スター型重合体、その合成方法及びベクター
【課題】Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとしてスター型重合体を光照射リビング重合によって効率よく合成することができるスター型重合体の合成方法及びこの方法により製造されたスター型重合体よりなるベクターを提供する。
【解決手段】Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程とを有することを特徴とするスター型重合体の合成方法。この方法により製造されたベクター。
【解決手段】Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程とを有することを特徴とするスター型重合体の合成方法。この方法により製造されたベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スター型重合体の合成方法と、この方法により合成されたスター型重合体と、このスター型重合体よりなるベクターとに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413-7417,1987）がある。ベクター用の高分子としてはポリエチレンイミンもエキソゲン（Exogen）として商品化されている。
【０００３】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本出願人は、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて酵素から保護することができるベクターとして、分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターをＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１にて提案している。
【０００４】
このベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与される。
【０００５】
同号公報には、このベクターの具体例として、ベンゼン誘導体のベンゼン環から２〜６個の分岐鎖を放射状に分岐させた化合物よりなるものが記載されている。
【０００６】
同号公報には、分岐鎖を結合させる核となるベンゼン誘導体として、具体的には次が例示されている。即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【０００７】
この分岐鎖の好適例として、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２の重合体が挙げられている。
【０００８】
この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと、核となる上記の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの非極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−を介して上記ビニル系モノマーの重合体が結合して放射状に分岐鎖を構成してなるカチオン性ポリマーが生成する。このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなるベクターは、高い電荷密度を有しており、結果、カチオン性ポリマーと核酸で形成される核酸含有複合体も高密度なものであり、生体内の酵素による作用を受けにくい立体構造をのために、核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０００９】
なお、同号公報には、ベンゼン誘導体以外のものとして、ナフタレン、アントラセン、ピレンも記載されている。
【００１０】
上記の合成反応は、上記ベンゼン誘導体等をイニファターとした光照射リビング重合反応である。
【００１１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００１２】
ＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１に記載の上記各ベンゼン誘導体等よりなるイニファターのうち、４分岐鎖以上の多分岐鎖のものはアルコールには難溶である。このイニファターはベンゼン、トルエンには可溶である。また、クロロホルム等のハロゲン化アルキルや、塩化メチレン等にも可溶である。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（１） ジチオカルバメートの光吸収波長は約２４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあり、この波長の光を照射することで効率良くラジカル開裂をさせて重合を行うことが可能である。イニファターの良溶媒であるベンゼンやトルエンは芳香環由来の光吸収が２５０ｎｍ〜２６０ｎｍ付近に存在するため、イニファターを効率良くラジカル開裂させる波長の光を溶媒自体が吸収し、重合反応の進行は溶媒の光吸収と拮抗することになる。
【００１４】
光路が短い、すなわち、小容量で重合を行う実験室レベルでは溶媒が光を吸収しても容器の全域に光が到達する。量産などの大容量の反応容器で光路が長くなった場合、溶媒による光吸収のために、入光側の容器表面でしか重合は進行しない。入光側の容器表面では、分子間の架橋や重合物の分解が複雑に起こり、目的物である分子量の大きいポリマーを効率よく得ることはできない。
【００１５】
（２） 上記の良溶媒であるクロロホルム、塩化メチレンなどは、２４０〜３００ｎｍの範囲の光を吸収せず、これらを使用した光照射重合は光路が長い、つまり量産スケールの大容量の反応容器でも重合が可能である。
【００１６】
しかしながら、クロロホルム等はポリマー成長鎖からの連鎖移動を起こしやすく、目的物であるイニファター系のポリマーの成長停止反応に寄与する。また、クロロホルム等が光分解して発生するラジカルを開始剤とした重合が起こり、イニファターと無関係なホモポリマーを生成させる。さらに、成長停止反応に寄与するハロゲン化アルキルラジカルはリビング末端を失活させてしまうため、重合度を上げることやＡＢ型ブロックポリマーの合成が不可能となる。
【００１７】
なお、ＡＢ型ブロックポリマーとは、Ａモノマーを重合した後にこのポリマーを単離し、次いで、Ｂモノマーとの系にて光照射を行うことにより合成されるブロックポリマーである。
【００１８】
本発明は、上記問題点を解消し、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとしてスター型重合体を光照射リビング重合によって効率よく合成することができるスター型重合体の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
