シアリルルイスｃ、シアリルＴｎ、及びＮ−グリコリルノイラミン酸のエピトープに関連づけられるヒトモノクローナル抗体、ならびに前記エピトープを含む幹細胞の分析方法
本発明は抗体工学の技術に関する。特に、本発明はヒトＩｇＭ抗体及びその誘導体に関し、それはいくつかのオリゴ糖配列及び／又は異種抗原性のシアリン酸残基に対する新規の結合特異性を有している。本発明は更にこのような新規の糖類及び／又はＮｅｕＧｃ結合型モノクローナル抗体を生成及び操作するプロセスと、免疫診断の分野でこれらの抗体及びその誘導体を用い、生物学的かつ未加工の物質サンプルにおける異種抗原性ＮｅｕＧｃの定性的及び定量的決定を可能にし、ならびに免疫療法においては、患者中の異種抗原性ＮｅｕＧｃの遮断を可能にするための方法とに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体工学の技術に関する。特に、本発明は、ヒトのグリカン結合型抗体及びその誘導体に関し、それはヒト以外の抗原性グリカンを含む特異的なオリゴ糖配列を結合する。本発明は更にこのようなグリカン結合型モノクローナル抗体を生成及び操作するプロセスと、免疫診断の分野でこれらの抗体及びその誘導体を用い、生物学的かつ未加工の物質サンプルにおけるヒト以外の抗原性グリカンを含む特異的なオリゴ糖配列の定性的及び定量的決定を可能にし、ならびに免疫療法においては、例えば移植の状況下で、患者中の抗原性グリカンの遮断を可能にするための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト自然抗体の結合特異性は既知である。自然抗体は、癌若しくは平均的な自己免疫疾患のような悪性疾患、又は異種抗原性グリカンのような病原性物質に対する保護に関与しうることが分かる。自然抗体の特異性は、その生成を生じさせる病原性症状の性質決定に有用であることが分かる。更に、新規の抗体及び特異性は新規試薬の生成及び最適化に有用である。
【０００３】
表２は、糖鎖認識に関与しうる、１．４．３０型の重鎖のペプチド配列の一部と関連付けできる特定の抗体型タンパク質配列を列記するが、本発明による最も好適な標的のオリゴ糖配列は示されていなかった。刊行物は重鎖１．４．３０型の配列全体も、新規の軽鎖配列も示していないことは理解されよう。糖鎖配列は１．４．２４型又は１．４．１１型のような他の新規の抗体又はこれらと相同の抗体について示していないことは更に理解されよう。
【０００４】
様々な細胞ベースの治療法が開発下にある。治療用細胞の抗原性グリカン及び／又は異種抗原性物質との混入は、新規の細胞治療法の開発における主要な問題であると認識されてきた。ＮｅｕＧｃは異種抗原、及び、例えばブタからヒトへの器官の異種移植を防ぐ障壁として知られ（国際公開第０２０８８３５１号、Ｚｈｕ，Ａｌｅｘ）、異種移植は更に複数のバイオ企業によって開発下にある。
【０００５】
ＮｅｕＧｃに対する抗体は公表されてきた。最も公表されている抗体はニワトリで生成され、更にヒトと同様にＮｅｕＧｃグリカンがない。シアリン酸の特徴的なグリセロール基側鎖のない酸化したＮｅｕＧｃを含むカラムにおけるニワトリ抗体の親和性精製による、ＮｅｕＧｃ認識型の抗体の生成のための方法が公表された（Ｖａｒｋｉ Ａら、国際公開第２００５０１０４８５号）。この方法は特定のニワトリ抗体の精製に有用であると思われる。本発明はＮｅｕＧｃのグリセロール部分への結合活性を含むヒトの天然型モノクローナル抗体の生成に関する。モノクローナル抗体が通常のバイオ技術の方法によって特徴づけられ、かつ再現性良く生成されうる試薬としての利点を有することは理解されよう。
【０００６】
特異的な特定のオリゴ糖の糖脂質を結合する、黒色腫の患者から生成されるヒトＩｇＭ抗体の２のクローンが更に報告された（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら、１９８８）。これらの抗体は、通常のヒト細胞又は組織も、癌のサンプルも認識しなかった。他の抗体３２−２７Ｍは糖脂質中の内部ＮｅｕＧｃに対し特異的であり、Ｎｅｕ５ｘα８Ｎｅｕ５Ｇｃα３（ＧａｌＮＡｃβ４）Ｇａｌβ４Ｇｌｃ型の配列中の非還元性末端の末端ＮｅｕＧｃに対しては特異的ではない。ウシ胎仔血清中で成長する黒色腫細胞で糖脂質を結合し、糖脂質の混入の可能性を有する。他の抗体は特定の糖脂質状の末端ＮｅｕＧｃを認識したが、いずれの条件下でもヒト細胞ではない（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら、１９８８）。本発明による抗体は、特異的な酸性の糖エピトープ及びＮｅｕＧｃ含有型の単糖及びオリゴ糖構造を認識することを明らかにし、ヒト細胞上のこのような構造はタンパク質である。癌の状況においては、オリゴ糖の糖脂質構造ＮｅｕＧｃα３ＬａｃβＣｅｒ（ＧＭ３）に対し特異的な、特定のわずかに特徴づけられた同様のポリクローナルＮｅｕＧｃ抗体（いわゆる、Ｄｅｉｃｈｅｒ−Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ抗体）が報告された。これらの研究は分析又は治療用途に対して有用な純粋なヒト抗体を表わしてないように思われる。
【０００７】
ＮｅｕＧｃ含有型のＧＭ３ガングリオシドＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ、又はシアリル２型のＮ−アセチルラクトサミンの糖脂質ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＧａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒに特異的に結合するＮｅｕ５Ｇｃ認識型のＰ３抗体は、天然のマウスＩｇＭ抗体として、かつヒト化抗体として知られている（国際公開第９９２０６５６号、Ｖａｓｑｕｅｚら）。抗体は糖脂質特異性であると示された。この特異性はＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）の型を排除し、シアリン酸含有配列のためのα３結合とともに、Ｎ−アセチルラクトサミン中にβ４結合があり、更に、Ｐ３抗体がＮｅｕＧｃ特異性を排他的に伝えるが、一方、この抗体はシアリン酸に対する配列特異性の優先度を有する。
【０００８】
本発明は、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃの双方を有し、異なる特異性がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとが認識し、重鎖及び軽鎖上に異なるペプチド配列を有する新規のヒト抗体を明らかにする。特有の結合特異性は更に、好適な実施形態においてシアリルＴｎ構造としてのα結合形態で、末端配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃを含む。この抗体がタンパク質上に、及び／又は、タンパク質及び糖脂質上に好適なグリカン構造を認識し、特異性は標的分子中の脂質構造を要求しないことは理解されよう。α３でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン及びラクトースＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎはこの抗体に対し非常に低い結合親和性を有するか、あるいは全く認識せず、このことはＰ３型又はＧＭ３特異的な抗体との相違を示す。
【０００９】
新規のオリゴ糖配列の結合特異性は、バックグラウンドにおける大部分のガングリオシド特異性と大いに異なり、１．４．３０型に関連づけた配列、特に重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、より特異的にはＦＴＦＳＳＹＡＭＳ型の配列と関連するものを含む。重鎖のＣＤＲ１領域は全体的に異なるオリゴ糖結合特異性を有するＰ３及び１４Ｆ７抗体に対する特定の相同性を有する。本発明で提供される軽鎖及び重鎖配列によって、本発明による１又はそれ以上のオリゴ糖結合活性を有するヒト抗体の設計及び最適化を可能にすることが更に理解されよう。ヒト抗体は抗原性ではないため、生体内及び生体外での免疫診断及び分析又は治療に有用である。
【００１０】
特に、α３結合された１型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβと、Ｏ−グリカン配列ＳＡα６ＧａｌＮＡｃα、及び、更には２型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβを含むが他のシアリル三糖配列を事実上排除するα６でシアリル化された構造との、この組合せは非常に特有であり、抗体中の特異的な２の別個のシアリン酸結合部位を暗示していることは理解されよう。
【００１１】
抗体の構造は、二級ヒドロキシル上にあるが、２型ラクトサミンと関連づけられないα３結合されたシアリン酸、及び、よりフレキシブルな一級ヒドロキシル構造上にあるα６結合されたシアリン酸のいずれかで２の配列型を認識できる。特異性は二分岐型のＮ−グリカンコア構造［ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ］上にある配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβのうちの少なくとも１つの強い認識を含まないことは更に明らかにされ、シアリルＴｎ構造はＮ−グリカン上に存在できないことが更に知られる。この特異性は明らかに、出願人の先の発明における、好適な幹細胞混入Ｎ−グリカン構造と異なっている。
【００１２】
いくつかのオリゴ糖配列は、ヒト幹細胞の性質決定用で知られている。本発明は無傷細胞の表面からいくつかの異なる配列を認識する特異的な結合試薬に関する。その認識は大きな細胞集団を含んでもよく、例えばほぼ８０％の幹細胞の標識化を示す。図９参照。並列実験において、細胞が脱離後二時間となった時に８０％を超える標識化が得られた。本発明は間葉系幹細胞、特に好適なヒト血液関連の幹細胞の性質決定のために、及び、特定形態の外因性試薬及び細胞培養条件、又はその欠如の状況における、特に有用な方法を明らかにした。
【００１３】
ヒト自然抗体は、有害な抗抗体免疫反応の可能性を有する動物からのいくつかの既知の抗体よりもヒト用途に好ましく、ヒトのグリカンと関連する構造をより認識できる。
【００１４】
ＮｅｕＧｃ結合型抗体は異種抗原性エピトープを特徴的に認識し、このような物質に対する免疫反応を検出及び決定するために臨床又は免疫診断で有用である。ハイブリドーマ技術といった従来の方法論によるＮｅｕＧｃエピトープを特異的に結合できるモノクローナル抗体の生成は、マウス及びほとんどの他の動物中の通常のグリコシレーションとしての構造の存在によって妨害されてきた。ファージディスプレイ技術はヒトの特定の複合型オリゴ糖構造に対する抗体の生成において適用され、有効な抗原性の決定基はいくつかの単糖残基をおおっている。しかしながら、ＮｅｕＧｃグリカンと結合するが、ＮｅｕＡｃグリカンと結合しない抗体中にあるような、ヒドロキシル基によって置換される１の水素イオンの軽微な変化のみで、単一の末端単糖を有効に認識することが可能なファージディスプレイ又は他のヒト抗体についてデータが存在しない。この抗体は、ＮｅｕＧｃ−単糖及び他の糖類の多価性高密度複合体を有効に認識する。抗体は更に、タンパク質及びヒト細胞を含む細胞の認識用に有用であることを示した。この方法は、臨床及び診断用途のために一定の質で生成されうる、酸性オリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃに特異的な組換え型抗体を生成するための新規の手段を与えている。
【発明の概要】
【００１５】
我々は本出願において、抗体が、生物学的サンプルにおける糖類及びＮｅｕＧｃ糖類の定性的及び定量的測定のために設計されるイムノアッセイにおいて、及び、例えば移植と関連するような免疫療法において、試薬として利用するのに十分に高い親和性及び特異性を有する場合の、α３でシアリル化された１型ラクトサミン、ＳＡα６Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ構造、ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、及びシアリルＴｎのＳＡα６ＧａｌＮＡｃを含む、特定の新規の酸性オリゴ糖と、異種抗原性のＮｅｕＧｃ糖類又は対応するＮｅｕＧｃグリカンを含む、特定の単糖エピトープとを特異的に結合するヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＭの抗体フラグメントの開発及び性質決定について述べる。特に、本発明はファージディスプレイ技術といった抗体ライブラリ法による糖類及び／又はＮｅｕＧｃに特異的なヒト抗体の選択と、大腸菌中で生成される、操作した抗体フラグメントの結合特性の性質決定について述べる。
【００１６】
従って、本発明は異なる種類のイムノアッセイプロトコルならびにヒト免疫療法に用いるべき新規の試薬を提供する。本発明は更に、これらの特異的な均一品質の試薬の連続供給の保証を可能にし、本来の処理単位ごとのポリクローナル抗血清の変化を除去する。これらの有利な効果は、新規、特異的、かつ経済的な、均一品質の免疫診断アッセイ及び治療用分子の製造を可能にする。
【００１７】
従って、ある本発明の特異的な目的は、本発明による糖類、そのフラグメント、その化学的又は非共有結合的な複合物、又はこのような抗体の他の誘導体を結合するヒトモノクローナル抗体を提供することであり、酸性糖類、及び／又は、好適な実施形態においては生物学的サンプルにおける糖類及び／又はＮｅｕＧｃの定性的及び／又は定量的測定、ならびに免疫療法におけるその使用を可能にする親和性及び特異性を有するＮｅｕＧｃグリカンを結合する。本発明の一価及び、特に少数価数の抗体は、異種抗原性のＮｅｕＧｃ糖類を含む糖類に対する特異的な結合を示す。
【００１８】
本発明の別の目的は、特異的なオリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃ糖類に特異的な抗体鎖をコード化するｃＤＮＡクローン、ならびに、特異的なオリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃ糖類に結合する抗体、そのフラグメント、又はこのような抗体の他の誘導体を生成するよう、このようなクローンを発現するための構造及び方法を提供することである。本発明は更に、ａ）核酸配列の発現分析用に、ｂ）核酸配列の発現を有効にするために、核酸配列及び相補的核酸配列、ならびに核酸配列と結合及びハイブリッド形成する類似の能力を有するその相同体の使用に関する。
【００１９】
本発明の更なる目的は、生物学的サンプル中の特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ糖類の定性的及び定量的測定のために、特異的な糖類及び、好適な実施形態においては特にＮｅｕＧｃ含有糖類に結合する抗体、そのフラグメント、若しくはこのような抗体の他の誘導体、又はその組合せを用いる方法を提供することである。更に、本発明は患者における免疫療法のために、特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ結合型の抗体、そのフラグメント、若しくはこのような抗体の他の誘導体、又はその組合せを提供する。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の図面及び詳細な説明で明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特異的な実施例は本発明の好適な実施形態を示すが、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び変形は、この詳細な説明から当該技術分野の当業者に明らかとなるため、例示のみのために与えられると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図の構成はスケールどおりではない。
【００２２】
【図１】図１は、無傷のヒト免疫グロブリン抗体、Ｆａｂフラグメント、及び単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の概略的な表現を示す。抗体のドメイン構造及び結合価は抗体クラスの選択に依存し、例えば、ＩｇＭは二価抗体構造のペンタマを含む。抗原結合部位は三角形で示される。
【図２】図２は、パニング手順を概略的に示す。
【図３】図３は、ＶＬ領域の推定アミノ酸配列の配列比較である。相補性決定領域（ＣＤＲ）が四角形で囲まれる。番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１）による。
【図４】図４は、ＶＨ領域の推定アミノ酸配列の配列比較である。相補性決定領域（ＣＤＲ）が四角形で囲まれる。番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１）による。
【図５】図５は、異なるＶＬ領域のｃＤＮＡである。ＶＬ領域のｃＤＮＡはファージディスプレイ技術によって分離された。
【図６】図６は、異なるＶＨ領域のｃＤＮＡである。ＶＨ領域のｃＤＮＡはファージディスプレイ技術によって分離された。
【図７】図７は、タンパク質レベルでのＶＨ及びＶＬ領域の相同性である。図３及び４中のアミノ酸配列の配列比較はタンパク質配列ツリーを描くために用いられた。
【図８】図８は、実験的手順で述べたようなイムノアッセイによって決定される１．４．２４型及び１．４．３０型の抗体の特異性である。１．４．２４型及び１．４．３０型の双方の抗体は天然生成型のＮｅｕＡｃ−単糖（ＧＦ３０８）以上にＮｅｕＧｃ−単糖（ＧＦ３０９）に対して、更に本発明による特定の他の末端糖エピトープに対して特異性が高い。
【図９】図９は、ＦＡＣＳ中の１．４．２４型抗体によるヒト臍帯血の間葉系幹細胞であるヒトＣＢ−ＭＳＣ細胞のラベリングである（「ｓｕｏｒａ ｌｅｉｍａｕｓ」は直接ラベリングのことである）。データは抗体によってラベリングされた多数の無傷細胞集団を示し、ラベリングは細胞培養条件に依存する。
【図１０】図１０は、実験的手順で述べられるようなイムノアッセイによって決定される１．４．１９−３（Ｆ３）型抗体の特異性である。糖類の還元性末端での文字Ａ、及び例えば（ａ２，６）のような結合構造中のａは（α２，６）といったα結合を示し、糖類の還元性末端での文字Ｂ、及び結合構造中のｂはβアノマ構造を示す。多価のポリアクリルアミド糖類複合体は、ロシアのＬｅｃｔｉｎｉｔｙ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社から入手するか、あるいはグリカンのドナー及び構造がＮＭＲ分光法によって検証される場合、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃを用いたものからシアル酸転移酵素反応によって合成された（酵素はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から入手）。
【図１１ａ】図１１ａは、ｓｃＦｖ１．４．１９−３（Ｆ３）のｃＤＮＡ及びタンパク質配列である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、１．４．２４型に対応する重鎖構造及び１．４．３０型に対応する軽鎖構造を有する、ｓｃＦｖ１．４．１９−３（Ｆ３）クローンの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［略語］
ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
Ｅ．ｃｏｌｉ 大腸菌
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
Ｆａｂ 特異的な抗原結合を有するフラグメント
Ｆｄ 重鎖の可変及び第１定常ドメイン
Ｆｖ 特異的な抗原結合を有する抗体の可変領域
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ
ｍＲＮＡ 伝令リボ核酸
ＮｅｕＡｃ Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−アセチルノイラミン酸
ＮｅｕＧｃ Ｎｅｕ５Ｇｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ リボ核酸
ｓｃＦｖ 単鎖抗体
ＳＡ シアリン酸、ＮｅｕＧｃ及びＮｅｕＡｃを含むノイラミン酸
ｓｕｐＥ グルタミン挿入型のアンバ抑圧ｔＲＮＡを運ぶ菌種の遺伝子型
ＶＨ 重鎖の可変領域
ＶＬ 軽鎖の可変領域
【００２４】
出願人は例えば国際公開第２００７／００６８６４号、国際公開第２００８／１０７５２２号、国際公開第２００８／０８７２５９号、国際公開第２００８／０８７２５８号、国際公開第２００８／０８７２５７号、国際公開第２００７／００６８７０号などの、幹細胞のグリカンマーカ構造についての他の同時係属中の発明を有し、引用として全体が含まれている。
【００２５】
結合剤分子／試薬はグリカンを結合し、好ましくは、結合剤に結合されるラベルのような結合の観察を可能にする特性を含む。強固なグリカン構造に対する新規のグリカン特異性は、グリカンに結合する試薬の高次構造を構造的に規定し、例えばインターネットページｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｓｗｅｅｔｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐのｓｗｅｅｔｄｂから入手可能である。好適な結合剤は、ａ）抗体、レクチン、及び酵素のようなタンパク質と、ｂ）タンパク質の結合ドメイン及び部位のようなペプチド、及びファージディスプレイペプチドのような合成ライブラリ由来のアナログと、ｃ）アプタマ等を含むペプチド物質を模倣する他のポリマ又は有機主鎖分子を含む。
【００２６】
タンパク質がモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転移酵素、植物レクチン、動物レクチン、又はそのペプチド模倣薬の群から選択される場合、ペプチド及びタンパク質は好ましくは、組換えタンパク質又はその得られた、対応する糖鎖認識ドメインであり、結合剤は検出可能なラベル構造を含む。配列データ及び分子モデリングに基づいて、この抗体のような結合剤分子を設計することが可能なことは理解されよう。抗体及びそのフラグメントが最も好適な結合試薬である。
【００２７】
以下の定義は本明細書中で用いられるいくつかの用語のために提供される。用語「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」及び「Ｆａｂ」は欧州特許出願第０１２５０２３号で用いられるのと同様に用いられる。
【００２８】
多様な文法的形態にある「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン分子の集団及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的な活性部分、すなわち抗原結合部位又はパラトープを含む分子を称する集合名詞として本明細書中で用いられる。本明細書中の用語「抗体」によって述べられた分子の例は限定しないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と、Ｆａｂフラグメントと、Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）フラグメントと、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）と、Ｆｖと、ＶＬ又はＶＨのいずれかのドメインを含むか、あるいは交互になるフラグメントとを含む。本発明の免疫グロブリン分子は任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）であってもよく、あるいは免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。好ましくは本発明の抗体は、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、又はＶＬ ＣＤＲを含むか、あるいは交互に含んでもよい。
【００２９】
「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」、「パラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）」は、抗原を特異的に結合する抗体分子の構造上の一部分である。
【００３０】
例示的な抗体はパラトープを含む、それらの免疫グロブリン分子の一部分であり、Ｆａｂ及びＦｖとして知られるそれらの一部分を含む。
【００３１】
抗体の一部である「Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、既知の方法による実質的に無傷の抗体上のパパインのタンパク質分解反応によって調製できる。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂフラグメントは更に、当該技術分野の当業者に既知の組換え方法によって生成してもよい。例えば、米国特許第４，９４９，７７８号参照。
【００３２】
「ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」はタンパク質の独立した折り畳み部分について述べるために用いられる。天然タンパク質におけるドメイン境界部に対する一般的な構造上の定義は、Ａｒｇｏｓ、１９８８で与えられる。
【００３３】
「可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」又は「Ｆｖ」は、免疫グロブリン分子のそれらの領域について述べるのに用いられ、抗原又はハプテン結合を担っている。通常、これらは免疫グロブリン分子の軽鎖及び重鎖のＮ末端の最初の約１００のアミノ酸からなる。
【００３４】
「単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインがリンカペプチドを介して相互に結合されて、単一のｍＲＮＡ分子から合成（転写）された、連続的なアミノ酸鎖を形成する分子を規定するために用いられる。
【００３５】
「リンカ（ｌｉｎｋｅｒ）」又は「リンカペプチド（ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、天然型又は操作型のタンパク質中の隣接するドメイン間で延在するアミノ酸配列について述べるのに用いられる。
【００３６】
「ＮｅｕＧｃ結合型抗体（ＮｅｕＧｃ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、その可変ドメインによって媒介される相互作用によって、ＮｅｕＧｃを特異的に認識し、それに結合する抗体である。特異的な認識は、対応するコントロールの糖類と比較した、特異的な糖類に対する結合活性の高さを表わす。
【００３７】
「糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は単糖又はオリゴ糖のエピトープを表わす。糖エピトープは非還元性末端の末端糖類であることが好ましく、その還元性末端からのみ伸長できることが好ましい。伸長部は、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、デンドリマ、又は多糖類を含むポリマ、又は疎水性のアグリコンを含む脂質といったタンパク質のような担体への結合によって、より大きな糖質構造及び／又は伸長部にできる。好適なポリマ構造は更に、例えば合成のネオ糖タンパク質又はネオ糖脂質における天然及び／又は非天然の糖質構造か、あるいは１価のアグリコン構造への結合、又はポリマのような担体構造に対するスペーサを含む糖類ポリマ複合体とを含む。
【００３８】
本発明による抗体あるいはこれらを含む血清又はライブラリといった、生物学的物質の分析の状況においては、好適なオリゴ糖エピトープは非還元性末端の末端オリゴ糖配列、より好ましくは伸長型のオリゴ糖配列を含み、天然担体構造は、還元性末端でセラミドを含むスフィンゴ糖脂質といった、タンパク質及び／又は脂質構造に結合するＯ−グリカン及び／又はＮ−グリカンの構造を含む、１又はそれ以上のタンパク質といった天然の複合糖質であることが好ましい。エピトープは好適な実施形態においては、従来技術の既知かつ変更可能な分岐型細菌性多糖類といった一部の多糖類、例えば発明者の述べた部分であってもよい。より好ましくは、糖類は還元性末端から単独で伸長され、更には、オリゴ糖配列は、任意の更なる群によって、還元性末端ではない任意のヒドロキシル基構造に変更又は分割されないことが好ましい。伸長構造はＯ−グリカン、Ｎ−グリカン、又は糖脂質（好ましくは、スフィンゴ糖脂質）の構造として認識される天然型グリカンの天然型配列であってもよい。
【００３９】
単一の単糖残基はα又はβグリコシド結合によって、スペーサ構造、好ましくはグリコシド結合したアルキルスペーサといった非単糖物質に結合され、グリカンをポリマに、好適な実施形態においてはポリペプチド、デンドリマ、又はポリアクリルアミドに、より好ましくはポリアクリルアミドに結合する。本発明はα及びβ結合されたシアリン酸の双方、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ及びグルクロン酸、好ましくはα又はβ結合を有するＧｌｃＡへの結合を明らかにした。本発明は更に、ＧｌｃＡを含む天然型グリカン、特にグリコサミノグリカン及び／又は糖脂質におけるＧｌｃＡへの結合の分析に関する。本発明は更に、グリコサミノグリカンといった平均的な多糖類配列における、オリゴ糖配列中のウロン酸含有型単糖残基へ結合する抗体の分析に関する。
【００４０】
糖脂質及び糖質の命名法は実質的に、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名委員会による推奨によるものである（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９８，３１２，１６７、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９７，２９７，１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２５７，２９）。
【００４１】
Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｌｃ（グルコース）、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、及びＮｅｕ５ＡｃはＤ体であり、ＦｕｃはＬ体であり、総ての単糖ユニットはピラノース型であると想定する。アミン基は規定されるように、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃの２位上に天然型ガラクトサミン及びグルコサミン用に存在する。グリコシド結合は部分的には短く、部分的には長い命名法で示され、シアリン酸ＳＡ／Ｎｅｕ５Ｘ残基のα３及びα６の結合はα２又は３、及びα２ないし６と同一の物をそれぞれ意味し、他の単糖残基があれば、α１ないし３、β１ないし３、β１ないし４、及びβ１ないし６はそれぞれα３、β３、β４、及びβ６として短縮できる。ラクトサミンは２型のＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及び／又は１型のＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃのことであり、シアリン酸（ＳＡ）はＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）若しくはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、又はＮｅｕ５Ｘの誘導体を含むその他の天然型シアリン酸である。シアリン酸はともにＮｅｕＮＸ又はＮｅｕ５Ｘのことであり、好ましくはＸはＡｃ又はＧｃである。場合によっては、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃ／ＸはＮｅｕＮＡｃ／ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＮＧｃ／ＮｅｕＧｃ／ＮｅｕＮＸとしてもよい。本明細書でのグリカンという用語は広範に、ヒト又は動物の複合糖質中にある、特に糖脂質又は糖タンパク質上のオリゴ糖又は多糖類の鎖を意味する。１又は複数のグリカンエピトープはオリゴ糖配列を意味し、伸長型エピトープは還元性末端で伸長される、好適なオリゴ糖配列の変異体を意味する。
【００４２】
「オリゴ糖配列（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はグリコシド結合した単糖残基の特異的な配列を意味し、好ましくは末端及び「コア（ｃｏｒｅ）」の配列を含む。オリゴ糖のコア配列は１又はそれ以上の非還元性末端の単糖によって修飾されうる。「末端オリゴ糖配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」の発現は、オリゴ糖が別の単糖残基又は複数の残基によって非還元性末端の末端残基と置換されないことを示す。好ましくは、オリゴ糖配列の非還元性末端はオリゴ糖配列からなり、オリゴ糖配列の還元性末端からのみ修飾され、好ましくは還元性末端からグリコシド複合体化（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）される。
【００４３】
本発明の範囲内にあるこのような抗体のフラグメントの例として、我々は本明細書で図３及び４に示したようなｓｃＦｖのフラグメントを開示する。従って、ある好適な実施形態においては本発明は、ＮｅｕＧｃ及び／又は糖類結合型抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖのフラグメントを提供する。結合能力に実質的に影響を与えない１又はそれ以上の保存的置換を有するＣＤＲ配列又は完全なＶＬ及びＶＨ配列の変異体型が代替的に用いられうることは理解すべきである。
【００４４】
新規の抗体配列は約５０のヒトのＩｇＭ遺伝子上の大きなプールから再現性良く生成された。本発明は実施例及び図面において４の抗体について示したように、抗体配列が実質的な相同性を共有することを明らかにした。各抗体配列が、重要な抗原を認識する天然型のヒト抗体配列などとして有用であることは理解されよう。本発明は軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）の配列と実質的な相同性又は類似性を有する抗体に関する。配列相同性は、ｃＤＮＡレベルのような、タンパク質及び核酸の双方で重要であることは理解されよう。好適な実施形態においては、抗体ドメインのペプチド（タンパク質）配列が比較される。本発明は図７に示されるように、図３中の軽鎖（ＶＬ）配列の配列（又は対応する図５中のＤＮＡ、完全相同性の割合（％）はタンパク質に対し規定されたものから変化することが理解されよう）と実質的な相同性を有する抗体に関し、総ての抗体は約５０％、より特異的には少なくとも約４９％のタンパク質レベルの相同性を共有し、１．４群と称される１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型の３のタンパク質配列は特異的な配列に対し少なくとも約９０％、より正確には少なくとも９３％の更に高い相同性を共有する。分析は更に、１．４．１１及び１．４．３０型の抗体の好適な下位群が互いに約９５％、より正確には約９７％の相同性を共有し、相同性は配列の同一性に近いことを明らかにした。
【００４５】
本発明は図７に示されるように、図４中の重鎖（ＶＨ）配列の配列（又は対応する図６中のＤＮＡ、完全相同性の割合（％）はタンパク質に対し規定されたものから変化することが理解されよう）と実質的な配列相同性を有する抗体に関し、総ての抗体は約５０％のタンパク質レベルの相同性を共有し、１．４群と称される１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型の３のタンパク質配列は特異的な配列に対し少なくとも約８０％、より正確には少なくとも８１％の更に高い相同性を共有する。分析は更に、１．４．１１及び１．４．２４型の抗体の好適な下位群が互いに約８５％の相同性を共有することを明らかにした。
【００４６】
［特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体用の共通配列の規定］
本発明は、本発明による抗体配列と選択的な他の抗体とを比較することによる特異的な糖類認識及び／又はＮｅｕＧｃ抗体のための共通配列を規定する方法に関する。本発明は更に、本発明による抗体配列と選択的な他の抗体とを比較することによる特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体、あるいは抗体群のための特有で特徴的な配列を規定する方法に関する。ＣＤＲが抗体の結合特性に必須であることについて既知なため、例えば、軽鎖と重鎖との双方に対して図３及び４中の四角形中に示されるように、本発明は実質的にＣＤＲ配列の比較に関する。
【００４７】
［軽鎖共通配列］
本発明は好適な実施形態においては、１．４群の抗体の軽鎖のための共通配列である、
ＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２はＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１は好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１は好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２はＧ又はＲであり、Ｘ３はＷ又はＶであるＣＤＲ３、
に関する。
【００４８】
相同性がＣＤＲ配列内で高いことは認識されよう。１．４群の抗体は、好ましくはＣＤＲ１ないし３配列に類似する又は実質的に類似するＣＤＲを有する特徴的な軽鎖を総て含む。
【００４９】
本発明は好適な実施形態においては、１．２．２０型の抗体の軽鎖のための共通配列である、
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
に関する。
【００５０】
１．２．２０型の抗体は、好ましくはＣＤＲ１ないし３配列に類似する又は実質的に類似するＣＤＲを有する特徴的な軽鎖を総て含む。
【００５１】
軽鎖ＣＤＲの長さのように１．４群及び１．２．２０型の抗体間には特徴的な差異があり、最初の２のＣＤＲは１．２．２０型抗体で短いが、ＣＤＲ３は１．２．２０型で長い。しかしながら、共通のモチーフである、
