ケノデオキシコール酸の精製方法
本発明は、ケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コール酸）を精製する方法に関する。特に、本発明は、ブタ胆汁固形化物に含まれる低級のケノデオキシコール酸混合物から高収率及び高純度でケノデオキシコール酸を精製する方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コール酸）を精製する方法に関する。特に、ブタ胆汁固形化物に含まれる低級のケノデオキシコール酸混合物からケノデオキシコール酸を、高収率及び高純度で精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ケノデオキシコール酸は、牛、豚、熊、または鶏若しくはガチョウなどの家禽類の胆汁に含まれ、更にヒトの胆汁にも含まれている。ケノデオキシコール酸は、胆管系疾患、高脂血症、胆石症及び慢性肝疾患の改善に効果を有するウルソデオキシコール酸の出発物質として用いられており、当該技術分野で下記のような製造方法が知られている。
【０００３】
ケノデオキシコール酸を製造するための一般的な方法は、コール酸（３α，７α，１２α−トリヒドロキシコール酸）のメチルエステル化工程、無水酢酸を用いる３α−及び７α−位の水酸基のアセチル化による保護化工程、１２α−位の水酸基をクロム酸で酸化してカルボニルにした後、ウォルフ・キッシュナー（Wolff-kichner）還元反応でカルボニル基を除去する工程、加水分解及び脱保護化してケノデオキシコール酸を得る工程で構成される。上記方法は、ウォルフ・キッシュナー還元反応時、２００℃以上の高温を保持する必要があり、また、狂牛病などにより原料供給に支障が起こることがある。
【０００４】
家禽類の胆汁には、ケノデオキシコール酸、リトコール酸（lithocholic acid）及び微量のコール酸が含まれている。従って、家禽類からケノデオキシコール酸を分離する方法も当該技術分野でよく知られているが、原料供給減少及び収率低下によって経済性が高くない（非特許文献１）。
【０００５】
天然ブタ胆汁のケノデオキシコール酸混合物からケノデオキシコール酸を純粋に分離精製する方法は、米国特許第４１８６１４３号（特許文献１）に記載されている。上記方法は、主要工程として、胆汁をケン化して、３α−ヒドロキシ−６−オキソ−５β−コール酸を除去する前処理工程、胆汁酸のエステル化工程、胆汁酸エステルのアセチル化工程、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去工程、アセチル化された式（Ｉ）のエステルの結晶化工程、脱保護化工程、有機溶媒での結晶化による式（Ｉ）の化合物の取得する工程を含んでいる。しかし、上記方法は、アセチル化された式（Ｉ）のエステルのＨＰＬＣ含有量に対する記載がなく、比旋光度が［α］Ｄ２５ ＋１３．８°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）であり、融点が１１９〜１２１℃であるため、目的化合物の純度が非常に低い［ＳＴＤ：［α］Ｄ２５ ＋１５．２°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）、融点１２７〜１２９℃］。また、目的化合物精製のための結晶化に必要とされる時間が、１６〜４８時間と非常に長く、全体工程が８工程であり、工程が複雑である。従って、上記方法により式（Ｉ）の化合物を精製する場合、収率が低くなり、全体工程の反応時間が１２日と非常に長く、経済性が大きく落ちる。
【０００６】
特に、上記方法に従って、本発明に用いられるケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を用いる場合、結晶化過程で不純物が一緒に沈澱し、互いに凝固し合うことによって、撹拌及び濾過ができない問題を有している。
【特許文献１】米国特許第４１８６１４３号
【非特許文献１】Windhaus et al, I Physiol. Chem., 140, 177〜185 (1924)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記問題点を解決するために、本発明の目的は、全工程に必要とされる時間を短縮しながら、高収率及び高純度で式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物を精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、ブタ胆汁の前処理、胆汁酸のエステル化、胆汁酸エステルのアセチル化、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去、アセチル化された胆汁酸エステルの結晶化及び脱保護化の各工程を含む、式（Ｉ）の化合物を精製する方法を提供し、
１）前処理工程として、塩を含む有機溶媒にケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を溶解させること、
２）結晶化工程として、１５〜２５℃の温度範囲で、Ｃ１−４アルコールで結晶化させること、
３）脱保護化工程として、結晶化工程の生成物に、塩基を加え、脱保護化し、酸を加えて水の存在下に結晶化させることを特徴とする式（Ｉ）の化合物の精製方法。
【０００９】
【化００３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で用いる用語「ブタ胆汁固形化物」は、ブタ胆汁由来の固形化物を意味し、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のケノデオキシコール酸の混合物を含んでいる。
【００１１】
【化００４】
【００１２】
式中、式（Ｉ）の化合物はケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コール酸、ＣＤＣＡ）であり、式（ＩＩ）の化合物はヒオデオキシコール酸（３α，６α−ジヒドロキシ−５β−コール酸、ＨＤＣＡ）であり、式（ＩＩＩ）の化合物はヒオコール酸（３α，６α，７α−トリヒドロキシ−５β−コール酸、ＨＣＡ）であり、式（ＩＶ）の化合物は３α−ヒドロキシ−６−オキソ−５β−コール酸（ｋｅｔｏ）を表す。
【００１３】
以下では、ケノデオキシコール酸を精製するための本願発明の各工程を詳細に説明する。
【００１４】
第１工程：ブタ胆汁固形化物の前処理
ケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を精製工程に使用するために、塩を含む有機溶媒で還流攪拌し、ブタ胆汁固形化物を全て溶解する。その後、混合物を室温に冷却し、１〜２時間攪拌し、そして、濾過紙、好ましくは濾過紙及び硅藻土を用いて濾過することによって、不溶物を除去する。有機溶媒は、減圧下で除去することによって、次の工程で使用するための残留物（例えば、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＨＣＡ及びｋｅｔｏ）を得る。本工程に用いられる塩は、化合物に影響を及ぼさない限り、任意に選択することができる。塩化ナトリウム、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）及び無水硫酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１つの塩が好ましく、塩化ナトリウムが最も好ましい。本工程に用いられる塩の量は、有機溶媒の量に対して、５〜１０重量％使用することが好ましい。塩の量が５重量％未満のとき、ブタ胆汁固形化物中の不溶物（脂肪酸など）及び水分が十分に除去されず、濾過が難しく、エステル化反応の収率及び速度が低下する。塩の量が１０重量％を超えるとき、過剰な塩が、精製を難しくする不純物として残存することになる。有機溶媒は、好ましくは、ブタ胆汁固形化物に入っているケノデオキシコール酸に悪影響を与えずに、これらを溶解することができる溶媒の中から任意に選択することができる。より好ましくは、酢酸エチル、アセトンである。
【００１５】
第２工程：ケノデオキシコール酸のエステル化
前工程から得られたケノデオキシコール酸混合残留物にアルコールを加えて、完全に溶けるまで還流攪拌する。ケノデオキシコール酸混合物が完全に溶解された後、溶液を０〜５℃に冷却する。上記溶液に酸触媒を加え、ケノデオキシコール酸混合物のエステル化反応が終結するまで室温で溶液を攪拌する。反応が終結すると、塩基を加えて溶液を中和させ、反応液を濾過する。濾過物をアルコールで洗浄した後、減圧濃縮してケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＣＡ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ｍｅ）を残留物として得る。本工程に用いられるアルコールは、特に制限されないが、エステル化反応の容易性などを考慮すると、炭素数１〜４の低級アルコールが好ましく、メタノールがさらに好ましい。本工程に用いられる酸触媒は、好ましくは硫酸、パラトルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）であり、塩基は炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムが使用される。
【００１６】
第３工程：ケノデオキシコール酸エステルのアセチル化
前工程から得られた残留物に、無水酢酸及び弱塩基を加え、還流させ、ケノデオキシコール酸エステル混合物の水酸基を全てアセチルに変換する。反応が終結した後、反応液にトルエンを加え、還流撹拌する。反応後残存する無水酢酸、酢酸及び塩基を還流攪拌し、減圧下にて反応液を濃縮して除去し、アセチル化されたケノデオキシコール酸エステルの混合物（例えば、ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ）を残留物として得る。本工程に用いられる好ましい弱塩基は、無水酢酸ナトリウムまたはピリジンであり、より好ましくは無水酢酸ナトリウムである。
【００１７】
第４工程：式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物の除去
残留物に非極性溶媒を加え、残留物が全て溶解するまで還流撹拌した後、室温に冷却する。溶媒の温度を２０〜２５℃に保持しながら、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物と式（ＩＩ）の中間生成物の一部（例えば、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ及び一部のＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を結晶化し、濾過して除去する。濾過物を、非極性溶媒でさらに洗浄し、濾液と洗浄液を集めて、減圧濃縮または真空乾燥させる。本工程の結晶化に用いられる非極性溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはイソオクタンなどが好ましく、ヘキサンまたはヘプタンがさらに好ましい。
【００１８】
第５工程：ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルの製造
式（Ｉ）の中間生成物である式（Ｖ）のケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステル（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を製造するために、前工程の生成物に、アルコール溶媒を加え、そして１５〜２５℃、好ましくは２０〜２５℃にて２〜３時間静置し、式（Ｖ）の化合物を結晶化させる。温度が１５℃未満の場合、式（Ｖ）の化合物が凝固し、撹拌及び濾過が難しく、２５℃を超える場合、結晶化が十分に行われない。式（Ｖ）の化合物が結晶化すると、これを濾過し、式（ＩＩ）の中間生成物を溶媒から除去する。濾過物をアルコール溶媒で洗浄し、真空乾燥し、式（Ｖ）のケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルを粗生成物として得る。式（Ｖ）の化合物を高純度で、好ましくは９９％以上の含有量で精製するために、アルコール溶媒を加え、０℃〜１５℃、好ましくは０℃〜５℃にて２〜３時間静置し、再結晶化することが好ましい。温度が０℃未満の場合、式（Ｖ）の化合物の収量が減少し、１５℃を超える場合にも再結晶化が行われるものの、収量が減少する。結晶化に用いられるアルコール溶媒は、炭素数１〜４個の直鎖または分岐鎖のアルコールが好ましく、エタノール、メタノール、イソプロパノールがさらに好ましく、式（Ｖ）の化合物の含有量からメタノールが最も好ましい。結晶化に用いられるアルコールの量は、残留物の量に対して、０．５〜３倍、好ましくは１．５〜３倍である。０．５倍未満のときは結晶が凝固して濾過が難しくなり、３倍以上のときは式（Ｖ）の化合物の含有量に影響を与えない。
【００１９】
【化００５】
【００２０】
第６工程：脱保護化及びケノデオキシコール酸の結晶化