請求項１のスター型重合体の合成方法は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程とを有することを特徴とするものである。
【００２０】
請求項２のスター型重合体の合成方法は、請求項１において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物は、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項３のスター型重合体の合成方法は、請求項１又は２において、モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項４のスター型重合体の合成方法は、請求項３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００２３】
請求項５のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、前記溶媒がハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンであることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項６のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、溶媒がクロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンであることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項７のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、溶媒がクロロホルムであることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項８のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記原料溶液中のモノマー濃度が７０重量％以上であることを特徴とするものである。
【００２７】
請求項９のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、第１の光照射工程の光の波長が２４０〜３００ｎｍであることを特徴とするものである。
【００２８】
請求項１０のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記アルコールがメタノールであることを特徴とするものである。
【００２９】
請求項１１のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記アルコールは前記モノマーのアルコール溶液であることを特徴とするものである。
【００３０】
請求項１２のスター型重合体は、請求項１ないし１１のいずれか１項の方法により合成されたものである。
【００３１】
請求項１３のスター型重合体は、請求項１２のスター型重合体に、さらに該スター型重合体のモノマーに使用したモノマーと異種のビニル系モノマーを追加重合してなるものである。
【００３２】
請求項１４のベクターは、請求項１２又は１３のスター型重合体よりなるものである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のスター型重合体の合成方法によれば、光照射リビング重合の初期だけ非極性溶媒中で光照射リビング重合反応を行わせ、その後はアルコール溶媒中で光照射リビング重合を行わせる。これにより、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとしてスター型重合体を光照射リビング重合によって効率よく合成することができる。
【００３４】
本発明の要点は次の通りである。
（１） ジチオカルバメートの光吸収波長である２４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲に吸収を持たず、かつ、ハロゲン化アルキルのように容易にラジカルの連鎖移動を起こさず、容易に分解してラジカルを発生することがない、アルコールを溶媒として重合を行う。
（２） ところがアルコールはイニファターを溶解しない貧溶媒である。イニファターをクロロホルムやベンゼンへ溶解し、これをアルコールへ滴下すると、直ちにイニファターが沈殿してしまう。
（３） イニファターを微量のクロロホルム又はトルエンなどへ溶解したペーストをモノマーと混合することで流動性のある高粘度溶液となる。該高粘度溶液中のモノマーの含有量は９０％程度である。この状態で重合を行うことは、反応が暴走する危険性があることと粘度が高く、拡散性に乏しいため均質にモノマーを連鎖反応へ供与することは不可能である。
（４） 前記ペーストを光路の短い小さな容器へ入れ、エネルギーの低い、好ましくは２４０〜３００ｎｍの単色光を照射すると、ジチオカルバメート分子団が開裂し、ラジカルが発生してモノマーの付加を受ける。そのまま重合を続けた場合は、分子量分布も不均質で分子間架橋が多い塊状のポリマーが生成する。本発明では、この単色光を照射する時間を短く、イニファターへ数分子のモノマーが付加した時点で照射を止める。この状態でイニファターはアルコールに（短時間であるが）見掛け上は可溶のものとなる。したがってアルコールを溶媒として十分な拡散分散性のある低粘度溶液として光照射を行うことで均質な重合が可能となる。最初にイニファターを溶解するために使用したクロロホルム又はベンゼンは微量であるため連鎖移動や開始剤として寄与せず、芳香環由来の光吸収も重合の進行と拮抗しえず、大過剰に存在するアルコールの中では、アルコール単独で重合した状態と近似するものである。
【００３５】
この方法によって製造されたスター型重合体は、これをベクターとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３７】
本発明において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が４個以上分岐鎖として結合しているものが好適である。
【００３８】
分岐鎖を結合させるイニファターとなるのはベンゼン環が好適であり、具体的には次が例示される。即ち、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。特に、後者のヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが好適である。
