サンプル分離吸着器具
【課題】サンプルを高精度に転写させることができるサンプル分離吸着器具を提供する。
【解決手段】本発明に係るサンプル分離吸着器具１００は、分離媒体３３に緩衝液を介して電流を流すことによって、分離媒体３３中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを分離媒体３３からサンプル吸着用部材６へ吸着させるものである。サンプル分離吸着器具１００は、第１電極４１が配置される第１緩衝液槽１と、第２電極４２が配置される第２緩衝液槽２と、サンプル吸着用部材６が配置されるサンプル吸着緩衝液槽３と、分離媒体３３を格納するサンプル分離部３１と、サンプル吸着用部材６を分離方向に垂直な方向に移動させる移動アーム５２とを備える。第２緩衝液槽２の側部２１には、第２開口３６に対向する位置に貫通孔３９が設けられており、サンプル吸着用部材６は、第２開口３６と側部２１との間に配置される。
【解決手段】本発明に係るサンプル分離吸着器具１００は、分離媒体３３に緩衝液を介して電流を流すことによって、分離媒体３３中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを分離媒体３３からサンプル吸着用部材６へ吸着させるものである。サンプル分離吸着器具１００は、第１電極４１が配置される第１緩衝液槽１と、第２電極４２が配置される第２緩衝液槽２と、サンプル吸着用部材６が配置されるサンプル吸着緩衝液槽３と、分離媒体３３を格納するサンプル分離部３１と、サンプル吸着用部材６を分離方向に垂直な方向に移動させる移動アーム５２とを備える。第２緩衝液槽２の側部２１には、第２開口３６に対向する位置に貫通孔３９が設けられており、サンプル吸着用部材６は、第２開口３６と側部２１との間に配置される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的なサンプルを各成分に分離しかつ分離されたサンプルを順次吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが終了した後、プロテオーム研究が盛んに行われている。「プロテオーム」とは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産されているタンパク質全体が意図され、その研究としてはタンパク質のプロファイリングなどが挙げられる。
【０００３】
タンパク質をプロファイリングする手法の１つとして最も用いられているものが、タンパク質の電気泳動、特に２次元電気泳動である。タンパク質は、電荷および分子量の独特の性質を有しているので、多数のタンパク質の混合物であるプロテオームから電荷のみまたは分子量のみに依存して個々のタンパク質を各成分に分離するよりも、両者を組み合わせることにより、より多くのタンパク質を高分解能にて分離することができる。
【０００４】
電気泳動によってタンパク質は電荷および／または分子量によって分離されるが、このような物理的性質のみで分離したタンパク質について、その分離位置から生物学的性質を特定することは困難である。また、タンパク質は合成された後にリン酸化などの化学的修飾（翻訳後修飾）を受けることによりその機能が制御されることが知られている。電気泳動のみではこのような翻訳後修飾に関する情報を得ることは困難である。
【０００５】
ウェスタンブロッティング法は電気泳動によって分離されたスラブゲル中のタンパク質を膜に転写する方法である（例えば、特許文献１などを参照のこと）。ウェスタンブロッティング法によりタンパク質が転写された膜上に特定の抗体をオーバーレイすれば、抗原抗体反応に基づいてタンパク質をある程度特定することが可能となる。また、翻訳後修飾の１つであるリン酸化について、タンパク質が転写された膜に抗リン酸化タンパク質抗体をオーバーレイすることにより、リン酸化の有無、およびリン酸化部位の相違を検出することが可能となる。
【０００６】
このように、電気泳動法とウェスタンブロッティング法との組み合わせは、タンパク質の生化学的性質を特定する上で非常に有用な方法である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
従来、電気泳動とウェスタンブロッティング法はそれぞれ独立した装置を用いて研究者の手作業によって行われている。例えば、電気泳動装置にて等電点電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルを装置から取り出して転写装置に移し、転写膜をセットして転写（ブロッティング）を行い、転写膜に抗体またはプローブを手動でオーバーレイするのが一般的である。この操作に用いるゲルは非常に柔らかい材料で扱いにくいため、操作が煩雑になり、その作業には熟練を要する。
【０００８】
そこで、これらの作業を自動化した技術が開発されている。例えば、特許文献２には、電気泳動からブロッティングまでの一連の操作を自動化するサンプル分離吸着器具が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−６３７６３号公報（１９９５年３月１０日公開）
【特許文献２】特開２００７−２９２６１６号公報（２００７年１１月８日公開）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】タンパク質実験ノート（下）：分離同定から機能解析へ（羊土社、２００５年、第３８〜４７項）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に、電気泳動を長時間連続して行うことにより、電極反応が緩衝液のｐＨを変化させ、緩衝溶液のｐＨが陰極側で塩基性に、陽極側で酸性に変化する。特に、チップサイズを小型にするため緩衝液量を少なくした場合には、ｐＨ変化が顕著に発生するという問題がある。
【００１２】
電気泳動媒体の端面から転写膜へ分離分子を転写するブロッティング方式においては、高分子量サンプルを端面にまで電気泳動させるための時間を要するため、上述の目的で緩衝液量を少なくした場合には、ｐＨ変化が電気泳動と転写に影響をあたえるという問題がある。
【００１３】
仮に、陽極側の緩衝液がｐＨ４以下の酸性にまで変化すると、陽極側の緩衝液に面するゲルが変性を起こすため、良好なブロッティングが困難になってしまう。また、緩衝液中に著しいｐＨ勾配が存在すると、電気浸透流が誘引されて、サンプルの転写パターンに悪影響を与えてしまう。
【００１４】
サンプルの電気泳動分離及びブロッティングのさらなる高精度化のためには、緩衝液のｐＨ変化等を考慮し、その影響を排除した高性能なサンプル分離吸着器具の実現が期待される。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、サンプルを高精度に転写させることができるサンプル分離吸着器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本研究に係るサンプル分離吸着器具は、上記の課題を解決するために、分離媒体に緩衝液を介して電流を流すことによって、上記分離媒体中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを上記分離媒体からサンプル吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具であって、第１電極が配置される第１緩衝液槽と、第２電極が配置される第２緩衝液槽と、上記第１緩衝液槽と上記第２緩衝液槽との間に配置される第３緩衝液槽と、上記第１緩衝液槽内に開口する第１開口および上記第３緩衝液槽内に開口する第２開口を有し、かつ、上記分離媒体を格納するサンプル分離部と、上記サンプル吸着用部材をサンプルの分離方向に垂直な方向に移動させる移動手段とを備え、上記第２緩衝液槽内と上記第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁において上記第２開口に対向する部位には、上記第２緩衝液槽と上記第３緩衝液槽とを連通する、通電のための貫通孔が設けられており、上記サンプル吸着用部材は、上記第３緩衝液槽内における上記第２開口と上記貫通孔との間に配置されることを特徴としている。
【００１７】
上記構成では、第１電極と第２電極とに電圧を印加すると、第２緩衝液槽内と第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁に設けられた貫通孔ならびにサンプル分離部の第１開口および第２開口を介して、第１および第２緩衝液槽内の緩衝液と分離媒体とが電気的に接続される。このとき、分離媒体中のサンプルは第１開口から第２開口に向けて移動し、各成分の移動度に応じて分離される。
【００１８】
分離されたサンプルは、サンプル分離部の第２開口から、当該第２開口に対向して設けられた上記貫通孔に向かって排出される。ここで、第２開口と上記貫通孔との間にはサンプル吸着用部材が配置されるため、第２開口を介して排出されたサンプルはサンプル吸着用部材に吸着（転写）される。すなわち、サンプル吸着は、サンプル吸着用部材の配置されたサンプル吸着緩衝液槽内で行なわれる。
【００１９】
サンプル吸着時、サンプル吸着用部材は、移動手段によって、サンプルの分離方向に対して垂直な方向に移動する。このため、第２開口から排出されたサンプルは順次、サンプル吸着用部材に連続的に吸着される。
【００２０】
上記構成によれば、本発明に係るサンプル分離吸着器具は、電極の配置された第１および第２緩衝液槽を利用して電気泳動を行い、電極が存在しないサンプル吸着緩衝液槽を利用してサンプル吸着を行う。このため、長時間の電圧印加によって第１緩衝液および第２緩衝液のｐＨが酸性または塩基性に変化したとしても、サンプル吸着用緩衝液槽内の第３緩衝液ではｐＨ変化の影響が抑制される。