前工程から得られた式（Ｉ）の化合物の中間生成物である式（Ｖ）の化合物を、塩基存在下で脱保護化し、酸性条件でｐＨを４以下、好ましくは２〜３に調節し、式（Ｉ）のケノデオキシコール酸を形成させる。同時に、反応溶液を３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で静置し、水の存在下に式（Ｉ）の化合物を結晶化させる。反応液を濾過し、濾過物を水で洗浄し、真空乾燥し、ケノデオキシコール酸を純粋に精製する。脱保護化に用いられる塩基は、特に制限されないが、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使用することが、後処理過程のために好ましい。ｐＨが４以上のとき、結晶が形成されず、ｐＨが２未満のとき、過剰の酸により最終産物の純度が落ちる。水での結晶化温度が３５℃未満のとき、式（Ｉ）の化合物の純度が落ち、４５℃以上のとき、式（Ｉ）の化合物の結晶が凝固して濾過が難しい。また、反応液の中和に用いられる酸も、特に制限されないが、塩酸または硫酸を使用することが、後処理過程のために好ましい。前工程から得られた残留物に、式（Ｖ）の化合物が９９％以上含まれているので、不純物含有量が少なく、有機溶媒を用いた追加の結晶化過程無しに、式（Ｉ）の化合物を純粋に精製することができる。本発明によって水中で結晶化された式（Ｉ）の化合物は、有機溶媒で結晶化された式（Ｉ）の化合物に比べて、融点が約２０℃以上高く、嵩高が小さく、工業的生産工程に好適である。
【００２１】
本発明を以下の実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【００２２】
分析方法
各工程から分離される中間生成物を確認するために、ＨＰＬＣを利用しており、試験条件は次の通りである。
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＵＧ１２０ Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）
移動相：アセトニトリル／水（８５：１５）
検出器：紫外吸光光度計（２１０ｎｍ）
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：２０μＬ
【００２３】
（実施例）
第１工程：ブタ胆汁固形化物の前処理
ケノデオキシコール酸を３５〜４０重量％含有するブタ胆汁固形化物６００ｇと塩化ナトリウム２４０ｇを、酢酸エチル２４００ｍＬ中で１時間還流攪拌し、ブタ胆汁固形化物を全て溶解した。その後、混合物の温度を２０〜２５℃に冷却し、１時間撹拌し、そして、硅藻土で濾過し、濾過物を酢酸エチル２４０ｍＬで洗浄した。濾液を集めて減圧下にて濃縮して、有機溶媒を除去し、ケノデオキシコール酸混合物（ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＨＣＡ及びｋｅｔｏ）を残留物として得た。
【００２４】
第２工程：ケノデオキシコール酸のエステル化
前工程から得られた残留物に、メタノール１５００ｍＬを加え、完全に溶けるまで３０分間還流攪拌した。この溶液を、０〜１０℃に冷却し、攪拌しながら硫酸１９．５ｍＬを加え、２０〜２５℃で２時間攪拌し、ケノデオキシコール酸混合物のエステル化反応を完結させた。エステル化反応が終結した後、炭酸水素ナトリウム５３．９ｇを加えて溶液を中和し、濾過した。濾過物をメタノール６００ｍＬで洗浄し、減圧濃縮し、５３４ｇのケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＣＡ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ｍｅ）を残留物として得た。
【００２５】
第３工程：ケノデオキシコール酸エステルのアセチル化
前工程から得られたケノデオキシコール酸エステル混合物５３４ｇに、無水酢酸ナトリウム８０ｇと無水酢酸８００ｍＬを加え、１２０〜１４０℃で５時間還流させた後、反応液を直ちに減圧濃縮した。反応液にトルエン１００ｍＬを加え、１５分間還流撹拌した後、減圧濃縮し、無水酢酸及び酢酸を完全に除去し、アセチル化されたケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ）を残留物として得た。
残留物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ（８．７６分）、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ（９．０５分）、ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）及びＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．８１分）
【００２６】
第４工程：式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物の除去
前工程から得られた残留物に、非極性溶媒であるヘキサン２６７０ｍＬを加え、３０分間還流攪拌した。その後、ヘキサン溶媒を冷却し、２５〜３５℃で３時間攪拌し、濾過した。濾過物（ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ及び一部のＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）は、ヘキサン５３４ｍＬを用いてさらに洗浄し、濾液及び洗浄液を集めて減圧濃縮し、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の中間生成物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を残留物として得た。
残留物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）及びＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．８１分）
【００２７】
第５工程：ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルの製造
前工程から得られた残留物に、メタノール８０１ｍＬを加え、３０分間還流攪拌し、そして２０〜２５℃に冷却し、２時間攪拌し、濾過した。濾過物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）をメタノール２６７ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥し、含有量９５〜９８％の粗生成物を得た。その後、メタノール２８８ｍＬを加え、温度を０〜５℃にして２時間、再結晶化を実施し、含有量９９％のケノデオキシコール酸−ジアセテート−エステルを得た。収量は、１４３ｇ（１１３．８ｇ＋母液：２９．２ｇ）であった。
ｍ．ｐ．：１２８〜１２９℃
生成物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）
【００２８】
第６工程：脱保護化及びケノデオキシコール酸の結晶化
ケノデオキシコール酸−ジアセテート−エステル１４３ｇと水酸化ナトリウム１７１ｇを水１４２５ｍＬに加え、４時間還流撹拌した。塩酸３４２ｍＬを使用してｐＨを２〜３に調節し、３５〜４５℃で１時間撹拌した後、濾過した。濾過物を水１４２ｍＬで洗浄し、７０℃で真空乾燥して純粋なケノデオキシコール酸１１３．８ｇを得た。
