図２Ａを参照のこと。このグリシンリッチセグメントのうちの二つは、ほぼ長さおよび出現率のみが異なり；最も共通のグリシンリッチセグメントは２３アミノ酸残基を含むが、より数の少ないバリアントは１７アミノ酸残基を含むものであった。これらのグリシンリッチセグメントは両方とも、全般的に、荷電残基を欠いているかまたは一つの荷電残基を含むものであった。対照的に、１４アミノ酸残基を含む最短型のグリシンリッチセグメントは、Ｎ末端に配列ＧＲＧＱＧまたはＧＱＧＱＧおよびＣ末端にＧＮを含む点が独特であった。
最長型のグリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ （Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ ＧＳＳ（配列番号５）により表され、荷電残基を欠いていた。このセグメントはコイル構造または３1−ヘリックス構造を形成することが予想された。中間サイズのグリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）Ｙ ＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号６）により表され、荷電残基を欠いているかまたは一つの荷電残基を含むものであった。このセグメントはコイル構造を形成することが予想された。最小型グリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ （Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号７）により表されるものであった。このセグメントはターン構造を形成することが予想された。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントは、アラニンリッチセグメントとグリシンリッチセグメントを交互にすることで構築されるものであった。例えば、
．．．．Ａ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5．．．
上記の最小型および最長型のグリシンリッチセグメントの各々は、概ね、グリシンリッチセグメント二つごとに出現することが観察された。例えば、
．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧshortＡ4ＧlongＡ5Ｇshort．．．
対照的に、より数の少ない中間サイズのグリシンリッチフラグメントは、概ね、それより長いタイプのグリシンリッチセグメントとそれより短いタイプのグリシンリッチセグメントの間に出現するものであった。例えば、
．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧmidＡ4ＧshortＡ5Ｇlong．．．
【００９７】
実施例３ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメ
ントの二次構造および三次構造の推定
溶液中のスピドロインポリペプチドは、典型的には、ヘアピン構造の形成により折り畳まれることから、成熟型の繊維においては逆平行βシート構造を前もって示すことが予想された。実施例１〜２のユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメント（配列番号３）において可能性のあるフォールディングパターンを理解するため、ヘアピンまたはターン構造の形成に適合するタンパク質領域を同定した。アラニンリッチセグメントは、ヘリックス構造を形成することが予想されることから、ターン形成の候補としての可能性は低く、それよりも、これらのセグメントは、繊維内でβシートを構成するのに一般的に保持されることの方が重要であった。
最近発表されたターン予測アルゴリズム（Ｆｕｃｈｓ，ＰＦ ＆ Ａｌｉｘ，ＡＪ，Ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｔｕｒｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｙｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５９，８２８−８３９（２００５））を用いたところ、最短型グリシンリッチセグメントは、タイプＩＩ βターンの形成の可能性が高いことを示し、二つのより長いグリシンリッチセグメントは、コイル構造を形成することが予測された。より長いＧｌｙリッチセグメントにおいてＧＧＸトリプレットする含量が高いことは、これらが３1−ヘリックス構造を形成できることを示唆していた。
スピドロインアミノ酸配列の反復的性質は、フォールディングパターンの同等に反復的な性質を示唆する。まとめると、これらの観察により、図２Ａに示されるようなユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントのフォールディングを得た。正に荷電した残基が、ほぼ必ずこの提唱したターン構造に存在することに注目されたい。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントのフォールディングパターンから、アラニンリッチセグメント／（より長い）グリシンリッチコイルセグメント／アラニンリッチセグメント／（より短い）グリシンリッチターンセグメント／アラニンリッチセグメント／（より長い）グリシンリッチコイルセグメント／アラニンリッチセグメントを見出すことができた（図２Ａに概略的に示されている）。
【００９８】
実施例４ ＭａＳｐ１タンパク質の非反復Ｃ末端フラグメントの配列分析
実施例１において得られたユープロステノプス オーストラリス由来のＭａＳｐ１タンパク質のＣ末端非反復フラグメント（配列番号４）の一次構造を、多くの公知の、特にユープロステノプス エスピー（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））、Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ Ｐ１９８３７−５（Ｘｕ，Ｍ ＆ Ｌｅｗｉｓ，ＲＶ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｆｉｂｅｒ：ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，７１２０−７１２４（１９９０））、およびその他由来のＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２タンパク質のＣ末端フラグメントとアラインメントを行なった。
図３に示される、反復フラグメントの最後のＳｅｒから始めたアラインメントから、ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域がよく保存されていることが明らかとなった。ユープロステノプス エスピーおよびアメリカジョロウグモは、９５％同一の残基を有し、ユープロステノプス オーストラリスおよびアメリカジョロウグモは、５４％同一の残基を有し；そしてユープロステノプス オーストラリスおよびユープロステノプス エスピーは、５５％同一の残基を有していた。ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列を配列番号８として表す。図３において、以下のＭａＳｐタンパク質のアラインメントを行った。これを、適用可能な場合はＧｅｎＢａｎｋアクセッションエントリーと共に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
実施例５ ＭａＳｐ１遺伝子の構築
ユープロステノプス オーストラリス由来タンパク質５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）をコードするＤＮＡ配列を、テンプレートとして実施例１のｃＤＮＡライブラリ由来のＭａＳｐ１クローンを用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ２キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるＰＣＲにより増幅した。設計したプライマーを使用して、制限酵素認識部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを、それぞれ５’末端および３’末端に導入し、停止コドンをＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に導入した。次いでＢａｍＨＩ−５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat−ＨｉｎｄＩＩＩ構築物を、以下の実施例６（Ｃ）に記載されるようにして調製した修飾型ｐＥＴ３２ベクター（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。
【０１０１】
実施例６ キメラＭａＳｐ１遺伝子の構築
（Ａ）ＲＥＰ遺伝子フラグメント
３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａで表される部分反復フラグメント（ＲＥＰ）をコードするＤＮＡ配列を、テンプレートとしてユープロステノプス エスピー ＭａＳｐ１タンパク質の反復領域をコードする部分ｃＤＮＡクローン（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＣＱ９７４３５８またはＣＱ８１６６５６）を用いて、ベタインの存在下で（Ｈｅｎｋｅ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｂｅｔａｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＣ−ｒｉｃｈ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５，３９５７−３９５８（１９９７））、ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ；Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によるＰＣＲにより増幅した。制限酵素認識部位を５’末端および３’末端に導入し、以下の構築物を得た：ＣＴフラグメント（下記参照）とつなぐ予定のＮｃｏＩ−３Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ−４Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＮｈｅＩ；および個別に発現させる予定の、停止コドンをＸｈｏＩ部位の上流に直接導入したＮｃｏＩ−４Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＸｈｏＩクローン。
【０１０２】
（Ｂ）ＣＴ遺伝子フラグメント
ユープロステノプス エスピー由来の（しかしアメリカジョロウグモおよびセネガルジョロウグモ由来のＭａＳｐ１との類似性が高い）非反復Ｃ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列を、Ｃ末端ＭａＳｐ１ドメインをコードするゲノムＤＮＡクローンを用いてＰＣＲにより増幅した（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））。制限酵素認識部位を５’末端および３’末端に導入し、３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａ部分ＲＥＰクローン（上記参照）とつなぐ予定のＮｈｅＩ−２Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb−ＸｈｏＩおよび個別に発現させる予定のＮｃｏＩ−２Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb−ＸｈｏＩを得た。
【０１０３】
（Ｃ）ＲＥＰ−ＣＴハイブリッドＭａＳｐ１遺伝子の構築
３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａ ＲＥＰクローンを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＴクローンとつないだ。次いで、得られた、融合型５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybおよび６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybクローンをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切り出し、元々あったトロンビン切断部位を除去しエンテロキナーゼ切断部位の下流に新規なトロンビン部位を導入した修飾型ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。
【０１０４】
実施例７ ＭａＳｐ１融合タンパク質の発現
実施例５〜６において構築した遺伝子によりコードされるＭａＳｐ１タンパク質を、以下のように、Ｔ７プロモーターの制御下で、チオレドキシン／Ｈｉｓ6／Ｓタグ／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子をコードする修飾型ｐＥＴ３２ベクター：チオレドキシンタグ／Ｈｉｓタグ／Ｓタグ／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１遺伝子を用いて、（Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴタイプの）融合タンパク質として発現させた。
種々のＭａＳｐ１構築物を含むｐＥＴ３２発現ベクターで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質転換した。細胞を、アンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中、３０℃で、ＯＤ600が１.０〜１.５になるまで培養し、ＩＰＴＧで誘導し、さらに室温で４時間インキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、２０ｍＭイミダゾール、および０.５Ｍ ＮａＣｌ中でＤＮＡｓｅＩおよびリゾチームによって溶解させ、さらにＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）のＨｉｓタグアフィニティクロマトグラフィによって精製した。結合した融合タンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８.０、および０.５Ｍ ＮａＣｌでＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０に対して透析した。得られた融合タンパク質は、クマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる判定で＞９０％の純度であり、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０中で可溶性であった。このプロセスにより、およそ４０ｍｇ／ｌ培養物の融合タンパク質を得、これは数週間の間有意な沈降をみせずに安定であった。
別の実験において、融合タンパク質を、Ｈｉｓ6／チオレドキシン／Ｈｉｓ6／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１タンパク質として、Ｔ７プロモーターの制御下に対応する遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドから発現させた。
【０１０５】
実施例８ ＭａＳｐ１タンパク質からの繊維の形成
実施例７から得た融合タンパク質からのタグの切断は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中、室温で非常に穏やかに揺動させながら、１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質比で行った。トロンビン切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定して３０〜６０分以内に完了させた。生じたＭａＳｐ１タンパク質（図２Ｂ、配列番号９〜１３）は、自発的に、様々な程度の巨視的な繊維へと重合した。表１を参照のこと。これらの繊維は、最初に、水／空気の界面で形成させた。その形成は、インキュベーション約１時間で肉眼で観察できるようになり（図４Ａ、４Ｂを参照のこと）、約５時間以降はさらなる繊維の成長が生じなくなった。６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb繊維は最大約２ｃｍ長、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は≧１０ｃｍ長であった。実験を繰り返すことにより、≧２０ｃｍの５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維（図４Ｃを参照のこと）を、さらには≧２ｍ長に至るものすら獲得した。繊維形成は、インキュベーション約１０分で肉眼で観察することができるようになった。
繊維を単離し、緩衝液で洗浄し、その後にＮ末端アミノ酸配列分析に供したところ、ＭａＳｐ１タンパク質の配列のみが示された。これにより、切断されたタグがこの繊維上に存在しないことが示された。
【０１０６】
実施例９ ＭａＳｐ１タンパク質繊維の分析
Ａ．引張強度の測定
実施例８の６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）および５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）繊維の引張強度を以下の通りに決定した。引張強度測定用のより短い型（１〜２ｃｍ）の６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb繊維を扱うために、それらを１５％グリセロール水溶液中で軽くインキュベートした後、風乾させた。より長い型（１０ｃｍ）の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は未処理のままか、１５％グリセロール中で軽くイン
キュベートするか、または７５％メタノール中で手で引っ張った（ｄｒａｗｎ ｂｙ ｈａｎｄ）後、風乾させた。風乾させた繊維の引張強度は、Ｚｗｉｃｋ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｓｔｅｒにおいてこれらの繊維を１０ｍｍ／分の速度で引っ張ることによって測定した。表１を参照のこと。
６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）製のグリセロール処理・風乾した１〜２ｃｍ長の繊維の引張強度は約２ＭＰａであり、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の１０ｃｍ繊維の強度は４〜５ＭＰａであった。脱水溶媒であるメタノール中で引っ張った後に風乾させた１０ｃｍ長の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は、同じタイプのグリセロール処理繊維よりも若干小さい２〜３ＭＰａの引張強度を示した。ここでの最高の引張強度は、さらなる処理を施さずに風乾させた１０ｃｍ長の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維において見られた１０ＭＰａであった。
引張強度の範囲（２〜１０ＭＰａ）は、再生されたクモ糸繊維（２〜２３０ＭＰａ）について報告されている下限値に匹敵するものであった。最長の、自発的に形成される繊維は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat構築物から得られ、このような風乾した繊維もまた、最高の引張強度を示した。これは、１２〜１５残基というポリＡｌａセグメントが６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybにおける８〜１４残基のＡｌａセグメントに対して長く、それによって前者のタンパク質において結晶βシートコンホメーションの比率が高くなったことに起因する可能性がある。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
Ｂ．走査電子顕微鏡
６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybおよび５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維の微視的構造を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて分析した（図５）。簡単に説明すると、サンプルをＳＥＭスタブ上に適用し、金およびパラジウムの６ｎｍ層で真空コーティングした。検体を、ＬＥＯ １５５０ ＦＥＧ ＳＥＭにおいて１０ｋＶの加速電圧を用いて観察および撮影した。