【００２１】
したがって、本発明に係るサンプル分離吸着器具では、ゲルの変性を防止すことができ、また、サンプルの吸着に最適なｐＨ環境下でサンプル吸着を行うことが可能となる。よって、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着を高精度に行うことができる。
【００２２】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記隔壁の上記部位には、上記貫通孔の開口上に、上記サンプル吸着用部材を上記第２開口に向けて押し当てる押当部が設けられていることが好ましい。
【００２３】
上記構成によれば、押当部による押し当て力によって、サンプル吸着用部材が第２開口に密着する。これによって、第２開口から排出されたサンプルが第３緩衝液に拡散することを抑え、当該サンプルをサンプル吸着用部材に効率的に吸着することができる。
【００２４】
また、上記構成によれば、貫通孔の開口上に設けられた押当部がサンプル吸着用部材を押し当てているため、貫通孔を介する緩衝液の流通が効果的に抑制される。すなわち、電極反応の影響を受けた第２緩衝液槽内の緩衝液が第３緩衝液内に流入することを抑制することができる。これによって、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着をより高精度に行うことができる。
【００２５】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記押当部は、貫通孔を有する弾力性素材、または、吸水時に膨張する素材から構成されることが好ましい。
【００２６】
上記構成によれば、上記貫通孔を介する電気的接続を確保した押当部を好適に構成することができる。
【００２７】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記第２緩衝液槽は、脱着可能な槽として構成されており、上記貫通孔は上記第２緩衝液槽の側部に設けられていることが好ましい。
【００２８】
上記構成によれば、本発明に係るサンプル分離吸着器具を簡易に構成することができる。
【００２９】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、上記貫通孔には導電性媒体が充填されていてもよい。
【００３０】
上記構成によれば、押当部を利用せずとも、導電性媒体自身の存在によって、貫通孔を介する緩衝液の流通を抑制することができる。また、押当部を用いずともサンプル分離部の第２開口とサンプル吸着用部材を密着させることが可能になる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るサンプル分離吸着器具は、電極の配置された第１および第２緩衝液槽と、サンプル吸着用部材の配置されたサンプル吸着緩衝液槽とを備えるため、サンプル吸着を好適なｐＨ条件下で行うことができ、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着を高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す断面図である。
【図２】（ａ）はサンプル分離部を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図３】（ａ）は第２緩衝液槽を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図４】（ａ）は第２緩衝液槽を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図５】サンプル分離部と第２緩衝液槽との配置関係を示す断面図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す斜視図である。
【図７】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す斜視図である。
【図８】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す断面図である。
【図９】実施例１および２におけるサンプル分離部を示す断面図である。
【図１０】実施例１および２におけるスペーサを示す断面図である。
【図１１】実施例１に係るサンプル分離吸着器具を用いてサンプル吸着を行った結果を示す図である。
【図１２】実施例２に係るサンプル分離吸着器具を用いてサンプル吸着を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について、図面に基づいて説明すれば以下のとおりである。
【００３４】
（サンプル分離吸着器具１００の構成）
まず、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００の概略的な構成について、図１を参照して説明する。図１は、サンプル分離吸着器具１００の構成を概略的に示す側面図である。
【００３５】
なお、以下の説明では、サンプル分離吸着器具１００において、図１に示す上下方向をＺ軸方向とし、第１電極４１および第２電極４２に定義されるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ方向（分離方向）をＹ軸方向とし、Ｙ軸およびＺ軸のいずれにも垂直な方向をＸ軸方向としている。
【００３６】
図１に示すように、サンプル分離吸着器具１００は、第１緩衝液槽１、第２緩衝液槽２、サンプル吸着緩衝液槽（第３緩衝液槽）３、分離媒体３３を格納するサンプル分離部３１、第１電極４１、および第２電極４２を備えている。また、サンプル分離吸着器具１００は、吸着用部材（サンプル吸着用部材）６を移動させる移動機構（移動手段）を備えている。
【００３７】
以下に、各部材について詳細に説明する。
【００３８】
第１緩衝液槽１および第２緩衝液槽２は、第１緩衝液および第２緩衝液がそれぞれ充填される槽であり、その内側には第１電極４１および第２電極４２がそれぞれ配置される。第１緩衝液および第２緩衝液としては、特に限定されず、一般に電気泳動に用いられる組成の緩衝液から、用途または目的に応じて、適宜選択することができる。また、本実施形態において、第１電極４１は電源（図示せず）の負極に接続され、第２電極４２は正極に接続されている。
【００３９】
また、第２緩衝液槽２は、収容容器１０に対して脱着可能な槽として構成されることが好ましい。このような第２緩衝液槽２を収容容器１０に取り付けることによって、第２緩衝液槽２と収容容器１０とサンプル分離部３１の間のスペースが、サンプル吸着緩衝液槽３として実現される。取り付けた第２緩衝液槽２のＺ方向への動きを固定するために、収容容器１０に設けられた上昇防止爪８０が第２緩衝液槽２を抑えてもよい。また、後述にて詳細に説明するが、第２緩衝液槽２の側部２１には、通電のための孔３９が形成され、押当部３８および親水性膜３７が設けられる。
【００４０】
サンプル吸着緩衝液槽３は、サンプル吸着用緩衝液が充填される槽である。サンプル吸着用緩衝液としては、サンプルが吸着されやすいｐＨ条件に調整された緩衝液を用いることが好ましい。
【００４１】
なお、図１において、第１緩衝液槽１およびサンプル吸着緩衝液槽３は、収容容器１０に形成された隔壁やサンプル分離部３１等を利用して実現されているが、本発明はこれに限られず、電気泳動を可能にする槽であればよい。
【００４２】
サンプル分離部３１は、第１緩衝液槽１とサンプル吸着緩衝液槽３との間に配置される。このとき、サンプル分離部３１は、例えば図１に示すサンプル分離部置場８に載置されてもよい。載置されたサンプル分離部３１は、Ｙ方向への動きを固定するために、サンプル吸着緩衝液槽３と係合してもよく、Ｚ方向への動きを固定するために、収容容器１０に設けられた上昇防止爪８０により抑えられもよい。
【００４３】
また、サンプル分離部３１は、Ｙ軸方向の両端にそれぞれ開口を有している。具体的には、サンプル分離部３１は、第１緩衝液槽１内に開口する第１開口３５と、サンプル吸着緩衝液槽３内に開口する第２開口３６とを有している。第１開口３５および第２開口３６の形状は、例えば、それぞれ長方形であってもよい。
【００４４】
また、サンプル分離部３１は、図４に示すように、その内部に分離媒体３３を格納するように構成されている。サンプル分離部３１に格納された分離媒体３３は、第１開口３５を介して第１緩衝液槽１内に面し、第２開口３６を介して第２緩衝液槽２内に面する。
【００４５】
図４（ａ）はサンプル分離部３１を示す斜視図であり、図４（ｂ）はその断面図である。図４（ｂ）に示すように、サンプル分離部３１は、２枚の絶縁板３４と、それらの間に空間を確保するため設置されるスペーサ（図示しない）とから構成することができる。また、第１開口３５側では、サンプルを分離媒体３３に接触させるために、分離媒体３３の上部が絶縁板３４から露出していることが望ましい。なお、第２開口３６には分離媒体３３を保持するために親水性膜３２が貼り付けられることが好ましい（図５参照）。
【００４６】
分離媒体３３は、電気泳動によってサンプルを分離するための媒体であり、一般に電気泳動法に用いられる媒体、例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル等を用いることができる。
【００４７】