ＧＸ１ＮＺ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｚ２であって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＩであり、Ｘ２はＧ、Ａ、又はＴであり、Ｘ３はＫ、Ｙ、又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＲであり、Ｚ１及びＺ２は、疎水性アミノ酸残基を含む脂肪族鎖であり、好ましくはＺ１はＬ又はＶであり、Ｚ２はＶ又はＩである、残基２７ないし４５のＣＤＲ１、
ＤＺ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｓであって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＱであり、Ｘ２はＲ又はＱであり、Ｘ３はＰ又はＧであり、Ｚ１は極性アミノ酸残基を含む塩基鎖であり、好ましくはＺ１はＲ又はＫである、残基５７ないし６２のＣＤＲ２、
Ｚ１ＷＸ１Ｘ２Ｘ３であって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＨであり、Ｘ２はＳ又はＮであり、Ｘ３はＧ又はＲであり、Ｚ１は疎水性アミノ酸残基を含む脂肪族鎖であり、好ましくはＺ１はＶ又はＩである、９８ないし１０２のＣＤＲ３、
が双方の型の抗体で見られうる。
【００５２】
好適なＣＤＲ３配列は更にＺ１ＷＸ１ＳＧを含み、Ｘ１は好ましくはＤ又はＨであり、Ｚ１はＶ又はＩである。この配列は１．２．２０、１．４．１１、及び１．４．３０型用の好適な共通配列である。
【００５３】
［重鎖共通配列］
本発明は好適な実施形態においては、１．４群の抗体の重鎖に対する共通配列、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４はＡ又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＧであり、Ｘ５はＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであるＣＤＲ２、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２はＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＭ又はＦであり、Ｘ８はＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
に関する。
【００５４】
相同性がＣＤＲ配列内で高いことが理解されよう。１．４群の抗体は好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２、及び最も好ましくは総てのＣＤＲ１ないし３の配列と類似又は実質的に類似するＣＤＲを好ましくは有する総ての特徴的な重鎖を含む。
【００５５】
本発明は好適な実施形態においては、１．２．２０型の抗体の重鎖の共通配列である、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
に関する。
【００５６】
１．２．２０型の抗体は特徴的な重鎖を含み、好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２、及び最も好ましくは総てのＣＤＲ１ないし３の配列と類似又は実質的に類似するＣＤＲを好ましくは有する。
【００５７】
重鎖ＣＤＲの長さのように、１．４群及び１．２．２０型の抗体間には特徴的な差異があり、１．２．２０型抗体の第２のＣＤＲは他のものよりも短く、ＣＤＲ３は更に、１．２．２０型について、及び１．４．３０型についてもより短い。しかしながら、共通のモチーフである、
Ｘ１ＴＺ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｚ２Ｘ５であって、Ｘ１は好ましくはＧ、Ｉ、又はＦであり、Ｘ２はＮ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ３はＫ、Ｓ、又はＲであり、Ｘ４はＹ、Ａ、又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであり、好ましくはＺ１はＶ、又はＦであり、Ｚ２はＷ又はＭである、残基２７ないし３５のＣＤＲ１、
Ｘ１Ｚ１Ｚ２Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６ＳＺ７ＫＺ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ、Ａ、又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＴ、Ｓ、又はＧであり、Ｘ５はなし、Ｄ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであり、Ｚ１はＶ又はＩであり、Ｚ２はＹ又はＳであり、Ｚ３はＮ又はＹであり、Ｚ４はＬ又はＹであり、Ｚ５はＮ又はＡであり、Ｚ６はＰ又はＡであり、Ｚ７はＬ又はＶであり、Ｚ８はＳ又はＧであるＣＤＲ２、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＤ、Ｒ、又はＭであり、Ｘ２はＹ、Ｐ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＴ、Ｍ、又はＦであり、Ｘ８はＹ、Ｖ、又はＰ若しくはＩであるＣＤＲ３、
が双方の型の抗体で見られうる。
【００５８】
好適な重鎖ＣＤＲ３配列は第２の最終位置でＤ型の保存残基を含む。
【００５９】
保存型のＣＤＲタンパク質又はＤＮＡ配列のような核酸は、特異的な糖類抗原又は抗体がタンパク質配列を認識することによる、及び／又は、ＰＣＲ分析のような、対応する核酸発現の認識用のＲＮＡ／ＤＮＡ分析によるアッセイのように、アッセイ中の抗体又は対応する核酸発現の認識に対し有用であることは理解されよう。
【００６０】
［糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析］
データは、特に１．４群の３のタンパク質配列が各抗体の特異的な特徴とともに、抗体の相同群を形成する大きな配列相同性を共有することを表わす。類似性によって１．４群の抗体の保存構造の分析が可能になる。特定の実施形態においては、本発明は、好適な型の糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体としての１．４群の抗体と、他の可能性のある糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析のための抗体タンパク質又は１又はそれ以上の核酸配列の使用とに関する。
【００６１】
１．２．２０型の配列は異なる配列を有するが、１．４群と類似する特異的な配列の特徴を共有する。特定の実施形態においては、本発明は、好適な型の糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体としての１．２．２０型の抗体と、他の可能性のある糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析のための抗体タンパク質又は核酸配列の使用とに関する。４の配列間の類似性によって、１．４群の抗体及び１．２．２０型と同様の抗体の保存構造の分析が可能になる。
【００６２】
［既知の抗体及び抗体配列と抗体群の比較］
本発明は更に、本発明による抗体の、構造的及び／又は機能的のいずれかで既知の抗体、好ましくは類似の構造及び／又は機能を有すると思われる抗体と比較する方法に関する。本発明は特にその抗体の、ニワトリで生成される既知のポリクローナル抗体のような既知のＮｅｕＧｃ認識型抗体、又は別個及び異なる特異性を有する、Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９８８によって述べられたヒトからクローンされた抗体といった既知のＮｅｕＧｃ認識型モノクローナル抗体、及び、キューバ共和国のハバナで生成されたＰ３型抗体といった、免疫化によってマウスで生成され、ＮｅｕＧｃ含有型糖脂質を認識すると知られるモノクローナル抗体（Ｍｏｒｅｎｏら、１９９８、Ｖａｓｑｕｅｚら、国際公開第９９２０６５６号）との比較に関する。
【００６３】
抗体の機能的結合は、本発明で用いられる多価複合体、及び／又はタンパク質、及び／又は脂質結合糖質、又は細胞物質上にあるＮｅｕＧｃ含有型構造での結合について好ましくは比較される。この抗体及び可能性のある比較抗体のタンパク質結合は、好適なタンパク質相互作用法によって行うことができ、ウェスタンブロット法といった固相アッセイ法によって行われることが好ましい。
【００６４】
本発明は更に、好ましくは類似の構造及び／又は機能を有すると思われる抗体からの他の抗体配列と、この抗体の配列、好ましくはタンパク質配列の比較に関する。類似した機能を有する好適な抗体は、酸性糖質認識型抗体、好ましくはＧｌｃＡ又はシアリン酸といったカルボン酸含有型糖質、より好ましくはシアリル化された糖質、及び好適な実施形態においてはＮｅｕＧｃ−糖質認識型抗体を含む。
【００６５】
この抗体配列を自己免疫性疾患及び／又は癌の患者で知られる抗体配列と比較することが、ＮｅｕＧｃ型構造の認識可能性を有する特定の型のヒト免疫応答がこれらの病気と関連するため、有用であることは更に理解されよう。本発明は、これらの病気と関連する抗体配列、好ましくは癌及び／又は自己免疫性疾患でのヒト抗体配列を比較し、好ましくは、本発明による好適な抗体／抗体群の範囲で、重鎖及び／又は軽鎖に対する相同性の割合（％）で抗体配列を選択し、好ましくはＮｅｕＧｃ含有型糖質への結合に対しこのような１又は複数の抗体を試験する方法に関する。このような実験が病気の原因を明らかにし、治療の可能性を計画するのに非常に有用であることは理解されよう。
【００６６】
好適な実施形態においては、比較用の抗体配列は、ＮｅｕＧｃを含む生物学的試薬又は物質を用いて移植／注入するといった、血液をＮｅｕＧｃ物質と接触させたヒトからクローンされ、好適な移植はＮｅｕＧｃを含む物質を用いた器官／組織の移植であり、好適な器官移植は更に、ＮｅｕＧｃでの混入の可能性を有する幹細胞移植を含む。
【００６７】
［有用なグリカン結合特異性を有する新規の抗体］
本発明は新規かつ有用な単糖及びオリゴ糖の結合特異性を有するモノクローナル抗体のライブラリを明らかにした。この抗体は結合特異性の特性を有し、複数の細胞型、特にヒト細胞の分析について有用である。
【００６８】
結合特異性はいくつかの有用なグリカン型を含み、その一部はサブタイプの細胞に好適である。本発明は好適な実施形態においては、特異的なサブタイプのヒト細胞の結合のために、これらの抗体からある抗体を選択することに関する。その抗体が細胞の識別に有用であることは更に理解されよう。
【００６９】
［疾患関連型の抗体］
本発明は更に、この抗体（又は複数の抗体）の重鎖部分において実質的な相同性があり、抗体が癌及び／又は自己免疫性疾患の状況において重要な抗原性構造を認識することを明らかにする。抗体の特異性は、特に３次元構造が知られない場合、配列から直接的に生成できない。
【００７０】
しかしながら、本発明による重鎖ＣＤＲ、特に本発明による、特に１．４．２４型に相同な抗体においてＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む抗体の間で、新規の糖質結合特異性があることを明らかにする。
【００７１】
これらの抗体の開発及び分析の主要な問題は、それらの糖質結合特異性の可能性及び／又は正確さが知られてこなかったことである。本発明は、シアリン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃ）及びグルクロン酸含有構造のような、酸性単糖残基含有構造を特に認識する抗体の糖質特異性を明らかにする方法を提供する。
【００７２】
［抗体の開発又は分析用のアッセイ］
本発明は疾患関連型又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法に関し、本方法は本発明による単糖及びオリゴ糖配列を含む糖類で、抗体の特異性を測定するステップを含む。
【００７３】
好ましくは、抗体の結合は少なくともオリゴ糖配列について、より好ましくはキーとなる少なくとも２のオリゴ糖配列について、更に及び最も好ましくは本発明によるキーとなる３のオリゴ糖配列について測定される。更に好適な実施形態においては、本発明による、好ましくは少なくとも１の、より好ましくは少なくとも２の、最も好ましくは少なくとも３のコントロールのオリゴ糖配列を含む、コントロールの糖類に結合する抗体が測定される。
【００７４】
好適な分析方法は、本発明による好適な１又はそれ以上の糖類配列と抗体を接触させるステップを含む。
【００７５】
更に好適なステップは糖類と抗体との間に形成される複合体を測定するステップを含む。複合体を観察する好適な方法は、ＦＲＥＴを含む、蛍光法といった分子の距離を測定する方法と、抗体のような非結合試薬を洗浄するといった、アッセイから非結合試薬を除去し、酵素、蛍光又は放射標識による方法といった検出方法を含む標準的な方法によって、抗体のような結合試薬を測定する方法とを含み、好適な酵素結合アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む。アッセイは固相アッセイにできることは理解されよう。
【００７６】
［単糖結合特異性］
分析は、フレキシブルなスペーサ構造であるＮｅｕ５Ｇｃα、ＧｌｃＡα、ＧｌｃＡβ、ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃβを含むポリアクリルアミド複合体として分析される場合、新規の抗体が単糖残基で高親和性を有することを明らかにした。オリゴ糖鎖の末端部分としてこれらの単糖残基を認識するために、特にＮｅｕ５Ｇｃに対し、同様のフレキシブルな構造の呈示が要求されることは理解されよう。特にα及びβ結合のＧｌｃ、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ−、Ｇａｌβ−、及びＦｕｃα−のいくつかの中性の非還元性末端単糖残基は結合実験で事実上陰性であった。図８。
【００７７】
最良の結合は酸性単糖残基のグルクロン酸及びＮｅｕ５Ｇｃのシアリン酸であった。更には、オリゴ糖結合特異性が、いくつかのＮｅｕ５Ａｃ含有型オリゴ糖配列への結合を明らかにした。
【００７８】
本発明は好適な実施形態においては、シアリン酸含有型グリカンの認識用の抗体、より好ましくはＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃ含有型グリカンに特異的な抗体の開発に関する。
【００７９】
［Ｎｅｕ５Ｇｃ含有型グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はＮｅｕ５ＡｃよりもＮｅｕ５Ｇｃのオリゴ糖配列により強く結合する（より特異的に認識する）新規の抗体に関する。好適な実施形態においては、結合／認識されたＮｅｕ５Ｇｃオリゴ糖配列は１型のＮ−アセチルラクトサミン配列Ｎｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである。好適な実施形態においては、Ｎｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃは好ましくはＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃより有効に認識される。
【００８０】
［Ｎｅｕ５Ａｃ含有型グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はＮｅｕ５ＧｃよりもＮｅｕ５Ａｃのオリゴ糖配列により強く結合する（より特異的に認識する）新規の抗体に関し、より好ましくは、抗体はＮｅｕ５Ａｃに結合するが、Ｎｅｕ５Ｇｃに非常に弱く結合するか、あるいは事実上全く結合しない。好適な実施形態においては、結合／認識されたＮｅｕ５Ａｃオリゴ糖配列は、シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、より好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαである。Ｎｅｕ５Ａｃ構造の選択的な認識は抗体に対する有用な特性であり、好適な実施形態においてはヒトと動物との間のグリカン構造の分化のために用いられることは理解されよう。
【００８１】
［新規の糖類結合特異性］
本発明は、少数の重要なキーとなるオリゴ糖配列である、
ａ）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃ、より好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであり、更により好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃはＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃより高親和性で認識又は結合される、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、
ｂ）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを含み、高親和性で認識される好適な標的はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、
ｃ）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃα、
の高特異性の認識を明らかにした。
【００８２】
本発明は更に、α３でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンとラクトースＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎとを含む抗体にわずかに結合されるか、あるいは全く結合されない有用なコントロールのオリゴ糖配列を明らかにした。ここで、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である。これらのグリカンは、抗体がグリカンの認識において特異的であることを示す。
【００８３】
これらの結合特異性及びその組合せは、ヒトモノクローナル抗体について、特に天然型ヒトモノクローナル抗体について新規である。ヒトモノクローナル抗体による複数であるが高選択性のグリカン認識の存在がいくらか特有であることは理解されよう。更には、グリコシレーションの種特異性のため、構造の抗原性は免疫化で通常用いられるマウス、ラット、又はウサギといった他の種での実験結果から知ることができないことは理解されよう。ポリクローナル抗血清の場合、実際の結合特異性はポリクローナル抗体及び抗血清での結果から得られなかった。
【００８４】
［より大きな構造に対する結合の分析］
本発明による抗体結合型の単糖又はオリゴ糖構造、又はそのエピトープはより大きなオリゴ糖配列の一部であってもよく、このオリゴ糖エピトープよりも高い又は低い親和性で認識されることは理解されよう。
【００８５】
本発明は、抗体の他の糖類への結合を、本発明による単糖又はオリゴ糖構造と比較するステップを含み、好ましくは本発明による少なくとも１の新規の結合配列を含む結合アッセイにおいて、特に天然の糖脂質又は糖タンパク質上にある大きなオリゴ糖配列を用いた、他のグリカンのスクリーニングに関する。
【００８６】
［変異誘発及び／又は配列の置換による更なる開発］
特異的に異なるα３及びα６結合されたシアリン酸構造及びα６でシアリル化されたＧａｌＮＡｃと、多様な構造におけるＮｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃへの異なる結合とを有するラクトサミンでの１及び２型の双方の認識は、抗体がグリカンの複数の立体構造を認識し、少なくとも２の異なるシアリン酸結合部位及び立体構造を有することを示す。
【００８７】
本発明は、変異誘発法によって可変部位の抗体のペプチド配列を変化させることによる、及び／又は、別の抗体からの対応する配列によって１の抗体から１又はそれ以上の可変ＣＤＲ配列又はその一部を置換することによる、新規の抗体の開発のために抗体特異性を変更する方法に関する。好適な実施形態においては、変異誘発法は本発明による糖質結合アッセイと組み合わされ、本発明による特異的な酸性グリカン構造に対する抗体の修飾結合は、特異性の変化を明らかにするよう測定される。
【００８８】
［新規のタンパク質発現型又はタンパク質／及び脂質発現型の標的グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はタンパク質型のグリカン標的配列を認識する抗体の開発及び分析に関する。本発明はシアリルＴｎ配列ＮｅｕＮＡｃα６ＧａｌＮＡｃαへの結合があり、ムチン型の糖タンパク質上にあることを明らかにした。本発明は構造を認識するヒトモノクローナル抗体、特に、共通配列を含むか、あるいはこの抗体と実質的に相同性を有する抗体に関する。
【００８９】
α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃは双方とも、タンパク質及び糖脂質によって提供されうることは更に理解されよう。本発明は、タンパク質及び脂質からの構造分析のための抗体の使用に関する。本発明は更に、構造を認識するヒトモノクローナル抗体、特に共通配列を含むか、あるいはこの抗体と実質的に相同性を有する抗体に関する。
【００９０】
本発明は特に、抗体がタンパク質結合されたグリカン上にＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃを認識する場合の、新規の抗体、好ましくはヒト抗体、及びそれらに関連するその更なる開発及びアッセイに関する。好適な実施形態においては、本発明はタンパク質結合されたＮｅｕ５Ｇｃの糖類配列に結合するヒト自然抗体に関する。
【００９１】
本発明は、糖類配列がタンパク質に結合する場合の、本発明による糖類配列、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ含有型のオリゴ糖配列への自然ヒト抗体の結合の分析に関する。
【００９２】
本発明は、糖類配列が脂質に結合する場合の、本発明による糖類配列、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ含有型のオリゴ糖配列への自然ヒト抗体の結合の分析に関する。本発明は特に、本発明による末端エピトープを含むラクト及びネオラクト系の糖脂質に対する結合の分析に関する。
【００９３】
［栄養又は治療上のタンパク質の状況における抗体結合の測定］
Ｎｅｕ５Ｇｃ結合型オリゴ糖は、治療又は栄養上の状況においてヒトと接触し、免疫反応を引き起こすようにできる糖タンパク質上に存在することは理解されよう。好適な実施形態においては、本発明はオリゴ糖配列が治療用タンパク質、好ましくは治療用組換えタンパク質に結合される場合の、本発明によるオリゴ糖配列に対するヒト抗体の分析に関する。
【００９４】
好適な実施形態においては、本発明によるアッセイにおいて測定すべき抗体が、本発明による抗体に対して相同性を有する。このアミノ酸配列に対する相同性は、本発明による糖類結合分析用に抗体を選択する方法ステップで用いられうることは理解されよう。好適な実施形態においては、抗体は、本発明による共通配列によって少なくとも１の可変部位を有するか、あるいは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の相同性の配列を有するか、あるいは２つのみ、又はより好ましくは１つのみの異なるアミノ酸残基を含み、好適な実施形態においては、それぞれのアミノ酸残基はアミノ酸であり、本発明による配列中のアミノ酸と類似する電荷又は疎水性を有している。
【００９５】
［結合特異性の分析］
本発明は更に、シアリン酸、好ましくはＮｅｕＧｃを含有する糖質への結合に対する、この抗体及び選択的な比較抗体の試験に関し、α３及び／又はα６及び／又はα８結合のような異なるシアリン酸結合構造を有し、好ましくは対応するＮｅｕＡｃ含有型の複合糖質で実験を制御する。試験すべき好適な糖質は、本発明による末端オリゴ糖配列、及び／又は抗体によって認識されない末端オリゴ糖配列のうちのいずれかを含む可能性のあるいずれかの糖類を含む。本発明は特に、総ての型の天然型酸性グリカン、より好ましくはシアリル化されたグリカン、及び／又はグルクロン酸含有型のグリカン及び物質、更により好ましくはこれらを含む天然物質の研究及び分析用の抗体に特に関する。
【００９６】
より好ましくは、分析すべき糖質は、例えば、Ｏ−グリカン及び／又はＮ−グリカンといった糖タンパク質上の、あるいはセラミドに結合されたグリカンを含むスフィンゴ糖脂質といった糖脂質上の、天然型複合糖質上のグリカンである。本発明による抗体によって認識される末端の二糖又はオリゴ糖エピトープは、グリカンの一部としての末端オリゴ糖エピトープとして好ましいか、あるいは、対応する配列がＴｎ抗原のように（天然型）グリカン全体に存在する場合、抗体は、実質的にグリカン全体（配列中の少なくとも部分的に総ての単糖残基）と、選択的に担体構造の更なる部分とを認識することが好ましい。オリゴ糖特異性によって天然型の哺乳類複合糖質の分析が可能であり、好適な実施形態においては、複合糖質、好ましくは糖タンパク質及び／又は糖脂質は、細胞及び／又は組織の物質上に、より好ましくは分離細胞及び／培養細胞といった細胞物質上に存在する。
【００９７】
［この抗体の変異体の好適な生成物］
類似するヒトモノクローナル抗体はヒト抗体ファージディスプレイライブラリから同様の方法によって生成されうることは理解されよう。類似する抗体は、抗体結合に必須ではない単一のアミノ酸残基を変えることによって生成できるか、あるいは類似する結合を可能にするよう変化させうることは理解されよう。アミノ酸残基の変更は好ましくは、単一の置換変異を生成するか、あるいは変異されたタンパク質配列のライブラリを生成し、ＮｅｕＧｃ含有型糖質構造への結合用の配列をスクリーニングする通常の組換え型ＤＮＡ技術によって行われる。本発明は、この抗体の置換変異及び変異体の設計及び／又は生成のための、親水性／疎水性の構造、大きさ、電荷、又は芳香族構造といった類似する側鎖特性を有する残基のような、既知の類似性の特定のアミノ酸残基の使用に関する。
【００９８】
本発明は、分子モデリング及び／又はＸ線結晶学及び／又はＮＭＲ法によって抗体の三次元構造を規定する方法に関し、好ましくはその構造は特異的な糖類又はＮｅｕＧｃ残基含有型の糖質構造と複合して生成される。本発明は更に、複合体を規定し、抗体配列の変異誘発のために実験を更に設計し、抗体のアミノ酸残基の変異誘発によって特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ含有型構造に対する抗体の特異性及び／又は親和性を開発するための情報を使用することに関する。
【００９９】
ヒト互換性のために、本発明による天然型配列及びヒト抗体ディスプレイライブラリからの類似相同体の推定は、例えばヒト生体内などでの様々なヒトでの用途に対して、あるいは代替的な非ヒト抗体とヒト血清抗体からの交差反応を防ぐ生体外診断に対して好適である。この抗体又は動物抗体フレームを有するキメラ形態中のそのリガンド結合型配列は、抗体の生物学的活性を研究するために動物実験で用いるのに好適であり、抗体配列が試験動物種の自然抗体から認識可能であるという事実のため、開発されることは更に理解されよう。
【０１００】
例えば、生物学的サンプル中の糖類及び／又はＮｅｕＧｃの定性的又は定量的な決定用にイムノアッセイで用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体はラベリングしてもよい。これらの目的のために、分析的又は診断的な抗体ラベリングのために従来用いられる様々な型のラベルは許容できる。
【０１０１】
例えば患者の悪性組織中の異種抗原性ＮｅｕＧｃを標的にするよう、免疫療法で用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体は治療用分子とともにラベリングしてもよい。これらの目的のために、治療用の抗体ラベリングに従来用いられる薬学的に許容可能なラベルが好適である。
【０１０２】
有害なＮｅｕＧｃ認識型の抗体の結合を遮断するために、抗体／抗体複合物は細胞毒性ではないことが好ましい。Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖ型フラグメントといった非免疫原性の抗体フラグメントは、自己免疫反応を受ける、又は天然型のＮｅｕＧｃ抗体によって移植される組織の、抗原性ＮｅｕＧｃ構造に対する結合を遮断するのに用いてもよい。
【０１０３】
例えば生体内イメージングで用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体はラベリングされてもよい。これらの目的のために、抗体ラベリングに従来用いられる薬学的に許容可能なイメージング用ラベルが好適である。
【０１０４】
抗体及び抗体フラグメントを複合する数多くの方法は、当該技術分野で既知である。一般的には抗体は、抗原結合部位から離れた部位で複合する。複合は好適な実施形態においては、グリカン、好ましくはＦｃドメインのＮ−グリカンのような、抗体のＮ結合型グリカンで、又は変異誘発によって生成される新規のグリコシレーション部位に対して生成されるグリカンで行われる。複合の他の好適な部位は可変領域から離れたポリペプチドのＮ又はＣ末端であり、好ましくは末端は、Ｎ末端のセリン残基のようなタンパク質構造を害しない化学的に修飾可能な構造を具え、ヒドラジン又はアミノオキシ試薬といったアルデヒド反応試薬によって特異的に酸化（グリカンと同様に）及び複合でき、治療上又は診断上の分子構造に結合されている。治療上又は診断上の分子構造は、治療のための、又は分析的な使用のための、例えばＥＬＩＳＡ試薬、光学分析のための光活性化可能な分子、アビジン／ストレプトアビジンラベリングのためのビオチン、又は生体内イメージングのための放射活性又はＮＭＲ／ＭＲＩ活性分子といった、細胞毒性分子又は放射活性分子、又はプロドラッグ／プロドラッグ放出分子であることが好ましい。
【０１０５】
別の態様においては、本発明は更に、本発明の抗体又は抗体誘導体をコード化するＤＮＡ分子と、このようなＤＮＡのフラグメントとを提供し、これらはＶＬ及び／又はＶＨ領域のＣＤＲをコード化する。このようなＤＮＡはベクタ、特に、本発明の抗体誘導体、あるいは少なくとも１の抗体鎖又は１の抗体鎖の一部の発現を関連づけることができる発現ベクタなどでクローンされうる。
【０１０６】
本発明の更なる態様においては、宿主細胞が提供され、細菌性細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び哺乳類細胞から選択され、本発明のＤＮＡ分子を含み、本発明の抗体又は抗体誘導体を発現できる宿主細胞を含む。従って、本発明の抗体誘導体は、１又はそれ以上の要求される抗体鎖を発現し、所望のタンパク質を直接的に回復させるか、又は必要に応じて別個の鎖を初期回復及び結合させる、本発明の宿主細胞を培養することによって調製してもよい。
【０１０７】
上に示したｓｃＦｖのフラグメントは、異種抗原性組換え型ＮｅｕＧｃを用いて、ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリのバイオパニングによって得られた。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリは５０の健常な供血者のリンパ球から単離されたｍＲＮＡから構成された。軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡの可変領域はＦｄ ｃＤＮＡ用のヒト特異性のプライマを用いて合成され、ヒトカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖はヒトκ及びλ鎖特異性のプライマを用いて合成された。軽鎖及び重鎖の可変領域は、Ｖκ ｃＤＮＡ及びＶλ ｃＤＮＡ用のヒトκ及びλ鎖特異性のプライマと、ＶＨ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＭ特異性のプライマとをそれぞれ用いてＰＣＲによって増幅させた。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリは、ＰＣＲプライマに導入される制限部位を用いて、可変領域のｃＤＮＡをｓｃＦｖファージディスプレイベクタにクローンすることによって構成された。
【０１０８】
ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリはパニング手順を用いたファージディスプレイによって選択された。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリは溶液中でビオチン化された異種抗原性組換え型ＮｅｕＧｃによってスクリーニングされ、結合剤はストレプトアビジン上に捕捉された。ファージの溶出は１００ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２．２）でなされ、その後すぐに、２ＭのＴｒｉｓ溶液で中和された。ファージ溶出は大腸菌細胞中で増幅された。４回のバイオパニング後、可溶性のｓｃＦｖのフラグメントが単離されたファージから生成された。選択されたｓｃＦｖのフラグメントの結合特異性はＥＬＩＳＡによって分析された。いくつかの糖類及び／又はＮｅｕＧｃ特異性のｓｃＦｖのフラグメントのクローンが得られた。
【０１０９】
本明細書中で述べたように、ファージディスプレイ技術は診断及び治療用途でヒトＩｇＭ組換え型の抗糖類及び／又は抗ＮｅｕＧｃ抗体を開発するための有効かつ実現可能なアプローチである。
【０１１０】
本発明の抗体フラグメントを得るためのある成功した選定戦略を述べてきたが、本発明の抗体フラグメントを与えることができる数多くの変形物は、当該技術分野の当業者に明らかであろう。ｓｃＦｖのフラグメント又はその誘導体のファージ又は微生物のディスプレイライブラリから直接的に、本発明のｓｃＦｖのフラグメントを選択することは可能である。ファージ又は微生物細胞は、表面タンパク質とともに融合タンパク質として本発明のｓｃＦｖのフラグメント又は他の抗体フラグメントを提供し、本発明の更なる態様を表わす。
【０１１１】
本発明の抗体及び抗体誘導体の微生物発現が、免疫診断アッセイ及び免疫療法で用いるのに好適な均一品質の高特異性の試薬の有効かつ経済的な生成のための手段を提供するが、代替的に、合成してこのような試薬又は少なくともその一部を生成することが可能である。従来の遺伝子工学技術を適用することによって、結合特性を実質的に変えることなく、例えば新しい配列が結合されるなど、本発明の初期に得られた抗体フラグメントを変えることができる。このような技術は、新規の糖類及びＮｅｕＧｃ結合型のハイブリッドタンパク質を生成するのに用いることができ、既に明細書中で規定したように糖類及びＮｅｕＧｃに対する親和性及び特異性の双方を保持する。
【０１１２】
［ＮｅｕＧｃ抗体を選択するための特異的な方法］
本発明は、抗体フラグメントのディスプレイライブラリが非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα複合体に対して結合せず、かつ非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα複合体に対し結合すると選択される場合の、ファージディスプレイ抗体ライブラリからの抗体フラグメントの選択に関する。好ましくは、選択のための複合体は固定化される。より好ましくは、前記ＮｅｕＡｃα非結合型の複合体は最初にファージライブラリから選択されて、次いでＮｅｕＧｃα結合型クローンがライブラリから選択される。抗体ライブラリは様々な方法で構成でき、好適な実施形態においては、ライブラリはｓｃＦｖライブラリであることが理解されよう。
【０１１３】
本発明はヒト抗体のライブラリから抗体フラグメントを選択する新規の有用な方法を明らかにし、好ましくは多数のヒトから得られるライブラリを形成し、より好ましくはそのライブラリは少なくとも約５０のヒトから得られる。実施例に示されたライブラリは、約５０の健常者の供血者の血液細胞から得られる。大多数のドナーのため、そのライブラリは単一末端のＮｅｕＧｃα残基に対する事実上総ての最大限のヒト抗体を含むと考えられる。抗体ライブラリは複数の選択から同一のクローンを与え、その方法が再現可能であることを示す。
【０１１４】
実施例における選択は、ＩｇＭ抗体のライブラリから行われた。本発明は好ましくは、抗ＮｅｕＧｃ抗体の生成／発見のためのＩｇＭ抗体の選択に関する。「成熟」抗体のため、一般的にはＩｇＭと他の抗体型の間には差異がある。ＩｇＭ抗体は更に天然で１０価であり、この選択方法は少価数の形態において抗体フラグメントを表示するファージを用いることによって、天然の少価数のＮｅｕＧｃの認識を模倣するように設計された。本発明による抗体が、多価結合剤を有する多価クラスタ化された糖類又はＮｅｕＧｃ構造の天然型ＩｇＭとしての認識と、更にはＦＡｂ型試薬による一価エピトープの認識とに有用であることを本発明は示す。他の抗体型は一般的に二価であり、少価数の抗原の認識にはほとんど有用ではない。
【０１１５】
抗体フラグメントは、ＮｅｕＡｃα及びＮｅｕＧｃαの多価複合体に対して選択される。正確な選択のために、双方の構造は好ましくは同一の担体構造に複合される。本発明は特に、クラスタ化された少価数のＮｅｕＧｃのエピトープを認識できる抗体に関する。ＮｅｕＧｃ認識型の抗体に関する過去の研究は、単分子の糖脂質構造に結合することについて記載され、単一のＮｅｕＧｃ残基又は、構造ＮｅｕＧｃα８ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒのように、相互に非常に近い構造で２のＮｅｕＧｃ残基を含むことは注目すべきである。スクリーニングが非還元性末端の末端構造に対して行われた場合、この抗体が糖脂質よりも他の糖複合体からの更なるグリカン構造の認識に有用であることは更に理解すべきである。
【０１１６】
好適な多価複合体は約２０未満の原子結合であるが、約６より大きい原子結合間の距離を有している。多価複合体は好ましくはフレキシブルなポリアミド構造、より好ましくはポリアクリルアミド構造を含む。フレキシブルは構造がメチレン構造を有するスペーサを含むことを示す。好ましくは、ＮｅｕＡｃα／ＮｅｕＧｃαは３の炭素のスペーサに結合され、メチレン基であることが好ましく、更にはポリアクリルアミドの主鎖に複合化される。多価のアクリルアミド複合体はＢｏｖｉｎ Ｎ、１９９８によって記載されるように化学的に合成でき、多価のアクリルアミド複合体は米国セントルイスのＳｉｇｍａ社又はロシアのＳｙｎｔｅｓｏｍｅ社のような試薬購入先から商業上入手可能である。