これにより、単一の繊維の直径が１０〜３０μｍであること、および個々の繊維がかなり均一な直径を示すことが明らかになった（図５ａは６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb、配列番号１３を示す）。巨視的な繊維に加えて、ゲル様の粒子も見られた。このような６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybの粒子をＳＥＭスタブ上で直接的に風乾させた後、およそ１０〜１５μｍ径の繊維が見られた（図５ｂ、ｃ）。７５％メタノール中で引っ張り、風乾させた５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の巨視的な繊維の直径は６０〜１２０μｍであり、それらは、整列した繊維を数本含んでいるようであった（図５ｄ〜ｆ）。風乾前に撚った繊維（図５ｅ）、繊維の端部（図５ｆ）。
【０１０９】
Ｃ．円偏光二色性分光法
実施例８において調製された、６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）または５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）からなる繊維を、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７で洗浄し、２％ＳＤＳを含む同一緩衝液に懸濁した。２５０〜１９０ｎｍの円偏光二色性スペクトルを、２２℃で、０.１ｃｍ光路長の石英キュベットにおいて、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計を用いて記録した。スキャン速度は５０ｎｍ／分であり、応答時間は２秒であり、取得インターバルは０.１ｎｍであり、帯域幅は１ｎｍであった。
図６に示されるスペクトルは、６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）の繊維の三回のスキャンの累積である。これは、逆平行βシート構造に特有の特徴である２２０ｎｍにおける最小値および１９５ｎｍにおける最大値を示している。５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnatの繊維についても非常に似通ったスペクトルが得られた（データは示さず）。つまり、自発的に形成された繊維は、ネイティブのおよび再生されたクモ糸繊維と類似の形態および構造を示した。
【０１１０】
実施例１０ 組換えクモ糸の生体適合性
クモ糸繊維を生物医学的用途で使用するのが望ましいので、この繊維の生体適合性を、組換え生成されたクモ糸の効果を二つの異なる細胞型を用いて調査することによって評価した。
ＭａＳｐ１タンパク質５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）を、実施例７〜８に記載されるようにして細菌中で発現させた。精製されたタンパク質を使用して、長さ＞１０ｃｍ、さらには長さ＞２０〜２００ｃｍで、直径約１００μｍの人工クモ糸繊維を製造した。
【０１１１】
Ａ．胚性マウスマスト細胞
胚性（１２.５日）マウスマスト細胞（ＩＬ−８およびマスト幹細胞因子を用いて８週間インビトロ培養した）を、２つの異なる細胞密度、高い方の密度は低い方の密度の約４倍、で播種した。これらの細胞はプラスチック表面に付着しないが、懸濁物中で培養した。各々約０.５ｃｍ長のクモ糸繊維片をウェルに加えた。マスト細胞を、クモ糸繊維の存在下または非存在下で３日間インキュベートし、その後、生存細胞および死滅細胞をトリパンブルー染色後に計数した（図７）。バーは標準誤差平均を伴うｎ＝２の平均値を示し、各サンプルを三連で計数した。
マスト細胞は、クモ糸繊維の存在による影響を受けなかった。三日間の培養後、クモ糸繊維の非存在下で培養したネガティブコントロールと比較して、細胞の死滅または増殖に関して有意な差が見られなかった。
【０１１２】
Ｂ．ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞
約０.５ｃｍ長のクモ糸繊維片を、少量の緩衝液から乾燥させることによって、６ウェルマイクロタイタープレートの底部に吸着させた。この繊維は、細胞培養培地を加えても剥がれなかった。次いで、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、種々の細胞密度でプレーティングし、計６日間培養した。ＨＥＫ−２９３細胞は、プラスチックセルの表面に付着し、付着状態で成長した。この繊維付近で成長したＨＥＫ−２９３細胞の能力およびこの繊維に対する細胞の物理的付着を検討した。
ＨＥＫ−２９３細胞は、クモ糸繊維を含むウェルにおいて通常通り付着および増殖した（光学顕微鏡下での観察）。この細胞は繊維の縁に非常に近いところで成長し、かつ部分的に剥がれた繊維の下でさえも成長したようであった（図８）。７日後、繊維をプラスチック表面から注意深く剥がしたところ、細胞群がこの繊維に物理的に付着していることがはっきりと見てとれた。この繊維は、図の右上半分を覆っている。ＨＥＫ２９３細胞は、繊維の縁に付着していることが確認され、かつ繊維の下でさえも成長していた。
検討した二つの異なる細胞型（マスト細胞、ＨＥＫ−２９３）は、組換えクモ糸の存在による影響を、比較的多量のクモ糸の存在下であっても受けなかった。このことは、試験した人工クモ糸繊維が、非毒性であり生体適合性である点で、ユープロステノプス オーストラリスの野生型しおり糸と類似することを示している。従って人工クモ糸繊維は生物医学的用途に適しているようである。
【０１１３】
実施例１１ ＭａＳｐ１タンパク質繊維の機械的特性および構造
５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の繊維の機械的特性を、行った引張試験を用いて試験し、応力−ひずみ曲線を作製した（図９）。引張り特性は、Ｚｗｉｃｋ Ｒｏｅｌｌ Ｚ２．５物性試験装置（Ｚｗｉｃｋ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて特徴付けた。試験は、１０ｍｍ／分の負荷速度を用いて、周囲条件の大気（２０℃および５２％相対湿度）の下で行った。繊維片を緩衝液から直接移し、マウントし、二回の延伸−弛緩サイクルに供した。引張試験に適した均一なクモ糸を作製するため、延伸−弛緩サイクルを用いて繊維を引き延ばした。まず、最大０.１Ｎの力で引っ張ることによって繊維を引き延ばした。弛緩させた後、これらに０.２５Ｎの力がかかるまでさらに引っ張った。
この処理により、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ ＩＤＣ−１１２Ｂ機器（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いる高さ測定で決定して、直径およそ８０μｍの引き延ばされた均一な繊維を得、これを以下の通りに走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認した。延伸−弛緩サイクルの前後に、繊維片をＳＥＭスタブ上に適用し、一晩風乾させた。このサンプルを、金およびパラジウムの６ｎｍ層で真空コーティングした。検体を、ＬＥＯ １５５０ ＦＥＧ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において１０ｋＶの加速電圧を用いて観察および撮影した。
引き延ばした繊維を切断して小片とし、その端部を接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ ４２０，Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）で段ボール紙の間に固定した。次いで、繊維サンプルを物性試験装置のグリップに固定し、破れるまで伸ばした。事前に引き延ばしておいた繊維の初期断面積を用い、円形の断面と仮定して応力−ひずみ曲線を作製した。応力値をこの繊維の初期断面積に対して標準化した。ひずみは、ｄＬ／Ｌ0（Ｌ0はこの繊維の初期の長さでありｄＬは繊維の長さの変化率である）に対応する。図９では、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の二倍に引き延ばした繊維（ｄｏｕｂｌｅ ｄｒａｗｎ ｆｉｂｅｒｓ）の三つの異なるサンプルについての応力−ひずみ曲線が示されており、これらの引張強度はおよそ０.２ＧＰａであることが測定された。
この繊維の微視的構造をＳＥＭにより分析した（図１０）。自発的に形成された繊維は、均一で平らな外観および数百マイクロメートルまでの幅を有し、高さは数十マイクロメートルと測定された（図１０ａ、ｂ）。
繊維を延伸−弛緩サイクルに供した後のそれらの断面は、フィブリルが緊密に整列したコンパクトなサブ構造を有するより丸みを帯びた形状を有していた（図１０ｃ〜ｆ）。切断面または破損面の外見（図１０ｅ、ｆ）は、生産された繊維の緊密さをさらに証明するものであった。
結論として、自発的に形成された繊維は、紡糸せずとも、ネイティブのまたは再生されたクモ糸繊維と類似の形態および機械的特性を示す。
【０１１４】
実施例１２ Ｓｐｉｄｒｏｉｎタンパク質バリアント
クモ糸の優れた引張強度には、強力な分子間相互作用が寄与しているものと考えた。従って、繊維内での分子間共有結合性架橋を可能とするミニチュアスピドロインのバリアントを作製した。二つの異なる変異型スピドロインタンパク質を、部位特異的変異誘発によりそれぞれ第一（配列番号１４、３６位および３７番目）ならびに第四（配列番号１５、１２８位および１２９番目）アラニンブロックに二つのシステイン残基を導入することによって構築した。これらのバリアントを発現させ、実施例５〜６において構築された遺伝子について実施例７〜８に記載されているのと同じプロトコルを用いて単離した。これらのバリアント（配列番号１４〜１５）は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）と同じ様式で繊維を形成した。
Ｃ末端ドメインの二量体化の重要性を解明するため、Ｃ末端ドメインのシステイン残基をセリン残基に交換したバリアントを構築した（配列番号１６、２２２番目）。しかし、このバリアント（配列番号１６）は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）と同じ様式で繊維を形成した。
【０１１５】
実施例１３ 発現されたスピドロインタンパク質からのＬＰＳおよび他の発熱物質の除去
所望のスピドロイン融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を以下の緩衝液：
Ａ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｂ：５ｍＭ ＣａＣｌ2、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｃ：１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｄ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、および
Ｅ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８
で洗浄した。
その後、細胞を、リゾチームおよびＤＮａｓｅＩを補充した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に溶解させた。次いで、このタンパク質サンプルをＮｉ−セファロースマトリクス上にロードし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０〜１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００〜３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で溶出した。関係のあるフラクションをプールし、これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に対して一晩透析した。次いで、このタンパク質サンプルに１００μＭ ＣａＣｌ2を補充し、最後に予め２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１００μＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８で平衡化させておいたＥｎｄｏＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラムを通した。このようにして、ＩＰＴおよびＬＡＬ動態アッセイで判定して発熱物質含量が１ＥＵ／ｍｇタンパク質のタンパク質サンプルを獲得することができた。
次いで、トロンビンを１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質比で用いて、この融合タンパク質をタンパク質分解により切断し、（上記のように）繊維の形成を誘導した。この繊維を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で三回、最後に水で三回洗浄した。これにより、発熱物質含量が０.２５ＥＵ／ｍｇ繊維の繊維を得た。
【０１１６】
この繊維の構造上の特徴は、１２５℃および１.５バールで１０分間のオートクレーブ処理によって影響を受けず、この素材を効果的に滅菌することができた。この繊維は化学的に安定であり、８Ｍ尿素、６Ｍ ＧｕａＨＣｌ、または純粋なＨＡｃのいずれによっても溶解させることができなかった。しかし、この繊維は、純粋なＨＦＩＰまたはギ酸によって溶解させることができた。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復部分、すなわち配列番号３内のセグメントのアラインメントである。
【図２】Ａは、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復部分（配列番号３）の概略的な、予測される構造的構成を表す。Ｂは、実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質（配列番号９〜１３）の概略的な、予測される構造的構成を表す。
【図３】ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域のアラインメントであり、それらの保存的性質を表している。
【図４】実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質から形成された繊維の巨視的な外観を表す。（Ａ）６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）繊維、バーは０.５ｃｍ；（Ｂ）５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）タンパク質繊維、バーは１ｃｍ；（Ｃ）５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）タンパク質繊維、バーは１ｃｍ。
【図５】実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質から形成された繊維の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）製の一本の繊維（ａ）およびゲル相（ｂ、ｃ）。５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の繊維を７５％メタノール中で引っ張り、風乾させ、ＳＥＭスタブに適用した（ｄ、ｅ、ｆ）。風乾前のねじれた繊維（ｅ）、繊維の端部（ｆ）。
【図６】６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）繊維の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
【図７】マウスマスト細胞の毒性試験の結果を表し、インビトロ生産されたクモ糸繊維の存在下または非存在下での三日間の培養後の生存細胞および死滅細胞の数を示している。
【図８】生体適合性研究においてインビトロ生産されたクモ糸繊維にさらした後のＨＥＫ２９３細胞の図である。
【図９】５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の二倍に引き延ばされた繊維の引張強度を示す応力−ひずみ曲線である。
【図１０】５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の組換え繊維のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。ａ、ｂ、自発的に形成された繊維。拡大画像（ｂ）は、フィブリルの細部構造を示す。突出した小さなフィブリル（矢印）は、約３００ｎｍの幅を有する。ｃ〜ｆ、二回の延伸−弛緩サイクル後の繊維。ｃおよびｄは同じ繊維を異なる倍率で示している。ｅは切断繊維面を示し、ｆは引張試験後の破損箇所を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の組換え生産の分野に関係する。とりわけ、本発明は、クモ糸タンパク質（ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の組換え生産に関係している。本発明は、新規な単離された大瓶状腺（ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ）スピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎ）タンパク質、および大瓶状腺スピドロイン融合タンパク質、ならびにこのようなタンパク質の製造方法およびその製造のためのポリ核酸分子を提供する。大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーおよびこのようなポリマーの製造方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸は、強度と弾性の組み合わせにより桁外れの強靱性を獲得する天然の高性能ポリマーである。クモには最大７つの特化した腺が存在し、これらは異なる機械的特性および機能を有する様々なタイプの糸繊維を産生する。大瓶状腺により産生されるしおり糸（ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ）は最も強靭な繊維であり、同重量では、人為的に製造された素材、例えば高張力鋼およびケブラー（Ｋｅｖｌａｒ）より優れている。しおり糸の特性は、医療または技術目的の新素材の開発において注目されている。
【０００３】
しおり糸は、２つの主要なポリペプチドからなり、これらはほとんどの場合大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１および２と称されるがニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）においてはＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４と称される。これらのタンパク質は、サンプルの経年数および分析条件に依存して２００〜７２０ｋＤａの範囲の見かけ上の分子量を有するが、クモしおり糸の全長遺伝子は未だ報告されていない。しおり糸ポリペプチドの特性については、Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，２０７０−２０７４（２００４）において議論されている。公知のしおり糸であるスピドロインは、その繊維内で結晶βシートを形成するアラニンリッチセグメントと、より柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いているグリシンリッチセグメントが交互に並ぶ、高度に反復的なブロックから構成される。そのＣ末端領域は非反復的であり、種の間で高度に保存されており、αヘリックスの立体配座をとる。しおり糸タンパク質のＮ末端領域は、つい最近特徴付けられたばかりであり、種々のスピドロインの間で、かつ種々のクモ種の間でさえも高度に保存されているＮ末端ドメインであることが明らかにされた（Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｏｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ｄｒａｇｌｉｎｅ，ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ，ａｎｄ ｃｙｌｉｎｄｒｉｆｏｒｍ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ７，３１２０−３１２４（２００６））。
【０００４】
しおり糸の機械的特性は種間で異なり；ユープロステノプス エスピー（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．）のしおり糸は、例えばニワオニグモまたはアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）のしおり糸を上回る堅さ、強度（破るのにより強い力が必要となる）を有し、かつ伸縮性が小さい。ユープロステノプス エスピー由来のしおり糸は、ニワオニグモ由来のしおり糸よりも結晶βシート構造の割合が高いようであり、その原因はユープロステノプス エスピーのＭａＳｐが今日までに分析されている全ての種の中で最高のポリアラニン含有量を有することによる可能性が高い（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，Ｎ．Ｎ．＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））。
【０００５】
