ジェノタイピング方法
本発明は、ジェノタイピング方法に関し、より一層詳しくは遺伝子型毎に付されるＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスを利用した多重ジェノタイピング方法に関する。本発明のＩＤシーケンスを利用して、パイロシーケンスを行う場合、遺伝型毎に独特かつ簡潔なパイログラムを取得できて、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子を簡単かつ効率的にジェノタイピングすることができ、本発明のジェノタイピング用プライマーは、分配形式を使う全てのシーケンスを利用したジェノタイピング方法に多様に応用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジェノタイピング方法に関し、より一層詳しくは遺伝子型毎に付されるＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスを利用した多重ジェノタイピング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性生物体を検出するための方法は、伝統的な培養方法による物理的・化学的特徴を確認する方法から始まり、病原体の特異的な遺伝的特性を検出する方法に発展して来ており、遺伝的特性を検出する方法には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）分析、パルスフィールド電気泳動、任意プライム重合酵素連鎖反応（arbitrarily-primed polymerase chain reaction：ＡＰ−ＰＣＲ）、反復配列基礎ＰＣＲ（repetitive sequence-based PCR）、リボタイピング（ribotyping）及び比較核酸配列決定法（comparative nucleic acid sequencing）等がある。このような方法は概して時間がかかり、高価であり、再現不可能であり、熟練した技術を要するため、殆どの診断環境には使用不可能である。前述した方法は、すべて通常煩雑な電気泳動段階が必要であり、病原体を培養してゲノムＤＮＡを精製すべきで、一種類以上の検出対象を含有する場合、検出結果がまともに出てこない場合が多い。このような制約は最近開発された高密度マイクロアレイ法による検出方法にいおいても同様である（Salazar et al., Nucleic Acids Res. 24:5056-5057, 1996; Troesch et al., J. Clin. Microbiol. 37:49-55, 1999; Lashkari et al., Proc. Natil. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13057-13062, 1997）。一方、パイロシーケンスは、伝統的なサンガー（Sanger）法によったシーケンスとは異なり、ＤＮＡ合成によってシーケンスする方法で、ヌクレオチドが重合されながら放出されるピロリン酸塩（pyrophosphate）を検出する方法で、ポリメリゼーション（Polymerization）時に４個のデオキシヌクレオチド三リン酸塩（deoxynucleotide triphosphates:ｄＮＴＰｓ）を一度に一つずつ順次入れて反応させる。重合されるｄＮＴＰに付いているＰＰｉは、酵素反応で光を発生し、発生した光は順次入った各々のｄＮＴＰの反応順にシグナルピークを現し、そのピークは各々のｄＮＴＰが反応した数に比例して高くなったり低くなったりするパターンを示して、塩基配列を決めることができる技術であり、最近では臨床試料で病原体に特異的な配列を、ＰＣＲ産物をパイロシーケンスを利用して形成されるパイログラム（pyrogram）で確認して、病原性菌または、ウイルスを検出する方法が使われている（Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007）。
【０００３】
しかし、パイロシーケンス手法では、ｄＮＴＰｓをいれる順序である分配順序（dispensation order）に従ってシーケンスが進められ、鋳型に分配順序にない配列は、反応が起きなくなってピークが形成されないが、同じ配列が連続的に出てくると、放出される光の量に応じてピーク高さが形成される特性を持っている。従って多種類の病原体が同一試料内に存在する場合、塩基配列の構成により、多数の病原体の塩基配列のピークが重なるように現れることになって、パイログラム判読を介した遺伝型確認が困難であり、特に反復される配列の個数が増加すると、前に位置する配列のピークが相対的に低くなる特徴があって、多重の病原体が感染している場合、各病原体の感染程度により、分別しようとするピークを確認することが難しいという欠点がある。
【０００４】
そこで、本発明者等は、パイロシーケンスを利用してジェノタイピングを実施するに当たり、タイピングしようとする遺伝型が独特かつ簡潔なパイログラムを持つようにしようと鋭意努力した結果、タイピング対象の特異配列とは独立的に存在すると共に、ＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークを持つＩＤシーケンスをタイピング対象の特異配列と繋げてパイロシーケンスすると、遺伝型毎に独特かつ簡潔なパイログラムが得られることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、タイピングしようとする遺伝型が独特かつ簡潔なパイログラムを持つようにパイロシーケンスするのに有用なＩＤシーケンスを提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したジェノタイピング方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶのジェノタイピング方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルスの検出方法を提供するところにある。
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明はＡ（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスを提供する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストで；Ｅは前記サインポスト（signpost）の単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで；及びｎは１〜３２の自然数である。
【０００７】
本発明はまた、ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスを提供する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【０００８】
本発明はまた、前記ＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記ジェノタイピング用プライマーを利用するジェノタイピング方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】分配順序に従ってパイロシーケンスが行われる過程及びパイログラムを示す。
【図２】分析配列に応じたパイログラムのピーク変化を示す。
【図３】分析配列に応じたパイログラムのピーク変化を示す。
【図４】サインポストの挿入によるパイログラムのピーク変化を示す。
【図５】２種類分析配列が混ざり合っている時のパイログラムを示す。
【図６】分配順序でサインポストの有無によるパイログラムを示す。
【図７】サインポスト後方の配列変化によるパイログラムを示す。
【図８】エンドマークがない場合のパイログラムを示す。
【図９】エンドマークがある場合のパイログラムを示す。
【図１０】サインポスト順序の変化による分配順の変化を示す。
【図１１】分配順序に従ってＩＤシーケンスをデザインする方法を示す。
【図１２】分配順序のデザイン方法を示す。
【図１３】分配順序に従ってＩＤシーケンスが現れるパイログラムを示す。
【図１４】分配順序を決めた後、ＩＤシーケンスをデザインする方法を示す。
【図１５】分配順序に従って現れるＩＤシーケンスのパイログラムを示す。
【図１６】本発明のＩＤシーケンスを利用してＨＰＶをジェノタイピングする方法を示す。
【図１７】一般的なＫＲＡＳ変異検出システムを示す。
【図１８】本発明のＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ変異を検出する方法を示す。
【図１９】本発明のＩＤシーケンスを利用して１５種のＨＰＶをジェノタイピングした結果を示す。
【図２０】本発明のＩＤシーケンスを利用して２種以上の多重ＨＰＶをジェノタイピングした結果を示す。
【図２１】本発明のＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２２】本発明のＩＤシーケンスを利用して多重ＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２３】本発明のＩＤシーケンスを利用して大腸癌組織でＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２４】本発明のＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルス感染検出方法を示す。
【図２５】本発明のＩＤシーケンスを利用して５種の呼吸器ウイルスの単一感染検出結果を示す。
【図２６】本発明のＩＤシーケンスを利用して５種の呼吸器ウイルスの多重感染検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の他の特徴及び実施態様は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【００１５】
一観点において、本発明は、Ａ（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスに関する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストで；Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで；及びｎは１〜３２の自然数である。
【００１６】
他の観点において、本発明は、ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスに関する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【００１７】
本発明の「ＩＤシーケンス」は、各遺伝子が固有に保存している特異的配列でなく、本発明に係るジェノタイピング方法において、各遺伝子型毎に独特に付することができる人為的に作製された塩基配列をいう。
本発明において前記「隣接したＩＤマーク」は、サインポストの前方または後方に位置したＩＤマークを意味する。
【００１８】
本発明のＩＤシーケンスは、パイロシーケンスを行う際に、パイログラムが次に出てくる配列によって影響されず独特の位置にピークが形成されるようにするサインポストとエンドマーク（endmark）を利用して、決まった分配順序（dispensation order）に従って、単一塩基配列（one nucleotide）に区別されるようにするために使われる。
【００１９】
この過程において、分配順序に従って個々の独特のピークを形成する単一塩基配列をＩＤマークといい、ＩＤマークが単一ピークを形成するために必要な配列のサインポストとエンドマークを含む配列をＩＤシーケンスという。１個のサインポストと１個のエンドマークを利用して、ＩＤマークの次に出てくる遺伝子の配列に影響を受けなくなるＩＤマークは３種類になり、従って、ジェノタイピングできる個数は３種類である。３種類以上の多重遺伝型検査（multiple genotyping）を行うためには、サインポストとＩＤマークを追加すれば良い。
【００２０】
一般的なパイロシーケンスでは、分配配列によりシーケンスが進められ、鋳型に分配配列（dispensation order：ＤＮＡ合成時ヌクレオシドが入る順序）にない配列があれば、反応が起きないためピークが形成されないが、同じ配列が連続的に存在すれば、放出される光量に応じてピークの高さが形成される特性を持っている（図１）。
【００２１】
１個の塩基を分析配列で利用すると、パイログラム上で４種類の相違するピークで区別できると考えられるが、実際には分析配列の次にくる配列はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中の一つであるため、少なくとも一つの場合は多重ピーク（同じ配列が繰り返してくる場合、一つの大きい多重ピークを形成する）を形成するしかないため、結果的に、単一塩基で単一ピークを区別できる方法は最大三つしか存在しない（図２）。
【００２２】
