セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法
【課題】アミノ酸残基数が少なく、かつセルロースに特異的に結合するペプチド、及びその製造方法の提供。
【解決手段】アミノ酸残基数が７個であり、少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、セルロース結合性ペプチド。また、ファージディスプレイペプチドライブラリーから、該セルロース結合性ペプチドを有するファージの増幅、分離、洗浄、溶出する工程からなるセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【解決手段】アミノ酸残基数が７個であり、少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、セルロース結合性ペプチド。また、ファージディスプレイペプチドライブラリーから、該セルロース結合性ペプチドを有するファージの増幅、分離、洗浄、溶出する工程からなるセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化や原油生産ピークの問題から、ガソリンに代わる自動車用燃料として再生可能資源であるバイオマス燃料の導入が検討されている。代表的な自動車用バイオマス燃料であるバイオエタノールは、さとうきび、とうもろこし、木材等を原料としており、これらを糖化した後、酵素発酵により製造される。中でも、木材は、地球上で最も多量に存在するバイオマス資源であることから、それを原料としたバイオエタノールの製造の実用化が望まれている。
【０００３】
木材等の主成分であるセルロースは、不溶性の材料であるため、糖化および酵素発酵の前に、可溶化する必要がある。
セルロース分解酵素であるセルラーゼは、触媒ドメイン、リンカー部位およびセルロース結合ドメイン（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＣＢＤ）の三つの領域から構成されており、このうちＣＢＤがセルロースを分解するのに重要であることが知られている。
しかしながら、酵素を用いた可溶化および糖化は分解速度やコストの面で問題がある。
【０００４】
これに対して、非特許文献１においては、人工的に得たバクテリオファージ・ディスプレーライブラリーを用いて、セルロースと特異的に結合する部分（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ：ＣＢＭ）を選別する試みが記載されており、ＳＷＹＬシーケンスがＣＢＭであると推測されている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｈｕａｘｕｅ Ｙｕ Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｗｕｌｉ Ｘｕｅｂａｏ，１９９８，３０（３），ｐ．２６３−２６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載されている方法は、ペプチドのアミノ酸残基数が１５個と比較的多いので、製造の際に高いコストおよび大きなエネルギーが必要であり、また、安定性に欠けるなどの問題があるため、実用上不利である。
また、非特許文献１に記載されている方法は、ペプチドのアミノ酸残基数が１５個であるため、溶液中である種の立体構造（コンファメーション）を採り、それがセルロースとの結合に多少なりとも寄与していると推測されるところ、特定の立体構造を採らないアミノ酸残基数が少ないペプチドの場合は、ＳＷＹＬシーケンスを有するペプチドであっても、セルロースへの特異的な結合を示すか否かは不明である。
そこで、本発明は、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドおよびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の方法により、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１４）を提供する。
（１）少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
（２）上記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含む、上記（１）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（３）少なくとも２個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続している、上記（２）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（４）ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＱＴＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
（５）前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
（６）上記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で１．５以上である上記（５）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（７）上記アミノ酸配列のＮ末端から第１番目および第５番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる上記（１）〜（６）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
（８）上記アミノ酸配列のＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる上記（１）〜（７）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【０００９】
（９）アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１０）前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備する、上記（９）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【００１０】
（１１）前記洗浄工程が、いずれもＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われる、上記（１０）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１２）前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、上記（１０）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１３）前記アミノ酸残基数が７個である、上記（９）〜（１２）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１４）上記（９）〜（１３）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のセルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明のセルロース結合性ペプチドおよびその製造方法を詳細に説明する。なお、本明細書において、アミノ酸配列は、特にことわりのない限り一文字表記で示される。この一文字表記に対応するアミノ酸残基名および三文字表記は次のとおりである。Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｃ：システィン（Ｃｙｓ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）。
【００１３】
本発明のセルロース結合性ペプチドの第１の態様は、少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチドである。
正のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）を有するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である。中でも、アラニンが好ましい。
本発明において、側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸におけるアミノ基は、イミノ基（＞ＮＨ）およびアミド（−ＣＯＮＨ）を含む。側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である。中でも、ヒスチジン、グルタミン、アルギニンが好ましい。
【００１４】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、上述した側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを、それぞれ少なくとも１個含む。本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドがセルロースに対して特異的に結合する理由は明らかでないが、セルロースが疎水的部分とヒドロキシ基とを有していることから、セルロース結合性ペプチドの正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸の部分が、セルロースの疎水的部分と疎水結合を形成し、かつ、セルロース結合性ペプチドの側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸の部分が、セルロースのヒドロキシ基と水素結合を形成するためであると推測される。
【００１５】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドにおいては、側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含むのが好ましい態様の一つである。これにより、水素結合がより生じやすくなる。
中でも、少なくとも２個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続しているのが好ましい。
【００１６】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、上述した側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを、それぞれ少なくとも１個含むアミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、セルロースに特異的に結合する。このようなペプチドであれば、７個のアミノ酸残基の配列順序は特に限定されないが、例えば、以下の本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドが好適に挙げられる。
【００１７】
本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドは、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＥＱＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらペプチドは、第一の態様と同様に、セルロースに特異的に結合する。本発明では、第一の態様として規定されるセルロース結合性ペプチドが、第２の態様のセルロース結合性ペプチドのいずれかと同一のものであってもよい。
【００１８】
本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドは、上記各アミノ酸配列を有していればよく、アミノ酸残基数が７個である場合は、上述した各アミノ酸配列自体であり、アミノ酸残基数が８個以上である場合は、上述した各アミノ酸配列を一部に含むものである。
アミノ酸残基数は、７〜１４個であるのが好ましい。
【００１９】
本明細書において、上記「セルロースに特異的に結合する」とは、セルロース結合性ペプチドのファージクローンのセルロースに対する結合定数とライブラリーのセルロースに対する結合定数との比が１を超えることを意味する。すなわち、本発明の第１および第２の態様で規定されるセルロースに特異的に結合するペプチドを構成する上記アミノ酸配列は、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である。なお、本発明における結合定数は、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験により、後述のLangmuir仮定式から求めることができる見掛けの結合定数（Ｋapp）である。
本発明では、セルロース結合性ペプチドのファージクローンのセルロースに対する結合定数とライブラリーのセルロースに対する結合定数との比は、１．１以上であるのが好ましく、１．３以上であるのがより好ましく、１．５以上であるのが更に好ましい。
【００２０】
第１または第２の態様で規定される７個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第１番目および第５番目が水酸基を有するアミノ酸残基であることが好ましい。また、Ｎ末端から第７番目すなわちＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基であることが好ましい。
なお、本発明の第２の態様に係るセルロース結合性ペプチドには、ファージディスプレイ法により一般的なポリマー親和性ペプチドとして選択されたペプチドのプロリン依存性の傾向は特別みられない。
【００２１】