【０１１７】
本発明は更に、本発明によるヒト抗体ライブラリからの選択によって発見される抗体に関する。
【０１１８】
［本発明による糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体の新規の特異性の特徴］
本発明による抗体は、多価の単糖複合体で分析した場合、異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃαに対する結合特異性を明らかにしたが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃαを結合しなかった。特定の抗体がオリゴシアリン酸又はポリシアリン酸ＮｅｕＧｃα８ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒなどの非末端位置にシアリン酸を認識するが、末端非還元性の末端残基としてではなく、例えば、Ｖａｒｋｉとその仲間によるニワトリのポリクローナル抗体の生成のために用いられる抗原が、グリセロール構造に関して切断され、ひいては末端修飾及び／又は伸長されたＮｅｕＧｃ構造の認識を可能にすることは注目すべきである。本発明は非還元性末端のＮｅｕＧｃαのために選択される優れた結合活性の抗体を明らかにした。有効な認識は、更なる修飾を要求しないが、他のＮｅｕＧｃ残基による担体構造又は伸長によって影響を受け、ひいてはエピトープは、担体に複合する末端単糖残基を含む単一末端のＮｅｕＧｃαであるとされる。
【０１１９】
抗体は結合特異性を有し、特定の酸性糖類及び／又は非還元性末端ＮｅｕＧｃエピトープを含むヒト細胞の認識を可能にする。既に公表されたヒト抗体と対照的に、これは糖脂質上に末端非還元性の末端ＮｅｕＧｃを認識するが、ヒト細胞では認識しないもの、及び糖脂質上で末端非還元性の末端ＮｅｕＧｃを認識せず、明らかにタンパク質上で認識せず、ウシ胎仔血清中で成長したヒト細胞を結合したものである。
【０１２０】
更に、本発明は最初に、ファージディスプレイ、又は、ＮｅｕＧｃ末端の単糖残基に結合するが、ＮｅｕＡｃ末端の単糖残基に結合しない抗体中などで、ヒドロキシル基によって置換される１のプロトンのわずかで軽微な変更を用いて、単一末端の単糖を有効に認識可能な他のヒト抗体について述べる。高い単糖レベルの選択性は、完全なＮｅｕＧｃ残基を結合するように選択されるヒト又はその他のＮｅｕＧｃ抗体について記載されていなかった。固有の単糖選択性は更に、シアリン酸として複合される２の他のヒトの末端単糖残基を用いて、及び単一のエピマ配置の差異を用いて研究され、類似の選択的な抗体は産生しなかった。
【０１２１】
ファージディスプレイシステムが天然型ヒト抗体を生成することは理解されよう。これらは、動物抗体又はヒト化した動物抗体よりも、ヒトでの用途でより容易に認容可能にすべきであり、ヒトにおいて非天然な構造を含む。
【０１２２】
更に、本発明の抗体は多価高密度／クラスタ化されたＮｅｕＧｃの複合体（上述の）を有効に認識し、好適な実施形態においては、ヒトＩｇＭの認識を模倣する３ないし１０価の形態といったクラスタ化された少価数形態で用いられるか、あるいは例えばドイツのＯｎｃｏＭＡｂ（登録商標）社のＶｏｌｍｅｒｓらの、当該技術分野に既知の方法によってヒトＩｇＭ抗体として生成される。驚くべきことに、通常はＦＡｂ ＩｇＭ抗体の親和性は非常に低いが、抗体は更に一価のＦａｂ型又は単鎖抗体として有効である。バックグラウンドにおける抗体のほとんどが、異なる特異性と通常は二価の構造のみを含む異なる型であることは注目すべきである。
【０１２３】
［核酸の分析］
本発明は更に、遺伝コードの総ての変異体を含む抗体配列に対応する核酸配列に関する。これらは当該技術分野の当業者に公知である。本発明は特に、抗体をコードするヒト天然型核酸配列に関する。本発明は更に、ヒト天然型核酸配列に対する相補的核酸配列に関する。本発明は更に、ａ）核酸配列の発現分析のための、ｂ）核酸配列の発現を生じさせるための、核酸配列で結合及びハイブリダイズする類似する能力を有する核酸配列及び相補的核酸配列、ならびにその相同体の使用に関する。好適な核酸相同体の好適な群はペプチド核酸を含む。好適な核酸配列分析は核酸配列のクローニング及びシーケンシングと、ハイブリダイゼーション法による、及びＲＴ−ＰＣＲ法といったＰＣＲ法による分析を含む。
【０１２４】
本発明は特に、移植される物質が特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃを含むと考えるべき理由がある場合の、特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃに対しヒト免疫反応を分析する状況における、好ましくは移植に対する免疫反応の状況における、より好ましくは細胞移植又は異種移植の状況における核酸分析に関する。本発明は更に、食物中のＮｅｕＧｃの量の栄養変化の状況における、ヒトでの本発明による核酸分析に関する。
【０１２５】
［細胞及び組織の分析］
特異的な糖類及び／又はヒトＮｅｕＧｃ結合型組換え型抗体、ならびにそのイムノアッセイでの有用性の開発及び性質決定は、以下の実施例に更に詳細に記載される。本発明は特に、細胞及び組織の分析に対する抗体の使用に関する。分析されるべき好適な細胞及び組織は、動物起源の細胞物質又はＮｅｕＧｃを含む動物物質と接触状態にある物質を含む。本発明はこの抗体がブタ細胞又はタンパク質といった、動物細胞又は動物細胞／組織由来の物質での本発明の酸性グリカン及び／又はＮｅｕＧｃ構造の分析に有用かつ好適であることを明らかにした。
【０１２６】
［好適な抗体の特異性、配列、及び方法］
本発明は特に、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列は好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであり、Ｎｅｕ５Ｇｃでの１型のＮ−アセチルラクトサミンの認識が、特に異種抗原性（非ヒト）シアリン酸Ｎｅｕ５Ｇｃを含みうる物質の認識の状況においては、抗体に対する非常に特有かつ有用な特性であると理解される、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
２）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであって、本発明が特に、シアリン酸がＮｅｕ５Ｇｃである場合に、シアリルラクトサミンはＮ−グリカン構造に結合せず、強く又は実質的に排他的な認識となるエピトープに対する結合を明らかにし、抗体オリゴ糖結合に対しかなり特有の特徴があるが、その特異性が他の特異性よりももっとも好適な、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
３）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
及び／又は、末端非還元性の末端単糖残基である、
４）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基と、
に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、好ましくは、
５）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないヒトモノクローナル抗体に関する。
【０１２７】
オリゴ糖配列のいずれもヒト幹細胞又はその特異的なサブタイプの細胞培養条件依存型マーカとして特徴づけられたことは理解されよう。
【０１２８】
本発明は特に、好適なオリゴ糖結合特異性を組合わせる特異性を有する特有の抗体に関する。好適な実施形態においては、その特異性は少なくとも末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列は好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎであって、ＳＡはシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、ｎは０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
を含む。第２の群は類似するａ６結合されるシアリン酸構造を表わし、それはα３のシアリン酸結合とともに特有の特異性である。
【０１２９】
オリゴ糖配列ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに対する好適な結合は、
ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
を含む。
【０１３０】
その特異性は更に、ポリマ複合型シアリン酸残基と、実施例に示されるような、特にａ３でシアリル化されたラクトースと２型のＮ−アセチルラクトサミンとを特に含む、非結合又は非常に低い結合活性のオリゴ糖配列とに対する特異性によって更に特徴づけられる。末端非還元性の末端単糖残基は更に、
１）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基、
を含むが、前記抗体は還元性末端から高分子担体に連結される非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、抗体は好ましくは通常のシアリルラクトサミンのオリゴ糖配列である、
２）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しない。
【０１３１】
好適な実施形態においては、いくつかの主要な特異性の特徴が含まれ、好適な抗体はα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列であるＮｅｕ５Ｇｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合し、抗体は末端非還元性の末端エピトープであるシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合し、抗体はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合し、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃよりＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃにより有効に結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合しない。
【０１３２】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに結合し、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃ、より有効にはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであることが好ましく、及び／又は、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合する。
【０１３３】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は式ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに従うα６でシアリル化された末端非還元性の末端エピトープに結合し、ＳＡはシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである。
【０１３４】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合する。
【０１３５】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合する。
【０１３６】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合する。その親和性は好適な実施形態においては、本発明に記載のようなＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
【０１３７】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は末端異種抗原性の非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合しない。
【０１３８】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列に結合せず、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である。
【０１３９】
［好適なポリペプチド配列］
本発明は抗体に関し、本発明による好適なポリペプチド配列を有する。抗体は更に好ましくは、本発明による１又はそれ以上の結合特異性の特徴を有する。本発明はオリゴ糖配列の認識用の新規の有用な抗体を明らかにした。抗体はヒト抗体であり、ヒト免疫系によって有効に認識されないため、治療及び診断に対して特別な有用性を有する。
【０１４０】
［抗体ＣＤＲ配列］
ＣＤＲ配列は抗体ファミリに対する特性であり、類似の抗体は、抗体の全ＣＤＲ配列のフラグメントに基づいて認識できることは理解されよう。本発明は更に、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、類似、又は最も好ましくは同一の抗体配列に関する。類似の配列は特に、本発明による抗体と同一又は類似の特異性を有する新しい抗体を検索するか、あるいは例えば、変異誘発法によって本発明による抗体を最適化し、及び本発明による好適なオリゴ糖配列に対して得られた抗体をスクリーニングする方法に好適である。
【０１４１】
本発明は更に、好適な共通配列の３ないし１０価のフラグメントを含む短い特徴的なエピトープに関する。
【０１４２】
［好適な短配列］
抗体ポリペプチドの好適な重鎖配列は、ＣＤＲ１配列の共通配列である、
ＧＦＴＦＲ、ＧＦＴＦＳ、ＧＩＴＦＲ、若しくはＧＩＴＦＳ、又はＦＴＦＲ、ＦＴＦＳ、ＩＴＦＲ、若しくはＩＴＦＳであるＣＤＲ１、
又は、
Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであるＸ１ＴＦＸ２Ｘ３Ｙ、
を有し、及び／又は、
好適な短い共通配列がＹＡＤＳＶＫ若しくはＹＹＡＤ、ＹＹＡＤＳ、ＹＹＡＤＳＶ、ＹＡＤＳ又はＹＡＤＳＶであるＣＤＲ２配列、
を有する１．４群の抗体の重鎖配列を含む。２のチロシンを有する配列は特に、特徴的なペプチドとして好適である。
【０１４３】
更に好適なＣＤＲ１フラグメントは、ＴＦＲＫ、ＴＦＲＫＹ、ＴＦＲＫＹＡ、ＴＦＲＫＹＡＭ、ＴＦＲＫＹＡＭＮ、ＴＦＳＳ、ＴＦＳＳＹ、ＴＦＳＳＹＡ、ＴＦＳＳＹＡＭ、ＴＦＳＳＹＡＭＳ、ＴＦＳＲ、ＴＦＳＲＹ、ＴＦＳＲＹＳ、ＴＦＳＲＹＳＭ、ＴＦＳＲＹＳＭＮ、ＦＲＫＹ、ＦＲＫＹＡ、ＦＲＫＹＡＭ、ＦＲＫＹＡＭＮ、ＦＳＳＹ、ＦＳＳＹＡ、ＦＳＳＹＡＭ、ＦＳＳＹＡＭＳ、ＦＳＲＹ、ＦＳＲＹＳ、ＦＳＲＹＳＭ、ＦＳＲＹＳＭＮ、ＲＫＹＡ、ＲＫＹＡＭ、ＲＫＹＡＭＮ、ＳＳＹＡ、ＳＳＹＡＭ、ＳＳＹＡＭＳ、ＳＲＹＳ、ＳＲＹＳＭ、及びＳＲＹＳＭＮを含む。短いフラグメント又はエピトープは特に、新しい抗体を検索又は最適化する方法に好ましい。これらの方法については、トリペプチドが最も好適であり、テトラ、ペンタ及びヘキサペプチド、ならびにそれより大きなものという順番で好適さが低減する。好適なトリペプチドはＴＦＳ及びＴＦＲ、ならびにＦＲＫ、ＦＳＳ、及びＦＳＲ、ならびにＲＫＹ、ＳＳＹ、及びＳＲＹを含む。
【０１４４】
本発明は更に抗体に関し、本発明による結合特異性の特徴を有し、共通配列である、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４はＡ又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＧであり、Ｘ５はＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであるＣＤＲ２、及び選択的に、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２はＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＭ又はＦであり、Ｘ８はＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは１．２．２０型の抗体の重鎖ＣＤＲである、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
を含む。
【０１４５】
本発明は更に抗体に関し、抗体は共通配列である、
ＴＬＲＳＧ又はＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２はＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１は好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、及び選択的に、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１は好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２はＧ又はＲであり、Ｘ３はＷ又はＶであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬ、ＧＧＤＮ、ＧＤＮＬ、又はＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
の配列を有する１．２．２０型の抗体を含む。
【０１４６】
好適な短い特徴的なエピトープは好適な共通配列、好ましくは、ＴＬＲＳ、ＴＬＲＳＧ、ＴＬＲＳＧＩ、ＴＬＲＳＧＩＮ、ＴＬＲＳＧＩＮＶ、ＴＬＲＳＧＩＮＶＧ、ＬＲＳ、ＬＲＳＧ、ＬＲＳＧＩ、ＬＲＳＧＩＮ、ＬＲＳＧＩＮＶ、ＬＲＳＧＩＮＶＧ、ＲＳＧ、ＲＳＧＩ、ＲＳＧＩＮ、ＲＳＧＩＮＶ、ＲＳＧＩＮＶＧ、ＳＧＩ、ＳＧＩＮ、ＳＧＩＮＶ、ＳＧＩＮＶＧ、ＧＩＮ、ＧＩＮＶ、ＧＩＮＶＧ、ＩＮＶ、ＩＮＶＧ、及びＮＶＧを含む軽鎖ＣＤＲ１の３ないし１０価のペプチドフラグメントを含む。
【０１４７】
好適な抗体は１．４型の軽鎖ＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２という少なくとも２つであることが好ましく、総ての配列ＣＤＲ１ないし３を含むことが最も好ましい。
【０１４８】
新規の抗体は、軽鎖及び重鎖の配列、あるいは本発明による抗体の相同配列を組合わせることによって生成でき、好適な実施形態においては、抗体は１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列と、１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される重鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列とを含むことは更に理解されよう。１．４群の抗体のより好適な配列は、例えば１．４．１９−３型（Ｆ３）抗体として組合わされる。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のうちのいずれかが異なる元の配列から得られうることは理解されよう。
【０１４９】
好適な抗体は１．４．２４型抗体の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列を、好適な実施形態においては１．４群の軽鎖配列を、好適な実施形態においては１．４．２４型軽鎖配列を含む。１．４．２４及び１．４．１９（−３）型、より好ましくは１．４．２４型の抗体はオリゴ糖配列に対する高親和性について好適である。このことは実施例でＥＬＩＳＡアッセイによって示され、本発明は特に抗体特異性に関し、特異性は多価のオリゴ糖複合体、好ましくはポリアクリルアミド複合体を用いてＥＬＩＳＡアッセイで比較される。
【０１５０】
［分析方法］
本発明は疾患関連型又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法に関し、本方法は、本発明によるシアリル化されたオリゴ糖及び単糖の配列に対する抗体の特異性を測定するステップと、好ましくは実施例に示したオリゴ糖配列を用いるステップと、好適な結合特異性で含まれる３のオリゴ糖配列、好ましくは好適なａ３及びａ６結合のシアリルオリゴ糖配列に対する特異性を好ましくは測定するステップを含む。好ましくは、抗体が本発明による配列若しくは配列フラグメント、又は相同配列、又は少なくとも１の類似又は相同のＣＤＲ１ないし３配列を有する場合に、特異性が測定される。
【０１５１】
本発明は更に、糖質エピトープ結合抗体を検出する方法を含む、抗体を検索し、あるいは特徴づけし、あるいは最適化する方法に関し、本方法は、
ａ）本発明に記載のように実質的に類似又は同一のＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列、あるいは配列フラグメント、あるいは相同体を有する抗体配列を、利用可能な配列データから検索するステップと、
ｂ）ステップａ）で検索された抗体を、本発明による好適な糖類結合特異性で記載のような糖類配列を含むシアリル糖類のライブラリと接触させるステップと、
ｃ）前記抗体が前記糖類配列のいずれかと結合するか、あるいは、好適な実施形態においては、本発明による抗体と同一の結合特異性を有するかどうかを検出するステップと、
を含む。本発明は特に、好ましくは本発明によるＥＬＩＳＡアッセイで、同一のオリゴ糖配列に結合するステップを含む、実質的に同一又は質的に同様の特異性を有する抗体の選択に関する。
【０１５２】
配列データは配列データベースから、あるいは当該技術分野で既知の抗体のシーケンシングにより入手可能である。
【０１５３】
［培養細胞又は外因性物質と接触状態にある細胞の分析］
［好適な細胞型及び分析方法］
本発明は特に、ヒト細胞の状態を分析し、外因性物質及び／細胞培養条件の、細胞に対する効果の分析のために、本発明による結合試薬、好ましくはモノクローナル抗体に細胞を接触させるステップを含むヒト幹細胞集団の状態を分析する方法に関する。
【０１５４】
この分析方法は、特に無傷細胞集団上のグリカン構造の細胞表面の発現に関する。細胞表面構造を分析することは有用であり、生体内での免疫応答及び／又は細胞、好ましくは幹細胞の細胞生物学に最も関連性があることは理解されよう。
【０１５５】
抗体によるヒト細胞、好ましくはヒト幹細胞のラベリングは、非ヒト外因性物質の存在下で細胞培養条件と関連し、及び／又はラベリングの欠如は、ヒト等価物質の存在下で細胞培養条件と関連する。外因性又は異種抗原性物質とも称される非ヒト物質は、細胞培養中に用いることができ、これらによる細胞の変化又は混入は、例えば細胞の免疫学的な適合性及び／又は細胞生物学的な標的特性の変化により、ヒト生体内での用途に対する細胞の適合性に影響を与えることは理解されよう。
【０１５６】
非ヒト外因性物質は好ましくは、前記非ヒト外因性物質中に非ヒト又は動物型のグリカン構造を含み、好適な非ヒト外因性物質は、動物血清タンパク質又は動物細胞タンパク質といった細胞培養で用いられる非ヒト動物タンパク質／ペプチド、好ましくはＦＣＳ（ウシ胎仔血清）又は動物細胞製剤（例えば、ブタ細胞製剤）といった、動物血清又はそのフラクトンのような動物血清タンパク質、又は非ヒトグリカン構造を生成する細胞培養から得られる組換え生成されたタンパク質である。ヒト等価物質はラベリングの欠如と関連し、好適な実施形態においては、ヒト血清タンパク質及び／又はヒトのグリコシレーションを含むように生成される組換型ヒトタンパク質といった、ヒト血清又は細胞／血液細胞由来のタンパク質のような、前記ヒト等価物質中のヒト型グリカン構造の存在（及び、好ましくは動物型グリカンの不存在）を意味する。
【０１５７】
本発明は分析方法に関し、無傷細胞の主要な下位個体群がラベリングされ、より好ましくは少なくとも１５％、更により好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも３５％、更により好ましくは少なくとも４５％、更により好ましくは少なくとも５５％、更により好ましくは少なくとも６５％、及び最も好ましくは少なくとも７５％又は８０ｍ％の細胞がラベリングされる。
【０１５８】
本発明は、予想外に大部分の、本発明によるヒト細胞、好ましくはヒト幹細胞、最も好ましくはヒト間葉系幹細胞が新規の試薬によってラベリングされることを明らかにした。好適な幹細胞はヒト血液由来の間葉系幹細胞、より好ましくは臍帯血又は骨髄由来の間葉系幹細胞である。
【０１５９】
本発明は特に、本発明による分析方法に関し、本発明による新規の抗体が用いられる。
【０１６０】
分析すべき最も好適な細胞は、
ｉ） 培養細胞と、
及び／又は、
ｉｉ） 血清のような外因性糖質物質、及び／又は、外因性の糖タンパク質及び／又は糖脂質と接触状態にあった細胞と、
及び／又は、
ｉｉｉ）本発明による抗体によって認識される特異的なオリゴ糖のうちの１又はそれ以上の発現を誘発する条件において成長させた細胞と、
を含む。
【０１６１】
発明者は既に、動物由来の低純度アルブミン製剤といった外因性糖質物質、又は磁力ソーティングシステムにおけるＦｃ遮断薬といった細胞選別試薬の極めて短い曝露に基づいて、細胞のグリコシレーションの変化を明らかにすることに関与してきた。細胞培養条件は細胞表面上の特定のオリゴ糖配列の生合成用の前駆体物質（例えば、Ｎｅｕ５Ｇｃといったシアリン酸、又は糖脂質）を提供することによって、及び／又は、細胞中のグリカン生合成の制御に影響を与えることによって、新規のグリカンの発現を誘発できることは更に知られる。
［無傷細胞］
【０１６２】
本発明は、抗体がＦＡＣＳ分析といったフローサイトメトリ及び／又は免疫組織化学によって観察可能な無傷細胞上で糖類配列を認識できることを明らかにした。本発明は特に、より特異的には抗体接触可能物質として、１又はそれ以上の糖類配列、より好ましくは無傷細胞上のオリゴ糖配列の分析に関連する。
【０１６３】
［細胞培養］
図９はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）における１．４．２４型抗体による、ヒト臍帯血間葉系幹細胞、ヒトＣＢ−ＭＳＣ細胞のラベリングを示す。細胞は外因性非ヒト物質の存在下で培養されており、非ヒト物質が「異物のない物質（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）」又はより特異的にはヒト由来の物質によって置き換えられる場合にはラベリングは観察されなかった。データは抗体によってラベリングされた主要な無傷細胞集団を示し、ラベリングは細胞培養条件に依存する。
【０１６４】
ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）処理は、細胞に対するシアリン酸依存型結合を確認するのに用いられた。実施例は更に、外因性（非ヒト）物質と接触状態にある場合のヒト幹細胞の有効なラベリングと、動物細胞の有効なラベリングとを示す。
【０１６５】
好適な実施形態においては、本発明は外因性物質、より好ましくはこの抗体によって認識されるオリゴ糖配列のうちの１又はそれ以上の存在を含むか、あるいは誘発する物質による混入についての培養細胞の分析に関する。
【０１６６】
好適な実施形態においては、抗体は、好ましくは物質が本発明によるオリゴ糖配列のうちの１又はそれ以上を含む場合の、ブタ又はウシ由来の物質といった非ヒト動物物質の存在下で培養される細胞の分析に用いられる。
【０１６７】
分析すべき最も好適な細胞は培養細胞を含み、好適な細胞型は、特にＮｅｕＧｃ含有型の生物学的物質と接触状態にあった場合に、ＮｅｕＧｃ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を取り込むと知られる細胞を含む。総ての細胞がＮｅｕＧｃによって有効に混入されるわけではないことは更に知られる。発明者は同時係属中の出願において、特異的にシアリル化されたグリカン構造は、造血、間葉又は胚性幹細胞に取り込まれることを明らかにした。本発明は好適な実施形態においては特に、この抗体によって認識される特異的なオリゴ糖配列の状況におけるＮｅｕＧｃを含む細胞の評価に関する。
【０１６８】
分析すべき好適な細胞型は、特にＮｅｕＧｃ含有型及び好適なシアリルオリゴ糖配列含有型、又は特異的なオリゴ糖配列の存在を誘発する物質と接触状態にあった場合に、ヒト細胞、より好ましくはヒト幹細胞、更により好ましくはヒト造血細胞、骨髄由来細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、及び胚性幹細胞、又は他の幹細胞等、ならびにこれらの細胞型のための同様かつ可能な支持細胞を含む。
【０１６９】
この抗体は様々な混入又は好適な細胞型上の混入誘発型オリゴ糖配列を認識するのに用いられうることは理解されよう。
【０１７０】
発明者は特に、多能性細胞からの有効なＮｅｕＧｃの混入及び／又はＮｅｕ５Ｇｃ／シアリン酸含有型のオリゴ糖の混入の新しい可能性を発見し、好ましくはこれらは多能性細胞であり、胚性起源ではなく、より好ましくは細胞型は、造血細胞、骨髄由来細胞、臍帯血細胞、及び間葉系幹細胞を含み、それは優良な治療可能性の総てであり、それは胚性幹細胞を有するような奇形発癌型のリスクをほとんど有しない。総ての細胞がＮｅｕＧｃ又はシアリン酸のオリゴ糖含有型の複合糖質によって有効に混入されるわけではないことは更に周知である。
【０１７１】
［非特許文献］
・Ｂｏｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５，４３１−４４６
・Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｙａｍｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｏｅｔｔｇｅｎ Ｈ．Ｆ．，Ｏｌｄ Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ Ｋ．Ｏ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１８５０７−１２．
・Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ，Ａ．，Ｔｅｒｏ Ｓａｔｏｍａａ，Ｔ．，Ｔｉｉｔｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｌａｉｔｉｎｅｎ，Ａ．，Ｍａｎｎｅｌｉｎ，Ｓ．，Ｍｉｋｋｏｌａ，Ｍ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｍｉｌｌｅｒ−Ｐｏｄｒａｚａ，Ｈ．，Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，Ｏｌｏｎｅｎ，Ａ．，Ｌｅｈｅｎｋａｒｉ，Ｐ．，Ｔｕｕｒｉ，Ｔ．，Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ，Ｔ．，Ｎａｔｕｎｅｎ，Ｊ．，Ｓａａｒｉｎｅｎ，Ｊ．＆Ｌａｉｎｅ，Ｊ．（２００６）投稿中
・Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．
・Ｍｏｒｅｎｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）８（７）６９５−７０５
【実施例】
【０１７２】
［ファージディスプレイ選択による組換え型のＮｅｕＧｃ特異性のｓｃＦｖのフラグメント］
本実施例においては、ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリはＮｅｕＧｃ−単糖に対して親和性及び特異性を有するｓｃＦｖのフラグメントを単離するように異種抗原性のＮｅｕＧｃによって構成及び選択された。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリの構成は、ＩｇＭのＦａｂ−κ及びＦａｂ−λライブラリを最初に構成することによって間接的に調製され、次いで特定のライブラリＤＮＡが重鎖及び軽鎖の可変ドメインのＰＣＲ増幅に用いられた。
【０１７３】
［未処理のヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリの構成］
５０の健常供血者からのヘパリン化された血液サンプル（１０ｍｌ）が貯蔵され、リンパ球はＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）単離プロトコルを用いて製造者の指示に従い単離された。ＲＮＡ全体はＰｒｏｍｅｇａ社のＲＮＡｇｅｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて製造者のプロトコルに従い、ヒトリンパ球貯蔵源から単離された。第一鎖のｃＤＮＡ合成はＰｒｏｍｅｇａ社のＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔを用いて行われた。ヒトＩｇＭのＶＨ及びＶＬ領域をコード化するｃＤＮＡは表３のＰＣＲプライマを用いて、ＶｅｎｔＰｏｌ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）で増幅された。抗体フラグメントの最終的なＰＣＲ生成物は貯蔵され、好適な制限酵素で消化された。消化されたＤＮＡフラグメントはＶＨ領域ならびにＶκ及びＶλ領域をコード化し、ファージミドベクタに連結され、大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質変換され、約１０８の別個のクローンのｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリを得た。
【０１７４】
ビオチン化されたパニング型（Ａｇ＋）及び欠乏型（Ａｇ−）の双方の抗原は、ストレプトアビジン複合型磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）上へ製造者のプロトコルに従い結合された。Ａｇ＋は多価のＮｅｕ５Ｇｃα−ポリアクリルアミド−ビオチンであり、Ａｇ−は多価のＮｅｕ５Ａｃα−ポリアクリルアミド−ビオチンであり、双方はロシアのＳｙｎｔｅｓｏｍｅ社／Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ社から入手された。複合体はビオチン分岐鎖を含む分岐型のポリアクリルアミド複合体に連結される３炭素数のアルキルスペーサを有する。
【０１７５】
［ヒトｓｃＦｖライブラリの選択］
ヒトｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリはファージディスプレイ技術によって選択された（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｂａｒｂａｓら、１９９１）。ＮｅｕＧｃ特異性のフラグメントの単離のために、未処理のヒトＩｇＭのｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリは、多価のフォーマットでバクテリオファージの表面に呈示され、ライブラリは親和性のパニング手順を用いて貯蔵及びパニングされた。ビオチン化されたポリアクリルアミド複合型シアリン酸誘導体は、ストレプトアビジン複合型磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）に製造者のプロトコルに従って結合された。ＮｅｕＡｃ複合体（Ａｇ−）は欠乏型のために用いられ、ＮｅｕＧｃ複合体（Ａｇ＋）はライブラリのパニング用に用いられた。
【０１７６】
最初に、ファージプールは、＋４℃で１６時間のスクリーニングステップで、バックグラウンドのコントロールとしても用いられる欠乏型のＡｇ（Ａｇ−）と結合する磁気ビーズと反応するのを可能にした。その後、ファージプールは取り除かれ、パニング型抗体（Ａｇ＋）又は欠乏型抗体（Ａｇ−、バックグラウンド）のいずれかを含むビーズ上へ移植された。室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーション後、ビーズは０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、結合ファージは酸性バッファ（１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出され、直ぐに２ＭのＴｒｉｓ溶液で中和された。次のパニングラウンドのために、溶出したファージプールは大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を感染させることによって増幅された。抗体フラグメントのファージ上への多価の呈示のために、ハイパーファージ（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ：Ｐｒｏｇｅｎ社）が総てのパニングラウンドで用いられた。４回のパニングが行われた。
【０１７７】
第２、第３及び第４のパニングラウンドでの可溶な一価のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩの融合物は大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中に発現した。１４８の別個のクローンは予備的な性質決定のため１ｍｌ規模で成長させた。上清はＡｇ＋でコーティングされるウェルをグリカン特異性の結合剤を捕捉するように、及びＡｇ−でコーティングされるウェルを非特異性の結合剤を認識するように用いて、ＥＬＩＳＡ上で分析された。１２の最も有望なクローンが配列され、結果として６の異なるＤＮＡ配列が発見された。そのうちの５つが細胞結合アッセイでの更なる性質決定のために選択された。
【０１７８】
［特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ結合型抗体の性質決定］