人工的なクモ糸を生産する試みは、全長遺伝子が未だに報告されていないがために、しおり糸タンパク質をコードする天然または合成遺伝子のフラグメントを利用している。組換えしおり糸タンパク質は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞、トランスジェニック蚕、およびトランスジェニックヤギを含む様々な系において発現されている。例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．７，４００−４０６（１９９６）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｉｒｗｉｎ，Ｓ．Ｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，２３−３２（１９９７）；Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，３１−３８（１９９８）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｂｅｄｚｙｋ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７，３３−３９（１９９７）；およびＬａｚａｒｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｅｒｓ ｓｐｕｎ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，４７２−４７６（２００２）を参照のこと。
【０００６】
ＷＯ ２００４／０１６６５１（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｙｏｒｋ）には、ユープロステノプス エスピー由来のＭａＳｐ１タンパク質の内部の反復部分をコードする核酸配列が記載されている。タンパク質は発現されていない。
【０００７】
Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）には、全てオニグモ科（Ａｒａｎｅｕｓ）由来のＡＤＦ３から獲得した、反復的なＡｌａリッチおよびＧｌｙ／Ｇｌｎリッチフラグメントならびに非反復フラグメントをコードする合成遺伝子「（ＡＱ）12ＮＲ３」が記載されている。この遺伝子は、凝集するがポリマーまたは繊維を形成しない可溶性タンパク質（５９.８ｋＤ、＞５２８ａａ）を発現させる。このタンパク質のアラニン含有量は１０〜１５％である。
【０００８】
ＷＯ ０３／０５７７２７には、哺乳動物細胞株および動物における可溶性組換えクモ糸ポリペプチドの発現が記載されている。一つの発現されたクモ糸ポリペプチド（ＡＤＦ−３；６０ｋＤ、６５２ａａ）は、反復単位および非反復的親水性ドメインからなる。別の発現されたクモ糸ポリペプチド（ＡＤＦ−３ Ｈｉｓ；６３ｋＤ、６７７ａａ）は、反復単位、非反復的親水性ドメイン、ｃ−ｍｙｃエピトープ、および６ヒスチジンタグからなる。反復単位のＡｌａ含量は低い（１０〜２０％）。得られたクモ糸ポリペプチドは、水性媒体に対する溶解性が乏しく、および／または沈殿物を形成する。得られたクモ糸ポリペプチドは自発的に重合しないので、ポリマーまたは繊維を得るために紡糸（ｓｐｉｎｎｉｎｇ）が必要となる。
【０００９】
いくつかの要因がしおり糸タンパク質の発現を困難にしている。その遺伝子の高度に反復的な性質、およびそれに付随するそのタンパク質の限局的なアミノ酸組成に起因して、転写および翻訳の誤りが生じる。その後の不連続的な翻訳で微生物発現系においてｔＲＮＡプールを使い果たすことによりタンパク質合成が完遂せずに終了することが別の理由であり得る。タンパク質合成の打ち切りについて議論されている他の理由は、ｍＲＮＡの二次構造の形成および遺伝子の組換えである。２.５ｋｂより大きいネイティブＭａＳｐ遺伝子は、細菌宿主において不安定であることが示されている。さらに、天然型のしおり糸フラグメントおよび設計されたブロックコポリマーは両方とも、特にＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４由来タンパク質は、容易に自己会合して無定形の凝集物を形成し、これが沈降およびタンパク質の減少を引き起こすため、組換えしおり糸タンパク質を可溶化形態で維持する困難性もある。Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３６０４−１３６１２（２００４）およびＬａｚａｒｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｅｒｓ ｓｐｕｎ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，４７２−４７６（２００２）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、クモ糸繊維を提供できる新規なクモ糸タンパク質を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、必要に応じて繊維に自己重合させることが容易に操作できる水溶性のクモ糸タンパク質を提供することである。これは、特有の用途、例えばその繊維上での真核細胞の培養を可能にする。さらに、この特性により、以下の工程の全てを生理学的条件下で行うことができ、これにより毒性およびタンパク質変性の危険が少なくなる。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、新規なクモ糸タンパク質の繊維を提供することである。
【００１３】
本発明の一つの目的は、必要に応じて繊維に自己重合させることが容易に操作できるクモ糸タンパク質をラージスケールで提供することである。
【００１４】
本発明の目的はまた、クモ糸タンパク質およびクモ糸タンパク質の繊維の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これらおよび以下の開示から明らかとなる他の目的のために、本発明は、一つの側面に従い、１５０〜４２０アミノ酸残基からなり、式ＲＥＰ−ＣＴ［式中、ＲＥＰは、８０〜３００アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、ここで該フラグメントはＬ（ＡＧ）nＬ、Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、Ｌ（ＧＡ）nＬ、Ｌ（ＧＡ）nＧＬ（式中、ｎは４〜８の整数であり；各個々のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０〜３個がＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；各個々のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；かつ各個々のＬセグメントは、０〜２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である）の群から選択され；そしてＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、このフラグメントは大瓶状腺スピドロインタンパク質由来のＣ末端フラグメントである］により規定される、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質、またはその誘導体を提供する。
【００１６】
本発明は、クモ糸様繊維を形成するのに十分なタンパク質モチーフの同定、および適する宿主、例えば細菌、好ましくは大腸菌において生産させることができる組換えＭａＳｐタンパク質を構築するための上記モチーフの使用に基づくものである。
【００１７】
本発明に従う特定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列である。
【００１８】
本発明に従ういくつかの実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様においては、各個々のＧセグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００１９】
本発明に従う特定の実施態様において、ＣＴフラグメントは、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、または配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、および配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、ならびに図３の任意のアミノ酸配列、特に図３のＭａＳｐ１配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。特定の実施態様においては、ＣＴフラグメントは、このアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列である。
【００２０】
本発明に従う特定の実施態様において、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）および他の発熱物質の含量は、１内毒素単位（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｕｎｉｔ）（ＥＵ）／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。
【００２１】
別の側面によれば、本発明は、大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、および第二タンパク質フラグメントからなり、ここで該第二タンパク質フラグメントが融合パートナーおよび切断剤認識部位を含み、ここで上記第一タンパク質フラグメントが切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される、単離された融合タンパク質を提供する。
【００２２】
本発明は、Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘ［式中、ＲＥＰおよびＣＴは本発明に従うタンパク質フラグメントであり；かつＸは融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントであり；ここでタンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは切断剤認識部位を通じて融合パートナーに結合される］の群から選択される、単離された融合タンパク質を提供する。
【００２３】
本発明に従う特定の実施態様において、単離された融合タンパク質におけるＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。
【００２４】
さらに別の側面によれば、本発明は、（ｉ）本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；および場合により（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、（ｉ）本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させること；および場合により（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。好ましい方法において、前記工程（ｉｉｉ）はさらに、前記液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、ここで前記重合は上記界面または上記界面付近の領域で開始される。好ましい方法において、前記液体媒体は水性媒体であり、別の相は空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される。
【００２６】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。
【００２７】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明の別の側面は、（ｉ）本発明の可溶性融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適した宿主において発現させること；および（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること、の工程を含む、本発明の可溶性融合タンパク質の生産方法にある。場合により、可溶性融合タンパク質を単離する前記工程（ｉｉ）はＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００２９】
本発明はまた、（ｉ）本発明の可溶性融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適する宿主において発現させること；（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；および場合により（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、からなる、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。さらに、場合により、可溶性融合タンパク質を単離する前記工程（ｉｉ）および大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する場合による工程（ｖ）は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００３０】
本発明はさらに、（ｉ）本発明の可溶型融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を適する宿主において発現させること；（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離すること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給すること、（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得ること；（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させること；および場合により（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離すること、の工程を含む、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。好ましい方法において、前記工程（ｖ）はさらに、液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、前記重合は上記界面または上記界面付近の領域で開始される。好ましい方法において、前記液体媒体は水性媒体であり、別の相は空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される。
【００３１】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。本発明はまた、本発明に従う方法により得ることができる、大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。好ましい実施態様において、前記ポリマーは繊維である。他の好ましい実施態様において、前記ポリマーは、泡、ゲル、メッシュ、またはフィルムからなる群より選択される構造を形成する。
【００３２】
さらに別の側面によれば、本発明は、融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの、上記切断剤認識部位を介してクモ糸タンパク質フラグメントに結合された上記タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質を生産するための新規な使用を提供する。好ましい実施態様において、前記クモ糸タンパク質フラグメントは、１５０〜４２０アミノ酸残基からなる。
【００３３】
最後の側面によれば、本発明は、配列番号１、および配列番号２〜１６をコードする核酸配列、またはその相補的核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子を提供する。本発明はまた、クモ糸タンパク質をコードする非天然型遺伝子を生産するための、単離されたポリ核酸分子の使用を提供する。
【００３４】
発明の詳細な開示
本発明は概して、クモ糸繊維の組換え生産に十分なスピドロインタンパク質モチーフの同定に基づくものである。このモチーフは、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）からの部分大瓶状腺スピドロイン１（ＭａＳｐ１）ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定からの推定アミノ酸配列に基づく。単離されたＭａＳｐ１ ｃＤＮＡは、新規なスピドロイン遺伝子、例えば本明細書中で報告されている遺伝子の構築の出発点として有用である。この新規スピドロイン ｃＤＮＡから得られるタンパク質から形成されるポリマーは、それらの物理的特性、特に高強度、弾性、および軽量という有用な組み合わせから有用である。それらはまた、細胞の付着および成長を支持する能力からも有用である。このしおり糸の特性は、医療目的または技術目的の新素材を開発する上で魅力的である。特に、本発明のクモ糸は、医療用デバイス、例えばインプラントおよび医療製品、例えば創縫合システム、バンドエンド、縫合糸、創傷包帯、ならびに組織工学および誘導細胞再生（ｇｕｉｄｅｄ ｃｅｌｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のスカフォールドにおいて有用である。本発明のクモ糸はまた、パラシュート、防弾チョッキ、シートベルト等の織物または編物として使用する上でも特に有用である。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、用語「繊維」は、少なくとも１μｍの厚みを有するポリマー、好ましくは肉眼で視認できる、すなわち少なくとも１μｍの厚みを有し、かつその厚みに対して長さでかなりの伸び、好ましくは５ｍｍ以上を有する巨視的なポリマーに関する。用語「繊維」は、構造化されていない凝集物または沈殿物を含まない。
【００３６】
用語「大瓶状腺スピドロインタンパク質」、「スピドロインタンパク質」は、本明細書を通じて互換的に使用され、全ての公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質、ニワオニグモの場合は典型的には「ＭａＳｐ」または「ＡＤＦ」と省略される、を包含する。これらの大瓶状腺スピドロインタンパク質は、一般的に二つのタイプ、１型および２型のものである。これらの用語はさらに、添付の特許請求の範囲において規定されるような本発明の新規タンパク質、ならびに公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質に対して高度の同一性および／または類似性を有する他の非天然型タンパク質を包含する。
【００３７】
本発明者らは、この同定したスピドロインタンパク質モチーフを、非天然型のスピドロインタンパク質をコードする新規な遺伝子構築物を構築するのに利用した。１５０〜４２０アミノ酸残基、換言すれば１５０以上、好ましくは２２０以上、好ましくは２５０以上で、かつ４２０以下、好ましくは３８０アミノ酸残基以下、好ましくは３２０アミノ酸残基以下、好ましくは２８０アミノ酸残基以下の、例えば２２０〜３６０のアミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質を、例えば細菌または他の適する生産生物において組換え生産させることができることを発見した。得られるスピドロインタンパク質は、本発明に従う巨視的なクモ糸繊維を自発的に形成する。これは驚くべき結果である。なぜならば、天然のスピドロインタンパク質および以前から知られている組換え生産された繊維形成性のスピドロインタンパク質は、本発明に従うタンパク質よりもずっと長いからである。さらに、天然のスピドロインタンパク質および以前から知られている組換え生産された繊維形成性のスピドロインタンパク質は、多量の内部リピートを含む傾向があり、重合のために紡糸および／または過酷な溶媒を使用する必要がある。
【００３８】
スピドロインタンパク質がインビトロで自発的に繊維を形成できることを示したのは本発明が初めてである。本明細書中に示されるデータもまた、繊維形成を誘導するのにスピドロイン配列の一部のみが存在する必要があることを示している。さらに、ユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ）の反復ドメインおよびジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ）の非反復Ｃ末端ドメイン（実施例６Ｃを参照のこと）を含む種間ハイブリッドも繊維を形成し、このことは、このモチーフの線維形成能が強力であることを示している。
【００３９】
その全般的な側面において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、式ＲＥＰ−ＣＴにより規定される。ＲＥＰタンパク質フラグメントおよびＣＴタンパク質フラグメントは共有結合により、典型的にはペプチド結合を介して結合される。
【００４０】