ｍ．ｐ．：１６０〜１６１℃、［α]Ｄ２５ ＋１３．０°［ｃ＝１，ＣＨＣｌ３］
【００２９】
（比較例）
第１工程：胆汁の前処理
濃縮したブタ胆汁１５０ｇを熱水１０００ｍＬに溶かした。その後、水酸化ナトリウム１００ｇを加え、２０時間還流攪拌した。この溶液を２５℃に冷却し、水１５００ｍＬを加え、１日間冷蔵放置した。反応溶液に硅藻土１０ｇを加え、撹拌及び濾過し、沈澱した式（ＩＶ）の３α−ヒドロキシ−６−ケトコール酸ナトリウムを除去した。濾液を、濃硫酸を用いてｐＨ８に調節し、ヒドロ亜硫酸ナトリウム５ｇを加え、１５分間攪拌した。その後、酢酸エチル４００ｍＬを加え、希硫酸でｐＨ５に調節した。溶液を３０分間攪拌し、層分離して水溶液層を除去した。硅藻土７ｇと活性炭７ｇを有機層に加え、３０分間撹拌及び濾過し、濾過物を酢酸エチル５０ｍＬで洗浄し、減圧濃縮した。
【００３０】
第２工程：胆汁酸のエステル化
前工程から得られた残留物をメタノール３００ｍＬに溶かし、濃硫酸４．０ｍＬを加え、室温で１日攪拌した。その後、炭酸水素ナトリウムで中和（ｐＨ７）し、濾過し、減圧濃縮した。
【００３１】
第３工程：式（ＩＩ）のメチルエステルの除去
前工程から得られた残留物を３２０ｍＬの熱ベンゼンに溶かし、２２５ｍＬに濃縮した後、１日間冷蔵放置した。その後、濾過し、濾過物（式（ＩＩ）のメチルエステルベンゼン付加物）をベンゼンで洗浄し、ベンゼン濾液と洗浄液を減圧濃縮した。
【００３２】
第４工程：胆汁酸エステルのアセチル化
前工程から得られた残留物に、無水酢酸７５ｍＬと無水酢酸ナトリウム７．５ｇを加え、５時間還流攪拌した。残った無水酢酸を蒸留して除去し、そしてメタノール３５ｍＬを加えた後、１５分間還流攪拌し、減圧蒸留して残っている無水酢酸を除去した。
【００３３】
第５工程：アセチル化された式（ＩＩＩ）のエステルの除去
前工程から得られた残留物を、ヘキサン溶媒２００ｍＬで還流し、この溶液を２０℃で、１日放置した。この懸濁液を濾過し、濾過物（粗結晶のＨＤＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ）をヘキサンで洗浄し、濾液と洗浄液を集めて減圧蒸留した。
【００３４】
第６工程：式（Ｖ）の化合物の分離
前工程から得られた残留物を、熱エタノール４６ｍＬに溶かした後、１日間冷蔵放置した。懸濁液を濾過し、濾過物を冷エタノール２７ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥した。式（Ｖ）の化合物２１．５ｇを、３倍量のエタノールで再結晶化し、１８．５ｇの生成物を得た。
ｍ．ｐ．１１９〜１２１℃；［α］Ｄ２５ ＋１０．４°（ｃ＝１，ジオキサン）；［α］Ｄ２５ ＋１３．８°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３)
【００３５】
第７工程：ケン化及び中和
ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステル１８．５ｇと水酸化ナトリウム１８．５ｇを水１８５ｍＬに加え、１４時間還流攪拌した。その後、濃硫酸でｐＨを４．５に調節した。
【００３６】
第８工程：式（Ｉ）の化合物の製造
前工程の反応液を酢酸エチルで抽出し、水溶液層を捨てた。酢酸エチル層を６％の塩水で洗浄し、約９０ｍＬに蒸留した。この溶液を冷却し、ヘキサン９０ｍＬを加え、１日間冷蔵放置した。この懸濁液を濾過し、濾過物をヘキサン２０ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥し、１２．７ｇのケノデオキシコール酸を得た。
ｍ．ｐ．１４２〜１４５℃；［α］Ｄ２５ ＋１３．０°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、ブタ胆汁固形化物から式（Ｉ）のケノデオキシコール酸を高収率及び高純度で精製することができる。また、本発明は精製時間を短縮することによって工業的精製に好適である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コール酸）を精製する方法に関する。特に、ブタ胆汁固形化物に含まれる低級のケノデオキシコール酸混合物からケノデオキシコール酸を、高収率及び高純度で精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ケノデオキシコール酸は、牛、豚、熊、または鶏若しくはガチョウなどの家禽類の胆汁に含まれ、更にヒトの胆汁にも含まれている。ケノデオキシコール酸は、胆管系疾患、高脂血症、胆石症及び慢性肝疾患の改善に効果を有するウルソデオキシコール酸の出発物質として用いられており、当該技術分野で下記のような製造方法が知られている。
【０００３】
ケノデオキシコール酸を製造するための一般的な方法は、コール酸（３α，７α，１２α−トリヒドロキシコール酸）のメチルエステル化工程、無水酢酸を用いる３α−及び７α−位の水酸基のアセチル化による保護化工程、１２α−位の水酸基をクロム酸で酸化してカルボニルにした後、ウォルフ・キッシュナー（Wolff-kichner）還元反応でカルボニル基を除去する工程、加水分解及び脱保護化してケノデオキシコール酸を得る工程で構成される。上記方法は、ウォルフ・キッシュナー還元反応時、２００℃以上の高温を保持する必要があり、また、狂牛病などにより原料供給に支障が起こることがある。
【０００４】
家禽類の胆汁には、ケノデオキシコール酸、リトコール酸（lithocholic acid）及び微量のコール酸が含まれている。従って、家禽類からケノデオキシコール酸を分離する方法も当該技術分野でよく知られているが、原料供給減少及び収率低下によって経済性が高くない（非特許文献１）。
【０００５】
天然ブタ胆汁のケノデオキシコール酸混合物からケノデオキシコール酸を純粋に分離精製する方法は、米国特許第４１８６１４３号（特許文献１）に記載されている。上記方法は、主要工程として、胆汁をケン化して、３α−ヒドロキシ−６−オキソ−５β−コール酸を除去する前処理工程、胆汁酸のエステル化工程、胆汁酸エステルのアセチル化工程、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去工程、アセチル化された式（Ｉ）のエステルの結晶化工程、脱保護化工程、有機溶媒での結晶化による式（Ｉ）の化合物の取得する工程を含んでいる。しかし、上記方法は、アセチル化された式（Ｉ）のエステルのＨＰＬＣ含有量に対する記載がなく、比旋光度が［α］Ｄ２５ ＋１３．８°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）であり、融点が１１９〜１２１℃であるため、目的化合物の純度が非常に低い［ＳＴＤ：［α］Ｄ２５ ＋１５．２°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）、融点１２７〜１２９℃］。また、目的化合物精製のための結晶化に必要とされる時間が、１６〜４８時間と非常に長く、全体工程が８工程であり、工程が複雑である。従って、上記方法により式（Ｉ）の化合物を精製する場合、収率が低くなり、全体工程の反応時間が１２日と非常に長く、経済性が大きく落ちる。