なお、本明細書中で使用される「サンプル」とは、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は供給源としての生物材料（たとえば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。生物学的サンプルとしては体液（たとえば血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液および髄液）および組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは被験体から得た皮膚病変部、喀痰、咽頭粘液、鼻腔粘液、膿または分泌物である。本明細書で使用される場合、用語「組織サンプル」は組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したたんぱく質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび・または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。また、「サンプル成分」は「サンプル」を構成する種々の因子（成分）が意図される。
【００４８】
吸着用部材６は、サンプルを吸着するための部材であり、図１に示すようにサンプル吸着緩衝液槽３内において第２開口３６と孔３９との間に配置される。また、吸着用部材６は、移動アーム６１に固定され、後述する移動機構によってＺ方向に移動する。
【００４９】
吸着用部材６は、強度を確保できる材料からなることが好ましく、例えば、サンプルがタンパク質の場合にはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜等を用いることができる。なお、ＰＶＤＦ膜は予めメタノールなどを用いて親水化処理を行っておくことが好ましい。また、他にもナイロン、ニトロセルロースなどの、従来用いられている核酸またはタンパク質が結合しやすい膜を用いることができる。
【００５０】
第１電極４１は、第１緩衝液槽１内において第１開口３５に対向して配置され、一方、第２電極４２は、第２緩衝液槽２内において孔３９に対向して配置される。
【００５１】
また、第１電極４１および第２電極４２は、導電性のある素材から形成されればよいが、電極のイオン化を防ぐため、素材には白金を用いることが好ましい。また、第２電極４２の形状は、第２開口３６と同一または第２開口３６よりも小さいことが好ましく、例えば線状であり得る。
【００５２】
（サンプル分離吸着器具１００の動作）
次に、サンプル分離吸着器具１００におけるサンプル吸着までの流れについて、図１を参照して説明する。
【００５３】
まず、収納容器１０のサンプル分離部置場８にサンプル分離部３１を設置し、第１緩衝液槽１に第１緩衝液を、サンプル吸着緩衝液槽３に第３緩衝液を充填する。移動アームに固定されたサンプル吸着用部材６を第３緩衝液中に浸けた状態で第２緩衝液槽を収納容器１０に設置後、第２緩衝液を充填する。その後第１電極４１および第２電極４２を配置する。
【００５４】
次にサンプルを分離媒体３３に導入する。例えば、２次元電気泳動を行う場合には、予め１次元目の等電点電気泳動を行ったサンプル媒体５０を用いる。サンプル導入の際には、アクリル等で作製した支持体５１にサンプル媒体５０を固定する。支持体５１は移動アーム５２によって移動し、サンプル媒体５０をサンプル分離部３１内の分離媒体３３における第１開口３５側の上部に載置する。また、等電点電気泳動等、１次元目の電気泳動を行わない場合には、分離媒体３３に形成されたウェルにサンプルを導入すればよい。
【００５５】
サンプル導入後、第１電極４１と第２電極４２との間に電圧を印加する。第１電極４１と第２電極４２とは、緩衝液および電極間に配置される各部材を介して電気的に接続される。これによって、分離媒体３３内のサンプルがＹ方向に電気泳動し、各サンプル成分の間に生じる移動度の差に基づいて分離され、第２開口３６から排出される。
【００５６】
また、電気泳動の開始後、移動アーム６１が吸着用部材６の引き上げを開始する。このため、第２開口から排出されたサンプルは、吸着用部材６に対して連続的に吸着される。
【００５７】
吸着用部材６へのサンプル吸着は、電極が存在しないサンプル吸着緩衝液槽３内で行われるため、電極反応の影響を受けずに良好に行うことができる。
【００５８】
サンプル吸着の終了後、吸着用部材６は回収され、染色や免疫反応等が行なわれる。その後、蛍光検出器などによって、サンプルの分離転写パターンが検出される。
【００５９】
（第２緩衝液槽）
次に、第２緩衝液槽２の構成について詳細に説明する。
【００６０】
図３（ａ）は第２緩衝液槽２を示す斜視図であり、図３（ｂ）はその断面図である。図４（ａ）は押当部３８および親水性膜３７が設けられた第２緩衝液槽２を示す斜視図であり、図４（ｂ）はその断面図である。
【００６１】
図３（ａ）（ｂ）に示すように、第２緩衝液槽２の側部（隔壁の一部）２１には、槽の内外をＹ方向に通電させるための孔（貫通孔）３９が形成されている。孔３９の開口の形状は、例えば長方形に形成することができる。
【００６２】
第２緩衝液槽２内に第２緩衝液が充填された際、孔３９の内部は第２緩衝液により満たされる。孔３９に緩衝液が満たされると、第１電極４１と第２電極４２との間に電圧を安定的に印加することが可能である。
【００６３】
また、図４（ａ）（ｂ）に示すように、第２緩衝液槽２の側部２１には、孔３９の開口上に、押当部３８が設置されることが好ましい。また、押当部３８上には親水性膜３７が貼り合わせられることがさらに好ましい。押当部３８としては、第１電極４１と第２電極４２との電気的接続を妨げず、かつ、吸着用部材６を第２開口３６に押し当てることが可能な構成であることが好ましい。
【００６４】
例えば、押当部３８は、吸水時に膨張する素材や、貫通孔を有する弾力性素材等から構成することができる。押当部３８として、具体的には、厚さや圧縮度合いの異なるろ紙や、ポリビニルアルコール、ビニロン、ポリ酢酸ビニル、およびポリウレタンなどが挙げられる。
【００６５】
また、親水性膜３７としては、例えば親水性ＰＶＤＦ膜などを用いることができる。
【００６６】
図５は、第２緩衝液槽２とサンプル分離部３１との好ましい配置関係を示す図である。
【００６７】
図５に示すように、第２緩衝液槽２とサンプル分離部３１とは吸着用部材６を挟むように配置される。このとき、第２緩衝液槽２の孔３９は、サンプル分離部３１の第２開口３６と対向している。
【００６８】
第２緩衝液槽２は、第２緩衝液槽２に設けられた押当部３８が吸着用部材６を第２開口３６に向けて押し当てるように構成される。例えば、押当部３８がその素材の有する弾力性や膨張性を利用して吸着用部材６を押し当てるように、第２緩衝液槽２が収容容器１０に固定されてもよい。この押し当ての力によって、吸着用部材６は、サンプル分離部３１の第２開口３６と密着し、また第２緩衝液槽２の側部２１（より具体的には親水性膜３７）に密着する。親水性膜３７はこの密着性をさらに向上させる役割を果たし、加えて吸着用部材６がＺ軸方向に移動する際の滑りを向上させる役割も果たす。
【００６９】
ここで、第２開口３６と吸着用部材６とが密着すると、第２開口３６から排出されたサンプルが第３緩衝液に拡散することを抑えることができる。これによって、サンプルを吸着用部材６に効率的に吸着することができる。
【００７０】
また、第２緩衝液槽２の側部２１と吸着用部材６とが密着すると、穴３９を介する緩衝液の流通が効果的に抑制される。すなわち、電極反応の影響を受けた第２緩衝液が、サンプル吸着緩衝液槽３内の緩衝液に流入することが抑制される。これによって、吸着用部材６に対するサンプル吸着をより高精度に行うことができる。
【００７１】
なお、本発明では、緩衝液の代わりにゲルなどの導電媒体を孔３９に満たすことも可能である。ただし、孔３９にゲルなどの導電媒体を満たした場合、長時間の電圧印加による影響により電気的な接続が得られなくなった途端、電圧値が急上昇し吸着が停止してしまう。よって、長時間安定的に電圧を印加するためには、孔３９に緩衝液を満たすことが好ましい。
【００７２】
また、本発明は、第２緩衝液槽２の側部２１に押当部３８を設ける構成に限られない。例えば、押当部３８の設けられる側部２１は、第２緩衝液槽２の側壁であることに限られず、第２緩衝液槽２とサンプル吸着緩衝液槽３と隔てる隔壁であればよい。
【００７３】
また、押当部３８を設けずとも、第２緩衝液槽２とサンプル吸着緩衝液槽３との間の緩衝液の流通が、サンプル吸着用部材６と側部２１が密着した状態で孔３９を介するものに限られることによって本発明の効果を得ることができる。
【００７４】
また、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００は、上述した各部材が予め取り付けた状態で提供されてもよく、あるいは、使用者が各部材を後から取り付ける構成で提供されてもよい。
【００７５】
（吸着用部材６の移動機構）
次に、吸着用部材６を移動させる移動機構の一例について説明する。
【００７６】
図６および図７は、サンプル分離吸着器具１００の備える移動機構を示す斜視図である。また、図７では、図面を簡略化するために、移動アーム５２および支持体５１を省略して示している。
【００７７】
駆動手段７を含むサンプル分離吸着器具１００の全体は基盤９に固定されている。吸着用部材６は移動アーム６１に固定されており、移動アーム６１は駆動手段７によって駆動される。具体的には、移動アーム６１は第１駆動手段７１に連結されており、第１駆動手段７１は基盤９の上に固定された第２駆動手段７２に連結されている。これら第１駆動手段７１および第２駆動手段７２によって移動アーム６１はＹ方向およびＺ方向へ駆動される。これによって、吸着用部材６の移動を制御することができる。