【００３９】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としてはハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特にクロロホルム又は塩化メチレン特にクロロホルムが好適である。
【００４０】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等が好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００４１】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これにまず第１の光照射工程によってイニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４２】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は７０重量％以上、例えば７０〜９９重量％が好適である。
【００４３】
イニファターの濃度は１０〜１０００ｍＭ程度が好適である。
【００４４】
照射する光の波長は２４０〜３００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜３０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜５分程度が特に好適である。
【００４５】
次に、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００４６】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００４７】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜３３０ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００４８】
この第２の光照射により、反応液中に目的とする分岐型スター型重合体が生成するので、必要に応じ精製してスター型重合体を得る。
【００４９】
このスター型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、分岐鎖が４個の場合は、５千〜５０万、特に３万〜７万、とりわけ４万〜６万程度が好ましい。分岐鎖が６個の場合は、５千〜５０万、特に１万〜３万、とりわけ１万〜２万程度が好ましい。
【００５０】
このようにして生成したスター型重合体よりなるベクターが核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００５１】
分岐鎖を構成する高分子鎖は基端側に第４級アミンを有し、先端側に第３級アミンを有するものであってもよい。分岐鎖を結合させる核の近傍を４級アミンにし、その周囲を３級アミンにすれば、細胞傷害性の低減と遺伝子導入の高効率化が期待できる。４級アミンはベクターとして必須の要素であるカチオンではあるが、殺菌剤や抗菌コートなどにも使用されているように細胞傷害性があるので、周囲を３級とすることは細胞傷害性の点で有利である。
【００５２】
分岐鎖を構成する高分子鎖は、２種類以上のモノマーを重合してなるＡＢ型ブロックポリマー、つまり、Ａモノマーを重合した後にこのポリマーを単離し、次いで、Ｂモノマーとの系にて光照射を行うことにより合成されるブロックポリマーを使用することができるが、基端部へカチオン性モノマーを使用し、先端部に非イオン性の親水性モノマーを使用することが好適である。また、先端部に疎水性のモノマーを使用することで、細胞膜の透過性が向上し、遺伝子導入に有利になることもある。
【００５３】
また、本発明のベクター内のカチオン性ポリマーはその正電荷が経時的に失活する性質を有していても良い。このようにベクター内の正電荷が失活することで、ベクターが包囲した核酸凝集体から核酸を放出する機能を付与することができる。この核酸の放出はベクターが細胞膜を透過した後に行われるよう当業者によって適宜条件を設定すれば良い。このような機能を有するカチオン性ポリマーとしては、長鎖状の分岐鎖に４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物が担持されているものが挙げられる。４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物としてはロイコマラカイトグリーンが挙げられ、該化合物を担持したカチオン性ポリマーは光照射によってカチオン化し、経時的に正電荷を失活する性質を有している。
【００５４】
上記スター型重合体よりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５５】
使用する核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもかまわない。核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５６】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００５７】
また、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００５８】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００５９】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６０】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６１】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６２】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００６３】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６４】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６５】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６６】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６７】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００６８】