【０００６】
特に、上記方法に従って、本発明に用いられるケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を用いる場合、結晶化過程で不純物が一緒に沈澱し、互いに凝固し合うことによって、撹拌及び濾過ができない問題を有している。
【特許文献１】米国特許第４１８６１４３号
【非特許文献１】Windhaus et al, I Physiol. Chem., 140, 177〜185 (1924)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記問題点を解決するために、本発明の目的は、全工程に必要とされる時間を短縮しながら、高収率及び高純度で式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物を精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、ブタ胆汁の前処理、胆汁酸のエステル化、胆汁酸エステルのアセチル化、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去、アセチル化された胆汁酸エステルの結晶化及び脱保護化の各工程を含む、式（Ｉ）の化合物を精製する方法を提供し、
１）前処理工程として、塩を含む有機溶媒にケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を溶解させること、
２）結晶化工程として、１５〜２５℃の温度範囲で、Ｃ１−４アルコールで結晶化させること、
３）脱保護化工程として、結晶化工程の生成物に、塩基を加え、脱保護化し、酸を加えて水の存在下に結晶化させることを特徴とする式（Ｉ）の化合物の精製方法。
【０００９】
【化００３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で用いる用語「ブタ胆汁固形化物」は、ブタ胆汁由来の固形化物を意味し、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のケノデオキシコール酸の混合物を含んでいる。
【００１１】
【化００４】
【００１２】
式中、式（Ｉ）の化合物はケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コール酸、ＣＤＣＡ）であり、式（ＩＩ）の化合物はヒオデオキシコール酸（３α，６α−ジヒドロキシ−５β−コール酸、ＨＤＣＡ）であり、式（ＩＩＩ）の化合物はヒオコール酸（３α，６α，７α−トリヒドロキシ−５β−コール酸、ＨＣＡ）であり、式（ＩＶ）の化合物は３α−ヒドロキシ−６−オキソ−５β−コール酸（ｋｅｔｏ）を表す。
【００１３】
以下では、ケノデオキシコール酸を精製するための本願発明の各工程を詳細に説明する。
【００１４】
第１工程：ブタ胆汁固形化物の前処理
ケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を精製工程に使用するために、塩を含む有機溶媒で還流攪拌し、ブタ胆汁固形化物を全て溶解する。その後、混合物を室温に冷却し、１〜２時間攪拌し、そして、濾過紙、好ましくは濾過紙及び硅藻土を用いて濾過することによって、不溶物を除去する。有機溶媒は、減圧下で除去することによって、次の工程で使用するための残留物（例えば、ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＨＣＡ及びｋｅｔｏ）を得る。本工程に用いられる塩は、化合物に影響を及ぼさない限り、任意に選択することができる。塩化ナトリウム、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）及び無水硫酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１つの塩が好ましく、塩化ナトリウムが最も好ましい。本工程に用いられる塩の量は、有機溶媒の量に対して、５〜１０重量％使用することが好ましい。塩の量が５重量％未満のとき、ブタ胆汁固形化物中の不溶物（脂肪酸など）及び水分が十分に除去されず、濾過が難しく、エステル化反応の収率及び速度が低下する。塩の量が１０重量％を超えるとき、過剰な塩が、精製を難しくする不純物として残存することになる。有機溶媒は、好ましくは、ブタ胆汁固形化物に入っているケノデオキシコール酸に悪影響を与えずに、これらを溶解することができる溶媒の中から任意に選択することができる。より好ましくは、酢酸エチル、アセトンである。
【００１５】
第２工程：ケノデオキシコール酸のエステル化
前工程から得られたケノデオキシコール酸混合残留物にアルコールを加えて、完全に溶けるまで還流攪拌する。ケノデオキシコール酸混合物が完全に溶解された後、溶液を０〜５℃に冷却する。上記溶液に酸触媒を加え、ケノデオキシコール酸混合物のエステル化反応が終結するまで室温で溶液を攪拌する。反応が終結すると、塩基を加えて溶液を中和させ、反応液を濾過する。濾過物をアルコールで洗浄した後、減圧濃縮してケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＣＡ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ｍｅ）を残留物として得る。本工程に用いられるアルコールは、特に制限されないが、エステル化反応の容易性などを考慮すると、炭素数１〜４の低級アルコールが好ましく、メタノールがさらに好ましい。本工程に用いられる酸触媒は、好ましくは硫酸、パラトルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）であり、塩基は炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムが使用される。
【００１６】
第３工程：ケノデオキシコール酸エステルのアセチル化
前工程から得られた残留物に、無水酢酸及び弱塩基を加え、還流させ、ケノデオキシコール酸エステル混合物の水酸基を全てアセチルに変換する。反応が終結した後、反応液にトルエンを加え、還流撹拌する。反応後残存する無水酢酸、酢酸及び塩基を還流攪拌し、減圧下にて反応液を濃縮して除去し、アセチル化されたケノデオキシコール酸エステルの混合物（例えば、ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ）を残留物として得る。本工程に用いられる好ましい弱塩基は、無水酢酸ナトリウムまたはピリジンであり、より好ましくは無水酢酸ナトリウムである。
【００１７】