また、分析配列以後に出てくる配列によって望まないピークが形成されることになり、分析配列以後に反復された塩基が連続的にある場合、重合反応が一度に起きるため、単一ピークが形成されるか、この反応で発生する発光量が増加するため、ピークの高さが比例的に増加する特性を持って、このような反復配列がある場合、相対的に単一塩基で存在すピークの高さは減少する現象が現れる（図３）。このような問題があるため、単一塩基を利用した多重ジェノタイピングに限界があり、これを解決するために、本発明のＩＤシーケンスでは次に位置する配列によって分析される配列のピークが影響を受けないよう、「分析配列」を分離させて、次の追加的な分析が可能にする分離配列を「サインポスト」と命名した（図４）。
【００２３】
また、前記サインポスト配列によりパイロシーケンスの分配順序（dispensation order）の設定が変わることになる。
２塩基で構成された一つの分析配列で１個の塩基配列をサインポストに設定すれば、残りの１個の塩基配列位に３個の塩基が各々位置することができ（同じ配列がくる場合は、ピークが重なるため、サインポストで配分された１個の塩基を除いた３個の塩基が残り一つの塩基位に位置することができる）、サインポストの前に位置した塩基は、図４のように分析配列以後に出てくる配列に影響を受けずにピークを独立的に、分離が可能に設定することができる。
【００２４】
前記分析配列でサインポストによって分離した単一塩基を「ＩＤマーク（ID mark）」と命名し、図４に示したように１個のＩＤマークと１個のサインポストを利用して三つのタイプに対する多重ジェノタイピングが可能になる。この時、分配順序（dispensation order）でサインポストの位置は、ＩＤマークの後に位置するようにする（サインポストの前に位置したＩＤマークだけが分析配列以後に出てくる後方配列に影響を受けないため）。
【００２５】
本発明の一様態で、単一塩基のＩＤマークと１個のサインポストからなる２塩基の分析配列をジェノタイピングするために、図５に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）、タイプ２（分析配列：ＴＣ）及びタイプ３（分析配列：ＧＣ）の分析配列を合成して、パイロシーケンスして、タイプ１では分配配列により分配配列１番にＡのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになり、タイプ２では分配配列２にＴのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになる。タイプ３では分配配列３にＧのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになる。ここで、分析配列中最初の塩基の配列であるＡ、Ｔ、Ｇは、各々ＩＤマークで、分析配列中二番目の塩基配列である共通したＣはサインポストである。
【００２６】
前記３つのタイプの分析配列を多重ジェノタイピングするために、図５の（ａ）に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）とタイプ２（分析配列：ＴＣ）を混ざり合ったサンプルを、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスした結果、分配配列１でＡのピークが現れ、分配配列２でＴのピークが現れ、分配配列３ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのタイプ１とタイプ２の二タイプで全部反応して現れるため、ＡとＴのピークより２倍の大きさで現れることになる。
【００２７】
同様に、図５の（ｂ）で、タイプ１（分析配列：ＡＣ）とタイプ３（分析配列：ＧＣ）が混ざり合ったサンプルでは、分配配列１でＡのピークが現れ、分配配列３でＧのピークが現れ、分配配列２ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのピークは２倍で二タイプで全部存在するため、反応が２倍で現れてピークの大きさも２倍になる。
【００２８】
さらに、図５の（ｃ）で、タイプ２（分析配列：ＴＣ）とタイプ３（分析配列：ＧＣ）が混ざり合ったサンプルでは、分配配列２でＴピークが現れ、分配配列３でＧのピークが現れ、分配配列１ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのピークは２倍で二タイプで全部存在するため、反応が２倍で現れてピークの大きさも２倍になることになる。
【００２９】
従って、サインポストによってＩＤマークは以後の配列と分離して独立的に存在できるため、多重ジェノタイピング時に有用である。
「ＩＤマーク」と「サインポスト」で構成された分析配列を利用したパイロシーケンスで分配配列にサインポストの配列を挿入してもしなくてもジェノタイピングの結果には差がないが、サインポストの配列を分配配列に挿入しなかった場合、機械的な誤りを判断できない短所がある（図６）。従って、分配配列にはサインポストの配列を挿入してパイロシーケンスが正常に進行されたかを判断できるようにすることが好ましい。また、パイロシーケンス時に多重ジェノタイピング時にＩＤマークのピークは、サインポストのピークより大きくはならないため、これもパイロシーケンスの誤りを判断する基準になることができる（図６）。
【００３０】
エンドマーク
サインポストは、単一塩基ＩＤマークと後方の配列を分離させて、ＩＤマークピークが後方配列の影響を受けないようにする役割を果たす。しかし、サインポストも、後方に来る配列がサインポストと同じ場合に検出される発光量の増加によるピークの高さが比例的に増加するため、これによって、前方のＩＤマークのピークの高さが変わる現象が生じる（図７）。このような現象を解決するために、ＩＤマークとサインポストが次に連結される配列に影響を受けないようにするために、サインポストとは異なった塩基配列をサインポストの後方に挿入することができ、この時挿入される配列を「エンドマーク」と命名し、前記エンドマークは分配配列（dispensation order）に挿入されない。前記「エンドマーク」はＩＤマークとサインポストが後方に連結される配列によって影響を受けなくして、一定の高さのピークを作る役割を果たす。
【００３１】
即ち、エンドマークがない場合は、図８に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）の次にＣＡが来る場合、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスすると、サインポストであるＣの次に重なるＣのために、分配配列１位のＡピークより分配配列３位のＣピークが大きくなる。同様に、タイプ３（分析配列：ＧＣ）の次にＣＣが来る場合には、サインポストであるＣの次にＣが３度重なって、分配配列３のＧのピークが大きくなりすぎた分配配列４のＣのピークによってずっと小さくなる。
【００３２】
エンドマークがある場合には、図９に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）の次にＣＡが来る場合、その間にエンドマークでＴが挿入され、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスすると、サインポストであるＣの次にＴが割り込んでＣが重ならず、分配配列１位のＡピークと分配配列３位のＣピークの高さが一定になる。同様に、タイプ３（分析配列：ＧＣ）の次にＣＣが来る場合にも、サインポストであるＣの次にエンドマークであるＴが挿入されて、サインポストの後にＣが重ならないため、分配配列３のＧのピークと分配配列４のＣのピークの高さが同一になる。本発明において、追加できるサインポストの個数Ｎは、２〜３２であることが好ましく、Ｎが３２の場合、６５種類の多重ジェノタイピングが可能である。
【００３３】
複数のＩＤマークと複数のサインポストを利用すると、３タイプ以上のジェノタイピングが可能である。
【００３４】
この場合にも、単一ピークのパイログラムを得るために、隣接した塩基配列間には、互いに異なる塩基で構成されなければならない。ＩＤマークは、サインポストの前方や２個のサインポストの間に置かれ、サインポストの間に置かれたＩＤマークは、両側のサインポストと異なった塩基配列を持たなければならないため、２種の異なる塩基であって、サインポストの前方に位置したＩＤマークの場合は後方に位置したサインポストと異なる塩基配列を持つだけでよく、３種の異なる塩基である。
【００３５】
この時、サインポスト１の塩基配列とサインポスト２の塩基配列は一致してはいけなく、最後方のサインポストの塩基配列とエンドマークの塩基配列も一致してはいけない。
【００３６】
ＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークで構成される配列を「ＩＤシーケンス」と命名し、本発明でＩＤシーケンスは、ＩＤマーク及びサインポストで構成され、好ましくはＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークで構成される。
本発明のＩＤシーケンスは、サインポストが１個追加される度に２個のタイプを追加的に区別できることになる。従って、２Ｎ＋１個（Ｎ＝サインポストの個数）のＩＤマークの位置によりジェノタイピングで区別することができる。
【００３７】
１個のＩＤマークとエンドマークを除いた残りの塩基配列は、サインポストで使われる塩基配列で、ＩＤシーケンス内のＩＤマークを同じ分配順序で区別しようとするなら、ＩＤシーケンス内でサインポストの塩基配列は同じ順序に置かれなければならない。即ち、ＩＤマークの位置だけサインポストの前や間に置かれることになり、サインポストの配列順序は同じでなければならない。それは、パイロシーケンスの特性上、サインポスト配列が異なると分配順も変わるためである（図１０）。
【００３８】
ＩＤシーケンスデザイン
サインポストを定めた後、ＩＤシーケンスを作る場合
２個のサインポストで構成する場合、まず、ＴとＧを各々サインポスト１及びサインポスト２で使用するなら、サインポスト１（Ｔ）の前面に置かれるＩＤマーカーは、Ａ、Ｇ及びＣ中いずれか一つであり、サインポスト１とサインポスト２の中間に位置するＩＤマーカーは、ＡまたはＣであり、エンドマーカーは、Ａ、Ｔ及びＣ中いずれか一つである。
【００３９】
従って、図１１に示したように、前記の通りに構成されるＩＤマーカーとサインポスト、エンドマーカーで構成されるＩＤシーケンスでＩＤマークを１個として生成できる場合は、五つで、サインポスト１の前に位置するＩＤマーカーを作る三つの場合（Ａ、Ｇ及びＣ）と、サインポスト１とサインポスト２との間に位置するＩＤマーカーを作る二つの場合（Ａ及びＣ）がある。
この時、エンドマークは分配順序に入らないため、ＩＤシーケンスでエンドマークが同じか互いに異なってもよい。
【００４０】
分配順序（dispensation order）のデザイン
ＩＤシーケンスを利用したジェノタイピングでは、分配順序に従って、ＩＤシーケンスに位置するＩＤマークが順次に独立的なピークを形成することになり、分配順序はサインポストを境界に形成できる種々の順列によりデザインできる。
前記ＩＤシーケンスにより形成できる分配順序中の一つは、次にと図面のようになり、エンドマークは分配順序に入らない。
【００４１】
図１２には、前記ＩＤシーケンスにより可能な１２個の分配順序を示し、前記１２個の可能な分配順序症中一つを選択して使うことができる。
分配順序の個数は、４ｘ６Ｎ（Ｎ＝サインポスト個数）通り形成される。従って、サインポストが２個の場合、１４４通りの分配順序を作ることができる。
従って、図１３に示したように、ＩＤシーケンスは分配順序に従って、固有のピークを持つことになる。
【００４２】
分配順序を決定後、ＩＤシーケンをスデザインする方法
ＩＤシーケンスは、１個のＩＤマークと１個以上のサインポスト中少なくとも１個のエンドマークで構成され、隣接した塩基配列は互いに異なるべきで、分配順序も、同じ条件を持つべきであり、分配順序を先に決めた後、ＩＤシーケンスをデザインしてもよい。
【００４３】
分配順序でサインポスト１の前には３個のＩＤマーカーが置かれ、２個のサインポストの間には２個のＩＤマークが置かれることになるため、この規則を利用すれば分配順序を持って次のようなＩＤシーケンスを作ることができる。
例えば、９通りの遺伝子型を分離しようとすると、（２Ｎ＋１）の公式に従って４個のサインポストが必要で、図１４に示したように、分配順序をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃをｎ回繰り返すように決めた場合、サインポストは、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａになり、エンドマークはＴになり、サインポストの間に位置した配列が、ＩＤマークになって、ＩＤシーケンスを作製することができ、分配順序のとおりパイロシーケンスを行うと、図１５に示されたような結果が得られる。
【００４４】
また他の観点において、本発明は、前記ＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーに関する。
【００４５】
本発明において、前記ジェノタイピング用遺伝子特異配列は、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的な配列であることを特徴とし、前記プライマーはパイロシーケンスを容易にするため、５’末端側にシーケンス用プライマー配列を追加で含有することを特徴とする。