５のモノクローナルの多価ファージの細胞結合は、ＮｅｕＧｃ陽性のブタ腎尿細管細胞(ＬＬＣ−ＰＬ１)の蛍光免疫染色によって研究された。細胞は２ないし４日間、９５％の空気及び５％のＣＯ２の湿気のある環境下で、３７℃で５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、１００ユニット／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを用いて補充されるＭ１９９細胞培養培地中で、コーティングされたガラスの８のチャンバスライド（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ社、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社、デンマーク）上に成長させた。細胞はＰＢＳで５回すすがれ、ＲＴで１０ないし１５分間、ＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒドで固定され、その後ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。非特異性の結合部位はＲＴで３０分間、ＰＢＳ中で３％のＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、ＦＲＣ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ社、フィンランド）で遮断された。
【０１７９】
ファージ抗体は１％のＨＳＡ−ＰＢＳで１０６ｐｆｕ／ｍｌまで希釈し、ＲＴで６０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで１０分間３回洗浄した。第２のマウス抗ファージ抗体（αＭ１３、１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及び第３のＦＩＴＣでラベリングされたヤギ抗マウス抗体（１：３００、Ｓｉｇｍａ社）は、ＲＴで６０分間インキュベートされ、ＰＢＳで５ないし１０分、３回洗浄され、ＤＡＰＩ染色を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国）に封入された。非特異性のハイパーファージは負のコントロールとして用いられた。結合の特異性はファージ抗体でのインキュベーション前に、シアリダーゼ処理により細胞表面からシアリン酸を除去することによって試験された。細胞のシアリダーゼ処理後に細胞表面に特異的に結合するが、その結合活性を失う４のクローンが同定された（表１）。
【０１８０】
［グリカン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング］
４のヒトＩｇＭのｓｃＦｖクローンは、ＩｇＧ１サブタイプを用いたヒトＦａｂフラグメントへの変換のために選択された（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｄｅｓｐｌａｎｃｑら、１９９４）。Ｆｄ領域及び軽鎖は表４のプライマを用いてＰＣＲをオーバラップすることによって増幅させた。Ｆｄ領域及び軽鎖の得られたｃＤＮＡは細菌性発現ベクタである、ｐＫＫｔａｃにクローンされ、次いで大腸菌ＲＶ３０８に形質変換された。１．２．２０、１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型として指定された可溶なＦａｂフラグメントが生成された。
【０１８１】
抗体Ｆａｂフラグメントは、シアリル化された細胞及びＮｅｕＧｃ含有型細胞の免疫染色で試験された。シアリン酸に依存し、シアリダーゼ酵素により放出可能な陽性の染色は、抗体が動物細胞物質で特徴づけられる場合に観察された。表１参照。細胞はフルオレセインとＤＡＰＩフィルタとを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及び蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ社、ドイツ）で観察された。画像は４００倍の拡大率を有するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で取り込まれた。染色の強度は−（陰性）又は＋／＋＋／＋＋＋（陽性）として類別された。
【０１８２】
抗体は更に、ウェスタンブロットアッセイで試験された。このアッセイは糖タンパク質に結合することを示した。
【０１８３】
［抗体配列の比較］
本発明による抗体配列は、標準的な方法によって他の入手可能な抗体配列と比較される。例えば、相同配列はＢＬＡＳＴプログラムによって検索され、例えばＥｎｔｒｅｚのネットページから入手可能である。表５は特異的な配列とともに、ＢＬＡＳＴによるほぼ相同の短い配列を検索することによって見つけられうる配列の不作為な実施例を示す。
【０１８４】
配列の一部は数多くの抗体配列と相同又は同一であり、その配列の一部、特にＣＤＲ３配列は非常に固有であるように見える。本発明は、
１）Ｎ残基がその他の抗体中に見つからなかった、１．４．３０型の軽鎖ＣＤＲ２中のＸ１−アミノ酸残基、
２）Ｇ残基がその他の抗体中に見つからなかった、１．４．３０及び１．４．１１型、及び希少なＸ１残基のＮに更に隣接するＲがある１．４．２４型の軽鎖ＣＤＲ３中のＸ２−アミノ酸残基、
３）１．２．２０型の重鎖ＣＤＲ２であるＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳＬＫＳ上の希少なＬ残基、
といった希少又は特有の単一のアミノ酸残基の置換変異を明らかにした。
【０１８５】
ＣＤＲ３配列は他の希少な特性を有する。重鎖ＣＤＲ３は比較的短く、１．２．２０及び１．４．２４型は６のアミノ酸残基を有し、１．４．３０型は７のアミノ酸残基を有し、９の残基を有する１．４．１１型であっても比較的短い。重鎖ＣＤＲ３は更に希少な配列を有すると思われ、例えば１．２．２０型の重鎖ＣＤＲ３はいずれの免疫グロブリンにも見られなかった。本発明は、保存され、かつ対応するより多くのＣＤＲ１及び２配列、ならびに共通配列を伴う固有で特有の特徴及びその組合せに関する。
【０１８６】
［１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性］
［実験手順］
［イムノアッセイによって決定された１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性］
ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）−ビオチン複合型の多価の単糖又はグリカン（Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ社、ロシア、表６参照）は、４℃、ｏ／ｎでＴＢＳバッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジンのマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、フィンランド）上で固定化された。ウェルはＴＢＳで４回洗浄され、非特異性結合部位は室温（ＲＴ）で６０分間、１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ７６３８）で遮断された。１．４．２４及び１．４．３０型の抗体は０．１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳで３μｇ／ｍｌに希釈され、ＲＴで２時間インキュベートされた。更に、ウェルはＴＢＳで４回洗浄され、第２の抗体である、ユーロピウムでラベリングされたヤギ抗ヒトλファージ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は０．１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈され、ＲＴ、暗所で６０分間インキュベートされた。ウェルは前述のように洗浄され、２００μｌのＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、フィンランド）はウェルごとに添加され、その後プレートはＲＴで５分間震とうされた。ユーロピウムシグナルはＶｉｃｔｏｒプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フィンランド）で検出された。
【０１８７】
［結果及び考察］
［抗体の特異性］
１．４．２４及び１．４．３０型の双方の抗体は、天然に発生するＮｅｕＡｃ−単糖（ＧＦ３０８、図８）よりもＮｅｕＧｃ−単糖（ＧＦ３０９）に対する特異性が高い。しかしながら、双方の抗体がグルクロン酸α／β（それぞれ、ＧＦ３４１及びＧＦ２７１）といった酸性単糖と交差反応する。更に抗ＮｅｕＧｃ抗体は、ＮｅｕＧｃ又はＮｅｕＡｃのいずれかの単糖を保有する二単糖及び三単糖の可変性の認識を示す。シアリン酸（ＳＡ）がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はガラクトース（Ｇａｌ）のいずれかとα２ないし６結合で連結される場合、ＮｅｕＡｃはＮｅｕＧｃ（ＧＦ３４５ないしＧＦ３４８）の少なくとも４倍良く認識される。ＳＡが１型のＬａｃＮＡｃにα２又は３結合される場合、ＮｅｕＧｃ／Ａｃの双方が抗体によって認識さて、ＮｅｕＧｃはわずかにＮｅｕＡｃより良い（それぞれ、ＧＦ４６２及びＧＦ４６１）。総ての他の抗体は、ＳＡがα２又は３結合で連結される場合（ＧＦ４５９、ＧＦ４６０、ＧＦ４６３ないしＧＦ４６８）、抗ＮｅｕＧｃ抗体によってまったく認識されない。
【０１８８】
［ヒト幹細胞を用いたＦａｂフラグメントの試験］
抗体Ｆａｂフラグメントは、記載のように（Ｌｅｓｋｅｌａら、２００３）、生成されたシアリルグリカン混入型／修飾型のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の免疫染色で試験された。動物物質（ウシ胎仔血清、ＦＣＳ）での細胞培養条件によって、細胞がＮｅｕ５Ｇｃ及び特有のオリゴ糖で陽性になる。簡潔に言えば、整形外科手術中に得られる骨髄は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを追加したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｌｐｈａ−Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ社）中で培養された。２日間付着を許容した後に、細胞はＰＢＳで洗浄され、同一培地中で２０００ないし３０００細胞数／ｃｍ２の密度で継代培養された。免疫染色実験のために、ＭＳＣはコーティングされたガラスの８のチャンバスライド上で培養され、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞に対し上述したように、パラホルムアルデヒドで固定した。抗体Ｆａｂフラグメントは１％のＨＳＡ−ＰＢＳ中で希釈され、ＲＴで６０分間インキュベートされ、その後ＰＢＳで１０分間、３回洗浄した。ＦＩＴＣでラベリングされたヤギ抗ヒトλ抗体（１：１０００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）はＲＴで６０分間インキュベートされ、開始前にＰＢＳで５ないし１０分間、３回洗浄した。細胞はフルオレセインとＤＡＰＩフィルタとを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及び蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ社、ドイツ）で観察された。画像は４００倍の拡大率を有するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で取り込まれた。染色の強度は−（陰性）又は＋／＋＋／＋＋＋（陽性）として類別された。結果は表７に示される。１．４．２４及び１．４．３０型の抗体は見つけられる場合、幹細胞を認識するのに特に有用である。
【０１８９】
［間葉系幹細胞の細胞培養条件に影響を与えるシアリン酸の分析］
［臍帯血間葉系幹細胞の生成］
ヒト条件の臍部の臍帯血ユニットは、母親にインフォームドコンセントを伝えた後に収集され、臍帯血は収集２４時間以内に処理された。単核細胞（ＭＮＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の密度勾配遠心分離によって各ユニットから単離された。単核細胞の分画は、１０６細胞数／ウェルでフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）でコーティングされた６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）上に平板培養された。非接着細胞のほとんどは培地が翌日に交換される際に除去された。細胞はＢＭ ＭＳＣについて上述したように基本的に培養された。分析で用いられるＣＢ ＭＳＣは継代数５ないし７であった。
【０１９０】
ＢＭ及びＣＢの双方のＭＳＣはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性、ならびにＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＨＬＡ−ＡＢＣに対し陽性になるようにフローサイトメトリによって分析された。細胞は骨原生、脂肪生成及び軟骨形成系列に沿って分化できることが示された。
【０１９１】
細胞はウシ胎仔血清の存在下で培養された。ＦＣＳの存在下で培養される細胞は１．４．２４型Ｆａｂフラグメントによって観察可能なシアリル−オリゴ糖エピトープを蓄積した。これらの一部は、結合がシアリン酸依存性であることを示すノイラミニダーゼ処理によって除去できた（最適化されない）。細胞が非動物性／特有のシアリン酸グリカン含有物質（特に、ヒト血清）の存在下で成長する場合、抗体は細胞を有効にラベリングしない。本発明は、動物性のシアリル物質の存在下での培養と関連づけられ、ヒト血清といった異物のないヒト物質での培養と関連づけられない場合の、幹細胞のラベリングと特異的なシアリン酸エピトープの呈示とに関する。
【０１９２】
［抗体変異体の例］
ファージディスプレイライブラリのスクリーニングは、Ｆ３とも称される１．４．１９（−３）型である更なる抗体配列を明らかにした。抗体の配列は１．４．２４型の重鎖及び１．４．１９型の軽鎖である、図１１ａ及び１１ｂを含む。抗体の特異性及び活性は、重鎖が抗体特異性を決定するキー因子であることを示す１．２４．４型と類似する。図１０。データは更に、軽鎖が少なくとも（ａｔ ｅｌａｔｓ）部分互換性であることを示す。好適な実施形態においては、本発明は４の他の抗体のいずれかを有する、１．４．２４型の抗体の重鎖配列、好ましくは１．４群の配列、最も好ましくは１．４．２４又は１．４．３０（Ｆ３）型の軽鎖、あるいは、４の他の抗体のいずれかを有する、１．４．３０型の抗体の重鎖配列、好ましくは１．４群の配列、最も好ましくは１．４．２４又は１．４．３０型の軽鎖を含む抗体に関する。
【０１９３】
表１は、選択されたＮｅｕＧｃ結合型抗体ファージのクローンのブタ腎尿細管細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１）への結合である。結合は免疫染色によって評価され、特異性は細胞のシアリダーゼ処理によって評価された。
【０１９４】
【表１】
【０１９５】
表２は類似のタンパク質配列、特に１．４．３０型と類似性を有し、特異的な糖脂質又は他の糖質を結合することが示される可能性のある、特定のバックグラウンドの抗体である。
【０１９６】
【表２】
【０１９７】
表３はＰＣＲプライマライブラリである。
【０１９８】
【表３】
【０１９９】
表４は、Ｆａｂフラグメントの増幅用のプライマである。
【０２００】
【表４】
【０２０１】
表５は、抗体配列の類似性の検索及び比較である。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
表６は１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性の決定に用いられる、グリカンポリアクリルアミド（ＰＡＡ）−ビオチン複合体及びそのコードである。
【０２０４】
【表６】
【０２０５】
表７は選択されたシアリル−オリゴ糖特異性の抗体Ｆａｂフラグメントのヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への結合である。結合は免疫染色によって評価された。
【０２０６】
【表７】
【０２０７】
［非特許文献］
・Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，７９７８−７９８２．
・Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ａ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７，１０２７−１０３３．
・Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６４４４−６４４８．
・Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．
・ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｆ．Ｊ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４．
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体工学の技術に関する。特に、本発明は、ヒトのグリカン結合型抗体及びその誘導体に関し、それはヒト以外の抗原性グリカンを含む特異的なオリゴ糖配列を結合する。本発明は更にこのようなグリカン結合型モノクローナル抗体を生成及び操作するプロセスと、免疫診断の分野でこれらの抗体及びその誘導体を用い、生物学的かつ未加工の物質サンプルにおけるヒト以外の抗原性グリカンを含む特異的なオリゴ糖配列の定性的及び定量的決定を可能にし、ならびに免疫療法においては、例えば移植の状況下で、患者中の抗原性グリカンの遮断を可能にするための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト自然抗体の結合特異性は既知である。自然抗体は、癌若しくは平均的な自己免疫疾患のような悪性疾患、又は異種抗原性グリカンのような病原性物質に対する保護に関与しうることが分かる。自然抗体の特異性は、その生成を生じさせる病原性症状の性質決定に有用であることが分かる。更に、新規の抗体及び特異性は新規試薬の生成及び最適化に有用である。
【０００３】
表２は、糖鎖認識に関与しうる、１．４．３０型の重鎖のペプチド配列の一部と関連付けできる特定の抗体型タンパク質配列を列記するが、本発明による最も好適な標的のオリゴ糖配列は示されていなかった。刊行物は重鎖１．４．３０型の配列全体も、新規の軽鎖配列も示していないことは理解されよう。糖鎖配列は１．４．２４型又は１．４．１１型のような他の新規の抗体又はこれらと相同の抗体について示していないことは更に理解されよう。
【０００４】
様々な細胞ベースの治療法が開発下にある。治療用細胞の抗原性グリカン及び／又は異種抗原性物質との混入は、新規の細胞治療法の開発における主要な問題であると認識されてきた。ＮｅｕＧｃは異種抗原、及び、例えばブタからヒトへの器官の異種移植を防ぐ障壁として知られ（国際公開第０２０８８３５１号、Ｚｈｕ，Ａｌｅｘ）、異種移植は更に複数のバイオ企業によって開発下にある。
【０００５】
ＮｅｕＧｃに対する抗体は公表されてきた。最も公表されている抗体はニワトリで生成され、更にヒトと同様にＮｅｕＧｃグリカンがない。シアリン酸の特徴的なグリセロール基側鎖のない酸化したＮｅｕＧｃを含むカラムにおけるニワトリ抗体の親和性精製による、ＮｅｕＧｃ認識型の抗体の生成のための方法が公表された（Ｖａｒｋｉ Ａら、国際公開第２００５０１０４８５号）。この方法は特定のニワトリ抗体の精製に有用であると思われる。本発明はＮｅｕＧｃのグリセロール部分への結合活性を含むヒトの天然型モノクローナル抗体の生成に関する。モノクローナル抗体が通常のバイオ技術の方法によって特徴づけられ、かつ再現性良く生成されうる試薬としての利点を有することは理解されよう。
【０００６】
特異的な特定のオリゴ糖の糖脂質を結合する、黒色腫の患者から生成されるヒトＩｇＭ抗体の２のクローンが更に報告された（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら、１９８８）。これらの抗体は、通常のヒト細胞又は組織も、癌のサンプルも認識しなかった。他の抗体３２−２７Ｍは糖脂質中の内部ＮｅｕＧｃに対し特異的であり、Ｎｅｕ５ｘα８Ｎｅｕ５Ｇｃα３（ＧａｌＮＡｃβ４）Ｇａｌβ４Ｇｌｃ型の配列中の非還元性末端の末端ＮｅｕＧｃに対しては特異的ではない。ウシ胎仔血清中で成長する黒色腫細胞で糖脂質を結合し、糖脂質の混入の可能性を有する。他の抗体は特定の糖脂質状の末端ＮｅｕＧｃを認識したが、いずれの条件下でもヒト細胞ではない（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら、１９８８）。本発明による抗体は、特異的な酸性の糖エピトープ及びＮｅｕＧｃ含有型の単糖及びオリゴ糖構造を認識することを明らかにし、ヒト細胞上のこのような構造はタンパク質である。癌の状況においては、オリゴ糖の糖脂質構造ＮｅｕＧｃα３ＬａｃβＣｅｒ（ＧＭ３）に対し特異的な、特定のわずかに特徴づけられた同様のポリクローナルＮｅｕＧｃ抗体（いわゆる、Ｄｅｉｃｈｅｒ−Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ抗体）が報告された。これらの研究は分析又は治療用途に対して有用な純粋なヒト抗体を表わしてないように思われる。
【０００７】
ＮｅｕＧｃ含有型のＧＭ３ガングリオシドＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ、又はシアリル２型のＮ−アセチルラクトサミンの糖脂質ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＧａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒに特異的に結合するＮｅｕ５Ｇｃ認識型のＰ３抗体は、天然のマウスＩｇＭ抗体として、かつヒト化抗体として知られている（国際公開第９９２０６５６号、Ｖａｓｑｕｅｚら）。抗体は糖脂質特異性であると示された。この特異性はＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）の型を排除し、シアリン酸含有配列のためのα３結合とともに、Ｎ−アセチルラクトサミン中にβ４結合があり、更に、Ｐ３抗体がＮｅｕＧｃ特異性を排他的に伝えるが、一方、この抗体はシアリン酸に対する配列特異性の優先度を有する。
【０００８】
本発明は、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃの双方を有し、異なる特異性がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとが認識し、重鎖及び軽鎖上に異なるペプチド配列を有する新規のヒト抗体を明らかにする。特有の結合特異性は更に、好適な実施形態においてシアリルＴｎ構造としてのα結合形態で、末端配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃを含む。この抗体がタンパク質上に、及び／又は、タンパク質及び糖脂質上に好適なグリカン構造を認識し、特異性は標的分子中の脂質構造を要求しないことは理解されよう。α３でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン及びラクトースＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎはこの抗体に対し非常に低い結合親和性を有するか、あるいは全く認識せず、このことはＰ３型又はＧＭ３特異的な抗体との相違を示す。
【０００９】
新規のオリゴ糖配列の結合特異性は、バックグラウンドにおける大部分のガングリオシド特異性と大いに異なり、１．４．３０型に関連づけた配列、特に重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、より特異的にはＦＴＦＳＳＹＡＭＳ型の配列と関連するものを含む。重鎖のＣＤＲ１領域は全体的に異なるオリゴ糖結合特異性を有するＰ３及び１４Ｆ７抗体に対する特定の相同性を有する。本発明で提供される軽鎖及び重鎖配列によって、本発明による１又はそれ以上のオリゴ糖結合活性を有するヒト抗体の設計及び最適化を可能にすることが更に理解されよう。ヒト抗体は抗原性ではないため、生体内及び生体外での免疫診断及び分析又は治療に有用である。
【００１０】
特に、α３結合された１型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβと、Ｏ−グリカン配列ＳＡα６ＧａｌＮＡｃα、及び、更には２型のＮ−アセチルラクトサミンＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβを含むが他のシアリル三糖配列を事実上排除するα６でシアリル化された構造との、この組合せは非常に特有であり、抗体中の特異的な２の別個のシアリン酸結合部位を暗示していることは理解されよう。
【００１１】
抗体の構造は、二級ヒドロキシル上にあるが、２型ラクトサミンと関連づけられないα３結合されたシアリン酸、及び、よりフレキシブルな一級ヒドロキシル構造上にあるα６結合されたシアリン酸のいずれかで２の配列型を認識できる。特異性は二分岐型のＮ−グリカンコア構造［ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ］上にある配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβのうちの少なくとも１つの強い認識を含まないことは更に明らかにされ、シアリルＴｎ構造はＮ−グリカン上に存在できないことが更に知られる。この特異性は明らかに、出願人の先の発明における、好適な幹細胞混入Ｎ−グリカン構造と異なっている。
【００１２】
いくつかのオリゴ糖配列は、ヒト幹細胞の性質決定用で知られている。本発明は無傷細胞の表面からいくつかの異なる配列を認識する特異的な結合試薬に関する。その認識は大きな細胞集団を含んでもよく、例えばほぼ８０％の幹細胞の標識化を示す。図９参照。並列実験において、細胞が脱離後二時間となった時に８０％を超える標識化が得られた。本発明は間葉系幹細胞、特に好適なヒト血液関連の幹細胞の性質決定のために、及び、特定形態の外因性試薬及び細胞培養条件、又はその欠如の状況における、特に有用な方法を明らかにした。
【００１３】
ヒト自然抗体は、有害な抗抗体免疫反応の可能性を有する動物からのいくつかの既知の抗体よりもヒト用途に好ましく、ヒトのグリカンと関連する構造をより認識できる。
【００１４】
ＮｅｕＧｃ結合型抗体は異種抗原性エピトープを特徴的に認識し、このような物質に対する免疫反応を検出及び決定するために臨床又は免疫診断で有用である。ハイブリドーマ技術といった従来の方法論によるＮｅｕＧｃエピトープを特異的に結合できるモノクローナル抗体の生成は、マウス及びほとんどの他の動物中の通常のグリコシレーションとしての構造の存在によって妨害されてきた。ファージディスプレイ技術はヒトの特定の複合型オリゴ糖構造に対する抗体の生成において適用され、有効な抗原性の決定基はいくつかの単糖残基をおおっている。しかしながら、ＮｅｕＧｃグリカンと結合するが、ＮｅｕＡｃグリカンと結合しない抗体中にあるような、ヒドロキシル基によって置換される１の水素イオンの軽微な変化のみで、単一の末端単糖を有効に認識することが可能なファージディスプレイ又は他のヒト抗体についてデータが存在しない。この抗体は、ＮｅｕＧｃ−単糖及び他の糖類の多価性高密度複合体を有効に認識する。抗体は更に、タンパク質及びヒト細胞を含む細胞の認識用に有用であることを示した。この方法は、臨床及び診断用途のために一定の質で生成されうる、酸性オリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃに特異的な組換え型抗体を生成するための新規の手段を与えている。
【発明の概要】
【００１５】
我々は本出願において、抗体が、生物学的サンプルにおける糖類及びＮｅｕＧｃ糖類の定性的及び定量的測定のために設計されるイムノアッセイにおいて、及び、例えば移植と関連するような免疫療法において、試薬として利用するのに十分に高い親和性及び特異性を有する場合の、α３でシアリル化された１型ラクトサミン、ＳＡα６Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ構造、ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、及びシアリルＴｎのＳＡα６ＧａｌＮＡｃを含む、特定の新規の酸性オリゴ糖と、異種抗原性のＮｅｕＧｃ糖類又は対応するＮｅｕＧｃグリカンを含む、特定の単糖エピトープとを特異的に結合するヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＭの抗体フラグメントの開発及び性質決定について述べる。特に、本発明はファージディスプレイ技術といった抗体ライブラリ法による糖類及び／又はＮｅｕＧｃに特異的なヒト抗体の選択と、大腸菌中で生成される、操作した抗体フラグメントの結合特性の性質決定について述べる。
【００１６】
従って、本発明は異なる種類のイムノアッセイプロトコルならびにヒト免疫療法に用いるべき新規の試薬を提供する。本発明は更に、これらの特異的な均一品質の試薬の連続供給の保証を可能にし、本来の処理単位ごとのポリクローナル抗血清の変化を除去する。これらの有利な効果は、新規、特異的、かつ経済的な、均一品質の免疫診断アッセイ及び治療用分子の製造を可能にする。
【００１７】
従って、ある本発明の特異的な目的は、本発明による糖類、そのフラグメント、その化学的又は非共有結合的な複合物、又はこのような抗体の他の誘導体を結合するヒトモノクローナル抗体を提供することであり、酸性糖類、及び／又は、好適な実施形態においては生物学的サンプルにおける糖類及び／又はＮｅｕＧｃの定性的及び／又は定量的測定、ならびに免疫療法におけるその使用を可能にする親和性及び特異性を有するＮｅｕＧｃグリカンを結合する。本発明の一価及び、特に少数価数の抗体は、異種抗原性のＮｅｕＧｃ糖類を含む糖類に対する特異的な結合を示す。
【００１８】
本発明の別の目的は、特異的なオリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃ糖類に特異的な抗体鎖をコード化するｃＤＮＡクローン、ならびに、特異的なオリゴ糖及び／又はＮｅｕＧｃ糖類に結合する抗体、そのフラグメント、又はこのような抗体の他の誘導体を生成するよう、このようなクローンを発現するための構造及び方法を提供することである。本発明は更に、ａ）核酸配列の発現分析用に、ｂ）核酸配列の発現を有効にするために、核酸配列及び相補的核酸配列、ならびに核酸配列と結合及びハイブリッド形成する類似の能力を有するその相同体の使用に関する。
【００１９】
本発明の更なる目的は、生物学的サンプル中の特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ糖類の定性的及び定量的測定のために、特異的な糖類及び、好適な実施形態においては特にＮｅｕＧｃ含有糖類に結合する抗体、そのフラグメント、若しくはこのような抗体の他の誘導体、又はその組合せを用いる方法を提供することである。更に、本発明は患者における免疫療法のために、特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ結合型の抗体、そのフラグメント、若しくはこのような抗体の他の誘導体、又はその組合せを提供する。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の図面及び詳細な説明で明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特異的な実施例は本発明の好適な実施形態を示すが、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び変形は、この詳細な説明から当該技術分野の当業者に明らかとなるため、例示のみのために与えられると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図の構成はスケールどおりではない。
【００２２】
【図１】図１は、無傷のヒト免疫グロブリン抗体、Ｆａｂフラグメント、及び単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の概略的な表現を示す。抗体のドメイン構造及び結合価は抗体クラスの選択に依存し、例えば、ＩｇＭは二価抗体構造のペンタマを含む。抗原結合部位は三角形で示される。
【図２】図２は、パニング手順を概略的に示す。
【図３】図３は、ＶＬ領域の推定アミノ酸配列の配列比較である。相補性決定領域（ＣＤＲ）が四角形で囲まれる。番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１）による。
【図４】図４は、ＶＨ領域の推定アミノ酸配列の配列比較である。相補性決定領域（ＣＤＲ）が四角形で囲まれる。番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１）による。
【図５】図５は、異なるＶＬ領域のｃＤＮＡである。ＶＬ領域のｃＤＮＡはファージディスプレイ技術によって分離された。
【図６】図６は、異なるＶＨ領域のｃＤＮＡである。ＶＨ領域のｃＤＮＡはファージディスプレイ技術によって分離された。
【図７】図７は、タンパク質レベルでのＶＨ及びＶＬ領域の相同性である。図３及び４中のアミノ酸配列の配列比較はタンパク質配列ツリーを描くために用いられた。
【図８】図８は、実験的手順で述べたようなイムノアッセイによって決定される１．４．２４型及び１．４．３０型の抗体の特異性である。１．４．２４型及び１．４．３０型の双方の抗体は天然生成型のＮｅｕＡｃ−単糖（ＧＦ３０８）以上にＮｅｕＧｃ−単糖（ＧＦ３０９）に対して、更に本発明による特定の他の末端糖エピトープに対して特異性が高い。
【図９】図９は、ＦＡＣＳ中の１．４．２４型抗体によるヒト臍帯血の間葉系幹細胞であるヒトＣＢ−ＭＳＣ細胞のラベリングである（「ｓｕｏｒａ ｌｅｉｍａｕｓ」は直接ラベリングのことである）。データは抗体によってラベリングされた多数の無傷細胞集団を示し、ラベリングは細胞培養条件に依存する。
【図１０】図１０は、実験的手順で述べられるようなイムノアッセイによって決定される１．４．１９−３（Ｆ３）型抗体の特異性である。糖類の還元性末端での文字Ａ、及び例えば（ａ２，６）のような結合構造中のａは（α２，６）といったα結合を示し、糖類の還元性末端での文字Ｂ、及び結合構造中のｂはβアノマ構造を示す。多価のポリアクリルアミド糖類複合体は、ロシアのＬｅｃｔｉｎｉｔｙ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社から入手するか、あるいはグリカンのドナー及び構造がＮＭＲ分光法によって検証される場合、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃを用いたものからシアル酸転移酵素反応によって合成された（酵素はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から入手）。
【図１１ａ】図１１ａは、ｓｃＦｖ１．４．１９−３（Ｆ３）のｃＤＮＡ及びタンパク質配列である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、１．４．２４型に対応する重鎖構造及び１．４．３０型に対応する軽鎖構造を有する、ｓｃＦｖ１．４．１９−３（Ｆ３）クローンの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［略語］
ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
Ｅ．ｃｏｌｉ 大腸菌
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
Ｆａｂ 特異的な抗原結合を有するフラグメント
Ｆｄ 重鎖の可変及び第１定常ドメイン
Ｆｖ 特異的な抗原結合を有する抗体の可変領域
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ
ｍＲＮＡ 伝令リボ核酸
ＮｅｕＡｃ Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−アセチルノイラミン酸
ＮｅｕＧｃ Ｎｅｕ５Ｇｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ リボ核酸
ｓｃＦｖ 単鎖抗体
ＳＡ シアリン酸、ＮｅｕＧｃ及びＮｅｕＡｃを含むノイラミン酸
ｓｕｐＥ グルタミン挿入型のアンバ抑圧ｔＲＮＡを運ぶ菌種の遺伝子型
ＶＨ 重鎖の可変領域
ＶＬ 軽鎖の可変領域
【００２４】
出願人は例えば国際公開第２００７／００６８６４号、国際公開第２００８／１０７５２２号、国際公開第２００８／０８７２５９号、国際公開第２００８／０８７２５８号、国際公開第２００８／０８７２５７号、国際公開第２００７／００６８７０号などの、幹細胞のグリカンマーカ構造についての他の同時係属中の発明を有し、引用として全体が含まれている。
【００２５】
結合剤分子／試薬はグリカンを結合し、好ましくは、結合剤に結合されるラベルのような結合の観察を可能にする特性を含む。強固なグリカン構造に対する新規のグリカン特異性は、グリカンに結合する試薬の高次構造を構造的に規定し、例えばインターネットページｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｓｗｅｅｔｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐのｓｗｅｅｔｄｂから入手可能である。好適な結合剤は、ａ）抗体、レクチン、及び酵素のようなタンパク質と、ｂ）タンパク質の結合ドメイン及び部位のようなペプチド、及びファージディスプレイペプチドのような合成ライブラリ由来のアナログと、ｃ）アプタマ等を含むペプチド物質を模倣する他のポリマ又は有機主鎖分子を含む。
【００２６】
タンパク質がモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転移酵素、植物レクチン、動物レクチン、又はそのペプチド模倣薬の群から選択される場合、ペプチド及びタンパク質は好ましくは、組換えタンパク質又はその得られた、対応する糖鎖認識ドメインであり、結合剤は検出可能なラベル構造を含む。配列データ及び分子モデリングに基づいて、この抗体のような結合剤分子を設計することが可能なことは理解されよう。抗体及びそのフラグメントが最も好適な結合試薬である。
【００２７】