タンパク質フラグメントＲＥＰは、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチが交互に並ぶ、反復的な特徴を有する。ＲＥＰフラグメントは、一般的に、８０以上、例えば１４０以上で、かつ３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、そして、以下でより詳細に説明するが、それ自体をいくつかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント、およびＧ（グリシンリッチ）セグメントに分けることができる。典型的には、リンカーセグメント（これは任意のものである）はＲＥＰフラグメントの末端に位置し、残りのセグメントはアラニンリッチおよびグリシンリッチが順々に並ぶものである。従って、ＲＥＰフラグメントは、一般的に、以下の構造［式中のｎは整数である］：
Ｌ（ＡＧ）nＬ、例えばＬＡ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、例えばＬＡ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5Ａ6Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）nＬ、例えばＬＧ1Ａ1Ｇ2Ａ2Ｇ3Ａ3Ｇ4Ａ4Ｇ5Ａ5Ｌ；または
Ｌ（ＧＡ）nＧＬ、例えばＬＧ1Ａ1Ｇ2Ａ2Ｇ3Ａ3Ｇ4Ａ4Ｇ5Ａ5Ｇ6Ｌ
のいずれかであり得る。当然の結果として、アラニンリッチセグメントまたはグリシンリッチセグメントのどちらがＮ末端またはＣ末端のリンカーセグメントに隣接しているかは重要なことではないということになる。ｎは４〜８、より好ましくは４〜６の整数；すなわちｎ＝４、ｎ＝５、またはｎ＝６であることが好ましい。
【００４１】
好ましい実施態様において、本発明に従うＲＥＰフラグメントのアラニン含量は、２０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上で、かつ５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３５％以下である。アラニン含量の高さは、より堅くおよび／もしくは強くならびに／またはより延びない繊維を提供すると考えられるので、これは利点である。この理由は、アラニン含量の高さは、その繊維におけるβシート構造の含量の高さに関係するためであると考えられる。従って、好ましい実施態様において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー、例えば繊維におけるβシート含量は５０％以上である、すなわちそのタンパク質の二次構造の５０％以上がβシート形態をとっている。
【００４２】
特定の実施態様において、ＲＥＰフラグメントは、プロリン残基を欠いている、すなわちＲＥＰフラグメントにはＰｒｏ残基が存在しない。
【００４３】
次に、本発明のＲＥＰフラグメントを構成するセグメントを見るに、各セグメントは独立している、すなわち、特定のＲＥＰフラグメントの任意の二つのＡセグメント、任意の二つのＧセグメント、または任意の二つのＬセグメントは同一であっても同一でなくてもよいことが強調される。従って、特定のＲＥＰフラグメント内で各タイプのセグメントが同一であるということは本発明の一般的特徴ではない。むしろ、以下の開示は、当業者に対して、どのように個々のセグメントを設計するか、そして本発明の機能的なスピドロインタンパク質の一部であるＲＥＰフラグメントにそれらをどのように集成するかのガイドラインを提供するものである。
【００４４】
本明細書中に示される実験データから、各個々のＡセグメントが８〜１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であることが結論付けられた。各個々のＡセグメントは１３〜１５アミノ酸残基を含むことが好ましい。Ａセグメントの大部分または二つ以上が１３〜１５アミノ酸残基を含み、そしてＡセグメントの少数派、例えば一つまたは二つが８〜１８アミノ酸残基、例えば８〜１２または１６〜１８アミノ酸残基を含むことも可能である。これらのアミノ酸残基の圧倒的多数がアラニン残基である。とりわけ、アミノ酸残基の０〜３個がアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。従って、各個々のＡセグメントにおける全てのアミノ酸残基が例外なく、または一つ、二つ、もしくは三つのアミノ酸残基（任意のアミノ酸であり得る）を除いてアラニン残基である。アラニンに置き換わるアミノ酸は天然アミノ酸であり、好ましくは個々にセリン、グルタミン酸、システイン、およびグリシンの群から選択されることが好ましく、より好ましくはセリンである。当然のことであるが、Ａセグメントの一つまたはそれ以上が完全アラニンセグメントであり、残りのＡセグメントが１〜３個の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン、またはグリシンを含むことも可能である。
【００４５】
好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上記のように、１０〜１５個のアラニン残基および０〜３個の非アラニン残基を含む１３〜１５アミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上記のように、１２〜１５個のアラニン残基および０〜１個の非アラニン残基を含む１３〜１５アミノ酸残基を含む。
【００４６】
各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の天然型配列のセグメントの対応する。実施例１〜２および図１〜２Ａを参照のこと。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１、配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０、配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２、ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。この群の各配列は、適切な条件下でクモ糸繊維を形成する能力を有する、本発明の発現された非天然型のスピドロインタンパク質のセグメントに対応する。実施例５〜８、１２、および図２Ｂを参照のこと。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明のＡセグメントはヘリックス構造またはベータシートを形成するものと予想される。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される用語「％同一性」は、以下の通りに算出される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて、クエリー配列と標的配列のアラインメントを行う。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列において完全一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｓ）を示すクエリー配列上の位置の割合を、％同一性として表す。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される用語「％類似性」は、疎水性の残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、およびＣｙｓが類似し；塩基性の残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓが類似し；酸性の残基ＧｌｕおよびＡｓｐが類似し；そして親水性の非荷電残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒが類似する点を除いて「％同一性」について記載した通りに算出される。残った天然アミノ酸Ｇｌｙはこの文脈では他のアミノ酸と類似しない。
【００４９】
本明細書を通じて、本発明に従う代替の実施態様は、特定された割合の同一性の代わりにそれに対応する割合の類似性を満たすものである。他の代替の実施態様は、特定の割合の同一性に加えて、各配列における好ましい同一性の割合の群から選択される、別のより高い割合の類似性を満たすものである。例えば、ある配列は、別の配列に対して７０％類似であり得；別の配列に対して７０％同一であり得：または別の配列に対して７０％同一かつ９０％類似でもあり得る。
【００５０】
本発明に従う好ましい実施態様において、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。従って、本発明に従う特定の実施態様においては、各個々のＡセグメントは、上記アミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００５１】
さらに、本明細書中に示される実験データから、各個々のＧセグメントが１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが結論付けられた。各個々のＧセグメントは１４〜２３アミノ酸残基からなることが好ましい。各Ｇセグメントのアミノ酸残基の少なくとも４０％はグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含量は４０〜６０％の範囲である。
【００５２】
各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の天然型配列のセグメントに対応する。実施例１〜２および図１〜２Ａを参照のこと。あるいは、各個々のＧセグメントは、配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２、ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。この群の各配列は、適切な条件下でクモ糸繊維を形成する能力を有する、本発明に従う発現された非天然型のスピドロインタンパク質の一セグメントに対応する。実施例５〜８、１２、および図２Ｂを参照のこと。
【００５３】
本発明に従う好ましい実施態様において、各個々Ｇセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。従って、本発明に従う特定の実施態様においては、各個々のＧセグメントは、上記アミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一である。
【００５４】
特定の実施態様において、本発明の各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でない。
【００５５】
特定の実施態様において、保存されたＴｙｒ残基に対応する（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応する）位置は、本発明の全てのＧセグメントにおいてＰｈｅではない。
【００５６】
特定の実施態様において、保存されたＴｙｒ残基に対応する（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応する）位置は、本発明に従う各ＧセグメントにおいてＴｙｒである。
【００５７】
当然の結果として、本発明のタンパク質の特定の実施態様は、上記の制限の組み合わせを示す、すなわち本発明の各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基が−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でなくかつ保存されたＴｙｒ残基（すなわち、配列番号５の１６位、配列番号６の１０位、および配列番号７の７位に対応）が本発明の各ＧセグメントにおいてＴｙｒとなるということである。特定の実施態様において、個別に、または任意の起りうる組み合わせで採られた上記の制限はさらに、前で議論したようなＲＥＰフラグメントがプロリン残基を欠いているという制限と組み合わせることができる。
【００５８】
図１〜２および実施例３〜４を参照すれば、本発明のＧセグメントには三つのサブタイプがあることが分かる。この分類は、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質配列の注意深い分析（図１〜２Ａ）に基づいており、そしてこの情報は新規な非天然型のクモ糸タンパク質の構築において利用され、検証されている（図２Ｂ）。
【００５９】
本発明のＧセグメントの第一のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号５に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ ＧＳＳにより表される。この第一の、かつ全体の中で最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には２３アミノ酸残基を含むが、それより少ない１７アミノ酸残基を含みかつ荷電残基を欠くまたは荷電残基を一つ含む場合もある。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、１７〜２３アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより少ない１２アミノ酸残基またはそれより多い３０アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、コイル構造または３1ヘリックス構造を形成すると予想される。この第一サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、８４〜１０６、１４８〜１７０、２１２〜２３４、３０７〜３２９、３７１〜３９３、４３５〜４５７、５３０〜５５２、５９５〜６１７、６８９〜７１１、７５３〜７７５、８１７〜８３９、８８１〜９０３、９４６〜９６８、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基２６〜４５および８９〜１１１である。この第一サブタイプの代替のＧセグメントは、配列番号１３のアミノ酸残基１２０〜１４９および１５９〜１７２である。特定の実施態様において、本発明に従うこの第一サブタイプの各Ｇセグメントの最初の二つのアミノ酸残基は−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−でない。
【００６０】
本発明のＧセグメントの第二のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号６に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）Ｙ ＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓにより表される。この第二の、全体の中で中間サイズのＧセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、かつ荷電残基を欠くかまたは荷電残基を一つ含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、１４〜２０アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより少ない１２アミノ酸残基またはそれより多い３０アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、コイル構造を形成すると予想される。この第二サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２４９〜２６５、４７１〜４８８、６３１〜６４７、および９８２〜９９８；ならびに配列番号９のアミノ酸残基４３〜６０である。
【００６１】
本発明のＧセグメントの第三のサブタイプは、図２Ａおよび配列番号７に示されるように、アミノ酸一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮにより表される。この第三のＧセグメントサブタイプは典型的には１４アミノ酸残基を含み、全体の中では本発明に従うＧセグメントサブタイプの中で最短である。この第三のＧセグメントサブタイプは、１２〜１７アミノ酸残基を含むのが好ましいが、それより多い２３アミノ酸残基を含む場合もあることが想定される。いずれかの特定の理論に拘束されることを望まないが、このサブタイプは、ターン構造を形成すると予想される。この第三サブタイプの典型的なＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基５７〜７０、１２１〜１３４、１８４〜１９７、２８０〜２９３、３４３〜３５６、４０７〜４２０、５０３〜５１６、５６７〜５８０、６６２〜６７５、７２６〜７３９、７９０〜８０３、８５４〜８６７、９１８〜９３１、１０１４〜１０２７；配列番号９のアミノ酸残基７６〜８９；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基６１〜７４である。この第三サブタイプの代替のＧセグメントは、配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１である。
【００６２】
従って、好ましい実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号５、配列番号６、および配列番号７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有する。
【００６３】
ＲＥＰフラグメントのＡセグメントおよびＧセグメントの交互配列の好ましい実施態様において、一つおきのＧセグメントが第一サブタイプのものであり、残りのＧセグメントが第三サブタイプのもの、例えば．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧshortＡ4ＧlongＡ5Ｇshort．．．である。ＲＥＰフラグメントの別の好ましい実施態様において、一つの第二サブタイプのＧセグメントが、このＧセグメントの規則性を挿入によって中断している、例えば．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧmidＡ4ＧshortＡ5Ｇlong．．．である。
【００６４】
各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表し、０〜２０アミノ酸残基、例えば０〜１０アミノ酸残基を含み得る。このセグメントは任意であり機能的にはスピドロインタンパク質にとって重要でないが、それでもその存在により、本発明のクモ糸繊維を形成する完全に機能的なスピドロインタンパク質が実現したとも言える。リンカーアミノ酸配列はまた、ユープロステノプス オーストラリス由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号３）にも存在する。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されるＡセグメントまたはＧセグメントのいずれかと似ている場合もあるが、通常、本明細書中に規定されるようなそれらの基準を十分に満たすものではない。
【００６５】
図２Ａに示されるように、ＲＥＰフラグメントのＣ末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳおよびＡＳＡＡＳＡＡＡにより表すことができ、これらはアラニンが豊富である。実際、二番目の配列は本発明のＡセグメントであると考えることができ、一番目の配列は本発明のＡセグメントに対して高い類似性を有する。本発明のリンカーセグメントの別の例は、一文字アミノ酸配列ＧＳＡＭＧＱＧＳを有し、これはグリシンが豊富であり本発明のＧセグメントに対して高い類似性を有する。
【００６６】
代表的なＬセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１〜６および１０９３〜１１１０；配列番号９のアミノ酸残基１〜１０および１５３〜１７１；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１７３〜１８０であるが、当業者はこれらのセグメントに関して多くの適切な代替のアミノ酸配列が存在することを容易に認識するであろう。本発明に従うＲＥＰフラグメントの一つの実施態様において、Ｌセグメントの一つは０アミノ酸を含む、すなわちＬセグメントの一つは存在しない。本発明に従うＲＥＰフラグメントの別の実施態様において、両方のＬセグメントが０アミノ酸を含む、すなわち両方のＬセグメントとも存在しない。従って、本発明に従うＲＥＰフラグメントのこれらの実施態様は、概略的に、以下のように（ＡＧ）nＬ、（ＡＧ）nＡＬ、（ＧＡ）nＬ、（ＧＡ）nＧＬ； Ｌ（ＡＧ）n、Ｌ（ＡＧ）nＡ、Ｌ（ＧＡ）n、Ｌ（ＧＡ）nＧ；および（ＡＧ）n、（ＡＧ）nＡ、（ＧＡ）n、（ＧＡ）nＧで表され得る。これらのＲＥＰフラグメントはいずれも、以下に規定される任意のＣＴフラグメントと共に使用するのに適している。
【００６７】