【００４６】
また他の観点において、本発明は、前記ジェノタイピング用プライマーを利用するのを特徴とするジェノタイピング方法に関する。
【００４７】
本発明のＩＤシーケンスを使ったジェノタイピング用プライマーは、分配形式を使う全シーケンスを利用したジェノタイピング方法に多様に応用可能で、好ましくはパイロシーケンス方法または半導体シーケンス方法が使えるが、これに限定されない。
【００４８】
本発明において、前記パイロシーケンス方法は、シーケンス過程で発生するｐｐｉ（pyrophosphate）の分解反応から生じる光を検出する方法で、半導体シーケンス（smiconductor sequencing）は、シーケンス過程で発生するプロトン（proton：Ｈ＋ｉｏｎ）による電流変化をチップ（chip）で分析する方法である（Andersona, Erik P. et al., Sens Actuators B Chem.; 129(1): 79, 2008)。
【００４９】
本発明において、（ａ）ジェノタイピング対象遺伝子により、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）前記デザインされたＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを利用してジェノタイピング対象遺伝子鋳型を増幅させて、ＰＣＲ産物を取得する段階；及び（ｃ）前記ＰＣＲ産物をパイロシーケンスしてＩＤシーケンスをシーケンスする段階を含むことを特徴とする。
【００５０】
また他の観点において、本発明は、（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法に関する。
【００５１】
本発明において、前記ウイルス遺伝子型の特異配列は、配列番号１〜１５で表される塩基配列中から選択されることを特徴とする。
ＨＰＶ（human papilloma virus）は、ヒトの皮膚や粘膜に感染する最も一般的なウイルスの一つであり、現在まで約１５０以上のタイプが知られており、これらの中３０種余りが性器接触を介して感染し、ＨＰＶウイルスによる癌発病率の８５％程度が子宮頸癌と関連がある。性器に感染する３０種余りのウイルス中１５タイプが子宮頸癌を引き起こす高危険群と知られている。子宮頸癌は、韓国の場合、女性癌発病率６位に該当して、パパコロニー塗抹（Pap smears）は感度と再現性が悪く、癌の状態を把握するのに問題点があり、頻繁に起きる試験のための費用負担も大きく作用する。現在までＦＤＡの許可を受けたＨＰＶ検査方法としては、ＨＹＢＲＩＤＣＡＰＴＵＲＥＩＩがあるが、この方法はＨＰＶ感染有無だけ診断し、どのタイプのＨＰＶが感染したかについては分からない。
【００５２】
ＨＰＶは、遺伝型毎に癌誘発率、癌タイプ、癌転移過程が異なるため、ジェノタイピングによって患者が感染したＨＰＶの遺伝型を分かることは重要である。例えば、ＣＩＮ ＩＩＩ＋の場合、ＨＰＶタイプ１６が５５％を占め、ＨＰＶタイプ１８が１５％を占めると報告され、その他３０％の場合も残りの高危険群１３タイプＨＰＶと関連があると報告された。
【００５３】
ＨＰＶをジェノタイピングする最も重要な理由は、遺伝型特異的ＨＰＶ感染をモニタリングできることであり、高齢女性の場合、感染の持続期間が若い女性より普通長いが、これは過去に長期間の感染の可能性が大きいためである。どの位の持続期間が重要であるかは臨床的に定められていないが、普通１年以上持続する場合、危険性が増加すると知られている。勿論ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８を検査することが重要であるが、発癌性ＨＰＶタイプの持続的な感染を検査することが最も重要である。
【００５４】
本発明の実施例では、ＩＤシーケンスを利用して１５種のＨＰＶウイルスをジェノタイピングした。ＨＰＶウイルスで１５種のウイルスで特異配列を持つＨＰＶ Ｌ１部位と９種のＩＤシーケンス及びシーケンス用プライマー部位を含有するプライマー（ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマー）と５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー（5’biotinylated GP6 plus primer）を利用して、各々１５種のＨＰＶウイルスゲノムを増幅させたＰＣＲ産物をパイロシーケンスした結果、１５種のウイルスに対する１５種のＩＤシーケンスのパイログラムが得られた（図１６）。
【００５５】
本発明のさらに他の実施例では、ＨＰＶタイプ１６に感染したＣａＳｋｉ細胞株のゲノムＤＮＡ（genomic DNA）とＨＰＶタイプ１８に感染したＨｅＬａ細胞株のゲノムＤＮＡを同量混合したサンプルをＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマーと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマーで増幅させたＰＣＲ産物をパイロシーケンスした結果、重複ピークの干渉がなくきれいなＨＰＶタイプ１６及びＨＰＶタイプ１８に該当するＩＤシーケンスのパイログラムを確認することができた。
【００５６】
また他の観点において、本発明は、（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法に関する。
【００５７】
Ｒａｓ遺伝子はラットで肉腫を引き起こすレトロウイルスの癌誘発遺伝子（oncogene）として初めて発見されたが、１９８５年にすい臓癌患者のリンパ節でＫＲＡＳの存在が知らされて以来、多様な研究が行われている。この癌遺伝子（oncogene）の突然変異は、人体の悪性突然変異中に頻繁に発見される遺伝子の一つである。この遺伝子と構造と機能が類似する遺伝子は、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓまた癌遺伝子として知られている。ＫＲＡＳのコドン１２、１３、６１の突然変異は、蛋白質活性に影響を与えて過度の活性を誘発することになる。
【００５８】
ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、消化器系の腺癌（adenocarcinoma）で発見され、すい臓の腺癌の場合、膵液と膵臓組織等で９０％の突然変異を発見することができ、これらの多くはコドン１２の変異と知られており、大腸癌では４０〜４５％で発見されるが、化学治療に反応がない、進行された結腸癌に使われるセツキシマブ（cetuximab）またはペニツムマブ（panitumumab）のような薬物に対する反応性の減少とも関連があると知られている。また、５〜３０％の非小細胞肺癌で観察され、喫煙歴がある患者で主に観察され、ＥＧＦＲ突然変異とは相互排他的に発見される。
【００５９】
野生型ＫＲＡＳ存在下、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）の三種類の突然変異は、一般的なパイロシークエンス方法では検出に限界がある。特に、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）突然変異は、発生頻度が高いため、検出限界のために排除が難しい（図１７）。
【００６０】
本発明の一実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３番の突然変異を検出する方法を開示した。本発明では、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）の三種類の突然変異に対して特異的に結合するプライマーを考案して、この３種類のプライマー特異的な塩基配列の前に固有ＩＤシーケンスを利用して検出できるように考案し、本発明の方法によると、４種類のフォワードプライマー（forward primer）と一種類のビオチン化リバースプライマー（biotinylated reverse primer）を利用して１回のＰＣＲ過程で１２種類のＫＲＡＳ突然変異を検出することができる（図１８）。
【００６１】
本発明において、前記ＫＲＡＳ遺伝子変異の特異配列は、配列番号３４〜３５で表される塩基配列中から選択されることを特徴とする。
【００６２】
また他の観点において、本発明は、（ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法に関する。
【００６３】
本発明の一実施例で、呼吸器ウイルス検出方法は、前記５種の呼吸器ウイルスに対して特異的に結合するプライマーを考案して、この３種類のプライマー特異的な塩基配列の前に固有ＩＤシーケンスを利用して検出できるように考案し、前記５種のＧＴ−呼吸器ウイルス５タイプフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマーを利用して、ｃＤＮＡを合成した後、ＧＴ−ＲｅｓｐｉＶｉｒｕｓＩＤプライマーと５’ビオチン化Ｍ１３リバースプライマーを利用して特異的にウイルスを増幅してパイロシーケンスで検出する方法である
【００６４】
本発明において、各呼吸器ウイルス遺伝子型の特異配列は、インフルエンザＡウイルスの場合は、配列番号４１、インフルエンザＢウイルスの場合は、配列番号４２、ＲＳＶ Ｂの場合は、配列番号４３、リノウイルスの場合は、配列番号４４、及びコロナウイルスＯＣ４３の場合は、配列番号４５で表される塩基配列であることを特徴とする。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６６】
実施例１：ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶジェノタイピング
本発明のＩＤシーケンスを利用して子宮頸癌原因ウイルスである高危険群のＨＰＶの遺伝子をタイピングした。
１５通りの高危険群ＨＰＶに対するＩＤシーケンスを表１のようにデザインした。
【００６７】
【表１】
【００６８】
前記１５種のＩＤシーケンスの３’末端には対応する各々対応するＨＰＶタイプに特異的な塩基配列を連結し、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して１５個の互いに異なるＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表２）。
【００６９】
【表２】
【００７０】
前記１５種のＨＰＶウイルスらは韓国人女性の子宮頸部細胞診検体（忠南（チュンナン）大学病院産婦人科）からゲノムＤＮＡを抽出した後、ＨＰＶ ＤＮＡチップを利用して感染した遺伝型を確認し、ＨＰＶウイルスのＬ１遺伝子をＰＣＲ増幅して得られる。
臨床試料からＨＰＶの感染の有無を判断するためのＰＣＲプライマーとして、ＧＰ５プラスプライマーとＧＰ６プラスプライマーを利用した。
【００７１】
【表３】
【００７２】
前記１５種のＨＰＶウイルスを各々鋳型として、表２に示した１５種のＰＣＲプライマーを同じ割合で混ぜてフォワードプライマー（ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマー）として使い、５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー（パイオニア、韓国）をリバースプライマーとして使って次の条件でＰＣＲを行った：
９５℃１５分−［９５℃（０.５分）、４５℃（０.５分）、７２℃（０.５分）］×４５サイクル−７２℃（１０分）−４℃維持。
【００７３】
前記ＰＣＲ産物には共通のシーケンスプライマー結合部位を含んでいる。本実施例では、一般的に多く使用するＴ７プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ −３’）を利用しており、このＴ７プライマーを利用してＩＤシーケンスのパイロシーケンスを行って、パイログラムを分析してＨＰＶをタイピングした（図１９及び図２０）。
【００７４】
分配順序でＨＰＶのタイプにより形成されるＩＤマークの位置を図１７の上方に示し、赤色で示したピークは、ＩＤマークで、青色で示したピークはサインポストである。
その結果、１５種のウイルスに該当する特異ＩＤマーカーの部分にだけパイログラムのピークが現れることを確認することができた。
【００７５】
実施例２：多重ＨＰＶジェノタイピング
実施例１で作製したＨＰＶ ＩＤシーケンスを利用して、多重ＨＰＶ感染に係るジェノタイピングを確認した。
（１）ＨＰＶの４つタイプ多重タイピング
４通りのＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、３３、３１、６６）に対するゲノムＤＮＡを鋳型として、各々をＧＰ５プラスプライマーとＧＰ６プラスプライマーを利用してＰＣＲで増幅した後、各タイプに対するＰＣＲ産物を１：１の割合で混合した混合物を鋳型として、ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマーと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマーを利用してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＴ７プライマーを利用してパイロシーケンスを行った。