以下の定義は本明細書中で用いられるいくつかの用語のために提供される。用語「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」及び「Ｆａｂ」は欧州特許出願第０１２５０２３号で用いられるのと同様に用いられる。
【００２８】
多様な文法的形態にある「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン分子の集団及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的な活性部分、すなわち抗原結合部位又はパラトープを含む分子を称する集合名詞として本明細書中で用いられる。本明細書中の用語「抗体」によって述べられた分子の例は限定しないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と、Ｆａｂフラグメントと、Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）フラグメントと、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）と、Ｆｖと、ＶＬ又はＶＨのいずれかのドメインを含むか、あるいは交互になるフラグメントとを含む。本発明の免疫グロブリン分子は任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）であってもよく、あるいは免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。好ましくは本発明の抗体は、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、又はＶＬ ＣＤＲを含むか、あるいは交互に含んでもよい。
【００２９】
「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」、「パラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）」は、抗原を特異的に結合する抗体分子の構造上の一部分である。
【００３０】
例示的な抗体はパラトープを含む、それらの免疫グロブリン分子の一部分であり、Ｆａｂ及びＦｖとして知られるそれらの一部分を含む。
【００３１】
抗体の一部である「Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、既知の方法による実質的に無傷の抗体上のパパインのタンパク質分解反応によって調製できる。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂフラグメントは更に、当該技術分野の当業者に既知の組換え方法によって生成してもよい。例えば、米国特許第４，９４９，７７８号参照。
【００３２】
「ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」はタンパク質の独立した折り畳み部分について述べるために用いられる。天然タンパク質におけるドメイン境界部に対する一般的な構造上の定義は、Ａｒｇｏｓ、１９８８で与えられる。
【００３３】
「可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」又は「Ｆｖ」は、免疫グロブリン分子のそれらの領域について述べるのに用いられ、抗原又はハプテン結合を担っている。通常、これらは免疫グロブリン分子の軽鎖及び重鎖のＮ末端の最初の約１００のアミノ酸からなる。
【００３４】
「単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインがリンカペプチドを介して相互に結合されて、単一のｍＲＮＡ分子から合成（転写）された、連続的なアミノ酸鎖を形成する分子を規定するために用いられる。
【００３５】
「リンカ（ｌｉｎｋｅｒ）」又は「リンカペプチド（ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、天然型又は操作型のタンパク質中の隣接するドメイン間で延在するアミノ酸配列について述べるのに用いられる。
【００３６】
「ＮｅｕＧｃ結合型抗体（ＮｅｕＧｃ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、その可変ドメインによって媒介される相互作用によって、ＮｅｕＧｃを特異的に認識し、それに結合する抗体である。特異的な認識は、対応するコントロールの糖類と比較した、特異的な糖類に対する結合活性の高さを表わす。
【００３７】
「糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は単糖又はオリゴ糖のエピトープを表わす。糖エピトープは非還元性末端の末端糖類であることが好ましく、その還元性末端からのみ伸長できることが好ましい。伸長部は、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、デンドリマ、又は多糖類を含むポリマ、又は疎水性のアグリコンを含む脂質といったタンパク質のような担体への結合によって、より大きな糖質構造及び／又は伸長部にできる。好適なポリマ構造は更に、例えば合成のネオ糖タンパク質又はネオ糖脂質における天然及び／又は非天然の糖質構造か、あるいは１価のアグリコン構造への結合、又はポリマのような担体構造に対するスペーサを含む糖類ポリマ複合体とを含む。
【００３８】
本発明による抗体あるいはこれらを含む血清又はライブラリといった、生物学的物質の分析の状況においては、好適なオリゴ糖エピトープは非還元性末端の末端オリゴ糖配列、より好ましくは伸長型のオリゴ糖配列を含み、天然担体構造は、還元性末端でセラミドを含むスフィンゴ糖脂質といった、タンパク質及び／又は脂質構造に結合するＯ−グリカン及び／又はＮ−グリカンの構造を含む、１又はそれ以上のタンパク質といった天然の複合糖質であることが好ましい。エピトープは好適な実施形態においては、従来技術の既知かつ変更可能な分岐型細菌性多糖類といった一部の多糖類、例えば発明者の述べた部分であってもよい。より好ましくは、糖類は還元性末端から単独で伸長され、更には、オリゴ糖配列は、任意の更なる群によって、還元性末端ではない任意のヒドロキシル基構造に変更又は分割されないことが好ましい。伸長構造はＯ−グリカン、Ｎ−グリカン、又は糖脂質（好ましくは、スフィンゴ糖脂質）の構造として認識される天然型グリカンの天然型配列であってもよい。
【００３９】
単一の単糖残基はα又はβグリコシド結合によって、スペーサ構造、好ましくはグリコシド結合したアルキルスペーサといった非単糖物質に結合され、グリカンをポリマに、好適な実施形態においてはポリペプチド、デンドリマ、又はポリアクリルアミドに、より好ましくはポリアクリルアミドに結合する。本発明はα及びβ結合されたシアリン酸の双方、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ及びグルクロン酸、好ましくはα又はβ結合を有するＧｌｃＡへの結合を明らかにした。本発明は更に、ＧｌｃＡを含む天然型グリカン、特にグリコサミノグリカン及び／又は糖脂質におけるＧｌｃＡへの結合の分析に関する。本発明は更に、グリコサミノグリカンといった平均的な多糖類配列における、オリゴ糖配列中のウロン酸含有型単糖残基へ結合する抗体の分析に関する。
【００４０】
糖脂質及び糖質の命名法は実質的に、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名委員会による推奨によるものである（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９８，３１２，１６７、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９７，２９７，１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２５７，２９）。
【００４１】
Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｌｃ（グルコース）、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、及びＮｅｕ５ＡｃはＤ体であり、ＦｕｃはＬ体であり、総ての単糖ユニットはピラノース型であると想定する。アミン基は規定されるように、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃの２位上に天然型ガラクトサミン及びグルコサミン用に存在する。グリコシド結合は部分的には短く、部分的には長い命名法で示され、シアリン酸ＳＡ／Ｎｅｕ５Ｘ残基のα３及びα６の結合はα２又は３、及びα２ないし６と同一の物をそれぞれ意味し、他の単糖残基があれば、α１ないし３、β１ないし３、β１ないし４、及びβ１ないし６はそれぞれα３、β３、β４、及びβ６として短縮できる。ラクトサミンは２型のＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及び／又は１型のＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃのことであり、シアリン酸（ＳＡ）はＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）若しくはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、又はＮｅｕ５Ｘの誘導体を含むその他の天然型シアリン酸である。シアリン酸はともにＮｅｕＮＸ又はＮｅｕ５Ｘのことであり、好ましくはＸはＡｃ又はＧｃである。場合によっては、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃ／ＸはＮｅｕＮＡｃ／ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＮＧｃ／ＮｅｕＧｃ／ＮｅｕＮＸとしてもよい。本明細書でのグリカンという用語は広範に、ヒト又は動物の複合糖質中にある、特に糖脂質又は糖タンパク質上のオリゴ糖又は多糖類の鎖を意味する。１又は複数のグリカンエピトープはオリゴ糖配列を意味し、伸長型エピトープは還元性末端で伸長される、好適なオリゴ糖配列の変異体を意味する。
【００４２】
「オリゴ糖配列（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はグリコシド結合した単糖残基の特異的な配列を意味し、好ましくは末端及び「コア（ｃｏｒｅ）」の配列を含む。オリゴ糖のコア配列は１又はそれ以上の非還元性末端の単糖によって修飾されうる。「末端オリゴ糖配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」の発現は、オリゴ糖が別の単糖残基又は複数の残基によって非還元性末端の末端残基と置換されないことを示す。好ましくは、オリゴ糖配列の非還元性末端はオリゴ糖配列からなり、オリゴ糖配列の還元性末端からのみ修飾され、好ましくは還元性末端からグリコシド複合体化（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）される。
【００４３】
本発明の範囲内にあるこのような抗体のフラグメントの例として、我々は本明細書で図３及び４に示したようなｓｃＦｖのフラグメントを開示する。従って、ある好適な実施形態においては本発明は、ＮｅｕＧｃ及び／又は糖類結合型抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖのフラグメントを提供する。結合能力に実質的に影響を与えない１又はそれ以上の保存的置換を有するＣＤＲ配列又は完全なＶＬ及びＶＨ配列の変異体型が代替的に用いられうることは理解すべきである。
【００４４】
新規の抗体配列は約５０のヒトのＩｇＭ遺伝子上の大きなプールから再現性良く生成された。本発明は実施例及び図面において４の抗体について示したように、抗体配列が実質的な相同性を共有することを明らかにした。各抗体配列が、重要な抗原を認識する天然型のヒト抗体配列などとして有用であることは理解されよう。本発明は軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）の配列と実質的な相同性又は類似性を有する抗体に関する。配列相同性は、ｃＤＮＡレベルのような、タンパク質及び核酸の双方で重要であることは理解されよう。好適な実施形態においては、抗体ドメインのペプチド（タンパク質）配列が比較される。本発明は図７に示されるように、図３中の軽鎖（ＶＬ）配列の配列（又は対応する図５中のＤＮＡ、完全相同性の割合（％）はタンパク質に対し規定されたものから変化することが理解されよう）と実質的な相同性を有する抗体に関し、総ての抗体は約５０％、より特異的には少なくとも約４９％のタンパク質レベルの相同性を共有し、１．４群と称される１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型の３のタンパク質配列は特異的な配列に対し少なくとも約９０％、より正確には少なくとも９３％の更に高い相同性を共有する。分析は更に、１．４．１１及び１．４．３０型の抗体の好適な下位群が互いに約９５％、より正確には約９７％の相同性を共有し、相同性は配列の同一性に近いことを明らかにした。
【００４５】
本発明は図７に示されるように、図４中の重鎖（ＶＨ）配列の配列（又は対応する図６中のＤＮＡ、完全相同性の割合（％）はタンパク質に対し規定されたものから変化することが理解されよう）と実質的な配列相同性を有する抗体に関し、総ての抗体は約５０％のタンパク質レベルの相同性を共有し、１．４群と称される１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型の３のタンパク質配列は特異的な配列に対し少なくとも約８０％、より正確には少なくとも８１％の更に高い相同性を共有する。分析は更に、１．４．１１及び１．４．２４型の抗体の好適な下位群が互いに約８５％の相同性を共有することを明らかにした。
【００４６】
［特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体用の共通配列の規定］
本発明は、本発明による抗体配列と選択的な他の抗体とを比較することによる特異的な糖類認識及び／又はＮｅｕＧｃ抗体のための共通配列を規定する方法に関する。本発明は更に、本発明による抗体配列と選択的な他の抗体とを比較することによる特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体、あるいは抗体群のための特有で特徴的な配列を規定する方法に関する。ＣＤＲが抗体の結合特性に必須であることについて既知なため、例えば、軽鎖と重鎖との双方に対して図３及び４中の四角形中に示されるように、本発明は実質的にＣＤＲ配列の比較に関する。
【００４７】
［軽鎖共通配列］
本発明は好適な実施形態においては、１．４群の抗体の軽鎖のための共通配列である、
ＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２はＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１は好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１は好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２はＧ又はＲであり、Ｘ３はＷ又はＶであるＣＤＲ３、
に関する。
【００４８】
相同性がＣＤＲ配列内で高いことは認識されよう。１．４群の抗体は、好ましくはＣＤＲ１ないし３配列に類似する又は実質的に類似するＣＤＲを有する特徴的な軽鎖を総て含む。
【００４９】
本発明は好適な実施形態においては、１．２．２０型の抗体の軽鎖のための共通配列である、
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
に関する。
【００５０】
１．２．２０型の抗体は、好ましくはＣＤＲ１ないし３配列に類似する又は実質的に類似するＣＤＲを有する特徴的な軽鎖を総て含む。
【００５１】
軽鎖ＣＤＲの長さのように１．４群及び１．２．２０型の抗体間には特徴的な差異があり、最初の２のＣＤＲは１．２．２０型抗体で短いが、ＣＤＲ３は１．２．２０型で長い。しかしながら、共通のモチーフである、
ＧＸ１ＮＺ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｚ２であって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＩであり、Ｘ２はＧ、Ａ、又はＴであり、Ｘ３はＫ、Ｙ、又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＲであり、Ｚ１及びＺ２は、疎水性アミノ酸残基を含む脂肪族鎖であり、好ましくはＺ１はＬ又はＶであり、Ｚ２はＶ又はＩである、残基２７ないし４５のＣＤＲ１、
ＤＺ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｓであって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＱであり、Ｘ２はＲ又はＱであり、Ｘ３はＰ又はＧであり、Ｚ１は極性アミノ酸残基を含む塩基鎖であり、好ましくはＺ１はＲ又はＫである、残基５７ないし６２のＣＤＲ２、
Ｚ１ＷＸ１Ｘ２Ｘ３であって、Ｘ１は好ましくはＤ又はＨであり、Ｘ２はＳ又はＮであり、Ｘ３はＧ又はＲであり、Ｚ１は疎水性アミノ酸残基を含む脂肪族鎖であり、好ましくはＺ１はＶ又はＩである、９８ないし１０２のＣＤＲ３、
が双方の型の抗体で見られうる。
【００５２】
好適なＣＤＲ３配列は更にＺ１ＷＸ１ＳＧを含み、Ｘ１は好ましくはＤ又はＨであり、Ｚ１はＶ又はＩである。この配列は１．２．２０、１．４．１１、及び１．４．３０型用の好適な共通配列である。
【００５３】
［重鎖共通配列］
本発明は好適な実施形態においては、１．４群の抗体の重鎖に対する共通配列、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４はＡ又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＧであり、Ｘ５はＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであるＣＤＲ２、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２はＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＭ又はＦであり、Ｘ８はＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
に関する。
【００５４】
相同性がＣＤＲ配列内で高いことが理解されよう。１．４群の抗体は好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２、及び最も好ましくは総てのＣＤＲ１ないし３の配列と類似又は実質的に類似するＣＤＲを好ましくは有する総ての特徴的な重鎖を含む。
【００５５】
本発明は好適な実施形態においては、１．２．２０型の抗体の重鎖の共通配列である、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
に関する。
【００５６】
１．２．２０型の抗体は特徴的な重鎖を含み、好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２、及び最も好ましくは総てのＣＤＲ１ないし３の配列と類似又は実質的に類似するＣＤＲを好ましくは有する。
【００５７】
重鎖ＣＤＲの長さのように、１．４群及び１．２．２０型の抗体間には特徴的な差異があり、１．２．２０型抗体の第２のＣＤＲは他のものよりも短く、ＣＤＲ３は更に、１．２．２０型について、及び１．４．３０型についてもより短い。しかしながら、共通のモチーフである、
Ｘ１ＴＺ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｚ２Ｘ５であって、Ｘ１は好ましくはＧ、Ｉ、又はＦであり、Ｘ２はＮ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ３はＫ、Ｓ、又はＲであり、Ｘ４はＹ、Ａ、又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであり、好ましくはＺ１はＶ、又はＦであり、Ｚ２はＷ又はＭである、残基２７ないし３５のＣＤＲ１、
Ｘ１Ｚ１Ｚ２Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６ＳＺ７ＫＺ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ、Ａ、又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＴ、Ｓ、又はＧであり、Ｘ５はなし、Ｄ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであり、Ｚ１はＶ又はＩであり、Ｚ２はＹ又はＳであり、Ｚ３はＮ又はＹであり、Ｚ４はＬ又はＹであり、Ｚ５はＮ又はＡであり、Ｚ６はＰ又はＡであり、Ｚ７はＬ又はＶであり、Ｚ８はＳ又はＧであるＣＤＲ２、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＤ、Ｒ、又はＭであり、Ｘ２はＹ、Ｐ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＴ、Ｍ、又はＦであり、Ｘ８はＹ、Ｖ、又はＰ若しくはＩであるＣＤＲ３、
が双方の型の抗体で見られうる。
【００５８】
好適な重鎖ＣＤＲ３配列は第２の最終位置でＤ型の保存残基を含む。
【００５９】
保存型のＣＤＲタンパク質又はＤＮＡ配列のような核酸は、特異的な糖類抗原又は抗体がタンパク質配列を認識することによる、及び／又は、ＰＣＲ分析のような、対応する核酸発現の認識用のＲＮＡ／ＤＮＡ分析によるアッセイのように、アッセイ中の抗体又は対応する核酸発現の認識に対し有用であることは理解されよう。
【００６０】
［糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析］
データは、特に１．４群の３のタンパク質配列が各抗体の特異的な特徴とともに、抗体の相同群を形成する大きな配列相同性を共有することを表わす。類似性によって１．４群の抗体の保存構造の分析が可能になる。特定の実施形態においては、本発明は、好適な型の糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体としての１．４群の抗体と、他の可能性のある糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析のための抗体タンパク質又は１又はそれ以上の核酸配列の使用とに関する。
【００６１】
１．２．２０型の配列は異なる配列を有するが、１．４群と類似する特異的な配列の特徴を共有する。特定の実施形態においては、本発明は、好適な型の糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体としての１．２．２０型の抗体と、他の可能性のある糖類及びＮｅｕＧｃ認識型の抗体の比較分析のための抗体タンパク質又は核酸配列の使用とに関する。４の配列間の類似性によって、１．４群の抗体及び１．２．２０型と同様の抗体の保存構造の分析が可能になる。
【００６２】
［既知の抗体及び抗体配列と抗体群の比較］
本発明は更に、本発明による抗体の、構造的及び／又は機能的のいずれかで既知の抗体、好ましくは類似の構造及び／又は機能を有すると思われる抗体と比較する方法に関する。本発明は特にその抗体の、ニワトリで生成される既知のポリクローナル抗体のような既知のＮｅｕＧｃ認識型抗体、又は別個及び異なる特異性を有する、Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９８８によって述べられたヒトからクローンされた抗体といった既知のＮｅｕＧｃ認識型モノクローナル抗体、及び、キューバ共和国のハバナで生成されたＰ３型抗体といった、免疫化によってマウスで生成され、ＮｅｕＧｃ含有型糖脂質を認識すると知られるモノクローナル抗体（Ｍｏｒｅｎｏら、１９９８、Ｖａｓｑｕｅｚら、国際公開第９９２０６５６号）との比較に関する。
【００６３】
抗体の機能的結合は、本発明で用いられる多価複合体、及び／又はタンパク質、及び／又は脂質結合糖質、又は細胞物質上にあるＮｅｕＧｃ含有型構造での結合について好ましくは比較される。この抗体及び可能性のある比較抗体のタンパク質結合は、好適なタンパク質相互作用法によって行うことができ、ウェスタンブロット法といった固相アッセイ法によって行われることが好ましい。
【００６４】
本発明は更に、好ましくは類似の構造及び／又は機能を有すると思われる抗体からの他の抗体配列と、この抗体の配列、好ましくはタンパク質配列の比較に関する。類似した機能を有する好適な抗体は、酸性糖質認識型抗体、好ましくはＧｌｃＡ又はシアリン酸といったカルボン酸含有型糖質、より好ましくはシアリル化された糖質、及び好適な実施形態においてはＮｅｕＧｃ−糖質認識型抗体を含む。
【００６５】
この抗体配列を自己免疫性疾患及び／又は癌の患者で知られる抗体配列と比較することが、ＮｅｕＧｃ型構造の認識可能性を有する特定の型のヒト免疫応答がこれらの病気と関連するため、有用であることは更に理解されよう。本発明は、これらの病気と関連する抗体配列、好ましくは癌及び／又は自己免疫性疾患でのヒト抗体配列を比較し、好ましくは、本発明による好適な抗体／抗体群の範囲で、重鎖及び／又は軽鎖に対する相同性の割合（％）で抗体配列を選択し、好ましくはＮｅｕＧｃ含有型糖質への結合に対しこのような１又は複数の抗体を試験する方法に関する。このような実験が病気の原因を明らかにし、治療の可能性を計画するのに非常に有用であることは理解されよう。
【００６６】
好適な実施形態においては、比較用の抗体配列は、ＮｅｕＧｃを含む生物学的試薬又は物質を用いて移植／注入するといった、血液をＮｅｕＧｃ物質と接触させたヒトからクローンされ、好適な移植はＮｅｕＧｃを含む物質を用いた器官／組織の移植であり、好適な器官移植は更に、ＮｅｕＧｃでの混入の可能性を有する幹細胞移植を含む。
【００６７】
［有用なグリカン結合特異性を有する新規の抗体］
本発明は新規かつ有用な単糖及びオリゴ糖の結合特異性を有するモノクローナル抗体のライブラリを明らかにした。この抗体は結合特異性の特性を有し、複数の細胞型、特にヒト細胞の分析について有用である。
【００６８】
結合特異性はいくつかの有用なグリカン型を含み、その一部はサブタイプの細胞に好適である。本発明は好適な実施形態においては、特異的なサブタイプのヒト細胞の結合のために、これらの抗体からある抗体を選択することに関する。その抗体が細胞の識別に有用であることは更に理解されよう。
【００６９】
［疾患関連型の抗体］
本発明は更に、この抗体（又は複数の抗体）の重鎖部分において実質的な相同性があり、抗体が癌及び／又は自己免疫性疾患の状況において重要な抗原性構造を認識することを明らかにする。抗体の特異性は、特に３次元構造が知られない場合、配列から直接的に生成できない。
【００７０】
しかしながら、本発明による重鎖ＣＤＲ、特に本発明による、特に１．４．２４型に相同な抗体においてＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む抗体の間で、新規の糖質結合特異性があることを明らかにする。
【００７１】
これらの抗体の開発及び分析の主要な問題は、それらの糖質結合特異性の可能性及び／又は正確さが知られてこなかったことである。本発明は、シアリン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃ）及びグルクロン酸含有構造のような、酸性単糖残基含有構造を特に認識する抗体の糖質特異性を明らかにする方法を提供する。
【００７２】
［抗体の開発又は分析用のアッセイ］
本発明は疾患関連型又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法に関し、本方法は本発明による単糖及びオリゴ糖配列を含む糖類で、抗体の特異性を測定するステップを含む。
【００７３】
好ましくは、抗体の結合は少なくともオリゴ糖配列について、より好ましくはキーとなる少なくとも２のオリゴ糖配列について、更に及び最も好ましくは本発明によるキーとなる３のオリゴ糖配列について測定される。更に好適な実施形態においては、本発明による、好ましくは少なくとも１の、より好ましくは少なくとも２の、最も好ましくは少なくとも３のコントロールのオリゴ糖配列を含む、コントロールの糖類に結合する抗体が測定される。
【００７４】
好適な分析方法は、本発明による好適な１又はそれ以上の糖類配列と抗体を接触させるステップを含む。
【００７５】
更に好適なステップは糖類と抗体との間に形成される複合体を測定するステップを含む。複合体を観察する好適な方法は、ＦＲＥＴを含む、蛍光法といった分子の距離を測定する方法と、抗体のような非結合試薬を洗浄するといった、アッセイから非結合試薬を除去し、酵素、蛍光又は放射標識による方法といった検出方法を含む標準的な方法によって、抗体のような結合試薬を測定する方法とを含み、好適な酵素結合アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む。アッセイは固相アッセイにできることは理解されよう。
【００７６】
［単糖結合特異性］
分析は、フレキシブルなスペーサ構造であるＮｅｕ５Ｇｃα、ＧｌｃＡα、ＧｌｃＡβ、ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃβを含むポリアクリルアミド複合体として分析される場合、新規の抗体が単糖残基で高親和性を有することを明らかにした。オリゴ糖鎖の末端部分としてこれらの単糖残基を認識するために、特にＮｅｕ５Ｇｃに対し、同様のフレキシブルな構造の呈示が要求されることは理解されよう。特にα及びβ結合のＧｌｃ、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ−、Ｇａｌβ−、及びＦｕｃα−のいくつかの中性の非還元性末端単糖残基は結合実験で事実上陰性であった。図８。
【００７７】
最良の結合は酸性単糖残基のグルクロン酸及びＮｅｕ５Ｇｃのシアリン酸であった。更には、オリゴ糖結合特異性が、いくつかのＮｅｕ５Ａｃ含有型オリゴ糖配列への結合を明らかにした。
【００７８】
本発明は好適な実施形態においては、シアリン酸含有型グリカンの認識用の抗体、より好ましくはＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃ含有型グリカンに特異的な抗体の開発に関する。
【００７９】
［Ｎｅｕ５Ｇｃ含有型グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はＮｅｕ５ＡｃよりもＮｅｕ５Ｇｃのオリゴ糖配列により強く結合する（より特異的に認識する）新規の抗体に関する。好適な実施形態においては、結合／認識されたＮｅｕ５Ｇｃオリゴ糖配列は１型のＮ−アセチルラクトサミン配列Ｎｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである。好適な実施形態においては、Ｎｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃは好ましくはＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃより有効に認識される。
【００８０】
［Ｎｅｕ５Ａｃ含有型グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はＮｅｕ５ＧｃよりもＮｅｕ５Ａｃのオリゴ糖配列により強く結合する（より特異的に認識する）新規の抗体に関し、より好ましくは、抗体はＮｅｕ５Ａｃに結合するが、Ｎｅｕ５Ｇｃに非常に弱く結合するか、あるいは事実上全く結合しない。好適な実施形態においては、結合／認識されたＮｅｕ５Ａｃオリゴ糖配列は、シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、より好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαである。Ｎｅｕ５Ａｃ構造の選択的な認識は抗体に対する有用な特性であり、好適な実施形態においてはヒトと動物との間のグリカン構造の分化のために用いられることは理解されよう。
【００８１】
［新規の糖類結合特異性］
本発明は、少数の重要なキーとなるオリゴ糖配列である、
ａ）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃ、より好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであり、更により好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃはＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃより高親和性で認識又は結合される、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、
ｂ）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを含み、高親和性で認識される好適な標的はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、
ｃ）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃα、
の高特異性の認識を明らかにした。
【００８２】
本発明は更に、α３でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンとラクトースＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎとを含む抗体にわずかに結合されるか、あるいは全く結合されない有用なコントロールのオリゴ糖配列を明らかにした。ここで、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である。これらのグリカンは、抗体がグリカンの認識において特異的であることを示す。
【００８３】
これらの結合特異性及びその組合せは、ヒトモノクローナル抗体について、特に天然型ヒトモノクローナル抗体について新規である。ヒトモノクローナル抗体による複数であるが高選択性のグリカン認識の存在がいくらか特有であることは理解されよう。更には、グリコシレーションの種特異性のため、構造の抗原性は免疫化で通常用いられるマウス、ラット、又はウサギといった他の種での実験結果から知ることができないことは理解されよう。ポリクローナル抗血清の場合、実際の結合特異性はポリクローナル抗体及び抗血清での結果から得られなかった。
【００８４】
［より大きな構造に対する結合の分析］
本発明による抗体結合型の単糖又はオリゴ糖構造、又はそのエピトープはより大きなオリゴ糖配列の一部であってもよく、このオリゴ糖エピトープよりも高い又は低い親和性で認識されることは理解されよう。
【００８５】
本発明は、抗体の他の糖類への結合を、本発明による単糖又はオリゴ糖構造と比較するステップを含み、好ましくは本発明による少なくとも１の新規の結合配列を含む結合アッセイにおいて、特に天然の糖脂質又は糖タンパク質上にある大きなオリゴ糖配列を用いた、他のグリカンのスクリーニングに関する。
【００８６】
［変異誘発及び／又は配列の置換による更なる開発］
特異的に異なるα３及びα６結合されたシアリン酸構造及びα６でシアリル化されたＧａｌＮＡｃと、多様な構造におけるＮｅｕ５Ｇｃ及びＮｅｕ５Ａｃへの異なる結合とを有するラクトサミンでの１及び２型の双方の認識は、抗体がグリカンの複数の立体構造を認識し、少なくとも２の異なるシアリン酸結合部位及び立体構造を有することを示す。
【００８７】
本発明は、変異誘発法によって可変部位の抗体のペプチド配列を変化させることによる、及び／又は、別の抗体からの対応する配列によって１の抗体から１又はそれ以上の可変ＣＤＲ配列又はその一部を置換することによる、新規の抗体の開発のために抗体特異性を変更する方法に関する。好適な実施形態においては、変異誘発法は本発明による糖質結合アッセイと組み合わされ、本発明による特異的な酸性グリカン構造に対する抗体の修飾結合は、特異性の変化を明らかにするよう測定される。
【００８８】
［新規のタンパク質発現型又はタンパク質／及び脂質発現型の標的グリカン］
好適な実施形態においては、本発明はタンパク質型のグリカン標的配列を認識する抗体の開発及び分析に関する。本発明はシアリルＴｎ配列ＮｅｕＮＡｃα６ＧａｌＮＡｃαへの結合があり、ムチン型の糖タンパク質上にあることを明らかにした。本発明は構造を認識するヒトモノクローナル抗体、特に、共通配列を含むか、あるいはこの抗体と実質的に相同性を有する抗体に関する。
【００８９】
α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃは双方とも、タンパク質及び糖脂質によって提供されうることは更に理解されよう。本発明は、タンパク質及び脂質からの構造分析のための抗体の使用に関する。本発明は更に、構造を認識するヒトモノクローナル抗体、特に共通配列を含むか、あるいはこの抗体と実質的に相同性を有する抗体に関する。
【００９０】
本発明は特に、抗体がタンパク質結合されたグリカン上にＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃを認識する場合の、新規の抗体、好ましくはヒト抗体、及びそれらに関連するその更なる開発及びアッセイに関する。好適な実施形態においては、本発明はタンパク質結合されたＮｅｕ５Ｇｃの糖類配列に結合するヒト自然抗体に関する。
【００９１】
本発明は、糖類配列がタンパク質に結合する場合の、本発明による糖類配列、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ含有型のオリゴ糖配列への自然ヒト抗体の結合の分析に関する。
【００９２】
本発明は、糖類配列が脂質に結合する場合の、本発明による糖類配列、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ含有型のオリゴ糖配列への自然ヒト抗体の結合の分析に関する。本発明は特に、本発明による末端エピトープを含むラクト及びネオラクト系の糖脂質に対する結合の分析に関する。
【００９３】
［栄養又は治療上のタンパク質の状況における抗体結合の測定］