本発明に係るセルロース結合性ペプチドは、製造方法を特に限定されないが、例えば、以下に示す本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により製造することができる。
【００２２】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法は、アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法である。
【００２３】
混合工程は、アミノ酸残基数が２〜１４個、好ましくは６〜１４個、より好ましくは７〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる工程である。
ライブラリー溶液には、ファージディスプレイペプチドライブラリーが含まれる。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、２０のｎ乗（ｎは、アミノ酸残基数）の多様性を有する。すなわち、２０のｎ乗（ｎは、アミノ酸残基数）種のペプチドを有するファージのライブラリーである。例えば、アミノ酸残基数が７個であれば、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、２０n（≒１．２８×１０9）種のペプチドを有するファージを有する。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が７個であるのが好ましい態様の一つである。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、特に限定されないが、例えば、市販のものを用いることができる。
また、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が異なる２種以上のファージを含んでいてもよい。
ライブラリー溶液は、水溶液であるのが好ましい。水溶液中のファージディスプレイペプチドライブラリーの濃度は、１０11〜１０12ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬであるのが好ましい。
【００２４】
ライブラリー溶液は、市販のものをそのまま用いてもよいが、ライブラリー溶液中のファージディスプレイペプチドライブラリーを大腸菌に感染させて増幅させた後に用いてもよい。その場合、大腸菌に感染させる方法は、特に限定されず、例えば、大腸菌のＯ／Ｎ培養液１００〜３００μＬをＬＢ培地に加え、ついでライブラリー溶液を０．５〜３μＬ加えて室温から４０℃までの温度で、１５０〜３００ｒｐｍで３〜６時間、振盪培養する方法が挙げられる。
【００２５】
セルロースは、特に限定されないが、純度および混合の容易さの点で、微結晶セルロースであるのが好ましい。微結晶セルロースは、特に限定されず、例えば、市販のものを用いることができる。
【００２６】
混合工程においては、上記ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、上記セルロースとを混合させる。
混合の方法は、特に限定されず、例えば、室温で１分間〜１２時間転倒混和する方法が挙げられる。
【００２７】
沈殿工程は、混合工程後、放置して、ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとの複合体を沈殿させる工程である。
混合工程においてセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとが結合して生成した複合体は、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージと比べて重いため、沈殿する。
【００２８】
分離工程は、沈殿した複合体を分離する工程である。
分離の方法は、沈殿した複合体を系から分離する方法であれば、特に限定されないが、例えば、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを含む溶液を除去して、沈殿を得る方法が挙げられる。
【００２９】
洗浄工程は、分離された複合体を洗浄する工程である。
複合体は、上述したように、ライブラリー溶液とセルロースとを混合させた状態から、沈殿により分離されたものである。したがって、ライブラリー溶液中のセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージが不純物として含まれる。洗浄工程は、そのようなセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを除去するために行われる。
【００３０】
洗浄の方法は、特に限定されず、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）を用いて洗浄する方法、セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法が好適に挙げられる。セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法を用いると、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージのみならず、セルロースに弱く結合するペプチドを有するファージも除去されるので、セルロースにより強く結合するペプチドを有するファージを得ることができると考えられる。
ＴＢＳＴを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、ｐＨ６〜９であり、０．０１〜０．１ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ２０を含む５００〜１０００μＬのＴＢＳＴを用い、室温から４０℃までの温度下で、５〜２０回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、ｐＨ６〜９であり、０．１〜５０ｍＭのセロビオースを含むＴＢＳＴ５００〜１０００μＬを用い、室温から４０℃までの温度下で、５〜２０回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
【００３１】
溶出工程は、洗浄された複合体からセルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる工程である。溶出工程においては、複合体がセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとの間で解離し、セルロース結合性ペプチドを有するファージが溶出する。
溶出の方法は、特に限定されず、例えば、グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法、セロビオース水溶液を用いて溶出する方法が挙げられる。
グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、ｐＨ１〜３のグリシン−塩酸緩衝液４００〜１０００μＬを用い、室温から４０℃までの温度下で、３０分間〜２時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
セロビオース水溶液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、０．０５〜０．５Ｍのセロビオースを含むｐＨ１〜３のグリシン−塩酸緩衝液４００〜１０００μＬを用い、室温下、１時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
【００３２】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、洗浄工程が、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、溶出工程が、グリシン−塩酸緩衝液を用いて行われるのが好ましい態様の一つであり、洗浄工程が、セロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、溶出工程が、セロビオース水溶液を用いて行われるのが別の好ましい態様の一つである。
【００３３】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、前記溶出工程の後に、溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備するのが好ましい。これにより、セルロース結合性ペプチドの得られる効率が高くなる。
【００３４】
上記サイクルにおける増幅工程は、溶出したセルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる工程である。このようにセルロース結合性ペプチドを有するファージを増幅させることにより、セルロース結合性ペプチドを有するファージが後の分離工程、洗浄工程および溶出工程で多少消失しても、最終的に残るようにすることができる。
増幅の方法の条件は、例えば、ＬＢ培地１０〜３０ｍＬと大腸菌Ｏ／Ｎ培養液１００〜３００μＬの混合液にファージ溶液５０〜２００μＬを加えて、室温から３７℃までの温度で、１５０〜３００ｒｐｍで３〜６時間、振盪培養する方法が挙げられる。
【００３５】
上記サイクルにおける混合工程は、増幅したセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる工程である。
混合の方法は、ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液の代わりに、増幅したセルロース結合性ペプチドを有するファージを用いる以外は、上述した混合工程と同様である。
【００３６】
上記サイクルにおける沈殿工程は、混合工程後、放置して、セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる工程である。
上記サイクルにおける分離工程は、沈殿した複合体を分離する工程である。
上記サイクルにおける洗浄工程は、分離された複合体を洗浄する工程である。
上記サイクルにおける溶出工程は、洗浄された複合体からセルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる工程である。
これらの沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程は、それぞれ上述した沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程と同様である。
上記サイクルを行う場合は、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもＴＢＳＴを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われるのが好ましい態様の一つであり、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われるのが別の好ましい態様の一つである。サイクル前および１回以上のサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて行われる場合、セロビオースの濃度を上げながら行うのが好ましい。例えば、サイクルを４回行うことによりバイオパニングを合計５回行う場合、１ｍＭ（バイオパニング１回目）、３ｍＭ（同２回目）、１０ｍＭ（同３回目）、３０ｍＭ（同４回目）、３０ｍＭ（同５回目）のようにすることができる。これにより、セルロースに弱く結合する特異性の低いファージを効率よく排除することができる。
【００３７】
サイクルの回数は、特に限定されないが、セルロース結合性ペプチドを有するファージが分離工程、洗浄工程および溶出工程で消失する可能性、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有さず、かつ、増幅工程で高効率で増幅されるファージの増幅性等を考慮すると、１〜５回であるのが好ましい。
【００３８】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、溶出工程（サイクルを行う場合は、サイクルにおける最後の溶出工程）で、セルロース結合性ペプチドを有するファージを含有する溶出液が得られる。
この溶出液中に、セルロース結合性ペプチドを有するファージが存在するか否かは、例えば、クローニングをして、ファージクローンを取り出し、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により、セルロースに対する結合定数を測定し、ライブラリーのセルロースに対する結合定数との比が１を超える、好ましくは１．５以上であるものが存在するか否かで判断することができる。
【００３９】
ＥＬＩＳＡは、特に限定されず、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等を用いることができる。いずれの方法においても、反応に関与しないタンパク質で固相ブロッキングすることができ、具体的には、スキムミルクなどをたとえばファージ溶液に添加することでブロッキングすることができる。この固相ブロッキングは、ＥＬＩＳＡで通常行なわれる手段であるが、本発明では、固相ブロッキングを行なわないことが好ましい。すなわち、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験の際には、スキムミルクなどの外部ペプチドの共存を避けることが好ましい。
【００４０】
結合定数は、ファージ濃度を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のＬａｎｇｍｕｉｒ式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）を求めることができる。
【数１】
【００４１】
式中、ＲＡはＥＬＩＳＡにより求めた各濃度での吸収を示し、ＲＡmaxは最大吸収を示す。
【００４２】