その結果、図２０のａ）に示したように、理論的に予測した結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００７６】
（２）ＣａＳｋｉ細胞株とＨｅＬａ細胞株を利用したＨＰＶ多重ジェノタイピング
ＨＰＶタイプ１６に感染したＣａＳｋｉ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５０（商標））のゲノムＤＮＡとＨＰＶタイプ１８に感染したＨｅＬａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２（商標））のゲノムＤＮＡを同量混合（１０ｎｇ：１０ｎｇ）して鋳型とし、ＧＴ−ＨＰＶ１５タイプと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー使って、ＰＣＲを行った後、前記ＰＣＲ産物をＴ７シーケンスプライマーを利用してＩＤシーケンスのパイロシーケンスを行った。
その結果、図２０のｂ）に示したように、ＣａＳｋｉ細胞１個当たり含まれた、ＨＰＶタイプ１６のコピー数は約６００コピーと知られており、ＨｅＬａ細胞１個当たり含まれたＨＰＶタイプ１８のコピー数は、約５０コピーと知られており、理論的に予測した結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００７７】
（３）子宮頸部臨床試料（cervical scraps samples）対象ＨＰＶ多重ジェノタイピング
子宮頸部細胞検査試料でｇＤＮＡを抽出して、ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶ多重ジェノタイピングと一般シーケンス結果を比較した場合、多重感染時シーケンス結果がない試料を排除して比較して、二つの結果が１００％一致するということが分かった（表４、表５）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
実施例３：ＩＤシーケンスを利用したＫＲＡＳ突然変異検出法
本発明のＩＤシーケンスを利用して、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を確認するために、ＫＲＡＳの３通りの突然変異である、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）に対するＩＤシーケンスをデザインした（表６）。
【００８１】
【表６】
【００８２】
また、前記３種のＩＤシーケンスのシーケンス末端には、各々対応するＫＲＡＳ変異に特異的な塩基配列を連結して、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して、３個の互いに異なるＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表７）。
【００８３】
【表７】
【００８４】
試料として使われたＩＤシーケンスに該当する突然変異に対する鋳型は、遺伝子合成を介して（ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）作製し、細胞株はＫＲＡＳ正常細胞株Ｃａｃｏ２と突然変異細胞株Ａ５４９、ＨＣＴ１１６を使った。
【００８５】
【表８】
【００８６】
前記４種のＫＲＡＳフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマーを利用して次の通りＰＣＲを行った後、パイロシーケンスを行った。
９５℃５分−［９５℃（０．５分）、６０℃（０．５分）、７２℃（０．５分）］×４０サイクル−７２℃（１０分）−４℃維持。
【００８７】
ＫＲＡＳ正常細胞株と突然変異（mutant）細胞株、ＩＤシーケンスで検出できるＫＲＡＳ ｍｕｔａｎｔ ｐｌａｓｍＩＤを鋳型と利用して、ＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ突然変異を検出した（図２１）。
その結果、各突然変異株に該当する特異ＩＤマーカーの部分にだけパイログラムのピークが現れることを確認することができた。
【００８８】
ＩＤシーケンス基盤ＫＲＡＳ変異検出法で多重突然変異検出が可能であるかを、前記３通りのＫＲＡＳ突然変異ＤＮＡを利用して同じ割合で混合した後、パイロシーケンスで検出した。
その結果、図２２に示したように、理論的に予測可能な結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００８９】
また、実際ＩＤシーケンス基盤ＫＲＡＳ多重突然変異検出法が実際臨床試料に適用されるかを大腸癌組織試料ｇＤＮＡを利用してテストして、１２人の試料に対してテストした結果、３人の患者で突然変異を検出でき、これに対する代表的なパイログラムを図２３に示した。
【００９０】
実施例４：ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルス感染検出
新種インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、季節インフルエンザＡ（Ｈ１型、Ｈ３型）、Ｂウイルスは、流行る時期が重なって感染症状が似ているが、治療剤の抗ウイルス剤に対して、ウイルスタイプ毎の治療効果が異なるため、ウイルスタイプを正確に区分検査して治療することが好ましい。そこで、ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルスジェノタイピング方法を開発した。
本実施例では代表的な呼吸器ウイルスであるインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の感染を検出した。前記５種の呼吸器ウイルスに対するＩＤシーケンスを表９のようにデザインした。
【００９１】
【表９】
【００９２】
前記５種のＩＤシーケンスの３’末端には対応する呼吸器ウイルスに特異的な塩基配列を連結して、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して、５種のＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表１０）。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
本実施例の呼吸器ウイルス検出方法は、ウイルス感染細胞で、前記５種のＧＴ−呼吸器ウイルス５タイプフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマー（表１１）を利用して、ｃＤＮＡを合成した後、表１０に示したＧＴ−ＲｅｓｐｉＶｉｒｕｓ ＩＤプライマーと５’ビオチン化Ｍ１３リバースプライマーを利用して特異的にウイルスを増幅して、パイロシーケンスで検出する方法である（図２４）。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
本実施例では、前記ウイルス遺伝子に対して必要部分を遺伝子合成（gene synthesis）し、前記合成されたウイルス遺伝子を鋳型として、多重ＰＣＲ（multiplex PCR）を行った後、パイロシーケンスで検出した。
その結果、図２５に示したように、理論的に予測可能な結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００９７】
多重感染に対するテストも、ウイルス遺伝子鋳型を同じ割合で混合した後、多重ＰＣＲを行った後、パイロシーケンスで検出時に正常に作動することを確認した（図２６）。
【００９８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
以上述べたように、本発明のＩＤシーケンスを利用すると、遺伝型毎に独特かつ簡潔なパイログラムを取得でき、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子を簡単かつ効率的にジェノタイピングすることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジェノタイピング方法に関し、より一層詳しくは遺伝子型毎に付されるＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスを利用した多重ジェノタイピング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性生物体を検出するための方法は、伝統的な培養方法による物理的・化学的特徴を確認する方法から始まり、病原体の特異的な遺伝的特性を検出する方法に発展して来ており、遺伝的特性を検出する方法には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）分析、パルスフィールド電気泳動、任意プライム重合酵素連鎖反応（arbitrarily-primed polymerase chain reaction：ＡＰ−ＰＣＲ）、反復配列基礎ＰＣＲ（repetitive sequence-based PCR）、リボタイピング（ribotyping）及び比較核酸配列決定法（comparative nucleic acid sequencing）等がある。このような方法は概して時間がかかり、高価であり、再現不可能であり、熟練した技術を要するため、殆どの診断環境には使用不可能である。前述した方法は、すべて通常煩雑な電気泳動段階が必要であり、病原体を培養してゲノムＤＮＡを精製すべきで、一種類以上の検出対象を含有する場合、検出結果がまともに出てこない場合が多い。このような制約は最近開発された高密度マイクロアレイ法による検出方法にいおいても同様である（Salazar et al., Nucleic Acids Res. 24:5056-5057, 1996; Troesch et al., J. Clin. Microbiol. 37:49-55, 1999; Lashkari et al., Proc. Natil. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13057-13062, 1997）。一方、パイロシーケンスは、伝統的なサンガー（Sanger）法によったシーケンスとは異なり、ＤＮＡ合成によってシーケンスする方法で、ヌクレオチドが重合されながら放出されるピロリン酸塩（pyrophosphate）を検出する方法で、ポリメリゼーション（Polymerization）時に４個のデオキシヌクレオチド三リン酸塩（deoxynucleotide triphosphates:ｄＮＴＰｓ）を一度に一つずつ順次入れて反応させる。重合されるｄＮＴＰに付いているＰＰｉは、酵素反応で光を発生し、発生した光は順次入った各々のｄＮＴＰの反応順にシグナルピークを現し、そのピークは各々のｄＮＴＰが反応した数に比例して高くなったり低くなったりするパターンを示して、塩基配列を決めることができる技術であり、最近では臨床試料で病原体に特異的な配列を、ＰＣＲ産物をパイロシーケンスを利用して形成されるパイログラム（pyrogram）で確認して、病原性菌または、ウイルスを検出する方法が使われている（Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007）。
【０００３】
しかし、パイロシーケンス手法では、ｄＮＴＰｓをいれる順序である分配順序（dispensation order）に従ってシーケンスが進められ、鋳型に分配順序にない配列は、反応が起きなくなってピークが形成されないが、同じ配列が連続的に出てくると、放出される光の量に応じてピーク高さが形成される特性を持っている。従って多種類の病原体が同一試料内に存在する場合、塩基配列の構成により、多数の病原体の塩基配列のピークが重なるように現れることになって、パイログラム判読を介した遺伝型確認が困難であり、特に反復される配列の個数が増加すると、前に位置する配列のピークが相対的に低くなる特徴があって、多重の病原体が感染している場合、各病原体の感染程度により、分別しようとするピークを確認することが難しいという欠点がある。
【０００４】
そこで、本発明者等は、パイロシーケンスを利用してジェノタイピングを実施するに当たり、タイピングしようとする遺伝型が独特かつ簡潔なパイログラムを持つようにしようと鋭意努力した結果、タイピング対象の特異配列とは独立的に存在すると共に、ＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークを持つＩＤシーケンスをタイピング対象の特異配列と繋げてパイロシーケンスすると、遺伝型毎に独特かつ簡潔なパイログラムが得られることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、タイピングしようとする遺伝型が独特かつ簡潔なパイログラムを持つようにパイロシーケンスするのに有用なＩＤシーケンスを提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したジェノタイピング方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶのジェノタイピング方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用したＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルスの検出方法を提供するところにある。