実施例１
［イニファターの合成］
まず、下記反応式（化１）に従って、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートミルメチル）ベンゼンよりなるイニファターを合成した。
【００６９】
６分岐型の原料のヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンはあらゆる溶媒に難溶のため、エタノール中で固相／液相の接触によりＮａＢｒを脱離させて合成した（反応式は図１参照）。ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇへ３０倍モル量のＮａＳＣＳＮ（Ｅｔ）２を加え、エタノール１０００ｍＬ中で室温で攪拌した。反応の終点はＴＬＣにより確認し、原料成分が確認されなくなるまで攪拌を継続した。終了までには５日間を要した。得られたイニファターはクロロホルムにより再結晶が可能であった。合成されたイニファターはＮＭＲにより構造を確認した（図５参照）。
【００７０】
【化１】
【００７１】
［モノマーの精製］
モノマーである３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡｍ）は減圧蒸留により精製した。オイルバス温を約１００℃とすると、禁止剤であるキノリン系化合物が析出するので、リービッヒには冷却水を通さず、ヘアドライヤーで加熱して揮発成分を真空トラップまで誘導した。揮発成分が確認されなくなった後、減圧を停止し、リービッヒ、ト字管など蒸留系の内部をクロロホルムで洗浄し、管壁へ付着したキノリン系物質を除去した。ＤＭＡＰＡＡｍの揮発が開始した後（オイルバス温は約１５０℃）、１１０℃〜１１５℃の分画を採取した。蒸留の停止はオイルバス温を下げることで行い、常圧へ戻すまでには１０分間の真空引きを継続した。常圧へ戻す作業は窒素ガスにて行い、精製したＤＭＡＰＡＡｍは保管せずに、即、重合に使用した。
【００７２】
［光重合］
第１の光照射工程
イニファター（０．０６ｇ、終濃度１ｍＭ）をクロロホルム約２００μＬで濡らし、ＤＭＡＰＡＡｍ４．０ｍＬと混合し、石英セル（１０ｍｍセル長）内へ入れ、２７６ｎｍの単色光（約１μＷ／ｃｍ２）を５分間照射した。
【００７３】
希釈工程
ＤＭＡＰＡＡｍ（終濃度約５ｇ＝０．１Ｍから約８０ｇ＝１．５Ｍまで）をメタノールと混合し、全量をメタノールで３５０ｍＬと混合し、窒素ガスバブリングを１時間行った。ここに２７６ｎｍの単色光（約１μＷ／ｃｍ２）を５分間照射した４ｍＬの溶液を混合し、希釈した。
【００７４】
第２の光照射工程
この希釈液に高圧水銀灯で光照射し、光重合を３０分間行った。反応終了時にかすかな淡黄色への着色と増粘を観察した。
【００７５】
［ポリマーの精製］
重合溶液をエバポレートしてメタノールを留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマーを再沈殿させた。沈殿をメタノールへ溶解し、＃２の濾紙で濾過した後にジエチルエーテル中へ滴下し再沈殿させた。これを２４時間放置し、ポリマーを完全に析出させた。その後さらにクロロホルム／ジエチルエーテル系で２回再沈殿させた。得られた精製ポリマーを水へ溶解し、エバポレーターで残留する有機溶媒を除去し、０．２μｍメンブランフィルターで濾過した後に凍結乾燥して６分岐型スターポリマーを得た。ＮＭＲにより目的物であることを確認した。分子量はＧＰＣにより測定した。重合時間を主とする重合条件設定により、自在に分子量を制御することができた。
【００７６】
比較例１
比較例としては、イニファターをクロロホルムへ溶解し、ＤＭＡＰＡＡｍをクロロホルムと混合し、クロロホルムで全量を３５０ｍＬとして光重合を行った。その結果、モノマー濃度や重合時間に依存性に分子量が上昇するが、分子量は約１８０００で頭打ちになり、それ以上の分子量のポリマーを得ることはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】比較例の結果を示すグラフである。
【図２】比較例の結果を示すグラフである。
【図３】比較例の結果を示すグラフである。
【図４】実施例の結果を示すグラフである。
【図５】イニファターのＮＭＲである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スター型重合体の合成方法と、この方法により合成されたスター型重合体と、このスター型重合体よりなるベクターとに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413-7417,1987）がある。ベクター用の高分子としてはポリエチレンイミンもエキソゲン（Exogen）として商品化されている。
【０００３】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本出願人は、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて酵素から保護することができるベクターとして、分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターをＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１にて提案している。
【０００４】
このベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与される。
【０００５】
同号公報には、このベクターの具体例として、ベンゼン誘導体のベンゼン環から２〜６個の分岐鎖を放射状に分岐させた化合物よりなるものが記載されている。
【０００６】
同号公報には、分岐鎖を結合させる核となるベンゼン誘導体として、具体的には次が例示されている。即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【０００７】
この分岐鎖の好適例として、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２の重合体が挙げられている。
【０００８】
この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと、核となる上記の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの非極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−を介して上記ビニル系モノマーの重合体が結合して放射状に分岐鎖を構成してなるカチオン性ポリマーが生成する。このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなるベクターは、高い電荷密度を有しており、結果、カチオン性ポリマーと核酸で形成される核酸含有複合体も高密度なものであり、生体内の酵素による作用を受けにくい立体構造をのために、核酸の失活、分解を抑制することができる。