第４工程：式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物の除去
残留物に非極性溶媒を加え、残留物が全て溶解するまで還流撹拌した後、室温に冷却する。溶媒の温度を２０〜２５℃に保持しながら、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物と式（ＩＩ）の中間生成物の一部（例えば、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ及び一部のＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を結晶化し、濾過して除去する。濾過物を、非極性溶媒でさらに洗浄し、濾液と洗浄液を集めて、減圧濃縮または真空乾燥させる。本工程の結晶化に用いられる非極性溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはイソオクタンなどが好ましく、ヘキサンまたはヘプタンがさらに好ましい。
【００１８】
第５工程：ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルの製造
式（Ｉ）の中間生成物である式（Ｖ）のケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステル（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を製造するために、前工程の生成物に、アルコール溶媒を加え、そして１５〜２５℃、好ましくは２０〜２５℃にて２〜３時間静置し、式（Ｖ）の化合物を結晶化させる。温度が１５℃未満の場合、式（Ｖ）の化合物が凝固し、撹拌及び濾過が難しく、２５℃を超える場合、結晶化が十分に行われない。式（Ｖ）の化合物が結晶化すると、これを濾過し、式（ＩＩ）の中間生成物を溶媒から除去する。濾過物をアルコール溶媒で洗浄し、真空乾燥し、式（Ｖ）のケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルを粗生成物として得る。式（Ｖ）の化合物を高純度で、好ましくは９９％以上の含有量で精製するために、アルコール溶媒を加え、０℃〜１５℃、好ましくは０℃〜５℃にて２〜３時間静置し、再結晶化することが好ましい。温度が０℃未満の場合、式（Ｖ）の化合物の収量が減少し、１５℃を超える場合にも再結晶化が行われるものの、収量が減少する。結晶化に用いられるアルコール溶媒は、炭素数１〜４個の直鎖または分岐鎖のアルコールが好ましく、エタノール、メタノール、イソプロパノールがさらに好ましく、式（Ｖ）の化合物の含有量からメタノールが最も好ましい。結晶化に用いられるアルコールの量は、残留物の量に対して、０．５〜３倍、好ましくは１．５〜３倍である。０．５倍未満のときは結晶が凝固して濾過が難しくなり、３倍以上のときは式（Ｖ）の化合物の含有量に影響を与えない。
【００１９】
【化００５】
【００２０】
第６工程：脱保護化及びケノデオキシコール酸の結晶化
前工程から得られた式（Ｉ）の化合物の中間生成物である式（Ｖ）の化合物を、塩基存在下で脱保護化し、酸性条件でｐＨを４以下、好ましくは２〜３に調節し、式（Ｉ）のケノデオキシコール酸を形成させる。同時に、反応溶液を３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で静置し、水の存在下に式（Ｉ）の化合物を結晶化させる。反応液を濾過し、濾過物を水で洗浄し、真空乾燥し、ケノデオキシコール酸を純粋に精製する。脱保護化に用いられる塩基は、特に制限されないが、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使用することが、後処理過程のために好ましい。ｐＨが４以上のとき、結晶が形成されず、ｐＨが２未満のとき、過剰の酸により最終産物の純度が落ちる。水での結晶化温度が３５℃未満のとき、式（Ｉ）の化合物の純度が落ち、４５℃以上のとき、式（Ｉ）の化合物の結晶が凝固して濾過が難しい。また、反応液の中和に用いられる酸も、特に制限されないが、塩酸または硫酸を使用することが、後処理過程のために好ましい。前工程から得られた残留物に、式（Ｖ）の化合物が９９％以上含まれているので、不純物含有量が少なく、有機溶媒を用いた追加の結晶化過程無しに、式（Ｉ）の化合物を純粋に精製することができる。本発明によって水中で結晶化された式（Ｉ）の化合物は、有機溶媒で結晶化された式（Ｉ）の化合物に比べて、融点が約２０℃以上高く、嵩高が小さく、工業的生産工程に好適である。
【００２１】
本発明を以下の実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【００２２】
分析方法
各工程から分離される中間生成物を確認するために、ＨＰＬＣを利用しており、試験条件は次の通りである。
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＵＧ１２０ Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）
移動相：アセトニトリル／水（８５：１５）
検出器：紫外吸光光度計（２１０ｎｍ）
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：２０μＬ
【００２３】
（実施例）
第１工程：ブタ胆汁固形化物の前処理
ケノデオキシコール酸を３５〜４０重量％含有するブタ胆汁固形化物６００ｇと塩化ナトリウム２４０ｇを、酢酸エチル２４００ｍＬ中で１時間還流攪拌し、ブタ胆汁固形化物を全て溶解した。その後、混合物の温度を２０〜２５℃に冷却し、１時間撹拌し、そして、硅藻土で濾過し、濾過物を酢酸エチル２４０ｍＬで洗浄した。濾液を集めて減圧下にて濃縮して、有機溶媒を除去し、ケノデオキシコール酸混合物（ＣＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＨＣＡ及びｋｅｔｏ）を残留物として得た。
【００２４】
第２工程：ケノデオキシコール酸のエステル化
前工程から得られた残留物に、メタノール１５００ｍＬを加え、完全に溶けるまで３０分間還流攪拌した。この溶液を、０〜１０℃に冷却し、攪拌しながら硫酸１９．５ｍＬを加え、２０〜２５℃で２時間攪拌し、ケノデオキシコール酸混合物のエステル化反応を完結させた。エステル化反応が終結した後、炭酸水素ナトリウム５３．９ｇを加えて溶液を中和し、濾過した。濾過物をメタノール６００ｍＬで洗浄し、減圧濃縮し、５３４ｇのケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−Ｍｅ、ＨＣＡ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ｍｅ）を残留物として得た。
【００２５】
第３工程：ケノデオキシコール酸エステルのアセチル化