Ｎｅｕ５Ｇｃ結合型オリゴ糖は、治療又は栄養上の状況においてヒトと接触し、免疫反応を引き起こすようにできる糖タンパク質上に存在することは理解されよう。好適な実施形態においては、本発明はオリゴ糖配列が治療用タンパク質、好ましくは治療用組換えタンパク質に結合される場合の、本発明によるオリゴ糖配列に対するヒト抗体の分析に関する。
【００９４】
好適な実施形態においては、本発明によるアッセイにおいて測定すべき抗体が、本発明による抗体に対して相同性を有する。このアミノ酸配列に対する相同性は、本発明による糖類結合分析用に抗体を選択する方法ステップで用いられうることは理解されよう。好適な実施形態においては、抗体は、本発明による共通配列によって少なくとも１の可変部位を有するか、あるいは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の相同性の配列を有するか、あるいは２つのみ、又はより好ましくは１つのみの異なるアミノ酸残基を含み、好適な実施形態においては、それぞれのアミノ酸残基はアミノ酸であり、本発明による配列中のアミノ酸と類似する電荷又は疎水性を有している。
【００９５】
［結合特異性の分析］
本発明は更に、シアリン酸、好ましくはＮｅｕＧｃを含有する糖質への結合に対する、この抗体及び選択的な比較抗体の試験に関し、α３及び／又はα６及び／又はα８結合のような異なるシアリン酸結合構造を有し、好ましくは対応するＮｅｕＡｃ含有型の複合糖質で実験を制御する。試験すべき好適な糖質は、本発明による末端オリゴ糖配列、及び／又は抗体によって認識されない末端オリゴ糖配列のうちのいずれかを含む可能性のあるいずれかの糖類を含む。本発明は特に、総ての型の天然型酸性グリカン、より好ましくはシアリル化されたグリカン、及び／又はグルクロン酸含有型のグリカン及び物質、更により好ましくはこれらを含む天然物質の研究及び分析用の抗体に特に関する。
【００９６】
より好ましくは、分析すべき糖質は、例えば、Ｏ−グリカン及び／又はＮ−グリカンといった糖タンパク質上の、あるいはセラミドに結合されたグリカンを含むスフィンゴ糖脂質といった糖脂質上の、天然型複合糖質上のグリカンである。本発明による抗体によって認識される末端の二糖又はオリゴ糖エピトープは、グリカンの一部としての末端オリゴ糖エピトープとして好ましいか、あるいは、対応する配列がＴｎ抗原のように（天然型）グリカン全体に存在する場合、抗体は、実質的にグリカン全体（配列中の少なくとも部分的に総ての単糖残基）と、選択的に担体構造の更なる部分とを認識することが好ましい。オリゴ糖特異性によって天然型の哺乳類複合糖質の分析が可能であり、好適な実施形態においては、複合糖質、好ましくは糖タンパク質及び／又は糖脂質は、細胞及び／又は組織の物質上に、より好ましくは分離細胞及び／培養細胞といった細胞物質上に存在する。
【００９７】
［この抗体の変異体の好適な生成物］
類似するヒトモノクローナル抗体はヒト抗体ファージディスプレイライブラリから同様の方法によって生成されうることは理解されよう。類似する抗体は、抗体結合に必須ではない単一のアミノ酸残基を変えることによって生成できるか、あるいは類似する結合を可能にするよう変化させうることは理解されよう。アミノ酸残基の変更は好ましくは、単一の置換変異を生成するか、あるいは変異されたタンパク質配列のライブラリを生成し、ＮｅｕＧｃ含有型糖質構造への結合用の配列をスクリーニングする通常の組換え型ＤＮＡ技術によって行われる。本発明は、この抗体の置換変異及び変異体の設計及び／又は生成のための、親水性／疎水性の構造、大きさ、電荷、又は芳香族構造といった類似する側鎖特性を有する残基のような、既知の類似性の特定のアミノ酸残基の使用に関する。
【００９８】
本発明は、分子モデリング及び／又はＸ線結晶学及び／又はＮＭＲ法によって抗体の三次元構造を規定する方法に関し、好ましくはその構造は特異的な糖類又はＮｅｕＧｃ残基含有型の糖質構造と複合して生成される。本発明は更に、複合体を規定し、抗体配列の変異誘発のために実験を更に設計し、抗体のアミノ酸残基の変異誘発によって特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ含有型構造に対する抗体の特異性及び／又は親和性を開発するための情報を使用することに関する。
【００９９】
ヒト互換性のために、本発明による天然型配列及びヒト抗体ディスプレイライブラリからの類似相同体の推定は、例えばヒト生体内などでの様々なヒトでの用途に対して、あるいは代替的な非ヒト抗体とヒト血清抗体からの交差反応を防ぐ生体外診断に対して好適である。この抗体又は動物抗体フレームを有するキメラ形態中のそのリガンド結合型配列は、抗体の生物学的活性を研究するために動物実験で用いるのに好適であり、抗体配列が試験動物種の自然抗体から認識可能であるという事実のため、開発されることは更に理解されよう。
【０１００】
例えば、生物学的サンプル中の糖類及び／又はＮｅｕＧｃの定性的又は定量的な決定用にイムノアッセイで用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体はラベリングしてもよい。これらの目的のために、分析的又は診断的な抗体ラベリングのために従来用いられる様々な型のラベルは許容できる。
【０１０１】
例えば患者の悪性組織中の異種抗原性ＮｅｕＧｃを標的にするよう、免疫療法で用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体は治療用分子とともにラベリングしてもよい。これらの目的のために、治療用の抗体ラベリングに従来用いられる薬学的に許容可能なラベルが好適である。
【０１０２】
有害なＮｅｕＧｃ認識型の抗体の結合を遮断するために、抗体／抗体複合物は細胞毒性ではないことが好ましい。Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖ型フラグメントといった非免疫原性の抗体フラグメントは、自己免疫反応を受ける、又は天然型のＮｅｕＧｃ抗体によって移植される組織の、抗原性ＮｅｕＧｃ構造に対する結合を遮断するのに用いてもよい。
【０１０３】
例えば生体内イメージングで用いるために、本発明の抗体及び抗体誘導体はラベリングされてもよい。これらの目的のために、抗体ラベリングに従来用いられる薬学的に許容可能なイメージング用ラベルが好適である。
【０１０４】
抗体及び抗体フラグメントを複合する数多くの方法は、当該技術分野で既知である。一般的には抗体は、抗原結合部位から離れた部位で複合する。複合は好適な実施形態においては、グリカン、好ましくはＦｃドメインのＮ−グリカンのような、抗体のＮ結合型グリカンで、又は変異誘発によって生成される新規のグリコシレーション部位に対して生成されるグリカンで行われる。複合の他の好適な部位は可変領域から離れたポリペプチドのＮ又はＣ末端であり、好ましくは末端は、Ｎ末端のセリン残基のようなタンパク質構造を害しない化学的に修飾可能な構造を具え、ヒドラジン又はアミノオキシ試薬といったアルデヒド反応試薬によって特異的に酸化（グリカンと同様に）及び複合でき、治療上又は診断上の分子構造に結合されている。治療上又は診断上の分子構造は、治療のための、又は分析的な使用のための、例えばＥＬＩＳＡ試薬、光学分析のための光活性化可能な分子、アビジン／ストレプトアビジンラベリングのためのビオチン、又は生体内イメージングのための放射活性又はＮＭＲ／ＭＲＩ活性分子といった、細胞毒性分子又は放射活性分子、又はプロドラッグ／プロドラッグ放出分子であることが好ましい。
【０１０５】
別の態様においては、本発明は更に、本発明の抗体又は抗体誘導体をコード化するＤＮＡ分子と、このようなＤＮＡのフラグメントとを提供し、これらはＶＬ及び／又はＶＨ領域のＣＤＲをコード化する。このようなＤＮＡはベクタ、特に、本発明の抗体誘導体、あるいは少なくとも１の抗体鎖又は１の抗体鎖の一部の発現を関連づけることができる発現ベクタなどでクローンされうる。
【０１０６】
本発明の更なる態様においては、宿主細胞が提供され、細菌性細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び哺乳類細胞から選択され、本発明のＤＮＡ分子を含み、本発明の抗体又は抗体誘導体を発現できる宿主細胞を含む。従って、本発明の抗体誘導体は、１又はそれ以上の要求される抗体鎖を発現し、所望のタンパク質を直接的に回復させるか、又は必要に応じて別個の鎖を初期回復及び結合させる、本発明の宿主細胞を培養することによって調製してもよい。
【０１０７】
上に示したｓｃＦｖのフラグメントは、異種抗原性組換え型ＮｅｕＧｃを用いて、ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリのバイオパニングによって得られた。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリは５０の健常な供血者のリンパ球から単離されたｍＲＮＡから構成された。軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡの可変領域はＦｄ ｃＤＮＡ用のヒト特異性のプライマを用いて合成され、ヒトカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖はヒトκ及びλ鎖特異性のプライマを用いて合成された。軽鎖及び重鎖の可変領域は、Ｖκ ｃＤＮＡ及びＶλ ｃＤＮＡ用のヒトκ及びλ鎖特異性のプライマと、ＶＨ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＭ特異性のプライマとをそれぞれ用いてＰＣＲによって増幅させた。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリは、ＰＣＲプライマに導入される制限部位を用いて、可変領域のｃＤＮＡをｓｃＦｖファージディスプレイベクタにクローンすることによって構成された。
【０１０８】
ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリはパニング手順を用いたファージディスプレイによって選択された。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリは溶液中でビオチン化された異種抗原性組換え型ＮｅｕＧｃによってスクリーニングされ、結合剤はストレプトアビジン上に捕捉された。ファージの溶出は１００ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２．２）でなされ、その後すぐに、２ＭのＴｒｉｓ溶液で中和された。ファージ溶出は大腸菌細胞中で増幅された。４回のバイオパニング後、可溶性のｓｃＦｖのフラグメントが単離されたファージから生成された。選択されたｓｃＦｖのフラグメントの結合特異性はＥＬＩＳＡによって分析された。いくつかの糖類及び／又はＮｅｕＧｃ特異性のｓｃＦｖのフラグメントのクローンが得られた。
【０１０９】
本明細書中で述べたように、ファージディスプレイ技術は診断及び治療用途でヒトＩｇＭ組換え型の抗糖類及び／又は抗ＮｅｕＧｃ抗体を開発するための有効かつ実現可能なアプローチである。
【０１１０】
本発明の抗体フラグメントを得るためのある成功した選定戦略を述べてきたが、本発明の抗体フラグメントを与えることができる数多くの変形物は、当該技術分野の当業者に明らかであろう。ｓｃＦｖのフラグメント又はその誘導体のファージ又は微生物のディスプレイライブラリから直接的に、本発明のｓｃＦｖのフラグメントを選択することは可能である。ファージ又は微生物細胞は、表面タンパク質とともに融合タンパク質として本発明のｓｃＦｖのフラグメント又は他の抗体フラグメントを提供し、本発明の更なる態様を表わす。
【０１１１】
本発明の抗体及び抗体誘導体の微生物発現が、免疫診断アッセイ及び免疫療法で用いるのに好適な均一品質の高特異性の試薬の有効かつ経済的な生成のための手段を提供するが、代替的に、合成してこのような試薬又は少なくともその一部を生成することが可能である。従来の遺伝子工学技術を適用することによって、結合特性を実質的に変えることなく、例えば新しい配列が結合されるなど、本発明の初期に得られた抗体フラグメントを変えることができる。このような技術は、新規の糖類及びＮｅｕＧｃ結合型のハイブリッドタンパク質を生成するのに用いることができ、既に明細書中で規定したように糖類及びＮｅｕＧｃに対する親和性及び特異性の双方を保持する。
【０１１２】
［ＮｅｕＧｃ抗体を選択するための特異的な方法］
本発明は、抗体フラグメントのディスプレイライブラリが非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα複合体に対して結合せず、かつ非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα複合体に対し結合すると選択される場合の、ファージディスプレイ抗体ライブラリからの抗体フラグメントの選択に関する。好ましくは、選択のための複合体は固定化される。より好ましくは、前記ＮｅｕＡｃα非結合型の複合体は最初にファージライブラリから選択されて、次いでＮｅｕＧｃα結合型クローンがライブラリから選択される。抗体ライブラリは様々な方法で構成でき、好適な実施形態においては、ライブラリはｓｃＦｖライブラリであることが理解されよう。
【０１１３】
本発明はヒト抗体のライブラリから抗体フラグメントを選択する新規の有用な方法を明らかにし、好ましくは多数のヒトから得られるライブラリを形成し、より好ましくはそのライブラリは少なくとも約５０のヒトから得られる。実施例に示されたライブラリは、約５０の健常者の供血者の血液細胞から得られる。大多数のドナーのため、そのライブラリは単一末端のＮｅｕＧｃα残基に対する事実上総ての最大限のヒト抗体を含むと考えられる。抗体ライブラリは複数の選択から同一のクローンを与え、その方法が再現可能であることを示す。
【０１１４】
実施例における選択は、ＩｇＭ抗体のライブラリから行われた。本発明は好ましくは、抗ＮｅｕＧｃ抗体の生成／発見のためのＩｇＭ抗体の選択に関する。「成熟」抗体のため、一般的にはＩｇＭと他の抗体型の間には差異がある。ＩｇＭ抗体は更に天然で１０価であり、この選択方法は少価数の形態において抗体フラグメントを表示するファージを用いることによって、天然の少価数のＮｅｕＧｃの認識を模倣するように設計された。本発明による抗体が、多価結合剤を有する多価クラスタ化された糖類又はＮｅｕＧｃ構造の天然型ＩｇＭとしての認識と、更にはＦＡｂ型試薬による一価エピトープの認識とに有用であることを本発明は示す。他の抗体型は一般的に二価であり、少価数の抗原の認識にはほとんど有用ではない。
【０１１５】
抗体フラグメントは、ＮｅｕＡｃα及びＮｅｕＧｃαの多価複合体に対して選択される。正確な選択のために、双方の構造は好ましくは同一の担体構造に複合される。本発明は特に、クラスタ化された少価数のＮｅｕＧｃのエピトープを認識できる抗体に関する。ＮｅｕＧｃ認識型の抗体に関する過去の研究は、単分子の糖脂質構造に結合することについて記載され、単一のＮｅｕＧｃ残基又は、構造ＮｅｕＧｃα８ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒのように、相互に非常に近い構造で２のＮｅｕＧｃ残基を含むことは注目すべきである。スクリーニングが非還元性末端の末端構造に対して行われた場合、この抗体が糖脂質よりも他の糖複合体からの更なるグリカン構造の認識に有用であることは更に理解すべきである。
【０１１６】
好適な多価複合体は約２０未満の原子結合であるが、約６より大きい原子結合間の距離を有している。多価複合体は好ましくはフレキシブルなポリアミド構造、より好ましくはポリアクリルアミド構造を含む。フレキシブルは構造がメチレン構造を有するスペーサを含むことを示す。好ましくは、ＮｅｕＡｃα／ＮｅｕＧｃαは３の炭素のスペーサに結合され、メチレン基であることが好ましく、更にはポリアクリルアミドの主鎖に複合化される。多価のアクリルアミド複合体はＢｏｖｉｎ Ｎ、１９９８によって記載されるように化学的に合成でき、多価のアクリルアミド複合体は米国セントルイスのＳｉｇｍａ社又はロシアのＳｙｎｔｅｓｏｍｅ社のような試薬購入先から商業上入手可能である。
【０１１７】
本発明は更に、本発明によるヒト抗体ライブラリからの選択によって発見される抗体に関する。
【０１１８】
［本発明による糖類及び／又はＮｅｕＧｃ抗体の新規の特異性の特徴］
本発明による抗体は、多価の単糖複合体で分析した場合、異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃαに対する結合特異性を明らかにしたが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃαを結合しなかった。特定の抗体がオリゴシアリン酸又はポリシアリン酸ＮｅｕＧｃα８ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒなどの非末端位置にシアリン酸を認識するが、末端非還元性の末端残基としてではなく、例えば、Ｖａｒｋｉとその仲間によるニワトリのポリクローナル抗体の生成のために用いられる抗原が、グリセロール構造に関して切断され、ひいては末端修飾及び／又は伸長されたＮｅｕＧｃ構造の認識を可能にすることは注目すべきである。本発明は非還元性末端のＮｅｕＧｃαのために選択される優れた結合活性の抗体を明らかにした。有効な認識は、更なる修飾を要求しないが、他のＮｅｕＧｃ残基による担体構造又は伸長によって影響を受け、ひいてはエピトープは、担体に複合する末端単糖残基を含む単一末端のＮｅｕＧｃαであるとされる。
【０１１９】
抗体は結合特異性を有し、特定の酸性糖類及び／又は非還元性末端ＮｅｕＧｃエピトープを含むヒト細胞の認識を可能にする。既に公表されたヒト抗体と対照的に、これは糖脂質上に末端非還元性の末端ＮｅｕＧｃを認識するが、ヒト細胞では認識しないもの、及び糖脂質上で末端非還元性の末端ＮｅｕＧｃを認識せず、明らかにタンパク質上で認識せず、ウシ胎仔血清中で成長したヒト細胞を結合したものである。
【０１２０】
更に、本発明は最初に、ファージディスプレイ、又は、ＮｅｕＧｃ末端の単糖残基に結合するが、ＮｅｕＡｃ末端の単糖残基に結合しない抗体中などで、ヒドロキシル基によって置換される１のプロトンのわずかで軽微な変更を用いて、単一末端の単糖を有効に認識可能な他のヒト抗体について述べる。高い単糖レベルの選択性は、完全なＮｅｕＧｃ残基を結合するように選択されるヒト又はその他のＮｅｕＧｃ抗体について記載されていなかった。固有の単糖選択性は更に、シアリン酸として複合される２の他のヒトの末端単糖残基を用いて、及び単一のエピマ配置の差異を用いて研究され、類似の選択的な抗体は産生しなかった。
【０１２１】
ファージディスプレイシステムが天然型ヒト抗体を生成することは理解されよう。これらは、動物抗体又はヒト化した動物抗体よりも、ヒトでの用途でより容易に認容可能にすべきであり、ヒトにおいて非天然な構造を含む。
【０１２２】
更に、本発明の抗体は多価高密度／クラスタ化されたＮｅｕＧｃの複合体（上述の）を有効に認識し、好適な実施形態においては、ヒトＩｇＭの認識を模倣する３ないし１０価の形態といったクラスタ化された少価数形態で用いられるか、あるいは例えばドイツのＯｎｃｏＭＡｂ（登録商標）社のＶｏｌｍｅｒｓらの、当該技術分野に既知の方法によってヒトＩｇＭ抗体として生成される。驚くべきことに、通常はＦＡｂ ＩｇＭ抗体の親和性は非常に低いが、抗体は更に一価のＦａｂ型又は単鎖抗体として有効である。バックグラウンドにおける抗体のほとんどが、異なる特異性と通常は二価の構造のみを含む異なる型であることは注目すべきである。
【０１２３】
［核酸の分析］
本発明は更に、遺伝コードの総ての変異体を含む抗体配列に対応する核酸配列に関する。これらは当該技術分野の当業者に公知である。本発明は特に、抗体をコードするヒト天然型核酸配列に関する。本発明は更に、ヒト天然型核酸配列に対する相補的核酸配列に関する。本発明は更に、ａ）核酸配列の発現分析のための、ｂ）核酸配列の発現を生じさせるための、核酸配列で結合及びハイブリダイズする類似する能力を有する核酸配列及び相補的核酸配列、ならびにその相同体の使用に関する。好適な核酸相同体の好適な群はペプチド核酸を含む。好適な核酸配列分析は核酸配列のクローニング及びシーケンシングと、ハイブリダイゼーション法による、及びＲＴ−ＰＣＲ法といったＰＣＲ法による分析を含む。
【０１２４】
本発明は特に、移植される物質が特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃを含むと考えるべき理由がある場合の、特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃに対しヒト免疫反応を分析する状況における、好ましくは移植に対する免疫反応の状況における、より好ましくは細胞移植又は異種移植の状況における核酸分析に関する。本発明は更に、食物中のＮｅｕＧｃの量の栄養変化の状況における、ヒトでの本発明による核酸分析に関する。
【０１２５】
［細胞及び組織の分析］
特異的な糖類及び／又はヒトＮｅｕＧｃ結合型組換え型抗体、ならびにそのイムノアッセイでの有用性の開発及び性質決定は、以下の実施例に更に詳細に記載される。本発明は特に、細胞及び組織の分析に対する抗体の使用に関する。分析されるべき好適な細胞及び組織は、動物起源の細胞物質又はＮｅｕＧｃを含む動物物質と接触状態にある物質を含む。本発明はこの抗体がブタ細胞又はタンパク質といった、動物細胞又は動物細胞／組織由来の物質での本発明の酸性グリカン及び／又はＮｅｕＧｃ構造の分析に有用かつ好適であることを明らかにした。
【０１２６】
［好適な抗体の特異性、配列、及び方法］
本発明は特に、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列は好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであり、Ｎｅｕ５Ｇｃでの１型のＮ−アセチルラクトサミンの認識が、特に異種抗原性（非ヒト）シアリン酸Ｎｅｕ５Ｇｃを含みうる物質の認識の状況においては、抗体に対する非常に特有かつ有用な特性であると理解される、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
２）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであって、本発明が特に、シアリン酸がＮｅｕ５Ｇｃである場合に、シアリルラクトサミンはＮ−グリカン構造に結合せず、強く又は実質的に排他的な認識となるエピトープに対する結合を明らかにし、抗体オリゴ糖結合に対しかなり特有の特徴があるが、その特異性が他の特異性よりももっとも好適な、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
３）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
及び／又は、末端非還元性の末端単糖残基である、
４）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基と、
に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、好ましくは、
５）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないヒトモノクローナル抗体に関する。
【０１２７】
オリゴ糖配列のいずれもヒト幹細胞又はその特異的なサブタイプの細胞培養条件依存型マーカとして特徴づけられたことは理解されよう。
【０１２８】
本発明は特に、好適なオリゴ糖結合特異性を組合わせる特異性を有する特有の抗体に関する。好適な実施形態においては、その特異性は少なくとも末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列は好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎであって、ＳＡはシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、ｎは０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
を含む。第２の群は類似するａ６結合されるシアリン酸構造を表わし、それはα３のシアリン酸結合とともに特有の特異性である。
【０１２９】
オリゴ糖配列ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに対する好適な結合は、
ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
を含む。
【０１３０】
その特異性は更に、ポリマ複合型シアリン酸残基と、実施例に示されるような、特にａ３でシアリル化されたラクトースと２型のＮ−アセチルラクトサミンとを特に含む、非結合又は非常に低い結合活性のオリゴ糖配列とに対する特異性によって更に特徴づけられる。末端非還元性の末端単糖残基は更に、
１）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基、
を含むが、前記抗体は還元性末端から高分子担体に連結される非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、抗体は好ましくは通常のシアリルラクトサミンのオリゴ糖配列である、
２）ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しない。
【０１３１】
好適な実施形態においては、いくつかの主要な特異性の特徴が含まれ、好適な抗体はα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列であるＮｅｕ５Ｇｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合し、抗体は末端非還元性の末端エピトープであるシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合し、抗体はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合し、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃよりＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃにより有効に結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合しない。
【０１３２】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに結合し、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃ、より有効にはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであることが好ましく、及び／又は、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合する。
【０１３３】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は式ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに従うα６でシアリル化された末端非還元性の末端エピトープに結合し、ＳＡはシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである。
【０１３４】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合する。
【０１３５】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合する。
【０１３６】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合する。その親和性は好適な実施形態においては、本発明に記載のようなＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
【０１３７】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体は末端異種抗原性の非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合しない。
【０１３８】
本発明は更にモノクローナル抗体に関し、抗体はＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列に結合せず、ＳＡはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎは０又は１である。
【０１３９】
［好適なポリペプチド配列］
本発明は抗体に関し、本発明による好適なポリペプチド配列を有する。抗体は更に好ましくは、本発明による１又はそれ以上の結合特異性の特徴を有する。本発明はオリゴ糖配列の認識用の新規の有用な抗体を明らかにした。抗体はヒト抗体であり、ヒト免疫系によって有効に認識されないため、治療及び診断に対して特別な有用性を有する。
【０１４０】
［抗体ＣＤＲ配列］
ＣＤＲ配列は抗体ファミリに対する特性であり、類似の抗体は、抗体の全ＣＤＲ配列のフラグメントに基づいて認識できることは理解されよう。本発明は更に、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、類似、又は最も好ましくは同一の抗体配列に関する。類似の配列は特に、本発明による抗体と同一又は類似の特異性を有する新しい抗体を検索するか、あるいは例えば、変異誘発法によって本発明による抗体を最適化し、及び本発明による好適なオリゴ糖配列に対して得られた抗体をスクリーニングする方法に好適である。
【０１４１】
本発明は更に、好適な共通配列の３ないし１０価のフラグメントを含む短い特徴的なエピトープに関する。
【０１４２】
［好適な短配列］
抗体ポリペプチドの好適な重鎖配列は、ＣＤＲ１配列の共通配列である、
ＧＦＴＦＲ、ＧＦＴＦＳ、ＧＩＴＦＲ、若しくはＧＩＴＦＳ、又はＦＴＦＲ、ＦＴＦＳ、ＩＴＦＲ、若しくはＩＴＦＳであるＣＤＲ１、
又は、
Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであるＸ１ＴＦＸ２Ｘ３Ｙ、
を有し、及び／又は、
好適な短い共通配列がＹＡＤＳＶＫ若しくはＹＹＡＤ、ＹＹＡＤＳ、ＹＹＡＤＳＶ、ＹＡＤＳ又はＹＡＤＳＶであるＣＤＲ２配列、
を有する１．４群の抗体の重鎖配列を含む。２のチロシンを有する配列は特に、特徴的なペプチドとして好適である。
【０１４３】
更に好適なＣＤＲ１フラグメントは、ＴＦＲＫ、ＴＦＲＫＹ、ＴＦＲＫＹＡ、ＴＦＲＫＹＡＭ、ＴＦＲＫＹＡＭＮ、ＴＦＳＳ、ＴＦＳＳＹ、ＴＦＳＳＹＡ、ＴＦＳＳＹＡＭ、ＴＦＳＳＹＡＭＳ、ＴＦＳＲ、ＴＦＳＲＹ、ＴＦＳＲＹＳ、ＴＦＳＲＹＳＭ、ＴＦＳＲＹＳＭＮ、ＦＲＫＹ、ＦＲＫＹＡ、ＦＲＫＹＡＭ、ＦＲＫＹＡＭＮ、ＦＳＳＹ、ＦＳＳＹＡ、ＦＳＳＹＡＭ、ＦＳＳＹＡＭＳ、ＦＳＲＹ、ＦＳＲＹＳ、ＦＳＲＹＳＭ、ＦＳＲＹＳＭＮ、ＲＫＹＡ、ＲＫＹＡＭ、ＲＫＹＡＭＮ、ＳＳＹＡ、ＳＳＹＡＭ、ＳＳＹＡＭＳ、ＳＲＹＳ、ＳＲＹＳＭ、及びＳＲＹＳＭＮを含む。短いフラグメント又はエピトープは特に、新しい抗体を検索又は最適化する方法に好ましい。これらの方法については、トリペプチドが最も好適であり、テトラ、ペンタ及びヘキサペプチド、ならびにそれより大きなものという順番で好適さが低減する。好適なトリペプチドはＴＦＳ及びＴＦＲ、ならびにＦＲＫ、ＦＳＳ、及びＦＳＲ、ならびにＲＫＹ、ＳＳＹ、及びＳＲＹを含む。
【０１４４】
本発明は更に抗体に関し、本発明による結合特異性の特徴を有し、共通配列である、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１は好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２はＲ又はＳであり、Ｘ３はＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４はＡ又はＳであり、Ｘ５はＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２はＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＳ又はＧであり、Ｘ５はＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６はＴ又はＩであるＣＤＲ２、及び選択的に、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１は好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２はＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３はＫ又はなしであり、Ｘ４はＧ又はなしであり、Ｘ５はＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６はＧ又はＡであり、Ｘ７はＭ又はＦであり、Ｘ８はＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは１．２．２０型の抗体の重鎖ＣＤＲである、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
を含む。
【０１４５】
本発明は更に抗体に関し、抗体は共通配列である、
ＴＬＲＳＧ又はＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１は好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２はＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１は好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、及び選択的に、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１は好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２はＧ又はＲであり、Ｘ３はＷ又はＶであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬ、ＧＧＤＮ、ＧＤＮＬ、又はＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
の配列を有する１．２．２０型の抗体を含む。
【０１４６】
好適な短い特徴的なエピトープは好適な共通配列、好ましくは、ＴＬＲＳ、ＴＬＲＳＧ、ＴＬＲＳＧＩ、ＴＬＲＳＧＩＮ、ＴＬＲＳＧＩＮＶ、ＴＬＲＳＧＩＮＶＧ、ＬＲＳ、ＬＲＳＧ、ＬＲＳＧＩ、ＬＲＳＧＩＮ、ＬＲＳＧＩＮＶ、ＬＲＳＧＩＮＶＧ、ＲＳＧ、ＲＳＧＩ、ＲＳＧＩＮ、ＲＳＧＩＮＶ、ＲＳＧＩＮＶＧ、ＳＧＩ、ＳＧＩＮ、ＳＧＩＮＶ、ＳＧＩＮＶＧ、ＧＩＮ、ＧＩＮＶ、ＧＩＮＶＧ、ＩＮＶ、ＩＮＶＧ、及びＮＶＧを含む軽鎖ＣＤＲ１の３ないし１０価のペプチドフラグメントを含む。
【０１４７】
好適な抗体は１．４型の軽鎖ＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、好ましくはＣＤＲ１及びＣＤＲ２という少なくとも２つであることが好ましく、総ての配列ＣＤＲ１ないし３を含むことが最も好ましい。
【０１４８】
新規の抗体は、軽鎖及び重鎖の配列、あるいは本発明による抗体の相同配列を組合わせることによって生成でき、好適な実施形態においては、抗体は１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列と、１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される重鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列とを含むことは更に理解されよう。１．４群の抗体のより好適な配列は、例えば１．４．１９−３型（Ｆ３）抗体として組合わされる。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のうちのいずれかが異なる元の配列から得られうることは理解されよう。
【０１４９】
好適な抗体は１．４．２４型抗体の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列を、好適な実施形態においては１．４群の軽鎖配列を、好適な実施形態においては１．４．２４型軽鎖配列を含む。１．４．２４及び１．４．１９（−３）型、より好ましくは１．４．２４型の抗体はオリゴ糖配列に対する高親和性について好適である。このことは実施例でＥＬＩＳＡアッセイによって示され、本発明は特に抗体特異性に関し、特異性は多価のオリゴ糖複合体、好ましくはポリアクリルアミド複合体を用いてＥＬＩＳＡアッセイで比較される。
【０１５０】
［分析方法］
本発明は疾患関連型又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法に関し、本方法は、本発明によるシアリル化されたオリゴ糖及び単糖の配列に対する抗体の特異性を測定するステップと、好ましくは実施例に示したオリゴ糖配列を用いるステップと、好適な結合特異性で含まれる３のオリゴ糖配列、好ましくは好適なａ３及びａ６結合のシアリルオリゴ糖配列に対する特異性を好ましくは測定するステップを含む。好ましくは、抗体が本発明による配列若しくは配列フラグメント、又は相同配列、又は少なくとも１の類似又は相同のＣＤＲ１ないし３配列を有する場合に、特異性が測定される。
【０１５１】
本発明は更に、糖質エピトープ結合抗体を検出する方法を含む、抗体を検索し、あるいは特徴づけし、あるいは最適化する方法に関し、本方法は、
ａ）本発明に記載のように実質的に類似又は同一のＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列、あるいは配列フラグメント、あるいは相同体を有する抗体配列を、利用可能な配列データから検索するステップと、
ｂ）ステップａ）で検索された抗体を、本発明による好適な糖類結合特異性で記載のような糖類配列を含むシアリル糖類のライブラリと接触させるステップと、
ｃ）前記抗体が前記糖類配列のいずれかと結合するか、あるいは、好適な実施形態においては、本発明による抗体と同一の結合特異性を有するかどうかを検出するステップと、
を含む。本発明は特に、好ましくは本発明によるＥＬＩＳＡアッセイで、同一のオリゴ糖配列に結合するステップを含む、実質的に同一又は質的に同様の特異性を有する抗体の選択に関する。
【０１５２】