本発明の第７の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチドである。
本発明の第７の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られ、かつ、セルロースに特異的に結合するものであれば、アミノ酸配列等を特に限定されない。
具体的には、例えば、上述した本発明の第２から第６までの態様のセルロース結合性ペプチドが挙げられる。
【００４３】
本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドは、いずれもアミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドであり、現在のところ、セルロースの可溶化能および分解能との関係は明らかでないが、本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドを用いてセルロースの可溶化および分解を行うことは、可能であると考えられる。
したがって、本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドを用いてバイオエタノールを製造することが可能になると考えられる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限られるものではない。なお、実施例において、「％」は特に指定のない限り、「質量％」を表す。
【００４５】
１． 実験方法
１．１ 実験試料
微結晶セルロースは、Ｍｅｒｃｋより購入したものをそのまま用いた。
ファージディスプレイペプチドライブラリー（以下、単に「ライブラリー」という。）は、Ｐｈ．Ｄ．−７TM Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。このライブラリーは、Ｍ１３系のｆｄファージの非主要外殻タンパク質であるｐＩＩＩのＮ末端に直鎖７残基のランダムなアミノ酸配列のペプチドが提示されたものであり、ペプチド４残基（ＧＧＧＳ）のスペーサーを介してｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐＩＩＩに融合した設計となっている。このライブラリーには、２０7個（≒１．２８×１０9個）のｐｈａｇｅ ｃｌｏｎｅｓが含まれている。
【００４６】
１．２ 微結晶セルロースの滅菌および洗浄
微結晶セルロースをエタノールに分散させた。静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作によりセルロースを滅菌した。
つぎに、ＴＢＳに分散させ、静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作を３回繰り返すことで微結晶セルロースを洗浄した。
【００４７】
１．３ セルロース結合性ファージのセレクション
図１に、セルロース結合性ファージのセレクションの概略工程図を示す。
本操作はＰｈ．Ｄ．−７TM Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを用いて行い、Ｋｉｔ付属のマニュアルを参考にし、一部改変して行った。
【００４８】
（１）試薬調製
（ａ）滅菌精製水
超純水をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）して調製し、室温で保存した。
（ｂ）Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（Ｔｅｔ）ストック溶液
テトラサイクリン塩酸塩１００ｍｇをエタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｄｅ）２０ｍＬに溶解し、−２０℃で遮光保存した。
（ｃ）ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液
Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）０．２５ｇ、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−Ｇａｌ） ０．２ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｄｅ） ５．０ｍＬに溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し−２０℃で遮光保存した。
（ｄ）ＬＢ培地
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ５ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ２．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを採取し、超純水５００ｍＬおよび４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１２５μＬを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｅ）ＬＢ ｐｌａｔｅ−Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ培地２００ｍＬを採取しＢａｃｔｏ Ａｇａｒ ３．０ｇを加えてオートクレーブ処理を行った後、５０℃以下まで冷却し、Ｔｅｔストック溶液８００μＬを加えシャーレ２０枚に分注し、固化させた後４℃で遮光保存した。
【００４９】
（ｆ）１０×ＴＢＳ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ３０．３ｇ，塩化ナトリウム４３．８ｇを４００ｍＬの超純水に溶解させ、６Ｍ塩酸および０．０１Ｍ塩酸でｐＨ７．５に調整した。超純水で５００ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｇ）ＰＥＧ／ＮａＣｌ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ＃６０００） １００．０ｇ、塩化ナトリウム７３．０ｇを超純水３３０ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｈ）ＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎ
ゼラチン０．１ｇを１０×ＴＢＳ １０ｍＬおよび超純水９０ｍＬに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、渦を巻くように撹拌してゼラチンを均一溶解させ、室温で保存した。
（ｉ）５％ＮａＮ3ストック溶液
アジ化ナトリウム５０ｍｇを１５ｍＬチューブに採取し、滅菌精製水９５０μＬに溶解させ４℃で保存した。
（ｊ）０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ
上記（ｉ）で調製した５％ＮａＮ3ストック溶液１００μＬをＴＢＳ ２５ｍＬに溶解させ、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
【００５０】
（ｋ）１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ３０．３ｇを超純水２００ｍＬに溶解させ、６Ｍ塩酸および０．０１Ｍ塩酸でｐＨ９．１に調整し、超純水で２５０ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、４℃で保存した。
（ｌ）Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ １．４ｇ、塩化マグネシウム六水和物０．１ｇを採取し、超純水２００ｍＬおよび４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液５０μＬを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｍ）５Ｍ ＮａＣｌ水溶液
２５０ｍＬ広口メディウム瓶に塩化ナトリウム７３．１ｇを採取し、超純水２５０ｍＬに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｎ）Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．２、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）
Ｇｌｙｃｉｎｅ ３．７５ｇを超純水５０ｍＬに溶解させ、６Ｍ塩酸でｐＨ２．２に調整した後、超純水で１００ｍＬにメスアップ後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った。ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、０１８−１５１５４、Ｌｏｔ．ＣＥＲ００６８、Ｗａｋｏ）１０ｍｇ、フェノールレッド１ｍｇを加えて溶解させ、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った後、４℃で保存した。
（ｏ）１×ＴＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０
１０×ＴＢＳ ４ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ） ２０μＬを滅菌精製水で４０ｍＬにメスアップし、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
【００５１】
（２）マスタープレートによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８）の保存
ＬＢ培地４９９μＬにＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ １μＬを加え、ＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅに１００μＬをプレーティングし、３７℃で１２時間培養し、４℃で保存した。マスタープレートは調製後１箇月以内に使用した。また、１箇月以内にコロニーから新たなＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅに線画培養することで植菌し、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体を保存した。
【００５２】
（３）ライブラリーの増幅
ＬＢ培地２０ｍＬにＥ．ｃｏｌｉ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬを加え、３００ｍＬバッフル付三角フラスコに移し、ついでライブラリー１μＬを加えて、３７℃、２００ｒｐｍの条件で５時間振盪培養した。これによりライブラリーを増幅した。
その後、培養液を５０ｍＬチューブに移して２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ、ＴＯＭＹ ＥＸ−１２６、ＴＳ−３８ＬＢ ｒｏｔｏｒ）、４℃の条件で１０分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな５０ｍＬチューブにＰＥＧ／ＮａＣｌ ３．３ｍＬを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに１００回転倒混和した後、４℃で１２時間静置した（ＰＥＧ沈殿精製）。その後、２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをＴＢＳ １ｍＬに再溶解させ、１．７ｍＬチューブに移した。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＳ１５Ｒ、Ｆ２４０２Ｈ ｒｏｔｏｒ）、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を新たな１．７ｍＬチューブに採取したＰＥＧ／ＮａＣｌ １５０μＬに加え、穏やかに１００回転倒混和した後、４℃で１時間以上静置した（ＰＥＧ沈殿精製）。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ ２００μＬを加えて溶解させ、新たな０．６ｍＬチューブに移して、ライブラリー溶液とし、４℃で保存した。
【００５３】
（４）バイオパニング
バイオパニングは、以下のＲｕｎ１〜３の３通りの方法で行った。
（ｉ）Ｒｕｎ１
上記（３）で増幅したライブラリー溶液を１．０×１０10ｐｆｕになるようにＴＢＳで希釈し、１０ｍｇの微結晶セルロースを懸濁させた。室温で１時間転倒混和し、放置した後、上清のファージ溶液を除去した。得られた微結晶セルロース／ファージ複合体を、０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）６００μＬで、５回洗浄した。
ついで、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬでファージを溶出した。
得られた溶出液を回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１８８μＬ加えて中和した後、限外濾過膜（分画分子量１００ｋＤａ）に移しＴＢＳで約１ｍＬにメスアップした。
２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で２分間遠心し、約５０μＬまでファージ溶液を濃縮した。再度、ＴＢＳで約１ｍＬにメスアップし遠心する操作を２回繰り返すことで（計３回）、バッファー交換と同時にファージ溶液を濃縮した後、ＴＢＳで約２００μＬにメスアップし、４℃で保存した。
【００５４】
（ｉｉ）Ｒｕｎ２