【０００９】
なお、同号公報には、ベンゼン誘導体以外のものとして、ナフタレン、アントラセン、ピレンも記載されている。
【００１０】
上記の合成反応は、上記ベンゼン誘導体等をイニファターとした光照射リビング重合反応である。
【００１１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００１２】
ＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１に記載の上記各ベンゼン誘導体等よりなるイニファターのうち、４分岐鎖以上の多分岐鎖のものはアルコールには難溶である。このイニファターはベンゼン、トルエンには可溶である。また、クロロホルム等のハロゲン化アルキルや、塩化メチレン等にも可溶である。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８ Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（１） ジチオカルバメートの光吸収波長は約２４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあり、この波長の光を照射することで効率良くラジカル開裂をさせて重合を行うことが可能である。イニファターの良溶媒であるベンゼンやトルエンは芳香環由来の光吸収が２５０ｎｍ〜２６０ｎｍ付近に存在するため、イニファターを効率良くラジカル開裂させる波長の光を溶媒自体が吸収し、重合反応の進行は溶媒の光吸収と拮抗することになる。
【００１４】
光路が短い、すなわち、小容量で重合を行う実験室レベルでは溶媒が光を吸収しても容器の全域に光が到達する。量産などの大容量の反応容器で光路が長くなった場合、溶媒による光吸収のために、入光側の容器表面でしか重合は進行しない。入光側の容器表面では、分子間の架橋や重合物の分解が複雑に起こり、目的物である分子量の大きいポリマーを効率よく得ることはできない。
【００１５】
（２） 上記の良溶媒であるクロロホルム、塩化メチレンなどは、２４０〜３００ｎｍの範囲の光を吸収せず、これらを使用した光照射重合は光路が長い、つまり量産スケールの大容量の反応容器でも重合が可能である。
【００１６】
しかしながら、クロロホルム等はポリマー成長鎖からの連鎖移動を起こしやすく、目的物であるイニファター系のポリマーの成長停止反応に寄与する。また、クロロホルム等が光分解して発生するラジカルを開始剤とした重合が起こり、イニファターと無関係なホモポリマーを生成させる。さらに、成長停止反応に寄与するハロゲン化アルキルラジカルはリビング末端を失活させてしまうため、重合度を上げることやＡＢ型ブロックポリマーの合成が不可能となる。
【００１７】
なお、ＡＢ型ブロックポリマーとは、Ａモノマーを重合した後にこのポリマーを単離し、次いで、Ｂモノマーとの系にて光照射を行うことにより合成されるブロックポリマーである。
【００１８】
本発明は、上記問題点を解消し、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとしてスター型重合体を光照射リビング重合によって効率よく合成することができるスター型重合体の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
請求項１のスター型重合体の合成方法は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程とを有することを特徴とするものである。
【００２０】
請求項２のスター型重合体の合成方法は、請求項１において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物は、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項３のスター型重合体の合成方法は、請求項１又は２において、モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項４のスター型重合体の合成方法は、請求項３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００２３】
請求項５のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、前記溶媒がハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンであることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項６のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、溶媒がクロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンであることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項７のスター型重合体の合成方法は、請求項４において、溶媒がクロロホルムであることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項８のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記原料溶液中のモノマー濃度が７０重量％以上であることを特徴とするものである。
【００２７】
請求項９のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、第１の光照射工程の光の波長が２４０〜３００ｎｍであることを特徴とするものである。
【００２８】
請求項１０のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記アルコールがメタノールであることを特徴とするものである。
【００２９】
請求項１１のスター型重合体の合成方法は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記アルコールは前記モノマーのアルコール溶液であることを特徴とするものである。
【００３０】
請求項１２のスター型重合体は、請求項１ないし１１のいずれか１項の方法により合成されたものである。
【００３１】