【００７８】
図８は、駆動手段７と電極（第１電極４１および第２電極４２）との間の制御を説明するためにサンプル分離吸着器具１００を示す断面図である。
【００７９】
図８に示すように、第１電極４１および第２電極４２は、配線１１２を介して、電源１１１の負極および正極にそれぞれ接続されている。また、電源１１１と第２電極４２との間には電流計１１３が配置される。第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流が流れるように、データ処理装置１１４によって電源１１１が制御される。
【００８０】
また、図８に示すように、駆動手段７（第１駆動手段および第２駆動手段）は駆動手段制御部７０により制御される。吸着用部材６を引き上げる時間になると、駆動手段制御部７０は駆動手段７が駆動を開始するように制御する。さらに、データ処理装置１１４は、電流計１１３の測定する電流値に基づいて、駆動手段制御部７０を制御してもよい。
【００８１】
なお、図示していないが、移動アーム５２についても上述した移動機構と同様な手段を用いて駆動することができ、これによってサンプルの導入を制御することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
実施例１では、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００を用いて、２次元電気泳動の２次元目の電気泳動とサンプル吸着とを行った。
【００８４】
〔１次元目電気泳動（サンプル媒体５０）〕
サンプル媒体５０として、イモビラインによる固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動用ゲルを１ｍｍ×６０ｍｍに切断して用いた。サンプル導入とゲル膨潤を行い、６０００Ｖで１時間の電気泳動を行った。
【００８５】
なお、サンプルとしては、蛍光マーカーで染色したマウス肝臓サンプルを用いた。
【００８６】
〔サンプル分離部３１〕
２枚の絶縁板３４として、６０ｍｍ×３０ｍｍ×２ｍｍ厚と６０ｍｍ×２８ｍｍ×２ｍｍ厚であり、２枚とも０．５ｍｍの段差を両端に有する石英ガラスを用いた。２枚の石英ガラスの外側には親水性ＰＶＤＦ膜をカプトンテープにより貼り付けた。このとき、親水性ＰＶＤＦ膜とガラス面との間に隙間ができないように注意し、カプトンテープは第２開口３６を阻害しないようにした。この石英ガラスの両端は中央部より０.５ｍｍ突起しており、この突起部から分離媒体の厚さを規定した。
【００８７】
上記のように作製したサンプル分離部３１にポリアクリルアミドゲルを充填したものを、サンプル分離部置場８に設置し、上昇防止爪８０で固定した。
【００８８】
〔第１緩衝液槽１〕
７０ｍｍ×７０ｍｍ×深さ１５ｍｍ（サンプル分離部置場８においては深さ８ｍｍ）の第１緩衝液槽１を収容容器１０に設け、第１緩衝液を充填した。第１緩衝液には市販のＭＯＰＳ／ＳＤＳバッファーを用いた。第１緩衝液槽１に配置する第１電極４１としては白金線を用いた。第１電極４１は電源１１１の負極に接続した。
【００８９】
〔第２緩衝液槽２〕
７０ｍｍ×７０ｍｍ×深さ１５ｍｍの第２緩衝液槽２を用い、その槽の側部２１（Ｚ方向１ｍｍ厚）の外側には、押当部３８を設置した。押当部３８表面には親水性膜３７を取り付けた。第２緩衝液槽２を収容容器１０に嵌め込んで設置し、上昇防止爪８０により固定した。第２緩衝液を第２緩衝液槽２に充填した。第２緩衝液には市販のＭＯＰＳバッファーを用いた。第２緩衝液槽２に配置する第２電極４２としては白金線を用いた。このとき、第２電極４２は電源１１１の正極に接続した。
【００９０】
〔サンプル吸着緩衝液槽３〕
第２緩衝液槽２を収容容器１０に設置することによって、第２緩衝液槽２、収容容器１０、およびサンプル分離部３１の間に出来たスペースを、サンプル吸着緩衝液槽３として用いた。サンプル吸着緩衝液槽３には、観察対象サンプルが吸着されやすいｐＨ条件を有する第３緩衝液を満たした。第３緩衝液には、第２緩衝液と同様、市販のＭＯＰＳバッファーを用いた。
【００９１】
〔吸着用部材６〕
吸着用部材６として、疎水性ＰＶＤＦをメタノールにより親水化したものを用いた。吸着用部材６の上端側を移動アーム６１に固定し、下端側をサンプル吸着緩衝液槽３内の第３緩衝液に浸漬させた。
【００９２】
〔サンプル媒体５０の分離媒体３３への導入〕
サンプル分離部３１の第１開口３５において分離媒体３３が露出している部分に、一次元目の電気泳動サンプルを含んだサンプル媒体５０を、移動アーム５２により上部から下ろして密着させた。
【００９３】
〔二次元目電気泳動〕
サンプル媒体５０と分離媒体３３が密着した状態で、電流計１１３の値が２５ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を２５分間流した。
【００９４】
〔サンプル吸着〕
電流計１１３の値が４０ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を６０分間流した。この時、第１駆動手段７１によって吸着用部材６を上方へ引き上げた。この引き上げ速度については、駆動手段制御部７０によって３２μｍ／ｓｅｃから２μｍ／ｓｅｃへと段階的に減速させた。
【００９５】
〔結果〕
サンプル吸着後、吸着用部材６を回収し、サンプルの検出を行った。その検出結果を図１１に示す。図１１に示すように、実施例１によれば、サンプル分離とサンプル吸着とを同一器具にて連続的に行いつつも、分解能の高いサンプル吸着パターンを得ることができた。
【００９６】
（実施例２）
実施例２では、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとサンプル吸着とを行った。実施例２では、第１実施例と同様であるところの説明を割愛し、以下には相違点のみを説明する。
【００９７】
〔サンプル分離部３１〕
サンプル分離部３１は実施例１と同様に作製した。サンプル分離部３１の内部には、分離媒体３３としてポリアクリルアミドゲルを充填した。ポリアクリルアミドゲルが重合する前に第１開口３５の上部にコームを差し込み、一次元電気泳動サンプル投入用のウェルを作製した。作製したウェルに分子量可視マーカーサンプルを１０μＬ流し込み、その後、アガロースゲルによってウェルに蓋をした。第２開口３６の外側には親水性膜３７を巻き付けた。
【００９８】
なお、サンプルとしては、可視タンパク質マーカーを用いた。
【００９９】
〔ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ〕
電流計１１３の値が２５ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を２５分間流した。
【０１００】
〔サンプル吸着〕
電流計１１３の値が４０ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を６０分間流した。この時、第１駆動手段７１によって、吸着用部材６を上方へ引き上げた。この引き上げ速度については、駆動手段制御部７０によって３２μｍ/secから２μｍ/secへと段階的に減速させた。
【０１０１】
〔結果〕
サンプル吸着後、吸着用部材６を回収し、サンプルの検出を行った。その検出結果を図１２に示す。図１２に示すように、実施例２によれば、サンプル分離とサンプル吸着とを同一器具にて連続的に行いつつも、分解能の高いサンプル吸着パターンを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、現在盛んにおこなわれているプロテオーム研究をより発展させることができる。また、本発明に係るサンプル分離吸着器具および当該器具に用いる種々の部材を別々に作製および販売することにより市場を活性化することができる。
【符号の説明】
【０１０３】
１ 第１緩衝液槽
２ 第２緩衝液槽
３ サンプル吸着緩衝液槽（第３緩衝液槽）
６ 吸着用部材（サンプル吸着用部材）
７ 駆動手段
２１ 側部
３１ サンプル分離部
３３ 分離媒体
３５ 第１開口
３６ 第２開口
３８ 押当部
４１ 第１電極
４２ 第２電極
６１ 移動アーム
１００ サンプル分離吸着器具
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的なサンプルを各成分に分離しかつ分離されたサンプルを順次吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが終了した後、プロテオーム研究が盛んに行われている。「プロテオーム」とは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産されているタンパク質全体が意図され、その研究としてはタンパク質のプロファイリングなどが挙げられる。
【０００３】
タンパク質をプロファイリングする手法の１つとして最も用いられているものが、タンパク質の電気泳動、特に２次元電気泳動である。タンパク質は、電荷および分子量の独特の性質を有しているので、多数のタンパク質の混合物であるプロテオームから電荷のみまたは分子量のみに依存して個々のタンパク質を各成分に分離するよりも、両者を組み合わせることにより、より多くのタンパク質を高分解能にて分離することができる。
【０００４】
電気泳動によってタンパク質は電荷および／または分子量によって分離されるが、このような物理的性質のみで分離したタンパク質について、その分離位置から生物学的性質を特定することは困難である。また、タンパク質は合成された後にリン酸化などの化学的修飾（翻訳後修飾）を受けることによりその機能が制御されることが知られている。電気泳動のみではこのような翻訳後修飾に関する情報を得ることは困難である。