洗浄において、０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）６００μＬの代わりに、１ｍＭのセロビオースを含むＴＢＳＴ ６００μＬを用い、溶出において、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬの代わりに０．１Ｍセロビオースを含むＴＢＳ ５００μＬを用い、限外ろ過膜に移す前に中和を行わなかった以外は、Ｒｕｎ１と同様の方法により、バイオパニングを行った。
【００５５】
（ｉｉｉ）Ｒｕｎ３
溶出において、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬの代わりに５０％ＥｔＯＨを含むＴＢＳ ５００μＬを用いた以外は、Ｒｕｎ１と同様の方法により、バイオパニングを行ったが、溶出時にファージが消失したため以降の操作は行わなかった。
【００５６】
（５）ファージプールの増幅
ＬＢ培地２０ｍＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬを加え３００ｍＬバッフル付三角フラスコに移し、上記（４）で得たファージ溶液１００μＬを加えて３７℃、２００ｒｐｍの条件で５時間振盪培養した。これによりファージプールを増幅した。
その後、培養液を５０ｍＬチューブに移して２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな５０ｍＬチューブにＰＥＧ／ＮａＣｌ ３．３ｍＬを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに１００回転倒混和した後４℃で一晩静置し、ファージを沈殿させた。その後、２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをＴＢＳ １ｍＬに再溶解させ、１．７ｍＬチューブに移した。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を新たな１．７ｍＬチューブに採取したＰＥＧ／ＮａＣｌ １５０μＬに加え、穏やかに１００回転倒混和した後４℃で１時間静置し、ファージを沈殿させた。さらに、１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ ２００μＬを加えて溶解させ、新たな０．６ｍＬチューブに上清を移して４℃で保存した。
【００５７】
得られたファージ溶液を用い、上記（４）のバイオパニングおよび（５）のファージプールの増幅を繰り返し行い、バイオパニング後のファージ濃度を測定しつつ、バイオパニングの回数が合計５回となったところで終了した。
なお、Ｒｕｎ２においては、洗浄に用いたセロビオースを含むＴＢＳＴにおけるセロビオースの濃度を、バイオパニング２回目は３ｍＭ、３回目は１０ｍＭ、４回目および５回目は３０ｍＭとした。
【００５８】
ファージ濃度は、以下の条件でＵＶ−ｖｉｓ分光光度測定を行って決定した。Ａ269＝３０の時のファージ粒子濃度が２×１０14ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬであるから、１／１００希釈したファージ溶液３００μＬをＵＶ−ｖｉｓで測定し、２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差からＡ269を求めた。Ａ269＝３０の時のファージ粒子濃度が上述したとおり２×１０14ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬ（＝３．３×１０-7Ｍに相当）であり、さらに、およそ１ｐｆｕ＝２０ｖｉｒｉｏｎｓであることを用いて増幅後のファージの力価を算出した。
【００５９】
＜ＵＶ−ｖｉｓ分光光度測定条件＞
測定モード：Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、レスポンス：Ｆａｓｔ、バンド幅：２．０ｎｍ、走査速度：４００ｎｍ／ｍｉｎ、開始波長：３４０ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、データ取込間隔：１．０ｎｍ
【００６０】
（６）力価測定（Ｔｉｔｅｒｉｎｇ）
ＬＢ培地５ｍＬにマスタープレートからピックアップしたシングルコロニーを加え、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃、２００ｒｐｍの条件で振盪培養した後（最大５時間）、ファージ溶液をＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎで所定の濃度に系列希釈し、これを分注した大腸菌懸濁液に１０μＬずつ加えて数分間インキュベートした。Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐを電子レンジで溶解し、３ｍＬずつ分注し、これにファージプール希釈液とインキュベートした大腸菌懸濁液を加えてよく混合した後、あらかじめ３７℃に温めたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌプレートに注いで均一に広げ５分間静置した。培地の固化を確認した後、３７℃で一晩培養した。プレート上の青いプラークの個数を数え、希釈率を考慮し調製したファージ溶液の濃度を算出した。
【００６１】
１．４ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
０．１ｍｇの微結晶セルロースを所定濃度のファージ／ＰＢＳ溶液（スキムミルク不含）に２０℃下懸濁させ、１時間静置した。ＰＢＳＴおよびＰＢＳをこの順に用いて洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化した抗Ｍ１３ファージ抗体溶液に懸濁させた。上清を除去した後、基質（２，２′−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）溶液に懸濁させ、４０５ｎｍの吸収によりファージの結合量を求めた。
【００６２】
１．５ ファージの結合定数の算出
ファージ濃度を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のＬａｎｇｍｕｉｒ式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）を求めた。
【数２】
式中、ＲＡはＥＬＩＳＡにより求めた各濃度での吸収を示し、ＲＡmaxは最大吸収を示す。
【００６３】
２．結果
２．１ ファージプールの結合定数
図２に、バイオパニングの回数とファージの回収率との関係を示す。図２に示されるように、ファージの回収率は、バイオパニングの回数の増加に従って増加する傾向にあった。このことは、ライブラリーにおいてランダムであったペプチドのうち、セルロースと特異的に結合するペプチドが、バイオパニングの繰り返しにより、ファージプールに濃縮されてきたことを示唆している。
【００６４】
２．２ ファージのクローニングとクローンの結合定数
得られたクローンが提示しているペプチドのアミノ酸配列、アミノ酸配列ごとの頻度、ＥＬＩＳＡの繰り返し回数（ｎ）、ＥＬＩＳＡにより求めたファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）およびそのライブラリーの結合定数に対する比（Ｋapp比）を、表１（Ｒｕｎ１）および表２（Ｒｕｎ２）に示す。
なお、ＥＬＩＳＡの繰り返し回数（ｎ）は、１日３回のＥＬＩＳＡをｎ＝１とするものである。したがってｎ＝３での結合定数（Ｋapp）は、合計９回のＥＬＩＳＡの平均値である。
【００６５】
また、結合定数の算出に用いた結合等温線のグラフ例を図３に示す。図３に示すクローン２−５ｃ０２＊は、Ｒｕｎ２系について、上記１．４ＥＬＩＳＡを、ファージ／ＰＢＳ溶液に０．０００１％スキムミルクを含有させた以外は同様に行なった場合に得られたクローンである。この０．０００１％スキムミルクを含有させたＥＬＩＳＡによるクローン２−５ｃ０２＊（アミノ酸配列：ＨＡＩＹＰＲＨ）の見掛けの結合定数（Ｋapp）は、２．５６（ｎ＝１）であり、この条件でのライブラリーの見掛けの結合定数（Ｋapp）は、１．３４であった。
図３に示されるように、ファージ濃度の増加とともに吸収（結合量）が飽和することから、Ｌａｎｇｍｕｉｒ式への仮定が妥当であることが示唆された。図３から、クローン（Ｒｕｎ２系）の結合量がライブラリーの結合量よりも多いことが明らかになった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
Ｒｕｎ１においては、パニング数４回の場合、１６個のクローンをピックアップしたところ、９種のアミノ酸配列が得られ（Ｒｕｎ１−４ｃ０１〜１−４ｃ１６）、パニング数５回の場合、１４個のクローンをピックアップしたところ、３種のアミノ酸配列が得られた（Ｒｕｎ１−５ｃ０１〜１−５ｃ０３）。
表１に示すとおり、Ｒｕｎ１の系では、パニング数が５回に達すると、顕著なセルロース特異的結合性を示すペプチドが得られにくくなっており、４回のパニング数で充分であると考えられる。
【００６８】
【表２】
【００６９】
Ｒｕｎ２においては、パニング数４回の場合、１６個のクローンをピックアップしたところ、１６種のアミノ酸配列が得られ（Ｒｕｎ２−４ｃ０１〜２−４ｃ１６）、パニング数５回の場合、１５個のクローンをピックアップしたところ、１０種のアミノ酸配列が得られた（Ｒｕｎ２−５ｃ０１〜２−５ｃ１４）。
【００７０】
表１および２に示されるクローンのうち、ライブラリーに対する結合定数の比＞１．５のものを、比の大きいものから順に表３に示す。
【表３】
【００７１】
表３に示されるライブラリーと比べて結合定数が顕著に大きい各種クローンは、セルロース（特異的）結合性ペプチドである。
なお、Ｒｕｎ１およびＲｕｎ２のいずれにおいても、アミノ酸配列ＨＰＥＲＡＴＬを有するクローン（Ｒｕｎ１での１−４ｃ０１および１−５ｃ０２、Ｒｕｎ２での２−５ｃ０５）の頻度が極めて高かったが、このクローンの結合定数はライブラリーと比べて小さいか同等程度である。したがって、このクローンは、セルロースに特異的に結合するペプチドではなく、バイオパニングの際に単に増幅効率がよいクローンであると推測される。
【００７２】
２．４ セルロース結合性ペプチドが含むアミノ酸
表３に示される９種のセルロース結合性ペプチド（ライブラリーに対する結合定数の比＞１．５）のアミノ酸配列におけるアミノ酸の出現頻度を表４に示す。
【００７３】
【表４】
【００７４】
表４から明らかなように、疎水的な（すなわち正のハイドロパシー指標を有する）アミノ酸であるアラニン（Ａ）と、アミンを側鎖に持つアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）およびアルギニン（Ｒ）とが、ライブラリーに比べて出現頻度が２倍近く高くなっており、セルロースとの結合に寄与していることが示唆された。さらに、セルロースが疎水基と水酸基とを有していることから、セルロース結合性ペプチドが、疎水性相互作用と水素結合とにより、セルロースと相互作用していることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】セルロース結合性ファージのセレクションの概略工程図である。
【図２】バイオパニングの回数とファージの回収率との関係を示すグラフである。
【図３】Ｒｕｎ２系の結合定数の算出に用いた結合等温線のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化や原油生産ピークの問題から、ガソリンに代わる自動車用燃料として再生可能資源であるバイオマス燃料の導入が検討されている。代表的な自動車用バイオマス燃料であるバイオエタノールは、さとうきび、とうもろこし、木材等を原料としており、これらを糖化した後、酵素発酵により製造される。中でも、木材は、地球上で最も多量に存在するバイオマス資源であることから、それを原料としたバイオエタノールの製造の実用化が望まれている。
【０００３】
木材等の主成分であるセルロースは、不溶性の材料であるため、糖化および酵素発酵の前に、可溶化する必要がある。
セルロース分解酵素であるセルラーゼは、触媒ドメイン、リンカー部位およびセルロース結合ドメイン（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＣＢＤ）の三つの領域から構成されており、このうちＣＢＤがセルロースを分解するのに重要であることが知られている。
しかしながら、酵素を用いた可溶化および糖化は分解速度やコストの面で問題がある。
【０００４】
これに対して、非特許文献１においては、人工的に得たバクテリオファージ・ディスプレーライブラリーを用いて、セルロースと特異的に結合する部分（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ：ＣＢＭ）を選別する試みが記載されており、ＳＷＹＬシーケンスがＣＢＭであると推測されている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｈｕａｘｕｅ Ｙｕ Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｗｕｌｉ Ｘｕｅｂａｏ，１９９８，３０（３），ｐ．２６３−２６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載されている方法は、ペプチドのアミノ酸残基数が１５個と比較的多いので、製造の際に高いコストおよび大きなエネルギーが必要であり、また、安定性に欠けるなどの問題があるため、実用上不利である。
また、非特許文献１に記載されている方法は、ペプチドのアミノ酸残基数が１５個であるため、溶液中である種の立体構造（コンファメーション）を採り、それがセルロースとの結合に多少なりとも寄与していると推測されるところ、特定の立体構造を採らないアミノ酸残基数が少ないペプチドの場合は、ＳＷＹＬシーケンスを有するペプチドであっても、セルロースへの特異的な結合を示すか否かは不明である。