前工程から得られたケノデオキシコール酸エステル混合物５３４ｇに、無水酢酸ナトリウム８０ｇと無水酢酸８００ｍＬを加え、１２０〜１４０℃で５時間還流させた後、反応液を直ちに減圧濃縮した。反応液にトルエン１００ｍＬを加え、１５分間還流撹拌した後、減圧濃縮し、無水酢酸及び酢酸を完全に除去し、アセチル化されたケノデオキシコール酸エステル混合物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ及びｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ）を残留物として得た。
残留物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ（８．７６分）、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ（９．０５分）、ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）及びＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．８１分）
【００２６】
第４工程：式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の中間生成物の除去
前工程から得られた残留物に、非極性溶媒であるヘキサン２６７０ｍＬを加え、３０分間還流攪拌した。その後、ヘキサン溶媒を冷却し、２５〜３５℃で３時間攪拌し、濾過した。濾過物（ＨＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ、ｋｅｔｏ−Ａｃ−Ｍｅ及び一部のＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）は、ヘキサン５３４ｍＬを用いてさらに洗浄し、濾液及び洗浄液を集めて減圧濃縮し、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の中間生成物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ、ＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）を残留物として得た。
残留物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）及びＨＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．８１分）
【００２７】
第５工程：ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステルの製造
前工程から得られた残留物に、メタノール８０１ｍＬを加え、３０分間還流攪拌し、そして２０〜２５℃に冷却し、２時間攪拌し、濾過した。濾過物（ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ）をメタノール２６７ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥し、含有量９５〜９８％の粗生成物を得た。その後、メタノール２８８ｍＬを加え、温度を０〜５℃にして２時間、再結晶化を実施し、含有量９９％のケノデオキシコール酸−ジアセテート−エステルを得た。収量は、１４３ｇ（１１３．８ｇ＋母液：２９．２ｇ）であった。
ｍ．ｐ．：１２８〜１２９℃
生成物のＨＰＬＣ結果（ＲＴ）：ＣＤＣＡ−ｄｉＡｃ−Ｍｅ（１２．２１分）
【００２８】
第６工程：脱保護化及びケノデオキシコール酸の結晶化
ケノデオキシコール酸−ジアセテート−エステル１４３ｇと水酸化ナトリウム１７１ｇを水１４２５ｍＬに加え、４時間還流撹拌した。塩酸３４２ｍＬを使用してｐＨを２〜３に調節し、３５〜４５℃で１時間撹拌した後、濾過した。濾過物を水１４２ｍＬで洗浄し、７０℃で真空乾燥して純粋なケノデオキシコール酸１１３．８ｇを得た。
ｍ．ｐ．：１６０〜１６１℃、［α]Ｄ２５ ＋１３．０°［ｃ＝１，ＣＨＣｌ３］
【００２９】
（比較例）
第１工程：胆汁の前処理
濃縮したブタ胆汁１５０ｇを熱水１０００ｍＬに溶かした。その後、水酸化ナトリウム１００ｇを加え、２０時間還流攪拌した。この溶液を２５℃に冷却し、水１５００ｍＬを加え、１日間冷蔵放置した。反応溶液に硅藻土１０ｇを加え、撹拌及び濾過し、沈澱した式（ＩＶ）の３α−ヒドロキシ−６−ケトコール酸ナトリウムを除去した。濾液を、濃硫酸を用いてｐＨ８に調節し、ヒドロ亜硫酸ナトリウム５ｇを加え、１５分間攪拌した。その後、酢酸エチル４００ｍＬを加え、希硫酸でｐＨ５に調節した。溶液を３０分間攪拌し、層分離して水溶液層を除去した。硅藻土７ｇと活性炭７ｇを有機層に加え、３０分間撹拌及び濾過し、濾過物を酢酸エチル５０ｍＬで洗浄し、減圧濃縮した。
【００３０】
第２工程：胆汁酸のエステル化
前工程から得られた残留物をメタノール３００ｍＬに溶かし、濃硫酸４．０ｍＬを加え、室温で１日攪拌した。その後、炭酸水素ナトリウムで中和（ｐＨ７）し、濾過し、減圧濃縮した。
【００３１】
第３工程：式（ＩＩ）のメチルエステルの除去
前工程から得られた残留物を３２０ｍＬの熱ベンゼンに溶かし、２２５ｍＬに濃縮した後、１日間冷蔵放置した。その後、濾過し、濾過物（式（ＩＩ）のメチルエステルベンゼン付加物）をベンゼンで洗浄し、ベンゼン濾液と洗浄液を減圧濃縮した。
【００３２】
第４工程：胆汁酸エステルのアセチル化
前工程から得られた残留物に、無水酢酸７５ｍＬと無水酢酸ナトリウム７．５ｇを加え、５時間還流攪拌した。残った無水酢酸を蒸留して除去し、そしてメタノール３５ｍＬを加えた後、１５分間還流攪拌し、減圧蒸留して残っている無水酢酸を除去した。
【００３３】
第５工程：アセチル化された式（ＩＩＩ）のエステルの除去
前工程から得られた残留物を、ヘキサン溶媒２００ｍＬで還流し、この溶液を２０℃で、１日放置した。この懸濁液を濾過し、濾過物（粗結晶のＨＤＣＡ−ｔｒｉＡｃ−Ｍｅ）をヘキサンで洗浄し、濾液と洗浄液を集めて減圧蒸留した。
【００３４】
第６工程：式（Ｖ）の化合物の分離
前工程から得られた残留物を、熱エタノール４６ｍＬに溶かした後、１日間冷蔵放置した。懸濁液を濾過し、濾過物を冷エタノール２７ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥した。式（Ｖ）の化合物２１．５ｇを、３倍量のエタノールで再結晶化し、１８．５ｇの生成物を得た。
ｍ．ｐ．１１９〜１２１℃；［α］Ｄ２５ ＋１０．４°（ｃ＝１，ジオキサン）；［α］Ｄ２５ ＋１３．８°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３)
【００３５】
第７工程：ケン化及び中和
ケノデオキシコール酸−ジアセテート−メチル−エステル１８．５ｇと水酸化ナトリウム１８．５ｇを水１８５ｍＬに加え、１４時間還流攪拌した。その後、濃硫酸でｐＨを４．５に調節した。