本発明に従うスピドロインタンパク質のＣ末端（ＣＴ）フラグメントは、スピドロインタンパク質のＣ末端アミノ酸配列に対して高い類似性を有する。図３に示されるように、このアミノ酸配列は様々な種ならびにＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２を含むスピドロインタンパク質の間で十分に保存されている。以下の実施例においては、ＣＴフラグメントが完全に欠失していない限り、具体的にどのＣＴフラグメントが本発明に従うスピドロインタンパク質に存在するかは重要なことではないことが実証されている。従って、本発明に従うＣＴフラグメントは、図３に示されるアミノ酸配列または類似性の高い配列のいずれかから選択できる。配列番号１３のＣＴhybフラグメントは配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して９６％の同一性を有するが、配列番号９のＣＴnatフラグメントは配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して５９％の同一性しか示さないことに注目されたい。このことは、幅広い様々なＣ末端配列が本発明のスピドロインタンパク質において使用できることを示している。
【００６８】
本発明に従うＣＴフラグメントの配列は、図３のアミノ酸配列に基づく配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％の同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明のＣＴフラグメントの配列は、配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜７１に対して少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明のＣＴフラグメントはさらに、配列番号８のコンセンサスアミノ酸配列またはそのアミノ酸残基１〜７１に対して７０％の同一性、好ましくは８０％の類似性を有する。
【００６９】
本発明の典型的なＣＴフラグメントは、配列番号４のユープロステノプス オーストラリス配列、配列番号９のユープロステノプス オーストラリス由来アミノ酸残基１７２〜２６９、ならびにユープロステノプス エスピー由来であると主張されている（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，Ｎ．Ｎ．＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））が、アメリカジョロウグモおよびセネガルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）由来のＭａＳｐ１に対する類似性が高い配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６である。従って、本発明の好ましい側面によれば、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。本発明の好ましい側面において、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい側面において、ＣＴフラグメントは、配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９、または図３および実施例４の任意の個々のＭａＳｐ１／ＡＤＦ−４アミノ酸配列と同一である。
【００７０】
ＣＴフラグメントは、典型的には、７０〜１２０アミノ酸残基からなる。ＣＴフラグメントは、少なくとも７０、または８０以上、好ましくは９０以上のアミノ酸残基を含むのが好ましい。ＣＴフラグメントが、最大１２０または１１０未満のアミノ酸残基を含むことも好ましい。典型的なＣＴフラグメントは、およそ１００アミノ酸残基を含む。
【００７１】
別の側面によれば、本発明は、好ましくは１５０〜４２０アミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、ならびに融合パートナーおよび切断剤認識部位を含む第二タンパク質フラグメントからなる単離された融合タンパク質を提供する。第一タンパク質フラグメントは切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合されていて、すなわち適切な条件下で適切な切断剤によって融合タンパク質を処理することによって融合パートナーを切り出し、好ましくは１５０〜４２０アミノ酸残基からなる大瓶状腺スピドロインタンパク質を提供することができる。この融合タンパク質を用いる利点は、沈降および適切な宿主、例えば細菌、好ましくは大腸菌で生産させる場合のその他の生産上の問題を引き起こさずに、溶液中で、好ましくは生理学的な媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９中で大量に生産させることができる点である。溶液中の融合タンパク質は、長い期間、典型的には数日または数週間の間、可溶性であり、これによりラージスケールでの生産が容易になり、タンパク質の凝集の危険が小さくなる。用語「可溶性」および「溶液中」は、タンパク質が目に見えて凝集せず、６００００×ｇで溶媒から沈降しないことを意味する。必要あらば、溶液中の融合タンパク質は、適当な切断剤を用いた切断に供され、自発的にクモ糸繊維を形成する大瓶状腺スピドロインタンパク質を提供することができる。
【００７２】
好ましい側面において、本発明は、Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘの群から選択される単離された融合タンパク質、好ましくはＸ−ＲＥＰ−ＣＴを提供する。ＲＥＰおよびＣＴは、本発明に従うタンパク質フラグメントであり、得られるＲＥＰ−ＣＴの形態のＭａＳｐタンパク質が本発明に従うＭａＳｐタンパク質であることを意味する。Ｘは、上記のような融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントである。タンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは、切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される。
【００７３】
本発明の融合パートナーには、その相手となるタンパク質フラグメント、ここでは本発明のＭａＳｐタンパク質、の溶解性および／または安定性を改善する任意のタンパク質フラグメントが含まれる。融合パートナーはまた、アフィニティ精製に適したハンドルを提供する。本発明に従う融合パートナーの例には、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＭＴＢ３２−Ｃ、Ｇｂ１、ＺＺ、およびＮｕｓ Ａが含まれるがこれらに限定されない。当業者は、代替の適切な融合パートナーを十分承知している。本発明の好ましい実施態様において、融合パートナーは、ＨｉｓタグおよびＳタグと組み合わせのチオレドキシン部分（ＴｈｒＸ）である。本発明の一つの好ましい実施態様において、融合パートナーは、二つのＨｉｓタグを有するＴｈｒＸ部分、すなわちＨｉｓタグ／ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグである。本発明の別の好ましい実施態様において、融合パートナーは、チオレドキシン部分（ＴｈｒＸ）である。
【００７４】
切断剤認識部位は、ＭａＳｐタンパク質フラグメントに結合されるＸタンパク質フラグメントの末端に置かれて、その認識部位における切断によりＭａＳｐタンパク質および融合パートナーが生じる。本発明に従う切断剤認識部位の例には、アミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳ（ＲとＧの間で切断される）を有するトロンビン認識部位；アミノ酸配列ＤＤＤＫ（Ｋの後ろで切断される）を有するエンテロキナーゼ認識部位；アミノ酸配列ＮＧ（ＮとＧの間で切断される）を有するヒドロキシルアミン認識部位；アミノ酸配列ＬＧＶＬＦＱＧＰ（ＱとＧの間で切断される）を有するＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ認識部位；アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（Ｒの後ろで切断される）を有する第Ｘａ因子認識部位；アミノ酸配列ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）、一般的にはＥＮＬＹＦＱＧ（ＱとＧ／Ｓの間で切断される）を有するＴＥＶ認識部位；アミノ酸配列ＥＤＮＬＹＦＱＧ（ＱとＧの間で切断される）を有するＡｃ−ＴＥＶ認識部位；およびアミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＱとＧの間で切断される）を有するＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ認識部位が含まれるがこれらに限定されない。他の適当な認識部位は、トリプシン、エンドプロテイナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ペプシン、およびＣＮＢｒの切断部位である。好適な切断認識部位のさらなる例は、十分に当業者の手の届く範囲内にある。本発明の好ましい実施態様において、切断剤認識部位はトロンビン認識部位である。
【００７５】
好ましい実施態様において、本発明のＸフラグメントは、ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグ／Ｓタグ／トロンビン切断部位という構造を有し、かつＸフラグメントは本発明のＲＥＰ−ＣＴタンパク質フラグメントのＮ末端に結合される。
【００７６】
一つの好ましい実施態様において、本発明のＸフラグメントはＨｉｓタグ／ＴｈｒＸ／Ｈｉｓタグ／トロンビン切断部位という構造を有し、かつＸフラグメントは本発明のＲＥＰ−ＣＴタンパク質フラグメントのＮ末端に結合される。
【００７７】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する。好ましくは、融合タンパク質は凝集せず、従って再溶解手順は必要ない。融合タンパク質は組換え生産され、融合タンパク質上のアフィニティハンドル、例えばＨｉｓタグまたは融合タンパク質中の任意の適切なエピトープを用いて精製され得る。液体媒体は、任意の適している媒体、好ましくは生理学的媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９であり得る。第二工程においては、切断剤認識部位において融合タンパク質の切断を達成するために、本発明に従う切断剤が液体媒体に加えられる。上記のように、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、これによって得られる。第三の場合による工程においては、このようにして得た大瓶状腺スピドロインタンパク質を、適する単離技術、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて液体媒体から単離する。
【００７８】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する。好ましくは、融合タンパク質は凝集せず、従って再溶解手順は必要ない。融合タンパク質は組換え生産され、融合タンパク質上のアフィニティハンドル、例えばＨｉｓタグまたは融合タンパク質中の任意の適切なエピトープを用いて精製され得る。液体媒体は、任意の適している媒体、好ましくは生理学的媒体、典型的には緩衝化水性媒体、例えば１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６〜９であり得る。第二工程においては、切断剤認識部位において融合タンパク質の切断を達成するために、本発明に従う切断剤が液体媒体に加えられる。上記のように、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、これによって得られる。第三工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる。重合は、典型的には、二つの異なる相の間の界面で、例えば液体／空気、液体／固体、および水／油の界面で開始される。従って、この第三工程はさらに、液体媒体と別の相の間の界面の提供も含み得る。別の相は、気相、液相、および固相からなる群より選択される。上記のように、液体媒体は典型的には水性媒体であり、適当な別の相は、例えば空気および水不混和性の有機溶媒、例えば油、例えばＰＣＲ反応に適した鉱油である。生じる界面の存在は、その界面またはその界面付近の液体媒体に及ぶ領域において重合を刺激し、それによってこの界面または界面領域において重合が開始される。好ましい界面には、水／空気および水／油の界面が含まれる。重合は、典型的には、室温でのインキュベーションによって、数分または数時間以内に、例えば１分〜５時間以内に自然に起こる。第四の場合による工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを、適切な単離技術を用いて液体媒体から単離する。
【００７９】
上記のように、繊維の形成は、融合タンパク質からのミニチュアスピドロインのタンパク質分解による遊離により誘導される。切断反応を、穏やかに左右に揺すられているチューブ内で行うと、繊維は、そのチューブに沿う空気−水の界面で形成される。チューブは任意の適切な素材、例えばプラスチックまたはガラスから製造され得る。切断混合物を静置すると、空気−水の界面にフィルムが形成される。水性の切断混合物の上面に油を添加すると、静置する場合であっても揺する場合であっても、フィルムは油−水の界面で形成される。切断混合物を、例えば空気によるバブリングまたはホイッピングにより泡立てると、この泡は安定であり、乾燥させれば固化する。
【００８０】
本発明の方法を用いれば、必要に応じて切断できおよび重合させ得る、本発明の融合タンパク質を多量に組換え生産することが可能である。これにより、重合工程の制御性が良くなり、望ましい特性を有するクモ糸繊維を獲得するためにパラメータを最適化させることができる。
【００８１】
本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質は、典型的には、様々な好適な宿主を用いて組換え生産される。従って、別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質、例えば配列番号９〜１３、好ましくは配列番号９、１２、および１３、をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む単離されたポリ核酸分子を提供する。これらのポリ核酸分子および本明細書中に開示される様々なタンパク質（配列番号２〜１６）をコードするポリ核酸分子もまた、非天然型のスピドロインタンパク質またはその生産系のさらなる開発に有用であり得る。
【００８２】
本発明に従う融合タンパク質は、典型的には、様々な適する宿主、例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞、およびトランスジェニック動物を用いて組換え生産される。本発明に従う融合タンパク質を細菌中で生産させるのが好ましい。
【００８３】
従って、別の側面によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む単離されたポリ核酸分子を提供する。このポリ核酸分子はまた、非天然型のスピドロインタンパク質またはその生産系のさらなる開発にも有用であり得る。
【００８４】
本発明に従うポリ核酸分子は、ｃＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。当業者なら十分に認識するように、ある核酸配列は、さらにその相補的核酸配列をも表わし得る。従って、本発明に従う核酸配列に相補的な核酸配列もまた、本発明の保護範囲に含まれる。
【００８５】
一つの側面によれば、本発明は、本発明に従う可溶性融合タンパク質の生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。場合により、可溶性融合タンパク質を単離する第二工程は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００８６】
本発明はさらに、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質の製造方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。第三工程においては、単離された融合タンパク質の溶液を供給し、第四工程においては、その液体媒体に適した切断剤を添加する。これにより、切断剤認識部位における融合タンパク質の切断が達成され、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質が提供される。場合による第五工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体から単離する。さらに、場合により、可溶性融合タンパク質を単離する第二工程および大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する場合による第五工程は、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む。
【００８７】
本発明はまた、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法を提供する。その第一工程において、本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を、適した宿主において発現する。第二工程においては、このようにして得られた可溶性融合タンパク質を、例えばクロマトグラフィおよび／または濾過を用いて単離する。第三工程においては、単離された融合タンパク質の溶液を供給し、第四工程においては、その液体媒体に適した切断剤を添加する。これにより、切断剤認識部位における融合タンパク質の切断が達成され、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質が提供される。第五工程においては、このようにして得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる。重合は、典型的には、二つの異なる相の間の界面で、例えば液体／空気、液体／固体、および水／油の界面で開始する。従って、この第五工程はさらに、液体媒体と別の相の間の界面を提供することも含み得る。別の相は、気相、液相、および固相からなる群より選択される。上記のように、液体媒体は典型的には水性媒体であり、適した別の相は、例えば空気および水不混和性の有機溶媒、例えば油、例えばＰＣＲ反応に適した鉱油である。生じる界面の存在は、その界面またはその界面付近の液体媒体に及ぶ領域において重合を刺激し、それによってこの界面または界面領域において重合が開始される。好ましい界面には、水／空気および水／油の界面が含まれる。重合は、典型的には、室温でインキュベーションすると、数分または数時間以内に、例えば１分〜５時間以内に自然に起こる。場合による第六工程においては、このようにして得られたポリマーを、液体媒体から単離する。
【００８８】
インビボで生体材料として使用する上での必須の、低発熱物質含量のタンパク質を得るため、リポ多糖類（ＬＰＳ）の除去に最適化された精製プロトコルを開発した。遊離したＬＰＳの混入を回避するため、産生細菌細胞を、ＣａＣｌ2およびＥＤＴＡの交互の洗浄工程に供する。細胞溶解後の後続の全ての精製工程は、標的タンパク質とＬＰＳの間の疎水性相互作用を最小限に抑えるために、低伝導率の緩衝液中で行われる。ＬＰＳ含量は、このタンパク質溶液を、ＬＰＳを特異的に吸着するリガンドを有するＥｎｄｏｔｒａｐカラムに通すことによってさらに最小限に抑える。ＬＰＳおよび他の発熱物質が絶えず低含量であることを確認するため、全てのバッチを、インビトロ発熱性物質試験法（ＩＰＴ）および／またはリムルスアメーバ様細胞溶解産物（ＬＡＬ）動態アッセイを用いて分析する。グラム陰性細菌の宿主において生産されたにもかかわらず、組換えスピドロインタンパク質を、ＬＰＳおよび他の発熱物質の残留レベルが動物試験において要求される限界以下、すなわち２５ ＥＵ／インプラント以下にまで精製することができる。本発明に従う特定の実施態様において、単離された融合タンパク質中のＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である。本発明に従う特定の実施態様において、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質中のＬＰＳおよび他の発熱物質の含量は、１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満、好ましくは０.２５ ＥＵ／ｍｇタン
パク質またはそれ未満である。
【００８９】
別の側面によれば、本発明は、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーを提供する。好ましい実施態様において、このタンパク質のポリマーは、本発明に従う方法のいずれか一つによって獲得できる。
【００９０】
好ましい実施態様において、本発明の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーのβシート含量は５０％以上である、すなわちこのタンパク質のポリマーの二次構造の５０％より多くがβシート形態をとっている。より高いβシート構造の含量は、より堅くおよび／もしくは強く、ならびに／またはより延びない繊維を提供すると考えられるので、これは利点である。
【００９１】