そこで、本発明は、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドおよびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の方法により、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１４）を提供する。
（１）少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
（２）上記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含む、上記（１）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（３）少なくとも２個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続している、上記（２）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（４）ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＱＴＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
（５）前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
（６）上記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で１．５以上である上記（５）に記載のセルロース結合性ペプチド。
（７）上記アミノ酸配列のＮ末端から第１番目および第５番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる上記（１）〜（６）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
（８）上記アミノ酸配列のＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる上記（１）〜（７）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【０００９】
（９）アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１０）前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備する、上記（９）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【００１０】
（１１）前記洗浄工程が、いずれもＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われる、上記（１０）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１２）前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、上記（１０）に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１３）前記アミノ酸残基数が７個である、上記（９）〜（１２）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
（１４）上記（９）〜（１３）のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のセルロース結合性ペプチドは、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明のセルロース結合性ペプチドおよびその製造方法を詳細に説明する。なお、本明細書において、アミノ酸配列は、特にことわりのない限り一文字表記で示される。この一文字表記に対応するアミノ酸残基名および三文字表記は次のとおりである。Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｃ：システィン（Ｃｙｓ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）。
【００１３】
本発明のセルロース結合性ペプチドの第１の態様は、少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチドである。
正のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）を有するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である。中でも、アラニンが好ましい。
本発明において、側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸におけるアミノ基は、イミノ基（＞ＮＨ）およびアミド（−ＣＯＮＨ）を含む。側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である。中でも、ヒスチジン、グルタミン、アルギニンが好ましい。
【００１４】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、上述した側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを、それぞれ少なくとも１個含む。本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドがセルロースに対して特異的に結合する理由は明らかでないが、セルロースが疎水的部分とヒドロキシ基とを有していることから、セルロース結合性ペプチドの正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸の部分が、セルロースの疎水的部分と疎水結合を形成し、かつ、セルロース結合性ペプチドの側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸の部分が、セルロースのヒドロキシ基と水素結合を形成するためであると推測される。
【００１５】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドにおいては、側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含むのが好ましい態様の一つである。これにより、水素結合がより生じやすくなる。
中でも、少なくとも２個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続しているのが好ましい。
【００１６】
本発明の第１の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、上述した側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを、それぞれ少なくとも１個含むアミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、セルロースに特異的に結合する。このようなペプチドであれば、７個のアミノ酸残基の配列順序は特に限定されないが、例えば、以下の本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドが好適に挙げられる。
【００１７】
本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドは、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＥＱＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらペプチドは、第一の態様と同様に、セルロースに特異的に結合する。本発明では、第一の態様として規定されるセルロース結合性ペプチドが、第２の態様のセルロース結合性ペプチドのいずれかと同一のものであってもよい。
【００１８】
本発明の第２の態様のセルロース結合性ペプチドは、上記各アミノ酸配列を有していればよく、アミノ酸残基数が７個である場合は、上述した各アミノ酸配列自体であり、アミノ酸残基数が８個以上である場合は、上述した各アミノ酸配列を一部に含むものである。
アミノ酸残基数は、７〜１４個であるのが好ましい。
【００１９】
本明細書において、上記「セルロースに特異的に結合する」とは、セルロース結合性ペプチドのファージクローンのセルロースに対する結合定数とライブラリーのセルロースに対する結合定数との比が１を超えることを意味する。すなわち、本発明の第１および第２の態様で規定されるセルロースに特異的に結合するペプチドを構成する上記アミノ酸配列は、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である。なお、本発明における結合定数は、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験により、後述のLangmuir仮定式から求めることができる見掛けの結合定数（Ｋapp）である。
本発明では、セルロース結合性ペプチドのファージクローンのセルロースに対する結合定数とライブラリーのセルロースに対する結合定数との比は、１．１以上であるのが好ましく、１．３以上であるのがより好ましく、１．５以上であるのが更に好ましい。
【００２０】
第１または第２の態様で規定される７個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第１番目および第５番目が水酸基を有するアミノ酸残基であることが好ましい。また、Ｎ末端から第７番目すなわちＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基であることが好ましい。
なお、本発明の第２の態様に係るセルロース結合性ペプチドには、ファージディスプレイ法により一般的なポリマー親和性ペプチドとして選択されたペプチドのプロリン依存性の傾向は特別みられない。
【００２１】
本発明に係るセルロース結合性ペプチドは、製造方法を特に限定されないが、例えば、以下に示す本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により製造することができる。
【００２２】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法は、アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法である。
【００２３】
混合工程は、アミノ酸残基数が２〜１４個、好ましくは６〜１４個、より好ましくは７〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる工程である。
ライブラリー溶液には、ファージディスプレイペプチドライブラリーが含まれる。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、２０のｎ乗（ｎは、アミノ酸残基数）の多様性を有する。すなわち、２０のｎ乗（ｎは、アミノ酸残基数）種のペプチドを有するファージのライブラリーである。例えば、アミノ酸残基数が７個であれば、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、２０n（≒１．２８×１０9）種のペプチドを有するファージを有する。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が７個であるのが好ましい態様の一つである。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、特に限定されないが、例えば、市販のものを用いることができる。
また、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が異なる２種以上のファージを含んでいてもよい。
ライブラリー溶液は、水溶液であるのが好ましい。水溶液中のファージディスプレイペプチドライブラリーの濃度は、１０11〜１０12ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬであるのが好ましい。
【００２４】
ライブラリー溶液は、市販のものをそのまま用いてもよいが、ライブラリー溶液中のファージディスプレイペプチドライブラリーを大腸菌に感染させて増幅させた後に用いてもよい。その場合、大腸菌に感染させる方法は、特に限定されず、例えば、大腸菌のＯ／Ｎ培養液１００〜３００μＬをＬＢ培地に加え、ついでライブラリー溶液を０．５〜３μＬ加えて室温から４０℃までの温度で、１５０〜３００ｒｐｍで３〜６時間、振盪培養する方法が挙げられる。
【００２５】
セルロースは、特に限定されないが、純度および混合の容易さの点で、微結晶セルロースであるのが好ましい。微結晶セルロースは、特に限定されず、例えば、市販のものを用いることができる。
【００２６】
混合工程においては、上記ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、上記セルロースとを混合させる。
混合の方法は、特に限定されず、例えば、室温で１分間〜１２時間転倒混和する方法が挙げられる。
【００２７】
沈殿工程は、混合工程後、放置して、ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとの複合体を沈殿させる工程である。
混合工程においてセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとが結合して生成した複合体は、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージと比べて重いため、沈殿する。
【００２８】
分離工程は、沈殿した複合体を分離する工程である。
分離の方法は、沈殿した複合体を系から分離する方法であれば、特に限定されないが、例えば、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを含む溶液を除去して、沈殿を得る方法が挙げられる。