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明はＡ（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスを提供する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストで；Ｅは前記サインポスト（signpost）の単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで；及びｎは１〜３２の自然数である。
【０００７】
本発明はまた、ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスを提供する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【０００８】
本発明はまた、前記ＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記ジェノタイピング用プライマーを利用するジェノタイピング方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】分配順序に従ってパイロシーケンスが行われる過程及びパイログラムを示す。
【図２】分析配列に応じたパイログラムのピーク変化を示す。
【図３】分析配列に応じたパイログラムのピーク変化を示す。
【図４】サインポストの挿入によるパイログラムのピーク変化を示す。
【図５】２種類分析配列が混ざり合っている時のパイログラムを示す。
【図６】分配順序でサインポストの有無によるパイログラムを示す。
【図７】サインポスト後方の配列変化によるパイログラムを示す。
【図８】エンドマークがない場合のパイログラムを示す。
【図９】エンドマークがある場合のパイログラムを示す。
【図１０】サインポスト順序の変化による分配順の変化を示す。
【図１１】分配順序に従ってＩＤシーケンスをデザインする方法を示す。
【図１２】分配順序のデザイン方法を示す。
【図１３】分配順序に従ってＩＤシーケンスが現れるパイログラムを示す。
【図１４】分配順序を決めた後、ＩＤシーケンスをデザインする方法を示す。
【図１５】分配順序に従って現れるＩＤシーケンスのパイログラムを示す。
【図１６】本発明のＩＤシーケンスを利用してＨＰＶをジェノタイピングする方法を示す。
【図１７】一般的なＫＲＡＳ変異検出システムを示す。
【図１８】本発明のＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ変異を検出する方法を示す。
【図１９】本発明のＩＤシーケンスを利用して１５種のＨＰＶをジェノタイピングした結果を示す。
【図２０】本発明のＩＤシーケンスを利用して２種以上の多重ＨＰＶをジェノタイピングした結果を示す。
【図２１】本発明のＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２２】本発明のＩＤシーケンスを利用して多重ＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２３】本発明のＩＤシーケンスを利用して大腸癌組織でＫＲＡＳ変異を検出した結果を示す。
【図２４】本発明のＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルス感染検出方法を示す。
【図２５】本発明のＩＤシーケンスを利用して５種の呼吸器ウイルスの単一感染検出結果を示す。
【図２６】本発明のＩＤシーケンスを利用して５種の呼吸器ウイルスの多重感染検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の他の特徴及び実施態様は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【００１５】
一観点において、本発明は、Ａ（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスに関する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストで；Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで；及びｎは１〜３２の自然数である。
【００１６】
他の観点において、本発明は、ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスに関する：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【００１７】
本発明の「ＩＤシーケンス」は、各遺伝子が固有に保存している特異的配列でなく、本発明に係るジェノタイピング方法において、各遺伝子型毎に独特に付することができる人為的に作製された塩基配列をいう。
本発明において前記「隣接したＩＤマーク」は、サインポストの前方または後方に位置したＩＤマークを意味する。
【００１８】
本発明のＩＤシーケンスは、パイロシーケンスを行う際に、パイログラムが次に出てくる配列によって影響されず独特の位置にピークが形成されるようにするサインポストとエンドマーク（endmark）を利用して、決まった分配順序（dispensation order）に従って、単一塩基配列（one nucleotide）に区別されるようにするために使われる。
【００１９】
この過程において、分配順序に従って個々の独特のピークを形成する単一塩基配列をＩＤマークといい、ＩＤマークが単一ピークを形成するために必要な配列のサインポストとエンドマークを含む配列をＩＤシーケンスという。１個のサインポストと１個のエンドマークを利用して、ＩＤマークの次に出てくる遺伝子の配列に影響を受けなくなるＩＤマークは３種類になり、従って、ジェノタイピングできる個数は３種類である。３種類以上の多重遺伝型検査（multiple genotyping）を行うためには、サインポストとＩＤマークを追加すれば良い。
【００２０】
一般的なパイロシーケンスでは、分配配列によりシーケンスが進められ、鋳型に分配配列（dispensation order：ＤＮＡ合成時ヌクレオシドが入る順序）にない配列があれば、反応が起きないためピークが形成されないが、同じ配列が連続的に存在すれば、放出される光量に応じてピークの高さが形成される特性を持っている（図１）。
【００２１】
１個の塩基を分析配列で利用すると、パイログラム上で４種類の相違するピークで区別できると考えられるが、実際には分析配列の次にくる配列はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中の一つであるため、少なくとも一つの場合は多重ピーク（同じ配列が繰り返してくる場合、一つの大きい多重ピークを形成する）を形成するしかないため、結果的に、単一塩基で単一ピークを区別できる方法は最大三つしか存在しない（図２）。
【００２２】
また、分析配列以後に出てくる配列によって望まないピークが形成されることになり、分析配列以後に反復された塩基が連続的にある場合、重合反応が一度に起きるため、単一ピークが形成されるか、この反応で発生する発光量が増加するため、ピークの高さが比例的に増加する特性を持って、このような反復配列がある場合、相対的に単一塩基で存在すピークの高さは減少する現象が現れる（図３）。このような問題があるため、単一塩基を利用した多重ジェノタイピングに限界があり、これを解決するために、本発明のＩＤシーケンスでは次に位置する配列によって分析される配列のピークが影響を受けないよう、「分析配列」を分離させて、次の追加的な分析が可能にする分離配列を「サインポスト」と命名した（図４）。
【００２３】
また、前記サインポスト配列によりパイロシーケンスの分配順序（dispensation order）の設定が変わることになる。
２塩基で構成された一つの分析配列で１個の塩基配列をサインポストに設定すれば、残りの１個の塩基配列位に３個の塩基が各々位置することができ（同じ配列がくる場合は、ピークが重なるため、サインポストで配分された１個の塩基を除いた３個の塩基が残り一つの塩基位に位置することができる）、サインポストの前に位置した塩基は、図４のように分析配列以後に出てくる配列に影響を受けずにピークを独立的に、分離が可能に設定することができる。
【００２４】
前記分析配列でサインポストによって分離した単一塩基を「ＩＤマーク（ID mark）」と命名し、図４に示したように１個のＩＤマークと１個のサインポストを利用して三つのタイプに対する多重ジェノタイピングが可能になる。この時、分配順序（dispensation order）でサインポストの位置は、ＩＤマークの後に位置するようにする（サインポストの前に位置したＩＤマークだけが分析配列以後に出てくる後方配列に影響を受けないため）。
【００２５】
本発明の一様態で、単一塩基のＩＤマークと１個のサインポストからなる２塩基の分析配列をジェノタイピングするために、図５に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）、タイプ２（分析配列：ＴＣ）及びタイプ３（分析配列：ＧＣ）の分析配列を合成して、パイロシーケンスして、タイプ１では分配配列により分配配列１番にＡのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになり、タイプ２では分配配列２にＴのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになる。タイプ３では分配配列３にＧのピークが現れ、分配配列４にＣのピークが現れることになる。ここで、分析配列中最初の塩基の配列であるＡ、Ｔ、Ｇは、各々ＩＤマークで、分析配列中二番目の塩基配列である共通したＣはサインポストである。
【００２６】
前記３つのタイプの分析配列を多重ジェノタイピングするために、図５の（ａ）に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）とタイプ２（分析配列：ＴＣ）を混ざり合ったサンプルを、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスした結果、分配配列１でＡのピークが現れ、分配配列２でＴのピークが現れ、分配配列３ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのタイプ１とタイプ２の二タイプで全部反応して現れるため、ＡとＴのピークより２倍の大きさで現れることになる。
【００２７】
同様に、図５の（ｂ）で、タイプ１（分析配列：ＡＣ）とタイプ３（分析配列：ＧＣ）が混ざり合ったサンプルでは、分配配列１でＡのピークが現れ、分配配列３でＧのピークが現れ、分配配列２ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのピークは２倍で二タイプで全部存在するため、反応が２倍で現れてピークの大きさも２倍になる。
【００２８】
さらに、図５の（ｃ）で、タイプ２（分析配列：ＴＣ）とタイプ３（分析配列：ＧＣ）が混ざり合ったサンプルでは、分配配列２でＴピークが現れ、分配配列３でＧのピークが現れ、分配配列１ではピークが現れず、分配配列４ではサインポストであるＣのピークが現れることになり、この時、サインポストであるＣのピークは２倍で二タイプで全部存在するため、反応が２倍で現れてピークの大きさも２倍になることになる。
【００２９】
従って、サインポストによってＩＤマークは以後の配列と分離して独立的に存在できるため、多重ジェノタイピング時に有用である。
「ＩＤマーク」と「サインポスト」で構成された分析配列を利用したパイロシーケンスで分配配列にサインポストの配列を挿入してもしなくてもジェノタイピングの結果には差がないが、サインポストの配列を分配配列に挿入しなかった場合、機械的な誤りを判断できない短所がある（図６）。従って、分配配列にはサインポストの配列を挿入してパイロシーケンスが正常に進行されたかを判断できるようにすることが好ましい。また、パイロシーケンス時に多重ジェノタイピング時にＩＤマークのピークは、サインポストのピークより大きくはならないため、これもパイロシーケンスの誤りを判断する基準になることができる（図６）。
【００３０】
エンドマーク
サインポストは、単一塩基ＩＤマークと後方の配列を分離させて、ＩＤマークピークが後方配列の影響を受けないようにする役割を果たす。しかし、サインポストも、後方に来る配列がサインポストと同じ場合に検出される発光量の増加によるピークの高さが比例的に増加するため、これによって、前方のＩＤマークのピークの高さが変わる現象が生じる（図７）。このような現象を解決するために、ＩＤマークとサインポストが次に連結される配列に影響を受けないようにするために、サインポストとは異なった塩基配列をサインポストの後方に挿入することができ、この時挿入される配列を「エンドマーク」と命名し、前記エンドマークは分配配列（dispensation order）に挿入されない。前記「エンドマーク」はＩＤマークとサインポストが後方に連結される配列によって影響を受けなくして、一定の高さのピークを作る役割を果たす。