【０００５】
ウェスタンブロッティング法は電気泳動によって分離されたスラブゲル中のタンパク質を膜に転写する方法である（例えば、特許文献１などを参照のこと）。ウェスタンブロッティング法によりタンパク質が転写された膜上に特定の抗体をオーバーレイすれば、抗原抗体反応に基づいてタンパク質をある程度特定することが可能となる。また、翻訳後修飾の１つであるリン酸化について、タンパク質が転写された膜に抗リン酸化タンパク質抗体をオーバーレイすることにより、リン酸化の有無、およびリン酸化部位の相違を検出することが可能となる。
【０００６】
このように、電気泳動法とウェスタンブロッティング法との組み合わせは、タンパク質の生化学的性質を特定する上で非常に有用な方法である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
従来、電気泳動とウェスタンブロッティング法はそれぞれ独立した装置を用いて研究者の手作業によって行われている。例えば、電気泳動装置にて等電点電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルを装置から取り出して転写装置に移し、転写膜をセットして転写（ブロッティング）を行い、転写膜に抗体またはプローブを手動でオーバーレイするのが一般的である。この操作に用いるゲルは非常に柔らかい材料で扱いにくいため、操作が煩雑になり、その作業には熟練を要する。
【０００８】
そこで、これらの作業を自動化した技術が開発されている。例えば、特許文献２には、電気泳動からブロッティングまでの一連の操作を自動化するサンプル分離吸着器具が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−６３７６３号公報（１９９５年３月１０日公開）
【特許文献２】特開２００７−２９２６１６号公報（２００７年１１月８日公開）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】タンパク質実験ノート（下）：分離同定から機能解析へ（羊土社、２００５年、第３８〜４７項）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に、電気泳動を長時間連続して行うことにより、電極反応が緩衝液のｐＨを変化させ、緩衝溶液のｐＨが陰極側で塩基性に、陽極側で酸性に変化する。特に、チップサイズを小型にするため緩衝液量を少なくした場合には、ｐＨ変化が顕著に発生するという問題がある。
【００１２】
電気泳動媒体の端面から転写膜へ分離分子を転写するブロッティング方式においては、高分子量サンプルを端面にまで電気泳動させるための時間を要するため、上述の目的で緩衝液量を少なくした場合には、ｐＨ変化が電気泳動と転写に影響をあたえるという問題がある。
【００１３】
仮に、陽極側の緩衝液がｐＨ４以下の酸性にまで変化すると、陽極側の緩衝液に面するゲルが変性を起こすため、良好なブロッティングが困難になってしまう。また、緩衝液中に著しいｐＨ勾配が存在すると、電気浸透流が誘引されて、サンプルの転写パターンに悪影響を与えてしまう。
【００１４】
サンプルの電気泳動分離及びブロッティングのさらなる高精度化のためには、緩衝液のｐＨ変化等を考慮し、その影響を排除した高性能なサンプル分離吸着器具の実現が期待される。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、サンプルを高精度に転写させることができるサンプル分離吸着器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本研究に係るサンプル分離吸着器具は、上記の課題を解決するために、分離媒体に緩衝液を介して電流を流すことによって、上記分離媒体中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを上記分離媒体からサンプル吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具であって、第１電極が配置される第１緩衝液槽と、第２電極が配置される第２緩衝液槽と、上記第１緩衝液槽と上記第２緩衝液槽との間に配置される第３緩衝液槽と、上記第１緩衝液槽内に開口する第１開口および上記第３緩衝液槽内に開口する第２開口を有し、かつ、上記分離媒体を格納するサンプル分離部と、上記サンプル吸着用部材をサンプルの分離方向に垂直な方向に移動させる移動手段とを備え、上記第２緩衝液槽内と上記第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁において上記第２開口に対向する部位には、上記第２緩衝液槽と上記第３緩衝液槽とを連通する、通電のための貫通孔が設けられており、上記サンプル吸着用部材は、上記第３緩衝液槽内における上記第２開口と上記貫通孔との間に配置されることを特徴としている。
【００１７】
上記構成では、第１電極と第２電極とに電圧を印加すると、第２緩衝液槽内と第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁に設けられた貫通孔ならびにサンプル分離部の第１開口および第２開口を介して、第１および第２緩衝液槽内の緩衝液と分離媒体とが電気的に接続される。このとき、分離媒体中のサンプルは第１開口から第２開口に向けて移動し、各成分の移動度に応じて分離される。
【００１８】
分離されたサンプルは、サンプル分離部の第２開口から、当該第２開口に対向して設けられた上記貫通孔に向かって排出される。ここで、第２開口と上記貫通孔との間にはサンプル吸着用部材が配置されるため、第２開口を介して排出されたサンプルはサンプル吸着用部材に吸着（転写）される。すなわち、サンプル吸着は、サンプル吸着用部材の配置されたサンプル吸着緩衝液槽内で行なわれる。
【００１９】
サンプル吸着時、サンプル吸着用部材は、移動手段によって、サンプルの分離方向に対して垂直な方向に移動する。このため、第２開口から排出されたサンプルは順次、サンプル吸着用部材に連続的に吸着される。
【００２０】
上記構成によれば、本発明に係るサンプル分離吸着器具は、電極の配置された第１および第２緩衝液槽を利用して電気泳動を行い、電極が存在しないサンプル吸着緩衝液槽を利用してサンプル吸着を行う。このため、長時間の電圧印加によって第１緩衝液および第２緩衝液のｐＨが酸性または塩基性に変化したとしても、サンプル吸着用緩衝液槽内の第３緩衝液ではｐＨ変化の影響が抑制される。
【００２１】
したがって、本発明に係るサンプル分離吸着器具では、ゲルの変性を防止すことができ、また、サンプルの吸着に最適なｐＨ環境下でサンプル吸着を行うことが可能となる。よって、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着を高精度に行うことができる。
【００２２】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記隔壁の上記部位には、上記貫通孔の開口上に、上記サンプル吸着用部材を上記第２開口に向けて押し当てる押当部が設けられていることが好ましい。
【００２３】
上記構成によれば、押当部による押し当て力によって、サンプル吸着用部材が第２開口に密着する。これによって、第２開口から排出されたサンプルが第３緩衝液に拡散することを抑え、当該サンプルをサンプル吸着用部材に効率的に吸着することができる。
【００２４】
また、上記構成によれば、貫通孔の開口上に設けられた押当部がサンプル吸着用部材を押し当てているため、貫通孔を介する緩衝液の流通が効果的に抑制される。すなわち、電極反応の影響を受けた第２緩衝液槽内の緩衝液が第３緩衝液内に流入することを抑制することができる。これによって、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着をより高精度に行うことができる。
【００２５】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記押当部は、貫通孔を有する弾力性素材、または、吸水時に膨張する素材から構成されることが好ましい。
【００２６】
上記構成によれば、上記貫通孔を介する電気的接続を確保した押当部を好適に構成することができる。
【００２７】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、
上記第２緩衝液槽は、脱着可能な槽として構成されており、上記貫通孔は上記第２緩衝液槽の側部に設けられていることが好ましい。
【００２８】
上記構成によれば、本発明に係るサンプル分離吸着器具を簡易に構成することができる。
【００２９】
また、本研究に係るサンプル分離吸着器具において、上記貫通孔には導電性媒体が充填されていてもよい。
【００３０】
上記構成によれば、押当部を利用せずとも、導電性媒体自身の存在によって、貫通孔を介する緩衝液の流通を抑制することができる。また、押当部を用いずともサンプル分離部の第２開口とサンプル吸着用部材を密着させることが可能になる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るサンプル分離吸着器具は、電極の配置された第１および第２緩衝液槽と、サンプル吸着用部材の配置されたサンプル吸着緩衝液槽とを備えるため、サンプル吸着を好適なｐＨ条件下で行うことができ、サンプル吸着用部材に対するサンプル吸着を高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す断面図である。