請求項１３のスター型重合体は、請求項１２のスター型重合体に、さらに該スター型重合体のモノマーに使用したモノマーと異種のビニル系モノマーを追加重合してなるものである。
【００３２】
請求項１４のベクターは、請求項１２又は１３のスター型重合体よりなるものである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のスター型重合体の合成方法によれば、光照射リビング重合の初期だけ非極性溶媒中で光照射リビング重合反応を行わせ、その後はアルコール溶媒中で光照射リビング重合を行わせる。これにより、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとしてスター型重合体を光照射リビング重合によって効率よく合成することができる。
【００３４】
本発明の要点は次の通りである。
（１） ジチオカルバメートの光吸収波長である２４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲に吸収を持たず、かつ、ハロゲン化アルキルのように容易にラジカルの連鎖移動を起こさず、容易に分解してラジカルを発生することがない、アルコールを溶媒として重合を行う。
（２） ところがアルコールはイニファターを溶解しない貧溶媒である。イニファターをクロロホルムやベンゼンへ溶解し、これをアルコールへ滴下すると、直ちにイニファターが沈殿してしまう。
（３） イニファターを微量のクロロホルム又はトルエンなどへ溶解したペーストをモノマーと混合することで流動性のある高粘度溶液となる。該高粘度溶液中のモノマーの含有量は９０％程度である。この状態で重合を行うことは、反応が暴走する危険性があることと粘度が高く、拡散性に乏しいため均質にモノマーを連鎖反応へ供与することは不可能である。
（４） 前記ペーストを光路の短い小さな容器へ入れ、エネルギーの低い、好ましくは２４０〜３００ｎｍの単色光を照射すると、ジチオカルバメート分子団が開裂し、ラジカルが発生してモノマーの付加を受ける。そのまま重合を続けた場合は、分子量分布も不均質で分子間架橋が多い塊状のポリマーが生成する。本発明では、この単色光を照射する時間を短く、イニファターへ数分子のモノマーが付加した時点で照射を止める。この状態でイニファターはアルコールに（短時間であるが）見掛け上は可溶のものとなる。したがってアルコールを溶媒として十分な拡散分散性のある低粘度溶液として光照射を行うことで均質な重合が可能となる。最初にイニファターを溶解するために使用したクロロホルム又はベンゼンは微量であるため連鎖移動や開始剤として寄与せず、芳香環由来の光吸収も重合の進行と拮抗しえず、大過剰に存在するアルコールの中では、アルコール単独で重合した状態と近似するものである。
【００３５】
この方法によって製造されたスター型重合体は、これをベクターとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３７】
本発明において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が４個以上分岐鎖として結合しているものが好適である。
【００３８】
分岐鎖を結合させるイニファターとなるのはベンゼン環が好適であり、具体的には次が例示される。即ち、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。特に、後者のヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが好適である。
【００３９】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としてはハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特にクロロホルム又は塩化メチレン特にクロロホルムが好適である。
【００４０】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等が好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００４１】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これにまず第１の光照射工程によってイニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４２】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は７０重量％以上、例えば７０〜９９重量％が好適である。
【００４３】
イニファターの濃度は１０〜１０００ｍＭ程度が好適である。
【００４４】
照射する光の波長は２４０〜３００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜３０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜５分程度が特に好適である。
【００４５】
次に、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００４６】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００４７】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜３３０ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００４８】
この第２の光照射により、反応液中に目的とする分岐型スター型重合体が生成するので、必要に応じ精製してスター型重合体を得る。
【００４９】
このスター型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、分岐鎖が４個の場合は、５千〜５０万、特に３万〜７万、とりわけ４万〜６万程度が好ましい。分岐鎖が６個の場合は、５千〜５０万、特に１万〜３万、とりわけ１万〜２万程度が好ましい。
【００５０】
このようにして生成したスター型重合体よりなるベクターが核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００５１】
分岐鎖を構成する高分子鎖は基端側に第４級アミンを有し、先端側に第３級アミンを有するものであってもよい。分岐鎖を結合させる核の近傍を４級アミンにし、その周囲を３級アミンにすれば、細胞傷害性の低減と遺伝子導入の高効率化が期待できる。４級アミンはベクターとして必須の要素であるカチオンではあるが、殺菌剤や抗菌コートなどにも使用されているように細胞傷害性があるので、周囲を３級とすることは細胞傷害性の点で有利である。
【００５２】