本発明に従うスピドロインタンパク質のポリマーは、巨視的な大きさの、すなわち１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上の直径および５ｍｍ以上の長さを有する繊維であるのが好ましい。繊維は１０〜４００μｍ、好ましくは６０〜１２０μｍの範囲の直径、および０.５〜３００ｃｍ、好ましくは１〜１００ｃｍの範囲の長さを有することが好ましい。他の好ましい範囲は、０.５〜３０ｃｍおよび１〜２０ｃｍである。本発明のスピドロインタンパク質のポリマーは１ＭＰａ以上、好ましくは２ＭＰａ以上、より好ましくは１０ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有することも好ましい。本発明のスピドロインタンパク質のポリマーは、１００ＭＰａ以上、より好ましくは２００ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有することが好ましい。本繊維は、物理的操作の間もインタクトな状態を維持する能力を有する、すなわち、紡糸、製織（ｗｅａｖｉｎｇ）、撚糸（ｔｗｉｓｔｉｎｇ）、かぎ針編み（ｃｒｏｃｈｅｔｉｎｇ）、および類似の方法に使用できる。
【００９２】
好ましい実施態様において、本発明に従うスピドロインタンパク質のポリマーは、泡、ゲル、メッシュ、またはフィルムを形成する。
【００９３】
さらに別の側面によれば、本発明は、融合タンパク質を製造するための、融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの新規な使用を提供する。本融合タンパク質は、前記タンパク質フラグメントおよび本発明のクモ糸タンパク質フラグメントを含むものであり、二つのフラグメントは切断剤認識部位を介して結合されている。クモ糸タンパク質フラグメントは、好ましくは、１５０〜４２０アミノ酸残基からなる。
【００９４】
以下、本発明を下記の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００９５】
実施例
実施例１ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１ ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
南アフリカで採取した、およそ１００匹の雌成体ユープロステノプス オーストラリスのクモ由来の大瓶状腺を用いて特注のｐＤＯＮＲ２２２ベースのＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ ｃＤＮＡライブラリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を構築した。ＭａＳｐ１タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンは、ユープロステノプス属の未知の亜種のクモを起源とするアラニンリッチおよびグリシンリッチフラグメントをコードするｃＤＮＡプローブを用いてライブラリをスクリーニングすることによって得た。コロニーブロッティングおよび検出はＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を製造元の指示に従い用いて行った。
一つの単一クローンをさらなる特徴付けのために選択した。このクローンからｃＤＮＡインサートの全長配列を得るため、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて塩基配列段階的削除（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を作製し、配列決定をＭｅｇａＢａｓｅ １０００機器（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行った。
得られた３.８ｋｂ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、３４のアラニンリッチセグメントおよびグリシンリッチセグメントの反復フラグメント（配列番号３）ならびに９７アミノ酸残基のＣ末端非反復フラグメント（配列番号４）を含む、１２０７アミノ酸残基のＭａＳｐ１タンパク質（配列番号２）をコードするものであった。
【００９６】
実施例２ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントの配列分析
実施例１のユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質配列の反復フラグメント（配列番号３）を、このフラグメントの反復セグメントのアラインメントによりさらに分析した。図１を参照のこと。このアラインメントを注意深く精査し、以下の構造情報を得た。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質のアラニンリッチセグメントは１３〜１５アミノ酸残基長であり、アラニン残基のみからなるかまたは一つの残基（セリン、グルタミン酸、またはグリシン残基であった）を除いて全てがアラニン残基からなるものであった。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントはさらに、三つの関連する、しかし異なるタイプのグリシンリッチセグメントをさらに含んでいた。図２Ａを参照のこと。このグリシンリッチセグメントのうちの二つは、ほぼ長さおよび出現率のみが異なり；最も共通のグリシンリッチセグメントは２３アミノ酸残基を含むが、より数の少ないバリアントは１７アミノ酸残基を含むものであった。これらのグリシンリッチセグメントは両方とも、全般的に、荷電残基を欠いているかまたは一つの荷電残基を含むものであった。対照的に、１４アミノ酸残基を含む最短型のグリシンリッチセグメントは、Ｎ末端に配列ＧＲＧＱＧまたはＧＱＧＱＧおよびＣ末端にＧＮを含む点が独特であった。
最長型のグリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ （Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ ＧＳＳ（配列番号５）により表され、荷電残基を欠いていた。このセグメントはコイル構造または３1−ヘリックス構造を形成することが予想された。中間サイズのグリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）Ｙ ＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号６）により表され、荷電残基を欠いているかまたは一つの荷電残基を含むものであった。このセグメントはコイル構造を形成することが予想された。最小型グリシンリッチセグメントは、アミノ酸一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ （Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号７）により表されるものであった。このセグメントはターン構造を形成することが予想された。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントは、アラニンリッチセグメントとグリシンリッチセグメントを交互にすることで構築されるものであった。例えば、
．．．．Ａ1Ｇ1Ａ2Ｇ2Ａ3Ｇ3Ａ4Ｇ4Ａ5Ｇ5．．．
上記の最小型および最長型のグリシンリッチセグメントの各々は、概ね、グリシンリッチセグメント二つごとに出現することが観察された。例えば、
．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧshortＡ4ＧlongＡ5Ｇshort．．．
対照的に、より数の少ない中間サイズのグリシンリッチフラグメントは、概ね、それより長いタイプのグリシンリッチセグメントとそれより短いタイプのグリシンリッチセグメントの間に出現するものであった。例えば、
．．．Ａ1ＧshortＡ2ＧlongＡ3ＧmidＡ4ＧshortＡ5Ｇlong．．．
【００９７】
実施例３ ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメ
ントの二次構造および三次構造の推定
溶液中のスピドロインポリペプチドは、典型的には、ヘアピン構造の形成により折り畳まれることから、成熟型の繊維においては逆平行βシート構造を前もって示すことが予想された。実施例１〜２のユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメント（配列番号３）において可能性のあるフォールディングパターンを理解するため、ヘアピンまたはターン構造の形成に適合するタンパク質領域を同定した。アラニンリッチセグメントは、ヘリックス構造を形成することが予想されることから、ターン形成の候補としての可能性は低く、それよりも、これらのセグメントは、繊維内でβシートを構成するのに一般的に保持されることの方が重要であった。
最近発表されたターン予測アルゴリズム（Ｆｕｃｈｓ，ＰＦ ＆ Ａｌｉｘ，ＡＪ，Ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｔｕｒｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｙｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５９，８２８−８３９（２００５））を用いたところ、最短型グリシンリッチセグメントは、タイプＩＩ βターンの形成の可能性が高いことを示し、二つのより長いグリシンリッチセグメントは、コイル構造を形成することが予測された。より長いＧｌｙリッチセグメントにおいてＧＧＸトリプレットする含量が高いことは、これらが３1−ヘリックス構造を形成できることを示唆していた。
スピドロインアミノ酸配列の反復的性質は、フォールディングパターンの同等に反復的な性質を示唆する。まとめると、これらの観察により、図２Ａに示されるようなユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントのフォールディングを得た。正に荷電した残基が、ほぼ必ずこの提唱したターン構造に存在することに注目されたい。
ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復フラグメントのフォールディングパターンから、アラニンリッチセグメント／（より長い）グリシンリッチコイルセグメント／アラニンリッチセグメント／（より短い）グリシンリッチターンセグメント／アラニンリッチセグメント／（より長い）グリシンリッチコイルセグメント／アラニンリッチセグメントを見出すことができた（図２Ａに概略的に示されている）。
【００９８】
実施例４ ＭａＳｐ１タンパク質の非反復Ｃ末端フラグメントの配列分析
実施例１において得られたユープロステノプス オーストラリス由来のＭａＳｐ１タンパク質のＣ末端非反復フラグメント（配列番号４）の一次構造を、多くの公知の、特にユープロステノプス エスピー（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））、Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ Ｐ１９８３７−５（Ｘｕ，Ｍ ＆ Ｌｅｗｉｓ，ＲＶ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｆｉｂｅｒ：ｓｐｉｄｅｒ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，７１２０−７１２４（１９９０））、およびその他由来のＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２タンパク質のＣ末端フラグメントとアラインメントを行なった。
図３に示される、反復フラグメントの最後のＳｅｒから始めたアラインメントから、ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域がよく保存されていることが明らかとなった。ユープロステノプス エスピーおよびアメリカジョロウグモは、９５％同一の残基を有し、ユープロステノプス オーストラリスおよびアメリカジョロウグモは、５４％同一の残基を有し；そしてユープロステノプス オーストラリスおよびユープロステノプス エスピーは、５５％同一の残基を有していた。ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列を配列番号８として表す。図３において、以下のＭａＳｐタンパク質のアラインメントを行った。これを、適用可能な場合はＧｅｎＢａｎｋアクセッションエントリーと共に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
実施例５ ＭａＳｐ１遺伝子の構築
ユープロステノプス オーストラリス由来タンパク質５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）をコードするＤＮＡ配列を、テンプレートとして実施例１のｃＤＮＡライブラリ由来のＭａＳｐ１クローンを用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ２キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるＰＣＲにより増幅した。設計したプライマーを使用して、制限酵素認識部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを、それぞれ５’末端および３’末端に導入し、停止コドンをＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に導入した。次いでＢａｍＨＩ−５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat−ＨｉｎｄＩＩＩ構築物を、以下の実施例６（Ｃ）に記載されるようにして調製した修飾型ｐＥＴ３２ベクター（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。
【０１０１】
実施例６ キメラＭａＳｐ１遺伝子の構築
（Ａ）ＲＥＰ遺伝子フラグメント
３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａで表される部分反復フラグメント（ＲＥＰ）をコードするＤＮＡ配列を、テンプレートとしてユープロステノプス エスピー ＭａＳｐ１タンパク質の反復領域をコードする部分ｃＤＮＡクローン（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＣＱ９７４３５８またはＣＱ８１６６５６）を用いて、ベタインの存在下で（Ｈｅｎｋｅ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｂｅｔａｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＣ−ｒｉｃｈ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５，３９５７−３９５８（１９９７））、ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ；Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によるＰＣＲにより増幅した。制限酵素認識部位を５’末端および３’末端に導入し、以下の構築物を得た：ＣＴフラグメント（下記参照）とつなぐ予定のＮｃｏＩ−３Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ−４Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＮｈｅＩ；および個別に発現させる予定の、停止コドンをＸｈｏＩ部位の上流に直接導入したＮｃｏＩ−４Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＸｈｏＩクローン。
【０１０２】
（Ｂ）ＣＴ遺伝子フラグメント
ユープロステノプス エスピー由来の（しかしアメリカジョロウグモおよびセネガルジョロウグモ由来のＭａＳｐ１との類似性が高い）非反復Ｃ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列を、Ｃ末端ＭａＳｐ１ドメインをコードするゲノムＤＮＡクローンを用いてＰＣＲにより増幅した（Ｐｏｕｃｈｋｉｎａ−Ｓｔａｎｔｃｈｅｖａ，ＮＮ ＆ ＭｃＱｕｅｅｎ−Ｍａｓｏｎ，ＳＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｆｒｏｍ ａ ｎｕｒｓｅｒｙ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ，Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ｓｐ．（Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３８，３７１−３７６（２００４））。制限酵素認識部位を５’末端および３’末端に導入し、３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａ部分ＲＥＰクローン（上記参照）とつなぐ予定のＮｈｅＩ−２Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb−ＸｈｏＩおよび個別に発現させる予定のＮｃｏＩ−２Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb−ＸｈｏＩを得た。
【０１０３】
（Ｃ）ＲＥＰ−ＣＴハイブリッドＭａＳｐ１遺伝子の構築
３Ｇｌｙ／Ａｌａおよび４Ｇｌｙ／Ａｌａ ＲＥＰクローンを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＴクローンとつないだ。次いで、得られた、融合型５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybおよび６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybクローンをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切り出し、元々あったトロンビン切断部位を除去しエンテロキナーゼ切断部位の下流に新規なトロンビン部位を導入した修飾型ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。
【０１０４】
実施例７ ＭａＳｐ１融合タンパク質の発現
実施例５〜６において構築した遺伝子によりコードされるＭａＳｐ１タンパク質を、以下のように、Ｔ７プロモーターの制御下で、チオレドキシン／Ｈｉｓ6／Ｓタグ／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子をコードする修飾型ｐＥＴ３２ベクター：チオレドキシンタグ／Ｈｉｓタグ／Ｓタグ／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１遺伝子を用いて、（Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴタイプの）融合タンパク質として発現させた。
種々のＭａＳｐ１構築物を含むｐＥＴ３２発現ベクターで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質転換した。細胞を、アンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中、３０℃で、ＯＤ600が１.０〜１.５になるまで培養し、ＩＰＴＧで誘導し、さらに室温で４時間インキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、２０ｍＭイミダゾール、および０.５Ｍ ＮａＣｌ中でＤＮＡｓｅＩおよびリゾチームによって溶解させ、さらにＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）のＨｉｓタグアフィニティクロマトグラフィによって精製した。結合した融合タンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８.０、および０.５Ｍ ＮａＣｌでＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０に対して透析した。得られた融合タンパク質は、クマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる判定で＞９０％の純度であり、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０中で可溶性であった。このプロセスにより、およそ４０ｍｇ／ｌ培養物の融合タンパク質を得、これは数週間の間有意な沈降をみせずに安定であった。
別の実験において、融合タンパク質を、Ｈｉｓ6／チオレドキシン／Ｈｉｓ6／トロンビン切断部位／ＭａＳｐ１タンパク質として、Ｔ７プロモーターの制御下に対応する遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドから発現させた。
【０１０５】
実施例８ ＭａＳｐ１タンパク質からの繊維の形成