配列データは配列データベースから、あるいは当該技術分野で既知の抗体のシーケンシングにより入手可能である。
【０１５３】
［培養細胞又は外因性物質と接触状態にある細胞の分析］
［好適な細胞型及び分析方法］
本発明は特に、ヒト細胞の状態を分析し、外因性物質及び／細胞培養条件の、細胞に対する効果の分析のために、本発明による結合試薬、好ましくはモノクローナル抗体に細胞を接触させるステップを含むヒト幹細胞集団の状態を分析する方法に関する。
【０１５４】
この分析方法は、特に無傷細胞集団上のグリカン構造の細胞表面の発現に関する。細胞表面構造を分析することは有用であり、生体内での免疫応答及び／又は細胞、好ましくは幹細胞の細胞生物学に最も関連性があることは理解されよう。
【０１５５】
抗体によるヒト細胞、好ましくはヒト幹細胞のラベリングは、非ヒト外因性物質の存在下で細胞培養条件と関連し、及び／又はラベリングの欠如は、ヒト等価物質の存在下で細胞培養条件と関連する。外因性又は異種抗原性物質とも称される非ヒト物質は、細胞培養中に用いることができ、これらによる細胞の変化又は混入は、例えば細胞の免疫学的な適合性及び／又は細胞生物学的な標的特性の変化により、ヒト生体内での用途に対する細胞の適合性に影響を与えることは理解されよう。
【０１５６】
非ヒト外因性物質は好ましくは、前記非ヒト外因性物質中に非ヒト又は動物型のグリカン構造を含み、好適な非ヒト外因性物質は、動物血清タンパク質又は動物細胞タンパク質といった細胞培養で用いられる非ヒト動物タンパク質／ペプチド、好ましくはＦＣＳ（ウシ胎仔血清）又は動物細胞製剤（例えば、ブタ細胞製剤）といった、動物血清又はそのフラクトンのような動物血清タンパク質、又は非ヒトグリカン構造を生成する細胞培養から得られる組換え生成されたタンパク質である。ヒト等価物質はラベリングの欠如と関連し、好適な実施形態においては、ヒト血清タンパク質及び／又はヒトのグリコシレーションを含むように生成される組換型ヒトタンパク質といった、ヒト血清又は細胞／血液細胞由来のタンパク質のような、前記ヒト等価物質中のヒト型グリカン構造の存在（及び、好ましくは動物型グリカンの不存在）を意味する。
【０１５７】
本発明は分析方法に関し、無傷細胞の主要な下位個体群がラベリングされ、より好ましくは少なくとも１５％、更により好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも３５％、更により好ましくは少なくとも４５％、更により好ましくは少なくとも５５％、更により好ましくは少なくとも６５％、及び最も好ましくは少なくとも７５％又は８０ｍ％の細胞がラベリングされる。
【０１５８】
本発明は、予想外に大部分の、本発明によるヒト細胞、好ましくはヒト幹細胞、最も好ましくはヒト間葉系幹細胞が新規の試薬によってラベリングされることを明らかにした。好適な幹細胞はヒト血液由来の間葉系幹細胞、より好ましくは臍帯血又は骨髄由来の間葉系幹細胞である。
【０１５９】
本発明は特に、本発明による分析方法に関し、本発明による新規の抗体が用いられる。
【０１６０】
分析すべき最も好適な細胞は、
ｉ） 培養細胞と、
及び／又は、
ｉｉ） 血清のような外因性糖質物質、及び／又は、外因性の糖タンパク質及び／又は糖脂質と接触状態にあった細胞と、
及び／又は、
ｉｉｉ）本発明による抗体によって認識される特異的なオリゴ糖のうちの１又はそれ以上の発現を誘発する条件において成長させた細胞と、
を含む。
【０１６１】
発明者は既に、動物由来の低純度アルブミン製剤といった外因性糖質物質、又は磁力ソーティングシステムにおけるＦｃ遮断薬といった細胞選別試薬の極めて短い曝露に基づいて、細胞のグリコシレーションの変化を明らかにすることに関与してきた。細胞培養条件は細胞表面上の特定のオリゴ糖配列の生合成用の前駆体物質（例えば、Ｎｅｕ５Ｇｃといったシアリン酸、又は糖脂質）を提供することによって、及び／又は、細胞中のグリカン生合成の制御に影響を与えることによって、新規のグリカンの発現を誘発できることは更に知られる。
［無傷細胞］
【０１６２】
本発明は、抗体がＦＡＣＳ分析といったフローサイトメトリ及び／又は免疫組織化学によって観察可能な無傷細胞上で糖類配列を認識できることを明らかにした。本発明は特に、より特異的には抗体接触可能物質として、１又はそれ以上の糖類配列、より好ましくは無傷細胞上のオリゴ糖配列の分析に関連する。
【０１６３】
［細胞培養］
図９はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）における１．４．２４型抗体による、ヒト臍帯血間葉系幹細胞、ヒトＣＢ−ＭＳＣ細胞のラベリングを示す。細胞は外因性非ヒト物質の存在下で培養されており、非ヒト物質が「異物のない物質（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）」又はより特異的にはヒト由来の物質によって置き換えられる場合にはラベリングは観察されなかった。データは抗体によってラベリングされた主要な無傷細胞集団を示し、ラベリングは細胞培養条件に依存する。
【０１６４】
ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）処理は、細胞に対するシアリン酸依存型結合を確認するのに用いられた。実施例は更に、外因性（非ヒト）物質と接触状態にある場合のヒト幹細胞の有効なラベリングと、動物細胞の有効なラベリングとを示す。
【０１６５】
好適な実施形態においては、本発明は外因性物質、より好ましくはこの抗体によって認識されるオリゴ糖配列のうちの１又はそれ以上の存在を含むか、あるいは誘発する物質による混入についての培養細胞の分析に関する。
【０１６６】
好適な実施形態においては、抗体は、好ましくは物質が本発明によるオリゴ糖配列のうちの１又はそれ以上を含む場合の、ブタ又はウシ由来の物質といった非ヒト動物物質の存在下で培養される細胞の分析に用いられる。
【０１６７】
分析すべき最も好適な細胞は培養細胞を含み、好適な細胞型は、特にＮｅｕＧｃ含有型の生物学的物質と接触状態にあった場合に、ＮｅｕＧｃ（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を取り込むと知られる細胞を含む。総ての細胞がＮｅｕＧｃによって有効に混入されるわけではないことは更に知られる。発明者は同時係属中の出願において、特異的にシアリル化されたグリカン構造は、造血、間葉又は胚性幹細胞に取り込まれることを明らかにした。本発明は好適な実施形態においては特に、この抗体によって認識される特異的なオリゴ糖配列の状況におけるＮｅｕＧｃを含む細胞の評価に関する。
【０１６８】
分析すべき好適な細胞型は、特にＮｅｕＧｃ含有型及び好適なシアリルオリゴ糖配列含有型、又は特異的なオリゴ糖配列の存在を誘発する物質と接触状態にあった場合に、ヒト細胞、より好ましくはヒト幹細胞、更により好ましくはヒト造血細胞、骨髄由来細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、及び胚性幹細胞、又は他の幹細胞等、ならびにこれらの細胞型のための同様かつ可能な支持細胞を含む。
【０１６９】
この抗体は様々な混入又は好適な細胞型上の混入誘発型オリゴ糖配列を認識するのに用いられうることは理解されよう。
【０１７０】
発明者は特に、多能性細胞からの有効なＮｅｕＧｃの混入及び／又はＮｅｕ５Ｇｃ／シアリン酸含有型のオリゴ糖の混入の新しい可能性を発見し、好ましくはこれらは多能性細胞であり、胚性起源ではなく、より好ましくは細胞型は、造血細胞、骨髄由来細胞、臍帯血細胞、及び間葉系幹細胞を含み、それは優良な治療可能性の総てであり、それは胚性幹細胞を有するような奇形発癌型のリスクをほとんど有しない。総ての細胞がＮｅｕＧｃ又はシアリン酸のオリゴ糖含有型の複合糖質によって有効に混入されるわけではないことは更に周知である。
【０１７１】
［非特許文献］
・Ｂｏｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５，４３１−４４６
・Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｙａｍｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｏｅｔｔｇｅｎ Ｈ．Ｆ．，Ｏｌｄ Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ Ｋ．Ｏ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１８５０７−１２．
・Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ，Ａ．，Ｔｅｒｏ Ｓａｔｏｍａａ，Ｔ．，Ｔｉｉｔｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｌａｉｔｉｎｅｎ，Ａ．，Ｍａｎｎｅｌｉｎ，Ｓ．，Ｍｉｋｋｏｌａ，Ｍ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｍｉｌｌｅｒ−Ｐｏｄｒａｚａ，Ｈ．，Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，Ｏｌｏｎｅｎ，Ａ．，Ｌｅｈｅｎｋａｒｉ，Ｐ．，Ｔｕｕｒｉ，Ｔ．，Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ，Ｔ．，Ｎａｔｕｎｅｎ，Ｊ．，Ｓａａｒｉｎｅｎ，Ｊ．＆Ｌａｉｎｅ，Ｊ．（２００６）投稿中
・Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．
・Ｍｏｒｅｎｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）８（７）６９５−７０５
【実施例】
【０１７２】
［ファージディスプレイ選択による組換え型のＮｅｕＧｃ特異性のｓｃＦｖのフラグメント］
本実施例においては、ヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリはＮｅｕＧｃ−単糖に対して親和性及び特異性を有するｓｃＦｖのフラグメントを単離するように異種抗原性のＮｅｕＧｃによって構成及び選択された。ヒトＩｇＭのｓｃＦｖファージライブラリの構成は、ＩｇＭのＦａｂ−κ及びＦａｂ−λライブラリを最初に構成することによって間接的に調製され、次いで特定のライブラリＤＮＡが重鎖及び軽鎖の可変ドメインのＰＣＲ増幅に用いられた。
【０１７３】
［未処理のヒトＩｇＭのｓｃＦｖライブラリの構成］
５０の健常供血者からのヘパリン化された血液サンプル（１０ｍｌ）が貯蔵され、リンパ球はＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）単離プロトコルを用いて製造者の指示に従い単離された。ＲＮＡ全体はＰｒｏｍｅｇａ社のＲＮＡｇｅｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて製造者のプロトコルに従い、ヒトリンパ球貯蔵源から単離された。第一鎖のｃＤＮＡ合成はＰｒｏｍｅｇａ社のＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔを用いて行われた。ヒトＩｇＭのＶＨ及びＶＬ領域をコード化するｃＤＮＡは表３のＰＣＲプライマを用いて、ＶｅｎｔＰｏｌ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）で増幅された。抗体フラグメントの最終的なＰＣＲ生成物は貯蔵され、好適な制限酵素で消化された。消化されたＤＮＡフラグメントはＶＨ領域ならびにＶκ及びＶλ領域をコード化し、ファージミドベクタに連結され、大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質変換され、約１０８の別個のクローンのｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリを得た。
【０１７４】
ビオチン化されたパニング型（Ａｇ＋）及び欠乏型（Ａｇ−）の双方の抗原は、ストレプトアビジン複合型磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）上へ製造者のプロトコルに従い結合された。Ａｇ＋は多価のＮｅｕ５Ｇｃα−ポリアクリルアミド−ビオチンであり、Ａｇ−は多価のＮｅｕ５Ａｃα−ポリアクリルアミド−ビオチンであり、双方はロシアのＳｙｎｔｅｓｏｍｅ社／Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ社から入手された。複合体はビオチン分岐鎖を含む分岐型のポリアクリルアミド複合体に連結される３炭素数のアルキルスペーサを有する。
【０１７５】
［ヒトｓｃＦｖライブラリの選択］
ヒトｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリはファージディスプレイ技術によって選択された（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｂａｒｂａｓら、１９９１）。ＮｅｕＧｃ特異性のフラグメントの単離のために、未処理のヒトＩｇＭのｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリは、多価のフォーマットでバクテリオファージの表面に呈示され、ライブラリは親和性のパニング手順を用いて貯蔵及びパニングされた。ビオチン化されたポリアクリルアミド複合型シアリン酸誘導体は、ストレプトアビジン複合型磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）に製造者のプロトコルに従って結合された。ＮｅｕＡｃ複合体（Ａｇ−）は欠乏型のために用いられ、ＮｅｕＧｃ複合体（Ａｇ＋）はライブラリのパニング用に用いられた。
【０１７６】
最初に、ファージプールは、＋４℃で１６時間のスクリーニングステップで、バックグラウンドのコントロールとしても用いられる欠乏型のＡｇ（Ａｇ−）と結合する磁気ビーズと反応するのを可能にした。その後、ファージプールは取り除かれ、パニング型抗体（Ａｇ＋）又は欠乏型抗体（Ａｇ−、バックグラウンド）のいずれかを含むビーズ上へ移植された。室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーション後、ビーズは０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、結合ファージは酸性バッファ（１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出され、直ぐに２ＭのＴｒｉｓ溶液で中和された。次のパニングラウンドのために、溶出したファージプールは大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を感染させることによって増幅された。抗体フラグメントのファージ上への多価の呈示のために、ハイパーファージ（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ：Ｐｒｏｇｅｎ社）が総てのパニングラウンドで用いられた。４回のパニングが行われた。
【０１７７】
第２、第３及び第４のパニングラウンドでの可溶な一価のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩの融合物は大腸菌のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中に発現した。１４８の別個のクローンは予備的な性質決定のため１ｍｌ規模で成長させた。上清はＡｇ＋でコーティングされるウェルをグリカン特異性の結合剤を捕捉するように、及びＡｇ−でコーティングされるウェルを非特異性の結合剤を認識するように用いて、ＥＬＩＳＡ上で分析された。１２の最も有望なクローンが配列され、結果として６の異なるＤＮＡ配列が発見された。そのうちの５つが細胞結合アッセイでの更なる性質決定のために選択された。
【０１７８】
［特異的な糖類及び／又はＮｅｕＧｃ結合型抗体の性質決定］
５のモノクローナルの多価ファージの細胞結合は、ＮｅｕＧｃ陽性のブタ腎尿細管細胞(ＬＬＣ−ＰＬ１)の蛍光免疫染色によって研究された。細胞は２ないし４日間、９５％の空気及び５％のＣＯ２の湿気のある環境下で、３７℃で５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、１００ユニット／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを用いて補充されるＭ１９９細胞培養培地中で、コーティングされたガラスの８のチャンバスライド（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ社、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社、デンマーク）上に成長させた。細胞はＰＢＳで５回すすがれ、ＲＴで１０ないし１５分間、ＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒドで固定され、その後ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。非特異性の結合部位はＲＴで３０分間、ＰＢＳ中で３％のＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、ＦＲＣ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ社、フィンランド）で遮断された。
【０１７９】
ファージ抗体は１％のＨＳＡ−ＰＢＳで１０６ｐｆｕ／ｍｌまで希釈し、ＲＴで６０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで１０分間３回洗浄した。第２のマウス抗ファージ抗体（αＭ１３、１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及び第３のＦＩＴＣでラベリングされたヤギ抗マウス抗体（１：３００、Ｓｉｇｍａ社）は、ＲＴで６０分間インキュベートされ、ＰＢＳで５ないし１０分、３回洗浄され、ＤＡＰＩ染色を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国）に封入された。非特異性のハイパーファージは負のコントロールとして用いられた。結合の特異性はファージ抗体でのインキュベーション前に、シアリダーゼ処理により細胞表面からシアリン酸を除去することによって試験された。細胞のシアリダーゼ処理後に細胞表面に特異的に結合するが、その結合活性を失う４のクローンが同定された（表１）。
【０１８０】
［グリカン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング］
４のヒトＩｇＭのｓｃＦｖクローンは、ＩｇＧ１サブタイプを用いたヒトＦａｂフラグメントへの変換のために選択された（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｄｅｓｐｌａｎｃｑら、１９９４）。Ｆｄ領域及び軽鎖は表４のプライマを用いてＰＣＲをオーバラップすることによって増幅させた。Ｆｄ領域及び軽鎖の得られたｃＤＮＡは細菌性発現ベクタである、ｐＫＫｔａｃにクローンされ、次いで大腸菌ＲＶ３０８に形質変換された。１．２．２０、１．４．１１、１．４．２４、及び１．４．３０型として指定された可溶なＦａｂフラグメントが生成された。
【０１８１】
抗体Ｆａｂフラグメントは、シアリル化された細胞及びＮｅｕＧｃ含有型細胞の免疫染色で試験された。シアリン酸に依存し、シアリダーゼ酵素により放出可能な陽性の染色は、抗体が動物細胞物質で特徴づけられる場合に観察された。表１参照。細胞はフルオレセインとＤＡＰＩフィルタとを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及び蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ社、ドイツ）で観察された。画像は４００倍の拡大率を有するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で取り込まれた。染色の強度は−（陰性）又は＋／＋＋／＋＋＋（陽性）として類別された。
【０１８２】
抗体は更に、ウェスタンブロットアッセイで試験された。このアッセイは糖タンパク質に結合することを示した。
【０１８３】
［抗体配列の比較］
本発明による抗体配列は、標準的な方法によって他の入手可能な抗体配列と比較される。例えば、相同配列はＢＬＡＳＴプログラムによって検索され、例えばＥｎｔｒｅｚのネットページから入手可能である。表５は特異的な配列とともに、ＢＬＡＳＴによるほぼ相同の短い配列を検索することによって見つけられうる配列の不作為な実施例を示す。
【０１８４】
配列の一部は数多くの抗体配列と相同又は同一であり、その配列の一部、特にＣＤＲ３配列は非常に固有であるように見える。本発明は、
１）Ｎ残基がその他の抗体中に見つからなかった、１．４．３０型の軽鎖ＣＤＲ２中のＸ１−アミノ酸残基、
２）Ｇ残基がその他の抗体中に見つからなかった、１．４．３０及び１．４．１１型、及び希少なＸ１残基のＮに更に隣接するＲがある１．４．２４型の軽鎖ＣＤＲ３中のＸ２−アミノ酸残基、
３）１．２．２０型の重鎖ＣＤＲ２であるＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳＬＫＳ上の希少なＬ残基、
といった希少又は特有の単一のアミノ酸残基の置換変異を明らかにした。
【０１８５】
ＣＤＲ３配列は他の希少な特性を有する。重鎖ＣＤＲ３は比較的短く、１．２．２０及び１．４．２４型は６のアミノ酸残基を有し、１．４．３０型は７のアミノ酸残基を有し、９の残基を有する１．４．１１型であっても比較的短い。重鎖ＣＤＲ３は更に希少な配列を有すると思われ、例えば１．２．２０型の重鎖ＣＤＲ３はいずれの免疫グロブリンにも見られなかった。本発明は、保存され、かつ対応するより多くのＣＤＲ１及び２配列、ならびに共通配列を伴う固有で特有の特徴及びその組合せに関する。
【０１８６】
［１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性］
［実験手順］
［イムノアッセイによって決定された１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性］
ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）−ビオチン複合型の多価の単糖又はグリカン（Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ社、ロシア、表６参照）は、４℃、ｏ／ｎでＴＢＳバッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジンのマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、フィンランド）上で固定化された。ウェルはＴＢＳで４回洗浄され、非特異性結合部位は室温（ＲＴ）で６０分間、１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ７６３８）で遮断された。１．４．２４及び１．４．３０型の抗体は０．１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳで３μｇ／ｍｌに希釈され、ＲＴで２時間インキュベートされた。更に、ウェルはＴＢＳで４回洗浄され、第２の抗体である、ユーロピウムでラベリングされたヤギ抗ヒトλファージ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は０．１％の超高純度のＢＳＡ−ＴＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈され、ＲＴ、暗所で６０分間インキュベートされた。ウェルは前述のように洗浄され、２００μｌのＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、フィンランド）はウェルごとに添加され、その後プレートはＲＴで５分間震とうされた。ユーロピウムシグナルはＶｉｃｔｏｒプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フィンランド）で検出された。
【０１８７】
［結果及び考察］
［抗体の特異性］
１．４．２４及び１．４．３０型の双方の抗体は、天然に発生するＮｅｕＡｃ−単糖（ＧＦ３０８、図８）よりもＮｅｕＧｃ−単糖（ＧＦ３０９）に対する特異性が高い。しかしながら、双方の抗体がグルクロン酸α／β（それぞれ、ＧＦ３４１及びＧＦ２７１）といった酸性単糖と交差反応する。更に抗ＮｅｕＧｃ抗体は、ＮｅｕＧｃ又はＮｅｕＡｃのいずれかの単糖を保有する二単糖及び三単糖の可変性の認識を示す。シアリン酸（ＳＡ）がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はガラクトース（Ｇａｌ）のいずれかとα２ないし６結合で連結される場合、ＮｅｕＡｃはＮｅｕＧｃ（ＧＦ３４５ないしＧＦ３４８）の少なくとも４倍良く認識される。ＳＡが１型のＬａｃＮＡｃにα２又は３結合される場合、ＮｅｕＧｃ／Ａｃの双方が抗体によって認識さて、ＮｅｕＧｃはわずかにＮｅｕＡｃより良い（それぞれ、ＧＦ４６２及びＧＦ４６１）。総ての他の抗体は、ＳＡがα２又は３結合で連結される場合（ＧＦ４５９、ＧＦ４６０、ＧＦ４６３ないしＧＦ４６８）、抗ＮｅｕＧｃ抗体によってまったく認識されない。
【０１８８】
［ヒト幹細胞を用いたＦａｂフラグメントの試験］
抗体Ｆａｂフラグメントは、記載のように（Ｌｅｓｋｅｌａら、２００３）、生成されたシアリルグリカン混入型／修飾型のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の免疫染色で試験された。動物物質（ウシ胎仔血清、ＦＣＳ）での細胞培養条件によって、細胞がＮｅｕ５Ｇｃ及び特有のオリゴ糖で陽性になる。簡潔に言えば、整形外科手術中に得られる骨髄は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを追加したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｌｐｈａ−Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ社）中で培養された。２日間付着を許容した後に、細胞はＰＢＳで洗浄され、同一培地中で２０００ないし３０００細胞数／ｃｍ２の密度で継代培養された。免疫染色実験のために、ＭＳＣはコーティングされたガラスの８のチャンバスライド上で培養され、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞に対し上述したように、パラホルムアルデヒドで固定した。抗体Ｆａｂフラグメントは１％のＨＳＡ−ＰＢＳ中で希釈され、ＲＴで６０分間インキュベートされ、その後ＰＢＳで１０分間、３回洗浄した。ＦＩＴＣでラベリングされたヤギ抗ヒトλ抗体（１：１０００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）はＲＴで６０分間インキュベートされ、開始前にＰＢＳで５ないし１０分間、３回洗浄した。細胞はフルオレセインとＤＡＰＩフィルタとを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２及び蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ社、ドイツ）で観察された。画像は４００倍の拡大率を有するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で取り込まれた。染色の強度は−（陰性）又は＋／＋＋／＋＋＋（陽性）として類別された。結果は表７に示される。１．４．２４及び１．４．３０型の抗体は見つけられる場合、幹細胞を認識するのに特に有用である。
【０１８９】
［間葉系幹細胞の細胞培養条件に影響を与えるシアリン酸の分析］
［臍帯血間葉系幹細胞の生成］
ヒト条件の臍部の臍帯血ユニットは、母親にインフォームドコンセントを伝えた後に収集され、臍帯血は収集２４時間以内に処理された。単核細胞（ＭＮＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の密度勾配遠心分離によって各ユニットから単離された。単核細胞の分画は、１０６細胞数／ウェルでフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）でコーティングされた６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）上に平板培養された。非接着細胞のほとんどは培地が翌日に交換される際に除去された。細胞はＢＭ ＭＳＣについて上述したように基本的に培養された。分析で用いられるＣＢ ＭＳＣは継代数５ないし７であった。
【０１９０】
ＢＭ及びＣＢの双方のＭＳＣはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性、ならびにＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＨＬＡ−ＡＢＣに対し陽性になるようにフローサイトメトリによって分析された。細胞は骨原生、脂肪生成及び軟骨形成系列に沿って分化できることが示された。
【０１９１】
細胞はウシ胎仔血清の存在下で培養された。ＦＣＳの存在下で培養される細胞は１．４．２４型Ｆａｂフラグメントによって観察可能なシアリル−オリゴ糖エピトープを蓄積した。これらの一部は、結合がシアリン酸依存性であることを示すノイラミニダーゼ処理によって除去できた（最適化されない）。細胞が非動物性／特有のシアリン酸グリカン含有物質（特に、ヒト血清）の存在下で成長する場合、抗体は細胞を有効にラベリングしない。本発明は、動物性のシアリル物質の存在下での培養と関連づけられ、ヒト血清といった異物のないヒト物質での培養と関連づけられない場合の、幹細胞のラベリングと特異的なシアリン酸エピトープの呈示とに関する。
【０１９２】
［抗体変異体の例］
ファージディスプレイライブラリのスクリーニングは、Ｆ３とも称される１．４．１９（−３）型である更なる抗体配列を明らかにした。抗体の配列は１．４．２４型の重鎖及び１．４．１９型の軽鎖である、図１１ａ及び１１ｂを含む。抗体の特異性及び活性は、重鎖が抗体特異性を決定するキー因子であることを示す１．２４．４型と類似する。図１０。データは更に、軽鎖が少なくとも（ａｔ ｅｌａｔｓ）部分互換性であることを示す。好適な実施形態においては、本発明は４の他の抗体のいずれかを有する、１．４．２４型の抗体の重鎖配列、好ましくは１．４群の配列、最も好ましくは１．４．２４又は１．４．３０（Ｆ３）型の軽鎖、あるいは、４の他の抗体のいずれかを有する、１．４．３０型の抗体の重鎖配列、好ましくは１．４群の配列、最も好ましくは１．４．２４又は１．４．３０型の軽鎖を含む抗体に関する。
【０１９３】
表１は、選択されたＮｅｕＧｃ結合型抗体ファージのクローンのブタ腎尿細管細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１）への結合である。結合は免疫染色によって評価され、特異性は細胞のシアリダーゼ処理によって評価された。
【０１９４】
【表１】
【０１９５】
表２は類似のタンパク質配列、特に１．４．３０型と類似性を有し、特異的な糖脂質又は他の糖質を結合することが示される可能性のある、特定のバックグラウンドの抗体である。
【０１９６】
【表２】
【０１９７】
表３はＰＣＲプライマライブラリである。
【０１９８】
【表３】
【０１９９】
表４は、Ｆａｂフラグメントの増幅用のプライマである。
【０２００】
【表４】
【０２０１】
表５は、抗体配列の類似性の検索及び比較である。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
表６は１．４．２４及び１．４．３０型の抗体の特異性の決定に用いられる、グリカンポリアクリルアミド（ＰＡＡ）−ビオチン複合体及びそのコードである。
【０２０４】
【表６】
【０２０５】
表７は選択されたシアリル−オリゴ糖特異性の抗体Ｆａｂフラグメントのヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への結合である。結合は免疫染色によって評価された。
【０２０６】
【表７】
【０２０７】
［非特許文献］
・Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，７９７８−７９８２．
・Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ａ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７，１０２７−１０３３．
・Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６４４４−６４４８．
・Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．
・ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｆ．Ｊ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト幹細胞集団の状態を分析するための方法であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
に結合する結合試薬と細胞を接触させるステップを含み、好ましくは前記細胞に対する外因性物質及び／細胞培養条件の効果の分析のための方法であり、前記結合試薬がモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒトモノクローナル抗体であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
に結合することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体において、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎが、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαとを含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体において、末端非還元性の末端単糖残基が、
１）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基、
を更に含み、前記抗体が還元性末端から高分子担体に連結される非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、かつ、
２）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項２又は４に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列であるＮｅｕ５Ｇｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合し、前記抗体が末端非還元性の末端エピトープであるシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合し、前記抗体がＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンの双方に結合し、前記抗体がＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃよりＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃにより有効に結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項２又は５に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が請求項２ないし４のいずれかに記載の結合特異性の特徴を有し、ＣＤＲ１配列の共通配列である、
ＧＦＴＦＲ、ＧＦＴＦＳ、ＧＩＴＦＲ、若しくはＧＩＴＦＳであるＣＤＲ１、
又は、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３Ｙ、
であって、Ｘ１が好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２がＲ又はＳであり、Ｘ３がＫ、又はＳ、又はＲであるＣＤＲ１、
を有する、あるいはＣＤＲ２配列の共通配列であるＹＡＤＳＶＫを有する１．４群の抗体の重鎖配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が共通配列である、
ＴＬＲＳＧ、又はＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１が好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２がＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１が好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、及び選択的に、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１が好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２がＧ又はＲであり、Ｘ３がＷ又はＶであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体、あるいは、
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬ又はＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