【図２】（ａ）はサンプル分離部を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図３】（ａ）は第２緩衝液槽を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図４】（ａ）は第２緩衝液槽を概略的に示す断面図であり、（ｂ）はその断面図である。
【図５】サンプル分離部と第２緩衝液槽との配置関係を示す断面図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す斜視図である。
【図７】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す斜視図である。
【図８】本発明の一実施形態に係るサンプル分離吸着器具の要部構成を示す断面図である。
【図９】実施例１および２におけるサンプル分離部を示す断面図である。
【図１０】実施例１および２におけるスペーサを示す断面図である。
【図１１】実施例１に係るサンプル分離吸着器具を用いてサンプル吸着を行った結果を示す図である。
【図１２】実施例２に係るサンプル分離吸着器具を用いてサンプル吸着を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について、図面に基づいて説明すれば以下のとおりである。
【００３４】
（サンプル分離吸着器具１００の構成）
まず、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００の概略的な構成について、図１を参照して説明する。図１は、サンプル分離吸着器具１００の構成を概略的に示す側面図である。
【００３５】
なお、以下の説明では、サンプル分離吸着器具１００において、図１に示す上下方向をＺ軸方向とし、第１電極４１および第２電極４２に定義されるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ方向（分離方向）をＹ軸方向とし、Ｙ軸およびＺ軸のいずれにも垂直な方向をＸ軸方向としている。
【００３６】
図１に示すように、サンプル分離吸着器具１００は、第１緩衝液槽１、第２緩衝液槽２、サンプル吸着緩衝液槽（第３緩衝液槽）３、分離媒体３３を格納するサンプル分離部３１、第１電極４１、および第２電極４２を備えている。また、サンプル分離吸着器具１００は、吸着用部材（サンプル吸着用部材）６を移動させる移動機構（移動手段）を備えている。
【００３７】
以下に、各部材について詳細に説明する。
【００３８】
第１緩衝液槽１および第２緩衝液槽２は、第１緩衝液および第２緩衝液がそれぞれ充填される槽であり、その内側には第１電極４１および第２電極４２がそれぞれ配置される。第１緩衝液および第２緩衝液としては、特に限定されず、一般に電気泳動に用いられる組成の緩衝液から、用途または目的に応じて、適宜選択することができる。また、本実施形態において、第１電極４１は電源（図示せず）の負極に接続され、第２電極４２は正極に接続されている。
【００３９】
また、第２緩衝液槽２は、収容容器１０に対して脱着可能な槽として構成されることが好ましい。このような第２緩衝液槽２を収容容器１０に取り付けることによって、第２緩衝液槽２と収容容器１０とサンプル分離部３１の間のスペースが、サンプル吸着緩衝液槽３として実現される。取り付けた第２緩衝液槽２のＺ方向への動きを固定するために、収容容器１０に設けられた上昇防止爪８０が第２緩衝液槽２を抑えてもよい。また、後述にて詳細に説明するが、第２緩衝液槽２の側部２１には、通電のための孔３９が形成され、押当部３８および親水性膜３７が設けられる。
【００４０】
サンプル吸着緩衝液槽３は、サンプル吸着用緩衝液が充填される槽である。サンプル吸着用緩衝液としては、サンプルが吸着されやすいｐＨ条件に調整された緩衝液を用いることが好ましい。
【００４１】
なお、図１において、第１緩衝液槽１およびサンプル吸着緩衝液槽３は、収容容器１０に形成された隔壁やサンプル分離部３１等を利用して実現されているが、本発明はこれに限られず、電気泳動を可能にする槽であればよい。
【００４２】
サンプル分離部３１は、第１緩衝液槽１とサンプル吸着緩衝液槽３との間に配置される。このとき、サンプル分離部３１は、例えば図１に示すサンプル分離部置場８に載置されてもよい。載置されたサンプル分離部３１は、Ｙ方向への動きを固定するために、サンプル吸着緩衝液槽３と係合してもよく、Ｚ方向への動きを固定するために、収容容器１０に設けられた上昇防止爪８０により抑えられもよい。
【００４３】
また、サンプル分離部３１は、Ｙ軸方向の両端にそれぞれ開口を有している。具体的には、サンプル分離部３１は、第１緩衝液槽１内に開口する第１開口３５と、サンプル吸着緩衝液槽３内に開口する第２開口３６とを有している。第１開口３５および第２開口３６の形状は、例えば、それぞれ長方形であってもよい。
【００４４】
また、サンプル分離部３１は、図４に示すように、その内部に分離媒体３３を格納するように構成されている。サンプル分離部３１に格納された分離媒体３３は、第１開口３５を介して第１緩衝液槽１内に面し、第２開口３６を介して第２緩衝液槽２内に面する。
【００４５】
図４（ａ）はサンプル分離部３１を示す斜視図であり、図４（ｂ）はその断面図である。図４（ｂ）に示すように、サンプル分離部３１は、２枚の絶縁板３４と、それらの間に空間を確保するため設置されるスペーサ（図示しない）とから構成することができる。また、第１開口３５側では、サンプルを分離媒体３３に接触させるために、分離媒体３３の上部が絶縁板３４から露出していることが望ましい。なお、第２開口３６には分離媒体３３を保持するために親水性膜３２が貼り付けられることが好ましい（図５参照）。
【００４６】
分離媒体３３は、電気泳動によってサンプルを分離するための媒体であり、一般に電気泳動法に用いられる媒体、例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル等を用いることができる。
【００４７】
なお、本明細書中で使用される「サンプル」とは、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は供給源としての生物材料（たとえば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。生物学的サンプルとしては体液（たとえば血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液および髄液）および組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは被験体から得た皮膚病変部、喀痰、咽頭粘液、鼻腔粘液、膿または分泌物である。本明細書で使用される場合、用語「組織サンプル」は組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したたんぱく質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび・または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。また、「サンプル成分」は「サンプル」を構成する種々の因子（成分）が意図される。
【００４８】
吸着用部材６は、サンプルを吸着するための部材であり、図１に示すようにサンプル吸着緩衝液槽３内において第２開口３６と孔３９との間に配置される。また、吸着用部材６は、移動アーム６１に固定され、後述する移動機構によってＺ方向に移動する。
【００４９】
吸着用部材６は、強度を確保できる材料からなることが好ましく、例えば、サンプルがタンパク質の場合にはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜等を用いることができる。なお、ＰＶＤＦ膜は予めメタノールなどを用いて親水化処理を行っておくことが好ましい。また、他にもナイロン、ニトロセルロースなどの、従来用いられている核酸またはタンパク質が結合しやすい膜を用いることができる。
【００５０】
第１電極４１は、第１緩衝液槽１内において第１開口３５に対向して配置され、一方、第２電極４２は、第２緩衝液槽２内において孔３９に対向して配置される。
【００５１】
また、第１電極４１および第２電極４２は、導電性のある素材から形成されればよいが、電極のイオン化を防ぐため、素材には白金を用いることが好ましい。また、第２電極４２の形状は、第２開口３６と同一または第２開口３６よりも小さいことが好ましく、例えば線状であり得る。
【００５２】
（サンプル分離吸着器具１００の動作）
次に、サンプル分離吸着器具１００におけるサンプル吸着までの流れについて、図１を参照して説明する。
【００５３】
まず、収納容器１０のサンプル分離部置場８にサンプル分離部３１を設置し、第１緩衝液槽１に第１緩衝液を、サンプル吸着緩衝液槽３に第３緩衝液を充填する。移動アームに固定されたサンプル吸着用部材６を第３緩衝液中に浸けた状態で第２緩衝液槽を収納容器１０に設置後、第２緩衝液を充填する。その後第１電極４１および第２電極４２を配置する。
【００５４】
次にサンプルを分離媒体３３に導入する。例えば、２次元電気泳動を行う場合には、予め１次元目の等電点電気泳動を行ったサンプル媒体５０を用いる。サンプル導入の際には、アクリル等で作製した支持体５１にサンプル媒体５０を固定する。支持体５１は移動アーム５２によって移動し、サンプル媒体５０をサンプル分離部３１内の分離媒体３３における第１開口３５側の上部に載置する。また、等電点電気泳動等、１次元目の電気泳動を行わない場合には、分離媒体３３に形成されたウェルにサンプルを導入すればよい。