【００２９】
洗浄工程は、分離された複合体を洗浄する工程である。
複合体は、上述したように、ライブラリー溶液とセルロースとを混合させた状態から、沈殿により分離されたものである。したがって、ライブラリー溶液中のセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージが不純物として含まれる。洗浄工程は、そのようなセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを除去するために行われる。
【００３０】
洗浄の方法は、特に限定されず、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）を用いて洗浄する方法、セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法が好適に挙げられる。セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法を用いると、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージのみならず、セルロースに弱く結合するペプチドを有するファージも除去されるので、セルロースにより強く結合するペプチドを有するファージを得ることができると考えられる。
ＴＢＳＴを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、ｐＨ６〜９であり、０．０１〜０．１ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ２０を含む５００〜１０００μＬのＴＢＳＴを用い、室温から４０℃までの温度下で、５〜２０回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
セロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、ｐＨ６〜９であり、０．１〜５０ｍＭのセロビオースを含むＴＢＳＴ５００〜１０００μＬを用い、室温から４０℃までの温度下で、５〜２０回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
【００３１】
溶出工程は、洗浄された複合体からセルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる工程である。溶出工程においては、複合体がセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとの間で解離し、セルロース結合性ペプチドを有するファージが溶出する。
溶出の方法は、特に限定されず、例えば、グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法、セロビオース水溶液を用いて溶出する方法が挙げられる。
グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、ｐＨ１〜３のグリシン−塩酸緩衝液４００〜１０００μＬを用い、室温から４０℃までの温度下で、３０分間〜２時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
セロビオース水溶液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、０．０５〜０．５Ｍのセロビオースを含むｐＨ１〜３のグリシン−塩酸緩衝液４００〜１０００μＬを用い、室温下、１時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
【００３２】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、洗浄工程が、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、溶出工程が、グリシン−塩酸緩衝液を用いて行われるのが好ましい態様の一つであり、洗浄工程が、セロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、溶出工程が、セロビオース水溶液を用いて行われるのが別の好ましい態様の一つである。
【００３３】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、前記溶出工程の後に、溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備するのが好ましい。これにより、セルロース結合性ペプチドの得られる効率が高くなる。
【００３４】
上記サイクルにおける増幅工程は、溶出したセルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる工程である。このようにセルロース結合性ペプチドを有するファージを増幅させることにより、セルロース結合性ペプチドを有するファージが後の分離工程、洗浄工程および溶出工程で多少消失しても、最終的に残るようにすることができる。
増幅の方法の条件は、例えば、ＬＢ培地１０〜３０ｍＬと大腸菌Ｏ／Ｎ培養液１００〜３００μＬの混合液にファージ溶液５０〜２００μＬを加えて、室温から３７℃までの温度で、１５０〜３００ｒｐｍで３〜６時間、振盪培養する方法が挙げられる。
【００３５】
上記サイクルにおける混合工程は、増幅したセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる工程である。
混合の方法は、ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液の代わりに、増幅したセルロース結合性ペプチドを有するファージを用いる以外は、上述した混合工程と同様である。
【００３６】
上記サイクルにおける沈殿工程は、混合工程後、放置して、セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる工程である。
上記サイクルにおける分離工程は、沈殿した複合体を分離する工程である。
上記サイクルにおける洗浄工程は、分離された複合体を洗浄する工程である。
上記サイクルにおける溶出工程は、洗浄された複合体からセルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる工程である。
これらの沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程は、それぞれ上述した沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程と同様である。
上記サイクルを行う場合は、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもＴＢＳＴを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われるのが好ましい態様の一つであり、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われるのが別の好ましい態様の一つである。サイクル前および１回以上のサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴＢＳＴを用いて行われる場合、セロビオースの濃度を上げながら行うのが好ましい。例えば、サイクルを４回行うことによりバイオパニングを合計５回行う場合、１ｍＭ（バイオパニング１回目）、３ｍＭ（同２回目）、１０ｍＭ（同３回目）、３０ｍＭ（同４回目）、３０ｍＭ（同５回目）のようにすることができる。これにより、セルロースに弱く結合する特異性の低いファージを効率よく排除することができる。
【００３７】
サイクルの回数は、特に限定されないが、セルロース結合性ペプチドを有するファージが分離工程、洗浄工程および溶出工程で消失する可能性、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有さず、かつ、増幅工程で高効率で増幅されるファージの増幅性等を考慮すると、１〜５回であるのが好ましい。
【００３８】
本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法においては、溶出工程（サイクルを行う場合は、サイクルにおける最後の溶出工程）で、セルロース結合性ペプチドを有するファージを含有する溶出液が得られる。
この溶出液中に、セルロース結合性ペプチドを有するファージが存在するか否かは、例えば、クローニングをして、ファージクローンを取り出し、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により、セルロースに対する結合定数を測定し、ライブラリーのセルロースに対する結合定数との比が１を超える、好ましくは１．５以上であるものが存在するか否かで判断することができる。
【００３９】
ＥＬＩＳＡは、特に限定されず、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等を用いることができる。いずれの方法においても、反応に関与しないタンパク質で固相ブロッキングすることができ、具体的には、スキムミルクなどをたとえばファージ溶液に添加することでブロッキングすることができる。この固相ブロッキングは、ＥＬＩＳＡで通常行なわれる手段であるが、本発明では、固相ブロッキングを行なわないことが好ましい。すなわち、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験の際には、スキムミルクなどの外部ペプチドの共存を避けることが好ましい。
【００４０】
結合定数は、ファージ濃度を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のＬａｎｇｍｕｉｒ式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）を求めることができる。
【数１】
【００４１】
式中、ＲＡはＥＬＩＳＡにより求めた各濃度での吸収を示し、ＲＡmaxは最大吸収を示す。
【００４２】
本発明の第７の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチドである。
本発明の第７の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られ、かつ、セルロースに特異的に結合するものであれば、アミノ酸配列等を特に限定されない。
具体的には、例えば、上述した本発明の第２から第６までの態様のセルロース結合性ペプチドが挙げられる。
【００４３】
本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドは、いずれもアミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドであり、現在のところ、セルロースの可溶化能および分解能との関係は明らかでないが、本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドを用いてセルロースの可溶化および分解を行うことは、可能であると考えられる。
したがって、本発明の第１から第７までの態様のセルロース結合性ペプチドを用いてバイオエタノールを製造することが可能になると考えられる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限られるものではない。なお、実施例において、「％」は特に指定のない限り、「質量％」を表す。
【００４５】
１． 実験方法
１．１ 実験試料
微結晶セルロースは、Ｍｅｒｃｋより購入したものをそのまま用いた。
ファージディスプレイペプチドライブラリー（以下、単に「ライブラリー」という。）は、Ｐｈ．Ｄ．−７TM Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。このライブラリーは、Ｍ１３系のｆｄファージの非主要外殻タンパク質であるｐＩＩＩのＮ末端に直鎖７残基のランダムなアミノ酸配列のペプチドが提示されたものであり、ペプチド４残基（ＧＧＧＳ）のスペーサーを介してｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐＩＩＩに融合した設計となっている。このライブラリーには、２０7個（≒１．２８×１０9個）のｐｈａｇｅ ｃｌｏｎｅｓが含まれている。
【００４６】
１．２ 微結晶セルロースの滅菌および洗浄
微結晶セルロースをエタノールに分散させた。静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作によりセルロースを滅菌した。
つぎに、ＴＢＳに分散させ、静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作を３回繰り返すことで微結晶セルロースを洗浄した。
【００４７】
１．３ セルロース結合性ファージのセレクション
図１に、セルロース結合性ファージのセレクションの概略工程図を示す。
本操作はＰｈ．Ｄ．−７TM Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを用いて行い、Ｋｉｔ付属のマニュアルを参考にし、一部改変して行った。
【００４８】
（１）試薬調製
（ａ）滅菌精製水
超純水をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）して調製し、室温で保存した。
（ｂ）Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（Ｔｅｔ）ストック溶液
テトラサイクリン塩酸塩１００ｍｇをエタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｄｅ）２０ｍＬに溶解し、−２０℃で遮光保存した。
（ｃ）ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌストック溶液
Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）０．２５ｇ、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−Ｇａｌ） ０．２ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｄｅ） ５．０ｍＬに溶解させ、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注し−２０℃で遮光保存した。
（ｄ）ＬＢ培地
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ５ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ２．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを採取し、超純水５００ｍＬおよび４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１２５μＬを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｅ）ＬＢ ｐｌａｔｅ−Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ培地２００ｍＬを採取しＢａｃｔｏ Ａｇａｒ ３．０ｇを加えてオートクレーブ処理を行った後、５０℃以下まで冷却し、Ｔｅｔストック溶液８００μＬを加えシャーレ２０枚に分注し、固化させた後４℃で遮光保存した。
【００４９】
（ｆ）１０×ＴＢＳ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ３０．３ｇ，塩化ナトリウム４３．８ｇを４００ｍＬの超純水に溶解させ、６Ｍ塩酸および０．０１Ｍ塩酸でｐＨ７．５に調整した。超純水で５００ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｇ）ＰＥＧ／ＮａＣｌ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ＃６０００） １００．０ｇ、塩化ナトリウム７３．０ｇを超純水３３０ｍＬに溶解させ、超純水で５００ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｈ）ＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎ
ゼラチン０．１ｇを１０×ＴＢＳ １０ｍＬおよび超純水９０ｍＬに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、渦を巻くように撹拌してゼラチンを均一溶解させ、室温で保存した。
（ｉ）５％ＮａＮ3ストック溶液
アジ化ナトリウム５０ｍｇを１５ｍＬチューブに採取し、滅菌精製水９５０μＬに溶解させ４℃で保存した。
（ｊ）０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ
上記（ｉ）で調製した５％ＮａＮ3ストック溶液１００μＬをＴＢＳ ２５ｍＬに溶解させ、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
【００５０】
（ｋ）１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．１）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ３０．３ｇを超純水２００ｍＬに溶解させ、６Ｍ塩酸および０．０１Ｍ塩酸でｐＨ９．１に調整し、超純水で２５０ｍＬにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、４℃で保存した。
（ｌ）Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐ
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ １．４ｇ、塩化マグネシウム六水和物０．１ｇを採取し、超純水２００ｍＬおよび４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液５０μＬを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｍ）５Ｍ ＮａＣｌ水溶液
２５０ｍＬ広口メディウム瓶に塩化ナトリウム７３．１ｇを採取し、超純水２５０ｍＬに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
（ｎ）Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．２、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）
Ｇｌｙｃｉｎｅ ３．７５ｇを超純水５０ｍＬに溶解させ、６Ｍ塩酸でｐＨ２．２に調整した後、超純水で１００ｍＬにメスアップ後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った。ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、０１８−１５１５４、Ｌｏｔ．ＣＥＲ００６８、Ｗａｋｏ）１０ｍｇ、フェノールレッド１ｍｇを加えて溶解させ、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った後、４℃で保存した。
（ｏ）１×ＴＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０
１０×ＴＢＳ ４ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ） ２０μＬを滅菌精製水で４０ｍＬにメスアップし、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
【００５１】
（２）マスタープレートによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８）の保存
ＬＢ培地４９９μＬにＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ １μＬを加え、ＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅに１００μＬをプレーティングし、３７℃で１２時間培養し、４℃で保存した。マスタープレートは調製後１箇月以内に使用した。また、１箇月以内にコロニーから新たなＬＢ−ｔｅｔ ｐｌａｔｅに線画培養することで植菌し、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体を保存した。
【００５２】
（３）ライブラリーの増幅
ＬＢ培地２０ｍＬにＥ．ｃｏｌｉ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬを加え、３００ｍＬバッフル付三角フラスコに移し、ついでライブラリー１μＬを加えて、３７℃、２００ｒｐｍの条件で５時間振盪培養した。これによりライブラリーを増幅した。
その後、培養液を５０ｍＬチューブに移して２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ、ＴＯＭＹ ＥＸ−１２６、ＴＳ−３８ＬＢ ｒｏｔｏｒ）、４℃の条件で１０分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな５０ｍＬチューブにＰＥＧ／ＮａＣｌ ３．３ｍＬを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに１００回転倒混和した後、４℃で１２時間静置した（ＰＥＧ沈殿精製）。その後、２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをＴＢＳ １ｍＬに再溶解させ、１．７ｍＬチューブに移した。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＳ１５Ｒ、Ｆ２４０２Ｈ ｒｏｔｏｒ）、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を新たな１．７ｍＬチューブに採取したＰＥＧ／ＮａＣｌ １５０μＬに加え、穏やかに１００回転倒混和した後、４℃で１時間以上静置した（ＰＥＧ沈殿精製）。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ ２００μＬを加えて溶解させ、新たな０．６ｍＬチューブに移して、ライブラリー溶液とし、４℃で保存した。
【００５３】
（４）バイオパニング
バイオパニングは、以下のＲｕｎ１〜３の３通りの方法で行った。
（ｉ）Ｒｕｎ１
上記（３）で増幅したライブラリー溶液を１．０×１０10ｐｆｕになるようにＴＢＳで希釈し、１０ｍｇの微結晶セルロースを懸濁させた。室温で１時間転倒混和し、放置した後、上清のファージ溶液を除去した。得られた微結晶セルロース／ファージ複合体を、０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）６００μＬで、５回洗浄した。
ついで、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬでファージを溶出した。
得られた溶出液を回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１８８μＬ加えて中和した後、限外濾過膜（分画分子量１００ｋＤａ）に移しＴＢＳで約１ｍＬにメスアップした。
２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で２分間遠心し、約５０μＬまでファージ溶液を濃縮した。再度、ＴＢＳで約１ｍＬにメスアップし遠心する操作を２回繰り返すことで（計３回）、バッファー交換と同時にファージ溶液を濃縮した後、ＴＢＳで約２００μＬにメスアップし、４℃で保存した。
【００５４】
（ｉｉ）Ｒｕｎ２
洗浄において、０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）６００μＬの代わりに、１ｍＭのセロビオースを含むＴＢＳＴ ６００μＬを用い、溶出において、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬの代わりに０．１Ｍセロビオースを含むＴＢＳ ５００μＬを用い、限外ろ過膜に移す前に中和を行わなかった以外は、Ｒｕｎ１と同様の方法により、バイオパニングを行った。
【００５５】
（ｉｉｉ）Ｒｕｎ３
溶出において、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）５００μＬの代わりに５０％ＥｔＯＨを含むＴＢＳ ５００μＬを用いた以外は、Ｒｕｎ１と同様の方法により、バイオパニングを行ったが、溶出時にファージが消失したため以降の操作は行わなかった。
【００５６】
（５）ファージプールの増幅
ＬＢ培地２０ｍＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８ Ｏ／Ｎ培養液２００μＬを加え３００ｍＬバッフル付三角フラスコに移し、上記（４）で得たファージ溶液１００μＬを加えて３７℃、２００ｒｐｍの条件で５時間振盪培養した。これによりファージプールを増幅した。
その後、培養液を５０ｍＬチューブに移して２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな５０ｍＬチューブにＰＥＧ／ＮａＣｌ ３．３ｍＬを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに１００回転倒混和した後４℃で一晩静置し、ファージを沈殿させた。その後、２３８０ｇ（３５００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをＴＢＳ １ｍＬに再溶解させ、１．７ｍＬチューブに移した。１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を新たな１．７ｍＬチューブに採取したＰＥＧ／ＮａＣｌ １５０μＬに加え、穏やかに１００回転倒混和した後４℃で１時間静置し、ファージを沈殿させた。さらに、１２３０３ｇ（１３０００ｒｐｍ）、４℃の条件で１０分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを０．０２％ＮａＮ3／ＴＢＳ ２００μＬを加えて溶解させ、新たな０．６ｍＬチューブに上清を移して４℃で保存した。
【００５７】
得られたファージ溶液を用い、上記（４）のバイオパニングおよび（５）のファージプールの増幅を繰り返し行い、バイオパニング後のファージ濃度を測定しつつ、バイオパニングの回数が合計５回となったところで終了した。
なお、Ｒｕｎ２においては、洗浄に用いたセロビオースを含むＴＢＳＴにおけるセロビオースの濃度を、バイオパニング２回目は３ｍＭ、３回目は１０ｍＭ、４回目および５回目は３０ｍＭとした。
【００５８】
ファージ濃度は、以下の条件でＵＶ−ｖｉｓ分光光度測定を行って決定した。Ａ269＝３０の時のファージ粒子濃度が２×１０14ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬであるから、１／１００希釈したファージ溶液３００μＬをＵＶ−ｖｉｓで測定し、２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差からＡ269を求めた。Ａ269＝３０の時のファージ粒子濃度が上述したとおり２×１０14ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬ（＝３．３×１０-7Ｍに相当）であり、さらに、およそ１ｐｆｕ＝２０ｖｉｒｉｏｎｓであることを用いて増幅後のファージの力価を算出した。