実施例７から得た融合タンパク質からのタグの切断は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中、室温で非常に穏やかに揺動させながら、１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質比で行った。トロンビン切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定して３０〜６０分以内に完了させた。生じたＭａＳｐ１タンパク質（図２Ｂ、配列番号９〜１３）は、自発的に、様々な程度の巨視的な繊維へと重合した。表１を参照のこと。これらの繊維は、最初に、水／空気の界面で形成させた。その形成は、インキュベーション約１時間で肉眼で観察できるようになり（図４Ａ、４Ｂを参照のこと）、約５時間以降はさらなる繊維の成長が生じなくなった。６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb繊維は最大約２ｃｍ長、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は≧１０ｃｍ長であった。実験を繰り返すことにより、≧２０ｃｍの５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維（図４Ｃを参照のこと）を、さらには≧２ｍ長に至るものすら獲得した。繊維形成は、インキュベーション約１０分で肉眼で観察することができるようになった。
繊維を単離し、緩衝液で洗浄し、その後にＮ末端アミノ酸配列分析に供したところ、ＭａＳｐ１タンパク質の配列のみが示された。これにより、切断されたタグがこの繊維上に存在しないことが示された。
【０１０６】
実施例９ ＭａＳｐ１タンパク質繊維の分析
Ａ．引張強度の測定
実施例８の６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）および５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）繊維の引張強度を以下の通りに決定した。引張強度測定用のより短い型（１〜２ｃｍ）の６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb繊維を扱うために、それらを１５％グリセロール水溶液中で軽くインキュベートした後、風乾させた。より長い型（１０ｃｍ）の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は未処理のままか、１５％グリセロール中で軽くイン
キュベートするか、または７５％メタノール中で手で引っ張った（ｄｒａｗｎ ｂｙ ｈａｎｄ）後、風乾させた。風乾させた繊維の引張強度は、Ｚｗｉｃｋ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｓｔｅｒにおいてこれらの繊維を１０ｍｍ／分の速度で引っ張ることによって測定した。表１を参照のこと。
６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）製のグリセロール処理・風乾した１〜２ｃｍ長の繊維の引張強度は約２ＭＰａであり、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の１０ｃｍ繊維の強度は４〜５ＭＰａであった。脱水溶媒であるメタノール中で引っ張った後に風乾させた１０ｃｍ長の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維は、同じタイプのグリセロール処理繊維よりも若干小さい２〜３ＭＰａの引張強度を示した。ここでの最高の引張強度は、さらなる処理を施さずに風乾させた１０ｃｍ長の５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維において見られた１０ＭＰａであった。
引張強度の範囲（２〜１０ＭＰａ）は、再生されたクモ糸繊維（２〜２３０ＭＰａ）について報告されている下限値に匹敵するものであった。最長の、自発的に形成される繊維は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat構築物から得られ、このような風乾した繊維もまた、最高の引張強度を示した。これは、１２〜１５残基というポリＡｌａセグメントが６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybにおける８〜１４残基のＡｌａセグメントに対して長く、それによって前者のタンパク質において結晶βシートコンホメーションの比率が高くなったことに起因する可能性がある。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
Ｂ．走査電子顕微鏡
６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybおよび５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat繊維の微視的構造を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて分析した（図５）。簡単に説明すると、サンプルをＳＥＭスタブ上に適用し、金およびパラジウムの６ｎｍ層で真空コーティングした。検体を、ＬＥＯ １５５０ ＦＥＧ ＳＥＭにおいて１０ｋＶの加速電圧を用いて観察および撮影した。
これにより、単一の繊維の直径が１０〜３０μｍであること、および個々の繊維がかなり均一な直径を示すことが明らかになった（図５ａは６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb、配列番号１３を示す）。巨視的な繊維に加えて、ゲル様の粒子も見られた。このような６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybの粒子をＳＥＭスタブ上で直接的に風乾させた後、およそ１０〜１５μｍ径の繊維が見られた（図５ｂ、ｃ）。７５％メタノール中で引っ張り、風乾させた５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の巨視的な繊維の直径は６０〜１２０μｍであり、それらは、整列した繊維を数本含んでいるようであった（図５ｄ〜ｆ）。風乾前に撚った繊維（図５ｅ）、繊維の端部（図５ｆ）。
【０１０９】
Ｃ．円偏光二色性分光法
実施例８において調製された、６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）または５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）からなる繊維を、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７で洗浄し、２％ＳＤＳを含む同一緩衝液に懸濁した。２５０〜１９０ｎｍの円偏光二色性スペクトルを、２２℃で、０.１ｃｍ光路長の石英キュベットにおいて、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計を用いて記録した。スキャン速度は５０ｎｍ／分であり、応答時間は２秒であり、取得インターバルは０.１ｎｍであり、帯域幅は１ｎｍであった。
図６に示されるスペクトルは、６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）の繊維の三回のスキャンの累積である。これは、逆平行βシート構造に特有の特徴である２２０ｎｍにおける最小値および１９５ｎｍにおける最大値を示している。５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnatの繊維についても非常に似通ったスペクトルが得られた（データは示さず）。つまり、自発的に形成された繊維は、ネイティブのおよび再生されたクモ糸繊維と類似の形態および構造を示した。
【０１１０】
実施例１０ 組換えクモ糸の生体適合性
クモ糸繊維を生物医学的用途で使用するのが望ましいので、この繊維の生体適合性を、組換え生成されたクモ糸の効果を二つの異なる細胞型を用いて調査することによって評価した。
ＭａＳｐ１タンパク質５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）を、実施例７〜８に記載されるようにして細菌中で発現させた。精製されたタンパク質を使用して、長さ＞１０ｃｍ、さらには長さ＞２０〜２００ｃｍで、直径約１００μｍの人工クモ糸繊維を製造した。
【０１１１】
Ａ．胚性マウスマスト細胞
胚性（１２.５日）マウスマスト細胞（ＩＬ−８およびマスト幹細胞因子を用いて８週間インビトロ培養した）を、２つの異なる細胞密度、高い方の密度は低い方の密度の約４倍、で播種した。これらの細胞はプラスチック表面に付着しないが、懸濁物中で培養した。各々約０.５ｃｍ長のクモ糸繊維片をウェルに加えた。マスト細胞を、クモ糸繊維の存在下または非存在下で３日間インキュベートし、その後、生存細胞および死滅細胞をトリパンブルー染色後に計数した（図７）。バーは標準誤差平均を伴うｎ＝２の平均値を示し、各サンプルを三連で計数した。
マスト細胞は、クモ糸繊維の存在による影響を受けなかった。三日間の培養後、クモ糸繊維の非存在下で培養したネガティブコントロールと比較して、細胞の死滅または増殖に関して有意な差が見られなかった。
【０１１２】
Ｂ．ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞
約０.５ｃｍ長のクモ糸繊維片を、少量の緩衝液から乾燥させることによって、６ウェルマイクロタイタープレートの底部に吸着させた。この繊維は、細胞培養培地を加えても剥がれなかった。次いで、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、種々の細胞密度でプレーティングし、計６日間培養した。ＨＥＫ−２９３細胞は、プラスチックセルの表面に付着し、付着状態で成長した。この繊維付近で成長したＨＥＫ−２９３細胞の能力およびこの繊維に対する細胞の物理的付着を検討した。
ＨＥＫ−２９３細胞は、クモ糸繊維を含むウェルにおいて通常通り付着および増殖した（光学顕微鏡下での観察）。この細胞は繊維の縁に非常に近いところで成長し、かつ部分的に剥がれた繊維の下でさえも成長したようであった（図８）。７日後、繊維をプラスチック表面から注意深く剥がしたところ、細胞群がこの繊維に物理的に付着していることがはっきりと見てとれた。この繊維は、図の右上半分を覆っている。ＨＥＫ２９３細胞は、繊維の縁に付着していることが確認され、かつ繊維の下でさえも成長していた。
検討した二つの異なる細胞型（マスト細胞、ＨＥＫ−２９３）は、組換えクモ糸の存在による影響を、比較的多量のクモ糸の存在下であっても受けなかった。このことは、試験した人工クモ糸繊維が、非毒性であり生体適合性である点で、ユープロステノプス オーストラリスの野生型しおり糸と類似することを示している。従って人工クモ糸繊維は生物医学的用途に適しているようである。
【０１１３】
実施例１１ ＭａＳｐ１タンパク質繊維の機械的特性および構造
５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の繊維の機械的特性を、行った引張試験を用いて試験し、応力−ひずみ曲線を作製した（図９）。引張り特性は、Ｚｗｉｃｋ Ｒｏｅｌｌ Ｚ２．５物性試験装置（Ｚｗｉｃｋ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて特徴付けた。試験は、１０ｍｍ／分の負荷速度を用いて、周囲条件の大気（２０℃および５２％相対湿度）の下で行った。繊維片を緩衝液から直接移し、マウントし、二回の延伸−弛緩サイクルに供した。引張試験に適した均一なクモ糸を作製するため、延伸−弛緩サイクルを用いて繊維を引き延ばした。まず、最大０.１Ｎの力で引っ張ることによって繊維を引き延ばした。弛緩させた後、これらに０.２５Ｎの力がかかるまでさらに引っ張った。
この処理により、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ ＩＤＣ−１１２Ｂ機器（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いる高さ測定で決定して、直径およそ８０μｍの引き延ばされた均一な繊維を得、これを以下の通りに走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認した。延伸−弛緩サイクルの前後に、繊維片をＳＥＭスタブ上に適用し、一晩風乾させた。このサンプルを、金およびパラジウムの６ｎｍ層で真空コーティングした。検体を、ＬＥＯ １５５０ ＦＥＧ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において１０ｋＶの加速電圧を用いて観察および撮影した。
引き延ばした繊維を切断して小片とし、その端部を接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ ４２０，Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）で段ボール紙の間に固定した。次いで、繊維サンプルを物性試験装置のグリップに固定し、破れるまで伸ばした。事前に引き延ばしておいた繊維の初期断面積を用い、円形の断面と仮定して応力−ひずみ曲線を作製した。応力値をこの繊維の初期断面積に対して標準化した。ひずみは、ｄＬ／Ｌ0（Ｌ0はこの繊維の初期の長さでありｄＬは繊維の長さの変化率である）に対応する。図９では、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の二倍に引き延ばした繊維（ｄｏｕｂｌｅ ｄｒａｗｎ ｆｉｂｅｒｓ）の三つの異なるサンプルについての応力−ひずみ曲線が示されており、これらの引張強度はおよそ０.２ＧＰａであることが測定された。
この繊維の微視的構造をＳＥＭにより分析した（図１０）。自発的に形成された繊維は、均一で平らな外観および数百マイクロメートルまでの幅を有し、高さは数十マイクロメートルと測定された（図１０ａ、ｂ）。
繊維を延伸−弛緩サイクルに供した後のそれらの断面は、フィブリルが緊密に整列したコンパクトなサブ構造を有するより丸みを帯びた形状を有していた（図１０ｃ〜ｆ）。切断面または破損面の外見（図１０ｅ、ｆ）は、生産された繊維の緊密さをさらに証明するものであった。
結論として、自発的に形成された繊維は、紡糸せずとも、ネイティブのまたは再生されたクモ糸繊維と類似の形態および機械的特性を示す。
【０１１４】
実施例１２ Ｓｐｉｄｒｏｉｎタンパク質バリアント
クモ糸の優れた引張強度には、強力な分子間相互作用が寄与しているものと考えた。従って、繊維内での分子間共有結合性架橋を可能とするミニチュアスピドロインのバリアントを作製した。二つの異なる変異型スピドロインタンパク質を、部位特異的変異誘発によりそれぞれ第一（配列番号１４、３６位および３７番目）ならびに第四（配列番号１５、１２８位および１２９番目）アラニンブロックに二つのシステイン残基を導入することによって構築した。これらのバリアントを発現させ、実施例５〜６において構築された遺伝子について実施例７〜８に記載されているのと同じプロトコルを用いて単離した。これらのバリアント（配列番号１４〜１５）は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）と同じ様式で繊維を形成した。
Ｃ末端ドメインの二量体化の重要性を解明するため、Ｃ末端ドメインのシステイン残基をセリン残基に交換したバリアントを構築した（配列番号１６、２２２番目）。しかし、このバリアント（配列番号１６）は、５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）と同じ様式で繊維を形成した。
【０１１５】
実施例１３ 発現されたスピドロインタンパク質からのＬＰＳおよび他の発熱物質の除去
所望のスピドロイン融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を以下の緩衝液：
Ａ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｂ：５ｍＭ ＣａＣｌ2、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｃ：１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、
Ｄ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、および
Ｅ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８
で洗浄した。
その後、細胞を、リゾチームおよびＤＮａｓｅＩを補充した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に溶解させた。次いで、このタンパク質サンプルをＮｉ−セファロースマトリクス上にロードし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０〜１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００〜３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で溶出した。関係のあるフラクションをプールし、これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に対して一晩透析した。次いで、このタンパク質サンプルに１００μＭ ＣａＣｌ2を補充し、最後に予め２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１００μＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８で平衡化させておいたＥｎｄｏＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラムを通した。このようにして、ＩＰＴおよびＬＡＬ動態アッセイで判定して発熱物質含量が１ＥＵ／ｍｇタンパク質のタンパク質サンプルを獲得することができた。
次いで、トロンビンを１：１０００（ｗ／ｗ）のトロンビン：融合タンパク質比で用いて、この融合タンパク質をタンパク質分解により切断し、（上記のように）繊維の形成を誘導した。この繊維を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で三回、最後に水で三回洗浄した。これにより、発熱物質含量が０.２５ＥＵ／ｍｇ繊維の繊維を得た。
【０１１６】
この繊維の構造上の特徴は、１２５℃および１.５バールで１０分間のオートクレーブ処理によって影響を受けず、この素材を効果的に滅菌することができた。この繊維は化学的に安定であり、８Ｍ尿素、６Ｍ ＧｕａＨＣｌ、または純粋なＨＡｃのいずれによっても溶解させることができなかった。しかし、この繊維は、純粋なＨＦＩＰまたはギ酸によって溶解させることができた。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復部分、すなわち配列番号３内のセグメントのアラインメントである。
【図２】Ａは、ユープロステノプス オーストラリス ＭａＳｐ１タンパク質の反復部分（配列番号３）の概略的な、予測される構造的構成を表す。Ｂは、実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質（配列番号９〜１３）の概略的な、予測される構造的構成を表す。
【図３】ＭａＳｐ１およびＭａＳｐ２のＣ末端領域のアラインメントであり、それらの保存的性質を表している。
【図４】実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質から形成された繊維の巨視的な外観を表す。（Ａ）６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhybタンパク質（配列番号１３）繊維、バーは０.５ｃｍ；（Ｂ）５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）タンパク質繊維、バーは１ｃｍ；（Ｃ）５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）タンパク質繊維、バーは１ｃｍ。
【図５】実施例５〜８に従い構築されたスピドロインタンパク質から形成された繊維の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）製の一本の繊維（ａ）およびゲル相（ｂ、ｃ）。５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）の繊維を７５％メタノール中で引っ張り、風乾させ、ＳＥＭスタブに適用した（ｄ、ｅ、ｆ）。風乾前のねじれた繊維（ｅ）、繊維の端部（ｆ）。
【図６】６Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴhyb（配列番号１３）繊維の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
【図７】マウスマスト細胞の毒性試験の結果を表し、インビトロ生産されたクモ糸繊維の存在下または非存在下での三日間の培養後の生存細胞および死滅細胞の数を示している。
【図８】生体適合性研究においてインビトロ生産されたクモ糸繊維にさらした後のＨＥＫ２９３細胞の図である。
【図９】５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の二倍に引き延ばされた繊維の引張強度を示す応力−ひずみ曲線である。
【図１０】５Ｇｌｙ／Ａｌａ−ＣＴnat（配列番号９）製の組換え繊維のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。ａ、ｂ、自発的に形成された繊維。拡大画像（ｂ）は、フィブリルの細部構造を示す。突出した小さなフィブリル（矢印）は、約３００ｎｍの幅を有する。ｃ〜ｆ、二回の延伸−弛緩サイクル後の繊維。ｃおよびｄは同じ繊維を異なる倍率で示している。ｅは切断繊維面を示し、ｆは引張試験後の破損箇所を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５０〜４２０アミノ酸残基からなり、式ＲＥＰ−ＣＴ