分岐鎖を構成する高分子鎖は、２種類以上のモノマーを重合してなるＡＢ型ブロックポリマー、つまり、Ａモノマーを重合した後にこのポリマーを単離し、次いで、Ｂモノマーとの系にて光照射を行うことにより合成されるブロックポリマーを使用することができるが、基端部へカチオン性モノマーを使用し、先端部に非イオン性の親水性モノマーを使用することが好適である。また、先端部に疎水性のモノマーを使用することで、細胞膜の透過性が向上し、遺伝子導入に有利になることもある。
【００５３】
また、本発明のベクター内のカチオン性ポリマーはその正電荷が経時的に失活する性質を有していても良い。このようにベクター内の正電荷が失活することで、ベクターが包囲した核酸凝集体から核酸を放出する機能を付与することができる。この核酸の放出はベクターが細胞膜を透過した後に行われるよう当業者によって適宜条件を設定すれば良い。このような機能を有するカチオン性ポリマーとしては、長鎖状の分岐鎖に４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物が担持されているものが挙げられる。４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物としてはロイコマラカイトグリーンが挙げられ、該化合物を担持したカチオン性ポリマーは光照射によってカチオン化し、経時的に正電荷を失活する性質を有している。
【００５４】
上記スター型重合体よりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５５】
使用する核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもかまわない。核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５６】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００５７】
また、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００５８】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００５９】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６０】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６１】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６２】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００６３】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６４】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６５】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６６】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６７】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００６８】
実施例１
［イニファターの合成］
まず、下記反応式（化１）に従って、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートミルメチル）ベンゼンよりなるイニファターを合成した。
【００６９】
６分岐型の原料のヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンはあらゆる溶媒に難溶のため、エタノール中で固相／液相の接触によりＮａＢｒを脱離させて合成した（反応式は図１参照）。ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇへ３０倍モル量のＮａＳＣＳＮ（Ｅｔ）２を加え、エタノール１０００ｍＬ中で室温で攪拌した。反応の終点はＴＬＣにより確認し、原料成分が確認されなくなるまで攪拌を継続した。終了までには５日間を要した。得られたイニファターはクロロホルムにより再結晶が可能であった。合成されたイニファターはＮＭＲにより構造を確認した（図５参照）。
【００７０】
【化１】
【００７１】
［モノマーの精製］
モノマーである３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡｍ）は減圧蒸留により精製した。オイルバス温を約１００℃とすると、禁止剤であるキノリン系化合物が析出するので、リービッヒには冷却水を通さず、ヘアドライヤーで加熱して揮発成分を真空トラップまで誘導した。揮発成分が確認されなくなった後、減圧を停止し、リービッヒ、ト字管など蒸留系の内部をクロロホルムで洗浄し、管壁へ付着したキノリン系物質を除去した。ＤＭＡＰＡＡｍの揮発が開始した後（オイルバス温は約１５０℃）、１１０℃〜１１５℃の分画を採取した。蒸留の停止はオイルバス温を下げることで行い、常圧へ戻すまでには１０分間の真空引きを継続した。常圧へ戻す作業は窒素ガスにて行い、精製したＤＭＡＰＡＡｍは保管せずに、即、重合に使用した。
【００７２】
［光重合］
第１の光照射工程
イニファター（０．０６ｇ、終濃度１ｍＭ）をクロロホルム約２００μＬで濡らし、ＤＭＡＰＡＡｍ４．０ｍＬと混合し、石英セル（１０ｍｍセル長）内へ入れ、２７６ｎｍの単色光（約１μＷ／ｃｍ２）を５分間照射した。
【００７３】
希釈工程
ＤＭＡＰＡＡｍ（終濃度約５ｇ＝０．１Ｍから約８０ｇ＝１．５Ｍまで）をメタノールと混合し、全量をメタノールで３５０ｍＬと混合し、窒素ガスバブリングを１時間行った。ここに２７６ｎｍの単色光（約１μＷ／ｃｍ２）を５分間照射した４ｍＬの溶液を混合し、希釈した。
【００７４】
第２の光照射工程
この希釈液に高圧水銀灯で光照射し、光重合を３０分間行った。反応終了時にかすかな淡黄色への着色と増粘を観察した。
【００７５】
［ポリマーの精製］
重合溶液をエバポレートしてメタノールを留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマーを再沈殿させた。沈殿をメタノールへ溶解し、＃２の濾紙で濾過した後にジエチルエーテル中へ滴下し再沈殿させた。これを２４時間放置し、ポリマーを完全に析出させた。その後さらにクロロホルム／ジエチルエーテル系で２回再沈殿させた。得られた精製ポリマーを水へ溶解し、エバポレーターで残留する有機溶媒を除去し、０．２μｍメンブランフィルターで濾過した後に凍結乾燥して６分岐型スターポリマーを得た。ＮＭＲにより目的物であることを確認した。分子量はＧＰＣにより測定した。重合時間を主とする重合条件設定により、自在に分子量を制御することができた。