【００３１】
即ち、エンドマークがない場合は、図８に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）の次にＣＡが来る場合、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスすると、サインポストであるＣの次に重なるＣのために、分配配列１位のＡピークより分配配列３位のＣピークが大きくなる。同様に、タイプ３（分析配列：ＧＣ）の次にＣＣが来る場合には、サインポストであるＣの次にＣが３度重なって、分配配列３のＧのピークが大きくなりすぎた分配配列４のＣのピークによってずっと小さくなる。
【００３２】
エンドマークがある場合には、図９に示したように、タイプ１（分析配列：ＡＣ）の次にＣＡが来る場合、その間にエンドマークでＴが挿入され、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの分配配列（dispensation order）でパイロシーケンスすると、サインポストであるＣの次にＴが割り込んでＣが重ならず、分配配列１位のＡピークと分配配列３位のＣピークの高さが一定になる。同様に、タイプ３（分析配列：ＧＣ）の次にＣＣが来る場合にも、サインポストであるＣの次にエンドマークであるＴが挿入されて、サインポストの後にＣが重ならないため、分配配列３のＧのピークと分配配列４のＣのピークの高さが同一になる。本発明において、追加できるサインポストの個数Ｎは、２〜３２であることが好ましく、Ｎが３２の場合、６５種類の多重ジェノタイピングが可能である。
【００３３】
複数のＩＤマークと複数のサインポストを利用すると、３タイプ以上のジェノタイピングが可能である。
【００３４】
この場合にも、単一ピークのパイログラムを得るために、隣接した塩基配列間には、互いに異なる塩基で構成されなければならない。ＩＤマークは、サインポストの前方や２個のサインポストの間に置かれ、サインポストの間に置かれたＩＤマークは、両側のサインポストと異なった塩基配列を持たなければならないため、２種の異なる塩基であって、サインポストの前方に位置したＩＤマークの場合は後方に位置したサインポストと異なる塩基配列を持つだけでよく、３種の異なる塩基である。
【００３５】
この時、サインポスト１の塩基配列とサインポスト２の塩基配列は一致してはいけなく、最後方のサインポストの塩基配列とエンドマークの塩基配列も一致してはいけない。
【００３６】
ＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークで構成される配列を「ＩＤシーケンス」と命名し、本発明でＩＤシーケンスは、ＩＤマーク及びサインポストで構成され、好ましくはＩＤマーク、サインポスト及びエンドマークで構成される。
本発明のＩＤシーケンスは、サインポストが１個追加される度に２個のタイプを追加的に区別できることになる。従って、２Ｎ＋１個（Ｎ＝サインポストの個数）のＩＤマークの位置によりジェノタイピングで区別することができる。
【００３７】
１個のＩＤマークとエンドマークを除いた残りの塩基配列は、サインポストで使われる塩基配列で、ＩＤシーケンス内のＩＤマークを同じ分配順序で区別しようとするなら、ＩＤシーケンス内でサインポストの塩基配列は同じ順序に置かれなければならない。即ち、ＩＤマークの位置だけサインポストの前や間に置かれることになり、サインポストの配列順序は同じでなければならない。それは、パイロシーケンスの特性上、サインポスト配列が異なると分配順も変わるためである（図１０）。
【００３８】
ＩＤシーケンスデザイン
サインポストを定めた後、ＩＤシーケンスを作る場合
２個のサインポストで構成する場合、まず、ＴとＧを各々サインポスト１及びサインポスト２で使用するなら、サインポスト１（Ｔ）の前面に置かれるＩＤマーカーは、Ａ、Ｇ及びＣ中いずれか一つであり、サインポスト１とサインポスト２の中間に位置するＩＤマーカーは、ＡまたはＣであり、エンドマーカーは、Ａ、Ｔ及びＣ中いずれか一つである。
【００３９】
従って、図１１に示したように、前記の通りに構成されるＩＤマーカーとサインポスト、エンドマーカーで構成されるＩＤシーケンスでＩＤマークを１個として生成できる場合は、五つで、サインポスト１の前に位置するＩＤマーカーを作る三つの場合（Ａ、Ｇ及びＣ）と、サインポスト１とサインポスト２との間に位置するＩＤマーカーを作る二つの場合（Ａ及びＣ）がある。
この時、エンドマークは分配順序に入らないため、ＩＤシーケンスでエンドマークが同じか互いに異なってもよい。
【００４０】
分配順序（dispensation order）のデザイン
ＩＤシーケンスを利用したジェノタイピングでは、分配順序に従って、ＩＤシーケンスに位置するＩＤマークが順次に独立的なピークを形成することになり、分配順序はサインポストを境界に形成できる種々の順列によりデザインできる。
前記ＩＤシーケンスにより形成できる分配順序中の一つは、次にと図面のようになり、エンドマークは分配順序に入らない。
【００４１】
図１２には、前記ＩＤシーケンスにより可能な１２個の分配順序を示し、前記１２個の可能な分配順序症中一つを選択して使うことができる。
分配順序の個数は、４ｘ６Ｎ（Ｎ＝サインポスト個数）通り形成される。従って、サインポストが２個の場合、１４４通りの分配順序を作ることができる。
従って、図１３に示したように、ＩＤシーケンスは分配順序に従って、固有のピークを持つことになる。
【００４２】
分配順序を決定後、ＩＤシーケンをスデザインする方法
ＩＤシーケンスは、１個のＩＤマークと１個以上のサインポスト中少なくとも１個のエンドマークで構成され、隣接した塩基配列は互いに異なるべきで、分配順序も、同じ条件を持つべきであり、分配順序を先に決めた後、ＩＤシーケンスをデザインしてもよい。
【００４３】
分配順序でサインポスト１の前には３個のＩＤマーカーが置かれ、２個のサインポストの間には２個のＩＤマークが置かれることになるため、この規則を利用すれば分配順序を持って次のようなＩＤシーケンスを作ることができる。
例えば、９通りの遺伝子型を分離しようとすると、（２Ｎ＋１）の公式に従って４個のサインポストが必要で、図１４に示したように、分配順序をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃをｎ回繰り返すように決めた場合、サインポストは、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａになり、エンドマークはＴになり、サインポストの間に位置した配列が、ＩＤマークになって、ＩＤシーケンスを作製することができ、分配順序のとおりパイロシーケンスを行うと、図１５に示されたような結果が得られる。
【００４４】
また他の観点において、本発明は、前記ＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーに関する。
【００４５】
本発明において、前記ジェノタイピング用遺伝子特異配列は、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的な配列であることを特徴とし、前記プライマーはパイロシーケンスを容易にするため、５’末端側にシーケンス用プライマー配列を追加で含有することを特徴とする。
【００４６】
また他の観点において、本発明は、前記ジェノタイピング用プライマーを利用するのを特徴とするジェノタイピング方法に関する。
【００４７】
本発明のＩＤシーケンスを使ったジェノタイピング用プライマーは、分配形式を使う全シーケンスを利用したジェノタイピング方法に多様に応用可能で、好ましくはパイロシーケンス方法または半導体シーケンス方法が使えるが、これに限定されない。
【００４８】
本発明において、前記パイロシーケンス方法は、シーケンス過程で発生するｐｐｉ（pyrophosphate）の分解反応から生じる光を検出する方法で、半導体シーケンス（smiconductor sequencing）は、シーケンス過程で発生するプロトン（proton：Ｈ＋ｉｏｎ）による電流変化をチップ（chip）で分析する方法である（Andersona, Erik P. et al., Sens Actuators B Chem.; 129(1): 79, 2008)。
【００４９】
本発明において、（ａ）ジェノタイピング対象遺伝子により、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）前記デザインされたＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを利用してジェノタイピング対象遺伝子鋳型を増幅させて、ＰＣＲ産物を取得する段階；及び（ｃ）前記ＰＣＲ産物をパイロシーケンスしてＩＤシーケンスをシーケンスする段階を含むことを特徴とする。
【００５０】
また他の観点において、本発明は、（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法に関する。
【００５１】
本発明において、前記ウイルス遺伝子型の特異配列は、配列番号１〜１５で表される塩基配列中から選択されることを特徴とする。
ＨＰＶ（human papilloma virus）は、ヒトの皮膚や粘膜に感染する最も一般的なウイルスの一つであり、現在まで約１５０以上のタイプが知られており、これらの中３０種余りが性器接触を介して感染し、ＨＰＶウイルスによる癌発病率の８５％程度が子宮頸癌と関連がある。性器に感染する３０種余りのウイルス中１５タイプが子宮頸癌を引き起こす高危険群と知られている。子宮頸癌は、韓国の場合、女性癌発病率６位に該当して、パパコロニー塗抹（Pap smears）は感度と再現性が悪く、癌の状態を把握するのに問題点があり、頻繁に起きる試験のための費用負担も大きく作用する。現在までＦＤＡの許可を受けたＨＰＶ検査方法としては、ＨＹＢＲＩＤＣＡＰＴＵＲＥＩＩがあるが、この方法はＨＰＶ感染有無だけ診断し、どのタイプのＨＰＶが感染したかについては分からない。
【００５２】
ＨＰＶは、遺伝型毎に癌誘発率、癌タイプ、癌転移過程が異なるため、ジェノタイピングによって患者が感染したＨＰＶの遺伝型を分かることは重要である。例えば、ＣＩＮ ＩＩＩ＋の場合、ＨＰＶタイプ１６が５５％を占め、ＨＰＶタイプ１８が１５％を占めると報告され、その他３０％の場合も残りの高危険群１３タイプＨＰＶと関連があると報告された。
【００５３】
ＨＰＶをジェノタイピングする最も重要な理由は、遺伝型特異的ＨＰＶ感染をモニタリングできることであり、高齢女性の場合、感染の持続期間が若い女性より普通長いが、これは過去に長期間の感染の可能性が大きいためである。どの位の持続期間が重要であるかは臨床的に定められていないが、普通１年以上持続する場合、危険性が増加すると知られている。勿論ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８を検査することが重要であるが、発癌性ＨＰＶタイプの持続的な感染を検査することが最も重要である。
【００５４】
本発明の実施例では、ＩＤシーケンスを利用して１５種のＨＰＶウイルスをジェノタイピングした。ＨＰＶウイルスで１５種のウイルスで特異配列を持つＨＰＶ Ｌ１部位と９種のＩＤシーケンス及びシーケンス用プライマー部位を含有するプライマー（ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマー）と５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー（5’biotinylated GP6 plus primer）を利用して、各々１５種のＨＰＶウイルスゲノムを増幅させたＰＣＲ産物をパイロシーケンスした結果、１５種のウイルスに対する１５種のＩＤシーケンスのパイログラムが得られた（図１６）。
【００５５】
本発明のさらに他の実施例では、ＨＰＶタイプ１６に感染したＣａＳｋｉ細胞株のゲノムＤＮＡ（genomic DNA）とＨＰＶタイプ１８に感染したＨｅＬａ細胞株のゲノムＤＮＡを同量混合したサンプルをＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマーと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマーで増幅させたＰＣＲ産物をパイロシーケンスした結果、重複ピークの干渉がなくきれいなＨＰＶタイプ１６及びＨＰＶタイプ１８に該当するＩＤシーケンスのパイログラムを確認することができた。
【００５６】
また他の観点において、本発明は、（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法に関する。
【００５７】
Ｒａｓ遺伝子はラットで肉腫を引き起こすレトロウイルスの癌誘発遺伝子（oncogene）として初めて発見されたが、１９８５年にすい臓癌患者のリンパ節でＫＲＡＳの存在が知らされて以来、多様な研究が行われている。この癌遺伝子（oncogene）の突然変異は、人体の悪性突然変異中に頻繁に発見される遺伝子の一つである。この遺伝子と構造と機能が類似する遺伝子は、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓまた癌遺伝子として知られている。ＫＲＡＳのコドン１２、１３、６１の突然変異は、蛋白質活性に影響を与えて過度の活性を誘発することになる。