の配列を有する１．２．２０型の抗体の軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項５に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４型の軽鎖ＣＤＲ配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項２又は５に記載のモノクローナル抗体において、前記抗体が請求項２ないし４のいずれかに記載の結合特異性の特徴を有し、共通配列である、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１が好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２がＲ又はＳであり、Ｘ３がＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４がＡ又はＳであり、Ｘ５がＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１が好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２がＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３がＧ又はＳであり、Ｘ４がＳ又はＧであり、Ｘ５がＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６がＴ又はＩであるＣＤＲ２、及び選択的に、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１が好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２がＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３がＫ又はなしであり、Ｘ４がＧ又はなしであり、Ｘ５がＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６がＧ又はＡであり、Ｘ７がＭ又はＦであり、Ｘ８がＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
の１．２．２０型の抗体の重鎖ＣＤＲを含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０又は１．２．２０型の配列の群から選択される前記軽鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列と、１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される前記重鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列とを含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項７に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４．２４型抗体の前記軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１２】
疾患関連型、又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法であって、当該方法が、請求項２ないし４に規定されたようなシアリル化されたオリゴ糖及び単糖の配列に対する前記抗体の特異性を測定し、好ましくは請求項３に記載の３のオリゴ糖配列に対する特異性を測定するステップを含み、前記抗体が請求項４ないし７、９、又は１０のいずれかに記載の配列を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
糖質エピトープ結合抗体を検出する方法であって、当該方法が、
ａ）請求項６、７、及び９のいずれか１項に記載の実質的に類似又は同一のＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列を有する抗体配列を、利用可能な配列データから検索するステップと、
ｂ）ステップａ）で検索された抗体を、請求項１ないし５のいずれかに記載の糖類配列を含むシアリル糖類のライブラリと接触させるステップと、
ｃ）前記抗体が前記配列のいずれかと結合するか、あるいは、請求項１３ないし２０に記載の抗体と同一の結合特異性を有するかどうかを検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに結合し、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、より有効にはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであることが好ましく、及び／又は、前記抗体がＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃとの双方に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が式ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに従うα６でシアリル化された末端非還元性の末端エピトープに結合し、ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する、末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が末端異種抗原性の非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列に結合せず、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が（ａ）免疫グロブリン分子全体と、（ｂ）ｓｃＦｖと、（ｃ）キメラ抗体と、（ｄ）Ｆａｂフラグメントと、（ｅ）Ｆａｂ’フラグメントと、（ｆ）Ｆ（ａｂ’）２と、（ｇ）Ｆｖと、（ｈ）ジスルフィド結合されたＦｖとからなる群から選択されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載のモノクローナル抗体において、前記ｓｃＦｖのフラグメント又は前記ＦａｂフラグメントがＩｇＭのサブクラスに属する抗体からのものであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２１に記載のモノクローナル抗体において、フラグメントがｓｃＦｖのフラグメントであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２４】
単離されたＤＮＡ分子であって、請求項２に記載のモノクローナル抗体と、このＤＮＡのフラグメントとをコード化し、前記抗体の少なくとも１の抗体鎖をコード化することを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の単離されたＤＮＡ分子において、前記抗体鎖がＶＬ及び／又はＶＨ領域のＣＤＲであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２６】
請求項２４に記載の単離されたＤＮＡ分子がベクタにクローン化されることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離されたＤＮＡ分子において、前記ベクタが請求項２に記載の抗体を発現できる発現ベクタであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２８】
請求項２４ないし２７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の宿主細胞が、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、あるいは前記抗体の少なくとも１の抗体鎖を発現できることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の宿主細胞において、前記抗体鎖が請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載のｓｃＦｖのフラグメントであることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
少なくとも１の抗体鎖を発現できる請求項２８に記載の宿主細胞を培養するステップと、
前記抗体を回復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法が、
前記回復ステップ後に成分鎖を結合するステップと、
結合した成分鎖を第２の宿主細胞に導入するステップと、
前記結合した成分鎖を回復するステップと、
を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法が、前記抗体をラベリングするステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
前記抗体又は抗体誘導体の少なくとも一部分を合成的に生成するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
ファージ又は微生物細胞であって、請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の抗体フラグメントを表面タンパク質を有する融合タンパク質として呈示することを特徴とするファージ又は微生物細胞。
【請求項３６】
請求項２に記載の抗体を選択する方法であって、請求項３５に記載のファージ又は細胞を含む抗体フラグメントのディスプレイライブラリから前記抗体を選択するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα複合体に結合しない第１の抗体が選択され、次いで、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα複合体に結合する抗体が残りの抗体から選択されるように、前記抗体が抗体フラグメントのディスプレイライブラリから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、前記複合体が固定化され、非結合型の前記ＮｅｕＡｃα複合体が最初にファージライブラリから選択され、次いでＮｅｕＧｃα結合型クローンがライブラリから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法において、前記ライブラリが少なくとも約５０の供血者から得られるヒト抗体のライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法において、前記ライブラリがＩｇＭライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法において、前記抗体フラグメントがＮｅｕＡｃα及びＮｅｕＧｃαの多価複合体に対して選択されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法において、前記多価複合体が２以上の末端シアリン酸残基を含み、シアリン酸残基間の距離が約２０原子結合未満であるが、約６原子結合より大きいことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法において、前記多価複合体がフレキシブルなポリアミド構造、より好ましくはポリアクリルアミド構造を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２７又は２８に記載のプロセスによって得られうる抗体。
【請求項４５】
サンプル中の酸性の糖類及び／又はＮｅｕＧｃを検出する方法であって、
前記サンプルを得るステップと、
前記サンプルを請求項２ないし１１又は１４ないし２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させることによって前記糖類を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記サンプルが細胞又は組織、好ましくはヒト細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
試験キットであって、運搬及び保存用に好適な容器中に請求項２ないし１１のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とする試験キット。
【請求項４８】
免疫診断で用いるための請求項２ないし１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４９】
免疫療法で用いるための請求項２ないし１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５０】
ヒトモノクローナル抗体であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
６）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
７）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
８）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
及び／又は、末端非還元性の末端単糖残基である、
９）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基と、
に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、好ましくは、
１０）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項５１】
ヒト幹細胞集団の状態を分析するための方法であって、請求項１又は５０に規定されたような結合試薬と細胞を接触させるステップを含み、前記細胞に対する外因性物質及び／細胞培養条件の効果の分析のための方法であり、前記結合試薬がモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、グリカン構造の無傷細胞集団上での表面発現が分析されることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、抗体によるラベリングが非ヒト外因性物質の存在下で細胞培養条件と関連し、及び／又は、前記ラベリングの欠如がヒト等価物質の存在下で細胞培養条件と関連することを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記ラベリングが前記非ヒト外因性物質中の非ヒト又は動物型のグリカン構造の存在と関連し、及び／又は、前記ラベリングの欠如が前記ヒト等価物質中のヒト型のグリカン構造の存在と関連することを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法において、前記ラベリングが動物血清タンパク質、好ましくはＦＣＳの存在と関連し、及び／又は、ラベリングの欠如がヒト血清タンパク質の等価物の存在と関連することを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５２ないし５５のいずれかに記載の方法において、前記無傷細胞の主要な下位個体群がラベリングされ、より好ましくは少なくとも１５％、更に好ましくは少なくとも７５％の細胞がラベリングされることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５２ないし５６のいずれかに記載の方法において、幹細胞はヒト血液由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯血又は骨髄由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５１ないし５７のいずれかに記載の方法において、請求項２ないし１１、又は１４ないし２０、又は５０のいずれかに記載の抗体が用いられることを特徴とする方法。
【請求項１】
ヒト幹細胞集団の状態を分析するための方法であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
に結合する結合試薬と細胞を接触させるステップを含み、好ましくは前記細胞に対する外因性物質及び／細胞培養条件の効果の分析のための方法であり、前記結合試薬がモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒトモノクローナル抗体であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
１）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
２）ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎと、
に結合することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体において、ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎが、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαとを含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体において、末端非還元性の末端単糖残基が、
１）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基、
を更に含み、前記抗体が還元性末端から高分子担体に連結される非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、かつ、
２）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項２又は４に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列であるＮｅｕ５Ｇｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの双方に結合し、前記抗体が末端非還元性の末端エピトープであるシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合し、前記抗体がＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンの双方に結合し、前記抗体がＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ａｃα３α３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃよりＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃにより有効に結合し、及び／又は、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項２又は５に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が請求項２ないし４のいずれかに記載の結合特異性の特徴を有し、ＣＤＲ１配列の共通配列である、
ＧＦＴＦＲ、ＧＦＴＦＳ、ＧＩＴＦＲ、若しくはＧＩＴＦＳであるＣＤＲ１、
又は、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３Ｙ、
であって、Ｘ１が好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２がＲ又はＳであり、Ｘ３がＫ、又はＳ、又はＲであるＣＤＲ１、
を有する、あるいはＣＤＲ２配列の共通配列であるＹＡＤＳＶＫを有する１．４群の抗体の重鎖配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が共通配列である、
ＴＬＲＳＧ、又はＴＬＲＳＧＩＮＶＧＸ１Ｘ２ＲＩＹであって、Ｘ１が好ましくはＡ又はＴであり、Ｘ２がＹ又はＳであるＣＤＲ１、
ＫＳＸ１ＳＤＫＱＱＧＳであって、Ｘ１が好ましくはＮ又はＤであるＣＤＲ２、及び選択的に、
ＭＩＷＨＸ１Ｘ２ＡＸ３ＷＶであって、Ｘ１が好ましくはＳ又はＮであり、Ｘ２がＧ又はＲであり、Ｘ３がＷ又はＶであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体、あるいは、
ＣＤＲ１：ＧＧＤＮＬ又はＧＧＤＮＬＧＧＫＳＶＨ、
ＣＤＲ２：ＤＤＲＤＲＰＳ、
ＣＤＲ３：ＱＶＷＤＳＧＳＥＳＶＶ、
の配列を有する１．２．２０型の抗体の軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項５に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４型の軽鎖ＣＤＲ配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項２又は５に記載のモノクローナル抗体において、前記抗体が請求項２ないし４のいずれかに記載の結合特異性の特徴を有し、共通配列である、
Ｘ１ＴＦＸ２Ｘ３ＹＸ４ＭＸ５であって、Ｘ１が好ましくはＩ又はＦであり、Ｘ２がＲ又はＳであり、Ｘ３がＫ、又はＳ、又はＲであり、Ｘ４がＡ又はＳであり、Ｘ５がＮ又はＳであるＣＤＲ１、
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧであって、Ｘ１が好ましくはＡ又はＳであり、Ｘ２がＮ、Ｇ、又はＳであり、Ｘ３がＧ又はＳであり、Ｘ４がＳ又はＧであり、Ｘ５がＤ、Ｓ、又はＹであり、Ｘ６がＴ又はＩであるＣＤＲ２、及び選択的に、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＤＸ８であって、Ｘ１が好ましくはＲ又はＭであり、Ｘ２がＰ、Ｋ、又はＮであり、Ｘ３がＫ又はなしであり、Ｘ４がＧ又はなしであり、Ｘ５がＧ、Ａ、又はなしであり、Ｘ６がＧ又はＡであり、Ｘ７がＭ又はＦであり、Ｘ８がＶ、又はＰ、又はＩであるＣＤＲ３、
を有する１．４群の抗体の重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、あるいは、
ＣＤＲ１：ＧＴＶＮＳＹＹＷＳ、
ＣＤＲ２：ＲＶＹＳＳＧＴＴＮＬＮＰＳ、
ＣＤＲ３：ＤＹＧＴＤＹ、
の１．２．２０型の抗体の重鎖ＣＤＲを含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０又は１．２．２０型の配列の群から選択される前記軽鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列と、１．４．１１、１．４．２４、１．４．３０、又は１．２．２０型の配列の群から選択される前記重鎖ＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列とを含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項７に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が１．４．２４型抗体の前記軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１ないしＣＤＲ３配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１２】
疾患関連型、又は細胞結合型の抗体、好ましくはヒト抗体の分析方法であって、当該方法が、請求項２ないし４に規定されたようなシアリル化されたオリゴ糖及び単糖の配列に対する前記抗体の特異性を測定し、好ましくは請求項３に記載の３のオリゴ糖配列に対する特異性を測定するステップを含み、前記抗体が請求項４ないし７、９、又は１０のいずれかに記載の配列を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
糖質エピトープ結合抗体を検出する方法であって、当該方法が、
ａ）請求項６、７、及び９のいずれか１項に記載の実質的に類似又は同一のＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列を有する抗体配列を、利用可能な配列データから検索するステップと、
ｂ）ステップａ）で検索された抗体を、請求項１ないし５のいずれかに記載の糖類配列を含むシアリル糖類のライブラリと接触させるステップと、
ｃ）前記抗体が前記配列のいずれかと結合するか、あるいは、請求項１３ないし２０に記載の抗体と同一の結合特異性を有するかどうかを検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がα３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに結合し、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、より有効にはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであることが好ましく、及び／又は、前記抗体がＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃとの双方に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が式ＳＡα６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｎに従うα６でシアリル化された末端非還元性の末端エピトープに結合し、ＳＡがシアリン酸、好ましくはＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃとを含む、双方のα６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミンに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃより高親和性を有する、末端非還元性の末端エピトープＮｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が末端異種抗原性の非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体がＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列に結合せず、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項２に記載のモノクローナル抗体において、当該抗体が（ａ）免疫グロブリン分子全体と、（ｂ）ｓｃＦｖと、（ｃ）キメラ抗体と、（ｄ）Ｆａｂフラグメントと、（ｅ）Ｆａｂ’フラグメントと、（ｆ）Ｆ（ａｂ’）２と、（ｇ）Ｆｖと、（ｈ）ジスルフィド結合されたＦｖとからなる群から選択されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載のモノクローナル抗体において、前記ｓｃＦｖのフラグメント又は前記ＦａｂフラグメントがＩｇＭのサブクラスに属する抗体からのものであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２１に記載のモノクローナル抗体において、フラグメントがｓｃＦｖのフラグメントであることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２４】
単離されたＤＮＡ分子であって、請求項２に記載のモノクローナル抗体と、このＤＮＡのフラグメントとをコード化し、前記抗体の少なくとも１の抗体鎖をコード化することを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の単離されたＤＮＡ分子において、前記抗体鎖がＶＬ及び／又はＶＨ領域のＣＤＲであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２６】
請求項２４に記載の単離されたＤＮＡ分子がベクタにクローン化されることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離されたＤＮＡ分子において、前記ベクタが請求項２に記載の抗体を発現できる発現ベクタであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２８】
請求項２４ないし２７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の宿主細胞が、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、あるいは前記抗体の少なくとも１の抗体鎖を発現できることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の宿主細胞において、前記抗体鎖が請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載のｓｃＦｖのフラグメントであることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
少なくとも１の抗体鎖を発現できる請求項２８に記載の宿主細胞を培養するステップと、
前記抗体を回復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法が、
前記回復ステップ後に成分鎖を結合するステップと、
結合した成分鎖を第２の宿主細胞に導入するステップと、
前記結合した成分鎖を回復するステップと、
を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法が、前記抗体をラベリングするステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
前記抗体又は抗体誘導体の少なくとも一部分を合成的に生成するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
ファージ又は微生物細胞であって、請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の抗体フラグメントを表面タンパク質を有する融合タンパク質として呈示することを特徴とするファージ又は微生物細胞。
【請求項３６】
請求項２に記載の抗体を選択する方法であって、請求項３５に記載のファージ又は細胞を含む抗体フラグメントのディスプレイライブラリから前記抗体を選択するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα複合体に結合しない第１の抗体が選択され、次いで、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα複合体に結合する抗体が残りの抗体から選択されるように、前記抗体が抗体フラグメントのディスプレイライブラリから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、前記複合体が固定化され、非結合型の前記ＮｅｕＡｃα複合体が最初にファージライブラリから選択され、次いでＮｅｕＧｃα結合型クローンがライブラリから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法において、前記ライブラリが少なくとも約５０の供血者から得られるヒト抗体のライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法において、前記ライブラリがＩｇＭライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法において、前記抗体フラグメントがＮｅｕＡｃα及びＮｅｕＧｃαの多価複合体に対して選択されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法において、前記多価複合体が２以上の末端シアリン酸残基を含み、シアリン酸残基間の距離が約２０原子結合未満であるが、約６原子結合より大きいことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法において、前記多価複合体がフレキシブルなポリアミド構造、より好ましくはポリアクリルアミド構造を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２７又は２８に記載のプロセスによって得られうる抗体。
【請求項４５】
サンプル中の酸性の糖類及び／又はＮｅｕＧｃを検出する方法であって、
前記サンプルを得るステップと、
前記サンプルを請求項２ないし１１又は１４ないし２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させることによって前記糖類を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記サンプルが細胞又は組織、好ましくはヒト細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
試験キットであって、運搬及び保存用に好適な容器中に請求項２ないし１１のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とする試験キット。
【請求項４８】
免疫診断で用いるための請求項２ないし１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４９】
免疫療法で用いるための請求項２ないし１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５０】
ヒトモノクローナル抗体であって、末端非還元性の末端オリゴ糖配列である、
６）α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃであって、ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、前記配列が好ましくはＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃである、α３でシアリル化された１型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
７）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃである、α６でシアリル化された２型のＮ−アセチルラクトサミン配列ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃと、
及び／又は、
８）シアリル化された非還元性末端の末端Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃ構造、好ましくはシアリルＴｎ配列Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαと、
及び／又は、末端非還元性の末端単糖残基である、
９）異種抗原性非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＧｃα−単糖残基と、
に結合するが、非還元性末端の単一末端であるＮｅｕＡｃα−単糖残基に結合せず、好ましくは、
１０）ＳＡがＮｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが０又は１である、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎに従うオリゴ糖配列、
に結合しないことを特徴とするヒトモノクローナル抗体。
【請求項５１】
ヒト幹細胞集団の状態を分析するための方法であって、請求項１又は５０に規定されたような結合試薬と細胞を接触させるステップを含み、前記細胞に対する外因性物質及び／細胞培養条件の効果の分析のための方法であり、前記結合試薬がモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、グリカン構造の無傷細胞集団上での表面発現が分析されることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、抗体によるラベリングが非ヒト外因性物質の存在下で細胞培養条件と関連し、及び／又は、前記ラベリングの欠如がヒト等価物質の存在下で細胞培養条件と関連することを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記ラベリングが前記非ヒト外因性物質中の非ヒト又は動物型のグリカン構造の存在と関連し、及び／又は、前記ラベリングの欠如が前記ヒト等価物質中のヒト型のグリカン構造の存在と関連することを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法において、前記ラベリングが動物血清タンパク質、好ましくはＦＣＳの存在と関連し、及び／又は、ラベリングの欠如がヒト血清タンパク質の等価物の存在と関連することを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５２ないし５５のいずれかに記載の方法において、前記無傷細胞の主要な下位個体群がラベリングされ、より好ましくは少なくとも１５％、更に好ましくは少なくとも７５％の細胞がラベリングされることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５２ないし５６のいずれかに記載の方法において、幹細胞はヒト血液由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯血又は骨髄由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５１ないし５７のいずれかに記載の方法において、請求項２ないし１１、又は１４ないし２０、又は５０のいずれかに記載の抗体が用いられることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５０４０９９（Ｐ２０１１−５０４０９９Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２６３３（Ｐ２０１０−５３２６３３）
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６０１２９
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０９２０５２５０）
【出願人】（５０９３３９０１６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６０１２９
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０９２０５２５０）
【出願人】（５０９３３９０１６）
【Ｆターム（参考）】
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