【００７６】
比較例１
比較例としては、イニファターをクロロホルムへ溶解し、ＤＭＡＰＡＡｍをクロロホルムと混合し、クロロホルムで全量を３５０ｍＬとして光重合を行った。その結果、モノマー濃度や重合時間に依存性に分子量が上昇するが、分子量は約１８０００で頭打ちになり、それ以上の分子量のポリマーを得ることはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】比較例の結果を示すグラフである。
【図２】比較例の結果を示すグラフである。
【図３】比較例の結果を示すグラフである。
【図４】実施例の結果を示すグラフである。
【図５】イニファターのＮＭＲである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、
非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、
該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、
光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、
希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程と
を有することを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項２】
請求項１において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物は、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項４】
請求項３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項５】
請求項４において、前記溶媒がハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項６】
請求項４において、溶媒がクロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項７】
請求項４において、溶媒がクロロホルムであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記原料溶液中のモノマー濃度が７０重量％以上であることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、第１の光照射工程の光の波長が２４０〜３００ｎｍであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記アルコールがメタノールであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記アルコールは前記モノマーのアルコール溶液であることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項の方法により合成されたスター型重合体。
【請求項１３】
請求項１２のスター型重合体に、さらに該スター型重合体のモノマーに使用したモノマーと異種のビニル系モノマーを追加重合してなるスター型重合体。
【請求項１４】
請求項１２又は１３のスター型重合体よりなるベクター。
【請求項１】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとする光照射リビング重合によるスター型重合体の合成方法であって、
非極性溶媒中にモノマー及びイニファターを溶解させてなる原料溶液を調製する工程と、
該原料溶液中に光を照射する第１の光照射工程と、
光照射した溶液をアルコールで希釈する希釈工程と、
希釈された溶液に光照射する第２の光照射工程と
を有することを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項２】
請求項１において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物は、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項４】
請求項３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項５】
請求項４において、前記溶媒がハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項６】
請求項４において、溶媒がクロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項７】
請求項４において、溶媒がクロロホルムであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記原料溶液中のモノマー濃度が７０重量％以上であることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、第１の光照射工程の光の波長が２４０〜３００ｎｍであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記アルコールがメタノールであることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記アルコールは前記モノマーのアルコール溶液であることを特徴とするスター型重合体の合成方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項の方法により合成されたスター型重合体。
【請求項１３】
請求項１２のスター型重合体に、さらに該スター型重合体のモノマーに使用したモノマーと異種のビニル系モノマーを追加重合してなるスター型重合体。
【請求項１４】
請求項１２又は１３のスター型重合体よりなるベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−７０５７９（Ｐ２００７−７０５７９Ａ）
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６２４３２（Ｐ２００５−２６２４３２）
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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