【００５８】
ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、消化器系の腺癌（adenocarcinoma）で発見され、すい臓の腺癌の場合、膵液と膵臓組織等で９０％の突然変異を発見することができ、これらの多くはコドン１２の変異と知られており、大腸癌では４０〜４５％で発見されるが、化学治療に反応がない、進行された結腸癌に使われるセツキシマブ（cetuximab）またはペニツムマブ（panitumumab）のような薬物に対する反応性の減少とも関連があると知られている。また、５〜３０％の非小細胞肺癌で観察され、喫煙歴がある患者で主に観察され、ＥＧＦＲ突然変異とは相互排他的に発見される。
【００５９】
野生型ＫＲＡＳ存在下、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）の三種類の突然変異は、一般的なパイロシークエンス方法では検出に限界がある。特に、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）突然変異は、発生頻度が高いため、検出限界のために排除が難しい（図１７）。
【００６０】
本発明の一実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３番の突然変異を検出する方法を開示した。本発明では、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）の三種類の突然変異に対して特異的に結合するプライマーを考案して、この３種類のプライマー特異的な塩基配列の前に固有ＩＤシーケンスを利用して検出できるように考案し、本発明の方法によると、４種類のフォワードプライマー（forward primer）と一種類のビオチン化リバースプライマー（biotinylated reverse primer）を利用して１回のＰＣＲ過程で１２種類のＫＲＡＳ突然変異を検出することができる（図１８）。
【００６１】
本発明において、前記ＫＲＡＳ遺伝子変異の特異配列は、配列番号３４〜３５で表される塩基配列中から選択されることを特徴とする。
【００６２】
また他の観点において、本発明は、（ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法に関する。
【００６３】
本発明の一実施例で、呼吸器ウイルス検出方法は、前記５種の呼吸器ウイルスに対して特異的に結合するプライマーを考案して、この３種類のプライマー特異的な塩基配列の前に固有ＩＤシーケンスを利用して検出できるように考案し、前記５種のＧＴ−呼吸器ウイルス５タイプフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマーを利用して、ｃＤＮＡを合成した後、ＧＴ−ＲｅｓｐｉＶｉｒｕｓＩＤプライマーと５’ビオチン化Ｍ１３リバースプライマーを利用して特異的にウイルスを増幅してパイロシーケンスで検出する方法である
【００６４】
本発明において、各呼吸器ウイルス遺伝子型の特異配列は、インフルエンザＡウイルスの場合は、配列番号４１、インフルエンザＢウイルスの場合は、配列番号４２、ＲＳＶ Ｂの場合は、配列番号４３、リノウイルスの場合は、配列番号４４、及びコロナウイルスＯＣ４３の場合は、配列番号４５で表される塩基配列であることを特徴とする。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６６】
実施例１：ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶジェノタイピング
本発明のＩＤシーケンスを利用して子宮頸癌原因ウイルスである高危険群のＨＰＶの遺伝子をタイピングした。
１５通りの高危険群ＨＰＶに対するＩＤシーケンスを表１のようにデザインした。
【００６７】
【表１】
【００６８】
前記１５種のＩＤシーケンスの３’末端には対応する各々対応するＨＰＶタイプに特異的な塩基配列を連結し、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して１５個の互いに異なるＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表２）。
【００６９】
【表２】
【００７０】
前記１５種のＨＰＶウイルスらは韓国人女性の子宮頸部細胞診検体（忠南（チュンナン）大学病院産婦人科）からゲノムＤＮＡを抽出した後、ＨＰＶ ＤＮＡチップを利用して感染した遺伝型を確認し、ＨＰＶウイルスのＬ１遺伝子をＰＣＲ増幅して得られる。
臨床試料からＨＰＶの感染の有無を判断するためのＰＣＲプライマーとして、ＧＰ５プラスプライマーとＧＰ６プラスプライマーを利用した。
【００７１】
【表３】
【００７２】
前記１５種のＨＰＶウイルスを各々鋳型として、表２に示した１５種のＰＣＲプライマーを同じ割合で混ぜてフォワードプライマー（ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマー）として使い、５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー（パイオニア、韓国）をリバースプライマーとして使って次の条件でＰＣＲを行った：
９５℃１５分−［９５℃（０.５分）、４５℃（０.５分）、７２℃（０.５分）］×４５サイクル−７２℃（１０分）−４℃維持。
【００７３】
前記ＰＣＲ産物には共通のシーケンスプライマー結合部位を含んでいる。本実施例では、一般的に多く使用するＴ７プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ −３’）を利用しており、このＴ７プライマーを利用してＩＤシーケンスのパイロシーケンスを行って、パイログラムを分析してＨＰＶをタイピングした（図１９及び図２０）。
【００７４】
分配順序でＨＰＶのタイプにより形成されるＩＤマークの位置を図１７の上方に示し、赤色で示したピークは、ＩＤマークで、青色で示したピークはサインポストである。
その結果、１５種のウイルスに該当する特異ＩＤマーカーの部分にだけパイログラムのピークが現れることを確認することができた。
【００７５】
実施例２：多重ＨＰＶジェノタイピング
実施例１で作製したＨＰＶ ＩＤシーケンスを利用して、多重ＨＰＶ感染に係るジェノタイピングを確認した。
（１）ＨＰＶの４つタイプ多重タイピング
４通りのＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、３３、３１、６６）に対するゲノムＤＮＡを鋳型として、各々をＧＰ５プラスプライマーとＧＰ６プラスプライマーを利用してＰＣＲで増幅した後、各タイプに対するＰＣＲ産物を１：１の割合で混合した混合物を鋳型として、ＧＴ−ＨＰＶ１５タイププライマーと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマーを利用してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＴ７プライマーを利用してパイロシーケンスを行った。
その結果、図２０のａ）に示したように、理論的に予測した結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００７６】
（２）ＣａＳｋｉ細胞株とＨｅＬａ細胞株を利用したＨＰＶ多重ジェノタイピング
ＨＰＶタイプ１６に感染したＣａＳｋｉ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５０（商標））のゲノムＤＮＡとＨＰＶタイプ１８に感染したＨｅＬａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２（商標））のゲノムＤＮＡを同量混合（１０ｎｇ：１０ｎｇ）して鋳型とし、ＧＴ−ＨＰＶ１５タイプと５’ビオチン化ＧＰ６プラスプライマー使って、ＰＣＲを行った後、前記ＰＣＲ産物をＴ７シーケンスプライマーを利用してＩＤシーケンスのパイロシーケンスを行った。
その結果、図２０のｂ）に示したように、ＣａＳｋｉ細胞１個当たり含まれた、ＨＰＶタイプ１６のコピー数は約６００コピーと知られており、ＨｅＬａ細胞１個当たり含まれたＨＰＶタイプ１８のコピー数は、約５０コピーと知られており、理論的に予測した結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００７７】
（３）子宮頸部臨床試料（cervical scraps samples）対象ＨＰＶ多重ジェノタイピング
子宮頸部細胞検査試料でｇＤＮＡを抽出して、ＩＤシーケンスを利用したＨＰＶ多重ジェノタイピングと一般シーケンス結果を比較した場合、多重感染時シーケンス結果がない試料を排除して比較して、二つの結果が１００％一致するということが分かった（表４、表５）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
実施例３：ＩＤシーケンスを利用したＫＲＡＳ突然変異検出法
本発明のＩＤシーケンスを利用して、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を確認するために、ＫＲＡＳの３通りの突然変異である、コドン１２（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）、コドン１３（ＧＧＣ＞ＴＧＣ及びＧＧＣ＞ＧＣＣ）に対するＩＤシーケンスをデザインした（表６）。
【００８１】
【表６】
【００８２】
また、前記３種のＩＤシーケンスのシーケンス末端には、各々対応するＫＲＡＳ変異に特異的な塩基配列を連結して、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して、３個の互いに異なるＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表７）。
【００８３】
【表７】
【００８４】
試料として使われたＩＤシーケンスに該当する突然変異に対する鋳型は、遺伝子合成を介して（ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）作製し、細胞株はＫＲＡＳ正常細胞株Ｃａｃｏ２と突然変異細胞株Ａ５４９、ＨＣＴ１１６を使った。
【００８５】
【表８】
【００８６】
前記４種のＫＲＡＳフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマーを利用して次の通りＰＣＲを行った後、パイロシーケンスを行った。
９５℃５分−［９５℃（０．５分）、６０℃（０．５分）、７２℃（０．５分）］×４０サイクル−７２℃（１０分）−４℃維持。
【００８７】
ＫＲＡＳ正常細胞株と突然変異（mutant）細胞株、ＩＤシーケンスで検出できるＫＲＡＳ ｍｕｔａｎｔ ｐｌａｓｍＩＤを鋳型と利用して、ＩＤシーケンスを利用してＫＲＡＳ突然変異を検出した（図２１）。
その結果、各突然変異株に該当する特異ＩＤマーカーの部分にだけパイログラムのピークが現れることを確認することができた。
【００８８】
ＩＤシーケンス基盤ＫＲＡＳ変異検出法で多重突然変異検出が可能であるかを、前記３通りのＫＲＡＳ突然変異ＤＮＡを利用して同じ割合で混合した後、パイロシーケンスで検出した。
その結果、図２２に示したように、理論的に予測可能な結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００８９】
また、実際ＩＤシーケンス基盤ＫＲＡＳ多重突然変異検出法が実際臨床試料に適用されるかを大腸癌組織試料ｇＤＮＡを利用してテストして、１２人の試料に対してテストした結果、３人の患者で突然変異を検出でき、これに対する代表的なパイログラムを図２３に示した。
【００９０】
実施例４：ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルス感染検出
新種インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、季節インフルエンザＡ（Ｈ１型、Ｈ３型）、Ｂウイルスは、流行る時期が重なって感染症状が似ているが、治療剤の抗ウイルス剤に対して、ウイルスタイプ毎の治療効果が異なるため、ウイルスタイプを正確に区分検査して治療することが好ましい。そこで、ＩＤシーケンスを利用した呼吸器ウイルスジェノタイピング方法を開発した。
本実施例では代表的な呼吸器ウイルスであるインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の感染を検出した。前記５種の呼吸器ウイルスに対するＩＤシーケンスを表９のようにデザインした。
【００９１】
【表９】
【００９２】
前記５種のＩＤシーケンスの３’末端には対応する呼吸器ウイルスに特異的な塩基配列を連結して、５’末端には共通したシーケンス用配列を連結して、単一シーケンスプライマーを利用して、５種のＩＤシーケンスをパイロシーケンスできるようにして、ＩＤシーケンスを含むＰＣＲプライマーを作製した（表１０）。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