【００５５】
サンプル導入後、第１電極４１と第２電極４２との間に電圧を印加する。第１電極４１と第２電極４２とは、緩衝液および電極間に配置される各部材を介して電気的に接続される。これによって、分離媒体３３内のサンプルがＹ方向に電気泳動し、各サンプル成分の間に生じる移動度の差に基づいて分離され、第２開口３６から排出される。
【００５６】
また、電気泳動の開始後、移動アーム６１が吸着用部材６の引き上げを開始する。このため、第２開口から排出されたサンプルは、吸着用部材６に対して連続的に吸着される。
【００５７】
吸着用部材６へのサンプル吸着は、電極が存在しないサンプル吸着緩衝液槽３内で行われるため、電極反応の影響を受けずに良好に行うことができる。
【００５８】
サンプル吸着の終了後、吸着用部材６は回収され、染色や免疫反応等が行なわれる。その後、蛍光検出器などによって、サンプルの分離転写パターンが検出される。
【００５９】
（第２緩衝液槽）
次に、第２緩衝液槽２の構成について詳細に説明する。
【００６０】
図３（ａ）は第２緩衝液槽２を示す斜視図であり、図３（ｂ）はその断面図である。図４（ａ）は押当部３８および親水性膜３７が設けられた第２緩衝液槽２を示す斜視図であり、図４（ｂ）はその断面図である。
【００６１】
図３（ａ）（ｂ）に示すように、第２緩衝液槽２の側部（隔壁の一部）２１には、槽の内外をＹ方向に通電させるための孔（貫通孔）３９が形成されている。孔３９の開口の形状は、例えば長方形に形成することができる。
【００６２】
第２緩衝液槽２内に第２緩衝液が充填された際、孔３９の内部は第２緩衝液により満たされる。孔３９に緩衝液が満たされると、第１電極４１と第２電極４２との間に電圧を安定的に印加することが可能である。
【００６３】
また、図４（ａ）（ｂ）に示すように、第２緩衝液槽２の側部２１には、孔３９の開口上に、押当部３８が設置されることが好ましい。また、押当部３８上には親水性膜３７が貼り合わせられることがさらに好ましい。押当部３８としては、第１電極４１と第２電極４２との電気的接続を妨げず、かつ、吸着用部材６を第２開口３６に押し当てることが可能な構成であることが好ましい。
【００６４】
例えば、押当部３８は、吸水時に膨張する素材や、貫通孔を有する弾力性素材等から構成することができる。押当部３８として、具体的には、厚さや圧縮度合いの異なるろ紙や、ポリビニルアルコール、ビニロン、ポリ酢酸ビニル、およびポリウレタンなどが挙げられる。
【００６５】
また、親水性膜３７としては、例えば親水性ＰＶＤＦ膜などを用いることができる。
【００６６】
図５は、第２緩衝液槽２とサンプル分離部３１との好ましい配置関係を示す図である。
【００６７】
図５に示すように、第２緩衝液槽２とサンプル分離部３１とは吸着用部材６を挟むように配置される。このとき、第２緩衝液槽２の孔３９は、サンプル分離部３１の第２開口３６と対向している。
【００６８】
第２緩衝液槽２は、第２緩衝液槽２に設けられた押当部３８が吸着用部材６を第２開口３６に向けて押し当てるように構成される。例えば、押当部３８がその素材の有する弾力性や膨張性を利用して吸着用部材６を押し当てるように、第２緩衝液槽２が収容容器１０に固定されてもよい。この押し当ての力によって、吸着用部材６は、サンプル分離部３１の第２開口３６と密着し、また第２緩衝液槽２の側部２１（より具体的には親水性膜３７）に密着する。親水性膜３７はこの密着性をさらに向上させる役割を果たし、加えて吸着用部材６がＺ軸方向に移動する際の滑りを向上させる役割も果たす。
【００６９】
ここで、第２開口３６と吸着用部材６とが密着すると、第２開口３６から排出されたサンプルが第３緩衝液に拡散することを抑えることができる。これによって、サンプルを吸着用部材６に効率的に吸着することができる。
【００７０】
また、第２緩衝液槽２の側部２１と吸着用部材６とが密着すると、穴３９を介する緩衝液の流通が効果的に抑制される。すなわち、電極反応の影響を受けた第２緩衝液が、サンプル吸着緩衝液槽３内の緩衝液に流入することが抑制される。これによって、吸着用部材６に対するサンプル吸着をより高精度に行うことができる。
【００７１】
なお、本発明では、緩衝液の代わりにゲルなどの導電媒体を孔３９に満たすことも可能である。ただし、孔３９にゲルなどの導電媒体を満たした場合、長時間の電圧印加による影響により電気的な接続が得られなくなった途端、電圧値が急上昇し吸着が停止してしまう。よって、長時間安定的に電圧を印加するためには、孔３９に緩衝液を満たすことが好ましい。
【００７２】
また、本発明は、第２緩衝液槽２の側部２１に押当部３８を設ける構成に限られない。例えば、押当部３８の設けられる側部２１は、第２緩衝液槽２の側壁であることに限られず、第２緩衝液槽２とサンプル吸着緩衝液槽３と隔てる隔壁であればよい。
【００７３】
また、押当部３８を設けずとも、第２緩衝液槽２とサンプル吸着緩衝液槽３との間の緩衝液の流通が、サンプル吸着用部材６と側部２１が密着した状態で孔３９を介するものに限られることによって本発明の効果を得ることができる。
【００７４】
また、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００は、上述した各部材が予め取り付けた状態で提供されてもよく、あるいは、使用者が各部材を後から取り付ける構成で提供されてもよい。
【００７５】
（吸着用部材６の移動機構）
次に、吸着用部材６を移動させる移動機構の一例について説明する。
【００７６】
図６および図７は、サンプル分離吸着器具１００の備える移動機構を示す斜視図である。また、図７では、図面を簡略化するために、移動アーム５２および支持体５１を省略して示している。
【００７７】
駆動手段７を含むサンプル分離吸着器具１００の全体は基盤９に固定されている。吸着用部材６は移動アーム６１に固定されており、移動アーム６１は駆動手段７によって駆動される。具体的には、移動アーム６１は第１駆動手段７１に連結されており、第１駆動手段７１は基盤９の上に固定された第２駆動手段７２に連結されている。これら第１駆動手段７１および第２駆動手段７２によって移動アーム６１はＹ方向およびＺ方向へ駆動される。これによって、吸着用部材６の移動を制御することができる。
【００７８】
図８は、駆動手段７と電極（第１電極４１および第２電極４２）との間の制御を説明するためにサンプル分離吸着器具１００を示す断面図である。
【００７９】
図８に示すように、第１電極４１および第２電極４２は、配線１１２を介して、電源１１１の負極および正極にそれぞれ接続されている。また、電源１１１と第２電極４２との間には電流計１１３が配置される。第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流が流れるように、データ処理装置１１４によって電源１１１が制御される。
【００８０】
また、図８に示すように、駆動手段７（第１駆動手段および第２駆動手段）は駆動手段制御部７０により制御される。吸着用部材６を引き上げる時間になると、駆動手段制御部７０は駆動手段７が駆動を開始するように制御する。さらに、データ処理装置１１４は、電流計１１３の測定する電流値に基づいて、駆動手段制御部７０を制御してもよい。
【００８１】
なお、図示していないが、移動アーム５２についても上述した移動機構と同様な手段を用いて駆動することができ、これによってサンプルの導入を制御することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
実施例１では、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００を用いて、２次元電気泳動の２次元目の電気泳動とサンプル吸着とを行った。
【００８４】
〔１次元目電気泳動（サンプル媒体５０）〕
サンプル媒体５０として、イモビラインによる固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動用ゲルを１ｍｍ×６０ｍｍに切断して用いた。サンプル導入とゲル膨潤を行い、６０００Ｖで１時間の電気泳動を行った。
【００８５】
なお、サンプルとしては、蛍光マーカーで染色したマウス肝臓サンプルを用いた。
【００８６】
〔サンプル分離部３１〕
２枚の絶縁板３４として、６０ｍｍ×３０ｍｍ×２ｍｍ厚と６０ｍｍ×２８ｍｍ×２ｍｍ厚であり、２枚とも０．５ｍｍの段差を両端に有する石英ガラスを用いた。２枚の石英ガラスの外側には親水性ＰＶＤＦ膜をカプトンテープにより貼り付けた。このとき、親水性ＰＶＤＦ膜とガラス面との間に隙間ができないように注意し、カプトンテープは第２開口３６を阻害しないようにした。この石英ガラスの両端は中央部より０.５ｍｍ突起しており、この突起部から分離媒体の厚さを規定した。
【００８７】
上記のように作製したサンプル分離部３１にポリアクリルアミドゲルを充填したものを、サンプル分離部置場８に設置し、上昇防止爪８０で固定した。
【００８８】
〔第１緩衝液槽１〕
７０ｍｍ×７０ｍｍ×深さ１５ｍｍ（サンプル分離部置場８においては深さ８ｍｍ）の第１緩衝液槽１を収容容器１０に設け、第１緩衝液を充填した。第１緩衝液には市販のＭＯＰＳ／ＳＤＳバッファーを用いた。第１緩衝液槽１に配置する第１電極４１としては白金線を用いた。第１電極４１は電源１１１の負極に接続した。
【００８９】
〔第２緩衝液槽２〕