【００５９】
＜ＵＶ−ｖｉｓ分光光度測定条件＞
測定モード：Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、レスポンス：Ｆａｓｔ、バンド幅：２．０ｎｍ、走査速度：４００ｎｍ／ｍｉｎ、開始波長：３４０ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、データ取込間隔：１．０ｎｍ
【００６０】
（６）力価測定（Ｔｉｔｅｒｉｎｇ）
ＬＢ培地５ｍＬにマスタープレートからピックアップしたシングルコロニーを加え、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃、２００ｒｐｍの条件で振盪培養した後（最大５時間）、ファージ溶液をＴＢＳ／ｇｅｌａｔｉｎで所定の濃度に系列希釈し、これを分注した大腸菌懸濁液に１０μＬずつ加えて数分間インキュベートした。Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｏｐを電子レンジで溶解し、３ｍＬずつ分注し、これにファージプール希釈液とインキュベートした大腸菌懸濁液を加えてよく混合した後、あらかじめ３７℃に温めたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌプレートに注いで均一に広げ５分間静置した。培地の固化を確認した後、３７℃で一晩培養した。プレート上の青いプラークの個数を数え、希釈率を考慮し調製したファージ溶液の濃度を算出した。
【００６１】
１．４ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
０．１ｍｇの微結晶セルロースを所定濃度のファージ／ＰＢＳ溶液（スキムミルク不含）に２０℃下懸濁させ、１時間静置した。ＰＢＳＴおよびＰＢＳをこの順に用いて洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化した抗Ｍ１３ファージ抗体溶液に懸濁させた。上清を除去した後、基質（２，２′−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）溶液に懸濁させ、４０５ｎｍの吸収によりファージの結合量を求めた。
【００６２】
１．５ ファージの結合定数の算出
ファージ濃度を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のＬａｎｇｍｕｉｒ式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）を求めた。
【数２】
式中、ＲＡはＥＬＩＳＡにより求めた各濃度での吸収を示し、ＲＡmaxは最大吸収を示す。
【００６３】
２．結果
２．１ ファージプールの結合定数
図２に、バイオパニングの回数とファージの回収率との関係を示す。図２に示されるように、ファージの回収率は、バイオパニングの回数の増加に従って増加する傾向にあった。このことは、ライブラリーにおいてランダムであったペプチドのうち、セルロースと特異的に結合するペプチドが、バイオパニングの繰り返しにより、ファージプールに濃縮されてきたことを示唆している。
【００６４】
２．２ ファージのクローニングとクローンの結合定数
得られたクローンが提示しているペプチドのアミノ酸配列、アミノ酸配列ごとの頻度、ＥＬＩＳＡの繰り返し回数（ｎ）、ＥＬＩＳＡにより求めたファージの見掛けの結合定数（Ｋapp）およびそのライブラリーの結合定数に対する比（Ｋapp比）を、表１（Ｒｕｎ１）および表２（Ｒｕｎ２）に示す。
なお、ＥＬＩＳＡの繰り返し回数（ｎ）は、１日３回のＥＬＩＳＡをｎ＝１とするものである。したがってｎ＝３での結合定数（Ｋapp）は、合計９回のＥＬＩＳＡの平均値である。
【００６５】
また、結合定数の算出に用いた結合等温線のグラフ例を図３に示す。図３に示すクローン２−５ｃ０２＊は、Ｒｕｎ２系について、上記１．４ＥＬＩＳＡを、ファージ／ＰＢＳ溶液に０．０００１％スキムミルクを含有させた以外は同様に行なった場合に得られたクローンである。この０．０００１％スキムミルクを含有させたＥＬＩＳＡによるクローン２−５ｃ０２＊（アミノ酸配列：ＨＡＩＹＰＲＨ）の見掛けの結合定数（Ｋapp）は、２．５６（ｎ＝１）であり、この条件でのライブラリーの見掛けの結合定数（Ｋapp）は、１．３４であった。
図３に示されるように、ファージ濃度の増加とともに吸収（結合量）が飽和することから、Ｌａｎｇｍｕｉｒ式への仮定が妥当であることが示唆された。図３から、クローン（Ｒｕｎ２系）の結合量がライブラリーの結合量よりも多いことが明らかになった。
【００６６】
【表１】
【００６７】
Ｒｕｎ１においては、パニング数４回の場合、１６個のクローンをピックアップしたところ、９種のアミノ酸配列が得られ（Ｒｕｎ１−４ｃ０１〜１−４ｃ１６）、パニング数５回の場合、１４個のクローンをピックアップしたところ、３種のアミノ酸配列が得られた（Ｒｕｎ１−５ｃ０１〜１−５ｃ０３）。
表１に示すとおり、Ｒｕｎ１の系では、パニング数が５回に達すると、顕著なセルロース特異的結合性を示すペプチドが得られにくくなっており、４回のパニング数で充分であると考えられる。
【００６８】
【表２】
【００６９】
Ｒｕｎ２においては、パニング数４回の場合、１６個のクローンをピックアップしたところ、１６種のアミノ酸配列が得られ（Ｒｕｎ２−４ｃ０１〜２−４ｃ１６）、パニング数５回の場合、１５個のクローンをピックアップしたところ、１０種のアミノ酸配列が得られた（Ｒｕｎ２−５ｃ０１〜２−５ｃ１４）。
【００７０】
表１および２に示されるクローンのうち、ライブラリーに対する結合定数の比＞１．５のものを、比の大きいものから順に表３に示す。
【表３】
【００７１】
表３に示されるライブラリーと比べて結合定数が顕著に大きい各種クローンは、セルロース（特異的）結合性ペプチドである。
なお、Ｒｕｎ１およびＲｕｎ２のいずれにおいても、アミノ酸配列ＨＰＥＲＡＴＬを有するクローン（Ｒｕｎ１での１−４ｃ０１および１−５ｃ０２、Ｒｕｎ２での２−５ｃ０５）の頻度が極めて高かったが、このクローンの結合定数はライブラリーと比べて小さいか同等程度である。したがって、このクローンは、セルロースに特異的に結合するペプチドではなく、バイオパニングの際に単に増幅効率がよいクローンであると推測される。
【００７２】
２．４ セルロース結合性ペプチドが含むアミノ酸
表３に示される９種のセルロース結合性ペプチド（ライブラリーに対する結合定数の比＞１．５）のアミノ酸配列におけるアミノ酸の出現頻度を表４に示す。
【００７３】
【表４】
【００７４】
表４から明らかなように、疎水的な（すなわち正のハイドロパシー指標を有する）アミノ酸であるアラニン（Ａ）と、アミンを側鎖に持つアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）およびアルギニン（Ｒ）とが、ライブラリーに比べて出現頻度が２倍近く高くなっており、セルロースとの結合に寄与していることが示唆された。さらに、セルロースが疎水基と水酸基とを有していることから、セルロース結合性ペプチドが、疎水性相互作用と水素結合とにより、セルロースと相互作用していることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】セルロース結合性ファージのセレクションの概略工程図である。
【図２】バイオパニングの回数とファージの回収率との関係を示すグラフである。
【図３】Ｒｕｎ２系の結合定数の算出に用いた結合等温線のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
【請求項２】
前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含む、請求項１に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項３】
少なくとも２個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続している、請求項２に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項４】
ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＱＴＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である請求項１〜４のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項６】
前記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で１．５以上である請求項５に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列のＮ末端から第１番目および第５番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる請求項１〜６のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列のＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる請求項１〜７のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項９】
アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備する、請求項９に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記洗浄工程が、いずれもＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われる、請求項１０に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、請求項１０に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸残基数が７個である、請求項９〜１２のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
【請求項１】
少なくとも１個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも１個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数７個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
【請求項２】
前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも２個含む、請求項１に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項３】
少なくとも２個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも２個が連続している、請求項２に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項４】
ＨＡＩＹＰＲＨ、ＳＨＴＬＳＡＫ、ＴＱＭＴＳＰＲ、ＹＡＧＰＹＱＨ、ＬＰＳＱＴＡＰ、ＧＱＴＲＡＰＬ、ＱＬＫＴＧＰＡ、ＦＱＶＰＲＳＱ、ＬＲＬＰＰＡＰからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ＥＬＩＳＡによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である請求項１〜４のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項６】
前記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で１．５以上である請求項５に記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列のＮ末端から第１番目および第５番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる請求項１〜６のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列のＣ末端から第１番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる請求項１〜７のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
【請求項９】
アミノ酸残基数が２〜１４個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、１回以上具備する、請求項９に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記洗浄工程が、いずれもＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われる、請求項１０に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、請求項１０に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸残基数が７個である、請求項９〜１２のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−９４８２２（Ｐ２００８−９４８２２Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４３５２１（Ｐ２００７−４３５２１）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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