本実施例の呼吸器ウイルス検出方法は、ウイルス感染細胞で、前記５種のＧＴ−呼吸器ウイルス５タイプフォワードプライマーと５’ビオチン化リバースプライマー（表１１）を利用して、ｃＤＮＡを合成した後、表１０に示したＧＴ−ＲｅｓｐｉＶｉｒｕｓ ＩＤプライマーと５’ビオチン化Ｍ１３リバースプライマーを利用して特異的にウイルスを増幅して、パイロシーケンスで検出する方法である（図２４）。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
本実施例では、前記ウイルス遺伝子に対して必要部分を遺伝子合成（gene synthesis）し、前記合成されたウイルス遺伝子を鋳型として、多重ＰＣＲ（multiplex PCR）を行った後、パイロシーケンスで検出した。
その結果、図２５に示したように、理論的に予測可能な結果と同じパイログラムを確認することができた。
【００９７】
多重感染に対するテストも、ウイルス遺伝子鋳型を同じ割合で混合した後、多重ＰＣＲを行った後、パイロシーケンスで検出時に正常に作動することを確認した（図２６）。
【００９８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
以上述べたように、本発明のＩＤシーケンスを利用すると、遺伝型毎に独特かつ簡潔なパイログラムを取得でき、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子を簡単かつ効率的にジェノタイピングすることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンス：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークであり；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストであり；Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークであり；及びｎは１〜３２の自然数である。
【請求項２】
ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンス：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークであり；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマー。
【請求項４】
ジェノタイピング用遺伝子特異配列は、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的な配列である請求項３に記載のプライマー。
【請求項５】
請求項３に記載のジェノタイピング用プライマーを利用することを含むジェノタイピング方法。
【請求項６】
前記ジェノタイピングはパイロシーケンス方法または半導体シーケンス方法を利用する請求項５に記載のジェノタイピング方法。
【請求項７】
次の段階を含むジェノタイピング方法：
（ａ）ジェノタイピング対象遺伝子により、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）前記デザインされたＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを利用してジェノタイピング対象遺伝子鋳型を増幅させて、ＰＣＲ産物を取得する段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物をパイロシーケンスしてＩＤシーケンスをシーケンスする段階。
【請求項８】
次の段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法：
（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；
（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階。
【請求項９】
前記ウイルス遺伝子型の特異配列は、配列番号１〜１５で表される塩基配列中から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
次の段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法：
（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；
（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階。
【請求項１１】
前記KRAS遺伝子変異の特異配列は、配列番号３４〜３５で表される塩基配列中から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
次の段階を含む呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法：
ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：
（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階。
【請求項１３】
前記各呼吸器ウイルス遺伝子型の特異配列は、インフルエンザＡウイルスの場合は、配列番号４１、インフルエンザＢウイルスの場合は、配列番号４２、ＲＳＶ Ｂの場合は、配列番号４３、リノウイルスの場合は、配列番号４４、及びコロナウイルスＯＣ４３の場合は、配列番号４５で表される塩基配列である請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンス：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークであり；Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストであり；Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークであり；及びｎは１〜３２の自然数である。
【請求項２】
ＩＤ−Ｓで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンス：
ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークであり；及びＳは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列のサインポストである。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマー。
【請求項４】
ジェノタイピング用遺伝子特異配列は、ウイルス遺伝子、疾病遺伝子、細菌遺伝子及び個人識別用遺伝子からなる群から選択される遺伝子に特異的な配列である請求項３に記載のプライマー。
【請求項５】
請求項３に記載のジェノタイピング用プライマーを利用することを含むジェノタイピング方法。
【請求項６】
前記ジェノタイピングはパイロシーケンス方法または半導体シーケンス方法を利用する請求項５に記載のジェノタイピング方法。
【請求項７】
次の段階を含むジェノタイピング方法：
（ａ）ジェノタイピング対象遺伝子により、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）前記デザインされたＩＤシーケンスにジェノタイピング用遺伝子特異配列が連結されているジェノタイピング用プライマーを利用してジェノタイピング対象遺伝子鋳型を増幅させて、ＰＣＲ産物を取得する段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物をパイロシーケンスしてＩＤシーケンスをシーケンスする段階。
【請求項８】
次の段階を含むＨＰＶのジェノタイピング方法：
（ａ）各々のＨＰＶウイルスの遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付されたウイルス遺伝子型の特異配列で構成されるジェノタイピング用プライマーを作製する段階；
（ｃ）ＨＰＶウイルスを含有するサンプルを前記ジェノタイピング用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＨＰＶの遺伝子型を区別する段階。
【請求項９】
前記ウイルス遺伝子型の特異配列は、配列番号１〜１５で表される塩基配列中から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
次の段階を含むＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法：
（ａ）各々のＫＲＡＳの遺伝子変異の種類に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された遺伝子変異に特異的な配列で構成される検出用プライマーを作製する段階；
（ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子を含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、ＫＲＡＳ遺伝子変異を検出する段階。
【請求項１１】
前記KRAS遺伝子変異の特異配列は、配列番号３４〜３５で表される塩基配列中から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
次の段階を含む呼吸器ウイルスを検出する段階を含む呼吸器ウイルスの検出方法：
ａ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶＢ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３の遺伝子型に応じて、（ＩＤ−Ｓ）ｎ−Ｅで構成されるジェノタイピング用ＩＤシーケンスをデザインする段階（ここで、ＩＤはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧから選択される一つの単一塩基配列であるＩＤマークで、Ｓは隣接したＩＤマークと連結され、前記隣接したＩＤマークの塩基配列と一致しない単一塩基配列であるサインポストで、Ｅは前記サインポストの単一塩基と一致しない単一塩基配列であるエンドマークで、及びｎは１〜３２の自然数）；
（ｂ）パイロシーケンス用プライマー配列、ＩＤシーケンス及び前記ＩＤシーケンスが付された各呼吸器ウイルス遺伝子の特異配列で構成される検出用プライマーを作製する段階：
（ｃ）インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ＲＳＶ Ｂ、リノウイルス及びコロナウイルスＯＣ４３からなる群から選択される呼吸器ウイルスを含有するサンプルを、前記検出用プライマーを利用して増幅させる段階；及び
（ｄ）前記増幅されたＰＣＲ産物でパイロシーケンスを行ってＩＤシーケンスをシーケンスし、ＩＤシーケンスにより、呼吸器ウイルスを検出する段階。
【請求項１３】
前記各呼吸器ウイルス遺伝子型の特異配列は、インフルエンザＡウイルスの場合は、配列番号４１、インフルエンザＢウイルスの場合は、配列番号４２、ＲＳＶ Ｂの場合は、配列番号４３、リノウイルスの場合は、配列番号４４、及びコロナウイルスＯＣ４３の場合は、配列番号４５で表される塩基配列である請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１３−５１０５８９（Ｐ２０１３−５１０５８９Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９８０６（Ｐ２０１２−５３９８０６）
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００８０５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５９２８５
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１０１４９３６７）ゲノミクトリー インコーポレーテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＭＩＣＴＲＥＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００８０５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５９２８５
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１０１４９３６７）ゲノミクトリー インコーポレーテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＭＩＣＴＲＥＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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