［式中、
ＲＥＰは、８０〜３００アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、ここで、該フラグメントは、Ｌ（ＡＧ）nＬ、Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、Ｌ（ＧＡ）nＬ、Ｌ（ＧＡ）nＧＬ
（ここで、
ｎは４〜８の整数であり；
各個々のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０〜３個がＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；かつ
各個々のＬセグメントは、０〜２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である）
の群から選択され；そして
ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、このフラグメントは大瓶状腺スピドロインタンパク質由来のＣ末端フラグメントである］
により定義されることを特徴とする、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質。
【請求項２】
各個々のＡセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
各個々のＡセグメントが、請求項２に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列である、請求項２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
各個々のＧセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号５〜７；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
各個々のＧセグメントが、請求項４に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列と同一である、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
ＣＴフラグメントが、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、または配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、および配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
ＣＴフラグメントが、請求項６に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列である、請求項６に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、および第二タンパク質フラグメントからなる単離された融合タンパク質であって、第二タンパク質フラグメントが融合パートナーおよび切断剤認識部位を含み、ここで第一タンパク質フラグメントが切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合されることを特徴とする、単離された融合タンパク質。
【請求項９】
Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘ
（式中、
ＲＥＰおよびＣＴは請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントであり；そして
Ｘは融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントであり；
ここで、タンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される）
の群から選択される、単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）請求項８または９に記載の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；および、場合により
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に規定された大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
（ｉ）請求項８または９に記載の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程；および、場合により
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離する工程、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に規定された大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１３】
請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適した宿主において発現させる工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程、
を含む、請求項８または９に記載の可溶性融合タンパク質の生産方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適した宿主において発現させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；および、場合により
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適する宿主において発現させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程；および、場合により
（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー。
【請求項１８】
請求項１１および１６のいずれか一項に記載の方法により得られる、大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー。
【請求項１９】
融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの、切断剤認識部位を介してクモ糸タンパク質フラグメントに結合された上記タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質を生産するための使用。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２〜１６をコードする核酸配列、またはその相補的核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項２１】
クモ糸タンパク質をコードする非天然型遺伝子を生産するための、請求項２０に記載の単離されたポリ核酸分子の使用。
【請求項２２】
工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程（ｉｉｉ）がさらに、該液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、該重合が該界面または界面付近の領域で開始される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程（ｖ）がさらに、該液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、該重合が該界面または界面付近の領域で開始される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
液体媒体が水性媒体であり、別の相が空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性融合タンパク質を単離する工程（ｉｉ）が、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
可溶性融合タンパク質を単離する工程（ｉｉ）、および場合により大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する工程（ｖ）が、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＰＳおよび他の発熱物質の含量が１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である、請求項８または９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２８】
ＬＰＳおよび他の発熱物質の含量が１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質。
【請求項１】
１５０〜４２０アミノ酸残基からなり、式ＲＥＰ−ＣＴ
［式中、
ＲＥＰは、８０〜３００アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、ここで、該フラグメントは、Ｌ（ＡＧ）nＬ、Ｌ（ＡＧ）nＡＬ、Ｌ（ＧＡ）nＬ、Ｌ（ＧＡ）nＧＬ
（ここで、
ｎは４〜８の整数であり；
各個々のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０〜３個がＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；かつ
各個々のＬセグメントは、０〜２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である）
の群から選択され；そして
ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基を有するタンパク質フラグメントであり、このフラグメントは大瓶状腺スピドロインタンパク質由来のＣ末端フラグメントである］
により定義されることを特徴とする、単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質。
【請求項２】
各個々のＡセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２、および１０６０〜１０７３；配列番号９のアミノ酸残基３１〜４２、６１〜７５、９０〜１０４、１２２〜１３５、および１５３〜１７１；配列番号１３のアミノ酸残基１２〜２５、４６〜６０、７５〜８８、１１２〜１１９、１５０〜１５８、および１７３〜１８０；配列番号１４のアミノ酸残基３１〜４２；ならびに配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
各個々のＡセグメントが、請求項２に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列である、請求項２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
各個々のＧセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９、および１０７４〜１０９２；配列番号５〜７；配列番号９のアミノ酸残基１１〜３０、４３〜６０、７６〜８９、１０５〜１２１、および１３６〜１５２；ならびに配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１、２６〜４５、６１〜７４、８９〜１１１、１２０〜１４９、および１５９〜１７２の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
各個々のＧセグメントが、請求項４に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列と同一である、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
ＣＴフラグメントが、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、または配列番号４、配列番号９のアミノ酸残基１７２〜２６９、配列番号１３のアミノ酸残基１８１〜２７６、および配列番号１６のアミノ酸残基１７２〜２６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
ＣＴフラグメントが、請求項６に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列である、請求項６に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
大瓶状腺スピドロインタンパク質である第一タンパク質フラグメント、および第二タンパク質フラグメントからなる単離された融合タンパク質であって、第二タンパク質フラグメントが融合パートナーおよび切断剤認識部位を含み、ここで第一タンパク質フラグメントが切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合されることを特徴とする、単離された融合タンパク質。
【請求項９】
Ｘ−ＲＥＰ−ＣＴおよびＲＥＰ−ＣＴ−Ｘ
（式中、
ＲＥＰおよびＣＴは請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントであり；そして
Ｘは融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントであり；
ここで、タンパク質フラグメント結合体ＲＥＰ−ＣＴは切断剤認識部位を介して融合パートナーに結合される）
の群から選択される、単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）請求項８または９に記載の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；および、場合により
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に規定された大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
（ｉ）請求項８または９に記載の融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｉ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程；および、場合により
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離する工程、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に規定された大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１３】
請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適した宿主において発現させる工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程、
を含む、請求項８または９に記載の可溶性融合タンパク質の生産方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適した宿主において発現させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；および、場合により
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１３に記載のポリ核酸分子を適する宿主において発現させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた可溶性融合タンパク質を単離する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた上記可溶性融合タンパク質の液体媒体中溶液を供給する工程、
（ｉｖ）融合タンパク質の切断剤認識部位での切断を達成するのに適した切断剤を上記液体媒体に加え、それによって大瓶状腺スピドロインタンパク質を得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程；および、場合により
（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたポリマーを上記液体媒体から単離する工程、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマーの生産方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー。
【請求項１８】
請求項１１および１６のいずれか一項に記載の方法により得られる、大瓶状腺スピドロインタンパク質のポリマー。
【請求項１９】
融合パートナーおよび切断剤認識部位を含むタンパク質フラグメントの、切断剤認識部位を介してクモ糸タンパク質フラグメントに結合された上記タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質を生産するための使用。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２〜１６をコードする核酸配列、またはその相補的核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリ核酸分子。
【請求項２１】
クモ糸タンパク質をコードする非天然型遺伝子を生産するための、請求項２０に記載の単離されたポリ核酸分子の使用。
【請求項２２】
工程（ｉｉ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程（ｉｉｉ）がさらに、該液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、該重合が該界面または界面付近の領域で開始される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉｖ）において得られた大瓶状腺スピドロインタンパク質を液体媒体中で重合させる工程（ｖ）がさらに、該液体媒体と、気相、液相、および固相からなる群より選択される別の相との間の界面を提供することを含み、該重合が該界面または界面付近の領域で開始される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
液体媒体が水性媒体であり、別の相が空気および水不混和性の有機溶媒からなる群より選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性融合タンパク質を単離する工程（ｉｉ）が、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
可溶性融合タンパク質を単離する工程（ｉｉ）、および場合により大瓶状腺スピドロインタンパク質を単離する工程（ｖ）が、ＬＰＳおよび他の発熱物質の除去を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＰＳおよび他の発熱物質の含量が１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である、請求項８または９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２８】
ＬＰＳおよび他の発熱物質の含量が１ ＥＵ／ｍｇタンパク質またはそれ未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された大瓶状腺スピドロインタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５２１９２１（Ｐ２００９−５２１９２１Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８４６３（Ｐ２００８−５４８４６３）
【出願日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００６／００１５０５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８２３９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８１９４６６３）スパイバー・テクノロジーズ・アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００６／００１５０５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８２３９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８１９４６６３）スパイバー・テクノロジーズ・アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
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