【００３６】
第８工程：式（Ｉ）の化合物の製造
前工程の反応液を酢酸エチルで抽出し、水溶液層を捨てた。酢酸エチル層を６％の塩水で洗浄し、約９０ｍＬに蒸留した。この溶液を冷却し、ヘキサン９０ｍＬを加え、１日間冷蔵放置した。この懸濁液を濾過し、濾過物をヘキサン２０ｍＬで洗浄し、６０℃で真空乾燥し、１２．７ｇのケノデオキシコール酸を得た。
ｍ．ｐ．１４２〜１４５℃；［α］Ｄ２５ ＋１３．０°（ｃ＝１，ＣＨＣｌ３）
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、ブタ胆汁固形化物から式（Ｉ）のケノデオキシコール酸を高収率及び高純度で精製することができる。また、本発明は精製時間を短縮することによって工業的精製に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ胆汁の前処理、胆汁酸のエステル化、胆汁酸エステルのアセチル化、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去、アセチル化された胆汁酸エステルの結晶化及び脱保護化の各工程を含む、式（Ｉ）の化合物の精製方法であって、
【化００１】
１）前処理工程として、塩を含む有機溶媒にケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を溶解させること、
２）結晶化工程として、１５〜２５℃の温度範囲で、Ｃ１−４アルコールで結晶化させること、
３）脱保護化工程として、結晶化工程の生成物に、塩基を加え、脱保護化し、酸を加えて水の存在下に結晶化させること、
を特徴とする式（Ｉ）の化合物の精製方法。
【請求項２】
前処理工程に用いられる塩が、塩化ナトリウム、無水硫酸マグネシウム及び無水硫酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
塩の量が、有機溶媒の全体量に対して、５〜１０重量％であることを特徴とする請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
結晶化工程後に、０〜１５℃の温度範囲でＣ１−４アルコールにてさらに再結晶化させることを含んでなる、再結晶化された生成物が、式（Ｖ）の化合物を９９％以上含むことを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【化００２】
【請求項５】
結晶化工程が、２０〜２５℃の温度範囲で遂行されることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項６】
結晶化工程に用いられるアルコールの量が、前工程から得られる残留物量に対して、０．５〜３倍であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項７】
脱保護化工程のｐＨが、４以下であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項８】
結晶化工程が、水の存在下、３５〜４５℃の温度範囲で遂行されることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項１】
ブタ胆汁の前処理、胆汁酸のエステル化、胆汁酸エステルのアセチル化、非極性有機溶媒を用いた中間生成物の除去、アセチル化された胆汁酸エステルの結晶化及び脱保護化の各工程を含む、式（Ｉ）の化合物の精製方法であって、
【化００１】
１）前処理工程として、塩を含む有機溶媒にケノデオキシコール酸を３５〜５５重量％含有するブタ胆汁固形化物を溶解させること、
２）結晶化工程として、１５〜２５℃の温度範囲で、Ｃ１−４アルコールで結晶化させること、
３）脱保護化工程として、結晶化工程の生成物に、塩基を加え、脱保護化し、酸を加えて水の存在下に結晶化させること、
を特徴とする式（Ｉ）の化合物の精製方法。
【請求項２】
前処理工程に用いられる塩が、塩化ナトリウム、無水硫酸マグネシウム及び無水硫酸ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
塩の量が、有機溶媒の全体量に対して、５〜１０重量％であることを特徴とする請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
結晶化工程後に、０〜１５℃の温度範囲でＣ１−４アルコールにてさらに再結晶化させることを含んでなる、再結晶化された生成物が、式（Ｖ）の化合物を９９％以上含むことを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【化００２】
【請求項５】
結晶化工程が、２０〜２５℃の温度範囲で遂行されることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項６】
結晶化工程に用いられるアルコールの量が、前工程から得られる残留物量に対して、０．５〜３倍であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項７】
脱保護化工程のｐＨが、４以下であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項８】
結晶化工程が、水の存在下、３５〜４５℃の温度範囲で遂行されることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【公表番号】特表２００９−５２２２５３（Ｐ２００９−５２２２５３Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８３６９（Ｐ２００８−５４８３６９）
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８０３９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５００４０９８４０）ダエウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (13)
【出願人】（５００４０９８５１）ダエウン ケミカル カンパニー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８０３９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５００４０９８４０）ダエウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (13)
【出願人】（５００４０９８５１）ダエウン ケミカル カンパニー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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