７０ｍｍ×７０ｍｍ×深さ１５ｍｍの第２緩衝液槽２を用い、その槽の側部２１（Ｚ方向１ｍｍ厚）の外側には、押当部３８を設置した。押当部３８表面には親水性膜３７を取り付けた。第２緩衝液槽２を収容容器１０に嵌め込んで設置し、上昇防止爪８０により固定した。第２緩衝液を第２緩衝液槽２に充填した。第２緩衝液には市販のＭＯＰＳバッファーを用いた。第２緩衝液槽２に配置する第２電極４２としては白金線を用いた。このとき、第２電極４２は電源１１１の正極に接続した。
【００９０】
〔サンプル吸着緩衝液槽３〕
第２緩衝液槽２を収容容器１０に設置することによって、第２緩衝液槽２、収容容器１０、およびサンプル分離部３１の間に出来たスペースを、サンプル吸着緩衝液槽３として用いた。サンプル吸着緩衝液槽３には、観察対象サンプルが吸着されやすいｐＨ条件を有する第３緩衝液を満たした。第３緩衝液には、第２緩衝液と同様、市販のＭＯＰＳバッファーを用いた。
【００９１】
〔吸着用部材６〕
吸着用部材６として、疎水性ＰＶＤＦをメタノールにより親水化したものを用いた。吸着用部材６の上端側を移動アーム６１に固定し、下端側をサンプル吸着緩衝液槽３内の第３緩衝液に浸漬させた。
【００９２】
〔サンプル媒体５０の分離媒体３３への導入〕
サンプル分離部３１の第１開口３５において分離媒体３３が露出している部分に、一次元目の電気泳動サンプルを含んだサンプル媒体５０を、移動アーム５２により上部から下ろして密着させた。
【００９３】
〔二次元目電気泳動〕
サンプル媒体５０と分離媒体３３が密着した状態で、電流計１１３の値が２５ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を２５分間流した。
【００９４】
〔サンプル吸着〕
電流計１１３の値が４０ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を６０分間流した。この時、第１駆動手段７１によって吸着用部材６を上方へ引き上げた。この引き上げ速度については、駆動手段制御部７０によって３２μｍ／ｓｅｃから２μｍ／ｓｅｃへと段階的に減速させた。
【００９５】
〔結果〕
サンプル吸着後、吸着用部材６を回収し、サンプルの検出を行った。その検出結果を図１１に示す。図１１に示すように、実施例１によれば、サンプル分離とサンプル吸着とを同一器具にて連続的に行いつつも、分解能の高いサンプル吸着パターンを得ることができた。
【００９６】
（実施例２）
実施例２では、本実施形態に係るサンプル分離吸着器具１００を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとサンプル吸着とを行った。実施例２では、第１実施例と同様であるところの説明を割愛し、以下には相違点のみを説明する。
【００９７】
〔サンプル分離部３１〕
サンプル分離部３１は実施例１と同様に作製した。サンプル分離部３１の内部には、分離媒体３３としてポリアクリルアミドゲルを充填した。ポリアクリルアミドゲルが重合する前に第１開口３５の上部にコームを差し込み、一次元電気泳動サンプル投入用のウェルを作製した。作製したウェルに分子量可視マーカーサンプルを１０μＬ流し込み、その後、アガロースゲルによってウェルに蓋をした。第２開口３６の外側には親水性膜３７を巻き付けた。
【００９８】
なお、サンプルとしては、可視タンパク質マーカーを用いた。
【００９９】
〔ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ〕
電流計１１３の値が２５ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を２５分間流した。
【０１００】
〔サンプル吸着〕
電流計１１３の値が４０ｍＡとなるように、第１電極４１と第２電極４２との間に一定電流を６０分間流した。この時、第１駆動手段７１によって、吸着用部材６を上方へ引き上げた。この引き上げ速度については、駆動手段制御部７０によって３２μｍ/secから２μｍ/secへと段階的に減速させた。
【０１０１】
〔結果〕
サンプル吸着後、吸着用部材６を回収し、サンプルの検出を行った。その検出結果を図１２に示す。図１２に示すように、実施例２によれば、サンプル分離とサンプル吸着とを同一器具にて連続的に行いつつも、分解能の高いサンプル吸着パターンを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、現在盛んにおこなわれているプロテオーム研究をより発展させることができる。また、本発明に係るサンプル分離吸着器具および当該器具に用いる種々の部材を別々に作製および販売することにより市場を活性化することができる。
【符号の説明】
【０１０３】
１ 第１緩衝液槽
２ 第２緩衝液槽
３ サンプル吸着緩衝液槽（第３緩衝液槽）
６ 吸着用部材（サンプル吸着用部材）
７ 駆動手段
２１ 側部
３１ サンプル分離部
３３ 分離媒体
３５ 第１開口
３６ 第２開口
３８ 押当部
４１ 第１電極
４２ 第２電極
６１ 移動アーム
１００ サンプル分離吸着器具
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離媒体に緩衝液を介して電流を流すことによって、上記分離媒体中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを上記分離媒体からサンプル吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具であって、
第１電極が配置される第１緩衝液槽と、
第２電極が配置される第２緩衝液槽と、
上記第１緩衝液槽と上記第２緩衝液槽との間に配置される第３緩衝液槽と、
上記第１緩衝液槽内に開口する第１開口および上記第３緩衝液槽内に開口する第２開口を有し、かつ、上記分離媒体を格納するサンプル分離部と、
上記サンプル吸着用部材をサンプルの分離方向に垂直な方向に移動させる移動手段とを備え、
上記第２緩衝液槽内と上記第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁において上記第２開口に対向する部位には、通電のための貫通孔が設けられており、
上記サンプル吸着用部材は、上記第３緩衝液槽内における上記第２開口と上記貫通孔との間に配置されることを特徴とするサンプル分離吸着器具。
【請求項２】
上記隔壁における上記貫通孔の開口上には、上記サンプル吸着用部材を上記第２開口に向けて押し当てる押当部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項３】
上記押当部は、貫通孔を有する弾力性素材、または、吸水時に膨張する素材から構成されることを特徴とする請求項２に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項４】
上記第２緩衝液槽は、脱着可能な槽として構成されており、上記貫通孔は上記第２緩衝液槽の側部に設けられていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項５】
上記貫通孔には導電媒体が充填されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項１】
分離媒体に緩衝液を介して電流を流すことによって、上記分離媒体中のサンプルを分離し、かつ、分離されたサンプルを上記分離媒体からサンプル吸着用部材へ吸着させるサンプル分離吸着器具であって、
第１電極が配置される第１緩衝液槽と、
第２電極が配置される第２緩衝液槽と、
上記第１緩衝液槽と上記第２緩衝液槽との間に配置される第３緩衝液槽と、
上記第１緩衝液槽内に開口する第１開口および上記第３緩衝液槽内に開口する第２開口を有し、かつ、上記分離媒体を格納するサンプル分離部と、
上記サンプル吸着用部材をサンプルの分離方向に垂直な方向に移動させる移動手段とを備え、
上記第２緩衝液槽内と上記第３緩衝液槽内とを隔てる隔壁において上記第２開口に対向する部位には、通電のための貫通孔が設けられており、
上記サンプル吸着用部材は、上記第３緩衝液槽内における上記第２開口と上記貫通孔との間に配置されることを特徴とするサンプル分離吸着器具。
【請求項２】
上記隔壁における上記貫通孔の開口上には、上記サンプル吸着用部材を上記第２開口に向けて押し当てる押当部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項３】
上記押当部は、貫通孔を有する弾力性素材、または、吸水時に膨張する素材から構成されることを特徴とする請求項２に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項４】
上記第２緩衝液槽は、脱着可能な槽として構成されており、上記貫通孔は上記第２緩衝液槽の側部に設けられていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のサンプル分離吸着器具。
【請求項５】
上記貫通孔には導電媒体が充填されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のサンプル分離吸着器具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１０２７２１（Ｐ２０１１−１０２７２１Ａ）
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５６９７４（Ｐ２００９−２５６９７４）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
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